ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com เบราว์เซอร์ที่คุณใช้อยู่มีการรองรับ CSS อย่างจำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) ในระหว่างนี้ เพื่อให้มั่นใจว่าเว็บไซต์จะยังคงได้รับการสนับสนุนต่อไป เราจะแสดงเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
อนุภาคซิลิกาพรุนถูกเตรียมโดยวิธีโซล-เจล โดยมีการดัดแปลงบางส่วนเพื่อให้ได้อนุภาคที่มีรูพรุนขนาดใหญ่ อนุภาคเหล่านี้ถูกทำให้เกิดอนุพันธ์โดยการพอลิเมอไรเซชันแบบถ่ายโอนโซ่แบบย้อนกลับได้ (RAFT) ด้วย N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) และสไตรีน เพื่อเตรียมเฟสคงที่แบบแทรก N-phenylmaleimide ของพอลิสไตรีน (PMP) คอลัมน์สแตนเลสแบบรูแคบ (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) ถูกบรรจุโดยการบรรจุแบบสลอรี่ ประเมินประสิทธิภาพการแยกสารผสมเปปไทด์ที่ประกอบด้วยเปปไทด์ห้าชนิด (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) และการย่อยโปรตีนอัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ (HAS) ด้วยเอนไซม์ทริปซิน ภายใต้สภาวะการชะล้างที่เหมาะสม จำนวนเพลทเชิงทฤษฎีของสารผสมเปปไทด์สูงถึง 280,000 เพลท/ตร.ม. เมื่อเปรียบเทียบประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ที่พัฒนาขึ้นกับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide เชิงพาณิชย์ พบว่าประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP นั้นเหนือกว่าคอลัมน์เชิงพาณิชย์ในแง่ของประสิทธิภาพการแยกและความละเอียด
ในช่วงไม่กี่ปีที่ผ่านมา อุตสาหกรรมชีวเภสัชภัณฑ์ได้กลายเป็นตลาดโลกที่ขยายตัวอย่างรวดเร็ว โดยมีส่วนแบ่งการตลาดเพิ่มขึ้นอย่างมาก ด้วยการเติบโตอย่างก้าวกระโดดของอุตสาหกรรมชีวเภสัชภัณฑ์1,2,3 การวิเคราะห์เปปไทด์และโปรตีนจึงเป็นที่ต้องการอย่างมาก นอกจากเปปไทด์เป้าหมายแล้ว ยังมีสิ่งเจือปนหลายชนิดเกิดขึ้นระหว่างการสังเคราะห์เปปไทด์ ดังนั้นจึงจำเป็นต้องมีการทำให้บริสุทธิ์ด้วยวิธีโครมาโทกราฟีเพื่อให้ได้เปปไทด์ที่มีความบริสุทธิ์ตามที่ต้องการ การวิเคราะห์และลักษณะเฉพาะของโปรตีนในของเหลวในร่างกาย เนื้อเยื่อ และเซลล์เป็นงานที่ท้าทายอย่างยิ่ง เนื่องจากมีสารที่อาจตรวจพบได้จำนวนมากในตัวอย่างเดียว แม้ว่าแมสสเปกโทรเมตรีจะเป็นเครื่องมือที่มีประสิทธิภาพสำหรับการจัดลำดับเปปไทด์และโปรตีน แต่หากฉีดตัวอย่างดังกล่าวเข้าไปในแมสสเปกโทรเมตรีในครั้งเดียว การแยกจะไม่สมบูรณ์ ปัญหานี้สามารถแก้ไขได้โดยการใช้การแยกด้วยโครมาโทกราฟีของเหลว (LC) ก่อนการวิเคราะห์ด้วย MS ซึ่งจะช่วยลดจำนวนสารวิเคราะห์ที่เข้าสู่แมสสเปกโทรเมตรีในแต่ละครั้ง4,5,6 นอกจากนี้ ในระหว่างการแยกด้วยเฟสของเหลว สารวิเคราะห์สามารถถูกโฟกัสได้ใน บริเวณที่แคบลงจึงทำให้สารวิเคราะห์เหล่านี้มีความเข้มข้นมากขึ้นและปรับปรุงความไวในการตรวจจับ MS โครมาโทกราฟีของเหลว (LC) ได้พัฒนาไปอย่างมากในช่วงทศวรรษที่ผ่านมาและกลายเป็นเทคนิคที่ได้รับความนิยมในการวิเคราะห์โปรตีโอมิกส์7,8,9,10
โครมาโทกราฟีของเหลวแบบย้อนกลับ (RP-LC) ถูกนำมาใช้กันอย่างแพร่หลายสำหรับการทำให้บริสุทธิ์และการแยกส่วนผสมของเปปไทด์โดยใช้ซิลิกาที่ดัดแปลงด้วยออกตาเดซิล (ODS) เป็นเฟสคงที่11,12,13 อย่างไรก็ตาม เฟสคงที่แบบ RP ไม่สามารถแยกเปปไทด์และโปรตีนได้อย่างน่าพอใจเนื่องจากโครงสร้างที่ซับซ้อนและลักษณะแอมฟิฟิลิกของพวกมัน 14,15 ดังนั้นจึงจำเป็นต้องใช้เฟสคงที่ที่ออกแบบมาเป็นพิเศษเพื่อวิเคราะห์เปปไทด์และโปรตีนที่มีส่วนประกอบขั้วและไม่มีขั้วเพื่อทำปฏิกิริยาและกักเก็บสารวิเคราะห์เหล่านี้ไว้16 โครมาโทกราฟีแบบผสม ซึ่งให้ปฏิสัมพันธ์แบบหลายโหมด สามารถเป็นทางเลือกแทน RP-LC สำหรับการแยกเปปไทด์ โปรตีน และส่วนผสมที่ซับซ้อนอื่นๆ เฟสคงที่แบบผสมหลายชนิดได้รับการเตรียม และคอลัมน์ที่บรรจุด้วยเฟสเหล่านี้ถูกนำมาใช้สำหรับการแยกเปปไทด์และโปรตีน17,18,19,20,21 เฟสคงที่แบบผสม (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar intercalation/RPLC) เหมาะสำหรับการแยกเปปไทด์และโปรตีนเนื่องจากการมีอยู่ของกลุ่มขั้วและกลุ่มที่ไม่เป็นขั้ว22,23,24,25,26,27,28 ในทำนองเดียวกัน เฟสคงที่แบบแทรกขั้วที่มีกลุ่มขั้วที่เชื่อมต่อกันด้วยพันธะโควาเลนต์แสดงให้เห็นถึงพลังการแยกที่ดีและความสามารถในการเลือกเฉพาะสำหรับสารวิเคราะห์ที่เป็นขั้วและไม่เป็นขั้ว เนื่องจากการแยกขึ้นอยู่กับปฏิสัมพันธ์ระหว่างสารวิเคราะห์และเฟสคงที่ ปฏิสัมพันธ์แบบหลายโหมด 29, 30, 31, 32 เมื่อเร็วๆ นี้ Zhang et al. 30 ได้เตรียมเฟสคงที่โพลีเอมีนที่ลงท้ายด้วยโดเดซิล และแยกไฮโดรคาร์บอน ยาแก้ซึมเศร้า ฟลาโวนอยด์ นิวคลีโอไซด์ เอสโตรเจน และสารวิเคราะห์อื่นๆ ได้สำเร็จ สารแทรกขั้วมีทั้งกลุ่มขั้วและกลุ่มไม่ขั้ว ดังนั้นจึงสามารถใช้แยกเปปไทด์และโปรตีนที่มีทั้งส่วนที่ชอบน้ำและไม่ชอบน้ำได้ คอลัมน์ที่มีขั้วฝังอยู่ (เช่น คอลัมน์ C18 ที่ฝังอะไมด์) มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ภายใต้ชื่อทางการค้า Ascentis Express RP-Amide columns แต่คอลัมน์เหล่านี้ใช้สำหรับการวิเคราะห์อะมีน 33 เท่านั้น
ในการศึกษาครั้งนี้ ได้เตรียมและประเมินเฟสคงที่แบบฝังขั้ว (โพลีสไตรีนฝัง N-phenylmaleimide) สำหรับการแยกเปปไทด์และสารย่อย HSA ด้วยเอนไซม์ทริปซิน เฟสคงที่นี้เตรียมขึ้นโดยใช้กลยุทธ์ดังต่อไปนี้ อนุภาคซิลิกาที่มีรูพรุนถูกเตรียมตามขั้นตอนที่ระบุไว้ในสิ่งพิมพ์ก่อนหน้าของเรา โดยมีการปรับเปลี่ยนโปรโตคอลการเตรียมบางส่วน อัตราส่วนของยูเรีย โพลีเอทิลีนไกลคอล (PEG) TMOS น้ำ และกรดอะซิติก ถูกปรับเพื่อเตรียมอนุภาคซิลิกาที่มีขนาดรูพรุนใหญ่ ประการที่สอง ลิแกนด์ใหม่ phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate ถูกสังเคราะห์และใช้ในการดัดแปลงอนุภาคซิลิกาเพื่อเตรียมเฟสคงที่แบบฝังขั้ว เฟสคงที่ที่ได้ถูกบรรจุลงในคอลัมน์สแตนเลส (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) โดยใช้แผนการบรรจุที่เหมาะสม การบรรจุคอลัมน์ได้รับการช่วยเหลือด้วยการสั่นสะเทือนเชิงกลเพื่อให้แน่ใจว่ามีการก่อตัวของชั้นที่สม่ำเสมอภายในคอลัมน์ ประเมินการแยกคอลัมน์บรรจุของส่วนผสมเปปไทด์ที่ประกอบด้วยห้าชนิด เปปไทด์ (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) และอัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ (HAS) ที่ย่อยด้วยเอนไซม์ทริปซิน พบว่าส่วนผสมของเปปไทด์และ HSA ที่ย่อยด้วยเอนไซม์ทริปซินสามารถแยกออกจากกันได้ดีและมีประสิทธิภาพ ประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP ถูกเปรียบเทียบกับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide พบว่าทั้งเปปไทด์และโปรตีนสามารถแยกออกจากกันได้ดีและมีประสิทธิภาพบนคอลัมน์ PMP ซึ่งมีประสิทธิภาพมากกว่าคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide
PEG (โพลีเอทิลีนไกลคอล), ยูเรีย, กรดอะซิติก, ไตรเมทอกซีออร์โธซิลิเคต (TMOS), ไตรเมทิลคลอโรซิเลน (TMCS), ทริปซิน, อัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ (HSA), แอมโมเนียมคลอไรด์, ยูเรีย, เฮกเซนเมทิลไดซิลาเซน (HMDS), เมทาคริลอยล์คลอไรด์ (MC), สไตรีน, 4-ไฮดรอกซี-TEMPO, เบนโซอิลเปอร์ออกไซด์ (BPO), อะซีโตไนไตรล์ (ACN) เกรด HPLC, เมทานอล, 2-โพรพานอล และอะซิโตน ซื้อจาก Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)
นำยูเรีย (8 กรัม), โพลีเอทิลีนไกลคอล (8 กรัม) และกรดอะซิติก 0.01 N 8 มิลลิลิตร มาคนให้เข้ากันเป็นเวลา 10 นาที จากนั้นเติม TMOS 24 มิลลิลิตร ลงไปในสภาวะเย็นจัด นำส่วนผสมของปฏิกิริยาไปให้ความร้อนที่ 40°C เป็นเวลา 6 ชั่วโมง แล้วต่อด้วย 120°C เป็นเวลา 8 ชั่วโมง ในหม้ออัดความดันสแตนเลส เทน้ำออก และนำวัสดุที่เหลือไปอบแห้งที่ 70°C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง นำมวลที่แห้งแล้วมาบดให้ละเอียดในเตาอบ และเผาที่ 550°C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง เตรียมตัวอย่าง 3 ชุด และนำมาวิเคราะห์เพื่อตรวจสอบความสามารถในการทำซ้ำของขนาดอนุภาค ขนาดรูพรุน และพื้นที่ผิว
โดยการปรับเปลี่ยนพื้นผิวของอนุภาคซิลิกาด้วยลิแกนด์ฟีนิลมาเลอิไมด์-เมทิลไวนิลไอโซไซยาเนต (PCMP) ที่สังเคราะห์ไว้ล่วงหน้า ตามด้วยการพอลิเมอไรเซชันแบบรัศมีกับสไตรีน ทำให้ได้สารประกอบที่มีหมู่ขั้ว ซึ่งทำหน้าที่เป็นเฟสคงที่สำหรับสารรวมตัวและสายโซ่พอลิสไตรีน กระบวนการเตรียมอธิบายไว้ด้านล่าง
นำ N-phenylmaleimide (200 มก.) และ methyl vinyl isocyanate (100 มก.) ละลายในโทลูอีนแห้ง จากนั้นเติม 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) 0.1 มล. ลงในขวดปฏิกิริยาเพื่อเตรียมโคพอลิเมอร์ phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate (PMCP) นำส่วนผสมไปให้ความร้อนที่ 60°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง กรอง และอบแห้งในเตาอบที่ 40°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง
นำอนุภาคซิลิกาแห้ง (2 กรัม) มากระจายในโทลูอีนแห้ง (100 มิลลิลิตร) คนและใช้คลื่นเสียงอัลตราโซนิกในขวดก้นกลมขนาด 500 มิลลิลิตร เป็นเวลา 10 นาที จากนั้นละลาย PMCP (10 มิลลิกรัม) ในโทลูอีนและค่อยๆ หยดลงในขวดปฏิกิริยาโดยใช้กรวยหยด นำส่วนผสมไปต้มกลับที่อุณหภูมิ 100°C เป็นเวลา 8 ชั่วโมง กรองและล้างด้วยอะซิโตน แล้วอบแห้งที่อุณหภูมิ 60°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง ต่อมา นำอนุภาคซิลิกาที่ยึดติด PMCP แล้ว (100 กรัม) มาละลายในโทลูอีน (200 มิลลิลิตร) และเติม 4-ไฮดรอกซี-TEMPO (2 มิลลิลิตร) โดยมีไดบิวทิลทินไดลอเรต 100 ไมโครลิตร เป็นตัวเร่งปฏิกิริยา นำส่วนผสมไปคนให้เข้ากันที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 8 ชั่วโมง กรองและอบแห้งที่อุณหภูมิ 50°C เป็นเวลา 3 ชั่วโมง
นำสไตรีน (1 มล.), เบนโซอิลเปอร์ออกไซด์ (BPO) (0.5 มล.) และอนุภาคซิลิกาที่ติดกับ TEMPO-PMCP (1.5 กรัม) มากระจายตัวในโทลูอีนและไล่ก๊าซออกด้วยไนโตรเจน จากนั้นทำการพอลิเมอไรเซชันของสไตรีนที่อุณหภูมิ 100°C เป็นเวลา 12 ชั่วโมง ล้างผลิตภัณฑ์ที่ได้ด้วยเมทานอลและทำให้แห้งที่อุณหภูมิ 60°C ค้างคืน แผนผังปฏิกิริยาโดยรวมแสดงในรูปที่ 1
ตัวอย่างถูกไล่แก๊สที่อุณหภูมิ 393 K เป็นเวลา 1 ชั่วโมง เพื่อให้ได้ความดันตกค้างน้อยกว่า 10⁻³ Torr ปริมาณ N₂ ที่ถูกดูดซับที่ความดันสัมพัทธ์ P/P₀ = 0.99 ถูกนำมาใช้ในการกำหนดปริมาตรของรูพรุนทั้งหมด ลักษณะทางสัณฐานวิทยาของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยลิแกนด์ถูกตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกน (Hitachi High Technologies, โตเกียว, ญี่ปุ่น) ตัวอย่างที่แห้งแล้ว (อนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยลิแกนด์) ถูกวางบนเสาอะลูมิเนียมโดยใช้เทปกาวคาร์บอน ทองคำถูกเคลือบลงบนตัวอย่างโดยใช้เครื่องเคลือบแบบสปัตเตอร์ Q150T และชั้น Au หนา 5 นาโนเมตรถูกเคลือบลงบนตัวอย่าง วิธีนี้ช่วยเพิ่มประสิทธิภาพของกระบวนการโดยใช้แรงดันไฟฟ้าต่ำและให้การสปัตเตอร์แบบเย็นที่มีเกรนละเอียด เครื่องวิเคราะห์ธาตุ Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ธาตุ เครื่องวิเคราะห์ขนาดอนุภาค Malvern (Worcestershire, สหราชอาณาจักร) Mastersizer 2000 ถูกใช้สำหรับการวิเคราะห์ขนาดอนุภาค ใช้ในการหาการกระจายขนาดอนุภาค โดยนำอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยลิแกนด์ (อย่างละ 5 มิลลิกรัม) มากระจายในไอโซโพรพานอล 5 มิลลิลิตร นำไปอัลตราโซนิคเป็นเวลา 10 นาที เขย่าด้วยเครื่องปั่นเหวี่ยงเป็นเวลา 5 นาที แล้ววางบนแท่นวางแบบออปติคอลของเครื่อง Mastersizer ทำการวิเคราะห์เทอร์โมกราวิเมตริกที่อัตรา 5 องศาเซลเซียสต่อนาที ในช่วงอุณหภูมิ 30 ถึง 800 องศาเซลเซียส
คอลัมน์แคบที่ทำจากสแตนเลสเคลือบแก้ว ขนาด (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) ถูกบรรจุโดยใช้วิธีการบรรจุแบบสารละลายข้น โดยใช้ขั้นตอนเดียวกันกับที่ใช้ในเอกสารอ้างอิง 31. คอลัมน์สแตนเลส (บุด้วยแก้ว ขนาด 100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) ที่มีข้อต่อทางออกบรรจุด้วยแผ่นกรองขนาด 1 µm ถูกเชื่อมต่อกับเครื่องบรรจุสารละลาย (Alltech Deerfield, IL, USA) เตรียมสารละลายเฟสคงที่โดยการแขวนเฟสคงที่ 150 มก. ในเมทานอล 1.2 มล. แล้วส่งไปยังคอลัมน์เก็บ เมทานอลถูกใช้เป็นตัวทำละลายสารละลายและตัวทำละลายขับเคลื่อน เติมคอลัมน์ตามลำดับโดยใช้แรงดัน 100 MPa เป็นเวลา 10 นาที 80 MPa เป็นเวลา 15 นาที และ 60 MPa เป็นเวลา 30 นาที ในระหว่างการบรรจุ จะใช้การสั่นสะเทือนเชิงกลด้วยเครื่องเขย่าคอลัมน์ GC สองเครื่อง (Alltech, Deerfield, IL, USA) เพื่อให้แน่ใจว่าการบรรจุคอลัมน์เป็นไปอย่างสม่ำเสมอ ปิดเครื่องบรรจุสารละลายและปล่อยแรงดันอย่างช้าๆ เพื่อป้องกันความเสียหายภายในคอลัมน์ ถอดคอลัมน์ออกจากหน่วยบรรจุสารละลายและเชื่อมต่อข้อต่ออีกตัวเข้ากับทางเข้าและไปยัง ระบบ LC เพื่อตรวจสอบประสิทธิภาพการทำงาน
เครื่อง LC pump (10AD Shimadzu, ประเทศญี่ปุ่น), หัวฉีด (Valco (USA) C14 W.05) พร้อมห่วงฉีดขนาด 50nL, เครื่องกำจัดฟองอากาศแบบเมมเบรน (Shimadzu DGU-14A), หน้าต่างแคปิลลารี UV-VIS ถูกสร้างขึ้น อุปกรณ์ตรวจจับ µLC พิเศษ (UV-2075) และไมโครคอลัมน์เคลือบแก้ว ใช้ท่อเชื่อมต่อที่แคบและสั้นมากเพื่อลดผลกระทบของการขยายแถบนอกคอลัมน์ หลังจากบรรจุแล้ว แคปิลลารี (50 μm id 365) และแคปิลลารีแบบลดขนาด (50 μm) ถูกติดตั้งที่ช่องทางออก 1/16″ ของข้อต่อลดขนาด การเก็บข้อมูลและการประมวลผลทางโครมาโทกราฟีทำโดยใช้ซอฟต์แวร์ Multichro 2000 ตรวจสอบที่ 254 nm สารวิเคราะห์ได้รับการทดสอบการดูดกลืนแสง UV ข้อมูลโครมาโทกราฟีได้รับการวิเคราะห์โดย OriginPro8 (Northampton, MA)
นำอัลบูมินจากซีรั่มมนุษย์ชนิดผงแห้งแช่แข็ง ≥ 96% (จากการวิเคราะห์ด้วยเจลอิเล็กโทรโฟเรซิสแบบอะกาโรส) 3 มิลลิกรัม ผสมกับทริปซิน (1.5 มิลลิกรัม), ยูเรีย 4.0 M (1 มิลลิลิตร) และแอมโมเนียมไบคาร์บอเนต 0.2 M (1 มิลลิลิตร) คนสารละลายเป็นเวลา 10 นาที แล้วนำไปแช่ในอ่างน้ำที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 6 ชั่วโมง จากนั้นเติม TFA 0.1% ปริมาณ 1 มิลลิลิตร เพื่อทำให้ปฏิกิริยาหยุดลง กรองสารละลายและเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิต่ำกว่า 4°C
การแยกส่วนผสมของเปปไทด์และสารย่อย HSA ด้วยเอนไซม์ทริปซินได้รับการประเมินแยกกันบนคอลัมน์ PMP ตรวจสอบการแยกส่วนผสมของเปปไทด์และสารย่อย HSA ด้วยเอนไซม์ทริปซินโดยใช้คอลัมน์ PMP และเปรียบเทียบผลลัพธ์กับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide จำนวนเพลทเชิงทฤษฎีคำนวณได้ดังนี้:
ภาพถ่าย SEM ของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่ยึดติดด้วยลิแกนด์แสดงอยู่ในรูปที่ 2 ภาพถ่าย SEM ของอนุภาคซิลิกาเปล่า (A, B) แสดงให้เห็นว่า ตรงกันข้ามกับการศึกษาครั้งก่อนของเรา อนุภาคเหล่านี้มีรูปร่างทรงกลม โดยที่อนุภาคมีลักษณะยาวหรือมีสมมาตรไม่สม่ำเสมอ พื้นผิวของอนุภาคซิลิกาที่ยึดติดด้วยลิแกนด์ (C, D) มีความเรียบกว่าอนุภาคซิลิกาเปล่า ซึ่งอาจเป็นผลมาจากการเคลือบโซ่โพลีสไตรีนบนพื้นผิวของอนุภาคซิลิกา
ภาพจากกล้องจุลทรรศน์อิเล็กตรอนแบบสแกนของอนุภาคซิลิกาเปล่า (A, B) และอนุภาคซิลิกาที่ยึดติดด้วยลิแกนด์ (C, D)
การกระจายขนาดอนุภาคของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยลิแกนด์แสดงในรูปที่ 3(A) เส้นโค้งการกระจายขนาดอนุภาคตามปริมาตรแสดงให้เห็นว่าขนาดของอนุภาคซิลิกาเพิ่มขึ้นหลังจากการดัดแปลงทางเคมี (รูปที่ 3A) ข้อมูลการกระจายขนาดอนุภาคของอนุภาคซิลิกาจากการศึกษาปัจจุบันและการศึกษาครั้งก่อนถูกนำมาเปรียบเทียบในตารางที่ 1(A) ขนาดอนุภาคตามปริมาตร d(0.5) ของ PMP คือ 3.36 μm เมื่อเทียบกับการศึกษาครั้งก่อนของเราที่มีค่า ad(0.5) เท่ากับ 3.05 μm (อนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยพอลิสไตรีน)34 ชุดนี้มีการกระจายขนาดอนุภาคที่แคบกว่าเมื่อเทียบกับการศึกษาครั้งก่อนของเราเนื่องจากอัตราส่วนของ PEG ยูเรีย TMOS และกรดอะซิติกในส่วนผสมปฏิกิริยาที่แตกต่างกัน ขนาดอนุภาคของเฟส PMP มีขนาดใหญ่กว่าเฟสอนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยพอลิสไตรีนที่เราศึกษาก่อนหน้านี้เล็กน้อย ซึ่งหมายความว่าการปรับแต่งพื้นผิวของอนุภาคซิลิกาด้วยสไตรีนนั้นทำให้เกิดการสะสมเพียง ชั้นโพลีสไตรีน (0.97 ไมโครเมตร) บนพื้นผิวซิลิกา ในขณะที่ในเฟส PMP ความหนาของชั้นอยู่ที่ 1.38 ไมโครเมตร
การกระจายขนาดอนุภาค (A) และการกระจายขนาดรูพรุน (B) ของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่จับกับลิแกนด์
ขนาดรูพรุน ปริมาตรรูพรุน และพื้นที่ผิวของอนุภาคซิลิกาในการศึกษาครั้งนี้แสดงอยู่ในตารางที่ 1(B) โปรไฟล์ PSD ของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยลิแกนด์แสดงอยู่ในรูปที่ 3(B) ผลลัพธ์ที่ได้เทียบเคียงได้กับการศึกษาครั้งก่อนของเรา ขนาดรูพรุนของอนุภาคซิลิกาเปล่าและอนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยลิแกนด์คือ 310 และ 241 ตามลำดับ ซึ่งแสดงให้เห็นว่าขนาดรูพรุนลดลง 69% หลังจากการดัดแปลงทางเคมี ดังแสดงในตารางที่ 1(B) และการเปลี่ยนแปลงของเส้นโค้งแสดงอยู่ในรูปที่ 3(B) ในทำนองเดียวกัน ปริมาตรรูพรุนของอนุภาคซิลิกาลดลงจาก 0.67 เป็น 0.58 cm³/g หลังจากการดัดแปลงทางเคมี พื้นที่ผิวจำเพาะของอนุภาคซิลิกาที่ศึกษาในปัจจุบันคือ 116 m²/g ซึ่งเทียบเคียงได้กับการศึกษาครั้งก่อนของเรา (124 m²/g) ดังแสดงในตารางที่ 1(B) พื้นที่ผิว (m²/g) ของซิลิกา นอกจากนี้ ขนาดอนุภาคยังลดลงจาก 116 ตารางเมตรต่อกรัม เหลือ 105 ตารางเมตรต่อกรัม หลังจากการปรับเปลี่ยนทางเคมี
ผลการวิเคราะห์ธาตุของเฟสคงที่แสดงอยู่ในตารางที่ 2 ปริมาณคาร์บอนของเฟสคงที่ในปัจจุบันคือ 6.35% ซึ่งต่ำกว่าปริมาณคาร์บอนของการศึกษาครั้งก่อนของเรา (อนุภาคซิลิกาที่ยึดด้วยพอลิสไตรีน 7.93%35 และ 10.21% ตามลำดับ) 42 ปริมาณคาร์บอนของเฟสคงที่ในปัจจุบันต่ำ เนื่องจากในการเตรียม SP ในปัจจุบัน นอกเหนือจากสไตรีนแล้ว ยังมีการใช้ลิแกนด์ขั้วบางชนิด เช่น ฟีนิลมาเลอิไมด์-เมทิลไวนิลไอโซไซยาเนต (PCMP) และ 4-ไฮดรอกซี-TEMPO ด้วย ร้อยละน้ำหนักของไนโตรเจนของเฟสคงที่ในปัจจุบันคือ 2.21% เมื่อเทียบกับ 0.1735 และ 0.85% โดยน้ำหนักของไนโตรเจนในการศึกษาครั้งก่อน ตามลำดับ ซึ่งหมายความว่าร้อยละน้ำหนักของไนโตรเจนในเฟสคงที่ในปัจจุบันสูงกว่าเนื่องจากฟีนิลมาเลอิไมด์ ในทำนองเดียวกัน ปริมาณคาร์บอนของผลิตภัณฑ์ (4) และ (5) คือ 2.7% และ 2.9% ตามลำดับ ในขณะที่ปริมาณคาร์บอนของผลิตภัณฑ์ขั้นสุดท้าย (6) คือ 6.35% ดังแสดงในตารางที่ 2 การสูญเสียน้ำหนักถูกตรวจสอบด้วยเฟสคงที่ PMP และเส้นโค้ง TGA แสดงในรูปที่ 4 เส้นโค้ง TGA แสดงการสูญเสียน้ำหนัก 8.6% ซึ่งสอดคล้องกับปริมาณคาร์บอน (6.35%) เป็นอย่างดี เนื่องจากลิแกนด์ไม่เพียงแต่มี C เท่านั้น แต่ยังมี N, O และ H ด้วย
เลือกใช้ลิแกนด์ฟีนิลมาเลอิไมด์-เมทิลไวนิลไอโซไซยาเนตสำหรับการปรับเปลี่ยนพื้นผิวของอนุภาคซิลิกา เนื่องจากมีหมู่ฟีนิลมาเลอิไมด์และหมู่ไวนิลไอโซไซยาเนตที่เป็นขั้ว หมู่ไวนิลไอโซไซยาเนตสามารถทำปฏิกิริยากับสไตรีนได้ต่อไปโดยการพอลิเมอไรเซชันแบบอนุมูลอิสระที่มีชีวิต เหตุผลที่สองคือการใส่หมู่ที่มีปฏิสัมพันธ์ปานกลางกับสารวิเคราะห์และไม่มีปฏิสัมพันธ์ทางไฟฟ้าสถิตที่รุนแรงระหว่างสารวิเคราะห์กับเฟสคงที่ เนื่องจากหมู่ฟีนิลมาเลอิไมด์ไม่มีประจุเสมือนที่ค่า pH ปกติ ความเป็นขั้วของเฟสคงที่สามารถควบคุมได้โดยปริมาณสไตรีนที่เหมาะสมและเวลาปฏิกิริยาของการพอลิเมอไรเซชันแบบอนุมูลอิสระ ขั้นตอนสุดท้ายของปฏิกิริยา (การพอลิเมอไรเซชันแบบอนุมูลอิสระ) มีความสำคัญและสามารถเปลี่ยนแปลงความเป็นขั้วของเฟสคงที่ได้ การวิเคราะห์ธาตุถูกดำเนินการเพื่อตรวจสอบปริมาณคาร์บอนของเฟสคงที่เหล่านี้ พบว่าการเพิ่มปริมาณสไตรีนและเวลาปฏิกิริยาจะเพิ่มปริมาณคาร์บอนของเฟสคงที่ และในทางกลับกัน เฟสคงที่ที่เตรียมด้วยความเข้มข้นของสไตรีนที่ต่างกันจะมีปริมาณคาร์บอนที่แตกต่างกัน โหลดเฟสคงที่เหล่านี้ลงในคอลัมน์สแตนเลสอีกครั้ง และตรวจสอบประสิทธิภาพการแยกสารด้วยโครมาโทกราฟี (การเลือกสรร ความละเอียด ค่า N เป็นต้น) จากการทดลองเหล่านี้ จึงได้เลือกสูตรที่เหมาะสมที่สุดในการเตรียมเฟสคงที่ PMP เพื่อให้มั่นใจได้ถึงขั้วที่ควบคุมได้และการกักเก็บสารวิเคราะห์ที่ดี
นอกจากนี้ ยังมีการประเมินส่วนผสมของเปปไทด์ 5 ชนิด (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) โดยใช้คอลัมน์ PMP ด้วยเฟสเคลื่อนที่ ใช้ตัวทำละลายอะซีโตไนไตรล์/น้ำ 60/40 (v/v) (0.1% TFA) ที่อัตราการไหล 80 μL/min ภายใต้สภาวะการชะล้างที่เหมาะสม จำนวนเพลทเชิงทฤษฎี (N) ต่อคอลัมน์ (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) คือ 20,000 ± 100 (200,000 เพลท/ตร.ม.) ตารางที่ 3 แสดงค่า N สำหรับคอลัมน์ PMP ทั้งสาม และโครมาโตแกรมแสดงในรูปที่ 5A การวิเคราะห์อย่างรวดเร็วบนคอลัมน์ PMP ที่อัตราการไหลสูง (700 μL/min) สามารถชะล้างเปปไทด์ได้ห้าชนิดภายในหนึ่งนาที ค่า N ดีมาก คือ 13,500 ± 330 ต่อคอลัมน์ (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) ซึ่งสอดคล้องกับ 135,000 เพลท/ตร.ม. (รูปที่ 5B) คอลัมน์ขนาดเดียวกันสามคอลัมน์ (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) ถูกบรรจุด้วย ใช้เฟสคงที่ PMP สามล็อตที่แตกต่างกันเพื่อตรวจสอบความสามารถในการทำซ้ำ บันทึกความเข้มข้นของสารวิเคราะห์สำหรับแต่ละคอลัมน์โดยใช้สภาวะการชะล้างที่เหมาะสม จำนวนเพลทเชิงทฤษฎี N และเวลาการกักเก็บเพื่อแยกส่วนผสมทดสอบเดียวกันบนแต่ละคอลัมน์ ข้อมูลความสามารถในการทำซ้ำสำหรับคอลัมน์ PMP แสดงในตารางที่ 4 ความสามารถในการทำซ้ำของคอลัมน์ PMP สอดคล้องกับค่า %RSD ที่ต่ำมาก ดังแสดงในตารางที่ 3
การแยกส่วนผสมของเปปไทด์บนคอลัมน์ PMP (B) และคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (A); เฟสเคลื่อนที่ 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), ขนาดคอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน); ลำดับการชะล้างของสารประกอบ: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) และ 5 (leucine) กรดเอนเคฟาลิน))
คอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) ได้รับการประเมินเพื่อใช้ในการแยกสารย่อยโปรตีนอัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ด้วยเอนไซม์ทริปซินในโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง โครมาโทแกรมในรูปที่ 6 แสดงให้เห็นว่าตัวอย่างถูกแยกออกจากกันได้ดีและมีความละเอียดสูง การวิเคราะห์สารย่อย HSA ทำได้โดยใช้ความเร็วการไหล 100 µL/นาที เฟสเคลื่อนที่ 70/30 อะซีโตไนไตรล์/น้ำ และ 0.1% TFA ดังแสดงในโครมาโทแกรม (รูปที่ 6) สารย่อย HSA ถูกแยกออกเป็น 17 พีค ซึ่งสอดคล้องกับ 17 เปปไทด์ ประสิทธิภาพการแยกของแต่ละพีคในสารย่อย HSA ถูกคำนวณและค่าต่างๆ แสดงอยู่ในตารางที่ 5
นำ HSA (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) ที่ผ่านการย่อยด้วยทริปซินมาแยกบนคอลัมน์ PMP โดยใช้ความเร็วการไหล (100 µL/นาที) และเฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยอะซีโตไนไตรล์/น้ำ ในอัตราส่วน 60/40 ที่มี TFA 0.1%
โดยที่ L คือความยาวของคอลัมน์, η คือความหนืดของเฟสเคลื่อนที่, ΔP คือแรงดันย้อนกลับของคอลัมน์ และ u คือความเร็วเชิงเส้นของเฟสเคลื่อนที่ ค่าการซึมผ่านของคอลัมน์ PMP คือ 2.5 × 10⁻¹⁴ m² อัตราการไหลคือ 25 μL/min และใช้ ACN/น้ำ 60/40 v/v ค่าการซึมผ่านของคอลัมน์ PMP (100 × 1.8 mm id) คล้ายกับผลการศึกษาครั้งก่อนของเรา Ref.34 ค่าการซึมผ่านของคอลัมน์ที่บรรจุด้วยอนุภาคที่มีรูพรุนผิวเผินคือ: 1.7 × 10⁻¹⁵ สำหรับอนุภาคขนาด 1.3 μm, 3.1 × 10⁻¹⁵ สำหรับอนุภาคขนาด 1.7 μm, 5.2 × 10⁻¹⁵ และ 2.5 × 10⁻¹⁴ m² สำหรับอนุภาคขนาด 2.6 μm สำหรับอนุภาคขนาด 5 μm 43 ดังนั้น ความสามารถในการซึมผ่านของเฟส PMP นั้นคล้ายคลึงกับอนุภาคแกนเปลือกขนาด 5 ไมโครเมตร
โดยที่ Wx คือน้ำหนักของคอลัมน์ที่บรรจุคลอโรฟอร์ม, Wy คือน้ำหนักของคอลัมน์ที่บรรจุเมทานอล และ ρ คือความหนาแน่นของตัวทำละลาย ความหนาแน่นของเมทานอล (ρ = 0.7866) และคลอโรฟอร์ม (ρ = 1.484) ความพรุนรวมของคอลัมน์อนุภาคซิลิกา-C18 (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) 34 และคอลัมน์ C18-ยูเรีย 31 ที่เราศึกษาก่อนหน้านี้คือ 0.63 และ 0.55 ตามลำดับ ซึ่งหมายความว่าการมีอยู่ของลิแกนด์ยูเรียช่วยลดการซึมผ่านของเฟสคงที่ ในทางกลับกัน ความพรุนรวมของคอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) คือ 0.60 การซึมผ่านของคอลัมน์ PMP ต่ำกว่าคอลัมน์ที่บรรจุด้วยอนุภาคซิลิกาที่ยึดติด C18 เนื่องจากในเฟสคงที่ประเภท C18 นั้น C18 ลิแกนด์จะยึดติดกับอนุภาคซิลิกาในรูปของโซ่เชิงเส้น ในขณะที่ในเฟสคงที่ชนิดโพลีสไตรีน จะมีชั้นโพลีเมอร์ที่ค่อนข้างหนาเกิดขึ้นรอบๆ อนุภาค ในการทดลองทั่วไป ค่าความพรุนของคอลัมน์จะคำนวณได้ดังนี้:
รูปที่ 7A,B แสดงคอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) และคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) โดยใช้สภาวะการชะล้างเดียวกัน (เช่น 60/40 ACN/H2O และ 0.1% TFA) ของกราฟ van Deemter เตรียมส่วนผสมของเปปไทด์ที่เลือก (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ในปริมาณ 20 µL/นาที อัตราการไหลขั้นต่ำสำหรับทั้งสองคอลัมน์คือ 800 µL/นาที ค่า HETP ขั้นต่ำที่อัตราการไหลที่เหมาะสม (80 µL/นาที) สำหรับคอลัมน์ PMP และคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide คือ 2.6 µm และ 3.9 µm ตามลำดับ ค่า HETP บ่งชี้ว่าประสิทธิภาพการแยกของคอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) ดีกว่าคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide ที่มีจำหน่ายในเชิงพาณิชย์ (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) มาก กราฟ van Deemter ในรูปที่ 7(A) แสดงให้เห็นว่าการลดลงของค่า N เมื่ออัตราการไหลเพิ่มขึ้นนั้นไม่สำคัญเมื่อเทียบกับการศึกษาครั้งก่อนของเรา ประสิทธิภาพการแยกที่สูงกว่าของคอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) เมื่อเทียบกับคอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide เกิดจากการปรับปรุงรูปร่าง ขนาด และขั้นตอนการบรรจุคอลัมน์ที่ซับซ้อนที่ใช้ในงานวิจัยปัจจุบัน34
(A) กราฟ van Deemter (HETP เทียบกับความเร็วเชิงเส้นของเฟสเคลื่อนที่) ที่ได้จากการใช้คอลัมน์ PMP (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) ใน ACN/H2O 60/40 ที่มี TFA 0.1% (B) กราฟ van Deemter (HETP เทียบกับความเร็วเชิงเส้นของเฟสเคลื่อนที่) ที่ได้จากการใช้คอลัมน์ Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 มม. เส้นผ่านศูนย์กลางภายใน) ใน ACN/H2O 60/40 ที่มี TFA 0.1%
ได้มีการเตรียมและประเมินเฟสคงที่โพลีสไตรีนฝังขั้ว (PMP) สำหรับการแยกส่วนผสมของเปปไทด์สังเคราะห์และสารย่อยโปรตีนอัลบูมินในซีรั่มของมนุษย์ (HAS) ด้วยเอนไซม์ทริปซินในโครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูง ประสิทธิภาพการแยกสารผสมเปปไทด์ของคอลัมน์ PMP นั้นยอดเยี่ยมทั้งในด้านประสิทธิภาพการแยกและความละเอียด ประสิทธิภาพการแยกที่ดีขึ้นของคอลัมน์ PMP เกิดจากหลายสาเหตุ เช่น ขนาดอนุภาคและขนาดรูพรุนของอนุภาคซิลิกา การสังเคราะห์เฟสคงที่แบบควบคุม และการบรรจุคอลัมน์ที่ซับซ้อน นอกจากประสิทธิภาพการแยกสูงแล้ว แรงดันย้อนกลับของคอลัมน์ต่ำที่อัตราการไหลสูงยังเป็นข้อดีอีกประการหนึ่งของเฟสคงที่นี้ คอลัมน์ PMP แสดงให้เห็นถึงความสามารถในการทำซ้ำที่ดีและสามารถใช้สำหรับการวิเคราะห์ส่วนผสมของเปปไทด์และสารย่อยโปรตีนต่างๆ ด้วยเอนไซม์ทริปซิน เราตั้งใจที่จะใช้คอลัมน์นี้สำหรับการแยกผลิตภัณฑ์จากธรรมชาติ สารประกอบออกฤทธิ์ทางชีวภาพจากพืชสมุนไพร และสารสกัดจากเชื้อราในโครมาโทกราฟีของเหลว ในอนาคต คอลัมน์ PMP จะได้รับการประเมินสำหรับการแยกโปรตีนและโมโนโคลนอลแอนติบอดีด้วย
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. การวิจัยเกี่ยวกับระบบการแยกเปปไทด์โดยโครมาโทกราฟีเฟสผกผัน ตอนที่ 1: การพัฒนาโปรโตคอลการกำหนดลักษณะคอลัมน์ J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. และคณะ เปปไทด์ออกฤทธิ์ที่ได้รับการปรับปรุงซึ่งออกแบบมาเพื่อการรักษาโรคติดเชื้อ เทคโนโลยีชีวภาพขั้นสูง 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018)
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. เปปไทด์บำบัดสังเคราะห์: วิทยาศาสตร์และตลาดการค้นพบยา 15 (1-2) วันนี้ 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010)
Xie, F., Smith, RD และ Shen, Y. โครมาโทกราฟีของเหลวโปรตีโอมิกส์ขั้นสูง J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. และคณะ โครมาโทกราฟีของเหลวขั้นสูง-แมสสเปกโทรเมตรีช่วยให้สามารถรวมเมตาโบโลมิกส์และโปรตีโอมิกส์ที่กำหนดเป้าหมายได้อย่างกว้างขวาง Anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019)
Chesnut, SM & Salisbury, JJ บทบาทของ UHPLC ในการพัฒนายา J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007)
Wu, N. & Clausen, AM แง่มุมพื้นฐานและเชิงปฏิบัติของโครมาโทกราฟีของเหลวความดันสูงพิเศษสำหรับการแยกอย่างรวดเร็ว J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007)
Wren, SA & Tchelitcheff, P. การประยุกต์ใช้โครมาโทกราฟีของเหลวประสิทธิภาพสูงพิเศษในการพัฒนายา J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006)
Gu, H. และคณะ ไฮโดรเจลมาโครพอรัสแบบโมโนลิธิกที่เตรียมจากอิมัลชันน้ำมันในน้ำที่มีเฟสภายในสูงเพื่อการทำให้บริสุทธิ์ของเอนเทอโรไวรัสอย่างมีประสิทธิภาพ Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020)
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA บทบาทของโครมาโทกราฟีของเหลวในโปรตีโอมิกส์ J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004)
Fekete, S., Veuthey, J.-L. และ Guillarme, D. แนวโน้มที่เกิดขึ้นใหม่ในการแยกเปปไทด์และโปรตีนบำบัดด้วยโครมาโทกราฟีของเหลวแบบย้อนกลับ: ทฤษฎีและการประยุกต์ใช้ วารสารเภสัชศาสตร์ วิทยาศาสตร์ชีวการแพทย์ ทวารหนัก 69, 9-27 (2012)
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC การแยกเปปไทด์แบบสองมิติโดยใช้ระบบ RP-RP-HPLC โดยใช้ค่า pH ที่แตกต่างกันในมิติการแยกแรกและมิติการแยกที่สอง J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005)
Feletti, S. และคณะ ได้ทำการศึกษาลักษณะการถ่ายโอนมวลและประสิทธิภาพจลนศาสตร์ของคอลัมน์โครมาโทกราฟีประสิทธิภาพสูงที่บรรจุด้วยอนุภาคพรุน C18 ขนาดเล็กกว่า 2 μm ทั้งแบบเต็มและแบบผิว J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020)
Piovesana, S. et al.แนวโน้มล่าสุดและความท้าทายในการวิเคราะห์ในการแยก การระบุ และการตรวจสอบความถูกต้องของเปปไทด์ที่มีฤทธิ์ทางชีวภาพของพืช anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018)
Mueller, JB และคณะ ภูมิทัศน์โปรตีโอมิกส์ของอาณาจักรแห่งชีวิต Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020)
DeLuca, C. และคณะ การประมวลผลขั้นปลายของเปปไทด์บำบัดโดยโครมาโทกราฟีของเหลวแบบเตรียม Molecule (Basel, Switzerland) 26(15), 4688(2021)
Yang, Y. & Geng, X. โครมาโทกราฟีแบบผสมและการประยุกต์ใช้กับไบโอพอลิเมอร์ J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011)
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. ลิแกนด์สำหรับโครมาโทกราฟีโปรตีนแบบผสม: หลักการ ลักษณะเฉพาะ และการออกแบบ J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009)