Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рахмет. Сіз қолданып жатқан шолғыш нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе үшін жаңартылған шолғышты пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer шолғышында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Әзірге қолдауды жалғастыру үшін сайтты мәнерлерсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Кеуекті кремнезем бөлшектері макрокеуекті бөлшектерді алу үшін кейбір модификациялары бар золь-гель әдісімен дайындалды. Бұл бөлшектер N-фенилмалеймид-метилвинилизоцианат (PMI) және стиролмен қайтымды қосу фрагментация тізбегін тасымалдау (RAFT) арқылы полимерлеу арқылы N-фенилмалеймидті полимерлі полимерді (интеркалациялануМППполимид) дайындау үшін алынған. фаза.Тар ұңғылы тот баспайтын болаттан жасалған колонналар (100 × 1,8 мм идентификатор) суспензиялы қаптамамен оралған. Бес пептидтерден тұратын пептидтік қоспаның бағаланған PMP бағанының бөлінуі (Гли-Тир, Гли-Леу-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Арг, Тир-Иле-Аргли-Арг) хроматографиялық өнімділік) және адам сарысуы альбуминінің (HAS) трипсинді қорытуы. Оңтайлы элюция жағдайында пептидтік қоспаның теориялық пластиналар саны 280 000 пластина/м²-ге дейін жетеді. Әзірленген колоннаның бөліну өнімділігін коммерциялық Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстыру, PMP бағанының жоғары өнімділігі мен бөлу бағанының жоғары өнімділігі болып табылатыны байқалды. рұқсат.
Соңғы жылдары биофармацевтика өнеркәсібі нарық үлесін айтарлықтай ұлғайтумен кеңейіп жатқан жаһандық нарыққа айналды. Биофармацевтика өнеркәсібінің қарқынды өсуімен1,2,3 пептидтер мен ақуыздарды талдау өте қажет. Мақсатты пептидтен басқа, пептидтердің синтезі кезінде бірнеше қоспалар пайда болады, осылайша пептидтердің хроматографиялық тазартылуын талап етеді. тазалық. Дене сұйықтықтарындағы, тіндеріндегі және жасушаларындағы ақуыздарды талдау және сипаттау бір үлгідегі ықтимал анықталатын түрлердің көп болуына байланысты өте күрделі міндет болып табылады. Масс-спектрометрия пептидтер мен белоктарды секвенирлеудің тиімді құралы болғанымен, егер мұндай үлгілер масс-спектрометрге бір өтуде енгізілсе, оның бөлінуі мінсіз бола алмайды. MS талдауына дейінгі сепарациялар, бұл белгілі бір уақытта масс-спектрометрге түсетін талданатын заттардың санын азайтады4,5,6.Сонымен қатар, сұйық фазаны бөлу кезінде талданатын заттар тар аймақтарға шоғырлануы мүмкін, осылайша бұл талданатын заттарды шоғырландырады және MS анықтау сезімталдығын арттырады. талдау7,8,9,10.
Кері фазалық сұйық хроматография (RP-LC) стационарлық фаза ретінде октадецил-модифицирленген кремнеземді (ODS) пайдаланып, пептидтік қоспаларды тазарту және бөлу үшін кеңінен қолданылады11,12,13. Дегенмен, RP стационарлы фазалары күрделі құрылымына және амфильді табиғатына байланысты пептидтер мен ақуыздардың қанағаттанарлық бөлінуін қамтамасыз етпейді14. Полярлы және полярлы емес бөліктері бар пептидтер мен белоктарды талдау үшін арнайы әзірленген стационарлық фазалар осы талдағыштармен өзара әрекеттесу және оларды сақтау үшін қажет16. Мультимодальдық әрекеттесулерді қамтамасыз ететін аралас режимдегі хроматография пептидтерді, белоктарды және басқа да күрделі қоспаларды бөлу үшін RP-LC-ге балама бола алады. пептидті және ақуызды бөлу үшін пайдаланылды17,18,19,20,21. Аралас режимдегі стационарлы фазалар (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярлық интеркалация/RPLC) полярлық және полярлы емес топтардың болуына байланысты пептидті және ақуызды бөлу үшін қолайлы. ковалентті байланысқан полярлық топтары бар фазалар полярлы және полярлы емес талданатын заттар үшін жақсы бөліну күші мен бірегей селективтілігін көрсетеді, өйткені бөліну талданатын зат пен стационар фазаның өзара әрекеттесуіне байланысты. Мультимодальдық өзара әрекеттесу 29, 30, 31, 32. Жақында, Чжан және т.б. Додецилмен аяқталатын полиамин стационарлық фазасын дайындады және көмірсутектерді, антидепрессанттарды, флавоноидтарды, нуклеозидтерді, эстрогендерді және бірнеше басқа анализаторларды сәтті бөлді. Полярлық интеркалатордың полярлы және полярлы емес топтары бар, сондықтан оны гидрофобты және гидрофобты, гидрофобты бағаналары бар пептидтер мен ақуыздарды бөлу үшін пайдалануға болады. амидпен енгізілген C18 бағандары) Ascentis Express RP-Amide бағаналары саудалық атауымен коммерциялық қол жетімді, бірақ бұл бағандар тек 33 аминді талдау үшін пайдаланылады.
Ағымдағы зерттеуде HSA пептидтері мен трипсин дайджесттерін бөлу үшін полярлы кірістірілген стационарлы фаза (N-фенилмалеймидпен салынған полистирол) дайындалды және бағаланды. Стационарлық фаза келесі стратегияны қолдану арқылы дайындалды. Кеуекті кремний бөлшектері біздің алдыңғы жарияланымда келтірілген процедураға сәйкес дайындалды, кейбір модификациялары бар полиэтиленді пропорциялар. гликол (PEG), TMOS, су сірке қышқылы үлкен кеуек өлшемі бар кремний диоксиді бөлшектерін дайындау үшін реттелді. Екіншіден, жаңа лиганд, фенилмалеймид-метил винил изоцианаты синтезделді және полярлы кірістірілген стационарлық фазаны дайындау үшін кремний диоксиді бөлшектерін алу үшін пайдаланылды. 1,8 мм идентификатор) оңтайландырылған орау сызбасын пайдалана отырып. Колоннада біртекті қабаттың пайда болуын қамтамасыз ету үшін колонна орамына механикалық діріл көмектеседі. Бес пептидтен тұратын пептидті қоспалардың оралған колонна бөлінуін бағалаңыз; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) және адам сарысуы альбуминінің трипсин дайджесті (HAS). Пептидтік қоспа мен HSA трипсин дайджесті жақсы ажыратымдылықпен бөлінгені байқалды және ПМП тиімділігімен салыстырылды. RP-Amide бағаны. Екі пептидтер де, ақуыздар да Ascentis Express RP-Amide бағанына қарағанда тиімдірек болған PMP бағанында жақсы ерігені және тиімді екені байқалды.
PEG (полиэтиленгликоль), мочевина, сірке қышқылы, триметокси ортосиликат (TMOS), триметилхлоросилан (TMCS), трипсин, адам сарысуындағы альбумин (HSA), аммоний хлориді, мочевина, гексанметилдисилазан (HMDS), хлорид, хлорид, метакрил, 4-Гидрокси-ТЕМПО, бензоил пероксиді (BPO), HPLC дәрежелі ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол және ацетон Сигма-Олдрихтен (Сент-Луис, МО, АҚШ) сатып алынды.
Мочевина (8 г), полиэтиленгликоль (8 г) және 8 мл 0,01 н сірке қышқылының қоспасы 10 минут бойы араластырылды, содан кейін мұздай салқын жағдайда оған 24 мл TMOS қосылды. Реакция қоспасы 40 ° C температурада 6 сағат бойы қыздырылды, содан кейін 120 ° C сусыз 8 сағат бойы суда қалдырылды. төгіліп, қалдық материал 70°C температурада 12 сағат кептірілді. Кептірілген жұмсақ масса пеште тегіс ұнтақталып, 550°C температурада 12 сағат бойы күйдірілді. Бөлшектердің өлшемі, кеуектер өлшемі және бетінің ауданы бойынша қайталану мүмкіндігін тексеру үшін үш партия дайындалды және сипатталды.
Алдын ала синтезделген фенилмалеймид-метилвинилизоцианатпен (PCMP) кремний диоксиді бөлшектерін беттік модификациялау, содан кейін стиролмен радиалды полимерлеу арқылы полярлы топты құрайтын қосылыс дайындалды. Агрегаттар мен полистирол тізбектері үшін стационарлық фаза. Дайындау процесі төменде сипатталған.
N-фенилмалеймид (200 мг) және метилвинил изоцианат (100 мг) құрғақ толуолда ерітілді және фенилмалеймид-метилвинилвинилполимерленген фенилмалеймидті дайындау үшін реакциялық колбаға 0,1 мл 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) қосылды (КПМ қоспасы қыздырылды.). 60°C температурада 3 сағат, сүзгіден өткізіп, пеште 40°C температурада 3 сағат кептіреді.
Кептірілген кремний диоксиді бөлшектері (2 г) құрғақ толуолда (100 мл) дисперстіленді, араластырылды және 500 мл дөңгелек түбі бар колбада 10 минут бойы ультрадыбыспен өңделді. PMCP (10 мг) толуолда ерітілді және тамшылататын воронка арқылы реакциялық колбаға тамшылатып қосылды. Қоспа 1 сағат бойы сүзгіден өткізіліп, сүзгіден өткізілген. ацетонды араластырып, 60°C температурада 3 сағат кептірді. Содан кейін PMCP-байланысқан кремний диоксиді бөлшектері (100 г) толуолда (200 мл) ерітілді және 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) 100 мкл дибутитилтин дилауратының қатысуымен қосылды, қоспа 58°C температурада катализатор ретінде сүзіледі. және 50°С температурада 3 сағат кептіреді.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиді BPO (0,5 мл) және TEMPO-PMCP қосылған кремнезем бөлшектері (1,5 г) толуолда дисперсті болды және азотпен тазартылды. Стиролды полимерлеу 100°C температурада 12 сағат бойы жүргізілді. Алынған өнім метолмен жуылып, түнде кептірілді. реакцияның жалпы схемасы 1-суретте көрсетілген.
Үлгілер 10-3 Torr төмен қалдық қысымды алу үшін 1 сағат бойы 393 К температурада газсыздандырылды. P/P0 = 0,99 салыстырмалы қысымда адсорбцияланған N2 мөлшері жалпы кеуек көлемін анықтау үшін пайдаланылды. Жалаңаш және лигандтармен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің морфологиясы жоғары электротехникалық сканерлеумен зерттелді. Токио, Жапония). Кептірілген үлгілер (жалаңаш кремний диоксиді және лигандпен байланыстырылған кремний тотығы бөлшектері) жабысқақ көміртекті таспаны пайдаланып алюминий бағанына орналастырылды. Үлгілерге Q150T шашыратқыш қаптау құралы арқылы алтын қапталды және үлгілерге 5 нм Au қабаты қойылды. Бұл төмен кернеуді пайдалана отырып, процесс тиімділігін жақсартады, E. E. (Уолтхэм, MA, АҚШ) Элементтік талдау үшін Flash EA1112 элементтік анализаторы пайдаланылды. Бөлшек өлшемдерінің таралуын алу үшін Malvern (Вустершир, Ұлыбритания) Mastersizer 2000 бөлшек өлшемді анализаторы пайдаланылды. Жалаңаш кремний диоксиді бөлшектері мен лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері (әрқайсысы 5 мг) 100,000 мл ерітіндіге бөлініп, ерітілді. 5 минут бойы құйынды және Mastersizer оптикалық стендіне қойылды. Термогравиметриялық талдау 30-дан 800 °C-қа дейінгі температура диапазонында минутына 5 °C жылдамдықпен орындалды.
Өлшемдері (100 × 1,8 мм идентификатор) әйнекпен қапталған тот баспайтын болаттан жасалған тар саңылаулы бағандар нөлдік буып-түю әдісін қолданып, Нұсқада қолданылған процедураны қолданып оралған. 31. Тот баспайтын болаттан жасалған колонна (әйнекпен қапталған, 100 × 1,8 мм идентификаторы) құрамында 1 мкм фриті бар шығыс фитингі суспензияны орауышқа (Alltech Deerfield, IL, АҚШ) қосылды. 150 мг стационарлық фазада 1 мет.2 сақтау орнында сақтау арқылы стационарлық фазалық суспензия дайындаңыз. баған. Метанол суспензия еріткіші ретінде, сондай-ақ қозғаушы еріткіш ретінде пайдаланылды. Колонканы 10 минут бойы 100 МП, 15 минут бойы 80 МП және 30 минут бойы 60 МП қысыммен толтырыңыз. Орау кезінде екі GC колонкасының шайқағышымен механикалық діріл қолданылды, АҚШ-тың біркелкі болуын қамтамасыз ету үшін, Defield tech. баған. Шламды орауышты жабыңыз және бағандағы кез келген зақымның алдын алу үшін қысымды баяу босатыңыз. Бағананы шламды орау бөлігінен ажыратып, оның жұмысын тексеру үшін кіріс және LC жүйесіне басқа фитингті қосыңыз.
LC сорғы (10AD Shimadzu, Жапония), инжектор (Valco (АҚШ) C14 W.05), 50 нл инъекциялық ілмегі бар мембраналық газсыздандырғыш (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS капиллярлық терезесі арнайы μLC құрылғысы детекторы (UV-2075) және түтіктерді өте қысқа қосатын және шыны қабықшаларды қысқарту үшін жасалды. қосымша баған диапазонының кеңеюінің әсері. Қаптамадан кейін капиллярлар (50 мкм id 365 және редукциялық капиллярлар (50 мкм) қалпына келтіретін қосылыстың 1/16" розеткасына орнатылды. Деректерді жинау және хроматографиялық өңдеу Multichro 2000 бағдарламалық құралының көмегімен жүзеге асырылды. Uhromatographic абсорбциялық сынағы U25 тестіден өтті. деректер OriginPro8 (Northampton, MA) арқылы талданды.
Адам сарысуынан альбумин, лиофилденген ұнтақ, ≥ 96% (агарозды гель электрофорезі) 3 мг трипсинмен (1,5 мг), 4,0 М мочевинамен (1 мл) және 0,2 М аммоний бикарбонатымен (1 мл) араластырылған. Ерітінді 10 минут бойы араластырып, содан кейін 10 ° C температурада сумен моншада 7 сағат ұсталды. мл 0,1% TFA. Ерітіндіні сүзіп, 4 °C төмен температурада сақтаңыз.
Пептидтік қоспаларды және HSA трипсин дайджесттерін бөлу PMP бағандарында бөлек бағаланды. PMP бағанымен HSA пептидтік қоспасы мен трипсин дайджестінің бөлінуін тексеріңіз және нәтижелерді Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстырыңыз. Теориялық пластина нөмірі келесідей есептеледі:
Жалаңаш кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің SEM кескіндері суретте көрсетілген. 2. Жалаң кремнезем бөлшектерінің (A, B) SEM суреттері біздің алдыңғы зерттеулерімізден айырмашылығы, бұл бөлшектердің бөлшектері ұзартылған немесе дұрыс емес симметрияға ие болатын сфералық екенін көрсетеді. кремний диоксиді бөлшектерінің беті.
Жалаң кремний диоксиді бөлшектерінің (A, B) және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің (C, D) сканерленген электронды микроскоптағы суреттері.
Жалаң кремний диоксиді бөлшектерінің және лиганд-байланыстырылған кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектер өлшемдерінің үлестірімі 3(A) суретте көрсетілген. Көлемге негізделген бөлшектер өлшемін бөлу қисығы кремний диоксиді бөлшектерінің мөлшері химиялық модификациядан кейін ұлғайғанын көрсетті (3А-сурет). Кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектердің өлшемдерінің таралу деректері ағымдағы зерттеудегі және алдыңғы зерттеу көлемінің T-1-де салыстырылатын көлемі. d(0,5), PMP 3,36 мкм құрайды, бұл біздің ad(0,5) мәні 3,05 мкм (полистиролмен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері) 34. Біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда, PEG, мочевина, TMOS қышқылдарының қатынасының өзгеруіне байланысты бұл топтамада бөлшектердің мөлшері тарырақ болды. біз бұрын зерттеген полистиролмен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің фазасынан үлкенірек. Бұл кремнеземдік бөлшектердің стиролмен бетінің функционализациясы кремний диоксиді бетінде полистирол қабатын (0,97 мкм) тұндырғанын білдіреді, ал PMP фазасында қабат қалыңдығы 1,38 мкм болды.
Жалаң кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектердің өлшемдерінің таралуы (A) және кеуектерінің таралуы (B).
Ағымдағы зерттеудегі кремний диоксиді бөлшектерінің кеуек өлшемі, кеуек көлемі және бетінің ауданы 1(B) кестеде келтірілген. Жалаң кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің PSD профильдері 3(В) суретте көрсетілген. Нәтижелер біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырмалы. тиісінше, бұл 1(B) кестеде көрсетілгендей, химиялық модификациядан кейін кеуек мөлшерінің 69-ға кемитінін көрсетеді, ал қисық сызықтың өзгеруі 3(B)-суретте көрсетілген. Сол сияқты, кремний диоксиді бөлшектерінің кеуектерінің көлемі химиялық модификациядан кейін 0,67-ден 0,58 см3/г-ға дейін азайды. м2/г, бұл біздің алдыңғы зерттеуімізбен (124 м2/г) салыстырмалы.
Стационарлы фазаның элементтік талдауының нәтижелері 2-кестеде көрсетілген. Ағымдағы стационарлы фазаның көміртегі жүктемесі 6,35% құрайды, бұл біздің алдыңғы зерттеудегі көміртегі жүктемесінен төмен (полистиролмен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері, тиісінше 7,93%35 және 10,21%) 42. Токтағы стационарлық фазаның көміртегі жүктемесі төмен болғандықтан SP, стиролдан басқа, фенилмалеймид-метилвинилизоцианат (PCMP) және 4-гидрокси-ТЕМПО сияқты кейбір полярлы лигандтар пайдаланылды. Ағымдағы стационарлы фазадағы азоттың салмағы 2,21% құрайды, бұл алдыңғы зерттеулердегі салмағы бойынша 0,1735 және 0,85% салыстырғанда. Қазіргі стационар фазада азот фенилмалеймидке байланысты жоғары. Сол сияқты өнімдердің (4) және (5) көміртегі жүктемелері сәйкесінше 2,7% және 2,9% құрады, ал соңғы өнімнің (6) көміртегі жүктемесі 2-кестеде көрсетілгендей 6,35% болды. Салмақ жоғалту фазасы PGA және TGA қисығымен тексерілді. Қисық 8,6% салмақ жоғалтуды көрсетеді, бұл көміртегі жүктемесіне жақсы сәйкес келеді (6,35%), өйткені лигандтарда тек С ғана емес, сонымен қатар N, O және H бар.
Фенилмалеймид-метилвинилизоцианат лиганды кремний диоксиді бөлшектерінің беттік модификациясы үшін таңдалды, өйткені оның полярлы фенилмалеймид топтары мен винилизоцианат топтары бар. Винил изоцианат топтары тірі радикалды полимерлену арқылы стиролмен одан әрі әрекеттесе алады. Екінші себеп - орташа электростатикалық өзара әрекеттесуі жоқ топты енгізу. талданатын зат және стационар фаза, өйткені фенилмалеймид бөлігінде қалыпты рН кезінде виртуалды заряд жоқ. Стационарлық фазаның полярлығын стиролдың оңтайлы мөлшерімен және бос радикалды полимерлеудің реакция уақытымен басқаруға болады. Реакцияның соңғы сатысы (бос радикалды полимерлеу) өте маңызды және стационарлық фазаның полярлығын өзгерте алады. стиролдың мөлшері мен реакция уақытын ұлғайту стационарлық фазаның көміртегі жүктемесін арттыратынын және керісінше стиролдың әртүрлі концентрациясымен дайындалған СП-лар әртүрлі көміртегі жүктемелеріне ие болатынын байқады. Тағы да, бұл стационарлық фазаларды тот баспайтын болаттан жасалған бағандарға жүктеңіз және олардың хроматографиялық өнімділігін тексеріңіз (селективтілік, рұқсат ету, N мәні және т.б.). бақыланатын полярлық және аналитті жақсы ұстау.
Бес пептидтік қоспалар (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) сондай-ақ жылжымалы фазаны пайдалана отырып, PMP бағанының көмегімен бағаланды; 60/40 (көлем/көлем) ацетонитрил/су (0,1% TFA) 80 мкл/мин ағын жылдамдығында. Оңтайлы элюция жағдайында бір бағандағы теориялық пластина саны (N) (100 × 1,8 мм идентификатор) 20 000 ± 100 (3 МП/м² үшін P200000 мәндерін береді). бағандар мен хроматограммалар 5А-суретте көрсетілген. Жоғары ағын жылдамдығымен (700 мкл/мин) PMP бағанында жылдам талдау, бес пептидтер бір минут ішінде элюцияланды, N мәндері өте жақсы, бір баған үшін 13500 ± 330 (100 × 1,8 мм идентификатор), сәйкес келеді Fi53, 0 0 м пластина. 5B). Өлшемдері бірдей үш баған (100 × 1,8 мм идентификатор) қайталану мүмкіндігін тексеру үшін PMP стационарлық фазасының үш түрлі партиясымен оралған. Әрбір баған үшін талданатын заттың концентрациясы оңтайлы элюция шарттарын және теориялық пластиналардың N санын және әр бағандағы бірдей сынақ қоспасын бөлу үшін ұстау уақытын пайдалана отырып жазылған. PMP бағанының қайталану мүмкіндігі 3-кестеде көрсетілгендей өте төмен %RSD мәндерімен жақсы сәйкес келеді.
PMP бағанында (B) және Ascentis Express RP-Amide бағанында (A) пептидті қоспаны бөлу; жылжымалы фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP бағанының өлшемдері (100 × 1,8 мм идентификатор); аналитикалық Қосылыстардың элюция тәртібі: 1 (Гли-Тир), 2 (Гли-Леу-Тир), 3 (Гли-Гли-Тир-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) және 5 (лейцин) энкефалин қышқылы).
PMP бағаны (100 × 1,8 мм идентификатор) жоғары өнімді сұйық хроматографияда адам сарысуы альбуминінің триптикалық дайджесттерін бөлу үшін бағаланды. 6-суреттегі хроматограмма үлгінің жақсы бөлінгенін және ажыратымдылықтың өте жақсы екенін көрсетеді. HSA дайджесттері 100 мкл/л/мин, жылжымалы фаза ацет/0три және ағын жылдамдығын пайдаланып талданды. 0,1% TFA. Хроматограммада (6-сурет) көрсетілгендей, HSA қорытуы 17 пептидке сәйкес келетін 17 шыңға бөлінген. HSA дайджестіндегі әрбір шыңның бөліну тиімділігі есептеліп, мәндері 5-кестеде келтірілген.
HSA (100 × 1,8 мм идентификатор) триптикалық дайджесті PMP бағанында бөлінген; ағын жылдамдығы (100 мкл/мин), жылжымалы фаза 60/40 ацетонитрил/0,1% TFA бар су.
мұндағы L - баған ұзындығы, η - жылжымалы фазаның тұтқырлығы, ΔP - бағанның кері қысымы, және u - жылжымалы фазаның сызықтық жылдамдығы. PMP бағанының өткізгіштігі 2,5 × 10-14 м2, ағынының жылдамдығы 25 мкЛ/мин, ал бағанның 60/40 в/в AC0M пайдаланылған су. 1,8 мм идентификатор) біздің алдыңғы зерттеуімізге ұқсас болды. Реф.34. Үсті кеуекті бөлшектермен қапталған бағананың өткізгіштігі: 1,3 мкм бөлшектер үшін 1,7 × 10-15, 1,7 мкм бөлшектер үшін 3,1 × 10-15, 5,2 × 14 және 5,2 ×14,-10,-12 м. 2,6 мкм бөлшектер 5 мкм бөлшектер үшін 43.Сондықтан PMP фазасының өткізгіштігі 5 мкм өзек-қабық бөлшектерінің өткізгіштігіне ұқсас.
мұндағы Wx хлороформмен оралған бағанның салмағы, Wy – метанолмен оралған колоннаның салмағы, ал ρ – еріткіштің тығыздығы. Метанол (ρ = 0,7866) және хлороформ (ρ = 1,484) тығыздығы. Жалпы кеуектілігі (SILICA-1801 мм бағанының SILICA-18 PAR. id) біз бұрын зерттеген 34 және C18-мочевина бағандары 31 сәйкесінше 0,63 және 0,55 болды. Бұл несепнәр лигандтарының болуы стационарлық фазаның өткізгіштігін төмендетеді дегенді білдіреді. Екінші жағынан, PMP бағанының жалпы кеуектілігі (100 × 1,8 мм бағанға қарағанда төмен). С18 типті стационарлы фазаларда C18 лигандтары кремнеземді бөлшектерге сызықтық тізбек ретінде қосылатындықтан, полистирол типті стационарлы фазаларда оның айналасында салыстырмалы қалың полимер қабаты түзіледі. Типтік тәжірибеде бағананың кеуектілігі келесідей есептеледі:
7A,B суретінде бірдей элюция шарттарын (яғни, 60/40 ACN/H2O және 0,1% TFA) қолданатын PMP бағаны (100 × 1,8 мм идентификатор) және Ascentis Express RP-Amide бағаны (100 × 1,8 мм идентификатор) көрсетілген. ) van Deemter учаскесі. Таңдалған пептидтік қоспалар (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 мкл/Екі баған үшін ең аз ағын жылдамдығы 800 мкЛ/мин. бағанасы және Ascentis Express RP-Amide бағаны тиісінше 2,6 мкм және 3,9 мкм болды. HETP мәндері PMP бағанының бөлу тиімділігінің (100 × 1,8 мм идентификаторы) коммерциялық қол жетімді Ascentis Express RP-Amide бағанынан (100 × 1,8 ммA7 идентификаторында) әлдеқайда жақсырақ екенін көрсетеді. ағынның артуымен N мәнінің төмендеуі біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда маңызды емес. Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстырғанда PMP бағанының (100 × 1,8 мм идентификатор) жоғарырақ бөлу тиімділігі ағымдағы жұмыста қолданылатын бөлшектер пішінін, өлшемін және күрделі бағанды ​​орау процедураларын жақсартуға негізделген34.
(A) 0,1% TFA бар 60/40 ACN/H2O ішінде PMP бағаны (100 × 1,8 мм идентификатор) арқылы алынған ван Димтер графигі (жылжымалы фазаның сызықтық жылдамдығына қарсы). id) 0,1% TFA бар 60/40 ACN/H2O.
Жоғары өнімді сұйық хроматографияда адам сарысуы альбуминінің (HAS) синтетикалық пептидті қоспаларын және трипсин дайджесттерін бөлу үшін полярлы кіріктірілген полистирол стационарлы фаза дайындалды және бағаланды. Пептидтік қоспаларға арналған PMP бағандарының хроматографиялық өнімділігі бөлу тиімділігі мен ажыратымдылығы бойынша тамаша. кремний диоксиді бөлшектерінің мөлшері, стационарлық фазаның бақыланатын синтезі және күрделі бағанды ​​орау. Жоғары бөлу тиімділігіне қоса, жоғары ағындық жылдамдықтардағы төмен бағана кері қысымы осы стационарлық фазаның тағы бір артықшылығы болып табылады. PMP бағандары жақсы қайталану мүмкіндігін көрсетеді және пептидтік қоспаларды талдау және әртүрлі ақуыздарды трипсинді ыдырату үшін пайдаланылуы мүмкін. сұйық хроматографияда дәрілік өсімдіктер мен саңырауқұлақ сығындылары. Болашақта PMP бағандары ақуыздар мен моноклоналды антиденелерді бөлу үшін де бағаланатын болады.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Reversed фазалық хроматография арқылы пептидтерді бөлу жүйелерін зерттеу I бөлім: бағанды ​​сипаттау хаттамасын әзірлеу.J. Хроматография.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б. және т.б. Жұқпалы ауруларды емдеуге арналған жақсартылған белсенді пептидтер.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Синтетикалық терапевтік пептидтер: ғылым және нарық. дәрі-дәрмектің ашылуы.15 (1-2) бүгін, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2019 (1010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J. Хроматография.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Advanced сұйық хроматография-масса-спектрометрия кең мақсатты метаболомиканы және протеомиканы қосуға мүмкіндік береді.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Дәрілік заттарды әзірлеудегі UHPLC рөлі.J. Қыркүйек Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM. Жылдам бөлуге арналған ультра жоғары қысымды сұйықтық хроматографиясының негізгі және практикалық аспектілері. Қыркүйек. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelicheff, P. Препаратты әзірлеуде ультра жоғары өнімді сұйықтық хроматографиясын қолдану. Хроматография.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Энтеровирустарды тиімді тазарту үшін судағы мұнай жоғары ішкі фазалық эмульсиялардан дайындалған монолитті макрокеуекті гидрогельдер.Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020 ж.).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, С. & Уилкинс, Я. Протеомикадағы сұйық хроматографияның рөлі. Хроматография.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Терапевтік пептидтер мен ақуыздардың кері фазалы сұйық хроматография бөлінуіндегі жаңа тенденциялар: теория және қолдану. Фармация.Биомедициналық ғылым.анус.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дейли, АЕ және Геблер, JC. Бірінші және екінші бөлу өлшемдерінде әртүрлі рН мәндерін пайдалана отырып, RP-RP-HPLC жүйесі арқылы пептидтерді екі өлшемді бөлу.J. Қыркүйек Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. C18 суб-2 мкм толық және үстірт кеуекті бөлшектермен оралған жоғары тиімді хроматографиялық бағандардың масса алмасу сипаттамалары мен кинетикалық өнімділігі зерттелді.J. Қыркүйек Ғылым.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Өсімдіктің биоактивті пептидтерін оқшаулау, идентификациялау және валидациялаудағы соңғы тенденциялар мен аналитикалық қиындықтар.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s002168-01 (s002168-02).
Мюллер, Дж.Б. және т.б. Өмір патшалығының протеомдық ландшафты. Табиғат 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Терапевтік пептидтерді препаративті сұйық хроматография арқылы өңдеу. Молекула (Базель, Швейцария) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Аралас режимдегі хроматография және оның биополимерлерге қолданылуы. Хроматография.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Чжао, Г., Донг, X.-Y.& Sun, Y. Аралас режимдегі ақуыз хроматографиясына арналған лигандтар: принципі, сипаттамасы және дизайны.J. Биотехнология.144(1), 3-11 (2009).