Köszönjük, hogy felkereste a Nature.com weboldalt. Az Ön által használt böngészőverzió korlátozottan támogatja a CSS-t. A legjobb élmény érdekében javasoljuk, hogy használjon egy frissített böngészőt (vagy kapcsolja ki a kompatibilitási módot az Internet Explorerben). Időközben a folyamatos támogatás biztosítása érdekében stílusok és JavaScript nélkül jelenítjük meg az oldalt.
A porózus szilícium-dioxid részecskéket szol-gél módszerrel állították elő, némi módosítással a makroporózus részecskék előállítása érdekében. Ezeket a részecskéket reverzibilis addíciós fragmentációs láncátviteli (RAFT) polimerizációval N-fenilmaleimid-metilvinilizocianáttal (PMI) és sztirollal derivatizálták, hogy előállítsák a polisztirol (PMP) állófázis N-fenilmaleimid interkalációját. Keskeny furatú rozsdamentes acél oszlopokat (100 × 1,8 mm belső átmérő) szuszpenziós töltettel töltöttek. Öt peptidből (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin) álló peptidkeverék PMP oszlopos elválasztását értékelték (kromatográfiás teljesítmény) és humán szérumalbumin (HAS) tripszinnel történő emésztését. Optimális elúciós körülmények között a peptidkeverék elméleti lemezszáma elérheti a 280 000 lemez/m²-t. A kifejlesztett oszlop elválasztási teljesítményét a kereskedelmi forgalomban kapható Ascentis Express RP-Amide oszloppal összehasonlítva... megfigyelték, hogy a PMP oszlop elválasztási teljesítménye az elválasztási hatékonyság és a felbontás tekintetében jobb volt a kereskedelmi forgalomban kapható oszlopnál.
Az utóbbi években a biofarmakológiai ipar egyre bővülő globális piaccá vált, jelentősen megnőtt piaci részesedéssel. A biofarmakológiai ipar robbanásszerű növekedésével1,2,3 a peptidek és fehérjék elemzése rendkívül igényes. A célpeptid mellett számos szennyeződés keletkezik a peptidszintézis során, így a kívánt tisztaságú peptidek előállításához kromatográfiás tisztításra van szükség. A testnedvekben, szövetekben és sejtekben található fehérjék elemzése és jellemzése rendkívül kihívást jelentő feladat az egyetlen mintában potenciálisan kimutatható nagyszámú faj miatt. Bár a tömegspektrometria hatékony eszköz a peptid- és fehérjeszekvenáláshoz, ha az ilyen mintákat egyetlen menetben injektálják a tömegspektrométerbe, az elválasztás nem lesz ideális. Ez a probléma enyhíthető folyadékkromatográfiás (LC) elválasztással az MS-analízis előtt, ami csökkenti a tömegspektrométerbe egy adott időpontban belépő analitok számát4,5,6. Ezenkívül a folyadékfázisú elválasztás során az analitok szűk régiókban fókuszálhatók, ezáltal koncentrálva ezeket az analitokat és javítva az MS-detektálás érzékenységét. A folyadékkromatográfia (LC) az elmúlt évtizedben jelentősen fejlődött, és népszerű technikává vált a proteomikai analízisben. elemzés7,8,9,10.
A fordított fázisú folyadékkromatográfiát (RP-LC) széles körben alkalmazzák peptidkeverékek tisztítására és szétválasztására, oktadecil-módosított szilícium-dioxidot (ODS) használva állófázisként11,12,13. Az RP állófázisok azonban komplex szerkezetük és amfifil jellegük miatt nem biztosítják a peptidek és fehérjék kielégítő elválasztását 14,15. Ezért speciálisan tervezett állófázisokra van szükség a poláris és nem poláris részekkel rendelkező peptidek és fehérjék elemzéséhez, hogy kölcsönhatásba lépjenek ezekkel az analitokkal és megtartsák azokat16. A vegyes módú kromatográfia, amely multimodális kölcsönhatásokat biztosít, alternatívája lehet az RP-LC-nek a peptidek, fehérjék és más komplex keverékek szétválasztásában. Számos vegyes módú állófázist készítettek, és ezekkel a fázisokkal töltött oszlopokat használtak peptid- és fehérjeszétválasztásra17,18,19,20,21. A vegyes módú állófázisok (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, poláris interkaláció/RPLC) alkalmasak peptid- és fehérjeszétválasztásra, mivel mind poláris, mind nem poláris részeket tartalmaznak. csoportok22,23,24,25,26,27,28. Hasonlóképpen, a kovalensen kötött poláris csoportokkal rendelkező poláris interkalációs állófázisok jó elválasztási teljesítményt és egyedi szelektivitást mutatnak a poláris és nem poláris analitok esetében, mivel az elválasztás az analit és az állófázis közötti kölcsönhatástól függ. Multimodális kölcsönhatások 29, 30, 31, 32. Nemrégiben Zhang és munkatársai 30 egy dodecil-terminális poliamin állófázist állítottak elő, és sikeresen elválasztottak szénhidrogéneket, antidepresszánsokat, flavonoidokat, nukleozidokat, ösztrogéneket és számos más analitot. A poláris interkalátor poláris és nem poláris csoportokkal is rendelkezik, így felhasználható olyan peptidek és fehérjék elválasztására, amelyek hidrofób és hidrofil részeket is tartalmaznak. A polárisan beágyazott oszlopok (pl. amidba ágyazott C18 oszlopok) kereskedelmi forgalomban kaphatók Ascentis Express RP-Amide oszlopok márkanéven, de ezeket az oszlopokat csak a 33-as amin elemzésére használják.
A jelenlegi vizsgálatban egy polárisan beágyazott állófázist (N-fenilmaleimidbe ágyazott polisztirol) készítettünk, és értékeltük a HSA peptidek és tripszinnel emésztett termékeinek elválasztását. Az állófázist a következő stratégiával állítottuk elő. A porózus szilícium-dioxid-részecskéket a korábbi publikációnkban leírt eljárás szerint állítottuk elő, az előállítási protokoll néhány módosításával. A karbamid, polietilénglikol (PEG), TMOS, víz-ecetsav arányát úgy állítottuk be, hogy nagy pórusméretű szilícium-dioxid-részecskéket kapjunk. Másodszor, egy új ligandumot, a fenilmaleimid-metil-vinil-izocianátot szintetizáltuk, és szilícium-dioxid-részecskék derivatizálására használtuk fel egy polárisan beágyazott állófázis előállításához. A kapott állófázist egy rozsdamentes acél oszlopba (100 × 1,8 mm belső átmérőjű) töltöttük az optimalizált tölteti séma szerint. Az oszloptöltést mechanikai vibrációval segítettük, hogy homogén ágy alakuljon ki az oszlopon belül. Értékeljük az öt peptidből álló peptidkeverékek töltött oszlopos elválasztását; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-enkefalin) és tripszinnel emésztett humán szérumalbumin (HAS). A peptidkeverék és a HSA tripszinnel emésztett változata jó felbontással és hatékonysággal szeparálódott. A PMP oszlop elválasztási teljesítményét az Ascentis Express RP-Amide oszlopéval hasonlították össze. Mind a peptidek, mind a fehérjék jól elválasztódtak és hatékonyak voltak a PMP oszlopon, amely hatékonyabb volt, mint az Ascentis Express RP-Amide oszlop.
PEG (polietilénglikol), karbamid, ecetsav, trimetoxi-ortoszilikát (TMOS), trimetil-klórszilán (TMCS), tripszin, humán szérumalbumin (HSA), ammónium-klorid, karbamid, hexán-metildiszilazán (HMDS), metakriloil-klorid (MC), sztirol, 4-hidroxi-TEMPO, benzoil-peroxid (BPO), HPLC minőségű acetonitril (ACN), metanol, 2-propanol és aceton. Beszerzési forrás: Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
8 g karbamid, 8 g polietilénglikol és 8 ml 0,01 N ecetsav elegyét 10 percig kevertettük, majd jéghideg körülmények között 24 ml TMOS-t adtunk hozzá. A reakcióelegyet 6 órán át 40 °C-on, majd 8 órán át 120 °C-on melegítettük rozsdamentes acél autoklávban. A vizet leöntöttük, és a maradék anyagot 12 órán át 70 °C-on szárítottuk. A szárított puha masszát kemencében simára őröltük, majd 12 órán át 550 °C-on kalcináltuk. Három tételt készítettünk el és jellemeztünk a részecskeméret, a pórusméret és a felület reprodukálhatóságának vizsgálata céljából.
Szilícium-dioxid részecskék felületmódosításával, előre szintetizált fenilmaleimid-metilvinilizocianát (PCMP) ligandummal, majd sztirollal végzett radiális polimerizációval egy poláris csoportot tartalmazó vegyületet állítottak elő. Stacioner fázis aggregátumokhoz és polisztirol láncokhoz. Az előállítási folyamatot az alábbiakban ismertetjük.
200 mg N-fenilmaleimidet és 100 mg metil-vinil-izocianátot oldottunk fel száraz toluolban, majd 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitrilt (AIBN) adtunk a reakcióedényhez, így fenilmaleimid-metil-vinil-izocianát kopolimert (PMCP) kaptunk. Az elegyet 3 órán át 60 °C-on melegítettük, majd szűrtük és 40 °C-on 3 órán át szárítottuk kemencében.
Szárított szilícium-dioxid részecskéket (2 g) diszpergáltunk száraz toluolban (100 ml), kevertettük és ultrahanggal kezeltük egy 500 ml-es gömblombikban 10 percig. PMCP-t (10 mg) oldottunk toluolban, és cseppentőtölcséren keresztül cseppenként adtuk a reakcióedénybe. Az elegyet 100 °C-on 8 órán át refluxáltuk, majd szűrtük, acetonnal mostuk, és 60 °C-on 3 órán át szárítottuk. Ezután PMCP-hez kötött szilícium-dioxid részecskéket (100 g) oldottunk toluolban (200 ml), és 4-hidroxi-TEMPO-t (2 ml) adtunk hozzá 100 µl dibutil-ón-dilaurát katalizátor jelenlétében. Az elegyet 50 °C-on 8 órán át kevertettük, szűrtük és 50 °C-on 3 órán át szárítottuk.
Sztirolt (1 ml), benzoil-peroxidot (BPO) (0,5 ml) és TEMPO-PMCP-hez kapcsolt szilícium-dioxid részecskéket (1,5 g) diszpergáltunk toluolban, majd nitrogénnel öblítettük át. A sztirol polimerizációját 100 °C-on 12 órán át végeztük. A kapott terméket metanollal mostuk, majd 60 °C-on egy éjszakán át szárítottuk. A teljes reakcióvázlat az 1. ábrán látható.
A mintákat 393 K-en 1 órán át gáztalanították, hogy a maradék nyomás 10-3 Torr alatt legyen. A teljes pórustérfogat meghatározására a P/P0 = 0,99 relatív nyomáson adszorbeált N2 mennyiségét használták. A csupasz és ligandumkötésű szilícium-dioxid-részecskék morfológiáját pásztázó elektronmikroszkóppal (Hitachi High Technologies, Tokió, Japán) vizsgálták. A szárított mintákat (csupasz szilícium-dioxid és ligandumkötésű szilícium-dioxid-részecskék) alumínium oszlopra helyezték öntapadó szénszalag segítségével. A mintákat Q150T porlasztásos bevonatolóval aranyozták, és egy 5 nm-es Au réteget vittek fel a mintákra. Ez javítja a folyamat hatékonyságát alacsony feszültségek használata esetén, és finomszemcsés, hideg porlasztást biztosít. Az elemanalízishez Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 elemanalizátort használtak. A részecskeméret-eloszlás meghatározásához Malvern (Worcestershire, Egyesült Királyság) Mastersizer 2000 részecskeméret-analizátort használtak. Csupasz szilícium-dioxid-részecskék és ligandumkötésű szilícium-dioxid-részecskék (5 mg/db) 5 ml izopropanolban diszpergáltunk, 10 percig ultrahanggal kezeltük, 5 percig vortexeltük, majd a Mastersizer optikai padjára helyeztük. A termogravimetriás analízist percenként 5 °C sebességgel végeztük 30 és 800 °C közötti hőmérsékleten.
A 100 × 1,8 mm belső átmérőjű, üvegbélésű, keskeny furatú, rozsdamentes acél oszlopokat szuszpenziós csomagolási módszerrel töltöttük meg, a hivatkozásban leírtak szerint. 31. Egy rozsdamentes acél oszlopot (üvegbélésű, 100 × 1,8 mm belső átmérőjű), amelynek kimeneti csatlakozója 1 µm-es frittet tartalmazott, egy szuszpenziós csomagológéphez (Alltech Deerfield, IL, USA) csatlakoztattunk. Készítsünk állófázisú szuszpenziót úgy, hogy 150 mg állófázist szuszpendálunk 1,2 ml metanolban, és küldjük a tárolóoszlopba. A metanolt szuszpenziós oldószerként, valamint hajtóoldószerként használtuk. Az oszlopot egymás után töltsük fel 100 MP nyomással 10 percig, 80 MP nyomással 15 percig, és 60 MP nyomással 30 percig. A feltöltés során mechanikai vibrációt alkalmaztunk két GC oszloprázóval (Alltech, Deerfield, IL, USA) az oszlop egyenletes feltöltésének biztosítása érdekében. Zárjuk le a szuszpenziós csomagológépet, és lassan engedjük ki a nyomást, hogy elkerüljük az oszlop belsejében bekövetkező károsodást. Válasszuk le az oszlopot a szuszpenziós csomagológépről, és csatlakoztassunk egy másik csatlakozót a bemenethez és az LC rendszerhez a teljesítményének ellenőrzéséhez.
Egy LC pumpát (10AD Shimadzu, Japán), injektort (Valco (USA) C14 W.05) 50nL-es befecskendező hurokkal, membrán gáztalanítót (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapilláris ablakot, speciális µLC eszközt, detektort (UV-2075) és üvegbélésű mikrooszlopokat használtak. Nagyon keskeny és rövid összekötő csöveket használtak az oszlopsáv extra kiszélesedésének hatásának minimalizálása érdekében. A csomagolás után kapillárisokat (50 μm belső átmérő 365) és redukáló kapillárisokat (50 μm) szereltek a redukáló kapilláris 1/16″-es kimenetére. Az adatgyűjtést és a kromatográfiás feldolgozást Multichro 2000 szoftverrel végezték. Monitorozás 254 nm-en. Az analitokat UV-abszorbanciára tesztelték. A kromatográfiás adatokat OriginPro8 (Northampton, MA) segítségével elemezték.
Humán szérumból származó albumin, liofilizált por, ≥ 96% (agaróz gélelektroforézis) 3 mg tripszinnel (1,5 mg), 4,0 M karbamiddal (1 ml) és 0,2 M ammónium-hidrogén-karbonáttal (1 ml) összekeverve. Az oldatot 10 percig kevertük, majd 6 órán át 37°C-os vízfürdőben tartottuk, végül 1 ml 0,1%-os TFA-val leállítottuk a reakciót. Az oldatot szűrtük, és 4°C alatt tároltuk.
A peptidkeverékek és a HSA tripszinnel emésztett termékek elválasztását külön-külön értékeltük PMP oszlopokon. Ellenőriztük a peptidkeverék és a HSA tripszinnel emésztett termékének elválasztását a PMP oszlopon, és összehasonlítottuk az eredményeket az Ascentis Express RP-Amide oszlop eredményeivel. Az elméleti tányérszámot a következőképpen számítottuk ki:
A csupasz szilícium-dioxid-részecskék és a ligandummal kötött szilícium-dioxid-részecskék pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képei a 2. ábrán láthatók. A csupasz szilícium-dioxid-részecskék (A, B) pásztázó elektronmikroszkópos (SEM) képei azt mutatják, hogy a korábbi vizsgálatainkkal ellentétben ezek a részecskék gömb alakúak, megnyúltak vagy szabálytalan szimmetriájúak. A ligandummal kötött szilícium-dioxid-részecskék (C, D) felülete simább, mint a csupasz szilícium-dioxid-részecskéké, ami a szilícium-dioxid-részecskék felületén lévő polisztirolláncok bevonatának tudható be.
Csupasz szilícium-dioxid-részecskék (A, B) és ligandummal kötött szilícium-dioxid-részecskék (C, D) pásztázó elektronmikroszkópos képei.
A csupasz szilícium-dioxid-részecskék és a ligandumkötésű szilícium-dioxid-részecskék részecskeméret-eloszlását a 3(A) ábra mutatja. A térfogatalapú részecskeméret-eloszlás görbék azt mutatták, hogy a szilícium-dioxid-részecskék mérete a kémiai módosítás után megnőtt (3A. ábra). A jelenlegi és az előző vizsgálatból származó szilícium-dioxid-részecskék részecskeméret-eloszlási adatait az 1(A) táblázat hasonlítja össze. A PMP térfogatalapú részecskemérete, d(0,5), 3,36 μm, szemben a korábbi vizsgálatunkban szereplő 3,05 μm-es ad(0,5) értékkel (polisztirolhoz kötött szilícium-dioxid-részecskék)34. Ennek a tételnek a részecskeméret-eloszlása ​​szűkebb volt a korábbi vizsgálatunkhoz képest a PEG, karbamid, TMOS és ecetsav változó arányai miatt a reakcióelegyben. A PMP fázis részecskemérete valamivel nagyobb, mint a korábban vizsgált polisztirolhoz kötött szilícium-dioxid-részecske fázisé. Ez azt jelenti, hogy a szilícium-dioxid-részecskék sztirollal történő felületi funkcionalizálása csak egy polisztirol réteget (0,97 µm) rakott le a szilícium-dioxid felületére, míg a PMP fázisban a rétegvastagság 1,38 µm volt.
A csupasz szilícium-dioxid-részecskék és a ligandumhoz kötött szilícium-dioxid-részecskék részecskeméret-eloszlása ​​(A) és pórusméret-eloszlása ​​(B).
A jelenlegi vizsgálatban szereplő szilícium-dioxid-részecskék pórusméretét, pórustérfogatát és felületét az 1. táblázat (B) mutatja. A csupasz szilícium-dioxid-részecskék és a ligandumkötésű szilícium-dioxid-részecskék PSD-profiljait a 3. ábra (B) mutatja. Az eredmények összehasonlíthatók a korábbi tanulmányunkkal. A csupasz és a ligandumkötésű szilícium-dioxid-részecskék pórusmérete 310, illetve 241, ami azt jelzi, hogy a pórusméret 69%-kal csökken a kémiai módosítás után, amint azt az 1. táblázat (B) mutatja, a görbe változását pedig a 3. ábra (B) mutatja. Hasonlóképpen, a szilícium-dioxid-részecskék pórustérfogata a kémiai módosítás után 0,67-ről 0,58 cm3/g-ra csökkent. A jelenleg vizsgált szilícium-dioxid-részecskék fajlagos felülete 116 m2/g, ami összehasonlítható a korábbi tanulmányunkkal (124 m2/g). Amint az 1. táblázat (B) mutatja, a szilícium-dioxid-részecskék felülete (m2/g) szintén 116 m2/g-ról 105 m2/g-ra csökkent a módosítás után. kémiai módosítás.
Az állófázis elemanalízisének eredményeit a 2. táblázat mutatja. A jelenlegi állófázis széntartalma 6,35%, ami alacsonyabb, mint a korábbi tanulmányunkban mért széntartalom (polisztirolhoz kötött szilícium-dioxid részecskék, 7,93%35, illetve 10,21%)42. A jelenlegi állófázis széntartalma alacsony, mivel a jelenlegi SP előállításánál a sztirol mellett néhány poláris ligandumot, például fenilmaleimid-metilvinilizocianátot (PCMP) és 4-hidroxi-TEMPO-t is használtak. A jelenlegi állófázis nitrogéntartalma 2,21%, szemben a korábbi tanulmányokban mért 0,1735, illetve 0,85 tömeg%-os nitrogéntartalommal. Ez azt jelenti, hogy a nitrogén tömegszázaléka magasabb a jelenlegi állófázisban a fenilmaleimid miatt. Hasonlóképpen, a (4) és (5) termékek széntartalma 2,7%, illetve 2,9% volt, míg a (6) végtermék széntartalma... 6,35%, amint az a 2. táblázatban látható. A tömegveszteséget PMP állófázissal ellenőriztük, a TGA-görbét a 4. ábra mutatja. A TGA-görbe 8,6%-os tömegveszteséget mutat, ami jó egyezést mutat a széntartalommal (6,35%), mivel a ligandumok nemcsak C-t, hanem N-t, O-t és H-t is tartalmaznak.
A fenilmaleimid-metilvinilizocianát ligandumot választottuk a szilícium-dioxid részecskék felületmódosítására, mivel poláris fenilmaleimid- és vinilizocianát-csoportokat tartalmaz. A vinilizocianát-csoportok élő gyökös polimerizációval reagálhatnak sztirollal. A második ok egy olyan csoport beillesztése, amely mérsékelt kölcsönhatásban van az analittal, és nincs erős elektrosztatikus kölcsönhatás az analit és az állófázis között, mivel a fenilmaleimid-résznek nincs virtuális töltése normál pH-n. Az állófázis polaritása a sztirol optimális mennyiségével és a szabadgyökös polimerizáció reakcióidejével szabályozható. A reakció utolsó lépése (szabadgyökös polimerizáció) kritikus, és megváltoztathatja az állófázis polaritását. Elemanalízist végeztünk ezen állófázisok széntartalmának ellenőrzésére. Megfigyeltük, hogy a sztirol mennyiségének és a reakcióidőnek a növelése növelte az állófázis széntartalmát, és fordítva. A különböző sztirolkoncentrációkkal előállított SP-k eltérő széntartalommal rendelkeznek. Ismét betöltjük ezeket az állófázisokat rozsdamentes acél oszlopokba, és ellenőrizzük kromatográfiás teljesítményüket (szelektivitás, felbontás, N-érték stb.). Ezen kísérletek alapján egy A PMP állófázis előkészítéséhez optimalizált készítményt választottak a szabályozott polaritás és a jó analit-visszatartás biztosítása érdekében.
Öt peptidkeveréket (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucin-enkefalin) is értékeltek PMP oszlopon mozgófázis segítségével; 60/40 (v/v) acetonitril/víz (0,1% TFA) 80 μl/perc áramlási sebességgel. Optimális eluálási körülmények között az elméleti tányérszám (N) oszloponként (100 × 1,8 mm belső átmérő) 20 000 ± 100 (200 000 lemez/m²). A 3. táblázat a három PMP oszlop N értékeit mutatja, a kromatogramokat pedig az 5A. ábra mutatja. Gyors analízis PMP oszlopon nagy áramlási sebességgel (700 μl/perc), öt peptid eluálódott egy percen belül, az N értékek nagyon jók voltak, 13 500 ± 330 oszloponként (100 × 1,8 mm belső átmérő), ami 135 000 lemez/m-nek felel meg (5B. ábra). Három azonos méretű oszlopot (100 × 1,8 mm belső átmérő) három különböző tételű PMP állófázissal töltöttünk meg a reprodukálhatóság ellenőrzése érdekében. Az analit Az egyes oszlopok koncentrációját az optimális elúciós körülmények, valamint az egyes oszlopokon azonos tesztkeverék elválasztásához szükséges elméleti tányérok száma (N) és retenciós idő alkalmazásával rögzítettük. A PMP oszlopok reprodukálhatósági adatait a 4. táblázat mutatja. A PMP oszlop reprodukálhatósága jól korrelál a nagyon alacsony %RSD értékekkel, amint azt a 3. táblázat mutatja.
Peptidkeverék szétválasztása PMP oszlopon (B) és Ascentis Express RP-Amide oszlopon (A); mozgófázis 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP oszlop méretei (100 × 1,8 mm belső átmérő); analitikai A vegyületek eluálási sorrendje: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) és 5 (leucin) (savas enkefalin).
Egy PMP oszlopot (100 × 1,8 mm belső átmérő) értékeltek humán szérumalbumin tripszinnel emésztett termékeinek elválasztására nagy teljesítményű folyadékkromatográfiával. A 6. ábrán látható kromatogram azt mutatja, hogy a minta jól elválik, és a felbontás nagyon jó. A HSA emésztett termékeket 100 µL/perc áramlási sebességgel, 70/30 acetonitril/víz mozgófázissal és 0,1% TFA-val elemezték. Amint a kromatogramon (6. ábra) látható, a HSA emésztést 17 csúcsra osztották, amelyek 17 peptidnek felelnek meg. Kiszámították a HSA emésztett termék minden csúcsának elválasztási hatékonyságát, és az értékeket az 5. táblázat tartalmazza.
A HSA (100 × 1,8 mm belső átmérőjű) tripszinnel emésztett változatát PMP oszlopon választottuk el; áramlási sebesség (100 µL/perc), mozgófázis 60/40 acetonitril/víz 0,1% TFA-val.
ahol L az oszlop hossza, η a mozgófázis viszkozitása, ΔP az oszlop ellennyomása, u pedig a mozgófázis lineáris sebessége. A PMP oszlop permeabilitása 2,5 × 10-14 m2, az áramlási sebesség 25 μL/perc volt, és 60/40 v/v ACN/víz elegyet használtunk. A PMP oszlop (100 × 1,8 mm belső átmérőjű) permeabilitása hasonló volt a korábbi, 34. hivatkozásban említett tanulmányunkban szereplőhöz. A felületesen porózus részecskékkel töltött oszlop permeabilitása: 1,7 × 10-15 az 1,3 μm-es részecskék esetében, 3,1 × 10-15 az 1,7 μm-es részecskék esetében, 5,2 × 10-15 és 2,5 × 10-14 m2 a 2,6 μm-es részecskék esetében. 5 μm-es részecskék esetében 43. Ezért a PMP fázis permeabilitása hasonló az 5 μm-es mag-héj részecskék permeabilitásához.
ahol Wx a kloroformmal töltött oszlop tömege, Wy a metanollal töltött oszlop tömege, ρ pedig az oldószer sűrűsége. A metanol (ρ = 0,7866) és a kloroform (ρ = 1,484) sűrűsége. A korábban vizsgált SILICA ARTICLES-C18 oszlopok (100 × 1,8 mm belső átmérő) 34 és C18-Urea oszlopok 31 teljes porozitása 0,63, illetve 0,55 volt. Ez azt jelenti, hogy a karbamid ligandumok jelenléte csökkenti az állófázis permeabilitását. Másrészt a PMP oszlop (100 × 1,8 mm belső átmérő) teljes porozitása 0,60. A PMP oszlopok permeabilitása alacsonyabb, mint a C18-kötésű szilícium-dioxid részecskékkel töltött oszlopoké, mivel a C18 típusú állófázisokban a C18 ligandumok lineáris láncokként kapcsolódnak a szilícium-dioxid részecskékhez, míg a polisztirol típusú állófázisokban viszonylag vastag polimer réteg képződik körülötte. Egy Egy tipikus kísérletben az oszlop porozitását a következőképpen számítjuk ki:
A 7A és 7B ábrák a van Deemter-diagram PMP oszlopát (100 × 1,8 mm belső átmérő) és Ascentis Express RP-Amide oszlopát (100 × 1,8 mm belső átmérő) mutatják azonos elúciós körülmények (azaz 60/40 ACN/H2O és 0,1% TFA) mellett. A kiválasztott peptidkeverékeket (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-enkefalin) 20 µL/perc térfogatban készítettük el. Mindkét oszlop minimális áramlási sebessége 800 µL/perc. A PMP oszlop és az Ascentis Express RP-Amide oszlop optimális áramlási sebességénél (80 µL/perc) a minimális HETP-értékek 2,6 µm, illetve 3,9 µm voltak. A HETP-értékek azt mutatják, hogy a PMP oszlop (100 × 1,8 mm belső átmérőjű) elválasztási hatékonysága sokkal jobb, mint a kereskedelmi forgalomban kapható Ascentis Express RP-Amide oszlopé (100 × 1,8 mm belső átmérőjű). A 7(A) ábrán látható van Deemter-diagram azt mutatja, hogy az N érték csökkenése a növekvő áramlással nem szignifikáns a korábbi tanulmányunkhoz képest. A PMP oszlop (100 × 1,8 mm belső átmérőjű) magasabb elválasztási hatékonysága a korábbihoz képest... Az Ascentis Express RP-Amide oszlophoz való csatlakozás a jelenlegi munkában alkalmazott részecskeforma, -méret és összetett oszloptöltési eljárások fejlesztésén alapul34.
(A) van Deemter-diagram (HETP vs. mozgófázis lineáris sebesség), PMP oszloppal (100 × 1,8 mm belső átmérőjű) 60/40 ACN/H2O elegyben 0,1% TFA-val felvéve. (B) van Deemter-diagram (HETP vs. mozgófázis lineáris sebesség), Ascentis Express RP-Amide oszloppal (100 × 1,8 mm belső átmérőjű) 60/40 ACN/H2O elegyben 0,1% TFA-val felvéve.
Egy polárisan beágyazott polisztirol állófázist készítettünk és értékeltünk szintetikus peptidkeverékek és humán szérumalbumin (HAS) tripszinnel emésztett termékeinek nagy teljesítményű folyadékkromatográfiás elválasztására. A PMP oszlopok peptidkeverékek kromatográfiás teljesítménye kiváló az elválasztási hatékonyság és a felbontás tekintetében. A PMP oszlopok jobb elválasztási teljesítménye számos oknak köszönhető, mint például a szilícium-dioxid-részecskék részecskemérete és pórusmérete, az állófázis szabályozott szintézise és az összetett oszloptöltés. A magas elválasztási hatékonyság mellett az alacsony oszlop-ellennyomás nagy áramlási sebességeknél ennek az állófázisnak a további előnye. A PMP oszlopok jó reprodukálhatóságot mutatnak, és peptidkeverékek elemzésére és különféle fehérjék tripszinnel emésztésére használhatók. Ezt az oszlopot természetes termékek, gyógynövényekből származó bioaktív vegyületek és gombakivonatok elválasztására tervezzük folyadékkromatográfiában. A jövőben a PMP oszlopokat fehérjék és monoklonális antitestek elválasztására is értékelni fogjuk.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. és Petersson, P. Peptidszétválasztó rendszerek kutatása fordított fázisú kromatográfiával I. rész: Oszlopjellemzési protokoll kidolgozása. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. és munkatársai. Továbbfejlesztett aktív peptidek fertőző betegségek kezelésére. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. és Khrestchatisky, M. Szintetikus terápiás peptidek: tudomány és a piac. Gyógyszerkutatás. 15 (1-2) ma, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD és Shen, Y. Fejlett proteomikus folyadékkromatográfia. J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. A fejlett folyadékkromatográfia-tömegspektrometria lehetővé teszi a széles körben célzott metabolomika és proteomika beépítését. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM és Salisbury, JJ Az UHPLC szerepe a gyógyszerfejlesztésben. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. és Clausen, AM Az ultra nagynyomású folyadékkromatográfia alapvető és gyakorlati vonatkozásai gyors elválasztáshoz. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA és Tchelitcheff, P. Ultra nagy teljesítményű folyadékkromatográfia alkalmazása a gyógyszerfejlesztésben. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. és munkatársai. Monolitikus makroporózus hidrogélek, olaj-a-vízben tenyésztett, nagy belső fázisú emulziókból előállítva enterovírusok hatékony tisztítására. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. és Wilkins, JA. A folyadékkromatográfia szerepe a proteomikában. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. és Guillarme, D. Új trendek a terápiás peptidek és fehérjék fordított fázisú folyadékkromatográfiás elválasztásában: elmélet és alkalmazások. J. Pharmacy. Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE és Gebler, JC Peptidek kétdimenziós szétválasztása RP-RP-HPLC rendszerrel, eltérő pH-értékek használatával az első és a második elválasztási dimenzióban. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. és munkatársai: Nagy hatékonyságú, 2 μm-nél kisebb, teljesen és felületileg porózus C18 részecskékkel töltött kromatográfiás oszlopok tömegátviteli jellemzőit és kinetikai teljesítményét vizsgálták. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. A növényi bioaktív peptidek izolálásában, azonosításában és validálásában rejlő legújabb trendek és analitikai kihívások. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Az élet királyságának proteomikai tájképe. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. és munkatársai. Terápiás peptidek downstream feldolgozása preparatív folyadékkromatográfiával. Molecule (Bázel, Svájc) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. és Geng, X. Vegyes módú kromatográfia és alkalmazása biopolimereken. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. és Sun, Y. Ligandumok vegyes módú fehérjekromatográfiához: elv, jellemzés és tervezés. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).