Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). In de tussentijd geven we de site weer zonder stijlen en JavaScript, om ondersteuning te blijven bieden.
Poreuze silicadeeltjes werden bereid met behulp van een sol-gelmethode met enkele aanpassingen om macroporeuze deeltjes te verkrijgen. Deze deeltjes werden gederivatiseerd door reversibele additiefragmentatieketenoverdracht (RAFT)-polymerisatie met N-fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat (PMI) en styreen om N-fenylmaleïmide-intercalatie van de stationaire fase van polystyreen (PMP) te bereiden. Roestvrijstalen kolommen met smalle boring (100 × 1,8 mm id) werden gepakt door middel van slurrypakking. Evalueerde PMP-kolomscheiding van een peptidemengsel bestaande uit vijf peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkefaline) chromatografische prestaties) en trypsine-digestie van humaan serumalbumine (HAS). Onder optimale elutieomstandigheden is het theoretische plaatgetal van het peptidemengsel zo hoog als 280.000 platen/m².Bij een vergelijking van de scheidingsprestaties van de ontwikkelde kolom met de commerciële Ascentis Express RP-Amide kolom werd vastgesteld dat de scheidingsprestaties van de PMP-kolom superieur waren aan de commerciële kolom in termen van scheidingsefficiëntie en resolutie.
De afgelopen jaren is de biofarmaceutische industrie een groeiende wereldwijde markt geworden met een substantiële toename van het marktaandeel. Met de explosieve groei van de biofarmaceutische industrie1,2,3 is de analyse van peptiden en eiwitten zeer gewenst. Naast het doelpeptide worden er tijdens de peptidesynthese verschillende onzuiverheden gegenereerd, waardoor chromatografische zuivering nodig is om peptiden van de gewenste zuiverheid te verkrijgen. De analyse en karakterisering van eiwitten in lichaamsvloeistoffen, weefsels en cellen is een uiterst uitdagende taak vanwege het grote aantal potentieel detecteerbare soorten in één monster. Hoewel massaspectrometrie een effectief hulpmiddel is voor peptide- en eiwitsequencing, zal de scheiding niet ideaal zijn als dergelijke monsters in één keer in de massaspectrometer worden geïnjecteerd. Dit probleem kan worden verholpen door scheidingen met vloeistofchromatografie (LC) uit te voeren vóór de MS-analyse, waardoor het aantal analyten dat op een bepaald moment de massaspectrometer binnenkomt, wordt verminderd4,5,6. Bovendien kunnen analyten tijdens de scheiding van de vloeistoffase worden gefocust op smalle gebieden, waardoor deze analyten worden geconcentreerd en de MS-detectie wordt verbeterd gevoeligheid. Vloeistofchromatografie (LC) heeft de afgelopen tien jaar een enorme vooruitgang geboekt en is een populaire techniek geworden in proteomische analyse7,8,9,10.
Omgekeerde-fase vloeistofchromatografie (RP-LC) wordt veel gebruikt voor de zuivering en scheiding van peptidemengsels met octadecyl-gemodificeerde silica (ODS) als stationaire fase11,12,13. Echter, RP stationaire fasen bieden geen bevredigende scheiding van peptiden en eiwitten vanwege hun complexe structuur en amfifiele aard14,15. Daarom zijn speciaal ontworpen stationaire fasen vereist om peptiden en eiwitten met polaire en niet-polaire groepen te analyseren om met deze analyten te interacteren en ze te behouden16. Gemengde-modus chromatografie, die multimodale interacties biedt, kan een alternatief zijn voor RP-LC voor de scheiding van peptiden, eiwitten en andere complexe mengsels. Verschillende gemengde-modus stationaire fasen zijn voorbereid en kolommen gevuld met deze fasen zijn gebruikt voor peptide- en eiwitscheidingen17,18,19,20,21. Gemengde-modus stationaire fasen (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polaire Intercalatie/RPLC) zijn geschikt voor peptide- en eiwitscheidingen vanwege de aanwezigheid van zowel polaire als apolaire groepen22,23,24,25,26,27,28. Polaire intercalerende stationaire fasen met covalent gebonden polaire groepen vertonen eveneens een goed scheidingsvermogen en een unieke selectiviteit voor polaire en apolaire analyten, aangezien de scheiding afhankelijk is van de interactie tussen de analyt en de stationaire fase. Multimodale interacties29, 30, 31, 32. Onlangs hebben Zhang et al. 30 bereidde een dodecyl-beëindigde polyamine-stationaire fase en scheidde met succes koolwaterstoffen, antidepressiva, flavonoïden, nucleosiden, oestrogenen en diverse andere analyten. De polaire intercalator heeft zowel polaire als niet-polaire groepen en kan daarom worden gebruikt om peptiden en eiwitten te scheiden die zowel hydrofobe als hydrofiele delen hebben. Polair ingebedde kolommen (bijvoorbeeld amide-ingebedde C18-kolommen) zijn commercieel verkrijgbaar onder de handelsnaam Ascentis Express RP-Amide-kolommen, maar deze kolommen worden uitsluitend gebruikt voor de analyse van amine 33.
In de huidige studie werd een polair ingebedde stationaire fase (N-fenylmaleïmide-ingebed polystyreen) bereid en geëvalueerd voor scheiding van peptiden en trypsine-digesten van HSA. De stationaire fase werd bereid met behulp van de volgende strategie. Poreuze silicadeeltjes werden bereid volgens de procedure beschreven in onze vorige publicatie met enkele aanpassingen aan het bereidingsprotocol. De verhouding van ureum, polyethyleenglycol (PEG), TMOS, waterazijnzuur werd aangepast om silicadeeltjes met een grote poriegrootte te bereiden. Ten tweede werd een nieuwe ligand, fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat, gesynthetiseerd en gebruikt om silicadeeltjes te derivatiseren om een ​​polair ingebedde stationaire fase te bereiden. De resulterende stationaire fase werd gepakt in een roestvrijstalen kolom (100 × 1,8 mm id) met behulp van het geoptimaliseerde pakkingsschema. De kolompakking wordt ondersteund door mechanische trillingen om te garanderen dat er een homogeen bed wordt gevormd in de kolom. Evalueer gepakte kolomscheiding van peptidemengsels bestaande uit vijf peptiden; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) en trypsine-digestie van humaan serumalbumine (HAS). Er werd waargenomen dat het peptidemengsel en het trypsine-digestie van HSA met een goede resolutie en efficiëntie werden gescheiden. De scheidingsprestaties van de PMP-kolom werden vergeleken met die van de Ascentis Express RP-Amide-kolom. Er werd waargenomen dat zowel peptiden als eiwitten goed werden gescheiden en efficiënt waren op de PMP-kolom, die efficiënter was dan de Ascentis Express RP-Amide-kolom.
PEG (polyethyleenglycol), ureum, azijnzuur, trimethoxyorthosilicaat (TMOS), trimethylchlorosilane (TMCS), trypsine, menselijk serumalbumine (HSA), ammoniumchloride, ureum, hexaanmethyldisilazaan (HMDS), methacryloylchloride (MC), styreen, 4-hydroxy-TEMPO, benzoylperoxide (BPO), HPLC-kwaliteit acetonitril (ACN), methanol, 2-propanol en aceton gekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS).
Een mengsel van ureum (8 g), polyethyleenglycol (8 g) en 8 ml 0,01 N azijnzuur werd 10 minuten geroerd, waarna er onder ijskoude omstandigheden 24 ml TMOS aan werd toegevoegd. Het reactiemengsel werd gedurende 6 uur verhit bij 40 °C en vervolgens gedurende 8 uur bij 120 °C in een roestvrijstalen autoclaaf. Het water werd afgegoten en het resterende materiaal werd gedurende 12 uur gedroogd bij 70 °C. De gedroogde zachte massa werd glad gemalen in een oven en gecalcineerd bij 550 °C gedurende 12 uur. Er werden drie batches bereid en gekarakteriseerd om de reproduceerbaarheid in deeltjesgrootte, poriegrootte en oppervlakte te onderzoeken.
Door oppervlaktemodificatie van silicadeeltjes met de vooraf gesynthetiseerde ligand fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat (PCMP), gevolgd door radiale polymerisatie met styreen, werd een verbinding met polaire groepen bereid. Stationaire fase voor aggregaten en polystyreenketens. Het bereidingsproces wordt hieronder beschreven.
N-fenylmaleïmide (200 mg) en methylvinylisocyanaat (100 mg) werden opgelost in droge tolueen en 0,1 ml 2,2'-azoisobutyronitril (AIBN) werd toegevoegd aan de reactiekolf om fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat-copolymeer (PMCP) te bereiden. Het mengsel werd 3 uur verwarmd tot 60 °C, gefiltreerd en 3 uur in een oven gedroogd bij 40 °C.
Gedroogde silicadeeltjes (2 g) werden gedispergeerd in droge tolueen (100 ml), geroerd en gedurende 10 minuten gesonificeerd in een rondbodemkolf van 500 ml. PMCP (10 mg) werd opgelost in tolueen en druppelsgewijs via een druppeltrechter toegevoegd aan de reactiekolf. Het mengsel werd gedurende 8 uur verwarmd onder terugvloeikoeling bij 100 °C, gefiltreerd en gewassen met aceton en gedurende 3 uur gedroogd bij 60 °C. Vervolgens werden PMCP-gebonden silicadeeltjes (100 g) opgelost in tolueen (200 ml) en werd 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) toegevoegd in aanwezigheid van 100 µl dibutyltindilauraat als katalysator. Het mengsel werd gedurende 8 uur geroerd bij 50 °C, gefiltreerd en gedurende 3 uur gedroogd bij 50 °C.
Styreen (1 ml), benzoylperoxide (BPO) (0,5 ml) en aan TEMPO-PMCP gebonden silicadeeltjes (1,5 g) werden gedispergeerd in tolueen en gespoeld met stikstof. De polymerisatie van styreen werd uitgevoerd bij 100 °C gedurende 12 uur. Het resulterende product werd gewassen met methanol en een nacht gedroogd bij 60 °C. Het algehele reactieschema is weergegeven in Figuur 1.
De monsters werden gedurende 1 uur ontgast bij 393 K om een ​​restdruk van minder dan 10-3 Torr te verkrijgen. De hoeveelheid N2 die werd geadsorbeerd bij een relatieve druk van P/P0 = 0,99 werd gebruikt om het totale poriënvolume te bepalen. De morfologie van kale en ligandgebonden silicadeeltjes werd onderzocht met behulp van scanning elektronenmicroscopie (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Gedroogde monsters (kale silica en ligandgebonden silicadeeltjes) werden met behulp van zelfklevende koolstoftape op een aluminiumkolom geplaatst. De monsters werden verguld met behulp van een Q150T sputtercoater en er werd een 5 nm Au-laag op de monsters afgezet. Dit verbetert de procesefficiëntie met behulp van lage spanningen en zorgt voor fijnkorrelige, koude sputtering. Een Thermo Electron (Waltham, MA, VS) Flash EA1112 elementanalysator werd gebruikt voor de elementanalyse. Een Malvern (Worcestershire, VK) Mastersizer 2000 deeltjesgrootte-analysator werd gebruikt om de deeltjesgrootte te bepalen distributie.Naakte silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes (elk 5 mg) werden gedispergeerd in 5 ml isopropanol, gedurende 10 min gesoniceerd, gedurende 5 min gewerveld en op de optische bank van de Mastersizer geplaatst.Thermogravimetrische analyse werd uitgevoerd met een snelheid van 5 °C per minuut over een temperatuurbereik van 30 tot 800 °C.
Met glas beklede smalle roestvrijstalen kolommen met afmetingen (100 × 1,8 mm id) werden gevuld met behulp van de slurry-vulmethode, waarbij dezelfde procedure werd toegepast als in Ref. 31. Een roestvrijstalen kolom (met glas bekleed, 100 × 1,8 mm binnendiameter) met een uitlaatfitting met een frit van 1 µm werd aangesloten op een slurrypacker (Alltech Deerfield, IL, VS). Bereid een stationaire fase-slurry door 150 mg stationaire fase te suspenderen in 1,2 ml methanol en deze naar de opslagkolom te sturen. Methanol werd gebruikt als oplosmiddel voor de slurry en als drijfmiddel. Vul de kolom achtereenvolgens door gedurende 10 minuten een druk van 100 MP, gedurende 15 minuten een druk van 80 MP en gedurende 30 minuten een druk van 60 MP toe te passen. Tijdens het vullen werden mechanische trillingen toegepast met twee GC-kolomschudders (Alltech, Deerfield, IL, VS) om een ​​gelijkmatige vulling van de kolom te garanderen. Sluit de slurrypacker en laat de druk langzaam ontsnappen om schade in de kolom te voorkomen. Koppel de kolom los van de slurrypacker en sluit een andere aan. montage op de inlaat en op het LC-systeem om de werking ervan te controleren.
Een LC-pomp (10AD Shimadzu, Japan), injector (Valco (VS) C14 W.05) met een injectielus van 50 nL, membraanontgasser (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS-capillairvenster werd geconstrueerd. Speciale µLC-detector (UV-2075) en microkolommen met glazen bekleding werden geconstrueerd. Gebruik zeer smalle en korte verbindingsslangen om het effect van extra kolombandverbreding te minimaliseren. Na verpakking werden capillairen (50 μm id 365) en reducerende capillairen (50 μm) geïnstalleerd bij de 1/16″-uitlaat van de reducerende capillair. Gegevensverzameling en chromatografische verwerking werden uitgevoerd met behulp van Multichro 2000-software. Monitoring bij 254 nm. Analyten werden getest op UV-absorptie. Chromatografische gegevens werden geanalyseerd met OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumine uit menselijk serum, gelyofiliseerd poeder, ≥ 96% (agarosegelelektroforese) 3 mg gemengd met trypsine (1,5 mg), 4,0 M ureum (1 ml) en 0,2 M ammoniumbicarbonaat (1 ml). De oplossing werd 10 minuten geroerd en 6 uur in een waterbad bij 37 °C bewaard, vervolgens geblust met 1 ml 0,1% TFA. Filtreer de oplossing en bewaar beneden 4 °C.
De scheiding van peptidemengsels en HSA-trypsinedigesten werd afzonderlijk geëvalueerd op PMP-kolommen. Controleer de scheiding van het peptidemengsel en trypsinedigest van HSA door de PMP-kolom en vergelijk de resultaten met de Ascentis Express RP-Amide-kolom. Het theoretische plaatnummer wordt als volgt berekend:
SEM-beelden van kale silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes worden weergegeven in FIG. 2. SEM-beelden van kale silicadeeltjes (A, B) tonen aan dat deze deeltjes, in tegenstelling tot onze eerdere studies, bolvormig zijn, waarbij de deeltjes langwerpig zijn of een onregelmatige symmetrie hebben. Het oppervlak van de ligandgebonden silicadeeltjes (C, D) is gladder dan dat van de kale silicadeeltjes, wat mogelijk te wijten is aan de coating van polystyreenketens op het oppervlak van de silicadeeltjes.
Scannende elektronenmicroscoopbeelden van kale silicadeeltjes (A, B) en ligandgebonden silicadeeltjes (C, D).
De deeltjesgrootteverdelingen van kale silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes worden weergegeven in Figuur 3(A). Volumegebaseerde deeltjesgrootteverdelingscurven lieten zien dat de grootte van de silicadeeltjes toenam na chemische modificatie (Fig. 3A). De gegevens over de deeltjesgrootteverdeling van de silicadeeltjes uit de huidige studie en de vorige studie worden vergeleken in Tabel 1(A). De volumegebaseerde deeltjesgrootte, d(0,5), van PMP is 3,36 μm, vergeleken met onze vorige studie met een ad(0,5)-waarde van 3,05 μm (polystyreengebonden silicadeeltjes)34. Deze batch had een smallere deeltjesgrootteverdeling vergeleken met onze vorige studie vanwege de variërende verhoudingen van PEG, ureum, TMOS en azijnzuur in het reactiemengsel. De deeltjesgrootte van de PMP-fase is iets groter dan die van de polystyreengebonden silicadeeltjesfase die we eerder bestudeerden. Dit betekent dat oppervlaktefunctionalisatie van silicadeeltjes met styreen alleen een polystyreenlaag (0,97 µm) afzette op het silica-oppervlak, terwijl in de PMP-fase de laagdikte 1,38 µm bedroeg.
Deeltjesgrootteverdeling (A) en poriegrootteverdeling (B) van kale silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes.
De poriegrootte, het porievolume en het oppervlak van de silicadeeltjes van de huidige studie worden weergegeven in Tabel 1(B). De PSD-profielen van kale silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes worden weergegeven in Figuur 3(B). De resultaten zijn vergelijkbaar met onze vorige studie. De poriegroottes van de kale en ligandgebonden silicadeeltjes zijn respectievelijk 310 en 241, wat aangeeft dat de poriegrootte met 69 afneemt na chemische modificatie, zoals weergegeven in Tabel 1(B), en de verandering van de curve wordt weergegeven in Fig. 3(B). Op dezelfde manier nam het porievolume van de silicadeeltjes af van 0,67 naar 0,58 cm3/g na chemische modificatie. Het specifieke oppervlak van de momenteel bestudeerde silicadeeltjes is 116 m2/g, wat vergelijkbaar is met ons vorige onderzoek (124 m2/g). Zoals weergegeven in Tabel 1(B), nam het oppervlak (m2/g) van de silicadeeltjes ook af van 116 m2/g naar 105 m2/g na chemische modificatie.
De resultaten van de elementanalyse van de stationaire fase worden weergegeven in Tabel 2. De koolstoflading van de huidige stationaire fase is 6,35%, wat lager is dan de koolstoflading van onze vorige studie (polystyreen gebonden silicadeeltjes, respectievelijk 7,93%35 en 10,21%) 42. De koolstoflading van de huidige stationaire fase is laag, omdat bij de bereiding van de huidige SP, naast styreen, enkele polaire liganden zoals fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat (PCMP) en 4-hydroxy-TEMPO werden gebruikt. Het stikstofgewichtspercentage van de huidige stationaire fase is 2,21%, vergeleken met respectievelijk 0,1735 en 0,85% op basis van het gewicht van stikstof in eerdere studies. Dit betekent dat het gewichtspercentage stikstof hoger is in de huidige stationaire fase vanwege fenylmaleïmide. Op dezelfde manier waren de koolstofladingen van producten (4) en (5) respectievelijk 2,7% en 2,9%, terwijl de koolstof De belading van het eindproduct (6) bedroeg 6,35%, zoals weergegeven in tabel 2. Het gewichtsverlies werd gecontroleerd met de stationaire fase van PMP en de TGA-curve wordt weergegeven in figuur 4. De TGA-curve laat een gewichtsverlies zien van 8,6%, wat in goede overeenstemming is met de koolstofbelading (6,35%) omdat de liganden niet alleen C bevatten, maar ook N, O en H.
De fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaatligand werd gekozen voor oppervlaktemodificatie van silicadeeltjes omdat het polaire fenylmaleïmidegroepen en vinylisocyanaatgroepen heeft. Vinylisocyanaatgroepen kunnen verder reageren met styreen door levende radicaalpolymerisatie. De tweede reden is om een ​​groep in te voegen die een matige interactie heeft met de analyt en geen sterke elektrostatische interactie tussen de analyt en de stationaire fase, aangezien de fenylmaleïmidegroep geen virtuele lading heeft bij normale pH. De polariteit van de stationaire fase kan worden gecontroleerd door de optimale hoeveelheid styreen en de reactietijd van vrije-radicalenpolymerisatie. De laatste stap van de reactie (vrije-radicalenpolymerisatie) is cruciaal en kan de polariteit van de stationaire fase veranderen. Elementanalyse werd uitgevoerd om de koolstoflading van deze stationaire fasen te controleren. Er werd waargenomen dat het verhogen van de hoeveelheid styreen en de reactietijd de koolstoflading van de stationaire fase verhoogde en vice versa. SP's bereid met verschillende concentraties styreen hebben verschillende koolstofladingen. Nogmaals, laad deze stationaire fasen in roestvrij stalen kolommen en controleer hun chromatografische prestaties (selectiviteit, resolutie, N-waarde, enz.). Op basis van deze experimenten werd een geoptimaliseerde formulering geselecteerd om de stationaire PMP-fase te bereiden om gecontroleerde polariteit en goede analytretentie te garanderen.
Vijf peptidemengsels (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkefaline) werden ook geëvalueerd met behulp van een PMP-kolom met een mobiele fase; 60/40 (v/v) acetonitril/water (0,1% TFA) bij een stroomsnelheid van 80 μL/min.Onder optimale elutiecondities bedraagt ​​het theoretische plaatnummer (N) per kolom (100 × 1,8 mm id) 20.000 ± 100 (200.000 platen/m²).Tabel 3 geeft de N-waarden voor de drie PMP-kolommen en de chromatogrammen worden weergegeven in Figuur 5A.Snelle analyse op een PMP-kolom bij een hoge stroomsnelheid (700 μL/min), vijf peptiden werden binnen één minuut geëlueerd, N-waarden waren erg goed, 13.500 ± 330 per kolom (100 × 1,8 mm id), komt overeen met 135.000 platen/m (Figuur 5B).Drie kolommen van identieke grootte (100 × 1,8 mm id) werden gevuld met drie verschillende partijen PMP-stationaire fase om de reproduceerbaarheid te controleren. De analytconcentratie voor elke kolom werd vastgelegd met behulp van de optimale elutiecondities en het aantal theoretische platen N en de retentietijd om hetzelfde testmengsel op elke kolom te scheiden. De reproduceerbaarheidsgegevens voor de PMP-kolommen worden weergegeven in Tabel 4. De reproduceerbaarheid van de PMP-kolom correleert goed met zeer lage %RSD-waarden, zoals weergegeven in Tabel 3.
Scheiding van het peptidemengsel op een PMP-kolom (B) en een Ascentis Express RP-Amide-kolom (A); mobiele fase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), afmetingen PMP-kolom (100 × 1,8 mm id); analytische elutievolgorde van de verbindingen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) en 5 (leucine) (zuur encefaline)).
Een PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) werd geëvalueerd voor de scheiding van tryptische digesten van humaan serumalbumine in hogeprestatievloeistofchromatografie. Het chromatogram in Figuur 6 laat zien dat het monster goed is gescheiden en dat de resolutie erg goed is. HSA-digesties werden geanalyseerd met een stroomsnelheid van 100 µL/min, mobiele fase 70/30 acetonitril/water en 0,1% TFA. Zoals te zien is in het chromatogram (Figuur 6), is de HSA-digestie opgesplitst in 17 pieken die overeenkomen met 17 peptiden. De scheidingsefficiëntie van elke piek in de HSA-digestie werd berekend en de waarden worden weergegeven in Tabel 5.
Een tryptisch digest van HSA (100 × 1,8 mm id) werd gescheiden op een PMP-kolom; stroomsnelheid (100 µL/min), mobiele fase 60/40 acetonitril/water met 0,1% TFA.
waarbij L de kolom lengte is, η de viscositeit van de mobiele fase, ΔP de tegendruk van de kolom en u de lineaire snelheid van de mobiele fase. De permeabiliteit van de PMP-kolom was 2,5 × 10-14 m2, de stroomsnelheid was 25 μL/min en er werd 60/40 v/v ACN/water gebruikt. De permeabiliteit van de PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) was vergelijkbaar met die van onze eerdere studie Ref.34. De permeabiliteit van de kolom gevuld met oppervlakkig poreuze deeltjes is: 1,7 × 10-15 voor 1,3 μm deeltjes, 3,1 × 10-15 voor 1,7 μm deeltjes, 5,2 × 10-15 en 2,5 × 10-14 m2 voor 2,6 μm deeltjes Voor 5 μm-deeltjes 43.De permeabiliteit van de PMP-fase is daarom vergelijkbaar met die van kern-schil-deeltjes van 5 μm.
waarbij Wx het gewicht is van de kolom die is gevuld met chloroform, Wy het gewicht is van de kolom die is gevuld met methanol en ρ de dichtheid is van het oplosmiddel. Dichtheden van methanol (ρ = 0,7866) en chloroform (ρ = 1,484). De totale porositeit van SILICA PARTICLES-C18 kolommen (100 × 1,8 mm id) 34 en C18-Ureum kolommen 31 die we eerder hebben bestudeerd, waren respectievelijk 0,63 en 0,55. Dit betekent dat de aanwezigheid van ureumliganden de permeabiliteit van de stationaire fase vermindert. Aan de andere kant is de totale porositeit van de PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) 0,60. De permeabiliteit van PMP-kolommen is lager dan die van kolommen die zijn gevuld met C18-gebonden silicadeeltjes, omdat in stationaire fasen van het C18-type de C18-liganden aan de silicadeeltjes als lineaire ketens, terwijl in stationaire fasen van het polystyreentype een relatief dikke polymeerlaag eromheen wordt gevormd. In een typisch experiment wordt de porositeit van de kolom als volgt berekend:
Figuur 7A,B tonen de PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) en de Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 × 1,8 mm id) met dezelfde elutiecondities (d.w.z. 60/40 ACN/H2O en 0,1% TFA). ) van het van Deemter-diagram. Geselecteerde peptidemengsels (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) werden bereid in 20 µL/. De minimale stroomsnelheid voor beide kolommen is 800 µL/min. De minimale HETP-waarden bij de optimale stroomsnelheid (80 µL/min) voor de PMP-kolom en de Ascentis Express RP-Amide-kolom waren respectievelijk 2,6 µm en 3,9 µm. De HETP-waarden geven aan dat de scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) veel beter is dan de commercieel verkrijgbare Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 × 1,8 mm id). De van Deemter-plot in Fig. 7(A) laat zien dat de afname van de N-waarde bij toenemende stroom niet significant is in vergelijking met onze eerdere studie.De hogere scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) vergeleken met de Ascentis Express RP-Amide-kolom is gebaseerd op verbeteringen in de deeltjesvorm, -grootte en complexe kolompakkingsprocedures die in het huidige werk worden gebruikt34.
(A) van Deemter-plot (lineaire snelheid van het HETP versus mobiele fase) verkregen met behulp van een PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) in 60/40 ACN/H2O met 0,1% TFA. (B) van Deemter-plot (lineaire snelheid van het HETP versus mobiele fase) verkregen met behulp van een Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 × 1,8 mm id) in 60/40 ACN/H2O met 0,1% TFA.
Een stationaire fase van polair ingebed polystyreen werd voorbereid en geëvalueerd voor de scheiding van synthetische peptidemengsels en trypsine-digesties van humaan serumalbumine (HAS) in hogeprestatievloeistofchromatografie. De chromatografische prestaties van PMP-kolommen voor peptidemengsels zijn uitstekend wat betreft scheidingsefficiëntie en resolutie. De verbeterde scheidingsprestaties van PMP-kolommen zijn te danken aan verschillende redenen, zoals de deeltjesgrootte en poriegrootte van de silicadeeltjes, gecontroleerde synthese van de stationaire fase en complexe kolompakking. Naast de hoge scheidingsefficiëntie is de lage kolomtegendruk bij hoge stroomsnelheden een ander voordeel van deze stationaire fase. PMP-kolommen vertonen een goede reproduceerbaarheid en kunnen worden gebruikt voor de analyse van peptidemengsels en trypsine-digestie van verschillende eiwitten. We zijn van plan deze kolom te gebruiken voor de scheiding van natuurlijke producten, bioactieve verbindingen uit medicinale planten en schimmelextracten in vloeistofchromatografie. In de toekomst zullen PMP-kolommen ook worden geëvalueerd voor de scheiding van eiwitten en monoklonale antilichamen.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Onderzoek naar peptide-scheidingssystemen door middel van omgekeerde fasechromatografie Deel I: Ontwikkeling van een kolomkarakteriseringsprotocol. J. Chromatography.1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Verbeterde actieve peptiden ontworpen voor de behandeling van infectieziekten. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetische therapeutische peptiden: wetenschap en de markt. Geneesmiddelenontdekking.15 (1-2) vandaag, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Geavanceerde proteomische vloeistofchromatografie. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Geavanceerde vloeistofchromatografie-massaspectrometrie maakt de integratie van breed gerichte metabolomics en proteomics mogelijk. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ De rol van UHPLC in de ontwikkeling van geneesmiddelen. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktische aspecten van ultrahoge druk vloeistofchromatografie voor snelle scheidingen. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Toepassing van ultrahogeprestatievloeistofchromatografie bij de ontwikkeling van geneesmiddelen. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolithische macroporeuze hydrogels bereid uit olie-in-water emulsies met een hoge interne fase voor efficiënte zuivering van enterovirussen. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA De rol van vloeistofchromatografie in proteomics. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Opkomende trends in omgekeerde-fase vloeistofchromatografiescheidingen van therapeutische peptiden en eiwitten: theorie en toepassingen. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tweedimensionale scheiding van peptiden met behulp van een RP-RP-HPLC-systeem met verschillende pH-waarden in de eerste en tweede scheidingsdimensie. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. De massaoverdrachtskarakteristieken en kinetische prestaties van zeer efficiënte chromatografische kolommen gevuld met volledig en oppervlakkig poreuze C18-deeltjes van minder dan 2 μm werden onderzocht. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Recente trends en analytische uitdagingen bij de isolatie, identificatie en validatie van bioactieve peptiden uit planten. anus.biological anus. Chemical. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Het proteomische landschap van het koninkrijk van het leven. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Downstream processing van therapeutische peptiden door middel van preparatieve vloeistofchromatografie. Molecule (Basel, Zwitserland) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Gemengde-moduschromatografie en de toepassing ervan op biopolymeren. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Liganden voor gemengde-modus eiwitchromatografie: principe, karakterisering en ontwerp. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).