Diolch i chi am ymweld â Nature.com. Mae gan y fersiwn porwr rydych chi'n ei ddefnyddio gefnogaeth gyfyngedig ar gyfer CSS. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu'n diffodd y modd cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn y cyfamser, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, byddwn yn arddangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Paratowyd gronynnau silica mandyllog gan ddefnyddio dull sol-gel gyda rhai addasiadau i gael gronynnau macropandyllog. Cafodd y gronynnau hyn eu deillio gan bolymeriad trosglwyddo cadwyn darnio adio gwrthdroadwy (RAFT) gydag N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) a styren i baratoi rhyngosodiad N-phenylmaleimide o gyfnod llonydd polystyren (PMP). Pacio colofnau dur di-staen cul-dwll (100 × 1.8 mm id) gan bacio slyri. Gwerthuswyd gwahanu colofn PMP o gymysgedd peptid sy'n cynnwys pum peptid (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) perfformiad cromatograffig) a threuliad trypsin o albwmin serwm dynol (HAS). O dan amodau elution gorau posibl, mae cyfrif platiau damcaniaethol y gymysgedd peptid mor uchel â 280,000 o blatiau/m². Cymharu perfformiad gwahanu'r golofn a ddatblygwyd â'r Ascentis Express masnachol. Colofn RP-Amide, gwelwyd bod perfformiad gwahanu'r golofn PMP yn well na'r golofn fasnachol o ran effeithlonrwydd gwahanu a datrysiad.
Yn ystod y blynyddoedd diwethaf, mae'r diwydiant biofferyllol wedi dod yn farchnad fyd-eang sy'n ehangu gyda chynnydd sylweddol yn ei gyfran o'r farchnad. Gyda thwf ffrwydrol y diwydiant biofferyllol1,2,3, mae dadansoddi peptidau a phroteinau yn ddymunol iawn. Yn ogystal â'r peptid targed, cynhyrchir sawl amhuredd yn ystod synthesis peptid, gan olygu bod angen puro cromatograffig i gael peptidau o'r purdeb a ddymunir. Mae dadansoddi a nodweddu proteinau mewn hylifau'r corff, meinweoedd a chelloedd yn dasg hynod heriol oherwydd y nifer fawr o rywogaethau y gellir eu canfod o bosibl mewn un sampl. Er bod sbectrometreg màs yn offeryn effeithiol ar gyfer dilyniannu peptidau a phroteinau, os yw samplau o'r fath yn cael eu chwistrellu i'r sbectromedr màs mewn un pas, ni fydd y gwahanu'n ddelfrydol. Gellir lliniaru'r broblem hon trwy weithredu gwahaniadau cromatograffaeth hylif (LC) cyn dadansoddiad MS, a fydd yn lleihau nifer yr analytau sy'n mynd i mewn i'r sbectromedr màs ar amser penodol4,5,6. Yn ogystal, yn ystod gwahanu cyfnod hylif, gellir canolbwyntio analytau mewn rhanbarthau cul, a thrwy hynny ganolbwyntio'r analytau hyn a gwella sensitifrwydd canfod MS. Mae cromatograffaeth hylif (LC) wedi datblygu'n sylweddol dros y degawd diwethaf ac mae wedi dod yn boblogaidd. techneg mewn dadansoddi proteomig7,8,9,10.
Defnyddir cromatograffaeth hylif cyfnod gwrthdro (RP-LC) yn helaeth ar gyfer puro a gwahanu cymysgeddau peptid gan ddefnyddio silica wedi'i addasu ag octadecyl (ODS) fel y cyfnod llonydd11,12,13. Fodd bynnag, nid yw cyfnodau llonydd RP yn darparu gwahanu peptidau a phroteinau yn foddhaol oherwydd eu strwythur cymhleth a'u natur amffifilig14,15. Felly, mae angen cyfnodau llonydd a gynlluniwyd yn arbennig i ddadansoddi peptidau a phroteinau gyda moieties pegynol ac an-begynol i ryngweithio â'r dadansoddion hyn a'u cadw16. Gall cromatograffaeth modd cymysg, sy'n darparu rhyngweithiadau amlfodd, fod yn ddewis arall yn lle RP-LC ar gyfer gwahanu peptidau, proteinau, a chymysgeddau cymhleth eraill. Mae sawl cyfnod llonydd modd cymysg wedi'u paratoi, ac mae colofnau wedi'u pacio â'r cyfnodau hyn wedi'u defnyddio ar gyfer gwahanu peptidau a phrotein17,18,19,20,21. Mae cyfnodau llonydd modd cymysg (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, rhyngosodiad pegynol/RPLC) yn addas ar gyfer gwahanu peptidau a phrotein oherwydd presenoldeb moieties pegynol ac an-begynol. grwpiau22,23,24,25,26,27,28. Yn yr un modd, mae cyfnodau llonydd rhyngosodol pegynol gyda grwpiau pegynol wedi'u bondio'n gofalent yn dangos pŵer gwahanu da a detholusrwydd unigryw ar gyfer dadansoddion pegynol ac an-begynol, gan fod gwahanu yn dibynnu ar y rhyngweithio rhwng y dadansoddion a'r cyfnod llonydd. Rhyngweithiadau amlfoddol29, 30, 31, 32. Yn ddiweddar, paratôdd Zhang et al.30 gyfnod llonydd polyamin â therfyn dodecyl a llwyddodd i wahanu hydrocarbonau, gwrthiselderau, flavonoidau, niwcleosidau, estrogenau, a sawl dadansoddion eraill. Mae gan y rhyngosodwr pegynol grwpiau pegynol ac an-begynol, felly gellir ei ddefnyddio i wahanu peptidau a phroteinau sydd â rhannau hydroffobig a hydroffilig. Mae colofnau wedi'u hymgorffori mewn pegynau (e.e., colofnau C18 wedi'u hymgorffori mewn amid) ar gael yn fasnachol o dan yr enw masnach colofnau Ascentis Express RP-Amide, ond dim ond ar gyfer dadansoddi amin 33 y defnyddir y colofnau hyn.
Yn yr astudiaeth gyfredol, paratowyd a gwerthuswyd cyfnod llonydd wedi'i fewnosod mewn pegynau (polystyren wedi'i fewnosod mewn N-ffenylmaleimid) ar gyfer gwahanu peptidau a threuliadau trypsin o HSA. Paratowyd y cyfnod llonydd gan ddefnyddio'r strategaeth ganlynol. Paratowyd gronynnau silica mandyllog yn ôl y weithdrefn a roddwyd yn ein cyhoeddiad blaenorol gyda rhai addasiadau i'r protocol paratoi. Addaswyd y gymhareb o wrea, polyethylen glycol (PEG), TMOS, dŵr asid asetig i baratoi gronynnau silica â maint mandwll mawr. Yn ail, syntheseiddiwyd ligand newydd, sef phenylmaleimide-methyl finyl isocyanad, a'i ddefnyddio i ddeillio gronynnau silica i baratoi cyfnod llonydd wedi'i fewnosod mewn pegynau. Pacio'r cyfnod llonydd canlyniadol i mewn i golofn ddur di-staen (100 × 1.8 mm id) gan ddefnyddio'r cynllun pacio wedi'i optimeiddio. Cynorthwyir pacio'r golofn gyda dirgryniad mecanyddol i sicrhau bod gwely homogenaidd yn cael ei ffurfio o fewn y golofn. Gwerthuso gwahanu colofn wedi'i bacio o gymysgeddau peptid sy'n cynnwys pum peptid; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) a threuliad Trypsin o albwmin serwm dynol (HAS). Gwelwyd bod y cymysgedd peptid a threuliad trypsin HSA yn gwahanu gyda datrysiad ac effeithlonrwydd da. Cymharwyd perfformiad gwahanu'r golofn PMP â pherfformiad gwahanu'r golofn Ascentis Express RP-Amide. Gwelwyd bod peptidau a phroteinau wedi'u datrys yn dda ac yn effeithlon ar y golofn PMP, a oedd yn fwy effeithlon na'r golofn Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polyethylene Glycol), Wrea, Asid Asetig, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Albwmin Serwm Dynol (HSA), Clorid Amoniwm, Wrea, Hexan Methyldisilazane (HMDS), Clorid Methacryloyl (MC), Styrene, 4-Hydroxy-TEMPO, Perocsid Bensoyl (BPO), Asetonitrile Gradd HPLC (ACN), Methanol, 2-Propanol, ac Aseton. Prynwyd gan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, UDA).
Cafodd cymysgedd o wrea (8 g), polyethylen glycol (8 g), ac 8 mL o asid asetig 0.01 N ei droi am 10 munud, ac yna ychwanegwyd 24 mL o TMOS ato o dan amodau oerfel rhewllyd. Cafodd y cymysgedd adwaith ei gynhesu ar 40°C am 6 awr ac yna ar 120°C am 8 awr mewn awtoclaf dur di-staen. Tywalltwyd y dŵr i ffwrdd a sychwyd y deunydd gweddilliol ar 70°C am 12 awr. Cafodd y màs meddal sych ei falu'n llyfn mewn popty a'i galchynnu ar 550°C am 12 awr. Paratowyd a nodweddwyd tair swp i archwilio atgynhyrchadwyedd o ran maint gronynnau, maint mandwll ac arwynebedd.
Drwy addasu arwyneb gronynnau silica gyda ligand cyn-syntheseiddiedig phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) ac yna polymerization rheiddiol gyda styren, paratowyd cyfansoddyn sy'n cynnwys grŵp pegynol. Cyfnod llonydd ar gyfer agregau a chadwyni polystyren. Disgrifir y broses baratoi isod.
Diddymwyd N-ffenylmaleimid (200 mg) a methyl finyl isocyanad (100 mg) mewn tolwen sych, ac ychwanegwyd 0.1 mL o 2,2′-asoisobutyronitril (AIBN) at y fflasg adwaith i baratoi copolymer ffenylmaleimid-methyl finyl isocyanad (PMCP). Gwresogwyd y cymysgedd ar 60°C am 3 awr, ei hidlo a'i sychu mewn popty ar 40°C am 3 awr.
Gwasgarwyd gronynnau silica sych (2 g) mewn tolwen sych (100 mL), eu troi a'u soniceiddio mewn fflasg gwaelod crwn 500 mL am 10 munud. Diddymwyd PMCP (10 mg) mewn tolwen a'i ychwanegu fesul diferyn at y fflasg adwaith trwy dwndis diferu. Cafodd y cymysgedd ei adlifo ar 100°C am 8 awr, ei hidlo a'i olchi ag aseton a'i sychu ar 60°C am 3 awr. Yna, diddymwyd gronynnau silica wedi'u bondio â PMCP (100 g) mewn tolwen (200 ml) ac ychwanegwyd 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) ym mhresenoldeb 100 µL o ddilaurad dibutyltin fel catalydd. Cafodd y cymysgedd ei droi ar 50°C am 8 awr, ei hidlo a'i sychu ar 50°C am 3 awr.
Gwasgarwyd styren (1 mL), perocsid bensoyl BPO (0.5 mL), a gronynnau silica ynghlwm wrth TEMPO-PMCP (1.5 g) mewn tolwen a'u puro â nitrogen. Cynhaliwyd polymerization styren ar 100°C am 12 awr. Golchwyd y cynnyrch canlyniadol â methanol a'i sychu ar 60°C dros nos. Dangosir y cynllun adwaith cyffredinol yn Ffigur 1.
Cafodd y samplau eu dadnwyo ar 393 K am 1 awr i gael pwysau gweddilliol o lai na 10-3 Torr. Defnyddiwyd faint o N2 a amsugnwyd ar bwysedd cymharol o P/P0 = 0.99 i bennu cyfanswm cyfaint y mandwll. Archwiliwyd morffoleg gronynnau silica noeth a gronynnau silica wedi'u bondio â ligand gyda microsgopeg electron sganio (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). Gosodwyd samplau sych (silica noeth a gronynnau silica wedi'u bondio â ligand) ar golofn alwminiwm gan ddefnyddio tâp carbon gludiog. Platiwyd aur ar y samplau gan ddefnyddio cotiwr chwistrellu Q150T, a dyddodwyd haen Au 5 nm ar y samplau. Mae hyn yn gwella effeithlonrwydd prosesau gan ddefnyddio folteddau isel ac yn darparu chwistrellu oer, grawn mân. Defnyddiwyd dadansoddwr elfennol Thermo Electron (Waltham, MA, UDA) Flash EA1112 ar gyfer dadansoddi elfennau. Defnyddiwyd dadansoddwr maint gronynnau Mastersizer 2000 Malvern (Swydd Gaerwrangon, DU) i gael y dosbarthiad maint gronynnau. Gronynnau silica noeth a gronynnau silica wedi'u bondio â ligand (5 mg yr un) wedi'u gwasgaru mewn 5 mL o isopropanol, eu soniceiddio am 10 munud, eu troi'n fortecs am 5 munud, a'u gosod ar fainc optegol y Mastersizer. Perfformiwyd dadansoddiad thermogravimetrig ar gyfradd o 5 °C y funud dros ystod tymheredd o 30 i 800 °C.
Paciowyd colofnau dur di-staen cul-dwll wedi'u leinio â gwydr o ddimensiynau (100 × 1.8 mm id) gan ddefnyddio'r dull pacio slyri, gan gymhwyso'r un weithdrefn a ddefnyddir yng Nghyf. 31.Cysylltwyd colofn ddur di-staen (wedi'i leinio â gwydr, 100 × 1.8 mm id) gyda ffitiad allfa yn cynnwys ffrit 1 µm â phaciwr slyri (Alltech Deerfield, IL, UDA).Paratowch slyri cyfnod llonydd trwy atal 150 mg o gyfnod llonydd mewn 1.2 mL o fethanol a'i anfon i'r golofn storio.Defnyddiwyd methanol fel y toddydd slyri yn ogystal â'r toddydd gwthio.Llenwch y golofn yn olynol trwy roi pwysau o 100 MP am 10 munud, 80 MP am 15 munud, a 60 MP am 30 munud.Yn ystod y pecynnu, cymhwyswyd dirgryniad mecanyddol gyda dau ysgwydwr colofn GC (Alltech, Deerfield, IL, UDA) i sicrhau pecynnu unffurf y golofn.Caewch y paciwr slyri a rhyddhewch y pwysau'n araf i atal unrhyw ddifrod o fewn y golofn.Datgysylltwch y golofn o'r uned pecynnu slyri a chysylltwch ffitiad arall â'r fewnfa ac â'r system LC i wirio ei pherfformiad.
Adeiladwyd pwmp LC (10AD Shimadzu, Japan), chwistrellwr (Valco (UDA) C14 W.05) gyda dolen chwistrellu 50nL, dadnwywr pilen (Shimadzu DGU-14A), ffenestr gapilar UV-VIS. Synhwyrydd dyfais µLC arbennig (UV-2075) a microgolofnau wedi'u leinio â gwydr. Defnyddiwch diwbiau cysylltu cul a byr iawn i leihau effaith ehangu band colofn ychwanegol. Ar ôl pecynnu, gosodwyd capilarïau (50 μm id 365) a chapilarïau undeb lleihau (50 μm) yn allfa 1/16″ yr undeb lleihau. Casglwyd data a phroseswyd cromatograffig gan ddefnyddio meddalwedd Multichro 2000. Monitro ar 254 nm Profwyd dadansoddwyr am amsugnedd UV. Dadansoddwyd data cromatograffig gan OriginPro8 (Northampton, MA).
Albwmin o serwm dynol, powdr wedi'i lyoffilio, ≥ 96% (electrofforesis gel agarose) 3 mg wedi'i gymysgu â trypsin (1.5 mg), 4.0 M wrea (1 mL), a 0.2 M bicarbonad amoniwm (1 mL). Cafodd y toddiant ei droi am 10 munud a'i gadw mewn baddon dŵr ar 37°C am 6 awr, yna ei ddiffodd gydag 1 mL o 0.1% TFA. Hidlo'r toddiant a'i storio islaw 4°C.
Gwerthuswyd gwahanu cymysgeddau peptid a threuliadau trypsin HSA ar wahân ar golofnau PMP. Gwiriwch wahanu'r cymysgedd peptid a threuliad trypsin HSA gan y golofn PMP a chymharwch y canlyniadau â cholofn Ascentis Express RP-Amide. Cyfrifir y rhif plât damcaniaethol fel a ganlyn:
Dangosir delweddau SEM o ronynnau silica noeth a gronynnau silica wedi'u bondio â ligand yn FFIG. 2. Mae delweddau SEM o ronynnau silica noeth (A, B) yn dangos, yn wahanol i'n hastudiaethau blaenorol, bod y gronynnau hyn yn sfferig lle mae'r gronynnau wedi'u hirgul neu â chymesuredd afreolaidd. Mae wyneb y gronynnau silica wedi'u bondio â ligand (C, D) yn llyfnach nag wyneb y gronynnau silica noeth, a all fod oherwydd gorchudd cadwyni polystyren ar wyneb y gronynnau silica.
Delweddau microsgop electron sganio o ronynnau silica noeth (A, B) a gronynnau silica wedi'u bondio â ligand (C, D).
Dangosir dosraniadau maint gronynnau gronynnau silica noeth a gronynnau silica wedi'u bondio â ligand yn Ffigur 3(A). Dangosodd cromliniau dosbarthiad maint gronynnau yn seiliedig ar gyfaint fod maint y gronynnau silica wedi cynyddu ar ôl addasu cemegol (Ffig. 3A). Cymharir data dosbarthiad maint gronynnau'r gronynnau silica o'r astudiaeth gyfredol a'r astudiaeth flaenorol yn Nhabl 1(A). Mae maint gronynnau yn seiliedig ar gyfaint, d(0.5), PMP yn 3.36 μm, o'i gymharu â'n hastudiaeth flaenorol gyda gwerth ad(0.5) o 3.05 μm (gronynnau silica wedi'u rhwymo â polystyren)34. Roedd gan y swp hwn ddosbarthiad maint gronynnau culach o'i gymharu â'n hastudiaeth flaenorol oherwydd y cymarebau amrywiol o PEG, wrea, TMOS, ac asid asetig yn y cymysgedd adwaith. Mae maint gronynnau'r cyfnod PMP ychydig yn fwy na maint y cyfnod gronynnau silica wedi'u rhwymo â polystyren a astudiwyd gennym yn flaenorol. Mae hyn yn golygu mai dim ond haen polystyren (0.97 µm) a adneuwyd ar wyneb y silica gan swyddogaetholi arwyneb gronynnau silica gyda styren, tra yn y cyfnod PMP roedd trwch yr haen yn... 1.38 µm.
Dosbarthiad maint gronynnau (A) a dosbarthiad maint mandwll (B) gronynnau silica noeth a gronynnau silica sy'n rhwym i ligand.
Rhoddir maint mandwll, cyfaint mandwll ac arwynebedd gronynnau silica'r astudiaeth gyfredol yn Nhabl 1(B). Dangosir proffiliau PSD gronynnau silica noeth a gronynnau silica wedi'u bondio â ligand yn Ffigur 3(B). Mae'r canlyniadau'n gymharol â'n hastudiaeth flaenorol. Meintiau mandwll y gronynnau silica noeth a'r gronynnau silica wedi'u bondio â ligand yw 310 a 241, yn y drefn honno, sy'n dangos bod maint y mandwll yn lleihau 69 ar ôl addasu cemegol, fel y dangosir yn Nhabl 1(B), a dangosir y newid yn y gromlin yn Ffig. 3(B). Yn yr un modd, gostyngodd cyfaint mandwll y gronynnau silica o 0.67 i 0.58 cm3/g ar ôl addasu cemegol. Arwynebedd penodol y gronynnau silica a astudiwyd ar hyn o bryd yw 116 m2/g, sy'n gymharol â'n hastudiaeth flaenorol (124 m2/g). Fel y dangosir yn Nhabl 1(B), gostyngodd arwynebedd (m2/g) y gronynnau silica hefyd o 116 m2/g i 105 m2/g ar ôl addasu cemegol. addasiad.
Dangosir canlyniadau dadansoddiad elfennol y cyfnod llonydd yn Nhabl 2. Mae llwyth carbon y cyfnod llonydd cyfredol yn 6.35%, sy'n is na llwyth carbon ein hastudiaeth flaenorol (gronynnau silica wedi'u bondio â polystyren, 7.93%35 a 10.21%, yn y drefn honno)42. Mae llwyth carbon y cyfnod llonydd cyfredol yn isel, oherwydd wrth baratoi'r SP cyfredol, yn ogystal â styren, defnyddiwyd rhai ligandau pegynol fel phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) a 4-hydroxy-TEMPO. Mae canran pwysau nitrogen y cyfnod llonydd cyfredol yn 2.21%, o'i gymharu â 0.1735 a 0.85% yn ôl pwysau o nitrogen mewn astudiaethau blaenorol, yn y drefn honno. Mae hyn yn golygu bod y % pwysau o nitrogen yn uwch yn y cyfnod llonydd cyfredol oherwydd phenylmaleimide. Yn yr un modd, roedd llwythi carbon cynhyrchion (4) a (5) yn 2.7% a 2.9%, yn y drefn honno, tra bod llwyth carbon y cynnyrch terfynol (6) yn 6.35%, fel y dangosir yn Nhabl 2. Gwiriwyd y golled pwysau gyda chyfnod llonydd PMP, a dangosir y gromlin TGA yn Ffigur 4. Mae'r gromlin TGA yn dangos colled pwysau o 8.6%, sy'n cytuno'n dda â'r llwyth carbon (6.35%) oherwydd bod y ligandau nid yn unig yn cynnwys C ond hefyd N, O, a H.
Dewiswyd y ligand phenylmaleimide-methylvinylisocyanate ar gyfer addasu arwyneb gronynnau silica oherwydd bod ganddo grwpiau phenylmaleimide pegynol a grwpiau finylisocyanate. Gall grwpiau finyl isocyanate adweithio ymhellach â styren trwy bolymerization radical byw. Yr ail reswm yw mewnosod grŵp sydd â rhyngweithio cymedrol â'r dadansoddyn a dim rhyngweithio electrostatig cryf rhwng yr dadansoddyn a'r cyfnod llonydd, gan nad oes gan y rhan phenylmaleimide wefr rithwir ar pH arferol. Gellir rheoli polaredd y cyfnod llonydd gan y swm gorau posibl o styren ac amser adwaith polymerization radical rhydd. Mae cam olaf yr adwaith (polymerization radical rhydd) yn hanfodol a gall newid polaredd y cyfnod llonydd. Perfformiwyd dadansoddiad elfennol i wirio llwyth carbon y cyfnodau llonydd hyn. Gwelwyd bod cynyddu faint o styren a'r amser adwaith yn cynyddu llwyth carbon y cyfnod llonydd ac i'r gwrthwyneb. Mae gan SPs a baratowyd gyda gwahanol grynodiadau o styren wahanol lwythi carbon. Unwaith eto, llwythwch y cyfnodau llonydd hyn i golofnau dur di-staen a gwiriwch eu perfformiad cromatograffig (detholusrwydd, datrysiad, N gwerth, ac ati). Yn seiliedig ar yr arbrofion hyn, dewiswyd fformiwleiddiad wedi'i optimeiddio i baratoi'r cyfnod llonydd PMP i sicrhau polaredd rheoledig a chadw dadansoddyn da.
Gwerthuswyd pum cymysgedd peptid (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) hefyd gan ddefnyddio colofn PMP sy'n defnyddio cyfnod symudol; 60/40 (v/v) asetonitril/dŵr (0.1% TFA) ar gyfradd llif o 80 μL/mun. O dan amodau elution gorau posibl, y nifer platiau damcaniaethol (N) fesul colofn (100 × 1.8 mm id) yw 20,000 ± 100 (200,000 plat/m²). Mae Tabl 3 yn rhoi'r gwerthoedd N ar gyfer y tair colofn PMP a dangosir y cromatogramau yn Ffigur 5A. Dadansoddiad cyflym ar golofn PMP ar gyfradd llif uchel (700 μL/mun), eluwyd pum peptid o fewn un funud, roedd y gwerthoedd N yn dda iawn, 13,500 ± 330 fesul colofn (100 × 1.8 mm id), Yn cyfateb i 135,000 plat/m (Ffigur 5B). Pacio tair colofn o'r un maint (100 × 1.8 mm id) gyda thri swp gwahanol o gyfnod llonydd PMP i wirio atgynhyrchadwyedd. Y Cofnodwyd crynodiad y dadansoddyn ar gyfer pob colofn gan ddefnyddio'r amodau elution gorau posibl a nifer y platiau damcaniaethol N ac amser cadw i wahanu'r un cymysgedd prawf ar bob colofn. Dangosir y data atgynhyrchadwyedd ar gyfer y colofnau PMP yn Nhabl 4. Mae atgynhyrchadwyedd y golofn PMP yn cydberthyn yn dda â gwerthoedd %RSD isel iawn, fel y dangosir yn Nhabl 3.
Gwahanu cymysgedd peptid ar golofn PMP (B) a cholofn Ascentis Express RP-Amide (A); cyfnod symudol 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), dimensiynau colofn PMP (100 × 1.8 mm id); dadansoddol Trefn elution y cyfansoddion: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) a 5 (leucine) asid enkeffalin)).
Gwerthuswyd colofn PMP (100 × 1.8 mm id) ar gyfer gwahanu treuliadau tryptig albwmin serwm dynol mewn cromatograffaeth hylif perfformiad uchel. Mae'r cromatogram yn Ffigur 6 yn dangos bod y sampl wedi'i gwahanu'n dda a bod y datrysiad yn dda iawn. Dadansoddwyd treuliadau HSA gan ddefnyddio cyfradd llif o 100 µL/mun, cyfnod symudol 70/30 asetonitril/dŵr a 0.1% TFA. Fel y dangosir yn y cromatogram (Ffigur 6), mae'r treuliad HSA wedi'i rannu'n 17 copa sy'n cyfateb i 17 peptid. Cyfrifwyd effeithlonrwydd gwahanu pob copa yn y treuliad HSA a rhoddir y gwerthoedd yn Nhabl 5.
Gwahanwyd treuliad tryptig o HSA (100 × 1.8 mm id) ar golofn PMP; cyfradd llif (100 µL/mun), cyfnod symudol 60/40 asetonitril/dŵr gyda 0.1% TFA.
lle mae L yn hyd y golofn, η yw gludedd y cyfnod symudol, ΔP yw pwysau cefn y golofn, ac u yw cyflymder llinol y cyfnod symudol. Roedd athreiddedd y golofn PMP yn 2.5 × 10-14 m2, roedd y gyfradd llif yn 25 μL/mun, a defnyddiwyd 60/40 v/v ACN/dŵr. Roedd athreiddedd y golofn PMP (100 × 1.8 mm id) yn debyg i athreiddedd ein hastudiaeth flaenorol Cyf.34. Mae athreiddedd y golofn sydd wedi'i phacio â gronynnau mandyllog arwynebol yn: 1.7 × 10-15 ar gyfer gronynnau 1.3 μm, 3.1 × 10-15 ar gyfer gronynnau 1.7 μm, 5.2 × 10-15 a 2.5 × 10-14 m2 ar gyfer gronynnau 2.6 μm Ar gyfer gronynnau 5 μm 43. Felly, mae athreiddedd y cyfnod PMP yn debyg i athreiddedd gronynnau craidd-plisgyn 5 μm.
lle mae Wx yn bwysau'r golofn sydd wedi'i phacio â chlorofform, Wy yw pwysau'r golofn sydd wedi'i phacio â methanol, a ρ yw dwysedd y toddydd. Dwyseddau methanol (ρ = 0.7866) a chlorofform (ρ = 1.484). Roedd cyfanswm mandylledd colofnau GRONYNNAU SILICA-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 a cholofnau C18-Wrea 31 a astudiwyd gennym yn flaenorol yn 0.63 a 0.55, yn y drefn honno. Mae hyn yn golygu bod presenoldeb ligandau wrea yn lleihau athreiddedd y cyfnod llonydd. Ar y llaw arall, cyfanswm mandylledd y golofn PMP (100 × 1.8 mm id) yw 0.60. Mae athreiddedd colofnau PMP yn is na threiddedd colofnau sydd wedi'u pacio â gronynnau silica wedi'u bondio â C18 oherwydd mewn cyfnodau llonydd math C18 mae'r ligandau C18 ynghlwm wrth y gronynnau silica fel cadwyni llinol, tra mewn cyfnodau llonydd math polystyren, mae'r haen polymer gymharol drwchus. yn cael ei ffurfio o'i gwmpas. Mewn arbrawf nodweddiadol, cyfrifir mandylledd y golofn fel:
Mae Ffigur 7A,B yn dangos y golofn PMP (100 × 1.8 mm id) a'r golofn Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) gan ddefnyddio'r un amodau elution (h.y., 60/40 ACN/H2O a 0.1% TFA).) o'r plot van Deemter. Paratowyd cymysgeddau peptid dethol (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) mewn 20 µL/ Y gyfradd llif leiaf ar gyfer y ddwy golofn yw 800 µL/mun. Y gwerthoedd HETP lleiaf ar y gyfradd llif orau (80 µL/mun) ar gyfer y golofn PMP a'r golofn Ascentis Express RP-Amide oedd 2.6 µm a 3.9 µm, yn y drefn honno. Mae'r gwerthoedd HETP yn dangos bod effeithlonrwydd gwahanu'r golofn PMP (100 × 1.8 mm id) yn llawer gwell na'r golofn Ascentis Express RP-Amide sydd ar gael yn fasnachol (100 × 1.8 mm id). Mae'r plot van Deemter yn Ffig. 7(A) yn dangos nad yw'r gostyngiad yng ngwerth N gyda llif cynyddol yn arwyddocaol o'i gymharu â'n hastudiaeth flaenorol. Mae effeithlonrwydd gwahanu uwch y golofn PMP (100 × 1.8 mm id) o'i gymharu â cholofn Ascentis Express RP-Amide yn seiliedig ar welliannau mewn siâp gronynnau, maint, a gweithdrefnau pacio colofn cymhleth a ddefnyddir yn y gwaith cyfredol34.
(A) plot van Deemter (HETP yn erbyn cyflymder llinol cyfnod symudol) a gafwyd gan ddefnyddio colofn PMP (100 × 1.8 mm id) mewn 60/40 ACN/H2O gyda 0.1% TFA. (B) plot van Deemter (HETP yn erbyn cyflymder llinol cyfnod symudol) a gafwyd gan ddefnyddio colofn Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) mewn 60/40 ACN/H2O gyda 0.1% TFA.
Paratowyd a gwerthuswyd cyfnod llonydd polystyren wedi'i fewnosod mewn pegynau ar gyfer gwahanu cymysgeddau peptid synthetig a threuliadau trypsin o albwmin serwm dynol (HAS) mewn cromatograffaeth hylif perfformiad uchel. Mae perfformiad cromatograffig colofnau PMP ar gyfer cymysgeddau peptid yn rhagorol o ran effeithlonrwydd a datrysiad gwahanu. Mae perfformiad gwahanu gwell colofnau PMP oherwydd amrywiaeth o resymau, megis maint y gronynnau a maint mandwll y gronynnau silica, synthesis rheoledig y cyfnod llonydd, a phacio colofn cymhleth. Yn ogystal ag effeithlonrwydd gwahanu uchel, mae pwysedd cefn colofn isel ar gyfraddau llif uchel yn fantais arall i'r cyfnod llonydd hwn. Mae colofnau PMP yn arddangos atgynhyrchedd da a gellir eu defnyddio ar gyfer dadansoddi cymysgeddau peptid a threuliad trypsin amrywiol broteinau. Rydym yn bwriadu defnyddio'r golofn hon ar gyfer gwahanu cynhyrchion naturiol, cyfansoddion bioactif o blanhigion meddyginiaethol a darnau ffwngaidd mewn cromatograffaeth hylif. Yn y dyfodol, bydd colofnau PMP hefyd yn cael eu gwerthuso ar gyfer gwahanu proteinau ac gwrthgyrff monoclonaidd.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. a Petersson, P. Ymchwil ar Systemau Gwahanu Peptidau drwy Gromatograffeg Cyfnod Gwrthdro Rhan I: Datblygu Protocol Nodweddu Colofn. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Peptidau gweithredol gwell wedi'u cynllunio ar gyfer trin clefydau heintus.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. a Khrestchatisky, M. Peptidau therapiwtig synthetig: gwyddoniaeth a'r farchnad. darganfod cyffuriau. 15 (1-2) heddiw, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD a Shen, Y. Cromatograffaeth Hylif Proteomig Uwch. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al.Mae cromatograffaeth hylif uwch-sbectrometreg màs yn galluogi ymgorffori metabolomeg a phroteomeg sydd wedi'u targedu'n eang.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM a Salisbury, JJ Rôl UHPLC mewn datblygu cyffuriau. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. a Clausen, AM Agweddau sylfaenol ac ymarferol cromatograffaeth hylif pwysedd uwch-uchel ar gyfer gwahanu cyflym. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA a Tchelitcheff, P. Cymhwyso cromatograffaeth hylif perfformiad uwch-uchel wrth ddatblygu cyffuriau. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Hydrogelau macroporous monolithig wedi'u paratoi o emwlsiynau cyfnod mewnol uchel olew-mewn-dŵr ar gyfer puro enterofirysau yn effeithlon.Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. a Wilkins, JA Rôl cromatograffaeth hylif mewn proteomeg.J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. a Guillarme, D. Tueddiadau sy'n dod i'r amlwg mewn gwahaniadau cromatograffaeth hylif cyfnod gwrthdro o peptidau a phroteinau therapiwtig: damcaniaeth a chymwysiadau. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE a Gebler, JC Gwahanu peptidau mewn dau ddimensiwn gan ddefnyddio system RP-RP-HPLC sy'n defnyddio gwahanol werthoedd pH yn y dimensiynau gwahanu cyntaf ac ail.J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Ymchwiliwyd i nodweddion trosglwyddo màs a pherfformiad cinetig colofnau cromatograffig effeithlonrwydd uchel wedi'u pacio â gronynnau C18 is-2 μm llawn ac arwynebol mandyllog. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Tueddiadau diweddar a heriau dadansoddol wrth ynysu, adnabod a dilysu peptidau bioactif planhigion.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Tirwedd proteomig teyrnas bywyd. Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al.Prosesu peptidau therapiwtig i lawr yr afon trwy gromatograffaeth hylif paratoadol. Molecule (Basel, y Swistir) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. a Geng, X. Cromatograffaeth modd cymysg a'i chymhwysiad i fiopolymerau. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. a Sun, Y. Ligandau ar gyfer cromatograffaeth protein modd cymysg: egwyddor, nodweddu a dylunio. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).