Nature.com сайтына кіргеніңіз үшін рақмет. Сіз пайдаланып отырған браузер нұсқасында CSS қолдауы шектеулі. Ең жақсы тәжірибе алу үшін жаңартылған браузерді пайдалануды ұсынамыз (немесе Internet Explorer бағдарламасында үйлесімділік режимін өшіріңіз). Сонымен қатар, үздіксіз қолдауды қамтамасыз ету үшін біз сайтты стильдерсіз және JavaScriptсіз көрсетеміз.
Кеуекті кремний диоксиді бөлшектері макрокеуекті бөлшектерді алу үшін кейбір модификациялармен золь-гель әдісімен дайындалды. Бұл бөлшектер полистиролдың (PMP) стационарлық фазасының N-фенилмалеимид интеркаляциясын дайындау үшін N-фенилмалеимид интеркаляциясын дайындау үшін N-фенилмалеимидті фрагментациялық тізбекті тасымалдау (RAFT) полимерлеуі арқылы N-фенилмалеимид-метилвинилисоцианат (PMI) және стиролмен қайтымды қосу фрагментациялық тізбекті тасымалдау (RAFT) арқылы туындыланды. Тар диаметрлі тот баспайтын болаттан жасалған бағандар (100 × 1,8 мм id) суспензиямен қаптау арқылы оралды. Бес пептидтен (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) тұратын пептидтік қоспаның PMP бағанының бөлінуі бағаланды (хроматографиялық өнімділік) және адам сарысуы альбуминінің (HAS) трипсин қорытылуы. Оңтайлы элюция жағдайында пептидтік қоспаның теориялық пластина саны 280 000 пластина/м² дейін жетеді. Әзірленген бөліну өнімділігін салыстыру Коммерциялық Ascentis Express RP-Amide бағанымен бірге қолданылған кезде, PMP бағанының бөлу өнімділігі бөлу тиімділігі мен ажыратымдылығы тұрғысынан коммерциялық бағанаға қарағанда жоғары екені байқалды.
Соңғы жылдары биофармацевтикалық өнеркәсіп нарық үлесінің айтарлықтай өсуімен кеңейіп келе жатқан әлемдік нарыққа айналды. Биофармацевтикалық өнеркәсіптің қарқынды өсуімен1,2,3 пептидтер мен ақуыздарды талдау өте қажет. Мақсатты пептидтен басқа, пептид синтезі кезінде бірнеше қоспалар пайда болады, сондықтан қажетті тазалықтағы пептидтерді алу үшін хроматографиялық тазартуды қажет етеді. Дене сұйықтықтарындағы, тіндеріндегі және жасушаларындағы ақуыздарды талдау және сипаттау бір үлгіде ықтимал анықталатын түрлердің көптігіне байланысты өте қиын міндет болып табылады. Масс-спектрометрия пептидтер мен ақуыздарды секвенирлеу үшін тиімді құрал болғанымен, егер мұндай үлгілер масс-спектрометрге бір өтуде енгізілсе, бөлу идеалды болмайды. Бұл мәселені MS талдауына дейін сұйық хроматографияны (LC) бөлу арқылы шешуге болады, бұл белгілі бір уақытта масс-спектрометрге түсетін аналиттер санын азайтады4,5,6. Сонымен қатар, сұйық фазаны бөлу кезінде аналиттерді тар аймақтарға шоғырландыруға болады, осылайша бұл аналиттерді шоғырландырып, MS анықтау сезімталдығын жақсартады. Сұйықтық Хроматография (ХХ) соңғы онжылдықта айтарлықтай дамыды және протеомдық талдауда танымал әдіске айналды7,8,9,10.
Кері фазалы сұйық хроматография (RP-LC) стационарлық фаза ретінде октадецил-модификацияланған кремний диоксидін (ODS) пайдаланып пептидтік қоспаларды тазарту және бөлу үшін кеңінен қолданылады11,12,13. Дегенмен, RP стационарлық фазалары күрделі құрылымы мен амфифильді табиғатына байланысты пептидтер мен ақуыздарды қанағаттанарлықтай бөлуді қамтамасыз етпейді14,15. Сондықтан, осы аналиттермен әрекеттесу және сақтау үшін полярлы және полярлы емес бөліктері бар пептидтер мен ақуыздарды талдау үшін арнайы жасалған стационарлық фазалар қажет16. Мультимодальды өзара әрекеттесуді қамтамасыз ететін аралас режимді хроматография пептидтерді, ақуыздарды және басқа да күрделі қоспаларды бөлу үшін RP-LC-ге балама бола алады. Бірнеше аралас режимді стационарлық фазалар дайындалды және осы фазалармен толтырылған бағандар пептид пен ақуызды бөлу үшін пайдаланылды17,18,19,20,21. Аралас режимді стационарлық фазалар (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, полярлық интеркаляция/RPLC) пептид пен ақуыз үшін жарамды. полярлы және полярлы емес топтардың болуына байланысты бөлінулер22,23,24,25,26,27,28. Сол сияқты, ковалентті байланысқан полярлы топтары бар полярлық интеркаляцияланатын стационарлық фазалар полярлы және полярлы емес аналиттер үшін жақсы бөліну күшін және бірегей селективтілікті көрсетеді, себебі бөліну аналит пен стационарлық фаза арасындағы өзара әрекеттесуге байланысты. Мультимодальды өзара әрекеттесулер29, 30, 31, 32. Жақында Чжан және т.б. 30 додецилмен аяқталған полиамин стационарлық фазасын дайындап, көмірсутектерді, антидепрессанттарды, флавоноидтарды, нуклеозидтерді, эстрогендерді және басқа да бірнеше аналиттерді сәтті бөлді. Полярлық интеркалаторда полярлық және полярлық емес топтар бар, сондықтан оны гидрофобты және гидрофильді бөліктері бар пептидтер мен ақуыздарды бөлу үшін пайдалануға болады. Полярлық ендірілген бағандар (мысалы, амидпен ендірілген C18 бағандары) Ascentis Express RP-Amide бағандары сауда атауымен коммерциялық түрде қолжетімді, бірақ бұл бағандар тек амин 33 талдау үшін қолданылады.
Ағымдағы зерттеуде HSA пептидтері мен трипсин дайджесттерін бөлу үшін полярлы ендірілген стационарлық фаза (N-фенилмалеимид енгізілген полистирол) дайындалды және бағаланды. Стационарлық фаза келесі стратегияны қолдана отырып дайындалды. Кеуекті кремний диоксиді бөлшектері алдыңғы басылымда келтірілген процедураға сәйкес дайындау хаттамасына кейбір өзгертулер енгізіліп дайындалды. Мочевинаның, полиэтиленгликольдің (PEG), TMOS, су сірке қышқылының қатынасы үлкен кеуек өлшемді кремний диоксиді бөлшектерін дайындау үшін реттелді. Екіншіден, жаңа лиганд, фенилмалеимид-метилвинил изоцианат синтезделіп, полярлы ендірілген стационарлық фазаны дайындау үшін кремний диоксиді бөлшектерін алу үшін пайдаланылды. Алынған стационарлық фаза оңтайландырылған орау схемасын қолдана отырып, тот баспайтын болаттан жасалған бағанға (100 × 1,8 мм id) оралды. Бағанды ​​орау механикалық дірілмен қамтамасыз етіледі, бұл баған ішінде біртекті қабаттың пайда болуын қамтамасыз етеді. Бес пептидтен тұратын пептид қоспаларының оралған бағанға бөлінуін бағалаңыз; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) және адам сарысуы альбуминінің (HAS) трипсин қорытылуы. HSA пептидтік қоспасы мен трипсин қорытылуының жақсы ажыратымдылықпен және тиімділікпен бөлінетіні байқалды. PMP бағанының бөлу өнімділігі Ascentis Express RP-Amide бағанының өнімділігімен салыстырылды. Пептидтер де, ақуыздар да PMP бағанында жақсы ажыратылған және тиімді екені байқалды, бұл Ascentis Express RP-Amide бағанына қарағанда тиімдірек болды.
PEG (полиэтиленгликоль), мочевина, сірке қышқылы, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трипсин, адам сарысуы альбумині (HSA), аммоний хлориді, мочевина, гексан метилдисилазан (HMDS), метакрилоиллхлорид (MC), стирол, 4-гидрокси-TEMPO, бензоил пероксиді (BPO), HPLC дәрежелі ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол және ацетон Sigma-Aldrich компаниясынан (Сент-Луис, Миссури, АҚШ) сатып алынды.
Мочевина (8 г), полиэтиленгликоль (8 г) және 8 мл 0,01 Н сірке қышқылының қоспасы 10 минут бойы араластырылды, содан кейін мұздай жағдайда 24 мл TMOS қосылды. Реакция қоспасы тот баспайтын болаттан жасалған автоклавта 40°C температурада 6 сағат, содан кейін 120°C температурада 8 сағат бойы қыздырылды. Су құйылып, қалған материал 70°C температурада 12 сағат бойы кептірілді. Кептірілген жұмсақ масса пеште тегіс ұнтақталып, 550°C температурада 12 сағат бойы күйдірілді. Бөлшектердің өлшемі, кеуектердің өлшемі және беткі ауданы бойынша қайталануын тексеру үшін үш партия дайындалып, сипатталды.
Кремний диоксиді бөлшектерін алдын ала синтезделген лиганд фенилмалеимид-метилвинилисоцианатпен (PCMP) беттік модификациялау және стиролмен радиалды полимерлеу арқылы полярлық топты қамтитын қосылыс дайындалды. Агрегаттар мен полистирол тізбектері үшін стационарлық фаза. Дайындау процесі төменде сипатталған.
N-фенилмалеимид (200 мг) және метилвинил изоцианат (100 мг) құрғақ толуолда ерітілді, ал фенилмалеимид-метилвинил изоцианат сополимерін (PMCP) дайындау үшін реакция колбасына 0,1 мл 2,2′-азоиизобутиронитрил (AIBN) қосылды. Қоспа 60°C температурада 3 сағат бойы қыздырылды, сүзіліп, пеште 40°C температурада 3 сағат бойы кептірілді.
Кептірілген кремний диоксиді бөлшектері (2 г) құрғақ толуолға (100 мл) ерітіліп, араластырылып, 500 мл дөңгелек түбі бар колбада 10 минут бойы ультрадыбыстық өңдеуден өтті. PMCP (10 мг) толуолда ерітіліп, тамшылатып құйылатын воронка арқылы реакция колбасына тамшылатып қосылды. Қоспа 100°C температурада 8 сағат бойы қайта люкстелді, сүзіліп, ацетонмен жуылып, 60°C температурада 3 сағат бойы кептірілді. Содан кейін PMCP-байланысқан кремний диоксиді бөлшектері (100 г) толуолда (200 мл) ерітіліп, катализатор ретінде 100 мкл дибутилтин дилауратының қатысуымен 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) қосылды. Қоспа 50°C температурада 8 сағат бойы араластырылды, сүзіліп, 50°C температурада 3 сағат бойы кептірілді.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиді BPO (0,5 мл) және TEMPO-PMCP қосылған кремний диоксиді бөлшектері (1,5 г) толуолда ерітіліп, азотпен тазартылды. Стиролдың полимерленуі 100°C температурада 12 сағат бойы жүргізілді. Алынған өнім метанолмен жуылып, 60°C температурада түні бойы кептірілді. Жалпы реакция схемасы 1-суретте көрсетілген.
Үлгілер 10-3 Торрдан аз қалдық қысым алу үшін 393 К температурада 1 сағат бойы газсыздандырылды. P/P0 = 0,99 салыстырмалы қысымында адсорбцияланған N2 мөлшері жалпы кеуек көлемін анықтау үшін пайдаланылды. Жалаңаш және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің морфологиясы сканерлеуші ​​электронды микроскопия арқылы зерттелді (Hitachi High Technologies, Токио, Жапония). Кептірілген үлгілер (жаңаш кремний диоксиді және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері) жабысқақ көміртекті таспаны пайдаланып алюминий бағанға орналастырылды. Q150T шашырату жабынын пайдаланып үлгілерге алтын жағылды, ал үлгілерге 5 нм Au қабаты салынды. Бұл төмен кернеулерді қолдану арқылы процестің тиімділігін арттырады және ұсақ түйіршікті, суық шашыратуды қамтамасыз етеді. Элементтерді талдау үшін Thermo Electron (Уолтем, Массачусетс, АҚШ) Flash EA1112 элементтік анализаторы пайдаланылды. Бөлшектердің өлшемін алу үшін Malvern (Вустершир, Ұлыбритания) Mastersizer 2000 бөлшектердің өлшемдік анализаторы пайдаланылды. таралуы. Жалаңаш кремний диоксиді бөлшектері және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері (әрқайсысы 5 мг) 5 мл изопропанолда ерітіліп, 10 минут бойы ультрадыбыспен өңделіп, 5 минут бойы араластырылып, Mastersizer оптикалық стендіне орналастырылды. Термогравиметриялық талдау 30-дан 800 °C-қа дейінгі температура диапазонында минутына 5 °C жылдамдықпен жүргізілді.
Өлшемдері (100 × 1,8 мм идентификаторлы) шынымен қапталған тот баспайтын болаттан жасалған тар диаметрлі бағандар суспензияны орау әдісімен, сілтемеде қолданылған процедурамен оралды. 31. 1 мкм фритті қамтитын шығыс фитингі бар тот баспайтын болаттан жасалған баған (шынымен қапталған, 100 × 1,8 мм идентификатор) шламды орау құрылғысына (Alltech Deerfield, IL, АҚШ) қосылды. 1,2 мл метанолға 150 мг стационарлық фазаны суспензиялап, сақтау бағанына жіберу арқылы стационарлық фазалық шламды дайындаңыз. Шламды еріткіш ретінде де, қозғаушы еріткіш ретінде де метанол пайдаланылды. 10 минут бойы 100 МП, 15 минут бойы 80 МП және 30 минут бойы 60 МП қысымын қолдану арқылы бағанды ​​​​тізбектей толтырыңыз. Орау кезінде бағананың біркелкі оралуын қамтамасыз ету үшін екі GC баған шайқағышымен (Alltech, Deerfield, IL, АҚШ) механикалық діріл қолданылды. Шламды орау құрылғысын жауып, баған ішіндегі кез келген зақымдануды болдырмау үшін қысымды баяу босатыңыз. Бағананы шламды орау құрылғысынан ажыратып, кіріске және LC жүйесіне тағы бір фитингті қосыңыз. оның өнімділігін тексеру үшін.
LC сорғысы (10AD Shimadzu, Жапония), 50 нл инжекциялық ілмегі бар инжектор (Valco (USA) C14 W.05), мембраналық дегазатор (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS капиллярлық терезесі жасалды. Арнайы µLC құрылғы детекторы (UV-2075) және шынымен қапталған микроколонкалар. Қосымша баған жолағының кеңею әсерін азайту үшін өте тар және қысқа жалғаушы түтіктерді пайдаланыңыз. Қаптамадан кейін тотықсыздандырғыш қосылыстың 1/16 дюймдік шығысына капиллярлар (50 мкм id 365 және тотықсыздандырғыш қосылыс капиллярлары (50 мкм) орнатылды. Деректерді жинау және хроматографиялық өңдеу Multichro 2000 бағдарламалық жасақтамасын пайдаланып жүргізілді. 254 нм толқын толқынында бақылау. Аналиттер ультракүлгін сәулеленуді сіңіруге тексерілді. Хроматографиялық деректер OriginPro8 (Нортгемптон, MA) көмегімен талданды.
Адам сарысуынан алынған альбумин, лиофилизацияланған ұнтақ, ≥ 96% (агароза гелімен электрофорез) 3 мг трипсинмен (1,5 мг), 4,0 М мочевинамен (1 мл) және 0,2 М аммоний бикарбонатымен (1 мл) араластырылған. Ерітінді 10 минут бойы араластырылып, 37°C температурада су моншасында 6 сағат бойы ұсталды, содан кейін 1 мл 0,1% TFA ерітіндісімен сөндіру жүргізілді. Ерітіндіні сүзіп, 4°C-тан төмен температурада сақтаңыз.
Пептидті қоспалар мен HSA трипсин дайджесттерінің бөлінуі PMP бағандарында бөлек бағаланды. PMP бағанындағы HSA пептидті қоспасы мен трипсин дайджестінің бөлінуін тексеріп, нәтижелерді Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстырыңыз. Теориялық пластина нөмірі келесідей есептеледі:
Жалаң кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің SEM суреттері 2-суретте көрсетілген. Жалаң кремний диоксиді бөлшектерінің SEM суреттері (A, B) біздің алдыңғы зерттеулерімізден айырмашылығы, бұл бөлшектердің сфералық екенін, онда бөлшектер созылған немесе дұрыс емес симметрияға ие екенін көрсетеді. Лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің (C, D) беті жалаң кремний диоксиді бөлшектеріне қарағанда тегіс, бұл кремний диоксиді бөлшектерінің бетінде полистирол тізбектерінің жабылуына байланысты болуы мүмкін.
Жалаңаш кремний диоксиді бөлшектерінің (A, B) және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің (C, D) сканерлеуші ​​электронды микроскоптық суреттері.
Жалаңаш кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектер өлшемінің таралуы 3(A) суретте көрсетілген. Көлемге негізделген бөлшектер өлшемінің таралу қисықтары химиялық модификациядан кейін кремний диоксиді бөлшектерінің өлшемінің артқанын көрсетті (3A сурет). Ағымдағы зерттеу мен алдыңғы зерттеуден алынған кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектер өлшемінің таралу деректері 1(A) кестесінде салыстырылған. PMP көлемге негізделген бөлшектер өлшемі, d(0.5), біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда 3,36 мкм құрайды, ad(0.5) мәні 3,05 мкм (полистиролмен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері)34. Бұл партия реакция қоспасындағы PEG, мочевина, TMOS және сірке қышқылының әртүрлі арақатынастарына байланысты біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда бөлшектер өлшемінің таралуы тар болды. PMP фазасының бөлшектер өлшемі біз бұрын зерттеген полистиролмен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің фазасынан сәл үлкенірек. Бұл кремний диоксиді бөлшектерінің стиролмен беттік функционалдануы кремний диоксиді бетіне тек полистирол қабатын (0,97 мкм) қалдырғанын білдіреді, ал PMP фазасында... қабаттың қалыңдығы 1,38 мкм болды.
Жалаңаш кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектер өлшемінің таралуы (A) және кеуек өлшемінің таралуы (B).
Ағымдағы зерттеудің кремний диоксиді бөлшектерінің кеуек өлшемі, кеуек көлемі және беттік ауданы 1(B) кестесінде келтірілген. Жалаңаш кремний диоксиді бөлшектерінің және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің PSD профильдері 3(B) суретте көрсетілген. Нәтижелер біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырмалы. Жалаңаш және лигандпен байланысқан кремний диоксиді бөлшектерінің кеуек өлшемдері сәйкесінше 310 және 241 құрайды, бұл химиялық модификациядан кейін кеуек өлшемінің 69-ға азаятынын көрсетеді, бұл 1(B) кестесінде көрсетілген, ал қисықтың өзгеруі 3(B) суретте көрсетілген. Сол сияқты, химиялық модификациядан кейін кремний диоксиді бөлшектерінің кеуек көлемі 0,67-ден 0,58 см3/г-ға дейін төмендеді. Қазіргі уақытта зерттеліп жатқан кремний диоксиді бөлшектерінің меншікті беттік ауданы 116 м2/г құрайды, бұл біздің алдыңғы зерттеуімізбен (124 м2/г) салыстырмалы. 1(B) кестесінде көрсетілгендей, кремний диоксиді бөлшектерінің беттік ауданы (м2/г) да 116 м2/г-дан 105-ке дейін төмендеді. химиялық модификациядан кейінгі м2/г.
Стационарлық фазаның элементтік талдау нәтижелері 2-кестеде көрсетілген. Ағымдағы стационарлық фазаның көміртегі жүктемесі 6,35% құрайды, бұл біздің алдыңғы зерттеуіміздегі көміртегі жүктемесінен төмен (полистиролмен байланысқан кремний диоксиді бөлшектері, сәйкесінше 7,93%35 және 10,21%) 42. Ағымдағы стационарлық фазаның көміртегі жүктемесі төмен, себебі ток SP дайындау кезінде стиролдан басқа, фенилмалеимид-метилвинилисоцианат (PCMP) және 4-гидрокси-TEMPO сияқты кейбір полярлық лигандтар қолданылды. Ағымдағы стационарлық фазаның азот салмақтық пайызы 2,21% құрайды, ал алдыңғы зерттеулердегі азоттың салмағы бойынша сәйкесінше 0,1735 және 0,85% болды. Бұл фенилмалеимидтің әсерінен ағымдағы стационарлық фазада азоттың салмақтық пайызы жоғары екенін білдіреді. Сол сияқты, (4) және (5) өнімдерінің көміртегі жүктемесі сәйкесінше 2,7% және 2,9% болды, ал соңғы өнімнің көміртегі жүктемесі (6) 2-кестеде көрсетілгендей 6,35% құрады. Салмақ жоғалту PMP стационарлық фазасымен тексерілді, ал TGA қисығы 4-суретте көрсетілген. TGA қисығы 8,6% салмақ жоғалтуды көрсетеді, бұл көміртегі жүктемесімен (6,35%) жақсы сәйкес келеді, себебі лигандтарда тек C ғана емес, сонымен қатар N, O және H бар.
Фенилмалеимид-метилвинилицоцианат лиганды кремний диоксиді бөлшектерінің беткі модификациясы үшін таңдалды, себебі оның құрамында полярлы фенилмалеимид топтары және винилисоцианат топтары бар. Винил изоцианат топтары тірі радикалды полимерлеу арқылы стиролмен одан әрі әрекеттесе алады. Екінші себеп - аналитпен орташа өзара әрекеттесетін және аналит пен стационарлық фаза арасында күшті электростатикалық өзара әрекеттесуі жоқ топты енгізу, себебі фенилмалеимид бөлігінің қалыпты рН кезінде виртуалды заряды жоқ. Стационарлық фазаның полярлығын стиролдың оңтайлы мөлшерімен және бос радикалды полимерленудің реакция уақытымен басқаруға болады. Реакцияның соңғы кезеңі (еркін радикалды полимерлену) өте маңызды және стационарлық фазаның полярлығын өзгерте алады. Бұл стационарлық фазалардың көміртегі жүктемесін тексеру үшін элементтік талдау жүргізілді. Стирол мөлшерін және реакция уақытын арттыру стационарлық фазаның көміртегі жүктемесін арттыратыны және керісінше байқалды. Әртүрлі концентрациядағы стиролмен дайындалған SP-лердің көміртегі жүктемесі әртүрлі. Тағы да, бұл стационарлық фазаларды тот баспайтын болат бағандарға салып, олардың Хроматографиялық өнімділік (селективтілік, ажыратымдылық, N мәні және т.б.). Осы тәжірибелерге сүйене отырып, бақыланатын полярлықты және аналиттің жақсы сақталуын қамтамасыз ету үшін PMP стационарлық фазасын дайындау үшін оңтайландырылған формула таңдалды.
Бес пептидтік қоспа (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) жылжымалы фазаны пайдаланатын PMP бағанын пайдаланып бағаланды; 60/40 (көлем/көлем) ацетонитрил/су (0,1% TFA) 80 мкл/мин ағын жылдамдығында. Оңтайлы элюция жағдайында бағанға теориялық пластина саны (N) (100 × 1,8 мм идентификатор) 20 000 ± 100 (200 000 пластина/м²). 3-кестеде үш PMP бағанының N мәндері берілген, ал хроматограммалар 5А-суретте көрсетілген. Жоғары ағын жылдамдығында (700 мкл/мин) PMP бағанында жылдам талдау жүргізілді, бір минут ішінде бес пептид элюцияланды, N мәндері өте жақсы болды, бағанға 13 500 ± 330 (100 × 1,8 мм идентификатор), 135 000 пластина/м² сәйкес келеді (5B-сурет). Бірдей өлшемдегі үш бағанға (100 × 1,8 мм идентификатор) тексеру үшін PMP стационарлық фазасының үш түрлі партиясы салынды. қайталану мүмкіндігі. Әрбір баған үшін аналит концентрациясы оңтайлы элюция шарттарын, теориялық пластиналар саны N және әр бағандағы бірдей сынақ қоспасын бөлу үшін сақтау уақытын пайдаланып жазылды. PMP бағандарының қайталану мүмкіндігі туралы деректер 4-кестеде көрсетілген. PMP бағанының қайталану мүмкіндігі 3-кестеде көрсетілгендей өте төмен %RSD мәндерімен жақсы корреляцияланады.
ПМП бағанында (B) және Ascentis Express RP-Amide бағанында (A) пептидтік қоспаны бөлу; жылжымалы фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), ПМП бағанының өлшемдері (100 × 1,8 мм id); аналитикалық Қосылыстардың элюция реті: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) және 5 (лейцин) қышқылы энкефалин)).
Жоғары өнімді сұйық хроматографияда адам сарысуы альбуминінің триптикалық дайджесттерін бөлу үшін PMP бағаны (100 × 1,8 мм ид.) бағаланды. 6-суреттегі хроматограмма үлгінің жақсы бөлінгенін және ажыратымдылығы өте жақсы екенін көрсетеді. HSA дайджесттері 100 мкл/мин ағын жылдамдығын, 70/30 ацетонитрил/су жылжымалы фазасын және 0,1% TFA пайдаланып талданды. Хроматограммада көрсетілгендей (6-сурет), HSA дайджесті 17 пептидке сәйкес келетін 17 шыңға бөлінді. HSA дайджестіндегі әрбір шыңның бөлу тиімділігі есептелді және мәндер 5-кестеде келтірілген.
HSA триптикалық дайджесті (100 × 1,8 мм ид.) PMP бағанында бөлінді; ағын жылдамдығы (100 мкл/мин), жылжымалы фазасы 60/40 ацетонитрил/су, 0,1% TFA бар.
мұндағы L - баған ұзындығы, η - жылжымалы фазаның тұтқырлығы, ΔP - бағанның кері қысымы, ал u - жылжымалы фазаның сызықтық жылдамдығы. PMP бағанының өткізгіштігі 2,5 × 10-14 м2, ағын жылдамдығы 25 мкл/мин болды және 60/40 v/v ACN/су пайдаланылды. PMP бағанының өткізгіштігі (100 × 1,8 мм идентификатор) біздің алдыңғы зерттеуіміздің 34 сілтемесіндегіге ұқсас болды. Беткі кеуекті бөлшектермен толтырылған бағанның өткізгіштігі: 1,3 мкм бөлшектер үшін 1,7 × 10-15, 1,7 мкм бөлшектер үшін 3,1 × 10-15, 2,6 мкм бөлшектер үшін 5,2 × 10-15 және 2,5 × 10-14 м2. 5 мкм бөлшектер үшін 43. Сондықтан PMP фазасының өткізгіштігі 5 мкм өзек қабығының өткізгіштігіне ұқсас. бөлшектер.
мұндағы Wx - хлороформмен толтырылған бағанның салмағы, Wy - метанолмен толтырылған бағанның салмағы, ал ρ - еріткіштің тығыздығы. Метанолдың (ρ = 0.7866) және хлороформның (ρ = 1.484) тығыздықтары. Біз бұрын зерттеген КРЕМНИЙ БӨЛШЕКТЕРІ-C18 бағандарының (100 × 1.8 мм id) 34 және C18-Мочевина бағандарының 31 жалпы кеуектілігі сәйкесінше 0.63 және 0.55 болды. Бұл мочевина лигандтарының болуы стационарлық фазаның өткізгіштігін төмендететінін білдіреді. Екінші жағынан, PMP бағанының жалпы кеуектілігі (100 × 1.8 мм id) 0.60 құрайды. PMP бағандарының өткізгіштігі C18-байланысқан кремний диоксиді бөлшектерімен толтырылған бағандарға қарағанда төмен, себебі C18 типті стационарлық фазаларда C18 лигандтары кремний диоксиді бөлшектеріне сызықтық тізбектер түрінде бекітілген, ал полистирол типті стационарлық фазаларда A салыстырмалы түрде қалың. оның айналасында полимер қабаты пайда болады. Әдеттегі тәжірибеде бағанның кеуектілігі келесідей есептеледі:
7A, B суреттерінде ван Деемтер графигінің бірдей элюция шарттарын (яғни, 60/40 ACN/H2O және 0,1% TFA) пайдаланып PMP бағаны (100 × 1,8 мм идентификатор) және Ascentis Express RP-Amide бағаны (100 × 1,8 мм идентификатор) көрсетілген. Таңдалған пептидті қоспалар (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 мкл/да дайындалды. Екі баған үшін де минималды ағын жылдамдығы 800 мкл/мин. PMP бағанасы мен Ascentis Express RP-Amide бағанасы үшін оңтайлы ағын жылдамдығындағы (80 мкл/мин) HETP минималды мәндері сәйкесінше 2,6 мкм және 3,9 мкм болды. HETP мәндері PMP бағанының (100 × 1,8 мм идентификатор) бөлу тиімділігі коммерциялық қолжетімді Ascentis Express RP-Amide бағанына (100 × 1,8 мм идентификатор) қарағанда әлдеқайда жақсы екенін көрсетеді. 7(A) суреттегі ван Деемтер графигі ағынның артуымен N мәнінің төмендеуі біздің алдыңғы зерттеуімізбен салыстырғанда маңызды емес екенін көрсетеді. PMP бағанының (100 ×) жоғары бөлу тиімділігі Ascentis Express RP-Amide бағанымен салыстырғанда 1,8 мм id) өлшемі ағымдағы жұмыста қолданылған бөлшектердің пішінін, өлшемін және күрделі бағандарды орау процедураларын жақсартуға негізделген34.
(A) 0,1% TFA бар 60/40 ACN/H2O ішіндегі PMP бағанын (100 × 1,8 мм идентификатор) пайдаланып алынған ван Димтер графигі (HETP және жылжымалы фазалық сызықтық жылдамдық).(B) 0,1% TFA бар 60/40 ACN/H2O ішіндегі Ascentis Express RP-Amide бағанын (100 × 1,8 мм идентификатор) пайдаланып алынған ван Димтер графигі (HETP және жылжымалы фазалық сызықтық жылдамдық).
Жоғары өнімді сұйық хроматографияда адам сарысуы альбуминінің (HAS) синтетикалық пептидтік қоспалары мен трипсин қорытылуын бөлу үшін полярлы ендірілген полистирол стационарлық фазасы дайындалып, бағаланды. Пептидтік қоспаларға арналған PMP бағандарының хроматографиялық өнімділігі бөлу тиімділігі мен ажыратымдылығы жағынан өте жақсы. PMP бағандарының бөлу өнімділігінің жақсаруы әртүрлі себептерге байланысты, мысалы, кремний диоксиді бөлшектерінің бөлшектерінің өлшемі мен кеуек өлшемі, стационарлық фазаның бақыланатын синтезі және бағанның күрделі орамдалуы. Жоғары бөлу тиімділігінен басқа, жоғары ағын жылдамдығында бағанның төмен кері қысымы бұл стационарлық фазаның тағы бір артықшылығы болып табылады. PMP бағандары жақсы қайталанушылықты көрсетеді және әртүрлі ақуыздардың пептидтік қоспаларын талдау және трипсин қорыту үшін пайдаланылуы мүмкін. Біз бұл бағанды ​​сұйық хроматографияда табиғи өнімдерді, дәрілік өсімдіктерден алынған биоактивті қосылыстарды және саңырауқұлақ сығындыларын бөлу үшін пайдалануды жоспарлап отырмыз. Болашақта PMP бағандары ақуыздар мен моноклоналды антиденелерді бөлу үшін де бағаланады.
Филд, Дж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х. және Петерссон, П. Кері фазалы хроматография арқылы пептидтерді бөлу жүйелерін зерттеу I бөлім: Бағанды ​​сипаттау хаттамасын әзірлеу. Хроматография журналы. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б. және т.б. Жұқпалы ауруларды емдеуге арналған жақсартылған белсенді пептидтер. Биотехнология. Жетілдірілген. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж. және Хрестчатиский, М. Синтетикалық терапиялық пептидтер: ғылым және нарық. Дәрілік заттарды ашу.15 (1-2) бүгін, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Сие, Ф., Смит, РД және Шен, Ю. Жетілдірілген протеомды сұйықтық хроматографиясы. Хроматография журналы. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. және т.б. Жетілдірілген сұйықтық хроматографиясы-масс-спектрометриясы кеңінен бағытталған метаболомика мен протеомиканы енгізуге мүмкіндік береді. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, С.М. және Салисбери, Дж.Дж. Дәрілік заттарды әзірлеудегі UHPLC рөлі. J. ​​Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. және Клаузен, А.М. Жылдам бөлуге арналған аса жоғары қысымды сұйықтық хроматографиясының негізгі және практикалық аспектілері. J. ​​Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. және Челитчефф, П. Дәрілік заттарды әзірлеуде аса жоғары өнімді сұйықтық хроматографиясын қолдану. Хроматография журналы. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. және т.б. Энтеровирустарды тиімді тазарту үшін судағы майдың жоғары ішкі фазалы эмульсияларынан дайындалған монолитті макрокеуекті гидрогельдер. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. және Уилкинс, ДЖА Сұйық хроматографияның протеомикадағы рөлі. Хроматография журналы. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Терапиялық пептидтер мен ақуыздарды кері фазалы сұйықтық хроматографиясымен бөлудегі жаңа үрдістер: теория және қолданылуы. J. Pharmacy. Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Бірінші және екінші бөлу өлшемдерінде әртүрлі рН мәндерін қолдана отырып, RP-RP-HPLC жүйесін пайдаланып пептидтерді екі өлшемді бөлу. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Фелетти, С. және т.б. Толық және үстірт кеуекті бөлшектермен толтырылған C18 суб-2 мкм жоғары тиімді хроматографиялық бағандардың масса тасымалдау сипаттамалары мен кинетикалық көрсеткіштері зерттелді. J. ​​Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Пиовесана, С. және т.б. Өсімдік биоактивті пептидтерін оқшаулау, идентификациялау және валидациялаудағы соңғы үрдістер мен аналитикалық қиындықтар. анус. биологиялық анус. Chemical.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж.Б. және т.б. Тіршілік патшалығының протеомдық ландшафты. Табиғат 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
ДеЛука, К. және т.б. Препараттық сұйық хроматография арқылы терапиялық пептидтерді төменнен өңдеу. Molecule (Базель, Швейцария) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Аралас режимдегі хроматография және оны биополимерлерге қолдану. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Аралас режимдегі ақуыз хроматографиясына арналған лигандтар: принципі, сипаттамасы және дизайны. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).