ขอขอบคุณที่เยี่ยมชม Nature.com เวอร์ชันเบราว์เซอร์ที่คุณใช้มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์ที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์ที่อัปเดตแล้ว (หรือปิดโหมดการทำงานร่วมกันใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่ามีการรองรับอย่างต่อเนื่อง เราจะแสดงไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
อนุภาคซิลิกาที่มีรูพรุนถูกเตรียมโดยวิธีโซลเจลโดยมีการปรับเปลี่ยนบางอย่างเพื่อให้ได้อนุภาคที่มีรูพรุนขนาดใหญ่ อนุภาคเหล่านี้ถูกทำให้เป็นอนุพันธ์โดยการถ่ายโอนโซ่การแตกตัวแบบเติมกลับได้ (RAFT) ด้วยพอลิเมอไรเซชัน N-ฟีนิลมาเลอิไมด์-เมทิลไวนิลไอโซไซยาเนต (PMI) และสไตรีนเพื่อเตรียมการแทรกซึม N-ฟีนิลมาเลอิไมด์ของโพลีสไตรีน (PMP) เฟสคงที่ คอลัมน์สแตนเลสขนาดรูแคบ (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) ถูกบรรจุด้วยการบรรจุแบบสลารี การประเมินการแยกคอลัมน์ PMP ของส่วนผสมเปปไทด์ที่ประกอบด้วยเปปไทด์ 5 ชนิด (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) ประสิทธิภาพทางโครมาโตกราฟี) และการย่อยด้วยทริปซินของอัลบูมินในซีรัมของมนุษย์ (HAS) ภายใต้สภาวะการชะที่เหมาะสมที่สุด การนับจำนวนแผ่นตามทฤษฎีของส่วนผสมเปปไทด์คือ สูงถึง 280,000 แผ่น/ตร.ม. เมื่อเปรียบเทียบประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ที่พัฒนาขึ้นกับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide เชิงพาณิชย์ พบว่าประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP เหนือกว่าคอลัมน์เชิงพาณิชย์ในแง่ของประสิทธิภาพการแยกและความละเอียด
ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา อุตสาหกรรมชีวเภสัชกรรมได้กลายเป็นตลาดโลกที่ขยายตัวโดยมีส่วนแบ่งการตลาดเพิ่มขึ้นอย่างมาก ด้วยการเติบโตอย่างรวดเร็วของอุตสาหกรรมชีวเภสัชกรรม1,2,3 การวิเคราะห์เปปไทด์และโปรตีนจึงเป็นที่ต้องการอย่างมาก นอกจากเปปไทด์เป้าหมายแล้ว ยังมีสิ่งเจือปนหลายชนิดที่เกิดขึ้นระหว่างการสังเคราะห์เปปไทด์ ดังนั้นจึงต้องทำการทำให้บริสุทธิ์ด้วยโครมาโทกราฟีเพื่อให้ได้เปปไทด์ที่มีความบริสุทธิ์ตามต้องการ การวิเคราะห์และจำแนกลักษณะโปรตีนในของเหลวในร่างกาย เนื้อเยื่อ และเซลล์เป็นงานที่ท้าทายอย่างยิ่งเนื่องจากมีสปีชีส์ที่อาจตรวจพบได้จำนวนมากในตัวอย่างเดียว แม้ว่าการสเปกโตรมิเตอร์มวลจะเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการจัดลำดับเปปไทด์และโปรตีน แต่หากฉีดตัวอย่างเหล่านี้เข้าไปในเครื่องสเปกโตรมิเตอร์มวลในครั้งเดียว การแยกจะไม่เหมาะสม ปัญหานี้สามารถบรรเทาลงได้โดยการใช้การแยกด้วยโครมาโทกราฟีของเหลว (LC) ก่อนการวิเคราะห์ MS ซึ่งจะลดจำนวนสารวิเคราะห์ที่เข้าสู่เครื่องสเปกโตรมิเตอร์มวลในเวลาที่กำหนด4,5,6 นอกจากนี้ ในระหว่างการแยกเฟสของเหลว สารวิเคราะห์ยังสามารถ ให้เน้นในบริเวณที่แคบ จึงทำให้สารวิเคราะห์เหล่านี้มีความเข้มข้นมากขึ้นและปรับปรุงความไวในการตรวจจับ MS โครมาโทกราฟีของเหลว (LC) มีความก้าวหน้าอย่างมากในช่วงทศวรรษที่ผ่านมา และได้กลายเป็นเทคนิคยอดนิยมในการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์7,8,9,10
โครมาโทกราฟีของเหลวแบบเฟสย้อนกลับ (RP-LC) ใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการทำให้บริสุทธิ์และแยกส่วนผสมของเปปไทด์โดยใช้ซิลิกาที่ดัดแปลงด้วยออกตาเดซิล (ODS) เป็นเฟสคงที่11,12,13 อย่างไรก็ตาม เฟสคงที่ของ RP ไม่สามารถแยกเปปไทด์และโปรตีนได้อย่างน่าพอใจเนื่องจากโครงสร้างที่ซับซ้อนและลักษณะแอมฟิฟิลิก14,15 ดังนั้น จำเป็นต้องมีเฟสคงที่ที่ออกแบบมาเป็นพิเศษเพื่อวิเคราะห์เปปไทด์และโปรตีนที่มีกลุ่มที่มีขั้วและไม่มีขั้วเพื่อโต้ตอบและรักษาสารวิเคราะห์เหล่านี้16 โครมาโทกราฟีแบบโหมดผสม ซึ่งให้ปฏิสัมพันธ์หลายโหมด สามารถเป็นทางเลือกแทน RP-LC สำหรับการแยกเปปไทด์ โปรตีน และส่วนผสมที่ซับซ้อนอื่นๆ ได้ เฟสคงที่แบบโหมดผสมหลายตัวได้รับการเตรียมไว้ และคอลัมน์ที่บรรจุด้วยเฟสเหล่านี้ถูกนำมาใช้เพื่อแยกเปปไทด์และโปรตีน17,18,19,20,21 เฟสคงที่แบบโหมดผสม (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, การแทรกสอดแบบโพลาไรซ์/RPLC) เหมาะสำหรับการแยกเปปไทด์และโปรตีนเนื่องจากมีทั้งกลุ่มที่มีโพลาไรซ์และไม่มีโพลาไรซ์22,23,24,25,26,27,28 ในทำนองเดียวกัน เฟสคงที่ที่มีการแทรกสอดแบบโพลาไรซ์ที่มีกลุ่มโพลาไรซ์ที่มีพันธะโควาเลนต์แสดงให้เห็นถึงพลังการแยกที่ดีและการคัดเลือกเฉพาะสำหรับสารวิเคราะห์แบบโพลาไรซ์และไม่มีโพลาไรซ์ เนื่องจากการแยกขึ้นอยู่กับปฏิสัมพันธ์ระหว่างสารวิเคราะห์และเฟสคงที่ ปฏิสัมพันธ์หลายโหมด 29, 30, 31, 32 เมื่อไม่นานมานี้ Zhang et al. 30 เตรียมเฟสคงที่ของโพลีเอมีนที่สิ้นสุดด้วยโดเดซิลและแยกไฮโดรคาร์บอน สารต้านอาการซึมเศร้า ฟลาโวนอยด์ นิวคลีโอไซด์ เอสโตรเจน และสารวิเคราะห์อื่นๆ ได้สำเร็จหลายรายการ อินเทอร์คาเลเตอร์แบบโพลาร์มีทั้งกลุ่มแบบโพลาร์และไม่มีโพลาร์ จึงใช้แยกเปปไทด์และโปรตีนที่มีทั้งกลุ่มที่ชอบน้ำและไม่ชอบน้ำได้ คอลัมน์แบบฝังแบบโพลาร์ (เช่น คอลัมน์ C18 ที่ฝังอะไมด์) มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ภายใต้ชื่อทางการค้าว่าคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide แต่คอลัมน์เหล่านี้ใช้สำหรับวิเคราะห์อะไมด์ 33 เท่านั้น
ในการศึกษาปัจจุบัน เฟสคงที่ฝังโพลาไรซ์ (โพลิสไตรีนฝัง N-ฟีนิลมาเลอิมายด์) ได้รับการเตรียมและประเมินผลสำหรับการแยกเปปไทด์และทริปซินย่อยของ HSA เฟสคงที่ถูกเตรียมโดยใช้กลยุทธ์ดังต่อไปนี้ อนุภาคซิลิกาที่มีรูพรุนถูกเตรียมตามขั้นตอนที่กำหนดไว้ในเอกสารเผยแพร่ครั้งก่อนของเรา โดยมีการดัดแปลงโปรโตคอลการเตรียมบางส่วน อัตราส่วนของยูเรีย โพลีเอทิลีนไกลคอล (PEG) TMOS กรดอะซิติกของน้ำถูกปรับเพื่อเตรียมอนุภาคซิลิกาที่มีขนาดรูพรุนขนาดใหญ่ ประการที่สอง ลิแกนด์ใหม่ ฟีนิลมาเลอิมายด์-เมทิลไวนิลไอโซไซยาเนต ถูกสังเคราะห์และใช้ในการสร้างอนุพันธ์ของอนุภาคซิลิกาเพื่อเตรียมเฟสคงที่ฝังโพลาไรซ์ เฟสคงที่ที่ได้จะถูกบรรจุลงในคอลัมน์สแตนเลส (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) โดยใช้รูปแบบการบรรจุที่เหมาะสมที่สุด การบรรจุคอลัมน์ได้รับความช่วยเหลือจากการสั่นสะเทือนทางกลเพื่อให้แน่ใจว่ามีการสร้างชั้นที่เป็นเนื้อเดียวกันภายในคอลัมน์ ประเมินการแยกคอลัมน์ที่บรรจุของส่วนผสมเปปไทด์ที่ประกอบด้วยห้า เปปไทด์ (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) และทริปซินที่ย่อยจากอัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ (HAS) พบว่าส่วนผสมเปปไทด์และทริปซินที่ย่อยจาก HSA แยกออกจากกันด้วยความละเอียดและมีประสิทธิภาพที่ดี ประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP ถูกนำไปเปรียบเทียบกับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide พบว่าทั้งเปปไทด์และโปรตีนสามารถแยกออกได้ดีและมีประสิทธิภาพบนคอลัมน์ PMP ซึ่งมีประสิทธิภาพมากกว่าคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide
PEG (โพลีเอทิลีนไกลคอล) ยูเรีย กรดอะซิติก ไตรเมทอกซีออร์โธซิลิเกต (TMOS) ไตรเมทิลคลอโรซิเลน (TMCS) ทริปซิน อัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ (HSA) แอมโมเนียมคลอไรด์ ยูเรีย เฮกเซนเมทิลไดซิลาเซน (HMDS) เมทาไครลอยล์คลอไรด์ (MC) สไตรีน 4-ไฮดรอกซี-TEMPO เบนโซอิลเปอร์ออกไซด์ (BPO) อะซีโตไนไตรล์เกรด HPLC (ACN) เมทานอล 2-โพรพานอล และอะซิโตน ซื้อจาก Sigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์ รัฐมิสซูรี สหรัฐอเมริกา)
ผสมยูเรีย (8 กรัม) โพลีเอทิลีนไกลคอล (8 กรัม) และกรดอะซิติก 0.01 N ปริมาณ 8 มิลลิลิตร เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นเติม TMOS 24 มิลลิลิตรลงไปภายใต้สภาวะที่เย็นจัด ผสมปฏิกิริยาให้ความร้อนที่อุณหภูมิ 40 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 6 ชั่วโมง จากนั้นที่อุณหภูมิ 120 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 8 ชั่วโมงในหม้ออัดไอน้ำสแตนเลส เทน้ำออก และทำให้วัสดุที่เหลือแห้งที่อุณหภูมิ 70 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 12 ชั่วโมง บดมวลอ่อนที่แห้งให้เรียบในเตาอบและเผาที่อุณหภูมิ 550 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 12 ชั่วโมง เตรียม 3 ชุดและกำหนดลักษณะเพื่อตรวจสอบความสามารถในการผลิตซ้ำในขนาดอนุภาค ขนาดรูพรุน และพื้นที่ผิว
โดยการดัดแปลงพื้นผิวของอนุภาคซิลิกาด้วยลิแกนด์ฟีนิลมาเลอิมายด์-เมทิลไวนิลไอโซไซยาเนต (PCMP) ที่สังเคราะห์ไว้ล่วงหน้า ตามด้วยการเกิดพอลิเมอไรเซชันแบบรัศมีด้วยสไตรีน จึงสามารถเตรียมสารประกอบที่มีหมู่โพลาร์ได้ เฟสคงที่สำหรับมวลรวมและโซ่โพลีสไตรีน กระบวนการเตรียมอธิบายไว้ด้านล่าง
N-phenylmaleimide (200 มก.) และเมทิลไวนิลไอโซไซยาเนต (100 มก.) ถูกละลายในโทลูอีนแห้ง และเติม 2,2'-azoisobutyronitrile (AIBN) 0.1 มล. ลงในขวดปฏิกิริยาเพื่อเตรียมโคพอลิเมอร์ฟีนิลมาเลอิไมด์-เมทิลไวนิลไอโซไซยาเนต (PMCP) ส่วนผสมถูกให้ความร้อนที่ 60°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง กรองและทำให้แห้งในเตาอบที่ 40°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง
อนุภาคซิลิกาแห้ง (2 กรัม) ถูกกระจายในโทลูอีนแห้ง (100 มล.) คนและโซนิเคตในขวดก้นกลมขนาด 500 มล. เป็นเวลา 10 นาที PMCP (10 มก.) ถูกละลายในโทลูอีนและหยดลงในขวดปฏิกิริยาโดยผ่านกรวยหยด ส่วนผสมถูกทำให้ไหลย้อนที่อุณหภูมิ 100°C เป็นเวลา 8 ชั่วโมง กรองและล้างด้วยอะซิโตน แล้วทำให้แห้งที่อุณหภูมิ 60°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง จากนั้น อนุภาคซิลิกาที่มีพันธะกับ PMCP (100 กรัม) ถูกละลายในโทลูอีน (200 มล.) และเติม 4-hydroxy-TEMPO (2 มล.) ลงในสารที่มีไดบิวทิลทินไดลอเรต 100 µL เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา ส่วนผสมถูกคนที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 8 ชั่วโมง กรองและทำให้แห้งที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง
สไตรีน (1 มล.) เบนโซอิลเปอร์ออกไซด์ BPO (0.5 มล.) และอนุภาคซิลิกาที่ติดกับ TEMPO-PMCP (1.5 กรัม) ถูกกระจายในโทลูอีนและไล่ด้วยไนโตรเจน การเกิดพอลิเมอไรเซชันของสไตรีนถูกดำเนินการที่อุณหภูมิ 100°C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง ผลิตภัณฑ์ที่ได้ถูกล้างด้วยเมทานอลและทำให้แห้งที่ 60°C ข้ามคืน แผนผังปฏิกิริยาโดยรวมแสดงอยู่ในรูปที่ 1
ตัวอย่างถูกทำให้หมดแก๊สที่อุณหภูมิ 393 K เป็นเวลา 1 ชั่วโมง เพื่อให้ได้ความดันตกค้างน้อยกว่า 10-3 Torr ใช้ปริมาณ N2 ที่ดูดซับที่ความดันสัมพันธ์ P/P0 = 0.99 เพื่อกำหนดปริมาตรรูพรุนทั้งหมด ตรวจสอบสัณฐานวิทยาของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะลิแกนด์ด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราด (Hitachi High Technologies, โตเกียว ประเทศญี่ปุ่น) วางตัวอย่างแห้ง (อนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะลิแกนด์) บนคอลัมน์อะลูมิเนียมโดยใช้เทปกาวคาร์บอน ชุบทองบนตัวอย่างโดยใช้เครื่องเคลือบสปัตเตอร์ Q150T และเคลือบชั้น Au ขนาด 5 นาโนเมตรบนตัวอย่าง วิธีนี้ช่วยปรับปรุงประสิทธิภาพกระบวนการโดยใช้แรงดันไฟฟ้าต่ำ และให้การสปัตเตอร์แบบเม็ดละเอียดและแบบเย็น เครื่องวิเคราะห์ธาตุ Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ธาตุ เครื่องวิเคราะห์อนุภาค Mastersizer 2000 จาก Malvern (Worcestershire, UK) เครื่องวิเคราะห์ขนาดถูกนำมาใช้เพื่อหาการกระจายขนาดของอนุภาค อนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะลิแกนด์ (อนุภาคละ 5 มก.) จะถูกกระจายในไอโซโพรพานอล 5 มล. โซนิเคตเป็นเวลา 10 นาที วอร์เท็กซ์เป็นเวลา 5 นาที แล้วนำไปวางบนโต๊ะออปติกของเครื่อง Mastersizer การวิเคราะห์เทอร์โมกราวิเมทริกจะดำเนินการที่อัตรา 5 องศาเซลเซียสต่อนาทีในช่วงอุณหภูมิ 30 ถึง 800 องศาเซลเซียส
เสาเหล็กสเตนเลสเจาะแคบบุกระจกที่มีขนาด (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) ได้รับการบรรจุโดยใช้วิธีการบรรจุแบบสารละลาย โดยใช้ขั้นตอนเดียวกับที่ใช้ในเอกสารอ้างอิง 31. คอลัมน์สแตนเลส (บุด้วยแก้ว เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) พร้อมอุปกรณ์ต่อออกที่มีฟริตขนาด 1 µm ถูกเชื่อมต่อกับแพ็คเกอร์สารละลาย (Alltech Deerfield, IL, USA) เตรียมสารละลายเฟสคงที่โดยแขวนลอยเฟสคงที่ 150 มก. ในเมทานอล 1.2 มล. แล้วส่งไปที่คอลัมน์จัดเก็บ เมทานอลถูกใช้เป็นตัวทำละลายสารละลายเช่นเดียวกับตัวทำละลายขับเคลื่อน เติมคอลัมน์ตามลำดับโดยใช้แรงดัน 100 MP เป็นเวลา 10 นาที 80 MP เป็นเวลา 15 นาที และ 60 MP เป็นเวลา 30 นาที ในระหว่างการบรรจุ มีการใช้การสั่นสะเทือนทางกลด้วยเครื่องเขย่าคอลัมน์ GC สองเครื่อง (Alltech, Deerfield, IL, USA) เพื่อให้แน่ใจว่าคอลัมน์บรรจุได้สม่ำเสมอ ปิดแพ็คเกอร์สารละลายและปล่อยแรงดันอย่างช้าๆ เพื่อป้องกันความเสียหายใดๆ ภายในคอลัมน์ ถอดคอลัมน์ออกจากชุดบรรจุสารละลาย และต่ออุปกรณ์ต่ออีกชิ้นเข้ากับทางเข้า และระบบ LC เพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพการทำงาน
ปั๊ม LC (10AD Shimadzu, ญี่ปุ่น) เครื่องฉีด (Valco (สหรัฐอเมริกา) C14 W.05) พร้อมห่วงฉีด 50nL เครื่องไล่แก๊สเมมเบรน (Shimadzu DGU-14A) หน้าต่างแคปิลลารี UV-VIS ถูกสร้างขึ้น ตัวตรวจจับอุปกรณ์ µLC พิเศษ (UV-2075) และไมโครคอลัมน์ที่บุด้วยแก้ว ใช้ท่อเชื่อมต่อที่แคบและสั้นมากเพื่อลดผลของการขยายแถบคอลัมน์พิเศษ หลังจากบรรจุภัณฑ์แล้ว แคปิลลารี (50 μm id 365 และแคปิลลารีข้อต่อลด (50 μm) ถูกติดตั้งที่ทางออก 1/16″ ของข้อต่อลด การรวบรวมข้อมูลและการประมวลผลโครมาโตกราฟีทำโดยใช้ซอฟต์แวร์ Multichro 2000 การตรวจสอบที่ 254 นาโนเมตร วิเคราะห์สารวิเคราะห์สำหรับการดูดกลืนแสง UV ข้อมูลโครมาโตกราฟีวิเคราะห์โดย OriginPro8 (นอร์แทมป์ตัน รัฐแมสซาชูเซตส์)
อัลบูมินจากซีรั่มของมนุษย์ ผงแห้งเยือกแข็ง ≥ 96% (อิเล็กโทรโฟรีซิสเจลอะกาโรส) 3 มก. ผสมกับทริปซิน (1.5 มก.) ยูเรีย 4.0 M (1 มล.) และแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 0.2 M (1 มล.) คนสารละลายเป็นเวลา 10 นาที แล้วเก็บไว้ในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 6 ชั่วโมง แล้วดับด้วย TFA 0.1% 1 มล. กรองสารละลายและเก็บไว้ที่อุณหภูมิต่ำกว่า 4°C
การแยกส่วนผสมของเปปไทด์และทริปซินไดเจสต์ของ HSA ได้รับการประเมินแยกกันในคอลัมน์ PMP ตรวจสอบการแยกส่วนผสมของเปปไทด์และทริปซินไดเจสต์ของ HSA โดยคอลัมน์ PMP และเปรียบเทียบผลลัพธ์กับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide คำนวณหมายเลขเพลตเชิงทฤษฎีดังนี้:
รูปที่ 2 แสดงภาพ SEM ของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะลิแกนด์ ภาพ SEM ของอนุภาคซิลิกาเปล่า (A, B) แสดงให้เห็นว่า เมื่อเทียบกับการศึกษาครั้งก่อนของเรา อนุภาคเหล่านี้มีรูปร่างเป็นทรงกลม โดยที่อนุภาคมีลักษณะยาวหรือมีความสมมาตรไม่สม่ำเสมอ พื้นผิวของอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะลิแกนด์ (C, D) เรียบเนียนกว่าพื้นผิวของอนุภาคซิลิกาเปล่า ซึ่งอาจเกิดจากการเคลือบของโซ่โพลีสไตรีนบนพื้นผิวของอนุภาคซิลิกา
ภาพกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบส่องกราดของอนุภาคซิลิกาเปล่า (A, B) และอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะลิแกนด์ (C, D)
การกระจายขนาดอนุภาคของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะลิแกนด์แสดงอยู่ในรูปที่ 3(A) เส้นโค้งการกระจายขนาดอนุภาคตามปริมาตรแสดงให้เห็นว่าขนาดของอนุภาคซิลิกาเพิ่มขึ้นหลังจากการดัดแปลงทางเคมี (รูปที่ 3A) ข้อมูลการกระจายขนาดอนุภาคของอนุภาคซิลิกาจากการศึกษาปัจจุบันและการศึกษาครั้งก่อนจะถูกเปรียบเทียบในตารางที่ 1(A) ขนาดอนุภาคตามปริมาตร d(0.5) ของ PMP คือ 3.36 μm เมื่อเปรียบเทียบกับการศึกษาครั้งก่อนของเราที่มีค่า ad(0.5) เท่ากับ 3.05 μm (อนุภาคซิลิกาที่ผูกกับโพลิสไตรีน)34 ชุดนี้มีการกระจายขนาดอนุภาคที่แคบกว่าเมื่อเทียบกับการศึกษาครั้งก่อนของเราเนื่องจากอัตราส่วนที่แตกต่างกันของ PEG ยูเรีย TMOS และกรดอะซิติกในส่วนผสมปฏิกิริยา ขนาดอนุภาคของเฟส PMP ใหญ่กว่าเฟสอนุภาคซิลิกาที่ผูกกับโพลิสไตรีนที่เราศึกษาไว้ก่อนหน้านี้เล็กน้อย ซึ่งหมายความว่าการทำให้ฟังก์ชันพื้นผิวของอนุภาคซิลิกาด้วยสไตรีนเท่านั้น วางชั้นโพลีสไตรีน (0.97 µm) บนพื้นผิวซิลิกา ในขณะที่ในเฟส PMP ความหนาของชั้นอยู่ที่ 1.38 µm
การกระจายขนาดอนุภาค (A) และการกระจายขนาดรูพรุน (B) ของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่ถูกผูกด้วยลิแกนด์
ขนาดรูพรุน ปริมาตรรูพรุน และพื้นที่ผิวของอนุภาคซิลิกาของการศึกษาปัจจุบันแสดงอยู่ในตาราง 1(B) โปรไฟล์ PSD ของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะลิแกนด์แสดงอยู่ในรูปที่ 3(B) ผลลัพธ์นั้นเปรียบเทียบได้กับการศึกษาครั้งก่อนของเรา ขนาดรูพรุนของอนุภาคซิลิกาเปล่าและที่มีพันธะลิแกนด์คือ 310 และ 241 ตามลำดับ ซึ่งบ่งชี้ว่าขนาดรูพรุนลดลง 69% หลังจากการปรับเปลี่ยนทางเคมี ดังที่แสดงในตาราง 1(B) และการเปลี่ยนแปลงของเส้นโค้งแสดงในรูปที่ 3(B) ในทำนองเดียวกัน ปริมาตรรูพรุนของอนุภาคซิลิกาลดลงจาก 0.67 เป็น 0.58 cm3/g หลังจากการปรับเปลี่ยนทางเคมี พื้นที่ผิวจำเพาะของอนุภาคซิลิกาที่ศึกษาปัจจุบันคือ 116 m2/g ซึ่งเปรียบเทียบได้กับการศึกษาครั้งก่อนของเรา (124 m2/g) ดังที่แสดงในตาราง 1(B) พื้นที่ผิว (m2/g) ของ อนุภาคซิลิกาลดลงจาก 116 m2/g เหลือ 105 m2/g หลังการปรับเปลี่ยนทางเคมี
ผลการวิเคราะห์ธาตุของเฟสคงที่แสดงไว้ในตารางที่ 2 ปริมาณคาร์บอนของเฟสคงที่ในปัจจุบันคือ 6.35% ซึ่งต่ำกว่าปริมาณคาร์บอนของการศึกษาครั้งก่อนของเรา (อนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยโพลีสไตรีน 7.93%35 และ 10.21% ตามลำดับ) 42 ปริมาณคาร์บอนของเฟสคงที่ในปัจจุบันต่ำ เนื่องจากในการเตรียม SP ปัจจุบัน นอกเหนือจากสไตรีนแล้ว ยังใช้ลิแกนด์ที่มีขั้วบางชนิด เช่น ฟีนิลมาเลอิมายด์-เมทิลไวนิลไอโซไซยาเนต (PCMP) และ 4-ไฮดรอกซี-TEMPO เปอร์เซ็นต์น้ำหนักไนโตรเจนของเฟสคงที่ในปัจจุบันคือ 2.21% เมื่อเทียบกับ 0.1735 และ 0.85% โดยน้ำหนักของไนโตรเจนในการศึกษาครั้งก่อนตามลำดับ ซึ่งหมายความว่าเปอร์เซ็นต์น้ำหนักของไนโตรเจนสูงกว่าในเฟสคงที่ในปัจจุบันเนื่องจากฟีนิลมาเลอิมายด์ ในทำนองเดียวกัน ปริมาณคาร์บอนของผลิตภัณฑ์ (4) และ (5) 2.7% และ 2.9% ตามลำดับ ในขณะที่ปริมาณคาร์บอนของผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย (6) อยู่ที่ 6.35% ดังที่แสดงในตารางที่ 2 การสูญเสียน้ำหนักถูกตรวจสอบด้วยเฟสคงที่ PMP และเส้นโค้ง TGA จะแสดงในรูปที่ 4 เส้นโค้ง TGA แสดงการสูญเสียน้ำหนักที่ 8.6% ซึ่งสอดคล้องกับปริมาณคาร์บอน (6.35%) เนื่องจากลิแกนด์ไม่เพียงแต่มี C เท่านั้น แต่ยังมี N, O และ H ด้วย
ลิแกนด์ฟีนิลมาเลอิมายด์-เมทิลไวนิลไอโซไซยาเนตถูกเลือกสำหรับการปรับเปลี่ยนพื้นผิวของอนุภาคซิลิกา เนื่องจากมีกลุ่มฟีนิลมาเลอิมายด์ที่มีขั้วและกลุ่มไวนิลไอโซไซยาเนต กลุ่มไวนิลไอโซไซยาเนตสามารถทำปฏิกิริยาเพิ่มเติมกับสไตรีนโดยการเกิดพอลิเมอไรเซชันของอนุมูลอิสระที่มีชีวิต เหตุผลที่สองคือการแทรกกลุ่มที่มีปฏิสัมพันธ์ปานกลางกับสารวิเคราะห์และไม่มีปฏิสัมพันธ์ทางไฟฟ้าสถิตที่รุนแรงระหว่างสารวิเคราะห์และเฟสคงที่ เนื่องจากกลุ่มฟีนิลมาเลอิมายด์ไม่มีประจุเสมือนที่ค่า pH ปกติ ความเป็นขั้วของเฟสคงที่สามารถควบคุมได้ด้วยสไตรีนในปริมาณที่เหมาะสมและเวลาปฏิกิริยาของการเกิดพอลิเมอไรเซชันของอนุมูลอิสระ ขั้นตอนสุดท้ายของปฏิกิริยา (การเกิดพอลิเมอไรเซชันของอนุมูลอิสระ) มีความสำคัญและสามารถเปลี่ยนความเป็นขั้วของเฟสคงที่ได้ ดำเนินการวิเคราะห์ธาตุเพื่อตรวจสอบปริมาณคาร์บอนของเฟสคงที่เหล่านี้ พบว่าการเพิ่มปริมาณสไตรีนและเวลาปฏิกิริยาจะเพิ่มปริมาณคาร์บอนของเฟสคงที่และในทางกลับกัน SP ที่เตรียมด้วยสไตรีนในความเข้มข้นต่างกันมี ปริมาณคาร์บอนที่แตกต่างกัน โหลดเฟสคงที่เหล่านี้ลงในคอลัมน์สแตนเลสอีกครั้งและตรวจสอบประสิทธิภาพทางโครมาโตกราฟี (การคัดเลือก ความละเอียด ค่า N ฯลฯ) จากการทดลองเหล่านี้ ได้มีการเลือกสูตรที่เหมาะสมที่สุดเพื่อเตรียมเฟสคงที่ PMP เพื่อให้แน่ใจว่ามีขั้วที่ควบคุมได้และการกักเก็บสารวิเคราะห์ที่ดี
นอกจากนี้ ยังมีการประเมินส่วนผสมของเปปไทด์ทั้งห้าชนิด (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) โดยใช้คอลัมน์ PMP ที่ใช้เฟสเคลื่อนที่อีกด้วย 60/40 (v/v) acetonitrile/น้ำ (0.1% TFA) ที่อัตราการไหล 80 μL/นาที ภายใต้สภาวะการชะที่เหมาะสมที่สุด จำนวนแผ่นเชิงทฤษฎี (N) ต่อคอลัมน์ (100 × 1.8 มม. id) คือ 20,000 ± 100 (200,000 แผ่น/ม.²) ตารางที่ 3 แสดงค่า N ของคอลัมน์ PMP ทั้งสามคอลัมน์ และโครมาโทแกรมแสดงอยู่ในรูปที่ 5A การวิเคราะห์อย่างรวดเร็วบนคอลัมน์ PMP ที่อัตราการไหลสูง (700 μL/นาที) เปปไทด์ 5 ตัวถูกชะออกภายในหนึ่งนาที ค่า N ดีมาก 13,500 ± 330 ต่อคอลัมน์ (100 × 1.8 มม. id) สอดคล้องกับ 135,000 แผ่น/ม. (รูปที่ 5B) คอลัมน์ที่มีขนาดเท่ากันสามคอลัมน์ (100 × 1.8 มม. id) บรรจุด้วยเฟสคงที่ PMP สามล็อตที่แตกต่างกันเพื่อตรวจสอบความสามารถในการทำซ้ำ ความเข้มข้นของสารวิเคราะห์สำหรับแต่ละคอลัมน์จะถูกบันทึกโดยใช้เงื่อนไขการชะที่เหมาะสมที่สุดและจำนวนแผ่นทฤษฎี N และเวลาการคงอยู่เพื่อแยกส่วนผสมทดสอบเดียวกันบนแต่ละคอลัมน์ ข้อมูลความสามารถในการทำซ้ำได้สำหรับคอลัมน์ PMP แสดงอยู่ในตารางที่ 4 ความสามารถในการทำซ้ำได้ของคอลัมน์ PMP มีความสัมพันธ์ที่ดีกับค่า %RSD ที่ต่ำมาก ดังที่แสดงในตารางที่ 3
การแยกส่วนผสมของเปปไทด์บนคอลัมน์ PMP (B) และคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (A); เฟสเคลื่อนที่ 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%) ขนาดคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.); ลำดับการชะของสารประกอบเชิงวิเคราะห์: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) และ 5 (leucine) acid enkephalin))
คอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) ได้รับการประเมินสำหรับการแยกโปรตีนย่อยทริปซินของอัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ในเครื่องโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง โครมาโทแกรมในรูปที่ 6 แสดงให้เห็นว่าตัวอย่างถูกแยกออกได้ดีและมีความละเอียดดีมาก โปรตีนย่อย HSA ถูกวิเคราะห์โดยใช้อัตราการไหล 100 µL/นาที เฟสเคลื่อนที่ 70/30 อะซีโตไนไตรล์/น้ำ และ 0.1% TFA ตามที่แสดงในโครมาโทแกรม (รูปที่ 6) โปรตีนย่อย HSA ถูกแบ่งออกเป็น 17 พีคที่สอดคล้องกับเปปไทด์ 17 ตัว ประสิทธิภาพการแยกของแต่ละพีคในโปรตีนย่อย HSA ได้รับการคำนวณ และค่าต่างๆ จะแสดงอยู่ในตารางที่ 5
แยกสารละลายทริปซินของ HSA (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) บนคอลัมน์ PMP; อัตราการไหล (100 µL/นาที) เฟสเคลื่อนที่ 60/40 อะซีโตไนไตรล์/น้ำพร้อม TFA 0.1%
โดยที่ L คือความยาวคอลัมน์ η คือความหนืดของเฟสเคลื่อนที่ ΔP คือแรงดันย้อนกลับของคอลัมน์ และ u คือความเร็วเชิงเส้นของเฟสเคลื่อนที่ ค่าการซึมผ่านของคอลัมน์ PMP อยู่ที่ 2.5 × 10-14 m2 อัตราการไหลอยู่ที่ 25 μL/นาที และใช้ 60/40 v/v ACN/น้ำ ค่าการซึมผ่านของคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) ใกล้เคียงกับค่าการซึมผ่านของการศึกษาครั้งก่อนของเรา Ref.34 ค่าการซึมผ่านของคอลัมน์ที่อัดแน่นด้วยอนุภาคที่มีรูพรุนผิวเผินคือ: 1.7 × 10-15 สำหรับอนุภาคขนาด 1.3 μm, 3.1 × 10-15 สำหรับอนุภาคขนาด 1.7 μm, 5.2 × 10-15 และ 2.5 × 10-14 m2 สำหรับอนุภาคขนาด 2.6 μm สำหรับอนุภาคขนาด 5 μm 43 ดังนั้น ความสามารถในการซึมผ่านของเฟส PMP มีค่าใกล้เคียงกับอนุภาคแกน-เปลือกขนาด 5 μm
โดยที่ Wx คือน้ำหนักของคอลัมน์ที่บรรจุด้วยคลอโรฟอร์ม Wy คือน้ำหนักของคอลัมน์ที่บรรจุด้วยเมทานอล และ ρ คือความหนาแน่นของตัวทำละลาย ความหนาแน่นของเมทานอล (ρ = 0.7866) และคลอโรฟอร์ม (ρ = 1.484) ความพรุนทั้งหมดของคอลัมน์อนุภาคซิลิกา-C18 (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) 34 และคอลัมน์ยูเรีย C18 31 ที่เราศึกษาก่อนหน้านี้มีค่าเท่ากับ 0.63 และ 0.55 ตามลำดับ ซึ่งหมายความว่าการมีลิแกนด์ยูเรียจะลดการซึมผ่านของเฟสคงที่ ในทางกลับกัน ความพรุนทั้งหมดของคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) มีค่าเท่ากับ 0.60 ความซึมผ่านของคอลัมน์ PMP ต่ำกว่าคอลัมน์ที่บรรจุด้วยอนุภาคซิลิกาที่มีพันธะ C18 เนื่องจากในเฟสคงที่ประเภท C18 อนุภาคซิลิกา C18 จะจับกับพันธะ C18 ลิแกนด์จะยึดติดกับอนุภาคซิลิกาในลักษณะของโซ่เชิงเส้น ในขณะที่ในเฟสคงที่ประเภทโพลีสไตรีน ชั้นโพลีเมอร์ที่ค่อนข้างหนา A จะถูกสร้างขึ้นรอบๆ ลิแกนด์ ในการทดลองทั่วไป จะคำนวณรูพรุนของคอลัมน์ดังนี้:
รูปที่ 7A,B แสดงคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) และคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) โดยใช้เงื่อนไขการชะแบบเดียวกัน (เช่น 60/40 ACN/H2O และ 0.1% TFA) ของพล็อต van Deemter ส่วนผสมเปปไทด์ที่เลือก (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ถูกเตรียมใน 20 µL/ อัตราการไหลขั้นต่ำสำหรับคอลัมน์ทั้งสองคือ 800 µL/นาที ค่า HETP ขั้นต่ำที่อัตราการไหลที่เหมาะสมที่สุด (80 µL/นาที) สำหรับคอลัมน์ PMP และคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide คือ 2.6 µm และ 3.9 µm ตามลำดับ ค่า HETP บ่งชี้ว่าประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) ดีกว่าคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide ที่วางจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) มาก กราฟ van Deemter ในรูปที่ 7(A) แสดงให้เห็นว่าการลดลงของค่า N เมื่อการไหลเพิ่มขึ้นนั้นไม่มีนัยสำคัญเมื่อเทียบกับค่าก่อนหน้าของเรา ประสิทธิภาพการแยกที่สูงกว่าของคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) เมื่อเปรียบเทียบกับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide ขึ้นอยู่กับการปรับปรุงรูปร่าง ขนาด และขั้นตอนการบรรจุคอลัมน์ที่ซับซ้อนที่ใช้ในงานปัจจุบัน34
(A) กราฟ van Deemter (HETP เทียบกับความเร็วเชิงเส้นของเฟสเคลื่อนที่) ที่ได้จากคอลัมน์ PMP (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) ใน 60/40 ACN/H2O ที่มี TFA 0.1% (B) กราฟ van Deemter (HETP เทียบกับความเร็วเชิงเส้นของเฟสเคลื่อนที่) ที่ได้จากคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน 100 × 1.8 มม.) ใน 60/40 ACN/H2O ที่มี TFA 0.1%
เฟสคงที่โพลีสไตรีนฝังขั้วได้รับการเตรียมและประเมินผลสำหรับการแยกส่วนผสมของเปปไทด์สังเคราะห์และการย่อยด้วยทริปซินของอัลบูมินในซีรัมของมนุษย์ (HAS) ในโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง ประสิทธิภาพทางโครมาโทกราฟีของคอลัมน์ PMP สำหรับส่วนผสมของเปปไทด์นั้นยอดเยี่ยมในด้านประสิทธิภาพการแยกและความละเอียด ประสิทธิภาพการแยกที่ปรับปรุงขึ้นของคอลัมน์ PMP เกิดจากหลายสาเหตุ เช่น ขนาดอนุภาคและขนาดรูพรุนของอนุภาคซิลิกา การสังเคราะห์เฟสคงที่แบบควบคุม และการบรรจุคอลัมน์ที่ซับซ้อน นอกเหนือจากประสิทธิภาพการแยกที่สูงแล้ว แรงดันย้อนกลับของคอลัมน์ต่ำที่อัตราการไหลสูงก็เป็นข้อได้เปรียบอีกประการของเฟสคงที่นี้ คอลัมน์ PMP แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการทำซ้ำได้ดีและสามารถใช้สำหรับการวิเคราะห์ส่วนผสมของเปปไทด์และการย่อยด้วยทริปซินของโปรตีนต่างๆ เราตั้งใจที่จะใช้คอลัมน์นี้สำหรับการแยกผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ สารชีวภาพจากพืชสมุนไพร และสารสกัดจากเชื้อราในโครมาโทกราฟีของเหลว ในอนาคต คอลัมน์ PMP จะได้รับการประเมินสำหรับการแยกโปรตีนและแอนติบอดีโมโนโคลนัลด้วย
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. และ Petersson, P. การวิจัยระบบการแยกเปปไทด์โดยโครมาโตกราฟีเฟสย้อนกลับ ส่วนที่ 1: การพัฒนาโปรโตคอลการจำแนกลักษณะของคอลัมน์ J. Chromatography 1603, 113–129 https://doi.org/10.1016/j.chroma 2019.05.038 (2019)
Gomez, B. et al. เปปไทด์ที่ทำงานได้ดีขึ้นซึ่งออกแบบมาเพื่อการรักษาโรคติดเชื้อ เทคโนโลยีชีวภาพ ขั้นสูง 36(2), 415-429 https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018)
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. และ Khrestchatisky, M. เปปไทด์สังเคราะห์ในการรักษา: วิทยาศาสตร์และตลาด การค้นพบยา 15 (1-2) วันนี้ 40-56 https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010)
Xie, F., Smith, RD และ Shen, Y. โครมาโตกราฟีของเหลวโปรตีโอมิกขั้นสูง J. Chromatography A 1261, 78–90 (2012)
Liu, W. et al. โครมาโทกราฟีของเหลวขั้นสูง-สเปกโตรมิเตอร์มวลช่วยให้สามารถผสมผสานเมตาโบโลมิกส์และโปรตีโอมิกส์ที่มีเป้าหมายกว้างๆ ได้ anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019)
Chesnut, SM และ Salisbury, JJ บทบาทของ UHPLC ในการพัฒนายา J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007)
Wu, N. & Clausen, AM ด้านพื้นฐานและเชิงปฏิบัติของโครมาโทกราฟีของเหลวแรงดันสูงพิเศษสำหรับการแยกอย่างรวดเร็ว J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007)
Wren, SA และ Tchelitcheff, P. การประยุกต์ใช้โครมาโตกราฟีของเหลวสมรรถนะสูงพิเศษในการพัฒนายา J. Chromatography 1119(1-2), 140-146 https://doi.org/10.1016/j.chroma 2006.02.052 (2549)
Gu, H. et al. ไฮโดรเจลขนาดใหญ่ที่มีรูพรุนแบบโมโนลิธิกที่เตรียมจากอิมัลชันเฟสภายในสูงในน้ำมันในน้ำเพื่อการชำระล้างเอนเทอโรไวรัสอย่างมีประสิทธิภาพ Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020)
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA บทบาทของโครมาโตกราฟีของเหลวในโปรตีโอมิกส์ J. Chromatography A 1053(1-2), 27-36 (2004)
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. แนวโน้มใหม่ในการแยกเปปไทด์และโปรตีนที่ใช้ในการรักษาโดยโครมาโทกราฟีของเหลวเฟสย้อนกลับ: ทฤษฎีและการประยุกต์ใช้ J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012)
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC การแยกเปปไทด์สองมิติโดยใช้ระบบ RP-RP-HPLC โดยใช้ค่า pH ต่างกันในมิติของการแยกครั้งแรกและครั้งที่สอง J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005)
Felietti, S. et al. ลักษณะการถ่ายเทมวลและสมรรถนะจลนศาสตร์ของคอลัมน์โครมาโตกราฟีประสิทธิภาพสูงที่บรรจุด้วยอนุภาค C18 ที่มีรูพรุนเต็มที่และผิวเผินขนาดต่ำกว่า 2 ไมโครเมตรได้รับการตรวจสอบแล้ว J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020)
Piovesana, S. et al. แนวโน้มล่าสุดและความท้าทายในการวิเคราะห์ในการแยก การระบุ และการตรวจสอบความถูกต้องของเปปไทด์ชีวภาพจากพืช anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018)
Mueller, JB et al. ภูมิทัศน์โปรตีโอมิกส์ของอาณาจักรแห่งชีวิต Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020)
DeLuca, C. et al. การประมวลผลปลายน้ำของเปปไทด์เพื่อการรักษาโดยโครมาโทกราฟีของเหลวแบบเตรียมการ โมเลกุล (บาเซิล สวิตเซอร์แลนด์) 26(15), 4688(2021)
Yang, Y. และ Geng, X. โครมาโตกราฟีแบบผสมโหมดและการประยุกต์ใช้กับไบโอโพลีเมอร์ J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011)
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. ลิแกนด์สำหรับโครมาโตกราฟีโปรตีนแบบผสม: หลักการ ลักษณะเฉพาะ และการออกแบบ J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009)