Bedankt voor uw bezoek aan Nature.com. De browserversie die u gebruikt, biedt beperkte ondersteuning voor CSS. Voor de beste ervaring raden we u aan een bijgewerkte browser te gebruiken (of de compatibiliteitsmodus in Internet Explorer uit te schakelen). Om de ondersteuning te blijven garanderen, tonen we de site in de tussentijd zonder stijlen en JavaScript.
Poreuze silicadeeltjes werden bereid met behulp van een sol-gelmethode met enkele aanpassingen om macroporeuze deeltjes te verkrijgen. Deze deeltjes werden gederevatiseerd door middel van reversibele additie-fragmentatie-ketenoverdracht (RAFT) polymerisatie met N-fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat (PMI) en styreen om een ​​N-fenylmaleïmide-intercalatie van polystyreen (PMP) stationaire fase te bereiden. Smalle roestvrijstalen kolommen (100 × 1,8 mm binnendiameter) werden gevuld met een slurry. De scheiding van een peptidemengsel bestaande uit vijf peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkefaline) en trypsinevertering van humaan serumalbumine (HAS) op de PMP-kolom werd geëvalueerd. Onder optimale elutieomstandigheden bedraagt ​​het theoretische aantal schotels van het peptidemengsel maar liefst 280.000. platen/m². Bij vergelijking van de scheidingsprestaties van de ontwikkelde kolom met de commerciële Ascentis Express RP-Amide kolom werd geconstateerd dat de scheidingsprestaties van de PMP-kolom superieur waren aan die van de commerciële kolom wat betreft scheidingsefficiëntie en resolutie.
De biofarmaceutische industrie is de afgelopen jaren uitgegroeid tot een wereldwijde markt met een aanzienlijke toename van het marktaandeel. Door de explosieve groei van de biofarmaceutische industrie1,2,3 is de analyse van peptiden en eiwitten zeer gewenst. Naast het doelpeptide worden er tijdens de peptidesynthese verschillende onzuiverheden gegenereerd, waardoor chromatografische zuivering nodig is om peptiden met de gewenste zuiverheid te verkrijgen. De analyse en karakterisering van eiwitten in lichaamsvloeistoffen, weefsels en cellen is een uiterst uitdagende taak vanwege het grote aantal potentieel detecteerbare soorten in één enkel monster. Hoewel massaspectrometrie een effectief hulpmiddel is voor peptide- en eiwitsequentiebepaling, zal de scheiding niet optimaal zijn als dergelijke monsters in één keer in de massaspectrometer worden geïnjecteerd. Dit probleem kan worden verholpen door vloeistofchromatografie (LC)-scheidingen uit te voeren vóór de MS-analyse, waardoor het aantal analyten dat tegelijkertijd de massaspectrometer binnenkomt, wordt verminderd4,5,6. Bovendien kunnen analyten tijdens vloeistoffasescheiding in smalle gebieden worden geconcentreerd, waardoor deze analyten worden geconcentreerd en de MS-detectie wordt verbeterd. Gevoeligheid. Vloeistofchromatografie (LC) heeft de afgelopen tien jaar een aanzienlijke vooruitgang geboekt en is een populaire techniek geworden in proteomische analyse7,8,9,10.
Omgekeerde-fase vloeistofchromatografie (RP-LC) wordt veel gebruikt voor de zuivering en scheiding van peptidemengsels met octadecyl-gemodificeerd silica (ODS) als stationaire fase11,12,13. RP-stationaire fasen bieden echter geen bevredigende scheiding van peptiden en eiwitten vanwege hun complexe structuur en amfifiele aard14,15. Daarom zijn speciaal ontworpen stationaire fasen nodig om peptiden en eiwitten te analyseren met polaire en niet-polaire componenten die met deze analyten interageren en ze vasthouden16. Gemengde-modus chromatografie, die multimodale interacties mogelijk maakt, kan een alternatief zijn voor RP-LC voor de scheiding van peptiden, eiwitten en andere complexe mengsels. Er zijn verschillende gemengde-modus stationaire fasen ontwikkeld en kolommen gevuld met deze fasen zijn gebruikt voor de scheiding van peptiden en eiwitten17,18,19,20,21. Gemengde-modus stationaire fasen (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polaire Intercalatie/RPLC) zijn geschikt voor de scheiding van peptiden en eiwitten vanwege de aanwezigheid van zowel polaire als niet-polaire groepen22,23,24,25,26,27,28. Op dezelfde manier vertonen polaire intercalerende stationaire fasen met covalent gebonden polaire groepen een goed scheidingsvermogen en een unieke selectiviteit voor polaire en niet-polaire analyten, aangezien de scheiding afhangt van de interactie tussen analyt en stationaire fase. Multimodale interacties 29, 30, 31, 32. Recentelijk hebben Zhang et al. 30 bereidde een stationaire fase met dodecyl-terminated polyamine voor en scheidde met succes koolwaterstoffen, antidepressiva, flavonoïden, nucleosiden, oestrogenen en diverse andere analyten. De polaire intercalator heeft zowel polaire als niet-polaire groepen, waardoor deze gebruikt kan worden voor de scheiding van peptiden en eiwitten met zowel hydrofobe als hydrofiele delen. Polair-ingebedde kolommen (bijvoorbeeld amide-ingebedde C18-kolommen) zijn commercieel verkrijgbaar onder de handelsnaam Ascentis Express RP-Amide-kolommen, maar deze kolommen worden alleen gebruikt voor de analyse van amine 33.
In de huidige studie werd een polaire stationaire fase (N-fenylmaleïmide-ingebed polystyreen) bereid en geëvalueerd voor de scheiding van peptiden en trypsine-digestaten van HSA. De stationaire fase werd bereid volgens de volgende strategie. Poreuze silicadeeltjes werden bereid volgens de procedure beschreven in onze eerdere publicatie, met enkele aanpassingen aan het bereidingsprotocol. De verhouding van ureum, polyethyleenglycol (PEG), TMOS, water en azijnzuur werd aangepast om silicadeeltjes met een grote poriegrootte te verkrijgen. Vervolgens werd een nieuwe ligand, fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat, gesynthetiseerd en gebruikt om silicadeeltjes te derivatiseren en zo een polaire stationaire fase te bereiden. De resulterende stationaire fase werd in een roestvrijstalen kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) gepakt met behulp van het geoptimaliseerde pakschema. Het vullen van de kolom werd ondersteund door mechanische vibratie om een ​​homogeen bed in de kolom te garanderen. De scheiding van peptidemengsels bestaande uit vijf peptiden in de gepakte kolom werd geëvalueerd. (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine-enkefaline) en trypsine-digest van humaan serumalbumine (HAS). Het peptidemengsel en de trypsine-digest van HSA bleken met een goede resolutie en efficiëntie te scheiden. De scheidingsprestaties van de PMP-kolom werden vergeleken met die van de Ascentis Express RP-Amide-kolom. Zowel peptiden als eiwitten bleken goed gescheiden en efficiënt te zijn op de PMP-kolom, die efficiënter was dan de Ascentis Express RP-Amide-kolom.
PEG (polyethyleenglycol), ureum, azijnzuur, trimethoxyorthosilicaat (TMOS), trimethylchloorsilaan (TMCS), trypsine, humaan serumalbumine (HSA), ammoniumchloride, ureum, hexaanmethyldisilazaan (HMDS), methacryloylchloride (MC), styreen, 4-hydroxy-TEMPO, benzoylperoxide (BPO), HPLC-kwaliteit acetonitril (ACN), methanol, 2-propanol en aceton. Aangekocht bij Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, VS).
Een mengsel van ureum (8 g), polyethyleenglycol (8 g) en 8 ml 0,01 N azijnzuur werd 10 minuten geroerd, waarna 24 ml TMOS onder ijskoude omstandigheden werd toegevoegd. Het reactiemengsel werd gedurende 6 uur verhit tot 40 °C en vervolgens gedurende 8 uur tot 120 °C in een roestvrijstalen autoclaaf. Het water werd afgegoten en het resterende materiaal werd gedroogd bij 70 °C gedurende 12 uur. De gedroogde zachte massa werd fijngemalen in een oven en gecalcineerd bij 550 °C gedurende 12 uur. Drie batches werden bereid en gekarakteriseerd om de reproduceerbaarheid van de deeltjesgrootte, poriegrootte en oppervlakte te onderzoeken.
Door oppervlaktemodificatie van silicadeeltjes met de vooraf gesynthetiseerde ligand fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat (PCMP), gevolgd door radiale polymerisatie met styreen, werd een polaire groepbevattende verbinding bereid. Stationaire fase voor aggregaten en polystyreenketens. Het bereidingsproces wordt hieronder beschreven.
N-fenylmaleïmide (200 mg) en methylvinylisocyanaat (100 mg) werden opgelost in droge tolueen, waarna 0,1 ml 2,2'-azoisobutyronitril (AIBN) aan de reactiekolf werd toegevoegd om een ​​fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat-copolymeer (PMCP) te bereiden. Het mengsel werd gedurende 3 uur verwarmd tot 60 °C, gefilterd en vervolgens 3 uur gedroogd in een oven bij 40 °C.
Gedroogde silicadeeltjes (2 g) werden gedispergeerd in droge tolueen (100 ml), geroerd en gesoniceerd in een rondbodemkolf van 500 ml gedurende 10 min. PMCP (10 mg) werd opgelost in tolueen en druppelgewijs toegevoegd aan de reactiekolf via een druppelbuisje. Het mengsel werd 8 uur lang onder reflux verwarmd bij 100 °C, gefilterd, gewassen met aceton en gedroogd bij 60 °C gedurende 3 uur. Vervolgens werden PMCP-gebonden silicadeeltjes (100 g) opgelost in tolueen (200 ml) en werd 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) toegevoegd in aanwezigheid van 100 µl dibutyltindilauraat als katalysator. Het mengsel werd 8 uur lang geroerd bij 50 °C, gefilterd en gedroogd bij 50 °C gedurende 3 uur.
Styreen (1 ml), benzoylperoxide (BPO) (0,5 ml) en TEMPO-PMCP-gehechte silicadeeltjes (1,5 g) werden gedispergeerd in tolueen en gespoeld met stikstof. De polymerisatie van styreen werd uitgevoerd bij 100 °C gedurende 12 uur. Het resulterende product werd gewassen met methanol en gedroogd bij 60 °C gedurende de nacht. Het algehele reactieschema is weergegeven in figuur 1.
De monsters werden gedurende 1 uur bij 393 K ontgast om een ​​restdruk van minder dan 10⁻³ Torr te verkrijgen. De hoeveelheid geadsorbeerde N₂ bij een relatieve druk van P/P₀ = 0,99 werd gebruikt om het totale porievolume te bepalen. De morfologie van kale en ligand-gebonden silicadeeltjes werd onderzocht met behulp van scanningelektronenmicroscopie (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Gedroogde monsters (kale silica en ligand-gebonden silicadeeltjes) werden met behulp van zelfklevende koolstoftape op een aluminiumkolom geplaatst. Goud werd op de monsters aangebracht met een Q150T sputtercoater, waarbij een 5 nm dikke Au-laag werd afgezet. Dit verbetert de procesefficiëntie bij gebruik van lage spanningen en zorgt voor fijnkorrelig, koud sputteren. Voor de elementanalyse werd een Thermo Electron (Waltham, MA, VS) Flash EA1112 elementanalysator gebruikt. Voor het bepalen van de deeltjesgrootteverdeling werd een Malvern (Worcestershire, VK) Mastersizer 2000 deeltjesgrootteanalysator gebruikt. Silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes (elk 5 mg) werden gedispergeerd in 5 ml isopropanol, gedurende 10 minuten gesoniceerd, gedurende 5 minuten gevortexd en op de optische bank van de Mastersizer geplaatst. Thermogravimetrische analyse werd uitgevoerd met een snelheid van 5 °C per minuut over een temperatuurbereik van 30 tot 800 °C.
Glasbeklede roestvrijstalen kolommen met een smalle boring van afmetingen (100 × 1,8 mm binnendiameter) werden gevuld met behulp van de slurry-vulmethode, waarbij dezelfde procedure werd toegepast als in Ref. 31. Een roestvrijstalen kolom (glasbekleed, 100 × 1,8 mm binnendiameter) met een uitlaatfitting met een frit van 1 µm werd aangesloten op een slurry packer (Alltech Deerfield, IL, VS). Bereid een stationaire fase-slurry voor door 150 mg stationaire fase te suspenderen in 1,2 ml methanol en stuur deze naar de opslagkolom. Methanol werd gebruikt als slurry-oplosmiddel en als drijfmiddel. Vul de kolom achtereenvolgens door drukken van 100 MPa gedurende 10 minuten, 80 MPa gedurende 15 minuten en 60 MPa gedurende 30 minuten toe te passen. Tijdens het vullen werd mechanische vibratie toegepast met twee GC-kolomschudders (Alltech, Deerfield, IL, VS) om een ​​uniforme vulling van de kolom te garanderen. Sluit de slurry packer en laat de druk langzaam ontsnappen om schade aan de kolom te voorkomen. Koppel de kolom los van de slurry packer en sluit een andere fitting aan op de inlaat en naar het LC-systeem om de prestaties ervan te controleren.
Een LC-pomp (10AD Shimadzu, Japan), injector (Valco (USA) C14 W.05) met een injectielus van 50 nL, membraanontgasser (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS capillairvenster, speciale µLC-detector (UV-2075) en met glas beklede microkolommen werden geconstrueerd. Er werden zeer smalle en korte verbindingsslangen gebruikt om het effect van extra kolombandverbreding te minimaliseren. Na het verpakken werden capillairen (50 μm binnendiameter 365) en reduceercapillairen (50 μm) geïnstalleerd op de 1/16″ uitgang van de reduceerkoppeling. Gegevensverzameling en chromatografische verwerking werden uitgevoerd met Multichro 2000-software. Monitoring bij 254 nm. Analytes werden getest op UV-absorptie. Chromatografische gegevens werden geanalyseerd met OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumine uit menselijk serum, gelyofiliseerd poeder, ≥ 96% (agarosegelelektroforese) 3 mg gemengd met trypsine (1,5 mg), 4,0 M ureum (1 ml) en 0,2 M ammoniumbicarbonaat (1 ml). De oplossing werd 10 minuten geroerd en vervolgens 6 uur in een waterbad van 37 °C gehouden, waarna deze werd geblust met 1 ml 0,1% TFA. Filter de oplossing en bewaar deze beneden 4 °C.
De scheiding van peptidemengsels en HSA-trypsinedigestaten werd afzonderlijk geëvalueerd op PMP-kolommen. Controleer de scheiding van het peptidemengsel en het trypsinedigestaat van HSA door de PMP-kolom en vergelijk de resultaten met die van de Ascentis Express RP-Amide-kolom. Het theoretische plaatgetal wordt als volgt berekend:
SEM-afbeeldingen van kale silicadeeltjes en aan liganden gebonden silicadeeltjes worden weergegeven in Fig. 2. SEM-afbeeldingen van kale silicadeeltjes (A, B) laten zien dat deze deeltjes, in tegenstelling tot onze eerdere studies, bolvormig zijn, waarbij de deeltjes langwerpig zijn of een onregelmatige symmetrie hebben. Het oppervlak van de aan liganden gebonden silicadeeltjes (C, D) is gladder dan dat van de kale silicadeeltjes, wat mogelijk te wijten is aan de coating van polystyreenketens op het oppervlak van de silicadeeltjes.
Scanning elektronenmicroscoopbeelden van kale silicadeeltjes (A, B) en aan liganden gebonden silicadeeltjes (C, D).
De deeltjesgrootteverdelingen van kale silicadeeltjes en ligandgebonden silicadeeltjes worden weergegeven in Figuur 3(A). Volumegebaseerde deeltjesgrootteverdelingscurven lieten zien dat de grootte van de silicadeeltjes toenam na chemische modificatie (Fig. 3A). De deeltjesgrootteverdelingsgegevens van de silicadeeltjes uit de huidige studie en de vorige studie worden vergeleken in Tabel 1(A). De volumegebaseerde deeltjesgrootte, d(0,5), van PMP is 3,36 μm, vergeleken met onze vorige studie met een ad(0,5)-waarde van 3,05 μm (polystyreengebonden silicadeeltjes)34. Deze batch had een smallere deeltjesgrootteverdeling vergeleken met onze vorige studie vanwege de variërende verhoudingen van PEG, ureum, TMOS en azijnzuur in het reactiemengsel. De deeltjesgrootte van de PMP-fase is iets groter dan die van de polystyreengebonden silicadeeltjesfase die we eerder bestudeerden. Dit betekent dat oppervlaktefunctionalering van silicadeeltjes met styreen slechts een polystyreenlaag (0,97 µm) op de silica afzette. aan het oppervlak, terwijl de laagdikte in de PMP-fase 1,38 µm bedroeg.
Deeltjesgrootteverdeling (A) en poriegrootteverdeling (B) van kale silicadeeltjes en aan liganden gebonden silicadeeltjes.
De poriegrootte, het porievolume en het oppervlakte van de silicadeeltjes in dit onderzoek worden weergegeven in Tabel 1(B). De PSD-profielen van kale silicadeeltjes en ligand-gebonden silicadeeltjes worden getoond in Figuur 3(B). De resultaten zijn vergelijkbaar met die van ons eerdere onderzoek. De poriegrootte van de kale en ligand-gebonden silicadeeltjes bedraagt ​​respectievelijk 310 en 241, wat aangeeft dat de poriegrootte met 69 afneemt na chemische modificatie, zoals weergegeven in Tabel 1(B). De verandering van de curve is te zien in Figuur 3(B). Evenzo nam het porievolume van de silicadeeltjes af van 0,67 tot 0,58 cm³/g na chemische modificatie. Het specifieke oppervlakte van de in dit onderzoek bestudeerde silicadeeltjes bedraagt ​​116 m²/g, wat vergelijkbaar is met ons eerdere onderzoek (124 m²/g). Zoals weergegeven in Tabel 1(B), nam het oppervlakte (m²/g) van de silicadeeltjes ook af van 116 m²/g tot 105 m²/g. m2/g na chemische modificatie.
De resultaten van de elementanalyse van de stationaire fase worden weergegeven in Tabel 2. De koolstofbelasting van de huidige stationaire fase is 6,35%, wat lager is dan de koolstofbelasting van onze vorige studie (polystyreen-gebonden silicadeeltjes, respectievelijk 7,93%35 en 10,21%)42. De koolstofbelasting van de huidige stationaire fase is laag, omdat bij de bereiding van de huidige SP, naast styreen, ook enkele polaire liganden zoals fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaat (PCMP) en 4-hydroxy-TEMPO werden gebruikt. Het stikstofgewichtspercentage van de huidige stationaire fase is 2,21%, vergeleken met respectievelijk 0,1735 en 0,85 gewichtsprocent stikstof in eerdere studies. Dit betekent dat het gewichtspercentage stikstof hoger is in de huidige stationaire fase vanwege fenylmaleïmide. Op dezelfde manier waren de koolstofbelastingen van producten (4) en (5) respectievelijk 2,7% en 2,9%, terwijl de koolstofbelasting van de Het eindproduct (6) was 6,35%, zoals weergegeven in Tabel 2. Het gewichtsverlies werd gecontroleerd met PMP stationaire fase, en de TGA-curve is weergegeven in Figuur 4. De TGA-curve toont een gewichtsverlies van 8,6%, wat goed overeenkomt met de koolstofbelading (6,35%) omdat de liganden niet alleen C bevatten, maar ook N, O en H.
De fenylmaleïmide-methylvinylisocyanaatligand werd gekozen voor oppervlaktemodificatie van silicadeeltjes omdat deze polaire fenylmaleïmide- en vinylisocyanaatgroepen bevat. Vinylisocyanaatgroepen kunnen verder reageren met styreen door middel van levende radicaalpolymerisatie. De tweede reden is het inbrengen van een groep die een matige interactie heeft met de analyt en geen sterke elektrostatische interactie tussen de analyt en de stationaire fase, aangezien de fenylmaleïmide-eenheid geen virtuele lading heeft bij normale pH. De polariteit van de stationaire fase kan worden geregeld door de optimale hoeveelheid styreen en de reactietijd van de vrije radicaalpolymerisatie. De laatste stap van de reactie (vrije radicaalpolymerisatie) is cruciaal en kan de polariteit van de stationaire fase veranderen. Elementanalyse werd uitgevoerd om de koolstofbelasting van deze stationaire fasen te controleren. Er werd waargenomen dat een verhoging van de hoeveelheid styreen en de reactietijd de koolstofbelasting van de stationaire fase verhoogde en vice versa. Stationaire fasen bereid met verschillende concentraties styreen hebben verschillende koolstofbelastingen. Vervolgens werden deze stationaire fasen in roestvrijstalen kolommen geladen en hun chromatografische prestaties (selectiviteit, resolutie, N-waarde, enz.) werden gecontroleerd. Op basis van deze experimenten werd een geoptimaliseerde formulering geselecteerd voor de bereiding van de PMP-stationaire fase om gecontroleerde polariteit en goede retentie van de analyt te garanderen.
Vijf peptidemengsels (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enkefaline) werden ook geëvalueerd met behulp van een PMP-kolom met een mobiele fase; 60/40 (v/v) acetonitril/water (0,1% TFA) bij een stroomsnelheid van 80 μL/min. Onder optimale elutieomstandigheden is het theoretische aantal platen (N) per kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) 20.000 ± 100 (200.000 platen/m²). Tabel 3 geeft de N-waarden voor de drie PMP-kolommen en de chromatogrammen worden weergegeven in Figuur 5A. Snelle analyse op een PMP-kolom bij een hoge stroomsnelheid (700 μL/min): vijf peptiden werden binnen één minuut geëlueerd, de N-waarden waren zeer goed, 13.500 ± 330 per kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter), wat overeenkomt met 135.000 platen/m² (Figuur 5B). Drie identieke kolommen (100 × De kolommen (1,8 mm binnendiameter) werden gevuld met drie verschillende batches PMP-stationaire fase om de reproduceerbaarheid te controleren. De analytconcentratie voor elke kolom werd vastgelegd met behulp van de optimale elutieomstandigheden en het aantal theoretische schotels N en de retentietijd om hetzelfde testmengsel op elke kolom te scheiden. De reproduceerbaarheidsgegevens voor de PMP-kolommen worden weergegeven in Tabel 4. De reproduceerbaarheid van de PMP-kolom correleert goed met zeer lage %RSD-waarden, zoals weergegeven in Tabel 3.
Scheiding van peptidemengsel op PMP-kolom (B) en Ascentis Express RP-Amide-kolom (A); mobiele fase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), afmetingen PMP-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter); analytische elutievolgorde van de verbindingen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) en 5 (leucine) zuur enkefaline)).
Een PMP-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) werd geëvalueerd voor de scheiding van trypsine-digestaten van humaan serumalbumine in hogedruk-vloeistofchromatografie. Het chromatogram in figuur 6 laat zien dat het monster goed gescheiden is en de resolutie zeer goed is. HSA-digestaten werden geanalyseerd met een stroomsnelheid van 100 µL/min, een mobiele fase van 70/30 acetonitril/water en 0,1% TFA. Zoals weergegeven in het chromatogram (figuur 6), is het HSA-digestaat opgesplitst in 17 pieken die overeenkomen met 17 peptiden. De scheidingsefficiëntie van elke piek in het HSA-digestaat werd berekend en de waarden staan ​​in tabel 5.
Een trypsine-digest van HSA (100 × 1,8 mm binnendiameter) werd gescheiden op een PMP-kolom; stroomsnelheid (100 µL/min), mobiele fase 60/40 acetonitril/water met 0,1% TFA.
waarbij L de kolomlengte is, η de viscositeit van de mobiele fase, ΔP de tegendruk in de kolom en u de lineaire snelheid van de mobiele fase. De permeabiliteit van de PMP-kolom was 2,5 × 10⁻¹⁴ m², de stroomsnelheid was 25 μL/min en er werd een 60/40 v/v ACN/water-mengsel gebruikt. De permeabiliteit van de PMP-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) was vergelijkbaar met die van onze eerdere studie (ref. 34). De permeabiliteit van de kolom gevuld met oppervlakkig poreuze deeltjes is: 1,7 × 10⁻¹⁵ voor deeltjes van 1,3 μm, 3,1 × 10⁻¹⁵ voor deeltjes van 1,7 μm, 5,2 × 10⁻¹⁵ en 2,5 × 10⁻¹⁴ m² voor deeltjes van 2,6 μm. deeltjes 43. Daarom is de permeabiliteit van de PMP-fase vergelijkbaar met die van 5 μm kern-manteldeeltjes.
waarbij Wx het gewicht is van de kolom gevuld met chloroform, Wy het gewicht is van de kolom gevuld met methanol en ρ de dichtheid van het oplosmiddel is. Dichtheden van methanol (ρ = 0,7866) en chloroform (ρ = 1,484). De totale porositeit van SILICA PARTICLES-C18 kolommen (100 × 1,8 mm binnendiameter) 34 en C18-Urea kolommen 31 die we eerder bestudeerden, was respectievelijk 0,63 en 0,55. Dit betekent dat de aanwezigheid van ureumliganden de permeabiliteit van de stationaire fase vermindert. Aan de andere kant is de totale porositeit van de PMP-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) 0,60. De permeabiliteit van PMP-kolommen is lager dan die van kolommen gevuld met C18-gebonden silicadeeltjes, omdat in C18-type stationaire fasen de C18-liganden aan de silicadeeltjes zijn gehecht als lineaire ketens, terwijl in stationaire fasen van het polystyreentype een relatief dikke polymeerlaag eromheen wordt gevormd. In een typisch experiment wordt de porositeit van de kolom als volgt berekend:
Figuur 7A en 7B tonen de PMP-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) en de Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) met dezelfde elutieomstandigheden (d.w.z. 60/40 ACN/H2O en 0,1% TFA). ) van de van Deemter-grafiek. Geselecteerde peptidemengsels (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine-enkefaline) werden bereid in 20 µL/min. De minimale stroomsnelheid voor beide kolommen is 800 µL/min. De minimale HETP-waarden bij de optimale stroomsnelheid (80 µL/min) voor de PMP-kolom en de Ascentis Express RP-Amide-kolom waren respectievelijk 2,6 µm en 3,9 µm. De HETP-waarden geven aan dat de scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) veel beter is dan die van de commercieel verkrijgbare Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter). De van Deemter-grafiek in figuur 7(A) laat zien dat de afname van de N-waarde met toenemende stroomsnelheid niet significant is in vergelijking met ons eerdere onderzoek. De hogere scheidingsefficiëntie van de PMP-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) in vergelijking met de Ascentis Express RP-Amide-kolom is gebaseerd op verbeteringen in de vorm en grootte van de deeltjes en de complexe kolomvulprocedures die in dit onderzoek zijn gebruikt34.
(A) Van Deemter-grafiek (HETP versus lineaire snelheid van de mobiele fase) verkregen met een PMP-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) in 60/40 ACN/H2O met 0,1% TFA. (B) Van Deemter-grafiek (HETP versus lineaire snelheid van de mobiele fase) verkregen met een Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) in 60/40 ACN/H2O met 0,1% TFA.
Een stationaire fase van polair polystyreen (PMP) werd bereid en geëvalueerd voor de scheiding van synthetische peptidemengsels en trypsine-digestaten van humaan serumalbumine (HAS) in hogedruk-vloeistofchromatografie (HPLC). De chromatografische prestaties van PMP-kolommen voor peptidemengsels zijn uitstekend wat betreft scheidingsefficiëntie en resolutie. De verbeterde scheidingsprestaties van PMP-kolommen zijn te danken aan verschillende factoren, zoals de deeltjesgrootte en poriegrootte van de silicadeeltjes, de gecontroleerde synthese van de stationaire fase en de complexe kolomvulling. Naast een hoge scheidingsefficiëntie is een lage tegendruk in de kolom bij hoge stroomsnelheden een ander voordeel van deze stationaire fase. PMP-kolommen vertonen een goede reproduceerbaarheid en kunnen worden gebruikt voor de analyse van peptidemengsels en trypsine-digestaten van diverse eiwitten. We zijn van plan deze kolom te gebruiken voor de scheiding van natuurproducten, bioactieve stoffen uit medicinale planten en schimmelextracten in vloeistofchromatografie. In de toekomst zullen PMP-kolommen ook worden geëvalueerd voor de scheiding van eiwitten en monoklonale antilichamen.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Onderzoek naar peptidescheidingssystemen door middel van omgekeerde fasechromatografie Deel I: Ontwikkeling van een protocol voor kolomkarakterisering. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Verbeterde actieve peptiden ontworpen voor de behandeling van infectieziekten. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetische therapeutische peptiden: wetenschap en de markt. Drug Discovery. 15 (1-2) vandaag, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Geavanceerde proteomische vloeistofchromatografie. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Geavanceerde vloeistofchromatografie-massaspectrometrie maakt de integratie van breed gerichte metabolomics en proteomics mogelijk. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ De rol van UHPLC in de ontwikkeling van geneesmiddelen. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktische aspecten van ultrahogedruk vloeistofchromatografie voor snelle scheidingen. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Toepassing van ultra-high performance vloeistofchromatografie in geneesmiddelenontwikkeling. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolithische macroporeuze hydrogels bereid uit olie-in-water-emulsies met een hoge interne fase voor efficiënte zuivering van enterovirussen. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA De rol van vloeistofchromatografie in proteomics. J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Opkomende trends in omgekeerde-fase vloeistofchromatografie scheidingen van therapeutische peptiden en eiwitten: theorie en toepassingen. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Tweedimensionale scheiding van peptiden met behulp van een RP-RP-HPLC-systeem met verschillende pH-waarden in de eerste en tweede scheidingsdimensie. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. De massaoverdrachtskarakteristieken en kinetische prestaties van hoogefficiënte chromatografische kolommen gevuld met C18 sub-2 μm volledig en oppervlakkig poreuze deeltjes werden onderzocht. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Recente trends en analytische uitdagingen bij de isolatie, identificatie en validatie van bioactieve peptiden uit planten. Chemische anus. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Het proteomische landschap van het rijk der levens. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Downstreamverwerking van therapeutische peptiden door preparatieve vloeistofchromatografie. Molecule (Basel, Zwitserland) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Gemengde-moduschromatografie en de toepassing ervan op biopolymeren. J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Liganden voor gemengde-modus eiwitchromatografie: principe, karakterisering en ontwerp. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).