Nature.com پر جانے کے لیے آپ کا شکریہ۔ آپ جو براؤزر ورژن استعمال کر رہے ہیں اسے CSS کے لیے محدود سپورٹ حاصل ہے۔ بہترین تجربہ کے لیے، ہم تجویز کرتے ہیں کہ آپ ایک اپ ڈیٹ شدہ براؤزر استعمال کریں (یا انٹرنیٹ ایکسپلورر میں کمپیٹیبلٹی موڈ آف کر دیں)۔ اس دوران، مسلسل سپورٹ کو یقینی بنانے کے لیے، ہم سائٹ کو بغیر اسٹائلز اور جاوا اسکرپٹ کے ڈسپلے کریں گے۔
غیر محفوظ سلیکا ذرات کو میکرو پورس پارٹیکلز حاصل کرنے کے لیے کچھ ترمیم کے ساتھ سول-جیل کے طریقہ کار سے تیار کیا گیا تھا۔ ان ذرات کو N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) کے ساتھ ریورس ایبل اضافی فریگمنٹیشن چین ٹرانسفر (RAFT) پولیمرائزیشن کے ذریعے اخذ کیا گیا تھا۔ مرحلہ۔ تنگ بور سٹینلیس سٹیل کے کالم (100 × 1.8 ملی میٹر id) سلری پیکنگ کے ذریعے پیک کیے گئے تھے۔ پانچ پیپٹائڈز پر مشتمل پیپٹائڈ مرکب کی پی ایم پی کالم علیحدگی کا جائزہ لیا گیا leucine enkephalin) کرومیٹوگرافک کارکردگی) اور انسانی سیرم البومین (HAS) کا ٹرپسن ہاضمہ۔ زیادہ سے زیادہ اخراج کے حالات کے تحت، پیپٹائڈ مرکب کی نظریاتی پلیٹ کی گنتی 280,000 پلیٹس/m² تک زیادہ ہے۔ ترقی یافتہ کالم کی علیحدگی کی کارکردگی کا موازنہ کرتے ہوئے اس کا مشاہدہ کیا گیا کہ تجارتی طور پر RPN-A کے ساتھ ظاہر ہوتا ہے۔ PMP کالم کی علیحدگی کی کارکردگی علیحدگی کی کارکردگی اور ریزولوشن کے لحاظ سے تجارتی کالم سے بہتر تھی۔
حالیہ برسوں میں، بائیو فارماسیوٹیکل انڈسٹری مارکیٹ شیئر میں خاطر خواہ اضافے کے ساتھ ایک پھیلتی ہوئی عالمی منڈی بن گئی ہے۔ بائیو فارماسیوٹیکل انڈسٹری 1,2,3 کی دھماکہ خیز نمو کے ساتھ، پیپٹائڈز اور پروٹینز کا تجزیہ انتہائی مطلوب ہے۔ ہدف پیپٹائڈ کے علاوہ، کئی نجاستیں پیدا ہوتی ہیں، پیپٹائڈس سنتھیسز کو دوبارہ بنانے کے دوران پیدا ہوتا ہے۔ مطلوبہ پاکیزگی کے پیپٹائڈس حاصل کریں۔ جسمانی رطوبتوں، بافتوں اور خلیوں میں پروٹین کا تجزیہ اور خصوصیت ایک ہی نمونے میں ممکنہ طور پر قابل شناخت پرجاتیوں کی بڑی تعداد کی وجہ سے ایک انتہائی مشکل کام ہے۔ اگرچہ ماس اسپیکٹومیٹری پیپٹائڈ اور پروٹین کی ترتیب کے لیے ایک موثر ذریعہ ہے، اگر اس طرح کے نمونوں کو ماس اسپیکٹرومیٹر میں داخل نہیں کیا جائے گا، تو اس کا معائنہ کیا جائے گا۔ مثالی۔ اس مسئلے کو MS تجزیہ سے پہلے مائع کرومیٹوگرافی (LC) کی علیحدگیوں کو لاگو کرکے کم کیا جا سکتا ہے، جو ایک مقررہ وقت پر ماس اسپیکٹومیٹر میں داخل ہونے والے تجزیہ کاروں کی تعداد کو کم کرے گا 4,5,6۔ اس کے علاوہ، مائع مرحلے کی علیحدگی کے دوران، تجزیہ کاروں کو تنگ علاقوں میں فوکس کیا جا سکتا ہے، اس طرح ایم ایس کا پتہ لگانے کے لیے ماس اسپیکٹومیٹر کی تعداد کم ہو جائے گی۔ sensitivity.Liquid chromatography (LC) نے پچھلی دہائی کے دوران نمایاں طور پر ترقی کی ہے اور پروٹومک تجزیہ7,8,9,10 میں ایک مقبول تکنیک بن گئی ہے۔
ریورسڈ فیز مائع کرومیٹوگرافی (RP-LC) بڑے پیمانے پر پیپٹائڈ مکسچر کی صفائی اور علیحدگی کے لیے آکٹیڈیسیل موڈیفائیڈ سلیکا (ODS) کو اسٹیشنری فیز کے طور پر استعمال کیا جاتا ہے۔ تاہم، RP اسٹیشنری فیزز پیپٹائڈس اور پروٹین کی پیچیدہ ساخت اور پیچیدہ ساخت کی وجہ سے تسلی بخش علیحدگی فراہم نہیں کرتے۔ 14,15 .لہذا، قطبی اور غیر قطبی موئیٹیز کے ساتھ پیپٹائڈس اور پروٹینز کا تجزیہ کرنے کے لیے خصوصی طور پر ڈیزائن کیے گئے اسٹیشنری مراحل کی ضرورت ہوتی ہے تاکہ ان تجزیہ کاروں کے ساتھ تعامل اور اسے برقرار رکھا جاسکے۔ مکسڈ موڈ اسٹیشنری فیزز تیار کیے گئے ہیں، اور ان مراحل سے بھرے کالم پیپٹائڈ اور پروٹین کی علیحدگی کے لیے استعمال کیے گئے ہیں 17,18,19,20,21۔ مکسڈ موڈ اسٹیشنری فیزز (WAX/RPLC، HILIC/RPLC، polar intercalation/RPLC) پیپٹائڈ اور پروٹین دونوں کے لیے موزوں ہیں کیونکہ پولر کی غیر موجودگی کی وجہ سے گروپس 22,23,24,25,26,27,28 .اسی طرح، ہم آہنگی سے بندھے ہوئے قطبی گروپوں کے ساتھ پولر انٹرکیلیٹنگ اسٹیشنری مراحل اچھی علیحدگی کی طاقت اور قطبی اور غیر قطبی تجزیہ کاروں کے لیے منفرد انتخاب کو ظاہر کرتے ہیں، کیونکہ علیحدگی تجزیہ کار اور اسٹیشنری مرحلے کے درمیان تعامل پر منحصر ہے۔ ملٹی موڈل تعاملات 29, 30, 31, 32. حال ہی میں, Zhang et al. 30 نے ایک ڈوڈیسائل ختم شدہ پولیمین سٹیشنری مرحلہ تیار کیا اور ہائیڈرو کاربن، اینٹی ڈپریسنٹس، فلیوونائڈز، نیوکلیوسائیڈز، ایسٹروجن، اور کئی دیگر تجزیہ کاروں کو کامیابی کے ساتھ الگ کیا۔ moieties.Polar-embeded کالم (مثال کے طور پر، amide-embeded C18 کالم) تجارتی طور پر Ascentis Express RP-Amide کالم کے تجارتی نام سے دستیاب ہیں، لیکن یہ کالم صرف amine 33 کے تجزیہ کے لیے استعمال کیے جاتے ہیں۔
موجودہ مطالعہ میں، ایک قطبی ایمبیڈڈ سٹیشنری فیز (N-phenylmaleimide-embedded polystyrene) تیار کیا گیا تھا اور HSA کے پیپٹائڈس اور ٹرپسن ڈائجسٹوں کو الگ کرنے کے لیے اس کا جائزہ لیا گیا تھا۔ اسٹیشنری فیز کو درج ذیل حکمت عملی کا استعمال کرتے ہوئے تیار کیا گیا تھا۔ غیر محفوظ سلیکا ذرات ہماری پچھلی اشاعت میں دیے گئے طریقہ کار کے مطابق تیار کیے گئے تھے۔ پولیتھیلین گلائکول (پی ای جی)، ٹی ایم او ایس، واٹر ایسٹک ایسڈ کو بڑے تاکنے والے سائز کے ساتھ سلکا کے ذرات تیار کرنے کے لیے ایڈجسٹ کیا گیا تھا۔ دوسرا، ایک نیا لیگینڈ، فینائلمالیمائڈ-میتھائل ونائل آئوسیانیٹ، کی ترکیب کی گئی تھی اور قطبی ایمبیڈڈ سٹیشنری مرحلے کو تیار کرنے کے لیے سلکا کے ذرات کو اخذ کرنے کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ (100 × 1.8 ملی میٹر id) آپٹمائزڈ پیکنگ اسکیم کا استعمال کرتے ہوئے۔ کالم کی پیکنگ کو مکینیکل وائبریشن سے مدد ملتی ہے تاکہ یہ یقینی بنایا جا سکے کہ کالم کے اندر ایک یکساں بیڈ بنتا ہے۔ (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) اور ہیومن سیرم البومین (HAS) کا ٹرپسن ڈائجسٹ۔ HSA کے پیپٹائڈ مکسچر اور ٹرپسن ڈائجسٹ کو اچھی ریزولوشن اور پی ایم پی کی کارکردگی کے ساتھ موازنہ کرنے کی کارکردگی کے ساتھ الگ ہونے کا مشاہدہ کیا گیا۔ Ascentis Express RP-Amide column.PMP کالم پر دونوں پیپٹائڈز اور پروٹینز کو اچھی طرح سے حل اور موثر دیکھا گیا، جو Ascentis Express RP-Amide کالم سے زیادہ موثر تھا۔
PEG (Polyethylene Glycol)، یوریا، Acetic Acid، Trimethoxy Orthosilicate (TMOS)، Trimethyl Chlorosilane (TMCS)، Trypsin، ہیومن سیرم البومین (HSA)، امونیم کلورائیڈ، یوریا، Hexane Methyldisilazane (HMDS)، Methacryloyl Chloride، Stycryloyl کلورائد، 4-ایم سی پی او، ایم سی ایس Benzoyl Peroxide (BPO)، HPLC گریڈ Acetonitrile (ACN)، Methanol، 2-Propanol، اور Acetone Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) سے خریدا گیا۔
یوریا (8 جی)، پولیتھیلین گلائکول (8 جی)، اور 0.01 این ایسٹک ایسڈ کے 8 ملی لیٹر کے مرکب کو 10 منٹ تک ہلایا گیا، اور پھر اس میں 24 ملی لیٹر ٹی ایم او ایس شامل کیا گیا، برف کے ٹھنڈے حالات میں۔ رد عمل کے مرکب کو 40 ڈگری سینٹی گریڈ پر 6 گھنٹے کے لیے گرم کیا گیا اور پھر 120 ڈگری سینٹی گریڈ پر بغیر اسٹیل پانی میں 120 ° C پر گرم کیا گیا۔ انڈیل دیا گیا اور باقی ماندہ مواد کو 70 ° C پر 12 گھنٹے تک خشک کیا گیا۔ خشک نرم ماس کو ایک تندور میں ہموار کیا گیا اور 12 گھنٹے تک 550 ° C پر کیلکائن کیا گیا۔ تین بیچز تیار کیے گئے اور ان کی خصوصیات ذرہ کے سائز، تاکنا کے سائز اور سطح کے رقبے میں تولیدی صلاحیت کی جانچ کرنے کے لیے کی گئیں۔
پہلے سے ترکیب شدہ ligand phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) کے ساتھ سلکا کے ذرات کی سطح میں ترمیم کرکے اس کے بعد اسٹائرین کے ساتھ ریڈیل پولیمرائزیشن کے ذریعے، ایک قطبی گروپ پر مشتمل مرکب تیار کیا گیا۔ ایگریگیٹس اور پولی اسٹیرین چینز کے لیے سٹیشنری مرحلہ۔ تیاری کا عمل ذیل میں بیان کیا گیا ہے۔
N-phenylmaleimide (200 mg) اور methyl vinyl isocyanate (100 mg) کو خشک ٹولوین میں تحلیل کیا گیا تھا، اور 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) کے 0.1 mL کو phenylmaleimide-methyl-Methyl-Mythyl-Mythyl-Mythyl-Mythyl-Mythyl-Mypoynate کو تیار کرنے کے لیے ری ایکشن فلاسک میں شامل کیا گیا تھا۔ 3 گھنٹے کے لیے 60 ° C پر گرم کریں، فلٹر کریں اور 40 ° C پر تندور میں 3 گھنٹے تک خشک کریں۔
خشک سلیکا کے ذرات (2 جی) کو خشک ٹولوین (100 ملی لیٹر) میں منتشر کیا گیا، 10 منٹ کے لیے 500 ملی لیٹر کے گول نیچے فلاسک میں ہلایا اور سونیکیٹ کیا گیا۔ PMCP (10 ملی گرام) کو ٹولوین میں تحلیل کیا گیا اور ڈراپنگ فنل کے ذریعے رد عمل کے فلاسک میں ڈراپ وائز شامل کیا گیا۔ مکسچر 80 ڈگری سینٹی گریڈ پر 10 منٹ کے لیے ری فلاسک تھا۔ اور ایسیٹون سے دھو کر 60 ° C پر 3 گھنٹے تک خشک کیا جاتا ہے۔ پھر PMCP بانڈڈ سلیکا کے ذرات (100 گرام) کو ٹولین (200 ملی لیٹر) میں تحلیل کیا گیا اور 4-ہائیڈروکسی-ٹیمپو (2 ملی لیٹر) کی موجودگی میں 100 µL dibutyltin a 50 °C dibutyltin dilairalure sti-50 °C پر ڈالا گیا۔ 8 گھنٹے کے لیے، فلٹر اور 50 ° C پر 3 گھنٹے تک خشک کریں۔
Styrene (1 mL)، benzoyl peroxide BPO (0.5 mL)، اور TEMPO-PMCP سے منسلک سلیکا کے ذرات (1.5 جی) کو ٹولین میں منتشر کیا گیا اور نائٹروجن سے صاف کیا گیا۔ سٹائرین کی پولیمرائزیشن 100 ° C پر 12 گھنٹے تک کی گئی اور نتیجہ میں 6 ڈگری سینٹی گریڈ کے ساتھ 100 ڈگری سینٹی گریڈ پر پیداوار کی گئی۔ رات بھر۔ رد عمل کی مجموعی اسکیم کو شکل 1 میں دکھایا گیا ہے۔
10-3 ٹور سے کم کا بقایا دباؤ حاصل کرنے کے لیے نمونوں کو 393 K پر 1 گھنٹے کے لیے ڈیگاس کیا گیا۔ P/P0 = 0.99 کے رشتہ دار دباؤ پر جذب ہونے والی N2 کی مقدار کل تاکوں کے حجم کا تعین کرنے کے لیے استعمال کی گئی۔ ٹیکنالوجیز، ٹوکیو، جاپان)۔خشک نمونے (ننگے سلیکا اور لیگنڈ بانڈڈ سلیکا ذرات) کو چپکنے والی کاربن ٹیپ کا استعمال کرتے ہوئے ایلومینیم کے کالم پر رکھا گیا تھا۔ Q150T اسپٹر کوٹر کا استعمال کرتے ہوئے نمونوں پر سونا چڑھایا گیا تھا، اور 5 nm کی Au تہہ جمع کی گئی تھی۔ grain, cold sputtering.A Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 عنصری تجزیہ کار عنصری تجزیہ کے لیے استعمال کیا گیا تھا۔ A Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 particle size analyzer کا استعمال کیا گیا تھا تاکہ particle and particle-nized particle and particle-size حاصل کیا جا سکے۔ سلیکا کے ذرات (5 ملی گرام ہر ایک) کو 5 ملی لیٹر آئسوپروپینول میں منتشر کیا گیا، 10 منٹ کے لیے سونیکیٹ کیا گیا، 5 منٹ کے لیے گھمایا گیا، اور ماسٹرزائزر کے آپٹیکل بنچ پر رکھا گیا۔ تھرموگراومیٹریک تجزیہ 5 °C فی منٹ درجہ حرارت سے 30 °C کے درجہ حرارت پر کیا گیا۔
شیشے کی لکیر والے سٹینلیس سٹیل کے تنگ بور کالموں کے طول و عرض (100 × 1.8 ملی میٹر id) سلری پیکنگ کے طریقہ کار کا استعمال کرتے ہوئے پیک کیے گئے تھے، اسی طریقہ کار کو ریف میں استعمال کیا گیا تھا۔ 31.A سٹینلیس سٹیل کا کالم (شیشے کی لکیر والا، 100 × 1.8 ملی میٹر id) ایک آؤٹ لیٹ فٹنگ کے ساتھ جس میں 1 µm فرٹ ہوتا ہے سلری پیکر (Alltech Deerfield, IL, USA) سے جڑا ہوا تھا۔ اسٹیشنری فیز سلوری تیار کریں اور اسے 150 mg سے 150 mg سے اسٹیشنری فیز میں بھیجیں۔ اسٹوریج کالم۔ میتھانول کو سلری سالوینٹ کے ساتھ ساتھ پروپیلنگ سالوینٹ کے طور پر بھی استعمال کیا گیا۔ کالم کو 10 منٹ کے لیے 100 MP، 15 منٹ کے لیے 80 MP، اور 30 ​​منٹ کے لیے 60 MP کا دباؤ لگا کر ترتیب وار بھریں۔ پیکنگ کے دوران مکینیکل وائبریشن کا اطلاق کیا گیا تھا USA) کالم کی یکساں پیکنگ کو یقینی بنانے کے لیے۔ کالم کے اندر کسی قسم کے نقصان کو روکنے کے لیے سلوری پیکر کو بند کریں اور دباؤ کو آہستہ آہستہ چھوڑ دیں۔
ایک LC پمپ (10AD Shimadzu، Japan)، انجیکٹر (Valco (USA) C14 W.05) 50nL انجیکشن لوپ کے ساتھ، جھلی ڈیگاسر (Shimadzu DGU-14A)، UV-VIS کیپلیری ونڈو کو خصوصی µLC ڈیوائس ڈیٹیکٹر (UV-20-20075) اور مائیکرو کولنسر کے ساتھ منسلک کیا گیا تھا۔ اضافی کالم بینڈ کی چوڑائی کے اثر کو کم کرنے کے لیے نلیاں لگائی گئیں۔ پیکیجنگ کے بعد، کیپلیریاں (50 μm id 365 اور reducing Union capillaries (50 μm) کو کم کرنے والی یونین کے 1/16″ آؤٹ لیٹ پر نصب کیا گیا۔ ڈیٹا اکٹھا کرنا اور کرومیٹوگرافک پروسیسنگ mon400m پر ملٹی رِنگ سوفٹ ویئر کا استعمال کرتے ہوئے کی گئی۔ اوریجن پرو 8 (نارتھمپٹن ​​، ایم اے) کے ذریعہ کرومیٹوگرافک ڈیٹا کا UV جذب کے لئے تجربہ کیا گیا۔
انسانی سیرم سے البومین، لائوفیلائزڈ پاؤڈر، ≥ 96% (ایگروز جیل الیکٹروفورسس) 3 ملی گرام ٹرپسن (1.5 ملی گرام)، 4.0 ایم یوریا (1 ملی لیٹر)، اور 0.2 ایم امونیم بائکاربونیٹ (1 ملی لیٹر)۔ محلول کو 10 منٹ تک ہلایا گیا اور پھر 3 ڈگری سینٹی گریڈ پانی میں 3 ڈگری سینٹی گریڈ پر رکھا گیا۔ 0.1% TFA کے 1 ملی لیٹر کے ساتھ۔ محلول کو فلٹر کریں اور 4 °C سے نیچے اسٹور کریں۔
پیپٹائڈ مکسچر اور HSA ٹرپسن ڈائجسٹ کی علیحدگی کا PMP کالموں پر الگ سے جائزہ لیا گیا۔ PMP کالم کے ذریعے HSA کے پیپٹائڈ مکسچر اور ٹرپسن ڈائجسٹ کی علیحدگی کو چیک کریں اور نتائج کا موازنہ Ascentis Express RP-Amide کالم سے کریں۔ نظریاتی پلیٹ نمبر مندرجہ ذیل ہے:
ننگے سلیکا ذرات اور لیگنڈ بانڈڈ سلیکا ذرات کی SEM تصاویر تصویر میں دکھائی گئی ہیں۔ 2 .ننگے سلیکا ذرات (A,B) کی SEM تصاویر سے پتہ چلتا ہے کہ، ہمارے پچھلے مطالعات کے برعکس، یہ ذرات کروی ہوتے ہیں جن میں ذرات لمبے ہوتے ہیں یا ان میں فاسد ہم آہنگی ہوتی ہے۔ ligand-bonded سلیکا ذرات (C, D) کی سطح اس سے زیادہ ہموار ہوتی ہے جس کی وجہ سے پولی اسٹائلی سیلیکا کا حصہ ہوتا ہے۔ سلکا کے ذرات کی سطح۔
ننگے سلیکا ذرات (A, B) اور ligand-bonded سلیکا ذرات (C, D) کی الیکٹران مائکروسکوپ کی تصاویر کو اسکین کرنا۔
ننگے سلیکا پارٹیکلز اور لیگنڈ بانڈڈ سلکا پارٹیکلز کی پارٹیکل سائز ڈسٹری بیوشن کو شکل 3(A) میں دکھایا گیا ہے۔ حجم پر مبنی پارٹیکل سائز ڈسٹری بیوشن کروز سے پتہ چلتا ہے کہ سیلیکا پارٹیکلز کے سائز میں کیمیائی ترمیم کے بعد اضافہ ہوا ہے۔ پی ایم پی کا حجم پر مبنی ذرہ سائز، d(0.5) 3.36 μm ہے، ہمارے پچھلے مطالعہ کے مقابلے میں اشتہار (0.5) قدر 3.05 μm (پولیسٹیرین سے منسلک سلیکا ذرات) 34۔ اس بیچ میں ہمارے پچھلے مطالعہ کے مقابلے میں ذرات کے سائز کی تقسیم کم تھی کیونکہ مختلف تیزابیت، تیزابیت، تیزابیت، اور ٹی ایم او ایس میں رد عمل کی وجہ سے مرکب۔ PMP فیز کا پارٹیکل سائز پولی اسٹیرین سے منسلک سلیکا پارٹیکل فیز سے تھوڑا بڑا ہے جس کا ہم نے پہلے مطالعہ کیا تھا۔ اس کا مطلب ہے کہ اسٹائرین کے ساتھ سلیکا پارٹیکلز کی سطح کے فنکشنلائزیشن نے سیلیکا کی سطح پر صرف پولی اسٹیرین کی پرت (0.97 µm) جمع کی، جب کہ PMP فیز میں موٹی پرت 3µ1 تھی۔
پارٹیکل سائز ڈسٹری بیوشن (A) اور پور سائز ڈسٹری بیوشن (B) ننگے سلکا پارٹیکلز اور لیگنڈ باؤنڈ سلکا پارٹیکلز۔
موجودہ مطالعہ کے سیلیکا ذرات کا تاکنا سائز، تاکنا حجم اور سطح کا رقبہ جدول 1(B) میں دیا گیا ہے۔ ننگے سلیکا ذرات اور ligand-bonded سلیکا ذرات کے PSD پروفائلز کو شکل 3(B) میں دکھایا گیا ہے۔ نتائج ہمارے پچھلے مطالعے سے موازنہ ہیں۔ ننگے اور ligand-bonded سلیکا ذرات کے تاکنا سائز، 340 ہیں اس بات کی نشاندہی کرتا ہے کہ کیمیائی ترمیم کے بعد تاکنا کا سائز 69 تک کم ہو جاتا ہے، جیسا کہ جدول 1(B) میں دکھایا گیا ہے، اور وکر کی تبدیلی تصویر 3(B) میں دکھائی گئی ہے۔ اسی طرح، کیمیائی ترمیم کے بعد سلیکا کے ذرات کا تاکنا حجم 0.67 سے 0.58 cm3/g تک کم ہو گیا۔ ہمارے پچھلے مطالعہ (124 m2/g) سے موازنہ کیا جا سکتا ہے۔ جیسا کہ جدول 1(B) میں دکھایا گیا ہے، کیمیائی ترمیم کے بعد سلکا کے ذرات کی سطح کا رقبہ (m2/g) بھی 116 m2/g سے کم ہو کر 105 m2/g ہو گیا۔
سٹیشنری فیز کے ابتدائی تجزیہ کے نتائج ٹیبل 2 میں دکھائے گئے ہیں۔ موجودہ سٹیشنری فیز کی کاربن لوڈنگ 6.35% ہے، جو ہمارے پچھلے اسٹڈی کی کاربن لوڈنگ سے کم ہے (پولیسٹیرین بانڈڈ سلیکا پارٹیکلز، بالترتیب 7.93%35 اور 10.21%) کیونکہ موجودہ سٹیشن کی تیاری میں 42 فیز کاربن لوڈنگ کم ہے۔ موجودہ ایس پی، اسٹائرین کے علاوہ، کچھ قطبی لیگنڈز جیسے فینیلمالیمائڈ-میتھائلوینیلیسوسیانیٹ (PCMP) اور 4-ہائیڈروکسی-ٹیمپو استعمال کیے گئے تھے۔ موجودہ اسٹیشنری مرحلے کا نائٹروجن وزن فیصد 0.1735 اور 0.85٪ کے مقابلے میں 2.21٪ ہے، جو کہ پچھلے مطالعات کے لحاظ سے یہ وزن کے لحاظ سے فیصد کے حساب سے 0.85 فیصد ہے۔ نائٹروجن موجودہ سٹیشنری فیز میں فینیلملیمائیڈ کی وجہ سے زیادہ ہے۔ اسی طرح، مصنوعات (4) اور (5) کی کاربن لوڈنگ بالترتیب 2.7% اور 2.9% تھی، جب کہ فائنل پروڈکٹ (6) کی کاربن لوڈنگ 6.35% تھی، جیسا کہ ٹیبل 2 میں دکھایا گیا ہے۔ PMP سٹیشن کے وزن میں کمی کو FMP GA فیز کے ساتھ چیک کیا گیا اور وزن میں کمی کی جانچ کی گئی۔ 4. TGA منحنی وزن میں 8.6% کی کمی کو ظاہر کرتا ہے، جو کاربن لوڈنگ (6.35%) کے ساتھ اچھی طرح متفق ہے کیونکہ لیگنڈز میں نہ صرف C بلکہ N، O، اور H بھی ہوتے ہیں۔
phenylmaleimide-methylvinylisocyanate ligand کو سلیکا ذرات کی سطح میں ترمیم کے لیے منتخب کیا گیا تھا کیونکہ اس میں قطبی phenylmaleimide گروپس اور vinylisocyanate گروپس ہوتے ہیں۔ Vinyl isocyanate گروپس زندہ ریڈیکل پولیمرائزیشن کے ذریعے اسٹائرین کے ساتھ مزید رد عمل ظاہر کرسکتے ہیں۔ دوسری وجہ ایک گروپ کو داخل کرنا ہے جس میں ایک مضبوط تعامل اور الیکٹرو اسٹائنیٹ کے درمیان کوئی تعامل نہ ہو۔ analyte اور اسٹیشنری مرحلہ، چونکہ phenylmaleimide moiety پر عام pH پر کوئی ورچوئل چارج نہیں ہوتا ہے۔ سٹیشنری مرحلے کی قطبیت کو اسٹائرین کی زیادہ سے زیادہ مقدار اور فری ریڈیکل پولیمرائزیشن کے رد عمل کے وقت سے کنٹرول کیا جا سکتا ہے۔ رد عمل کا آخری مرحلہ (فری ریڈیکل پولیمرائزیشن) اہم ہے اور سٹیشنری سٹیشن کی پولرٹی کو تبدیل کر سکتا ہے۔ ان اسٹیشنری مراحل کی کاربن لوڈنگ۔ یہ دیکھا گیا کہ اسٹائرین کی مقدار میں اضافہ اور رد عمل کے وقت نے اسٹیشنری فیز کی کاربن لوڈنگ میں اضافہ کیا اور اس کے برعکس۔ اسٹائرین کے مختلف ارتکاز کے ساتھ تیار کردہ ایس پیز میں مختلف کاربن لوڈنگ ہوتی ہے۔ ایک بار پھر، ان اسٹیشنری مراحل کو سٹینلیس سٹیل کے کالموں میں لوڈ کریں اور ان کی کارکردگی کی جانچ پڑتال کریں، کارکردگی کی جانچ پڑتال کریں۔ وغیرہ)۔ان تجربات کی بنیاد پر، PMP سٹیشنری فیز کو تیار کرنے کے لیے ایک بہترین فارمولیشن کا انتخاب کیا گیا تاکہ کنٹرول شدہ قطبیت اور اچھی تجزیہ کار کو برقرار رکھا جا سکے۔
پانچ پیپٹائڈ مرکب (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، leucine enkephalin) کا بھی ایک موبائل مرحلے کا استعمال کرتے ہوئے PMP کالم کا استعمال کرتے ہوئے جائزہ لیا گیا۔ 80 μL/min کی بہاؤ کی شرح پر 60/40 (v/v) acetonitrile/water (0.1% TFA)۔ زیادہ سے زیادہ اخراج کے حالات کے تحت، نظریاتی پلیٹ نمبر (N) فی کالم (100 × 1.8 mm id) 20,000 ± 0,000m/t² ہے قابل پلا (1002 ± 1002)۔ تین PMP کالموں اور کرومیٹوگرامس کی قدریں شکل 5A میں دکھائی گئی ہیں۔ PMP کالم پر تیز بہاؤ کی شرح (700 μL/min) پر تیز تجزیہ، ایک منٹ کے اندر پانچ پیپٹائڈز کو خارج کر دیا گیا، N کی قدریں بہت اچھی تھیں، 13,500 ± 310mm cords (130 ± 310 کورڈس) 135,000 پلیٹس/میٹر (شکل 5B)۔ تین ایک جیسے سائز کے کالم (100 × 1.8 ملی میٹر id) تین مختلف لاٹوں سے پی ایم پی سٹیشنری فیز سے بھرے ہوئے تھے تاکہ تولیدی صلاحیت کو جانچا جا سکے۔ ہر کالم کے لیے تجزیہ کرنے والے ارتکاز کو زیادہ سے زیادہ اخراج کے حالات کا استعمال کرتے ہوئے ریکارڈ کیا گیا تھا اور ہر ایک پلاٹین کے دوبارہ ٹیسٹ کے لیے ایک ہی نمبر کا استعمال کیا گیا تھا۔ کالم۔ PMP کالموں کے لیے تولیدی صلاحیت کا ڈیٹا ٹیبل 4 میں دکھایا گیا ہے۔ PMP کالم کی تولیدی صلاحیت بہت کم %RSD اقدار کے ساتھ اچھی طرح سے جڑی ہوئی ہے، جیسا کہ جدول 3 میں دکھایا گیا ہے۔
PMP کالم (B) اور Ascentis Express RP-Amide کالم (A) پر پیپٹائڈ مرکب کی علیحدگی؛ موبائل فیز 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%)، PMP کالم کے طول و عرض (100 × 1.8 ملی میٹر id)؛ تجزیاتی مرکبات کے اخراج کی ترتیب: 1 (Gly-Tyr)، 2 (Gly-Leu-Tyr)، 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg)، 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) اور 5 (leucine) acid enkephalin))۔
ایک PMP کالم (100 × 1.8 mm id) کو ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی میں انسانی سیرم البومین کے ٹرپٹک ڈائجسٹوں کو الگ کرنے کے لیے جانچا گیا تھا۔ شکل 6 میں کرومیٹوگرام ظاہر کرتا ہے کہ نمونہ اچھی طرح سے الگ ہے اور ریزولوشن بہت اچھا ہے۔ HSA ڈائجسٹ کا تجزیہ کیا گیا تھا موبائل کی شرح 1µL/00 منٹ کا استعمال کرتے ہوئے۔ 70/30 acetonitrile/water اور 0.1% TFA۔ جیسا کہ کرومیٹوگرام (شکل 6) میں دکھایا گیا ہے، HSA کے عمل انہضام کو 17 چوٹیوں میں تقسیم کیا گیا ہے جو 17 پیپٹائڈس کے مطابق ہے۔ HSA ڈائجسٹ میں ہر چوٹی کی علیحدگی کی کارکردگی کا تخمینہ لگایا گیا ہے اور قابل قدر TFA میں دی گئی ہے۔
PMP کالم پر HSA (100 × 1.8 mm id) کا ٹرپٹک ڈائجسٹ الگ کیا گیا تھا۔ بہاؤ کی شرح (100 µL/منٹ)، موبائل فیز 60/40 acetonitrile/water 0.1% TFA کے ساتھ۔
جہاں L کالم کی لمبائی ہے، η موبائل فیز کی viscosity ہے، ΔP کالم کا بیک پریشر ہے، اور u موبائل فیز کی لکیری رفتار ہے۔ PMP کالم کی پارگمیتا 2.5 × 10-14 m2 تھی، بہاؤ کی شرح 25 μL/min تھی، اور 60/40 AC/40 AC/40 AC کا استعمال کیا گیا تھا۔ کالم (100 × 1.8 ملی میٹر id) ہمارے پچھلے مطالعہ Ref.34 سے ملتا جلتا تھا۔ سطحی طور پر غیر محفوظ ذرات سے بھرے کالم کی پارگمیتا یہ ہے: 1.7 × 10-15 1.3 μm ذرات کے لئے، 3.1 × 10-15 1.7 × 2.5 × 5.5 μ1 حصہ۔ 2.6 μm ذرات کے لیے 10-14 m2 5 μm ذرات کے لیے 43. اس لیے، PMP مرحلے کی پارگمیتا 5 μm کور شیل ذرات کی طرح ہے۔
جہاں Wx کلوروفارم سے بھرے کالم کا وزن ہے، Wy میتھانول سے بھرے کالم کا وزن ہے، اور ρ سالوینٹس کی کثافت ہے۔ میتھانول کی کثافت (ρ = 0.7866) اور کلوروفارم (ρ = 1.484)۔ کل پورسٹی 1.8 ملی میٹر id) 34 اور C18-یوریا کالم 31 جن کا ہم نے پہلے مطالعہ کیا تھا وہ بالترتیب 0.63 اور 0.55 تھے۔ اس کا مطلب یہ ہے کہ یوریا لیگنڈز کی موجودگی سٹیشنری مرحلے کی پارگمیتا کو کم کرتی ہے۔ دوسری طرف، PMP کالم کی کل پورسٹی (100 .6 mm .80 mm) ہے۔ PMP کالم C18 بانڈڈ سلکا ذرات سے بھرے کالموں سے کم ہوتے ہیں کیونکہ C18 قسم کے سٹیشنری مراحل میں C18 ligands سلیکا کے ذرات سے لکیری زنجیروں کے طور پر جڑے ہوتے ہیں، جبکہ پولی سٹیرین قسم کے سٹیشنری مراحل میں، ایک نسبتاً موٹی پولیمر پرت اس کے گرد بنتی ہے۔
شکل 7A,B PMP کالم (100 × 1.8 mm id) اور Ascentis Express RP-Amide کالم (100 × 1.8 mm id) کو اسی اخراج کے حالات (یعنی 60/40 ACN/H2O اور 0.1% TFA) کا استعمال کرتے ہوئے دکھاتا ہے۔ ) وین ڈیمٹر پلاٹ کا۔ منتخب پیپٹائڈ مکسچر (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 µL/ دونوں کالموں کے لیے کم از کم بہاؤ کی شرح 800 µminL/min um TP umt کی قدر کے حساب سے ہے۔ PMP کالم اور Ascentis Express RP-Amide کالم کے لیے (80 µL/min) بالترتیب 2.6 µm اور 3.9 µm تھے۔ HETP کی قدریں اس بات کی نشاندہی کرتی ہیں کہ PMP کالم کی علیحدگی کی کارکردگی (100 × 1.8 ملی میٹر ایکسپریس colum id سے زیادہ بہتر ہے) (100 × 1.8 ملی میٹر id)۔ تصویر 7(A) میں وین ڈیمٹر پلاٹ ظاہر کرتا ہے کہ بڑھتے ہوئے بہاؤ کے ساتھ N قدر میں کمی ہمارے پچھلے مطالعہ کے مقابلے میں اہم نہیں ہے۔ PMP کالم کی اعلی علیحدگی کی کارکردگی (100 × 1.8 mm id) Ascentis Express کے مقابلے میں RP-Amide کی شکل میں پیچیدہ، column کے سائز پر مبنی RP-Amide کی شکل میں بہتری ہے۔ موجودہ کام میں استعمال ہونے والے پیکنگ کے طریقہ کار34۔
(A) وین ڈیمٹر پلاٹ (HETP بمقابلہ موبائل فیز لکیری رفتار) PMP کالم (100 × 1.8 mm id) کا استعمال کرتے ہوئے 60/40 ACN/H2O میں 0.1% TFA کے ساتھ حاصل کیا گیا۔ (100 × 1.8 ملی میٹر id) 60/40 ACN/H2O میں 0.1% TFA کے ساتھ۔
ایک قطبی ایمبیڈڈ پولی اسٹیرین سٹیشنری مرحلہ تیار کیا گیا تھا اور اعلی کارکردگی والے مائع کرومیٹوگرافی میں ہیومن سیرم البومین (HAS) کے مصنوعی پیپٹائڈ مرکب اور ٹرپسن ڈائجسٹ کو الگ کرنے کے لیے جانچا گیا تھا۔ پیپٹائڈ مکسچر کے لیے پی ایم پی کالموں کی کرومیٹوگرافک کارکردگی PMP کی علیحدگی کی کارکردگی میں بہترین ہے جس کی وجہ سے پی ایم پی کی کارکردگی کو الگ کرنے اور الگ کرنے کی کارکردگی میں بہتری ہے۔ مختلف وجوہات کی بناء پر، جیسے کہ سلیکا کے ذرات کے ذرات کا سائز اور تاکنا سائز، اسٹیشنری مرحلے کی کنٹرول شدہ ترکیب، اور پیچیدہ کالم پیکنگ۔ اعلی علیحدگی کی کارکردگی کے علاوہ، ہائی بہاؤ کی شرح پر کم کالم کا دباؤ اس اسٹیشنری مرحلے کا ایک اور فائدہ ہے۔ مختلف پروٹینز کے۔ ہم اس کالم کو قدرتی مصنوعات، دواؤں کے پودوں سے بایو ایکٹیو مرکبات اور مائع کرومیٹوگرافی میں فنگل کے عرق کی علیحدگی کے لیے استعمال کرنے کا ارادہ رکھتے ہیں۔ مستقبل میں، PMP کالموں کو پروٹین اور مونوکلونل اینٹی باڈیز کی علیحدگی کے لیے بھی جانچا جائے گا۔
فیلڈ، جے کے، یوربی، ایم آر، لاؤ، جے، تھیگرسن، ایچ اور پیٹرسن، پی. ریورسڈ فیز کرومیٹوگرافی کے ذریعے پیپٹائڈ سیپریشن سسٹمز پر تحقیق حصہ I: ایک کالم کریکٹرائزیشن پروٹوکول کی ترقی۔ Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019)۔
Gomez, B. et al. متعدی بیماریوں کے علاج کے لیے تیار کردہ فعال پیپٹائڈز کو بہتر بنایا گیا ہے۔ Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018)۔
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetic Therapeutic Peptides: Science and the market.drug discovery.15 (1-2) Today, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.02009 ().
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012)۔
Liu, W. et al.Advanced liquid chromatography-mas spectrometry وسیع پیمانے پر ہدف شدہ میٹابولومکس اور proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019) کو شامل کرنے کے قابل بناتی ہے۔
Chesnut, SM & Salisbury, JJ منشیات کی نشوونما میں UHPLC کا کردار۔ Sci.30 (8)، 1183-1190 (2007) ستمبر۔
وو، این اور کلازن، اے ایم تیز رفتار علیحدگی کے لیے الٹرا ہائی پریشر مائع کرومیٹوگرافی کے بنیادی اور عملی پہلو۔ جے۔ ستمبر Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007)۔
Wren, SA & Tchelitcheff, P. منشیات کی نشوونما میں الٹرا ہائی پرفارمنس مائع کرومیٹوگرافی کی درخواست۔ Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006)۔
Gu, H. et al.Enteroviruses.Chemical.Britain.J. کی موثر صاف کرنے کے لیے تیل میں پانی کے اعلی اندرونی مرحلے کے ایمولشن سے تیار کردہ مونولیتھک میکروپورس ہائیڈروجلز۔ 401، 126051 (2020)۔
Shi, Y., Xiang, R. Horváth, C. & Wilkins, JA پروٹومکس میں مائع کرومیٹوگرافی کا کردار۔ Chromatography.A 1053(1-2)، 27-36 (2004)۔
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. معکوس فیز مائع کرومیٹوگرافی کے علاج کے پیپٹائڈس اور پروٹین کی علیحدگی میں ابھرتے ہوئے رجحانات: تھیوری اور ایپلی کیشنز۔ فارمیسی.بایومیڈیکل سائنس.anus.69, 9-27 (2012)۔
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC پہلی اور دوسری علیحدگی کے طول و عرض میں مختلف pH اقدار کا استعمال کرتے ہوئے RP-RP-HPLC نظام کا استعمال کرتے ہوئے پیپٹائڈس کی دو جہتی علیحدگی۔ Sci.28 (14)، 1694-1703 (2005) ستمبر۔
Feletti, S. et al. C18 ذیلی 2 μm مکمل اور سطحی طور پر غیر محفوظ ذرات سے بھرے اعلی کارکردگی والے کرومیٹوگرافک کالموں کی بڑے پیمانے پر منتقلی کی خصوصیات اور حرکی کارکردگی کی چھان بین کی گئی۔ Sci.43 (9-10)، 1737-1745 (2020) ستمبر۔
Piovesana, S. et al. پلانٹ بائیو ایکٹیو پیپٹائڈس کی تنہائی، شناخت اور توثیق میں حالیہ رجحانات اور تجزیاتی چیلنجز
Mueller, JB et al.The proteomic landscape of the kingdom of life.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020)۔
DeLuca, C. et al. تیاری کے مائع کرومیٹوگرافی کے ذریعے علاج کے پیپٹائڈس کی ڈاون اسٹریم پروسیسنگ۔ مالیکیول (بیسل، سوئٹزرلینڈ) 26(15)، 4688(2021)۔
یانگ، وائی اور گینگ، ایکس مکسڈ موڈ کرومیٹوگرافی اور بائیو پولیمر پر اس کا اطلاق۔ Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011)۔
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands for mixed-mode protein chromatography: اصول، خصوصیت، اور ڈیزائن.J. بایو ٹیکنالوجی.144(1)، 3-11 (2009)۔