Hvala vam što ste posjetili Nature.com. Verzija preglednika koju koristite ima ograničenu podršku za CSS. Za najbolje iskustvo, preporučujemo da koristite ažurirani preglednik (ili isključite način kompatibilnosti u Internet Exploreru). U međuvremenu, kako bismo osigurali kontinuiranu podršku, prikazat ćemo stranicu bez stilova i JavaScripta.
Porozne čestice silicijum dioksida pripremljene su sol-gel metodom s nekim modifikacijama kako bi se dobile makroporozne čestice. Ove čestice su derivatizirane polimerizacijom reverzibilne adicije fragmentacije lanca (RAFT) s N-fenilmaleimid-metilvinilizocijanatom (PMI) i stirenom kako bi se pripremila stacionarna faza interkalacijom N-fenilmaleimida s polistirenom (PMP). Kolone od nehrđajućeg čelika uskog promjera (100 × 1,8 mm un. promjera) pakirane su pakiranjem u suspenziju. Procijenjene su performanse razdvajanja smjese peptida koja se sastoji od pet peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin enkefalin) na PMP koloni) i digestija humanog serumskog albumina (HAS) tripsinom. Pod optimalnim uvjetima elucije, teorijski broj ploča smjese peptida je čak 280.000 ploča/m². Poređenje performansi razdvajanja razvijene kolone s komercijalnom Ascentis Express kolonom. RP-amidna kolona, ​​uočeno je da su performanse separacije PMP kolone bile superiornije u odnosu na komercijalnu kolonu u smislu efikasnosti separacije i rezolucije.
Posljednjih godina, biofarmaceutska industrija postala je globalno tržište u ekspanziji sa značajnim povećanjem tržišnog udjela. S eksplozivnim rastom biofarmaceutske industrije1,2,3, analiza peptida i proteina je veoma poželjna. Pored ciljnog peptida, tokom sinteze peptida nastaje nekoliko nečistoća, što zahtijeva hromatografsko prečišćavanje kako bi se dobili peptidi željene čistoće. Analiza i karakterizacija proteina u tjelesnim tečnostima, tkivima i ćelijama izuzetno je izazovan zadatak zbog velikog broja potencijalno detektabilnih vrsta u jednom uzorku. Iako je masena spektrometrija efikasan alat za sekvenciranje peptida i proteina, ako se takvi uzorci ubrizgavaju u maseni spektrometar u jednom prolazu, razdvajanje neće biti idealno. Ovaj problem se može ublažiti primjenom separacija tečnom hromatografijom (LC) prije MS analize, što će smanjiti broj analita koji ulaze u maseni spektrometar u datom trenutku4,5,6. Osim toga, tokom separacije tečne faze, analiti se mogu fokusirati u uskim regijama, čime se ovi analiti koncentrišu i poboljšava osjetljivost MS detekcije. Tečna hromatografija (LC) je značajno napredovala tokom posljednje decenije i postala je popularna tehnika u proteomska analiza7,8,9,10.
Tečna hromatografija reverzne faze (RP-LC) se široko koristi za prečišćavanje i odvajanje peptidnih smjesa korištenjem oktadecil-modificiranog silicijum dioksida (ODS) kao stacionarne faze11,12,13. Međutim, RP stacionarne faze ne pružaju zadovoljavajuće odvajanje peptida i proteina zbog svoje složene strukture i amfifilne prirode14,15. Stoga su potrebne posebno dizajnirane stacionarne faze za analizu peptida i proteina s polarnim i nepolarnim dijelovima kako bi interagovale s ovim analitima i zadržale ih16. Mješovita hromatografija, koja omogućava multimodalne interakcije, može biti alternativa RP-LC za odvajanje peptida, proteina i drugih složenih smjesa. Pripremljeno je nekoliko stacionarnih faza miješanog načina rada, a kolone napunjene ovim fazama korištene su za odvajanje peptida i proteina17,18,19,20,21. Mješovite stacionarne faze (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polarna interkalacija/RPLC) pogodne su za odvajanje peptida i proteina zbog prisustva i polarnih i nepolarnih faza. grupe22,23,24,25,26,27,28. Slično tome, polarne interkalirajuće stacionarne faze s kovalentno vezanim polarnim grupama pokazuju dobru moć razdvajanja i jedinstvenu selektivnost za polarne i nepolarne analite, jer razdvajanje ovisi o interakciji između analita i stacionarne faze. Multimodalne interakcije 29, 30, 31, 32. Nedavno su Zhang i suradnici 30 pripremili dodecil-terminiranu poliaminsku stacionarnu fazu i uspješno razdvojili ugljikovodike, antidepresive, flavonoide, nukleozide, estrogene i nekoliko drugih analita. Polarni interkalator ima i polarne i nepolarne grupe, tako da se može koristiti za odvajanje peptida i proteina koji imaju i hidrofobne i hidrofilne dijelove. Polarno ugrađene kolone (npr. C18 kolone ugrađene u amid) komercijalno su dostupne pod trgovačkim nazivom Ascentis Express RP-Amide kolone, ali se ove kolone koriste samo za analizu amina 33.
U trenutnoj studiji, pripremljena je polarno ugrađena stacionarna faza (polistiren ugrađen u N-fenilmaleimid) i procijenjena za odvajanje peptida i tripsin digestija HSA. Stacionarna faza je pripremljena korištenjem sljedeće strategije. Porozne čestice silicija pripremljene su prema postupku datom u našoj prethodnoj publikaciji s nekim modifikacijama protokola pripreme. Omjer uree, polietilen glikola (PEG), TMOS-a, vode i octene kiseline prilagođen je kako bi se pripremile čestice silicija s velikom veličinom pora. Drugo, sintetiziran je novi ligand, fenilmaleimid-metil vinil izocijanat, i korišten je za derivatizaciju čestica silicija kako bi se pripremila polarno ugrađena stacionarna faza. Dobivena stacionarna faza je pakirana u kolonu od nehrđajućeg čelika (100 × 1,8 mm un. promjera) korištenjem optimizirane sheme pakiranja. Pakiranje kolone potpomognuto je mehaničkim vibracijama kako bi se osiguralo formiranje homogenog sloja unutar kolone. Procijenite odvajanje smjesa peptida koje se sastoje od pet peptida u pakiranoj koloni; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkefalin) i tripsin razgradnjom humanog serumskog albumina (HAS). Uočeno je da se smjesa peptida i tripsin razgradnjom HSA odvajaju s dobrom rezolucijom i efikasnošću. Performanse razdvajanja PMP kolone upoređene su s performansama Ascentis Express RP-Amide kolone. Uočeno je da su i peptidi i proteini dobro razdvojeni i efikasni na PMP koloni, koja je bila efikasnija od Ascentis Express RP-Amide kolone.
PEG (polietilen glikol), urea, sirćetna kiselina, trimetoksi ortosilikat (TMOS), trimetil hlorosilan (TMCS), tripsin, humani serumski albumin (HSA), amonijum hlorid, urea, heksan metildisilazan (HMDS), metakriloil hlorid (MC), stiren, 4-hidroksi-TEMPO, benzoil peroksid (BPO), acetonitril (ACN) HPLC čistoće, metanol, 2-propanol i aceton kupljeni od Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, SAD).
Smjesa uree (8 g), polietilen glikola (8 g) i 8 mL 0,01 N sirćetne kiseline miješana je 10 minuta, a zatim je dodano 24 mL TMOS-a pod ledeno hladnim uslovima. Reakcijska smjesa je zagrijavana na 40°C tokom 6 sati, a zatim na 120°C tokom 8 sati u autoklavu od nehrđajućeg čelika. Voda je izlivena, a preostali materijal je sušen na 70°C tokom 12 sati. Osušena meka masa je glatko samljevena u pećnici i kalcinirana na 550°C tokom 12 sati. Pripremljene su i karakterizirane tri serije kako bi se ispitala ponovljivost veličine čestica, veličine pora i površine.
Modifikacijom površine čestica silicijum dioksida prethodno sintetiziranim ligandom fenilmaleimid-metilvinilizocijanatom (PCMP), a zatim radijalnom polimerizacijom sa stirenom, pripremljen je spoj koji sadrži polarnu grupu. Stacionarna faza za agregate i polistirenske lance. Proces pripreme opisan je u nastavku.
N-fenilmaleimid (200 mg) i metil vinil izocijanat (100 mg) su rastvoreni u suhom toluenu, a 0,1 mL 2,2'-azoizobutironitrila (AIBN) je dodano u reakcijsku tikvicu da bi se pripremio kopolimer fenilmaleimid-metil vinil izocijanata (PMCP). Smjesa je zagrijavana na 60°C tokom 3 sata, filtrirana i sušena u pećnici na 40°C tokom 3 sata.
Osušene čestice silicijum dioksida (2 g) su dispergovane u suhom toluenu (100 mL), miješane i sonicirane u okrugloj tikvici od 500 mL tokom 10 minuta. PMCP (10 mg) je rastvoren u toluenu i dodavan kap po kap u reakcijsku tikvicu putem lijevka za kapanje. Smjesa je refluksirana na 100°C tokom 8 sati, filtrirana i isprana acetonom te sušena na 60°C tokom 3 sata. Zatim su čestice silicijum dioksida vezane za PMCP (100 g) rastvorene u toluenu (200 ml) i dodan je 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) u prisustvu 100 µL dibutiltin dilaurata kao katalizatora. Smjesa je miješana na 50°C tokom 8 sati, filtrirana i sušena na 50°C tokom 3 sata.
Stiren (1 mL), benzoil peroksid BPO (0,5 mL) i čestice silicijum dioksida vezane za TEMPO-PMCP (1,5 g) dispergovane su u toluenu i pročišćene dušikom. Polimerizacija stirena provedena je na 100°C tokom 12 sati. Dobiveni produkt je ispran metanolom i sušen na 60°C preko noći. Ukupna reakcijska shema prikazana je na Slici 1.
Uzorci su degazirani na 393 K tokom 1 sata kako bi se postigao rezidualni pritisak manji od 10-3 Torr. Količina N2 adsorbovanog pri relativnom pritisku P/P0 = 0,99 korištena je za određivanje ukupnog volumena pora. Morfologija golih i ligandima vezanih čestica silicijum dioksida ispitana je skenirajućom elektronskom mikroskopijom (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Osušeni uzorci (goli silicijum dioksid i čestice silicijum dioksida vezane ligandima) postavljeni su na aluminijumsku kolonu pomoću ljepljive ugljenične trake. Zlato je naneseno na uzorke pomoću Q150T raspršivača, a na uzorke je nanesen sloj Au od 5 nm. Ovo poboljšava efikasnost procesa korištenjem niskih napona i omogućava fino zrno, hladno raspršivanje. Za elementarnu analizu korišten je Thermo Electron (Waltham, MA, SAD) Flash EA1112 elementarni analizator. Za dobijanje distribucije veličine čestica korišten je Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 analizator veličine čestica. Gole čestice silicijum dioksida i čestice silicijum dioksida vezane ligandima (5 mg (svaki) su dispergovani u 5 mL izopropanola, sonicirani 10 minuta, vrtloženi 5 minuta i postavljeni na optički stol Mastersizera. Termogravimetrijska analiza je provedena brzinom od 5 °C u minuti u temperaturnom rasponu od 30 do 800 °C.
Kolone od nehrđajućeg čelika obložene staklom uskog promjera dimenzija (100 × 1,8 mm unutrašnji promjer) pakirane su metodom pakiranja u suspenziju, primjenjujući isti postupak korišten u Ref. 31. Kolona od nehrđajućeg čelika (obložena staklom, 100 × 1,8 mm unutrašnji prečnik) s izlaznim priključkom koji sadrži fritu od 1 µm spojena je na pakerica suspenzije (Alltech Deerfield, IL, SAD). Pripremite suspenziju stacionarne faze suspendiranjem 150 mg stacionarne faze u 1,2 mL metanola i pošaljite je u kolonu za skladištenje. Metanol je korišten kao rastvarač suspenzije, kao i kao pogonski rastvarač. Kolonu napunite sekvencijalno primjenom pritiska od 100 MP tokom 10 minuta, 80 MP tokom 15 minuta i 60 MP tokom 30 minuta. Tokom pakiranja, primijenjene su mehaničke vibracije pomoću dvije GC mućkalice za kolone (Alltech, Deerfield, IL, SAD) kako bi se osiguralo ravnomjerno pakiranje kolone. Zatvorite paker suspenzije i polako otpustite pritisak kako biste spriječili bilo kakvo oštećenje unutar kolone. Odvojite kolonu od jedinice za pakiranje suspenzije i spojite drugi priključak na ulaz i na LC sistem kako biste provjerili njene performanse.
Konstruisana je LC pumpa (10AD Shimadzu, Japan), injektor (Valco (SAD) C14 W.05) sa 50nL injekcijskom petljom, membranski degazator (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilarni prozor. Korišten je poseban µLC detektor (UV-2075) i mikrokolone obložene staklom. Korištene su vrlo uske i kratke spojne cijevi kako bi se minimizirao efekat dodatnog širenja pojasa kolone. Nakon pakovanja, kapilare (50 μm id 365) i kapilare redukcionog spoja (50 μm) su instalirane na izlazu od 1/16″ redukcionog spoja. Prikupljanje podataka i hromatografska obrada izvršeni su pomoću softvera Multichro 2000. Praćenje na 254 nm. Analiti su testirani na UV apsorbanciju. Kromatografski podaci su analizirani pomoću OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin iz ljudskog seruma, liofilizirani prah, ≥ 96% (elektroforeza na agaroznom gelu) 3 mg pomiješan sa tripsinom (1,5 mg), 4,0 M ureom (1 mL) i 0,2 M amonijum bikarbonatom (1 mL). Rastvor je miješan 10 minuta i držan u vodenom kupatilu na 37°C tokom 6 sati, a zatim ugašen sa 1 mL 0,1% TFA. Rastvor filtrirati i čuvati na temperaturi ispod 4°C.
Razdvajanje peptidnih smjesa i tripsin razgradnje HSA odvojeno je procijenjeno na PMP kolonama. Provjerite razdvajanje peptidne smjese i tripsin razgradnje HSA pomoću PMP kolone i uporedite rezultate sa Ascentis Express RP-Amide kolonom. Teorijski broj ploča izračunava se na sljedeći način:
SEM slike čestica silicijum dioksida bez liganda i čestica silicijum dioksida vezanih za ligand prikazane su na SLICI 2. SEM slike čestica silicijum dioksida bez liganda (A, B) pokazuju da su, za razliku od naših prethodnih studija, ove čestice sfernog oblika, izdužene ili imaju nepravilnu simetriju. Površina čestica silicijum dioksida vezanih za ligand (C, D) je glatkija od površine čestica silicijum dioksida bez liganda, što može biti posljedica premaza polistirenskih lanaca na površini čestica silicijum dioksida.
Slike skenirajućeg elektronskog mikroskopa golih čestica silicijum dioksida (A, B) i čestica silicijum dioksida vezanih ligandom (C, D).
Distribucija veličine čestica golih čestica silicijum dioksida i čestica silicijum dioksida vezanih ligandima prikazana je na Slici 3(A). Krive raspodjele veličine čestica zasnovane na volumenu pokazale su da se veličina čestica silicijum dioksida povećala nakon hemijske modifikacije (Slika 3A). Podaci o raspodjeli veličine čestica silicijum dioksida iz trenutne studije i prethodne studije upoređeni su u Tabeli 1(A). Veličina čestica zasnovana na volumenu, d(0,5), PMP-a iznosi 3,36 μm, u poređenju s našom prethodnom studijom s vrijednošću ad(0,5) od 3,05 μm (čestice silicijum dioksida vezane za polistiren)34. Ova serija imala je užu raspodjelu veličine čestica u poređenju s našom prethodnom studijom zbog različitih omjera PEG-a, uree, TMOS-a i sirćetne kiseline u reakcijskoj smjesi. Veličina čestica PMP faze je nešto veća od veličine čestica faze čestica silicijum dioksida vezanih za polistiren koju smo prethodno proučavali. To znači da je površinska funkcionalizacija čestica silicijum dioksida stirenom samo nanijela sloj polistirena (0,97 µm) na površinu silicijum dioksida, dok je u PMP fazi debljina sloja bila... 1,38 µm.
Raspodjela veličine čestica (A) i raspodjela veličine pora (B) čestica silicijum dioksida bez prirodnjaka i čestica silicijum dioksida vezanih za ligand.
Veličina pora, volumen pora i površina čestica silicijum dioksida iz trenutne studije dati su u Tabeli 1(B). PSD profili čestica silicijum dioksida bez liganda i čestica silicijum dioksida vezanih za ligand prikazani su na Slici 3(B). Rezultati su uporedivi s našom prethodnom studijom. Veličine pora čestica silicijum dioksida bez liganda i 241, respektivno, što ukazuje na to da se veličina pora smanjuje za 69 nakon hemijske modifikacije, kao što je prikazano u Tabeli 1(B), a promjena krivulje je prikazana na Slici 3(B). Slično tome, volumen pora čestica silicijum dioksida smanjio se sa 0,67 na 0,58 cm3/g nakon hemijske modifikacije. Specifična površina trenutno proučavanih čestica silicijum dioksida je 116 m2/g, što je uporedivo s našom prethodnom studijom (124 m2/g). Kao što je prikazano u Tabeli 1(B), površina (m2/g) čestica silicijum dioksida također se smanjila sa 116 m2/g na 105 m2/g nakon hemijske modifikacije. modifikacija.
Rezultati elementarne analize stacionarne faze prikazani su u Tabeli 2. Sadržaj ugljika u trenutnoj stacionarnoj fazi iznosi 6,35%, što je niže od sadržaja ugljika u našoj prethodnoj studiji (čestice silicijum dioksida vezane za stiren, 7,93%35 i 10,21%, respektivno)42. Sadržaj ugljika u trenutnoj stacionarnoj fazi je nizak, jer su u pripremi trenutnog SP, pored stirena, korišteni i neki polarni ligandi poput fenilmaleimid-metilvinilizocijanata (PCMP) i 4-hidroksi-TEMPO. Težinski udio dušika u trenutnoj stacionarnoj fazi iznosi 2,21%, u poređenju sa 0,1735 i 0,85% težinski dušika u prethodnim studijama. To znači da je težinski udio dušika veći u trenutnoj stacionarnoj fazi zbog fenilmaleimida. Slično tome, sadržaj ugljika u proizvodima (4) i (5) iznosio je 2,7% i 2,9%, respektivno, dok je sadržaj ugljika u konačnom proizvodu (6) bio... 6,35%, kao što je prikazano u Tabeli 2. Gubitak težine je provjeren pomoću stacionarne faze PMP, a TGA kriva je prikazana na Slici 4. TGA kriva pokazuje gubitak težine od 8,6%, što je u dobrom skladu sa sadržajem ugljika (6,35%) jer ligandi sadrže ne samo C već i N, O i H.
Fenilmaleimid-metilvinilizocijanatni ligand je odabran za modifikaciju površine čestica silicijum dioksida jer ima polarne fenilmaleimidne grupe i vinilizocijanatne grupe. Vinil izocijanatne grupe mogu dalje reagovati sa stirenom putem žive radikalne polimerizacije. Drugi razlog je umetanje grupe koja ima umjerenu interakciju sa analitom i nema jaku elektrostatičku interakciju između analita i stacionarne faze, budući da fenilmaleimidni dio nema virtuelni naboj pri normalnom pH. Polaritet stacionarne faze može se kontrolisati optimalnom količinom stirena i vremenom reakcije polimerizacije slobodnih radikala. Posljednji korak reakcije (polimerizacija slobodnih radikala) je kritičan i može promijeniti polaritet stacionarne faze. Elementarna analiza je provedena kako bi se provjerilo ugljično opterećenje ovih stacionarnih faza. Uočeno je da povećanje količine stirena i vremena reakcije povećava ugljično opterećenje stacionarne faze i obrnuto. SP pripremljeni sa različitim koncentracijama stirena imaju različito ugljično opterećenje. Ponovo, ubacite ove stacionarne faze u kolone od nehrđajućeg čelika i provjerite njihove hromatografske performanse (selektivnost, rezolucija, vrijednost N, itd.). Na osnovu ovih eksperimenata, odabrana je optimizirana formulacija za pripremu stacionarne faze PMP-a kako bi se osigurala kontrolirana polarnost i dobro zadržavanje analita.
Pet peptidnih smjesa (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin enkefalin) također su procijenjene korištenjem PMP kolone s mobilnom fazom; 60/40 (v/v) acetonitril/voda (0,1% TFA) pri protoku od 80 μL/min. Pod optimalnim uslovima elucije, teorijski broj ploča (N) po koloni (100 × 1,8 mm id) je 20.000 ± 100 (200.000 ploča/m²). Tabela 3 daje vrijednosti N za tri PMP kolone, a hromatogrami su prikazani na Slici 5A. Brza analiza na PMP koloni pri visokoj brzini protoka (700 μL/min), pet peptida je eluirano u roku od jedne minute, vrijednosti N su bile vrlo dobre, 13.500 ± 330 po koloni (100 × 1,8 mm id), što odgovara 135.000 ploča/m² (Slika 5B). Tri kolone identične veličine (100 × 1,8 mm id) su napunjene sa tri različite serije stacionarne faze PMP-a radi provjere ponovljivosti. Koncentracija analita za svaku kolonu zabilježena je korištenjem optimalnih uvjeta elucije i broja teorijskih ploča N i vremena zadržavanja za odvajanje iste testne smjese na svakoj koloni. Podaci o reproducibilnosti za PMP kolone prikazani su u Tabeli 4. Reprodukcijnost PMP kolone dobro korelira s vrlo niskim vrijednostima %RSD, kao što je prikazano u Tabeli 3.
Razdvajanje smjese peptida na PMP koloni (B) i Ascentis Express RP-Amide koloni (A); mobilna faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimenzije PMP kolone (100 × 1,8 mm un.); analitički. Redoslijed eluiranja spojeva: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (leucin) kiseli enkefalin).
PMP kolona (100 × 1,8 mm un. promjera) je procijenjena za odvajanje tripsinskih digestija humanog serumskog albumina u visokoefikasnoj tečnoj hromatografiji. Hromatogram na slici 6 pokazuje da je uzorak dobro odvojen i da je rezolucija vrlo dobra. HSA digestije su analizirane korištenjem brzine protoka od 100 µL/min, mobilne faze 70/30 acetonitril/voda i 0,1% TFA. Kao što je prikazano na hromatogramu (Slika 6), HSA digestija je podijeljena na 17 vrhova koji odgovaraju 17 peptida. Izračunata je efikasnost odvajanja svakog vrha u HSA digestiji, a vrijednosti su date u tabeli 5.
Triptički razgradni produkt HSA (100 × 1,8 mm un. promjera) je odvojen na PMP koloni; brzina protoka (100 µL/min), mobilna faza 60/40 acetonitril/voda sa 0,1% TFA.
gdje je L dužina kolone, η viskoznost mobilne faze, ΔP povratni pritisak u koloni, a u linearna brzina mobilne faze. Permeabilnost PMP kolone bila je 2,5 × 10-14 m2, brzina protoka 25 μL/min, a korišten je ACN/voda omjera 60/40 v/v. Permeabilnost PMP kolone (100 × 1,8 mm id) bila je slična onoj iz naše prethodne studije Ref.34. Permeabilnost kolone napunjene površinski poroznim česticama je: 1,7 × 10-15 za čestice od 1,3 μm, 3,1 × 10-15 za čestice od 1,7 μm, 5,2 × 10-15 i 2,5 × 10-14 m2 za čestice od 2,6 μm za čestice od 5 μm 43. Stoga je permeabilnost PMP faze slična onoj za čestice jezgro-ljuska od 5 μm.
gdje je Wx težina kolone napunjene hloroformom, Wy je težina kolone napunjene metanolom, a ρ je gustoća rastvarača. Gustoće metanola (ρ = 0,7866) i kloroforma (ρ = 1,484). Ukupna poroznost kolona SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 i kolona C18-Urea 31 koje smo prethodno proučavali bila je 0,63 odnosno 0,55. To znači da prisustvo liganada uree smanjuje propusnost stacionarne faze. S druge strane, ukupna poroznost PMP kolone (100 × 1,8 mm id) je 0,60. Propusnost PMP kolona je niža od one kod kolona napunjenih česticama silicijum dioksida vezanim za C18 jer su u stacionarnim fazama tipa C18 ligandi vezani za čestice silicijum dioksida kao linearni lanci, dok se u stacionarnim fazama tipa polistirena oko njega formira relativno debeli polimerni sloj. U U tipičnom eksperimentu, poroznost kolone se izračunava kao:
Slika 7A i B prikazuje PMP kolonu (100 × 1,8 mm unutrašnji prečnik) i Ascentis Express RP-Amide kolonu (100 × 1,8 mm unutrašnji prečnik) korištenjem istih uslova elucije (tj. 60/40 ACN/H2O i 0,1% TFA). ) van Deemterovog dijagrama. Odabrane mješavine peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin Enkefalin) pripremljene su u 20 µL/min. Minimalna brzina protoka za obje kolone je 800 µL/min. Minimalne vrijednosti HETP-a pri optimalnoj brzini protoka (80 µL/min) za PMP kolonu i Ascentis Express RP-Amide kolonu bile su 2,6 µm i 3,9 µm, respektivno. Vrijednosti HETP-a ukazuju na to da je efikasnost separacije PMP kolone (100 × 1,8 mm id) mnogo bolja od komercijalno dostupne Ascentis Express RP-Amide kolone (100 × 1,8 mm id). Van Deemterov dijagram na slici 7(A) pokazuje da smanjenje vrijednosti N s povećanjem protoka nije značajno u poređenju s našom prethodnom studijom. Veća efikasnost separacije PMP kolone (100 × 1,8 mm id) u poređenju sa Ascentis Express RP-Amide kolonom zasnovano je na poboljšanjima u obliku, veličini čestica i složenim procedurama pakovanja kolone korištenim u trenutnom radu34.
(A) van Deemterov dijagram (HETP u odnosu na linearnu brzinu mobilne faze) dobijen korištenjem PMP kolone (100 × 1,8 mm un. prečnik) u 60/40 ACN/H2O sa 0,1% TFA. (B) van Deemterov dijagram (HETP u odnosu na linearnu brzinu mobilne faze) dobijen korištenjem Ascentis Express RP-Amide kolone (100 × 1,8 mm un. prečnik) u 60/40 ACN/H2O sa 0,1% TFA.
Pripremljena je i procijenjena stacionarna faza od polarno ugrađenog polistirena za odvajanje sintetičkih peptidnih smjesa i tripsin digestije humanog serumskog albumina (HAS) u tečnoj hromatografiji visokih performansi. Kromatografske performanse PMP kolona za peptidne smjese su odlične u efikasnosti i rezoluciji odvajanja. Poboljšane performanse odvajanja PMP kolona su posljedica različitih razloga, kao što su veličina čestica i veličina pora čestica silicijum dioksida, kontrolisana sinteza stacionarne faze i složeno pakovanje kolone. Pored visoke efikasnosti odvajanja, nizak povratni pritisak u koloni pri visokim brzinama protoka je još jedna prednost ove stacionarne faze. PMP kolone pokazuju dobru reproducibilnost i mogu se koristiti za analizu peptidnih smjesa i tripsin digestiju različitih proteina. Namjeravamo koristiti ovu kolonu za odvajanje prirodnih proizvoda, bioaktivnih spojeva iz ljekovitih biljaka i gljivičnih ekstrakata u tečnoj hromatografiji. U budućnosti će se PMP kolone također procijeniti za odvajanje proteina i monoklonskih antitijela.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Istraživanje sistema za odvajanje peptida pomoću reverzne fazne hromatografije, Dio I: Razvoj protokola za karakterizaciju kolone. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. i dr. Poboljšani aktivni peptidi dizajnirani za liječenje zaraznih bolesti. Biotechnology. Advanced. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetički terapijski peptidi: nauka i tržište. Otkriće lijekova. 15 (1-2) danas, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Napredna proteomska tečna hromatografija. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. i dr. Napredna tečna hromatografija-masena spektrometrija omogućava uključivanje široko ciljane metabolomike i proteomike. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM i Salisbury, JJ Uloga UHPLC-a u razvoju lijekova. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentalni i praktični aspekti tečne hromatografije ultravisokog pritiska za brza odvajanja. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Primjena tečne hromatografije ultra visokih performansi u razvoju lijekova. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. i dr. Monolitni makroporozni hidrogeli pripremljeni od emulzija ulja u vodi s visokim sadržajem unutrašnje faze za efikasno prečišćavanje enterovirusa. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA Uloga tečne hromatografije u proteomici. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. i Guillarme, D. Novi trendovi u razdvajanju terapeutskih peptida i proteina reverzno-faznom tečnom hromatografijom: teorija i primjena. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Dvodimenzionalno odvajanje peptida korištenjem RP-RP-HPLC sistema uz korištenje različitih pH vrijednosti u prvoj i drugoj dimenziji odvajanja. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. i dr. Ispitane su karakteristike prijenosa mase i kinetičke performanse visokoefikasnih hromatografskih kolona napunjenih potpuno i površinski poroznim česticama C18 veličine ispod 2 μm. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. i dr. Nedavni trendovi i analitički izazovi u izolaciji, identifikaciji i validaciji biljnih bioaktivnih peptida. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB i dr. Proteomski pejzaž carstva života. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. i dr. Obrada terapijskih peptida preparativnom tečnom hromatografijom. Molecule (Basel, Švicarska) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. i Geng, X. Mješovita hromatografija i njena primjena na biopolimere. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. i Sun, Y. Ligandi za proteinsku hromatografiju miješanog načina rada: princip, karakterizacija i dizajn. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).