Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Таны ашиглаж буй хөтчийн хувилбар нь CSS-ийн дэмжлэг хязгаарлагдмал байна. Хамгийн сайн туршлагын тулд бид танд шинэчлэгдсэн хөтчийг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр нийцтэй байдлын горимыг унтраах). Энэ хооронд бид үргэлжлүүлэн дэмжлэг үзүүлэхийн тулд сайтыг хэв маяг болон JavaScriptгүйгээр харуулах болно.
Сүвэрхэг цахиурын хэсгүүдийг макро сүвэрхэг хэсгүүдийг гаргаж авахын тулд зарим өөрчлөлтийг оруулан золь-гелийн аргаар бэлтгэсэн. Эдгээр хэсгүүдийг N-фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PMI) болон стирол ашиглан буцаах нэмэлт фрагментийн гинжин дамжуулалт (RAFT) полимержилтээр гаргаж авсан бөгөөд полистирол (PMP)-ийн хөдөлгөөнгүй фазын N-фенилмалеимид интеркаляцийг бэлтгэсэн. Нарийн диаметртэй зэвэрдэггүй ган багануудыг (100 × 1.8 мм хэмжээтэй) зутан савлагаагаар савласан. Таван пептид (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) хроматографийн гүйцэтгэл болон хүний ​​сийвэнгийн альбумин (HAS)-ийн трипсин задралаас бүрдсэн пептидийн холимгийг PMP баганаар ялгах чадварыг үнэлсэн. Хамгийн оновчтой элюцийн нөхцөлд пептидийн холимгийн онолын хавтангийн тоо 280,000 хавтан/м² хүртэл өндөр байна. Боловсруулсан ялгах гүйцэтгэлийг харьцуулах Арилжааны Ascentis Express RP-Amide баганатай баганыг харьцуулсан бөгөөд PMP баганын ялгах гүйцэтгэл нь ялгах үр ашиг болон нягтралын хувьд арилжааны баганаас илүү байсан нь ажиглагдсан.
Сүүлийн жилүүдэд биофармацевтикийн салбар зах зээлийн эзлэх хувь мэдэгдэхүйц нэмэгдэж, дэлхийн зах зээл өргөжиж байна. Биофармацевтикийн салбарын огцом өсөлттэй холбоотойгоор1,2,3 пептид болон уургийн шинжилгээ маш их эрэлттэй байна. Зорилтот пептидээс гадна пептидийн нийлэгжилтийн явцад хэд хэдэн хольц үүсдэг тул хүссэн цэвэршилттэй пептидийг авахын тулд хроматографийн цэвэршүүлэлт шаардлагатай болдог. Нэг дээжинд илрүүлэх боломжтой олон тооны зүйл байдаг тул биеийн шингэн, эд, эс дэх уургийн шинжилгээ, шинж чанарыг тодорхойлох нь маш хэцүү ажил юм. Массын спектрометр нь пептид болон уургийн дарааллыг тогтоох үр дүнтэй хэрэгсэл боловч ийм дээжийг нэг удаагийн дамжуулалтаар массын спектрометрт оруулбал ялгах нь тийм ч тохиромжтой биш байх болно. Энэ асуудлыг MS шинжилгээний өмнө шингэн хроматографи (LC) ялгах замаар багасгаж болох бөгөөд энэ нь тодорхой хугацаанд массын спектрометрт орж буй аналитуудын тоог бууруулна4,5,6. Нэмж дурдахад, шингэн фазын ялгах үед аналитуудыг нарийн бүсэд төвлөрүүлж, улмаар эдгээр аналитуудыг төвлөрүүлж, MS илрүүлэх мэдрэмжийг сайжруулж болно. Шингэн Хроматографи (ХХ) нь сүүлийн арван жилд мэдэгдэхүйц хөгжсөн бөгөөд протеомик шинжилгээнд түгээмэл хэрэглэгддэг арга болсон7,8,9,10.
Урвуу фазын шингэн хроматографи (RP-LC) нь октадецилээр өөрчлөгдсөн цахиур (ODS)-ийг хөдөлгөөнгүй фаз болгон ашиглан пептидийн хольцыг цэвэршүүлэх, ялгахад өргөн хэрэглэгддэг11,12,13. Гэсэн хэдий ч RP хөдөлгөөнгүй фазууд нь нарийн төвөгтэй бүтэц, амфифилийн шинж чанартай тул пептид ба уургийг хангалттай салгаж чаддаггүй14,15. Тиймээс эдгээр аналитуудтай харилцан үйлчилж, хадгалахын тулд туйлширсан болон туйлширсан бус хэсгүүдтэй пептид ба уургийг шинжлэхэд тусгайлан боловсруулсан хөдөлгөөнгүй фазууд шаардлагатай16. Олон горимт харилцан үйлчлэлийг хангадаг холимог горимын хроматографи нь пептид, уураг болон бусад нарийн төвөгтэй хольцыг ялгахад RP-LC-ийн өөр хувилбар байж болно. Хэд хэдэн холимог горимын хөдөлгөөнгүй фазуудыг бэлтгэсэн бөгөөд эдгээр фазаар дүүргэсэн багануудыг пептид ба уургийг ялгахад ашигласан17,18,19,20,21. Холимог горимын хөдөлгөөнгүй фазууд (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, туйлын интеркаляци/RPLC) нь пептид ба уургийн хувьд тохиромжтой. туйл болон туйл бус бүлгүүдийн аль алиных нь байгаагаас үүдэлтэй салалтууд22,23,24,25,26,27,28. Үүнтэй адилаар, ковалент холбоо бүхий туйлширсан бүлгүүдтэй туйл хоорондын харилцан үйлчлэлийн хөдөлгөөнгүй фазууд нь туйл болон туйл бус аналитуудын хувьд сайн салгах чадвар болон өвөрмөц сонгомол чанарыг харуулдаг, учир нь салалт нь аналит ба хөдөлгөөнгүй фазын харилцан үйлчлэлээс хамаардаг. Олон төрлийн харилцан үйлчлэлүүд 29, 30, 31, 32. Саяхан Жан нар. 30 нь додецилээр төгссөн полиамины хөдөлгөөнгүй фазыг бэлтгэж, нүүрсустөрөгч, антидепрессант, флавоноид, нуклеозид, эстроген болон бусад хэд хэдэн аналитыг амжилттай ялгасан. Туйлын интеркалатор нь туйлын болон туйлын бус бүлгүүдтэй тул гидрофобик болон гидрофилийн хэсгүүдтэй пептид ба уургийг ялгахад ашиглаж болно. Туйлын шигтгээтэй багана (жишээ нь, амид шигтгээтэй C18 багана) нь Ascentis Express RP-Amide багана гэсэн худалдааны нэрээр худалдаалагдаж байгаа боловч эдгээр баганыг зөвхөн амин 33-ийн шинжилгээнд ашигладаг.
Одоогийн судалгаанд туйлшралд суулгагдсан суурин фаз (N-фенилмалеимид- суулгагдсан полистирол)-ыг бэлтгэж, HSA-ийн пептид ба трипсин задралыг ялгахад үнэлсэн. Хөдөлгөөнгүй фазыг дараах стратегийг ашиглан бэлтгэсэн. Сүвэрхэг цахиурын хэсгүүдийг өмнөх нийтлэлд өгөгдсөн журмын дагуу бэлтгэсэн бөгөөд бэлтгэлийн протоколд зарим өөрчлөлт оруулсан. Мочевин, полиэтилен гликол (PEG), TMOS, усны цууны хүчлийн харьцааг том нүх сүвтэй цахиурын хэсгүүдийг бэлтгэхэд тохируулсан. Хоёрдугаарт, шинэ лиганд болох фенилмалеимид-метил винил изоцианатыг нэгтгэж, цахиурын хэсгүүдийг гаргаж авахад ашиглан туйлшралд суулгагдсан суурин фазыг бэлтгэсэн. Үүссэн суурин фазыг оновчтой савлах схемийг ашиглан зэвэрдэггүй ган багана (100 × 1.8 мм id)-д савласан. Баганын савлагааг механик чичиргээгээр дэмжиж, баганын дотор нэгэн төрлийн ор үүссэнийг баталгаажуулсан. Таван пептидээс бүрдсэн пептидийн холимгийг савласан баганын ялгалтыг үнэлэх; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) болон хүний ​​сийвэнгийн альбумины (HAS) трипсин задрал. HSA-ийн пептидийн холимог ба трипсин задрал нь сайн нягтралтай, үр ашигтайгаар ялгарч байгааг ажигласан. PMP баганын ялгах гүйцэтгэлийг Ascentis Express RP-Amide баганынхтай харьцуулсан. Пептид болон уургууд хоёулаа PMP баганад сайн уусч, үр ашигтай байгааг ажигласан бөгөөд энэ нь Ascentis Express RP-Amide баганаас илүү үр дүнтэй байв.
PEG (Полиэтилен гликол), мочевин, цууны хүчил, триметокси ортосиликат (TMOS), триметил хлорсилан (TMCS), трипсин, хүний ​​сийвэнгийн альбумин (HSA), аммонийн хлорид, мочевин, гексан метилдисилазан (HMDS), метакрилоил хлорид (MC), стирол, 4-гидрокси-TEMPO, бензоил хэт исэл (BPO), HPLC зэрэглэлийн ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол, болон ацетоныг Sigma-Aldrich (Сент-Луис, Миссури, АНУ)-аас худалдаж авсан.
Мочевин (8 гр), полиэтилен гликол (8 гр), 8 мл 0.01 Н цууны хүчлийн холимгийг 10 минутын турш хутгаж, дараа нь мөс шиг хүйтэн нөхцөлд 24 мл TMOS нэмсэн. Урвалын хольцыг 40°C-д 6 цаг, дараа нь 120°C-д зэвэрдэггүй ган автоклавт 8 цаг халаана. Усыг асгаж, үлдэгдэл материалыг 70°C-д 12 цагийн турш хатаана. Хатаасан зөөлөн массыг зууханд жигд нунтаглаж, 550°C-д 12 цагийн турш шатаана. Бөөмийн хэмжээ, нүх сүвний хэмжээ, гадаргуугийн талбайгаар давтагдах чадварыг шалгахын тулд гурван багц бэлтгэж, шинжилнэ.
Цахиурын хэсгүүдийг урьдчилан нийлэгжүүлсэн лиганд фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP)-ээр гадаргуугийн өөрчлөлт хийж, дараа нь стиролоор радиаль полимержилт хийснээр туйлын бүлэг агуулсан нэгдлийг бэлтгэсэн. Агрегатууд болон полистирол гинжний хөдөлгөөнгүй үе шат. Бэлтгэх үйл явцыг доор тайлбарлав.
N-фенилмалеимид (200 мг) болон метил винил изоцианат (100 мг)-ийг хуурай толуолд уусгаж, фенилмалеимид-метил винил изоцианатын сополимер (PMCP) бэлтгэхийн тулд урвалын колбонд 0.1 мл 2,2′-азоиизобутиронитрил (AIBN) нэмсэн. Холимгийг 60°C-д 3 цагийн турш халааж, шүүж, 40°C-д зууханд 3 цагийн турш хатаасан.
Хатаасан цахиурын хэсгүүдийг (2 г) хуурай толуолд (100 мл) тарааж, хутгаж, 500 мл-ийн дугуй ёроолтой колбонд 10 минутын турш хэт авиагаар шүүсэн. PMCP (10 мг)-ийг толуолд уусгаж, дуслын юүлүүрээр дамжуулан урвалын колбонд дуслаар нэмсэн. Холимгийг 100°C-д 8 цагийн турш буцаан шүүж, шүүж, ацетоноор угааж, 60°C-д 3 цагийн турш хатаасан. Дараа нь PMCP-тэй холбогдсон цахиурын хэсгүүдийг (100 г) толуолд (200 мл) уусгаж, катализатор болгон 100 µл дибутилтин дилуратыг байрлуулж 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) нэмсэн. Холимгийг 50°C-д 8 цагийн турш хутгаж, шүүж, 50°C-д 3 цагийн турш хатаасан.
Стирол (1 мл), бензоил хэт исэл BPO (0.5 мл), TEMPO-PMCP-тэй холбогдсон цахиурын хэсгүүд (1.5 г)-ийг толуолд тарааж, азотоор цэвэрлэсэн. Стиролын полимержилтийг 100°C-д 12 цагийн турш явуулсан. Үүссэн бүтээгдэхүүнийг метанолоор угааж, 60°C-д шөнийн турш хатаасан. Нийт урвалын схемийг Зураг 1-т үзүүлэв.
Дээжийг 393 К температурт 1 цагийн турш хийгүйжүүлж, 10-3 Торр-оос бага үлдэгдэл даралтыг гарган авсан. Нийт нүх сүвний эзэлхүүнийг тодорхойлохын тулд P/P0 = 0.99 харьцангуй даралттай үед шингээгдсэн N2 хэмжээг ашигласан. Нүх сүвний нийт эзэлхүүнийг тодорхойлохын тулд нүцгэн болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн морфологийг сканнердах электрон микроскопоор шалгасан (Hitachi High Technologies, Токио, Япон). Хатаасан дээжийг (нүцгэн цахиур болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүд) наалдамхай нүүрстөрөгчийн тууз ашиглан хөнгөн цагаан багана дээр байрлуулсан. Q150T шүршигч бүрээс ашиглан дээжинд алтыг бүрж, дээжинд 5 нм Au давхаргыг түрхсэн. Энэ нь бага хүчдэл ашиглан үйл явцын үр ашгийг сайжруулж, нарийн ширхэгтэй, хүйтэн шүрших боломжийг олгодог. Элементийн шинжилгээнд Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 элементийн анализаторыг ашигласан. Бөөмийн хэмжээг авахын тулд Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 бөөмийн хэмжээний анализаторыг ашигласан. тархалт. Нүцгэн цахиурын хэсгүүд болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийг (тус бүр 5 мг) 5 мл изопропанолд уусгаж, 10 минутын турш хэт авиагаар шүүж, 5 минутын турш хутгаж, Мастерсайзерын оптик вандан дээр байрлуулсан. Термогравиметрийн шинжилгээг 30-800 °C температурын хязгаарт минутанд 5 °C хурдтайгаар гүйцэтгэсэн.
100 × 1.8 мм хэмжээтэй (id) шилэн доторлогоотой зэвэрдэггүй ган нарийн диаметртэй багануудыг лавлагаанд ашигласантай ижил аргаар зутан савлах аргыг ашиглан савласан. 31. 1 мкм фрит агуулсан гаралтын холбох хэрэгсэлтэй зэвэрдэггүй ган багана (шилэн доторлогоотой, 100 × 1.8 мм хэмжээтэй)-ийг зутан савлагчтай (Alltech Deerfield, IL, USA) холбосон. 1.2 мл метанолд 150 мг хөдөлгөөнгүй фазыг дүүжлүүлэн хадгалах багана руу илгээж хөдөлгөөнгүй фазын зутан бэлтгэнэ. Метанолыг зутан уусгагч болон түлхэгч уусгагч болгон ашигласан. Баганыг 10 минутын турш 100 MP, 15 минутын турш 80 MP, 30 минутын турш 60 MP даралтыг дараалан хийж дүүргэнэ. Савлах явцад багана жигд савлагдахыг хангахын тулд хоёр GC багана сэгсрэгч (Alltech, Deerfield, IL, USA) ашиглан механик чичиргээг хэрэглэсэн. Баганын дотор ямар нэгэн гэмтэл гарахаас сэргийлж зутан савлагчийг хааж, даралтыг аажмаар суллана. Баганыг зутан савлах нэгжээс салгаж, өөр холбох хэрэгслийг оролт болон LC системд холбоно. түүний гүйцэтгэлийг шалгахын тулд.
LC насос (10AD Shimadzu, Япон), 50nL шахах гогцоотой форсунк (Valco (USA) C14 W.05), мембраны хийгүйжүүлэгч (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS хялгасан судасны цонхыг угсарсан. Тусгай µLC төхөөрөмжийн илрүүлэгч (UV-2075) болон шилэн доторлогоотой бичил багана. Нэмэлт баганын зурвасын тэлэлтийн нөлөөллийг багасгахын тулд маш нарийн, богино холболтын хоолой ашиглана. Савлагааны дараа бууруулагч холболтын 1/16 инчийн гаралтын хэсэгт хялгасан судаснууд (50 μm id 365 болон бууруулагч холболтын хялгасан судаснууд (50 μm) суурилуулсан. Өгөгдөл цуглуулах, хроматографийн боловсруулалтыг Multichro 2000 програм хангамж ашиглан хийсэн. 254 нм-ийн хяналтыг аналитууд дээр хэт ягаан туяаны шингээлтийг шалгасан. Хроматографийн өгөгдлийг OriginPro8 (Нортгемптон, MA) ашиглан шинжилсэн.
Хүний сийвэнгийн альбумин, лиофилжүүлсэн нунтаг, ≥ 96% (агарозын гель электрофорез) 3 мг-ийг трипсин (1.5 мг), 4.0 М мочевин (1 мл), 0.2 М аммонийн бикарбонат (1 мл)-тэй хольсон. Уусмалыг 10 минут хутгаж, 37°C-д 6 цагийн турш усан ваннд байлгаад, дараа нь 1 мл 0.1% TFA-аар унтраасан. Уусмалыг шүүж, 4°C-аас доош температурт хадгална.
Пептидийн холимог болон HSA трипсиний задралыг PMP баганад тусад нь үнэлсэн. PMP баганаар HSA-ийн пептидийн холимог болон трипсиний задралыг ялгаж байгааг шалгаж, үр дүнг Ascentis Express RP-Amide баганатай харьцуулна уу. Онолын хавтангийн дугаарыг дараах байдлаар тооцоолно:
Нүцгэн цахиурын хэсгүүд болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн SEM зургийг Зураг 2-т үзүүлэв. Нүцгэн цахиурын хэсгүүдийн SEM зургууд (A, B) нь бидний өмнөх судалгаануудаас ялгаатай нь эдгээр хэсгүүд нь бөмбөрцөг хэлбэртэй бөгөөд хэсгүүд нь сунасан эсвэл жигд бус тэгш хэмтэй болохыг харуулж байна. Лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн (C, D) гадаргуу нь нүцгэн цахиурын хэсгүүдийнхээс илүү гөлгөр бөгөөд энэ нь цахиурын хэсгүүдийн гадаргуу дээр полистирол гинжний бүрхүүл үүссэнтэй холбоотой байж болох юм.
Нүцгэн цахиурын хэсгүүд (A, B) болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн (C, D) электрон микроскопоор авсан зургийг сканнердах.
Нүцгэн цахиурын хэсгүүд болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн ширхэгийн хэмжээний тархалтыг Зураг 3(A)-д үзүүлэв. Эзэлхүүн дээр суурилсан ширхэгийн хэмжээний тархалтын муруй нь химийн өөрчлөлтийн дараа цахиурын хэсгүүдийн хэмжээ нэмэгдсэн болохыг харуулсан (Зураг 3A). Одоогийн судалгаа болон өмнөх судалгааны цахиурын хэсгүүдийн ширхэгийн хэмжээний тархалтын өгөгдлийг Хүснэгт 1(A)-д харьцуулсан болно. PMP-ийн эзэлхүүн дээр суурилсан ширхэгийн хэмжээ, d(0.5) нь бидний өмнөх судалгаатай харьцуулахад 3.36 μм бөгөөд ad(0.5) утга нь 3.05 μм (полистиролтой холбогдсон цахиурын хэсгүүд)34 байсан. Урвалын холимог дахь PEG, мочевин, TMOS, цууны хүчлийн харьцаа харилцан адилгүй байгаагаас шалтгаалан энэ багц нь бидний өмнөх судалгаатай харьцуулахад илүү нарийхан ширхэгийн хэмжээний тархалттай байсан. PMP фазын ширхэгийн хэмжээ нь бидний өмнө нь судалсан полистиролтой холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн фазынхаас арай том байна. Энэ нь цахиурын хэсгүүдийг стиролтой гадаргуугийн функциональчлал нь цахиурын гадаргуу дээр зөвхөн полистирол давхарга (0.97 µм) хуримтлуулсан гэсэн үг юм. давхаргын зузаан нь 1.38 мкм байв.
Нүцгэн цахиурын хэсгүүд болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн ширхэгийн хэмжээний тархалт (A) ба нүх сүвний хэмжээний тархалт (B).
Одоогийн судалгааны цахиурын хэсгүүдийн нүх сүвний хэмжээ, нүх сүвний эзэлхүүн болон гадаргуугийн талбайг Хүснэгт 1(B)-д үзүүлэв. Нүцгэн цахиурын хэсгүүд болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн PSD профайлыг Зураг 3(B)-д үзүүлэв. Үр дүнг бидний өмнөх судалгаатай харьцуулж болно. Нүцгэн болон лигандтай холбогдсон цахиурын хэсгүүдийн нүх сүвний хэмжээ тус тус 310 ба 241 байгаа нь Хүснэгт 1(B)-д үзүүлсэнчлэн химийн өөрчлөлтийн дараа нүх сүвний хэмжээ 69-өөр буурч байгааг харуулж байгаа бөгөөд муруйн өөрчлөлтийг Зураг 3(B)-д үзүүлэв. Үүнтэй адилаар химийн өөрчлөлтийн дараа цахиурын хэсгүүдийн нүх сүвний хэмжээ 0.67-аас 0.58 см3/г болж буурсан. Одоогоор судлагдаж буй цахиурын хэсгүүдийн гадаргуугийн талбай нь 116 м2/г бөгөөд энэ нь бидний өмнөх судалгаатай (124 м2/г) харьцуулж болно. Хүснэгт 1(B)-д үзүүлсэнчлэн цахиурын хэсгүүдийн гадаргуугийн талбай (м2/г) мөн 116 м2/г-аас 105 болж буурсан. химийн өөрчлөлтийн дараах м2/г.
Хөдөлгөөнгүй фазын элементийн шинжилгээний үр дүнг Хүснэгт 2-т үзүүлэв. Одоогийн хөдөлгөөнгүй фазын нүүрстөрөгчийн ачаалал 6.35% байгаа нь бидний өмнөх судалгааны нүүрстөрөгчийн ачааллаас (полистирол холбогдсон цахиурын хэсгүүд тус тус 7.93%35 ба 10.21%) бага байна. 42. Одоогийн хөдөлгөөнгүй фазын нүүрстөрөгчийн ачаалал бага байна. Учир нь одоогийн SP-г бэлтгэхэд стиролоос гадна фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP) болон 4-гидрокси-TEMPO зэрэг зарим туйлын лигандуудыг ашигласан. Одоогийн хөдөлгөөнгүй фазын азотын жингийн хувь нь өмнөх судалгаануудад тус тус 0.1735 ба 0.85% азотын жингийн хувьтай харьцуулахад 2.21% байна. Энэ нь фенилмалеимидээс шалтгаалан одоогийн хөдөлгөөнгүй фазад азотын жингийн хувь өндөр байна гэсэн үг юм. Үүнтэй адилаар (4) ба (5) бүтээгдэхүүний нүүрстөрөгчийн ачаалал тус тус 2.7% ба 2.9% байсан бол эцсийн бүтээгдэхүүний нүүрстөрөгчийн ачаалал (6) нь Хүснэгт 2-т үзүүлсэн шиг 6.35% байв. Жингийн алдагдлыг PMP хөдөлгөөнгүй фазаар шалгасан бөгөөд TGA муруйг Зураг 4-т үзүүлэв. TGA муруй нь 8.6% жингийн алдагдлыг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь нүүрстөрөгчийн ачаалалтай (6.35%) сайн тохирч байна, учир нь лигандууд нь зөвхөн C төдийгүй N, O, H агуулдаг.
Фенилмалеимид-метилвинилизоцианатын лиганд нь цахиурын хэсгүүдийн гадаргуугийн өөрчлөлтөд сонгосон, учир нь энэ нь туйлын фенилмалеимид бүлэг ба винилизоцианатын бүлэгтэй байдаг. Винил изоцианатын бүлгүүд нь амьд радикал полимержилтээр стиролтой цаашид урвалд орж болно. Хоёр дахь шалтгаан нь аналиттай дунд зэргийн харилцан үйлчлэлцдэг, аналит ба хөдөлгөөнгүй фазын хооронд хүчтэй электростатик харилцан үйлчлэлцдэггүй бүлгийг оруулах явдал юм, учир нь фенилмалеимид хэсэг нь хэвийн рН-д виртуал цэнэггүй байдаг. Хөдөлгөөнгүй фазын туйлшралыг стиролын оновчтой хэмжээ болон чөлөөт радикал полимержилтийн урвалын хугацаагаар хянаж болно. Урвалын сүүлийн алхам (чөлөөт радикал полимержилт) нь чухал бөгөөд хөдөлгөөнгүй фазын туйлшралыг өөрчилж болно. Эдгээр хөдөлгөөнгүй фазын нүүрстөрөгчийн ачааллыг шалгахын тулд элементийн шинжилгээ хийсэн. Стиролын хэмжээ болон урвалын хугацааг нэмэгдүүлэх нь хөдөлгөөнгүй фазын нүүрстөрөгчийн ачааллыг нэмэгдүүлж, эсрэгээр нь нэмэгдүүлснийг ажигласан. Стиролын өөр өөр концентрацитай бэлтгэсэн SP нь өөр өөр нүүрстөрөгчийн ачаалалтай байдаг. Дахин хэлэхэд эдгээр хөдөлгөөнгүй фазуудыг зэвэрдэггүй ган багана руу ачаалж, тэдгээрийг шалгана уу. Хроматографийн гүйцэтгэл (сонголт, нягтрал, N утга гэх мэт). Эдгээр туршилтууд дээр үндэслэн хяналттай туйлшрал болон аналитийн сайн хадгалалтыг хангахын тулд PMP-ийн хөдөлгөөнгүй фазыг бэлтгэх оновчтой найрлагыг сонгосон.
Таван пептидийн холимог (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин)-ийг мөн хөдөлгөөнт фаз ашиглан PMP баганаар үнэлсэн; 80 мкл/мин урсгалын хурдтай 60/40 (v/v) ацетонитрил/ус (0.1% TFA). Хамгийн оновчтой элюцийн нөхцөлд багана тус бүрийн онолын хавтангийн тоо (N) (100 × 1.8 мм id) нь 20,000 ± 100 (200,000 хавтан/м²) байна. Хүснэгт 3-т гурван PMP баганын N утгыг өгсөн бөгөөд хроматограммыг Зураг 5А-д үзүүлэв. Өндөр урсгалын хурдтай (700 мкл/мин) PMP багана дээр хурдан шинжилгээ хийж, нэг минутын дотор таван пептидийг элюцидсэн, N утга маш сайн байсан, багана тус бүрт 13,500 ± 330 (100 × 1.8 мм id), 135,000 хавтан/м2-тэй тохирч байна (Зураг 5B). Ижил хэмжээтэй гурван баганыг (100 × 1.8 мм id) шалгахын тулд гурван өөр багц PMP суурин фазаар дүүргэсэн. давтагдах чадвар. Багана бүрийн аналитын концентрацийг оновчтой элюцийн нөхцөл, онолын хавтангийн тоо N болон хадгалах хугацааг ашиглан багана бүр дээр ижил туршилтын хольцыг ялгаж тэмдэглэсэн. PMP баганын давтагдах чадварыг Хүснэгт 4-т үзүүлэв. PMP баганын давтагдах чадвар нь Хүснэгт 3-т үзүүлсэн шиг маш бага %RSD утгатай сайн хамааралтай байна.
PMP багана (B) болон Ascentis Express RP-Amide багана (A) дээрх пептидийн хольцыг ялгах; хөдөлгөөнт фаз 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP баганын хэмжээс (100 × 1.8 мм id); аналитик Нэгдлүүдийн элюцийн дараалал: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) болон 5 (лейциний) хүчил энкефалин)).
Өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографид хүний ​​сийвэнгийн альбумины триптик задралыг ялгах зорилгоор PMP баганыг (100 × 1.8 мм id) үнэлсэн. Зураг 6-д үзүүлсэн хроматограмм нь дээжийг сайн ялгасан бөгөөд нягтрал нь маш сайн болохыг харуулж байна. HSA задралыг 100 мкл/мин урсгалын хурд, хөдөлгөөнт фазын 70/30 ацетонитрил/ус болон 0.1% TFA ашиглан шинжилсэн. Хроматограммд үзүүлсэнчлэн (Зураг 6) HSA задралыг 17 пептидтэй харгалзах 17 оргилд хуваасан. HSA задралын оргил бүрийн ялгах үр ашгийг тооцоолж, утгыг Хүснэгт 5-д үзүүлэв.
HSA-ийн триптик дайжест (100 × 1.8 мм хэмжээтэй)-ийг PMP баганад ялгасан; урсгалын хурд (100 µл/мин), хөдөлгөөнт фазын 60/40 ацетонитрил/ус, 0.1% TFA-тай.
энд L нь баганын урт, η нь хөдөлгөөнт фазын зуурамтгай чанар, ΔP нь баганын буцах даралт, u нь хөдөлгөөнт фазын шугаман хурд юм. PMP баганын нэвчилт нь 2.5 × 10-14 м2, урсгалын хурд 25 мкл/мин, 60/40 v/v ACN/ус ашигласан. PMP баганын нэвчилт нь (100 × 1.8 мм id) бидний өмнөх судалгааны лавлагаа 34-тэй төстэй байв. Өнгөц сүвэрхэг хэсгүүдээр дүүргэсэн баганын нэвчилт нь: 1.3 мкм хэсгүүдийн хувьд 1.7 × 10-15, 1.7 мкм хэсгүүдийн хувьд 3.1 × 10-15, 5.2 × 10-15 болон 2.6 мкм хэсгүүдийн хувьд 2.5 × 10-14 м2 байна. 5 мкм хэсгүүдийн хувьд 43. Тиймээс PMP фазын нэвчилт нь 5 мкм цөм бүрхүүлийн нэвчилттэй төстэй байна. бөөмс.
энд Wx нь хлороформоор дүүргэсэн баганын жин, Wy нь метанолоор дүүргэсэн баганын жин, ρ нь уусгагчийн нягтрал юм. Метанол (ρ = 0.7866) ба хлороформ (ρ = 1.484)-ийн нягтрал. Бидний өмнө нь судалсан СИЛИКА БӨЛӨГЧҮҮД-C18 багана (100 × 1.8 мм id) 34 ба C18-Мочевин багана 31-ийн нийт сүвэрхэг чанар нь тус тус 0.63 ба 0.55 байв. Энэ нь мочевин лиганд байгаа нь хөдөлгөөнгүй фазын нэвчилтийг бууруулдаг гэсэн үг юм. Нөгөөтэйгүүр, PMP баганын нийт сүвэрхэг чанар (100 × 1.8 мм id) нь 0.60 байна. PMP баганын нэвчилт нь C18-холбогдсон цахиурын хэсгүүдээр дүүргэсэн баганаас бага байдаг, учир нь C18 төрлийн хөдөлгөөнгүй фазуудад C18 лигандууд нь цахиурын хэсгүүдэд шугаман гинж хэлбэрээр холбогдсон байдаг бол полистирол төрлийн хөдөлгөөнгүй фазуудад A харьцангуй зузаантай байдаг. түүний эргэн тойронд полимер давхарга үүсдэг. Ердийн туршилтанд баганын сүвэрхэг чанарыг дараах байдлаар тооцоолно.
Зураг 7A, B-д ван Деемтерийн графикийн ижил элюцийн нөхцөл (жишээ нь, 60/40 ACN/H2O ба 0.1% TFA) ашиглан PMP багана (100 × 1.8 мм id) болон Ascentis Express RP-Amide баганыг (100 × 1.8 мм id) харуулав. Сонгосон пептидийн холимог (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin)-ийг 20 µL/-д бэлтгэсэн. Хоёр баганын хамгийн бага урсгалын хурд нь 800 µL/мин байна. PMP багана болон Ascentis Express RP-Amide баганын хамгийн оновчтой урсгалын хурд (80 µL/мин) дээрх HETP-ийн хамгийн бага утга нь тус тус 2.6 µm ба 3.9 µm байв. HETP-ийн утга нь PMP баганын (100 × 1.8 мм id) ялгах үр ашиг нь худалдаанд байгаа Ascentis Express RP-Amide баганаас (100 × 1.8 мм id) хамаагүй дээр байгааг харуулж байна. Зураг 7(A)-д үзүүлсэн ван Деемтерийн график нь өмнөх судалгаатай харьцуулахад урсгал нэмэгдэхийн хэрээр N утга буурах нь ач холбогдолгүй болохыг харуулж байна. PMP баганын (100 ×) ялгах үр ашиг өндөр байгаа нь Ascentis Express RP-Amide баганатай харьцуулахад 1.8 мм id) нь одоогийн ажилд ашигласан бөөмсийн хэлбэр, хэмжээ, баганын савлах нарийн төвөгтэй журмын сайжруулалтад үндэслэсэн болно34.
(A) 0.1% TFA бүхий 60/40 ACN/H2O дахь PMP багана (100 × 1.8 мм id) ашиглан олж авсан ван Деемтерийн график (HETP ба хөдөлгөөнт фазын шугаман хурд).(B) 0.1% TFA бүхий 60/40 ACN/H2O дахь Ascentis Express RP-Amide багана (100 × 1.8 мм id) ашиглан олж авсан ван Деемтерийн график (HETP ба хөдөлгөөнт фазын шугаман хурд).
Өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографид хүний ​​сийвэнгийн альбумин (HAS)-ийн синтетик пептидийн холимог болон трипсиний задралыг ялгахад туйлшралтай полистирол суурьтай фазыг бэлтгэж, үнэлсэн. Пептидийн холимогт зориулсан PMP баганын хроматографийн гүйцэтгэл нь ялгах үр ашиг, нягтралын хувьд маш сайн. PMP баганын ялгах гүйцэтгэл сайжирсан нь цахиурын хэсгүүдийн хэмжээ болон нүх сүвний хэмжээ, хөдөлгөөнгүй фазын хяналттай синтез, баганын нарийн төвөгтэй савлагаа зэрэг олон шалтгаантай холбоотой юм. Өндөр ялгах үр ашгаас гадна өндөр урсгалын хурдтай үед бага баганын арын даралт нь энэхүү хөдөлгөөнгүй фазын бас нэг давуу тал юм. PMP баганууд нь сайн давтагдах чадварыг харуулдаг бөгөөд янз бүрийн уургийн пептидийн холимог болон трипсиний задралыг шинжлэхэд ашиглаж болно. Бид энэ баганыг шингэн хроматографид байгалийн гаралтай бүтээгдэхүүн, эмийн ургамлын био идэвхт нэгдлүүд болон мөөгөнцрийн хандыг ялгахад ашиглахаар төлөвлөж байна. Ирээдүйд PMP багануудыг уураг болон моноклональ эсрэгбиеийг ялгахад үнэлэх болно.
Филд, Ж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Ж., Тогерсен, Х. & Петерссон, П. Урвуу фазын хроматографийн аргаар пептид ялгах системийн судалгаа I хэсэг: Баганын шинж чанарын протокол боловсруулах. Хроматографийн сэтгүүл. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомез, Б. нар. Халдварт өвчнийг эмчлэхэд зориулагдсан сайжруулсан идэвхтэй пептидүүд. Биотехнологи. Дэвшилтэт.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинез, Ж. & Хрестчатиский, М. Синтетик эмчилгээний пептидүүд: шинжлэх ухаан ба зах зээл. эмийн нээлт.15 (1-2) өнөөдөр, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Сие, Ф., Смит, РД & Шен, Ю. Дэвшилтэт протеомик шингэний хроматографи. Хроматографи сэтгүүл. А 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Дэвшилтэт шингэн хроматографи-массын спектрометр нь өргөн хүрээтэй чиглэсэн метаболомик ба протеомикийг нэгтгэх боломжийг олгодог. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, СМ & Салисбери, ЖЖ Эмийн хөгжилд UHPLC-ийн үүрэг. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. & Клаусен, AM Хурдан ялгах зориулалттай хэт өндөр даралтын шингэн хроматографийн үндсэн ба практик талууд. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. & Челитчефф, П. Эмийн хөгжилд хэт өндөр хүчин чадалтай шингэн хроматографийн хэрэглээ. Хроматографи сэтгүүл. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. нар. Энтеровирусыг үр дүнтэй цэвэршүүлэх зориулалттай усан дахь тосны өндөр дотоод фазын эмульсээс бэлтгэсэн цул макро нүх сүвтэй гидрогель. Химийн. Британи. J. 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. & Вилкинс, Ж.А. Протеомик дахь шингэний хроматографийн үүрэг. Хроматографийн сэтгүүл. А 1053(1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вейтей, Ж.-Л. & Гуилларме, Д. Эмчилгээний пептид ба уургийг урвуу фазын шингэн хроматографийн аргаар ялгах шинээр гарч ирж буй чиг хандлага: онол ба хэрэглээ. Эмийн сан. Биоанагаахын шинжлэх ухаан. анус.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дэйли, А.Э. & Геблер, Ж.К. Эхний болон хоёр дахь тусгаарлах хэмжээсүүдэд өөр өөр рН утгыг ашиглан RP-RP-HPLC системийг ашиглан пептидийг хоёр хэмжээст ялгах. Ж. 9-р сар. Шинжлэх ухаан.28(14), 1694-1703 (2005).
Фелетти, С. нар. C18 дэд-2 μм бүрэн болон өнгөц нүх сүвтэй хэсгүүдээр дүүргэсэн өндөр үр ашигтай хроматографийн баганын массын дамжуулалтын шинж чанар ба кинетик гүйцэтгэлийг судалсан. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Пиовесана, С. нар. Ургамлын биологийн идэвхт пептидийг ялгах, тодорхойлох, баталгаажуулах чиглэлээрх сүүлийн үеийн чиг хандлага ба аналитик бэрхшээлүүд.анус.биологийн анус.Химийн.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, ЖБ нар. Амьдралын хаант улсын протеомын ландшафт. Байгаль 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
ДеЛука, К. нар. Эмчилгээний пептидийг бэлдмэлийн шингэн хроматографийн аргаар боловсруулах. Молекул (Базель, Швейцарь) 26(15), 4688(2021).
Ян, Ю. & Гэн, Х. Холимог горимын хроматографи ба түүний биополимерт хэрэглэх нь. Хроматографийн сэтгүүл. А 1218(49), 8813–8825 (2011).
Жао, Г., Донг, Х.-Й.& Сун, Й. Холимог горимын уургийн хроматографийн лигандууд: зарчим, шинж чанар, дизайн. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).