Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез куллана торган браузер версиясендә CSS өчен чикләнгән ярдәм күрсәтелә. Иң яхшы тәҗрибә өчен, без сезгә яңартылган браузер кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'да туры килүчәнлек режимын сүндерегез). Шуңа кадәр, ярдәмне дәвам итү өчен, без сайтны стильләрсез һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Макропорозлы кисәкчәләр алу өчен, күзәнәкле кремний диоксиды кисәкчәләре бераз модификацияләнгән золь-гель ысулы белән әзерләнде. Бу кисәкчәләр полистиролның (PMP) стационар фазасының N-фенилмалеимид интеркаляциясен әзерләү өчен N-фенилмалеимид интеркаляциясен әзерләү өчен N-фенилмалеимид (PMI) һәм стирол белән кире кайтарыла торган өстәмә фрагментация чылбыры күчерү (RAFT) полимеризациясе юлы белән алынды. Тар диаметрлы дат басмас корыч колонналар (100 × 1,8 мм id) суспензия белән төрелде. Биш пептидтан (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) хроматографик күрсәткечләрдән һәм кеше сыворотка альбуминының (HAS) трипсин эшкәртүеннән торган пептид катнашмасының PMP колоннасы белән аерылуы бәяләнде. Оптималь элюция шартларында пептид катнашмасының теоретик пластиналар саны 280,000 пластина/м² кадәр җитә. Эшләнгән пластиналарның аерылу күрсәткечләрен чагыштыру коммерция максатларында кулланылган Ascentis Express RP-Amide колоннасы белән чагыштырганда, PMP колоннасының аеру күрсәткечләре аеру нәтиҗәлелеге һәм чишелеше ягыннан коммерция максатларында кулланылган колоннага караганда югарырак булуы күзәтелде.
Соңгы елларда биофармацевтика сәнәгате киңәюче глобаль базарга әйләнде, базар өлеше сизелерлек артты. Биофармацевтика сәнәгатенең кискен үсеше белән1,2,3, пептидлар һәм аксымнарны анализлау бик кирәк. Максатлы пептидтан тыш, пептид синтезы вакытында берничә катнашма барлыкка килә, шуңа күрә теләгән сафлыктагы пептидларны алу өчен хроматографик чистарту кирәк. Бер үрнәктә потенциаль рәвештә ачыкланырга мөмкин булган төрләрнең күп булуы аркасында тән сыеклыкларындагы, тукымаларда һәм күзәнәкләрдәге аксымнарны анализлау һәм характеристикалау бик катлаулы бурыч. Масса-спектрометрия пептид һәм аксым секвенирлавы өчен нәтиҗәле корал булса да, мондый үрнәкләр масса-спектрометрга бер үтү белән кертелсә, аеру идеаль булмаячак. Бу проблеманы MS анализы алдыннан сыек хроматография (LC) аеруларын куллану юлы белән чишәргә мөмкин, бу билгеле бер вакытта масса-спектрометрга керүче аналитлар санын киметәчәк4,5,6. Моннан тыш, сыек фазаны аеру вакытында аналитларны тар өлкәләргә тупларга мөмкин, шуның белән бу аналитларны тупларга һәм MS детекторлау сизгерлеген яхшыртырга мөмкин. Сыеклык хроматография (ХХ) соңгы дистә ел эчендә сизелерлек алга китте һәм протеомик анализда популяр ысулга әйләнде7,8,9,10.
Кире фазалы сыек хроматография (RP-LC) стационар фаза буларак октадецил-модификацияләнгән кремний диоксидын (ODS) кулланып пептид катнашмаларын чистарту һәм аеру өчен киң кулланыла11,12,13. Ләкин, RP стационар фазалары катлаулы структурасы һәм амфифиль табигате аркасында пептидларны һәм аксымнарны канәгатьләнерлек аеруны тәэмин итми14,15. Шуңа күрә, поляр һәм поляр булмаган өлешләре булган пептидларны һәм аксымнарны анализлау өчен махсус эшләнгән стационар фазалар кирәк, алар белән үзара бәйләнештә булу һәм бу аналитларны саклап калу өчен16. Мультимодаль үзара бәйләнешләрне тәэмин итүче катнаш режимлы хроматография пептидларны, аксымнарны һәм башка катлаулы катнашмаларны аеру өчен RP-LCга альтернатива була ала. Берничә катнаш режимлы стационар фаза әзерләнде, һәм бу фазалар белән тутырылган колонналар пептид һәм аксым аеру өчен кулланылды17,18,19,20,21. Катнаш режимлы стационар фазалар (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, поляр интеркаляция/RPLC) пептид һәм аксым өчен яраклы. поляр һәм поляр булмаган төркемнәр булу сәбәпле аерылулар22,23,24,25,26,27,28. Шулай ук, ковалент бәйләнешле поляр төркемнәре белән поляр интеркаляцияләүче стационар фазалар поляр һәм поляр булмаган аналитлар өчен яхшы аерылу көчен һәм уникаль селективлыкны күрсәтә, чөнки аерылу аналит һәм стационар фаза арасындагы үзара бәйләнешкә бәйле. Мультимодаль үзара бәйләнешләр 29, 30, 31, 32. Күптән түгел, Чжан һ.б. 30 додецил белән тәмамланган полиамин стационар фазасын әзерләде һәм углеводородларны, антидепрессантларны, флавоноидларны, нуклеозидларны, эстрогеннарны һәм башка берничә аналитны уңышлы аерды. Поляр интеркалаторның поляр һәм поляр булмаган төркемнәре бар, шуңа күрә аны гидрофоб һәм гидрофиль өлешләре булган пептидларны һәм аксымнарны аеру өчен кулланырга мөмкин. Полярга урнаштырылган колонналар (мәсәлән, амидка урнаштырылган C18 колонналары) Ascentis Express RP-Amide колонналары сәүдә исеме астында сатыла, ләкин бу колонналар 33 аминын анализлау өчен генә кулланыла.
Агымдагы тикшеренүдә, HSA пептидларын һәм трипсин дайджестларын аеру өчен полярлы стационар фаза (N-фенилмалеимид белән дайджестланган полистирол) әзерләнде һәм бәяләнде. Стационар фаза түбәндәге стратегияне кулланып әзерләнде. Күзәнәкле кремний диоксиды кисәкчәләре безнең алдагы басмада бирелгән процедура буенча әзерләнде, әзерләү протоколына кайбер үзгәрешләр кертелде. Зур мәсамә зурлыгындагы кремний диоксиды кисәкчәләрен әзерләү өчен мочевина, полиэтиленгликоль (PEG), TMOS, су сиркә кислотасы нисбәте көйләнде. Икенчедән, яңа лиганд, фенилмалеимид-метилвинил изоцианат, синтезланды һәм кремний диоксиды кисәкчәләрен алу өчен полярлы стационар фазаны әзерләү өчен кулланылды. Нәтиҗәдә барлыкка килгән стационар фаза оптимальләштерелгән төрү схемасын кулланып, дат басмас корыч колоннага (100 × 1,8 мм id) төрелде. Колонна эчендә гомоген катлам барлыкка килүен тәэмин итү өчен колонна төрүенә механик тибрәнү ярдәм итә. Биш пептидтан торган пептид катнашмаларының төрү колоннасын аеруны бәяләгез; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) һәм кеше сыворотка альбуминының (HAS) трипсин дайджесты. HSA пептид катнашмасы һәм трипсин дайджесты яхшы чишелеш һәм нәтиҗәлелек белән аерылуы күзәтелде. PMP колонкасының аеру күрсәткечләре Ascentis Express RP-Amide колонкасы белән чагыштырылды. Пептидларның да, аксымнарның да PMP колонкасында яхшы чишелеш һәм нәтиҗәлелек күзәтелде, бу Ascentis Express RP-Amide колонкасына караганда нәтиҗәлерәк иде.
PEG (полиэтиленгликоль), мочевина, сиркә кислотасы, триметоксиортосиликат (TMOS), триметилхлорсилан (TMCS), трипсин, кеше сыворотка альбумины (HSA), аммоний хлориды, мочевина, гексан метилдисилазан (HMDS), метакрилоиллхлорид (MC), стирол, 4-гидрокси-TEMPO, бензоил пероксиды (BPO), HPLC сортлы ацетонитрил (ACN), метанол, 2-пропанол һәм ацетон Sigma-Aldrich компаниясеннән (Сент-Луис, Миссури, АКШ) сатып алынган.
Мочевина (8 г), полиэтиленгликоль (8 г) һәм 8 мл 0,01 Н сиркә кислотасы катнашмасы 10 минут дәвамында болгатылды, аннары бозлы шартларда 24 мл TMOS өстәлде. Реакция катнашмасы 40°C температурада 6 сәгать, аннары 120°C температурада 8 сәгать дәвамында дат басмас корыч автоклавта җылытылды. Су агызылды һәм калган материал 70°C температурада 12 сәгать дәвамында киптерелде. Киптерелгән йомшак масса мичтә шома тартылды һәм 550°C температурада 12 сәгать дәвамында кыздырылды. Кисәкчәләр зурлыгы, мәсамә зурлыгы һәм өслек мәйданы буенча кабатланучанлыкны тикшерү өчен өч партия әзерләнде һәм характеристика ясалды.
Кремний диоксиды кисәкчәләрен алдан синтезланган лиганд фенилмалеимид-метилвинилисоцианат (PCMP) белән өслек модификациясе, аннары стирол белән радиаль полимеризацияләү юлы белән, поляр төркемле кушылма әзерләнде. Агрегатлар һәм полистирол чылбырлары өчен стационар фаза. Әзерләү процессы түбәндә тасвирлана.
N-фенилмалеимид (200 мг) һәм метилвинил изоцианат (100 мг) коры толуолда эретелде, һәм фенилмалеимид-метилвинил изоцианат сополимерын (PMCP) әзерләү өчен реакция колбасына 0,1 мл 2,2′-азоиизобутиронитрил (AIBN) өстәлде. Катнашма 60°C температурада 3 сәгать җылытылды, фильтрланды һәм 40°C температурада 3 сәгать мичтә киптерелде.
Киптерелгән кремний диоксиды кисәкчәләре (2 г) коры толуолда (100 мл) эретелде, болгатты һәм 500 мл түгәрәк төп колбада 10 минут дәвамында ультратавыш белән эшкәртелде. PMCP (10 мг) толуолда эретелде һәм тамчылатып воронка аша реакция колбасына тамчылатып өстәлде. Катнашма 100°C температурада 8 сәгать дәвамында кире әйләндерде, фильтрланды һәм ацетон белән юылды һәм 60°C температурада 3 сәгать дәвамында киптерелде. Аннары PMCP белән бәйләнгән кремний диоксиды кисәкчәләре (100 г) толуолда (200 мл) эретелде һәм катализатор буларак 100 мкл дибутилтин дилаураты катнашында 4-гидрокси-TEMPO (2 мл) өстәлде. Катнашма 50°C температурада 8 сәгать дәвамында болгатты, фильтрланды һәм 50°C температурада 3 сәгать дәвамында киптерелде.
Стирол (1 мл), бензоил пероксиды BPO (0,5 мл) һәм TEMPO-PMCP белән беркетелгән кремний диоксиды кисәкчәләре (1,5 г) толуолда эретелгән һәм азот белән чистартылган. Стиролның полимерлашуы 100°C температурада 12 сәгать дәвамында башкарылган. Нәтиҗәдә барлыкка килгән продукт метанол белән юылган һәм 60°C температурада төнлә киптерелгән. Гомуми реакция схемасы 1 нче рәсемдә күрсәтелгән.
Үрнәкләр 10-3 Торрдан кимрәк калдык басым алу өчен 393 К температурада 1 сәгать дәвамында дегазацияләнде. P/P0 = 0,99 чагыштырма басымда адсорбцияләнгән N2 күләме гомуми мәсамә күләмен билгеләү өчен кулланылды. Ялангач һәм лиганд белән бәйләнгән кремний диоксиды кисәкчәләренең морфологиясе сканерлаучы электрон микроскопиясе ярдәмендә тикшерелде (Hitachi High Technologies, Токио, Япония). Киптерелгән үрнәкләр (ялангач кремний һәм лиганд белән бәйләнгән кремний диоксиды кисәкчәләре) алюминий баганага ябыштыргыч углерод тасмасы ярдәмендә урнаштырылды. Үрнәкләргә Q150T сиптерү каплагычы ярдәмендә алтын белән капланды, һәм үрнәкләргә 5 нм Au катламы салынды. Бу түбән көчәнешләр кулланып процесс нәтиҗәлелеген яхшырта һәм вак бөртекле, салкын сиптерүне тәэмин итә. Элемент анализы өчен Thermo Electron (Уолтем, Массачусетс, АКШ) Flash EA1112 элемент анализаторы кулланылды. Кисәкчәләр зурлыгын алу өчен Malvern (Вустершир, Бөекбритания) Mastersizer 2000 кисәкчәләр зурлыгы анализаторы кулланылды. таралышы. Ялангач кремний кисәкчәләре һәм лиганд белән бәйләнгән кремний кисәкчәләре (һәрберсе 5 мг) 5 мл изопропанолда эретелде, 10 минут дәвамында ультратавыш белән эшкәртелде, 5 минут дәвамында вортексланды һәм Mastersizer оптик эскәмиясенә куелды. Термогравиметрик анализ 30-800 °C температура диапазонында минутына 5 °C тизлектә үткәрелде.
Пыяла белән капланган дат басмас корычтан ясалган тар диаметрлы колонналар (100 × 1,8 мм ид.), сылтамада кулланылган шул ук процедураны кулланып, шлам белән тутыру ысулы белән төрелде. 31. 1 мкм фритлы чыгу җайланмасы булган дат басмас корыч колонна (пыяла белән капланган, 100 × 1,8 мм идентификатор) шлам тутыргычка (Alltech Deerfield, IL, АКШ) тоташтырылган. 1,2 мл метанолда 150 мг стационар фазаны суспензияләп, саклау колоннасына җибәреп, стационар фаза шламын әзерләгез. Шлам эреткече һәм хәрәкәтләндергеч эреткеч буларак метанол кулланылды. Колоннаны 10 минутка 100 МП, 15 минутка 80 МП һәм 30 минутка 60 МП басым ясап, эзлекле рәвештә тутырыгыз. Тутыру вакытында, колоннаның тигез тутырылуын тәэмин итү өчен, ике GC колонна селкетү җайланмасы (Alltech, Deerfield, IL, АКШ) белән механик тибрәнү кулланылды. Шлам тутыргычны ябыгыз һәм колонна эчендәге зыянны булдырмас өчен басымны әкрен генә төшерегез. Колоннаны шлам тутыргыч җайланмасыннан аерыгыз һәм керү тишегенә һәм LC системасына тагын бер җайланманы тоташтырыгыз. аның эшчәнлеген тикшерү өчен.
LC насосы (10AD Shimadzu, Япония), 50 нл инъекция элмәге булган инжектор (Valco (АКШ) C14 W.05), мембраналы дегазатор (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS капилляр тәрәзәсе төзелгән. Махсус µLC җайланма детекторы (UV-2075) һәм пыяла белән капланган микроколонкалар. Өстәмә колонна полосасы киңәюенең йогынтысын минимальләштерү өчен бик тар һәм кыска тоташтыручы торбалар кулланыгыз. Төргәкләгәннән соң, киметү берләшмәсенең 1/16 дюймлы чыгу урынына капиллярлар (50 мкм id 365 һәм киметү берләшмә капиллярлары (50 мкм) урнаштырылган. Мәгълүмат җыю һәм хроматографик эшкәртү Multichro 2000 программасы ярдәмендә башкарылды. 254 нм да мониторинг. Аналитлар UV йотучанлыгына тикшерелде. Хроматографик мәгълүматлар OriginPro8 (Нортгемптон, MA) ярдәмендә анализланды.
Кеше кан сарысуыннан алынган альбумин, лиофилизацияләнгән порошок, ≥ 96% (агароза геле электрофорезы) 3 мг трипсин (1,5 мг), 4,0 М мочевина (1 мл) һәм 0,2 М аммоний бикарбонаты (1 мл) белән кушылган. Эремә 10 минут болгатылган һәм 37°C температурада 6 сәгать су мунчасында тотылган, аннары 1 мл 0,1% TFA белән сүндерелгән. Эремәне фильтрлагыз һәм 4°C тан түбән температурада саклагыз.
Пептид катнашмаларын һәм HSA трипсин дайджестларын аеру PMP баганаларында аерым бәяләнде. PMP баганасында HSA пептид катнашмасы һәм трипсин дайджестын аеруны тикшерегез һәм нәтиҗәләрне Ascentis Express RP-Amide баганалары белән чагыштырыгыз. Теоретик пластина саны түбәндәгечә исәпләнә:
Ялан кремний кисәкчәләренең һәм лиганд белән бәйләнгән кремний кисәкчәләренең SEM рәсемнәре 2 нче рәсемдә күрсәтелгән. Ялан кремний кисәкчәләренең SEM рәсемнәре (A, B) күрсәткәнчә, безнең алдагы тикшеренүләрдән аермалы буларак, бу кисәкчәләр сферик, аларда кисәкчәләр озынча яки тигез булмаган симметриягә ия. Лиганд белән бәйләнгән кремний кисәкчәләренең (C, D) өслеге ялан кремний кисәкчәләренекенә караганда шомарак, бу кремний кисәкчәләре өслегендә полистирол чылбырлары белән каплану аркасында булырга мөмкин.
Ялангач кремний диоксиды кисәкчәләренең (A, B) һәм лиганд белән бәйләнгән кремний диоксиды кисәкчәләренең (C, D) сканерлаучы электрон микроскоп рәсемнәре.
Ялангач кремний диоксиды кисәкчәләренең һәм лиганд белән бәйләнгән кремний диоксиды кисәкчәләренең кисәкчә зурлыгы бүленеше 3(А) рәсемдә күрсәтелгән. Күләмгә нигезләнгән кисәкчә зурлыгы бүленеше кәкреләре химик модификациядән соң кремний диоксиды кисәкчәләренең зурлыгы артканлыгын күрсәтте (3А рәсем). Хәзерге тикшеренүдән һәм алдагы тикшеренүдән алынган кремний диоксиды кисәкчәләренең кисәкчә зурлыгы бүленеше мәгълүматлары 1(А) таблицасында чагыштырыла. PMP-ның күләмгә нигезләнгән кисәкчә зурлыгы, d(0.5), безнең алдагы тикшеренү белән чагыштырганда 3.36 мкм тәшкил итә, ad(0.5) кыйммәте 3.05 мкм (полистирол белән бәйләнгән кремний диоксиды кисәкчәләре)34. Бу партиянең алдагы тикшеренү белән чагыштырганда кисәкчә зурлыгы бүленеше таррак иде, чөнки реакция катнашмасында PEG, мочевина, TMOS һәм сиркә кислотасы нисбәтләре төрлечә. PMP фазасының кисәкчә зурлыгы без элек өйрәнгән полистирол белән бәйләнгән кремний диоксиды кисәкчәләре фазасыннан бераз зуррак. Бу кремний диоксиды кисәкчәләренең стирол белән өслек функционализациясе кремний диоксиды өслегенә полистирол катламын гына (0.97 мкм) урнаштырган дигән сүз, ә PMP фазасында катламның калынлыгы 1,38 мкм иде.
Ялангач кремний кисәкчәләренең һәм лиганд белән бәйләнгән кремний диоксиды кисәкчәләренең кисәкчәләр зурлыгы бүленеше (A) һәм мәсамә зурлыгы бүленеше (B).
Хәзерге тикшеренүдәге кремний диоксиды кисәкчәләренең тишек зурлыгы, тишек күләме һәм өслек мәйданы 1(B) таблицасында күрсәтелгән. Ялан кремний кисәкчәләренең һәм лиганд белән бәйләнгән кремний диоксиды кисәкчәләренең PSD профильләре 3(B) рәсемдә күрсәтелгән. Нәтиҗәләр безнең алдагы тикшеренү белән чагыштырырлык. Ялан һәм лиганд белән бәйләнгән кремний диоксиды кисәкчәләренең тишек зурлыклары 310 һәм 241 тәшкил итә, бу химик модификациядән соң тишек зурлыгы 69 ка кимүен күрсәтә, 1(B) таблицасында күрсәтелгәнчә, һәм кәкре үзгәреше 3(B) рәсемдә күрсәтелгән. Шулай ук, химик модификациядән соң кремний диоксиды кисәкчәләренең тишек күләме 0,67 дән 0,58 см3/г га кадәр кимегән. Хәзерге вакытта өйрәнелгән кремний диоксиды кисәкчәләренең чагыштырма өслек мәйданы 116 м2/г тәшкил итә, бу безнең алдагы тикшеренү белән чагыштырырлык (124 м2/г). 1(B) таблицасында күрсәтелгәнчә, кремний диоксиды кисәкчәләренең өслек мәйданы (м2/г) да 116 м2/г дан 105 ка кадәр кимегән. химик модификациядән соң м2/г.
Стационар фазаның элемент анализы нәтиҗәләре 2 нче таблицада күрсәтелгән. Ток стационар фазаның углерод йөкләмәсе 6,35% тәшкил итә, бу безнең алдагы тикшеренүдәге углерод йөкләмәсеннән түбәнрәк (полистирол белән бәйләнгән кремний кисәкчәләре, тиешенчә 7,93%35 һәм 10,21%) 42. Ток стационар фазаның углерод йөкләмәсе түбән, чөнки ток SP әзерләүдә, стиролдан тыш, фенилмалеимид-метилвинилизоцианат (PCMP) һәм 4-гидрокси-TEMPO кебек кайбер поляр лигандлар кулланылды. Ток стационар фазаның азот авырлыгы проценты 2,21% тәшкил итә, алдагы тикшеренүләрдә азотның авырлыгы буенча 0,1735 һәм 0,85% булган. Бу азотның авырлык проценты фенилмалеимид аркасында агымдагы стационар фазада югарырак дигән сүз. Шул ук рәвешле, (4) һәм (5) продуктларының углерод йөкләмәсе тиешенчә 2,7% һәм 2,9% тәшкил итте, ә соңгы продуктның углерод йөкләмәсе (6) 2 нче таблицада күрсәтелгәнчә 6,35% тәшкил итте. Авырлык югалту PMP стационар фазасы белән тикшерелде, һәм TGA кәкресе 4 нче рәсемдә күрсәтелгән. TGA кәкресе 8,6% авырлык югалтуын күрсәтә, бу углерод йөкләмәсе белән (6,35%) яхшы туры килә, чөнки лигандларда C гына түгел, ә N, O һәм H да бар.
Фенилмалеимид-метилвинилизоцианат лиганды кремний диоксиды кисәкчәләренең өслеген модификацияләү өчен сайланган, чөнки аның поляр фенилмалеимид төркемнәре һәм винилизоцианат төркемнәре бар. Винил изоцианат төркемнәре тере радикаль полимеризация аша стирол белән реакциягә керә ала. Икенче сәбәп - аналит белән уртача үзара бәйләнеше булган һәм аналит белән стационар фаза арасында көчле электростатик үзара бәйләнеше булмаган төркемне кертү, чөнки фенилмалеимид өлешенең нормаль рН дәрәҗәсендә виртуаль заряды юк. Стационар фазаның полярлыгын стиролның оптималь күләме һәм ирекле радикаль полимеризация реакция вакыты белән контрольдә тотарга мөмкин. Реакциянең соңгы этабы (ирекле радикаль полимеризация) бик мөһим һәм ул стационар фазаның полярлыгын үзгәртә ала. Бу стационар фазаларның углерод йөкләнешен тикшерү өчен элементаль анализ үткәрелде. Стирол күләмен һәм реакция вакытын арттыру стационар фазаның углерод йөкләнешен арттырганы һәм киресенчә күзәтелде. Стиролның төрле концентрацияләре белән әзерләнгән SPларның төрле углерод йөкләнеше бар. Тагын бер тапкыр, бу стационар фазаларны дат басмас корыч колонналарга йөкләгез һәм аларны тикшерегез. Хроматографик күрсәткечләр (сайлаучанлык, чишелеш, N кыйммәте һ.б.). Бу тәҗрибәләргә нигезләнеп, контрольдә тотылган полярлыкны һәм аналитның яхшы саклануын тәэмин итү өчен PMP стационар фазасын әзерләү өчен оптимальләштерелгән формула сайланды.
Биш пептид катнашмасы (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, лейцин энкефалин) шулай ук ​​мобиль фаза кулланып PMP колонкасы ярдәмендә бәяләнде; 60/40 (v/v) ацетонитрил/су (0,1% TFA) 80 мкл/мин агым тизлегендә. Оптималь элюция шартларында, бер баганага теоретик пластина саны (N) (100 × 1,8 мм id) 20,000 ± 100 (200,000 пластина/м²). 3 нче таблицада өч PMP багана өчен N кыйммәтләре бирелгән, һәм хроматограммалар 5А рәсемдә күрсәтелгән. Югары агым тизлегендә (700 мкл/мин) PMP баганасында тиз анализ, бер минут эчендә биш пептид элюцияләнде, N кыйммәтләре бик яхшы иде, бер баганага 13,500 ± 330 (100 × 1,8 мм id), 135,000 пластина/м² туры килә (5B рәсем). Бер үк зурлыктагы өч баганага (100 × 1,8 мм id) тикшерү өчен өч төрле PMP стационар фазасы тутырылган. кабатланучанлык. Һәр багана өчен аналит концентрациясе оптималь элюция шартларын һәм теоретик пластиналар саны N һәм бер үк сынау катнашмасын һәр баганада аеру өчен саклау вакытын кулланып теркәлгән. PMP баганалары өчен кабатланучанлык мәгълүматлары 4 нче таблицада күрсәтелгән. PMP баганасының кабатланучанлыгы 3 нче таблицада күрсәтелгәнчә, бик түбән %RSD кыйммәтләре белән яхшы корреляцияләнә.
ПМП баганасында (B) һәм Ascentis Express RP-Amide баганасында (A) пептид катнашмасын аеру; күчмә фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), ПМП баганасының үлчәмнәре (100 × 1,8 мм id); аналитик Кушылмаларның элюция тәртибе: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) һәм 5 (лейцин) кислотасы энкефалин)).
Югары нәтиҗәле сыек хроматографиядә кеше сыворотка альбуминының триптик дайджестларын аеру өчен PMP колонкасы (100 × 1,8 мм ид) бәяләнде. 6 нчы рәсемдәге хроматограмма үрнәкнең яхшы аерылганлыгын һәм чишелеше бик яхшы булуын күрсәтә. HSA дайджестлары 100 мкл/мин агым тизлеге, 70/30 ацетонитрил/су хәрәкәтчән фазасы һәм 0,1% TFA кулланып анализланды. Хроматограммада күрсәтелгәнчә (6 нчы рәсем), HSA дайджесты 17 пептидка туры килә торган 17 пикка бүленгән. HSA дайджестындагы һәр пикның аеру нәтиҗәлелеге исәпләнде һәм кыйммәтләр 5 нче таблицада бирелгән.
HSA триптик дайджесты (100 × 1,8 мм ид.) PMP баганасында аерылды; агым тизлеге (100 мкл/мин), хәрәкәтчән фаза 60/40 ацетонитрил/су, 0,1% TFA белән.
монда L - колонна озынлыгы, η - күчмә фазаның ябышлыгы, ΔP - колоннаның кире басымы, һәм u - күчмә фазаның сызыклы тизлеге. PMP колоннасының үткәрүчәнлеге 2,5 × 10-14 м2, агым тизлеге 25 мкл/мин, һәм 60/40 v/v ACN/су кулланылган. PMP колоннасының үткәрүчәнлеге (100 × 1,8 мм id) безнең алдагы тикшеренү 34 сылтамасына охшаш иде. Өстән күзәнәкле кисәкчәләр белән тутырылган колоннаның үткәрүчәнлеге: 1,3 мкм кисәкчәләр өчен 1,7 × 10-15, 1,7 мкм кисәкчәләр өчен 3,1 × 10-15, 2,6 мкм кисәкчәләр өчен 5,2 × 10-15 һәм 2,5 × 10-14 м2. 5 мкм кисәкчәләр өчен 43. Шуңа күрә PMP фазасының үткәрүчәнлеге 5 мкм үзәк кабыклысына охшаш. кисәкчәләр.
монда Wx - хлороформ белән тутырылган колоннаның авырлыгы, Wy - метанол белән тутырылган колоннаның авырлыгы, ә ρ - эреткечнең тыгызлыгы. Метанол (ρ = 0.7866) һәм хлороформның (ρ = 1.484) тыгызлыклары. Без элек өйрәнгән КРЕМНИК КИСӘКЧӘКЧӘЛӘРЕ-C18 колонналарының (100 × 1.8 мм идентификатор) 34 һәм C18-Мочевина колонналарының 31 гомуми күзәнәклелеге 0.63 һәм 0.55 иде. Бу мочевина лигандларының булуы стационар фазаның үткәрүчәнлеген киметә дигән сүз. Икенче яктан, PMP колоннасының гомуми күзәнәклелеге (100 × 1.8 мм идентификатор) 0.60 тәшкил итә. PMP колонналарының үткәрүчәнлеге C18 белән бәйләнгән кремний диоксиды кисәкчәләре белән тутырылган колонналарныкыннан түбәнрәк, чөнки C18 типтагы стационар фазаларда C18 лигандлары кремний диоксиды кисәкчәләренә сызыклы чылбырлар рәвешендә тоташа, ә полистирол типтагы стационар фазаларда, A чагыштырмача калынрак. аның тирәсендә полимер катламы барлыкка килә. Гадәти экспериментта багананың мәсамәлелеге түбәндәгечә исәпләнә:
7А һәм В рәсемнәрендә ван Деемтер графигының бер үк элюция шартларын (мәсәлән, 60/40 ACN/H2O һәм 0,1% TFA) кулланып PMP баганасының (100 × 1,8 мм id) һәм Ascentis Express RP-Amide баганасының (100 × 1,8 мм id) күрсәтелгән. Сайланган пептид катнашмалары (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 мкл/дә әзерләнде. Ике багана өчен дә минималь агым тизлеге 800 мкл/мин тәшкил итә. PMP багана һәм Ascentis Express RP-Amide баганалары өчен оптималь агым тизлегендә (80 мкл/мин) минималь HETP кыйммәтләре 2,6 мкм һәм 3,9 мкм тәшкил итте. HETP кыйммәтләре PMP баганасының (100 × 1,8 мм ид) аерылу нәтиҗәлелегенең коммерциядә сатыла торган Ascentis Express RP-Amide баганасына (100 × 1,8 мм ид) караганда күпкә яхшырак булуын күрсәтә. 7(А) рәсемдәге ван Деемтер графигы күрсәткәнчә, агым арткан саен N кыйммәтенең кимүе безнең алдагы тикшеренү белән чагыштырганда әһәмиятле түгел. PMP баганасының (100 ×) югарырак аерылу нәтиҗәлелеге Ascentis Express RP-Amide колонкасы белән чагыштырганда 1,8 мм id), хәзерге эштә кулланылган кисәкчәләр формасын, зурлыгын һәм катлаулы колонна тутыру процедураларын яхшыртуга нигезләнгән34.
(A) 0,1% TFA белән 60/40 ACN/H2O эчендә PMP баганасын (100 × 1,8 мм идентификатор) кулланып алынган ван Димтер графигы (HETP һәм күчмә фаза сызыкча тизлеге).(B) 0,1% TFA белән 60/40 ACN/H2O эчендә Ascentis Express RP-Amide баганасын (100 × 1,8 мм идентификатор) кулланып алынган ван Димтер графигы (HETP һәм күчмә фаза сызыкча тизлеге).
Полярлы полистирол стационар фазасы әзерләнде һәм югары нәтиҗәле сыек хроматографиядә кеше сыворотка альбуминының (HAS) синтетик пептид катнашмаларын һәм трипсин дайджестларын аеру өчен бәяләнде. Пептид катнашмалары өчен PMP колонкаларының хроматографик күрсәткечләре аеру нәтиҗәлелеге һәм чишелеше ягыннан бик яхшы. PMP колонкаларының яхшыртылган аеру күрсәткечләре төрле сәбәпләр белән бәйле, мәсәлән, кисәкчәләрнең зурлыгы һәм кремний диоксиды кисәкчәләренең пора зурлыгы, стационар фазаның контрольдә тотылган синтезы һәм баганаларның катлаулы тутырылуы. Югары аеру нәтиҗәлелегеннән тыш, югары агым тизлегендә багананың түбән арткы басымы бу стационар фазаның тагын бер өстенлеге. PMP колонкалары яхшы кабатланучанлык күрсәтә һәм төрле аксымнарның пептид катнашмаларын һәм трипсин дайджестын анализлау өчен кулланылырга мөмкин. Без бу багананы сыек хроматографиядә табигый продуктларны, дару үсемлекләреннән биоактив кушылмаларны һәм гөмбә экстрактларын аеру өчен кулланырга ниятлибез. Киләчәктә PMP колонкалары аксымнарны һәм моноклональ антитәнчекләрне аеру өчен дә бәяләнәчәк.
Филд, Дж.К., Эуэрби, М.Р., Лау, Дж., Тогерсен, Х. һәм Петерссон, П. Кире фазалы хроматография ярдәмендә пептидларны аеру системаларын тикшерү I өлеш: Колонна характеристикасы протоколын эшләү. Хроматография журналы. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б. һ.б. Йогышлы авыруларны дәвалау өчен эшләнгән яхшыртылган актив пептидлар. Биотехнология. Алга киткән. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж. һәм Хрестчатиский, М. Синтетик терапевтик пептидлар: фән һәм базар. Даруларны ачу.15 (1-2) бүген, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Алга киткән протеомик сыек хроматография. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. һ.б. Алга киткән сыек хроматография-масса спектрометриясе киң максатчан метаболомика һәм протеомиканы кертү мөмкинлеген бирә. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, С.М. һәм Солсбери, Дж.Дж. Дарулар эшләүдә UHPLC роле. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. һәм Клаузен, А.М. Тиз аеру өчен югары басымлы сыек хроматографиясенең төп һәм гамәли аспектлары. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, С.А. һәм Челитчефф, П. Дарулар эшләүдә ультра югары нәтиҗәле сыек хроматографиясен куллану. Хроматография журналы. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. һ.б. Энтеровирусларны нәтиҗәле чистарту өчен судагы майлы югары эчке фазалы эмульсияләрдән әзерләнгән монолит макропорозлы гидрогельләр. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Ши, Ю., Сян, Р., Хорват, К. һәм Вилкинс, ДЖА. Протеомикада сыек хроматографиянең роле. Хроматография журналы. А 1053(1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вейтей, Дж.-Л. һәм Гийарм, Д. Терапевтик пептидлар һәм аксымнарны кире фазалы сыек хроматографиядә аеруның яңа тенденцияләре: теория һәм кушымталар. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Беренче һәм икенче аеру үлчәмнәрендә төрле pH кыйммәтләрен кулланып, RP-RP-HPLC системасын кулланып пептидларны ике үлчәмле аеру. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Фелетти, С. һ.б. C18 суб-2 мкм тулы һәм өслекле күзәнәкле кисәкчәләр белән тутырылган югары нәтиҗәле хроматографик колонкаларның масса күчерү үзенчәлекләре һәм кинетик күрсәткечләре тикшерелде. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Пиовесана, С. һ.б. Үсемлек биоактив пептидларын изоляцияләү, идентификацияләү һәм валидацияләүдәге соңгы тенденцияләр һәм аналитик кыенлыклар. анус. биологик анус. Химик.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж.Б. һ.б. Тереклек патшалыгының протеомик ландшафты. Табигать 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
ДеЛюка, К. һ.б. Терапевтик пептидларны препаратив сыек хроматография ярдәмендә эшкәртү. Molecule (Базель, Швейцария) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Катнаш режимлы хроматография һәм аны биополимерларга куллану. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Чжао, Г., Донг, Х.-Й. һәм Сун, Й. Катнаш режимлы аксым хроматографиясе өчен лигандлар: принцип, характеристика һәм дизайн. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).