Go raibh maith agat as cuairt a thabhairt ar Nature.com. Tá tacaíocht theoranta do CSS sa leagan brabhsálaí atá in úsáid agat. Chun an taithí is fearr a fháil, molaimid duit brabhsálaí nuashonraithe a úsáid (nó mód comhoiriúnachta a mhúchadh in Internet Explorer). Idir an dá linn, chun tacaíocht leanúnach a chinntiú, taispeánfaimid an suíomh gan stíleanna agus JavaScript.
Ullmhaíodh cáithníní shilice scagach trí mhodh sol-glóthach le roinnt modhnuithe chun cáithníní macrapóireacha a fháil. Rinneadh na cáithníní seo a dhíorthú trí pholaiméiriú aistrithe slabhra ilroinnte breise inchúlaithe (RAFT) le N-feinilmailíd-meitilviniliseacianáit (PMI) agus stéiréin chun idirshuíomh N-feinilmailíd de chéim sheasta polaistiréin (PMP) a ullmhú. Pacáladh colúin cruach dhosmálta caol-tholláin (100 × 1.8 mm id) trí phacáil sludair. Rinneadh meastóireacht ar dheighilt colún PMP ar mheascán peiptíde ina bhfuil cúig pheiptíd (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) feidhmíocht chrómatagrafaíochta) agus díleá trypsin ar albaimin séiream daonna (HAS). Faoi choinníollacha elution is fearr, tá comhaireamh pláta teoiriciúil an mheascáin peiptíde chomh hard le 280,000 pláta/m². Rinneadh comparáid idir feidhmíocht dheighilte an cholúin fhorbartha agus an Ascentis Express tráchtála. I gcolún RP-Amide, breathnaíodh go raibh feidhmíocht deighilte an cholúin PMP níos fearr ná an cholún tráchtála i dtéarmaí éifeachtúlachta deighilte agus taifeach.
Le blianta beaga anuas, tá an tionscal bithchógaisíochta ina mhargadh domhanda atá ag leathnú agus méadú suntasach tagtha ar a sciar den mhargadh. Le fás pléascach an tionscail bithchógaisíochta1,2,3, tá an-tóir ar anailís a dhéanamh ar pheiptídí agus ar phróitéiní. Chomh maith leis an bpeiptíd sprice, gintear roinnt eisíontais le linn sintéis peiptíde, rud a éilíonn íonú crómatagrafaíochta chun peiptídí den íonacht atá ag teastáil a fháil. Is tasc thar a bheith dúshlánach é anailís agus tréithriú próitéiní i sreabháin choirp, i bhfíocháin agus i gcealla mar gheall ar an líon mór speiceas is féidir a bhrath i sampla amháin. Cé gur uirlis éifeachtach í mais-speictriméadracht le haghaidh seicheamhú peiptíde agus próitéine, má instealltar samplaí den sórt sin isteach sa mais-speictriméadar in aon phas amháin, ní bheidh an scaradh idéalach. Is féidir an fhadhb seo a mhaolú trí scaradh crómatagrafaíochta leachta (LC) a chur i bhfeidhm roimh anailís MS, rud a laghdóidh líon na n-anailítí a théann isteach sa mais-speictriméadar ag am ar leith4,5,6. Ina theannta sin, le linn scaradh céime leachta, is féidir anailítí a dhíriú i réigiúin chúng, rud a fhágann go ndírítear na hanailítí seo agus go bhfeabhsaítear íogaireacht bhrath MS. Tá dul chun cinn suntasach déanta ar chrómatagrafaíocht leachta (LC) le deich mbliana anuas agus tá sí anois ina ceann coitianta. teicníc in anailís phróitéómach7,8,9,10.
Úsáidtear crómatagrafaíocht leachtach céim droim ar ais (RP-LC) go forleathan chun meascán peiptíde a íonú agus a dheighilt ag baint úsáide as shilice ochtadeicil-mhodhnaithe (ODS) mar an chéim sheasta11,12,13. Mar sin féin, ní sholáthraíonn céimeanna seasta RP deighilt shásúil peiptídí agus próitéiní mar gheall ar a struchtúr casta agus a nádúr amfaifileach14,15. Dá bhrí sin, tá gá le céimeanna seasta atá deartha go speisialta chun peiptídí agus próitéiní a anailísiú le codanna polacha agus neamhpholacha chun idirghníomhú leis na hanailítí seo agus iad a choinneáil16. Is féidir le crómatagrafaíocht mhód measctha, a sholáthraíonn idirghníomhaíochtaí ilmhódacha, a bheith ina rogha eile seachas RP-LC chun peiptídí, próitéiní agus meascáin chasta eile a dheighilt. Ullmhaíodh roinnt céimeanna seasta mód measctha, agus úsáideadh colúin atá pacáilte leis na céimeanna seo le haghaidh deighiltí peiptíde agus próitéine17,18,19,20,21. Tá céimeanna seasta mód measctha (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, idirshuíomh polach/RPLC) oiriúnach le haghaidh deighiltí peiptíde agus próitéine mar gheall ar láithreacht an dá cheann polach agus neamhpholach. grúpaí22,23,24,25,26,27,28. Ar an gcaoi chéanna, léiríonn céimeanna stáiseanacha idirshuímheacha polacha le grúpaí polacha atá nasctha go comhfhiúsach cumhacht dheighilte mhaith agus roghnaíocht uathúil d'anailítí polacha agus neamhpholacha, toisc go mbraitheann an deighilt ar an idirghníomhaíocht idir an anailít agus an chéim stáiseanach. Idirghníomhaíochtaí ilmhódacha29, 30, 31, 32.Le déanaí, d'ullmhaigh Zhang et al.30 céim stáiseanach polaimíne foirceanta le dodecyl agus d'éirigh leo hidreacarbóin, frithdhúlagráin, flavonoidí, núicléasídí, estrogens, agus roinnt anailítí eile a dheighilt go rathúil.Tá grúpaí polacha agus neamhpholacha araon ag an idirshuímheach polach, mar sin is féidir é a úsáid chun peiptídí agus próitéiní a bhfuil codanna hidreafóbacha agus hidreafíleacha acu a dheighilt.Tá colúin atá leabaithe i bpolacha (m.sh., colúin C18 atá leabaithe in aimíd) ar fáil go tráchtála faoin ainm trádála colúin Ascentis Express RP-Amide, ach ní úsáidtear na colúin seo ach chun anailís a dhéanamh ar aimín 33.
Sa staidéar reatha, ullmhaíodh agus rinneadh meastóireacht ar chéim sheasta atá leabaithe i bpolair (polaistiréin atá leabaithe i N-feinilmailíd) le haghaidh scaradh peiptídí agus díleácha trypsin de HSA. Ullmhaíodh an chéim sheasta ag baint úsáide as an straitéis seo a leanas. Ullmhaíodh cáithníní shilice scagach de réir an nós imeachta a tugadh inár bhfoilseachán roimhe seo le roinnt modhnuithe ar an bprótacal ullmhúcháin. Coigeartaíodh an cóimheas úiré, poileitiléin glycol (PEG), TMOS, uisce aigéad aicéiteach chun cáithníní shilice a ullmhú le méid mór póir. Ar an dara dul síos, sintéisíodh ligand nua, feinilmailíd-meitil vinile isocianáit, agus úsáideadh é chun cáithníní shilice a dhíorthú chun céim sheasta atá leabaithe i bpolair a ullmhú. Pacáladh an chéim sheasta mar thoradh air sin i gcolún cruach dhosmálta (100 × 1.8 mm id) ag baint úsáide as an scéim pacála optamaithe. Cuidítear leis an bpacáil colún le creathadh meicniúil chun a chinntiú go bhfoirmítear leaba aonchineálach laistigh den cholún. Déan meastóireacht ar scaradh pacáilte colún meascán peiptíde ina bhfuil cúig pheiptíd; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) agus díleá trypsin d'albaimin séiream daonna (HAS). Breathnaíodh go raibh an meascán peptide agus díleá trypsin de HSA ag scaradh le réiteach agus éifeachtúlacht mhaith. Rinneadh comparáid idir feidhmíocht scaradh an cholúin PMP agus feidhmíocht scaradh an cholúin Ascentis Express RP-Amide. Breathnaíodh go raibh na peptides agus na próitéiní araon dea-réitithe agus éifeachtach ar an gcolún PMP, a bhí níos éifeachtaí ná an colún Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Poileitiléin Glicól), Úiré, Aigéad Aicéiteach, Trímheitocsa Ortashiliceat (TMOS), Trímheitil Chlóraisilán (TMCS), Trypsin, Albúimín Séiream Daonna (HSA), Clóiríd Amóiniam, Úiré, Heicsán Meitildisilazán (HMDS), Clóiríd Meatacriolóile (MC), Stíréin, 4-Hiodrocsa-TEMPO, Beinsoile Peroxide (BPO), Aicéatóinítríl Grád HPLC (ACN), Meatánól, 2-Própanól, agus Aicéatón Ceannaithe ó Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAM).
Corraíodh meascán d'úiré (8 g), poileitiléin glycol (8 g), agus 8 mL d'aigéad aicéiteach 0.01 N ar feadh 10 nóiméad, agus ansin cuireadh 24 mL de TMOS leis faoi choinníollacha oighir-fhuar. Téite an meascán imoibrithe ag 40°C ar feadh 6 uair an chloig agus ansin ag 120°C ar feadh 8 n-uaire an chloig in uathchlabh cruach dhosmálta. Doirteadh an t-uisce amach agus triomaíodh an t-ábhar iarmharach ag 70°C ar feadh 12 uair an chloig. Meilteadh an mhais bhog thriomú go réidh in oigheann agus cailcíníodh í ag 550°C ar feadh 12 uair an chloig. Ullmhaíodh agus tréithríodh trí bhaisc chun in-atáirgtheacht i méid na gcáithníní, méid na bpoll agus achar dromchla a scrúdú.
Trí mhodhnú dromchla cáithníní shilice le ligand réamh-shintéisithe feinilmailíd-meitilviniliseacianáit (PCMP) agus ansin polaiméiriú gathach le stíréin, ullmhaíodh comhdhúil ina bhfuil grúpa polach. Céim sheasta do chomhiomláin agus slabhraí polaistiréin. Déantar cur síos ar an bpróiseas ullmhúcháin thíos.
Tuaslagadh N-feinilmailíd (200 mg) agus meitile vinile isocianáit (100 mg) i dtolúéin thirim, agus cuireadh 0.1 mL de 2,2′-asóisobútairínitríle (AIBN) leis an bhfleascán imoibrithe chun cóipliméir feinilmailíd-meitile vinile isocianáite (PMCP) a ullmhú. Téitear an meascán ag 60°C ar feadh 3 uair an chloig, scagtar é agus triomaítear é in oigheann ag 40°C ar feadh 3 uair an chloig.
Scaipeadh cáithníní shilice triomaithe (2 g) i dtolúéin thirim (100 mL), corraíodh agus rinneadh soniciú orthu i bhfleascán bun cruinn 500 mL ar feadh 10 nóiméad. Tuaslagadh PMCP (10 mg) i dtolúéin agus cuireadh braoiníní leis an bhfleascán imoibrithe é trí fhunail braoiníní. Rinneadh an meascán a athshruthú ag 100°C ar feadh 8 n-uaire an chloig, scagadh é agus nite le haicéatón agus triomaíodh é ag 60°C ar feadh 3 uair an chloig. Ansin, tuaslagadh cáithníní shilice nasctha le PMCP (100 g) i dtolúéin (200 ml) agus cuireadh 4-hiodrocsa-TEMPO (2 mL) leis i láthair 100 µL de dhélauráit débhúitile stáin mar chatalaíoch. Corraíodh an meascán ag 50°C ar feadh 8 n-uaire an chloig, scagadh é agus triomaíodh é ag 50°C ar feadh 3 uair an chloig.
Scaipeadh stíréin (1 mL), sárocsaíd beinsóil BPO (0.5 mL), agus cáithníní shilice ceangailte le TEMPO-PMCP (1.5 g) i dtolúéin agus glanadh iad le nítrigin. Rinneadh polaiméiriú stíréine ag 100°C ar feadh 12 uair an chloig. Níodh an táirge mar thoradh air sin le meatánól agus triomaíodh é ag 60°C thar oíche. Taispeántar an scéim imoibrithe fhoriomlán i bhFíor 1.
Díghásáladh na samplaí ag 393 K ar feadh 1 uair an chloig chun brú iarmharach níos lú ná 10-3 Torr a fháil. Baineadh úsáid as an méid N2 a ionsúdh ag brú coibhneasta P/P0 = 0.99 chun an toirt iomlán póire a chinneadh. Rinneadh scrúdú ar mhoirfeolaíocht na gcáithníní shilice lom agus ligand-nasctha le micreascópacht scanadh leictreon (Hitachi High Technologies, Tóiceo, an tSeapáin). Cuireadh samplaí triomaithe (shilice lom agus cáithníní shilice ligand-nasctha) ar cholún alúmanaim ag baint úsáide as téip ghreamaitheach carbóin. Plátáladh ór ar na samplaí ag baint úsáide as cótálaí spútar Q150T, agus taiscíodh ciseal Au 5 nm ar na samplaí. Feabhsaíonn sé seo éifeachtúlacht an phróisis ag baint úsáide as voltais ísle agus soláthraíonn sé spútaráil fuar, gráin mhín. Baineadh úsáid as anailíseoir eiliminteach Thermo Electron (Waltham, MA, SAM) Flash EA1112 le haghaidh anailíse eiliminteach. Baineadh úsáid as anailíseoir méid cáithníní Malvern (Worcestershire, an Ríocht Aontaithe) Mastersizer 2000 chun an dáileadh méid cáithníní a fháil. Cáithníní shilice nocht agus cáithníní shilice ligand-nasctha (5 mg an ceann) scaipthe i 5 mL d'iseaprópánól, rinneadh iad a shoniciú ar feadh 10 nóiméad, a chorraíl ar feadh 5 nóiméad, agus a chur ar bhinse optúil an Mastersizer. Rinneadh anailís theirmighribhiméadrach ag ráta 5 °C in aghaidh an nóiméid thar raon teochta 30 go 800 °C.
Pacáladh colúin cruach dhosmálta caol-tholláin atá líneáilte le gloine de thoisí (100 × 1.8 mm id) ag baint úsáide as an modh pacála sloda, ag cur i bhfeidhm an nós imeachta céanna a úsáideadh i dTagairt. 31. Ceanglaíodh colún cruach dhosmálta (líneáilte le gloine, 100 × 1.8 mm id) le feistiú asraonta ina raibh friot 1 µm le pacálaí sloda (Alltech Deerfield, IL, SAM). Ullmhaigh sloda céime seasta trí 150 mg de chéim sheasta a chur ar fionraí i 1.2 mL de mheatánól agus é a sheoladh chuig an gcolún stórála. Úsáideadh meatánól mar thuaslagóir sloda chomh maith leis an tuaslagóir tiomána. Líon an colún de réir a chéile trí bhrúnna 100 MP a chur i bhfeidhm ar feadh 10 nóiméad, 80 MP ar feadh 15 nóiméad, agus 60 MP ar feadh 30 nóiméad. Le linn na pacála, cuireadh creathadh meicniúil i bhfeidhm le dhá chroitheadóir colún GC (Alltech, Deerfield, IL, SAM) chun pacáil aonfhoirmeach an cholúin a chinntiú. Dún an pacálaí sloda agus scaoil an brú go mall chun aon damáiste laistigh den cholún a chosc. Dícheangail an colún ón aonad pacála sloda agus ceangail feistiú eile leis an ionraon agus leis an gcóras LC chun a fheidhmíocht a sheiceáil.
Tógadh caidéal LC (10AD Shimadzu, an tSeapáin), insteallóir (Valco (SAM) C14 W.05) le lúb insteallta 50nL, díghásálaí membrane (Shimadzu DGU-14A), fuinneog ribeach UV-VIS. Braiteoir gléas speisialta µLC (UV-2075) agus micreacholúin líneáilte le gloine. Baineadh úsáid as feadánra nasctha an-chúng agus gearr chun éifeacht leathnú banda breise an cholúin a íoslaghdú. Tar éis pacáistithe, suiteáladh ribeadáin (50 μm id 365) agus ribeadáin aontais laghdaitheacha (50 μm) ag asraon 1/16″ an aontais laghdaitheacha. Rinneadh bailiú sonraí agus próiseáil crómatagrafaíochta ag baint úsáide as bogearraí Multichro 2000. Rinneadh monatóireacht ag 254 nm ar anailísithe le haghaidh ionsú UV. Rinne OriginPro8 (Northampton, MA) anailís ar shonraí crómatagrafaíochta.
Albúimín ó shéiream daonna, púdar lioifile, ≥ 96% (leictreafóiréis glóthach agaróise) 3 mg measctha le trypsin (1.5 mg), 4.0 M úiré (1 mL), agus 0.2 M décharbónáit amóiniam (1 mL). Corraíodh an tuaslagán ar feadh 10 nóiméad agus coinníodh i ndabhach uisce é ag 37°C ar feadh 6 uair an chloig, ansin múchadh é le 1 mL de 0.1% TFA. Scag an tuaslagán agus stóráil faoi bhun 4°C.
Rinneadh meastóireacht ar leithligh ar dheighilt meascán peiptíde agus díleá trypsin HSA ar cholúin PMP. Seiceáil deighilt an mheascáin peiptíde agus díleá trypsin HSA leis an gcolún PMP agus déan comparáid idir na torthaí agus colún Ascentis Express RP-Amide. Ríomhtar an uimhir phláta teoiriciúil mar seo a leanas:
Taispeántar íomhánna SEM de cháithníní shilice lom agus cáithníní shilice nasctha le ligand i bhFíor 2. Léiríonn íomhánna SEM de cháithníní shilice lom (A, B), i gcodarsnacht lenár staidéir roimhe seo, go bhfuil na cáithníní seo sféarúil ina bhfuil na cáithníní sínte nó siméadracht neamhrialta acu. Tá dromchla na gcáithníní shilice nasctha le ligand (C, D) níos míne ná dromchla na gcáithníní shilice lom, rud a d'fhéadfadh a bheith mar gheall ar sciath slabhraí polaistiréin ar dhromchla na gcáithníní shilice.
Íomhánna micreascóp leictreon scanála de cháithníní shilice lom (A, B) agus cáithníní shilice nasctha le ligand (C, D).
Taispeántar dáiltí méid na gcáithníní de cháithníní shilice lom agus cáithníní shilice nasctha le ligand i bhFíor 3(A). Léirigh cuar dáileadh méid na gcáithníní bunaithe ar thoirt gur mhéadaigh méid na gcáithníní shilice tar éis modhnú ceimiceach (Fíor 3A). Déantar comparáid idir sonraí dáileadh méid na gcáithníní de na cáithníní shilice ón staidéar reatha agus ón staidéar roimhe seo i dTábla 1(A). Is é 3.36 μm méid na gcáithníní bunaithe ar thoirt, d(0.5), de PMP, i gcomparáid lenár staidéar roimhe seo le luach ad(0.5) de 3.05 μm (cáithníní shilice ceangailte le polaistiréin)34. Bhí dáileadh méid na gcáithníní níos cúinge ag an mbaisc seo i gcomparáid lenár staidéar roimhe seo mar gheall ar na cóimheasa éagsúla de PEG, úiré, TMOS, agus aigéad aicéiteach sa mheascán imoibrithe. Tá méid na gcáithníní sa chéim PMP beagán níos mó ná méid na gcáithníní shilice ceangailte le polaistiréin a ndearnamar staidéar orthu roimhe seo. Ciallaíonn sé seo nár thaisc feidhmiúlacht dromchla cáithníní shilice le stíréin ach ciseal polaistiréin (0.97 µm) ar dhromchla an shilice, ach sa chéim PMP bhí tiús na sraithe... 1.38 µm.
Dáileadh méid na gcáithníní (A) agus dáileadh méid na bpoll (B) i gcás cáithníní shilice lom agus cáithníní shilice atá ceangailte le ligand.
Tugtar méid na bpoll, toirt na bpoll agus achar dromchla na gcáithníní shilice sa staidéar reatha i dTábla 1(B). Taispeántar próifílí PSD na gcáithníní shilice lom agus na gcáithníní shilice nasctha le ligand i bhFíor 3(B). Tá na torthaí inchomparáide lenár staidéar roimhe seo. Is iad 310 agus 241 méideanna na bpoll sna cáithníní shilice lom agus nasctha le ligand, faoi seach, rud a léiríonn go laghdaíonn méid na bpoll faoi 69 tar éis modhnú ceimiceach, mar a thaispeántar i dTábla 1(B), agus taispeántar an t-athrú ar an gcuar i bhFíor 3(B). Ar an gcaoi chéanna, laghdaigh toirt na bpoll sna cáithníní shilice ó 0.67 go 0.58 cm3/g tar éis modhnú ceimiceach. Is é 116 m2/g achar dromchla sonrach na gcáithníní shilice atá á staidéar faoi láthair, atá inchomparáide lenár staidéar roimhe seo (124 m2/g). Mar a thaispeántar i dTábla 1(B), laghdaigh achar dromchla (m2/g) na gcáithníní shilice freisin ó 116 m2/g go 105 m2/g tar éis modhnú ceimiceach. modhnú.
Léirítear torthaí na hanailíse eilimintí ar an gcéim sheasta i dTábla 2. Is é 6.35% an luchtú carbóin sa chéim sheasta reatha, atá níos ísle ná an luchtú carbóin inár staidéar roimhe seo (cáithníní shilice nasctha le polaistiréin, 7.93%35 agus 10.21%, faoi seach)42. Tá an luchtú carbóin sa chéim sheasta reatha íseal, toisc gur úsáideadh roinnt ligand polar cosúil le feinilmailíd-meitilviniliseacianáit (PCMP) agus 4-hiodrocsa-TEMPO agus an SP reatha á ullmhú, chomh maith le stíréin. Is é 2.21% céatadán meáchain nítrigine na céime seasta reatha, i gcomparáid le 0.1735 agus 0.85% de réir meáchain nítrigine i staidéir roimhe seo, faoi seach. Ciallaíonn sé seo go bhfuil an céatadán meáchain nítrigine níos airde sa chéim sheasta reatha mar gheall ar feinilmailíd. Ar an gcaoi chéanna, ba iad 2.7% agus 2.9%, faoi seach, luchtú carbóin táirgí (4) agus (5), agus luchtú carbóin an táirge deiridh (6) Bhí 6.35% ann, mar a thaispeántar i dTábla 2. Rinneadh an meáchain caillteanas a sheiceáil le céim sheasta PMP, agus taispeántar cuar an TGA i bhFíor 4. Taispeánann cuar an TGA meáchain caillteanas 8.6%, rud atá i gcomhréir mhaith leis an ualach carbóin (6.35%) toisc go bhfuil ní hamháin C sna ligand ach N, O, agus H freisin.
Roghnaíodh an ligand feinilmailímíde-meitilviniliseacianáite le haghaidh modhnú dromchla cáithníní shilice toisc go bhfuil grúpaí feinilmailímíde polacha agus grúpaí viniliseacianáite aige. Is féidir le grúpaí viniliseacianáite imoibriú tuilleadh le stíréin trí pholaiméiriú radacach beo. Is é an dara cúis ná grúpa a chur isteach a bhfuil idirghníomhaíocht mheasartha aige leis an anailít agus gan aon idirghníomhaíocht leictreastatach láidir idir an anailít agus an chéim sheasta, ós rud é nach bhfuil aon lucht fíorúil ag an gcuid feinilmailímíde ag pH gnáth. Is féidir polaraíocht na céime seasta a rialú tríd an méid is fearr stíréine agus am imoibrithe polaiméiriú radacach saor in aisce. Tá an chéim dheireanach den imoibriú (polaiméiriú radacach saor in aisce) ríthábhachtach agus is féidir léi polaraíocht na céime seasta a athrú. Rinneadh anailís eiliminteach chun ualach carbóin na gcéimeanna seasta seo a sheiceáil. Breathnaíodh gur mhéadaigh méadú ar mhéid na stíréine agus an t-am imoibrithe ualach carbóin na céime seasta agus a mhalairt. Tá ualaí carbóin éagsúla ag SPanna ullmhaithe le tiúchain éagsúla stíréine. Arís, luchtaigh na céimeanna seasta seo i gcolúin cruach dhosmálta agus seiceáil a bhfeidhmíocht crómatagrafaíochta (roghnaíocht, taifeach, N luach, etc.).Bunaithe ar na turgnaimh seo, roghnaíodh foirmliú optamaithe chun céim sheasta PMP a ullmhú chun polaraíocht rialaithe agus coinneáil mhaith anailíte a chinntiú.
Rinneadh meastóireacht freisin ar chúig mheascán peptide (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) ag baint úsáide as colún PMP ag baint úsáide as céim shoghluaiste; 60/40 (v/v) aicéatóinítríl/uisce (0.1% TFA) ag ráta sreafa 80 μL/nóim.Faoi choinníollacha eluála is fearr, is é 20,000 ± 100 (200,000 pláta/m²) an líon plátaí teoiriciúil (N) in aghaidh an cholúin (100 × 1.8 mm id).Tugann Tábla 3 na luachanna N do na trí cholún PMP agus taispeántar na crómatagram i bhFíor 5A.Anailís thapa ar cholún PMP ag ráta sreafa ard (700 μL/nóim), eluáladh cúig pheiptíd laistigh de nóiméad amháin, bhí luachanna N an-mhaith, 13,500 ± 330 in aghaidh an cholúin (100 × 1.8 mm id), Freagraíonn sé do 135,000 pláta/m² (Fíor 5B).Pacáileadh trí cholún den mhéid chéanna (100 × 1.8 mm id) le trí bhaisc éagsúla de chéim sheasta PMP chun atáirgtheacht a sheiceáil.An Taifeadadh tiúchan anailíte do gach colún ag baint úsáide as na coinníollacha eluála is fearr agus líon na plátaí teoiriciúla N agus an t-am coinneála chun an meascán tástála céanna a dheighilt ar gach colún. Taispeántar na sonraí atáirgtheachta do na colúin PMP i dTábla 4. Tá comhghaol maith idir atáirgtheacht an cholúin PMP agus luachanna %RSD an-íseal, mar a thaispeántar i dTábla 3.
Deighilt an mheascáin peptide ar cholún PMP (B) agus colún Ascentis Express RP-Amide (A); céim shoghluaiste 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), toisí cholún PMP (100 × 1.8 mm id); anailíseach Ord eluála na gcomhdhúl: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) agus 5 (leucine) aigéad einceifilín)).
Rinneadh meastóireacht ar cholún PMP (100 × 1.8 mm id) chun díleácha tryptacha d'albaimin séiream daonna a dheighilt i gcrómatagrafaíocht leachtach ardfheidhmíochta. Léiríonn an crómatagram i bhFíor 6 go bhfuil an sampla deighilte go maith agus go bhfuil an taifeach an-mhaith. Rinneadh anailís ar dhíleácha HSA ag baint úsáide as ráta sreafa 100 µL/nóim, céim shoghluaiste 70/30 aicéatóinítríl/uisce agus 0.1% TFA. Mar a thaispeántar sa chrómatagram (Fíor 6), roinneadh an díleá HSA ina 17 buaic a fhreagraíonn do 17 peiptíd. Ríomhadh éifeachtúlacht dheighilte gach buaice sa díleá HSA agus tugtar na luachanna i dTábla 5.
Scaradh díleá tryptach de HSA (100 × 1.8 mm id) ar cholún PMP; ráta sreafa (100 µL/nóim), céim shoghluaiste 60/40 aicéatóinítríl/uisce le 0.1% TFA.
áit a seasann L do fhad an cholúin, η do shlaodacht na céime soghluaiste, ΔP do bhrú ar ais an cholúin, agus u do luas líneach na céime soghluaiste. Ba é 2.5 × 10-14 m2 tréscaoilteacht cholún PMP, ba é 25 μL/nóim an ráta sreafa, agus úsáideadh 60/40 v/v ACN/uisce. Bhí tréscaoilteacht cholún PMP (100 × 1.8 mm id) cosúil le tréscaoilteacht ár staidéir roimhe seo Tagairt 34. Is é tréscaoilteacht an cholúin atá pacáilte le cáithníní scagach dromchlach ná: 1.7 × 10-15 do cháithníní 1.3 μm, 3.1 × 10-15 do cháithníní 1.7 μm, 5.2 × 10-15 agus 2.5 × 10-14 m2 do cháithníní 2.6 μm. Do cháithníní 5 μm 43. Dá bhrí sin, tá tréscaoilteacht chéim PMP cosúil le tréscaoilteacht cáithníní croí-bhlaosc 5 μm.
áit a seasann Wx do mheáchan an cholúin atá pacáilte le clóraform, seasann Wy do mheáchan an cholúin atá pacáilte le meatánól, agus seasann ρ do dhlús an tuaslagóra. Dlúis meatánóil (ρ = 0.7866) agus clóraform (ρ = 1.484). Ba iad 0.63 agus 0.55, faoi seach, tréscaoilteacht iomlán na gcolún SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 agus na gcolún C18-Úiré 31 a ndearnamar staidéar orthu roimhe seo. Ciallaíonn sé seo go laghdaíonn láithreacht ligand úiré tréscaoilteacht na céime seasta. Ar an láimh eile, is é 0.60 tréscaoilteacht iomlán an cholúin PMP (100 × 1.8 mm id). Tá tréscaoilteacht cholún PMP níos ísle ná tréscaoilteacht na gcolún atá pacáilte le cáithníní shilice nasctha le C18 toisc go bhfuil na ligand C18 ceangailte leis na cáithníní shilice mar shlabhraí líneacha i gcéimeanna seasta de chineál C18, agus i gcéimeanna seasta de chineál polaistiréin, tá an ciseal polaiméire sách tiubh. déantar timpeall air. I dturgnamh tipiciúil, ríomhtar tréscaoilteacht an cholúin mar:
Taispeánann Fíor 7A,B an colún PMP (100 × 1.8 mm id) agus colún Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) ag baint úsáide as na coinníollacha eluála céanna (i.e., 60/40 ACN/H2O agus 0.1% TFA). ) den phlota van Deemter. Ullmhaíodh meascáin pheiptíde roghnaithe (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) i 20 µL/ Is é 800 µL/nóim an ráta sreafa íosta don dá cholún. Ba iad 2.6 µm agus 3.9 µm, faoi seach, na luachanna HETP íosta ag an ráta sreafa is fearr (80 µL/nóim) don cholún PMP agus don cholún Ascentis Express RP-Amide. Léiríonn na luachanna HETP go bhfuil éifeachtúlacht scaradh an cholúin PMP (100 × 1.8 mm id) i bhfad níos fearr ná an colún Ascentis Express RP-Amide atá ar fáil go tráchtála (100 × 1.8 mm id). Taispeánann plota van Deemter i bhFíor 7(A) nach bhfuil an laghdú ar luach N le méadú ar shreabhadh suntasach i gcomparáid lenár staidéar roimhe seo. Tá éifeachtúlacht scaradh níos airde an cholúin PMP (100 × 1.8 mm id) i gcomparáid leis an gcolún Ascentis Express RP-Amide bunaithe ar fheabhsuithe i gcruth, méid na gcáithníní, agus nósanna imeachta casta pacála colún a úsáidtear sa saothar reatha34.
(A) Plota van Deemter (HETP i gcoinne luas líneach céime soghluaiste) a fuarthas ag baint úsáide as colún PMP (100 × 1.8 mm id) i 60/40 ACN/H2O le 0.1% TFA. (B) Plota van Deemter (HETP i gcoinne luas líneach céime soghluaiste) a fuarthas ag baint úsáide as colún Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) i 60/40 ACN/H2O le 0.1% TFA.
Ullmhaíodh céim sheasta polaistiréin leabaithe i bpol agus rinneadh meastóireacht uirthi le haghaidh scaradh meascán peiptíde sintéiseach agus díleá trypsin d'albaimin séiream daonna (HAS) i gcrómatagrafaíocht leachtach ardfheidhmíochta. Tá feidhmíocht chrómatagrafaíochta colún PMP do mheascáin pheiptíde den scoth maidir le héifeachtúlacht agus réiteach scaradh. Tá feidhmíocht scaradh feabhsaithe colún PMP mar gheall ar chúiseanna éagsúla, amhail méid na gcáithníní agus méid na bpoll de na cáithníní shilice, sintéis rialaithe na céime seasta, agus pacáil chasta colún. Chomh maith le héifeachtúlacht ard scaradh, is buntáiste eile den chéim sheasta seo brú íseal ar ais colún ag rátaí sreafa arda. Taispeánann colúin PMP dea-atáirgtheacht agus is féidir iad a úsáid chun anailís a dhéanamh ar mheascáin pheiptíde agus díleá trypsin próitéiní éagsúla. Tá sé beartaithe againn an colún seo a úsáid chun táirgí nádúrtha, comhdhúile bithghníomhacha ó phlandaí míochaine agus sleachta fungasacha a scaradh i gcrómatagrafaíocht leachtach. Amach anseo, déanfar meastóireacht ar cholúin PMP freisin le haghaidh scaradh próitéiní agus antashubstaintí monachlónacha.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Taighde ar Chórais Deighilte Peiptíde trí Chrómatagrafaíocht Céime Droim ar Ais Cuid I: Forbairt Prótacail Saintréithe Colúin. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Peiptídí gníomhacha feabhsaithe atá deartha le haghaidh cóireáil galair thógálacha. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peiptídí teiripeacha sintéiseacha: eolaíocht agus an margadh. fionnachtain drugaí. 15 (1-2) inniu, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Crómatagrafaíocht Leachtach Próitéómach Ardleibhéil. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al.Cumasaíonn crómatagrafaíocht leachtach ardleibhéil-speictriméadracht mhaise ionchorprú meitibileamaice agus próitéamaice atá dírithe go forleathan.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ról UHPLC i bhforbairt drugaí. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Gnéithe bunúsacha agus praiticiúla de chrómatagrafaíocht leachtach ardbhrú le haghaidh deighiltí tapa. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Feidhmiú crómatagrafaíochta leachta ardfheidhmíochta i bhforbairt drugaí. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Hidrigéil macrapóireacha monailiteacha ullmhaithe ó eibleachtaí ardchéime inmheánaí ola-in-uisce le haghaidh íonú éifeachtach einteirvíris. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ról na crómatagrafaíochta leachta i bpróitéamaíocht. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Treochtaí atá ag teacht chun cinn i ndeighiltí crómatagrafaíochta leachtacha céim-aisiompaithe de pheiptídí teiripeacha agus próitéiní: teoiric agus feidhmeanna. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Deighilt dhéthoiseach peiptídí ag baint úsáide as córas RP-RP-HPLC ag baint úsáide as luachanna pH éagsúla sa chéad agus sa dara toise deighilte.J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Rinneadh imscrúdú ar shaintréithe aistrithe maise agus ar fheidhmíocht chinéiteach colún crómatagrafaíochta ardéifeachtúlachta atá pacáilte le cáithníní C18 faoi bhun 2 μm atá lán-scagach agus dromchlach. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Treochtaí agus dúshláin anailíseacha le déanaí i leithlisiú, sainaithint agus bailíochtú peiptídí bithghníomhacha plandaí.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Tírdhreach próitéómach ríocht na beatha. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Próiseáil iartheachtach peiptídí teiripeacha trí chrómatagrafaíocht leachtach ullmhúcháin. Molecule (Basel, an Eilvéis) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Crómatagrafaíocht mheasctha agus a cur i bhfeidhm ar bhithpholaiméirí. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligands le haghaidh crómatagrafaíocht próitéine measctha-mhodha: prionsabal, tréithriú, agus dearadh. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).