Nature.com сайтына кергәнегез өчен рәхмәт. Сез кулланган браузер версиясе CSS өчен чикләнгән ярдәмгә ия. Иң яхшы тәҗрибә өчен без яңартылган браузерны кулланырга киңәш итәбез (яки Internet Explorer'та яраклашу режимын сүндерегез). Шул ук вакытта, ярдәмне дәвам итәр өчен, без сайтны стильләр һәм JavaScriptсыз күрсәтәчәкбез.
Кисәк кремний кисәкчәләре макропор кисәкчәләрен алу өчен кайбер модификацияләр белән эремчек-гель ысулы белән әзерләнгәннәр. Бу кисәкчәләр N-фенилмалеймид-метилвинилисокянат (PMI) һәм стирол белән N-фенилмалеймид интернациональ полистирлы стационар стационар фенора полимеры. . пептид катнашмасының күләме 280,000 тәлинкә / м² кадәр. Эшләнгән багананың аеру күрсәткечләрен коммерция Ascentis Express RP-Amide баганасы белән чагыштырганда, PMP баганасының аеру эше коммерция баганасыннан аеру эффективлыгы һәм резолюциясе ягыннан өстенрәк булганы күзәтелде.
Соңгы елларда биофармацевтика индустриясе базар өлешенең сизелерлек артуы белән киңәюче глобаль базарга әйләнде. Биофармацевтика сәнәгатенең шартлаучы үсеше белән 1,2,3, пептидлар һәм протеиннар анализы бик кирәк. Пептид синтезы вакытында берничә пычрак барлыкка килә, шуңа күрә кирәкле чисталык пептидларын алу өчен хроматографик чистарту таләп ителә. бер үрнәктә ачыклана торган төрләр. Масса спектрометриясе пептид һәм протеин эзләү өчен эффектив корал булса да, мондый үрнәкләр масса спектрометрына кертелсә, аеру идеаль булмас. Бу проблеманы сыек хроматография (LC) аеруны кулланып йомшартырга мөмкин, бу масса спектрометрына, аналитиклар санын киметергә мөмкин. бу аналитикларны туплау һәм MS ачыклау сизгерлеген яхшырту. Сыек хроматография (LC) соңгы ун елда сизелерлек алга китте һәм протеом анализында популяр техникага әйләнде7,8,9,10.
Кире фазалы сыек хроматография (RP-LC) октадецил-модификацияләнгән кремний (ODS) ярдәмендә пептид катнашмаларын чистарту һәм аеру өчен киң кулланыла11,12,13. Шулай да, RP стационар этаплары пептидлар һәм аксымнарның канәгатьләнерлек аерылуын тәэмин итмиләр, поляр булмаган анализлар, поляр булмаган фазалар. Бу аналитиклар белән үзара бәйләнештә тору өчен, мультимодаль үзара бәйләнешне тәэмин итүче катнаш режимлы хроматография, пептидларны, протеиннарны һәм башка катлаулы катнашмаларны аеру өчен RP-LC өчен альтернатива булырга мөмкин. Төрле катнаш режимлы стационар этаплар әзерләнде, һәм бу этаплар белән тутырылган баганалар пептид һәм протеин аеру өчен кулланылды17,18,19,20,20,2,20,2,20,20,20,20,2,20,20,20,20,2,20,20,20,2 HILIC / RPLC, поляр инкальация / RPLC) поляр һәм поляр булмаган төркемнәр булганга күрә пептид һәм протеинны аеру өчен яраклы22,23,24,25,26,27,28 .Бу охшаш поляр группалар белән поляр үзара стационар этаплар яхшы аерылу көчен күрсәтәләр, поляр һәм поляр булмаган аналитиклар арасында үзара бәйләнеш. Мультимодаль үзара бәйләнеш 29, 30, 31, 32. Соңгы вакытта Чжан һәм башкалар. 30 додецил белән беткән полиамин стационар этап әзерләде һәм углеводородлар, антидепрессантлар, флавоноидлар, нуклеозидлар, эстрогеннар һәм башка берничә аналитикны уңышлы аерды. Поляр интеркалаторның поляр һәм поляр булмаган төркемнәре бар, шуңа күрә ул гидрофобик һәм гидрофилик колонкалар булган пептидлар һәм аксымнарны аеру өчен кулланылырга мөмкин. Ascentis Express RP-Amide баганалары исеме, ләкин бу баганалар амин 33 анализы өчен генә кулланыла.
Хәзерге тикшеренүдә поляр урнаштырылган стационар этап (N-фенилмалеймид белән урнаштырылган полистирол) әзерләнде һәм HSA пептидларын һәм трипсин ашламаларын аеру өчен бәяләнде. Стационар этап түбәндәге стратегия ярдәмендә әзерләнде. Силикат кремний кисәкчәләре алдагы басмада бирелгән процедура буенча әзерләнде. Зур күзәнәк зурлыгында кремний кисәкчәләре. Икенче, яңа лиганд, фенилмалеймид-метил винил изокянат синтезланган һәм поляр урнаштырылган стационар фазаны әзерләү өчен кремний кисәкчәләрен чыгару өчен кулланылган. Нәтиҗәдә стационар фаза тотрыксыз корыч баганага салынган (100 × 1,8 мм идентификацияләнгән). багана. Биш пептидтан торган пептид катнашмаларының пакетланган баганасын аеруны бәяләгез. . пептидлар һәм протеиннар PMP баганасында яхшы чишелгән һәм эффектив булган, бу Ascentis Express RP-Amide баганасына караганда эффективрак булган.
PEG (Полиэтилен Гликол), Уреа, Ацетик Кислота, Триметокси Ортосиликат (ТМОС), Триметил Хлоросилан (TMCS), Трипсин, Кеше Серумы Альбумин (HSA), Аммоний Хлорид, Уреа, Гексан Метилдисилазан (HMDS), Метакрил. 4-Гидрокси-ТЕМПО, Бензойл Пероксид (BPO), HPLC Ацетонитрил (ACN), Метанол, 2-Пропанол, һәм Ацетон Сигма-Алдричтан (Сент-Луис, МО, АКШ) сатып алынган.
Карбамид (8 г), полиэтилен гликол (8 г), һәм 8 мл 0,01 Н кислотасы кислотасы 10 минутка кайнатылды, аннары 24 мл ТМОС боз-салкын шартларда кушылды. Реакция катнашмасы 40 ° C 6 сәгать эчендә җылытылды, аннары 120 ° C дат басмаган корыч автоклавда. 12 сәгать корыган. мичтә шома җир һәм 1250 сәгать эчендә 550 ° C кальцинацияләнде. Өч партия әзерләнде һәм кисәкчәләрнең зурлыгында, күзәнәк күләмендә һәм өслек мәйданында үрчү мөмкинлеген тикшерү өчен характеристика бирелде.
Алдан синтезланган лиганд фенилмалеймид-метилвинилисокянат (PCMP) белән кремний кисәкчәләрен өслек модификациясе белән, аннары стирол белән радиаль полимеризация, поляр төркем булган кушылма әзерләнде. Агрегатлар һәм полистирол чылбырлары өчен стационар этап. Әзерлек процессы түбәндә тасвирланган.
Н-фенилмалеймид (200 мг) һәм метил винил изокянат (100 мг) коры толуенда эретелде, һәм 0,1 мл 2,2′-азоисобутиронитрил (AIBN) реакция флассасына фенилмалеймид-метил винил изокянат кополимеры (60 мм). 40 ° C температурада 3 сәгать.
Кипкән кремний кисәкчәләре (2 г) коры толуенда (100 мл) таралдылар, 500 мл түгәрәк төбендә 10 минутка кушылдылар һәм соникалаштырылды. PMCP (10 мг) толуенда эретелде һәм тамчы функция аша реакция флассасына тамчы тамчы кушылды. кремний кисәкчәләре (100 г) толуенда (200 мл) эретелде һәм 4-гидрокси-ТЕМПО (2 мл) катализатор буларак 100 µЛ дибутилтин дилатурасы булганда кушылды.
Стирол (1 мл), бензойл пероксиды BPO (0,5 мл), һәм TEMPO-PMCP кушылган кремний кисәкчәләре (1,5 г) толуенда таралдылар һәм азот белән чистартылды. Стиролны полимеризацияләү 100 ° C температурада 12 сәгать дәвамында ясалды.
-3рнәкләр 39-3 К температурада 1 сәгать эчендә деградацияләнде, 10-3 Торрдан да ким булмаган калдык басымы алу өчен. P / P0 = 0.99 чагыштырмача басымда adsorbed N2 күләме гомуми күзәнәк күләмен билгеләр өчен кулланылды. Ялан һәм бәйләнгән кремний кисәкчәләренең морфологиясе сканерланган электрон микроскопия (Hitachi High Technologies, Токио, Япония). ябыштыргыч углерод тасмасы ярдәмендә багана. Алтын үрнәкләргә Q150T спуттер пальто белән капланган, һәм үрнәкләргә 5 нм Ау катламы салынган. Бу түбән көчәнеш ярдәмендә процесс эффективлыгын яхшырта һәм яхшы ашлык, салкын бөтерелү белән тәэмин итә. Кисәкчәләр күләме тарату. Ябык кремний кисәкчәләре һәм бәйләнгән кремний кисәкчәләре (һәрберсе 5 мг) 5 мл изопропанолда таралдылар, 10 минутка соникалаштырылды, 5 минутка вортекска куелды һәм мастеризаторның оптик эскәмиясенә куелды. Термогравиметрик анализ минутта 30 ° 800 ° C температурада.
Пыяла белән капланган дат басмас корыч тар тарлы колонналар (100 × 1,8 мм id) пычрак төрү ысулы ярдәмендә тутырылган, Резюмеда кулланылган шул ук процедураны кулланып. 31. Датланмаган корыч багана (пыяла белән капланган, 100 × 1,8 мм id) 1 мм фритны үз эченә алган розетка белән тоташтырылган (Аллтех Дирфилд, IL, АКШ) .Стационар фазаны әзерләгез, 1,2 мл метанолда 150 мг стационар фазаны туктатып, саклагыч баганага җибәрегез. 10 минут эчендә 100 MP басым, 15 минутта 80 MP, 30 минут эчендә 60 MP. Урнашу вакытында механик тибрәнү ике GC баганасы белән (Alltech, Deerfield, IL, АКШ) кулланылды. Колоннаны бертөрле төрүне тәэмин итү өчен.
LC насосы (10AD Шимадзу, Япония), инжектор (Валко (АКШ) C14 W.05) 50nL инъекция циклы, мембрана дегассеры (Шимадзу DGU-14A), UV-VIS капиллярлы тәрәзә төзелде Махсус µLC җайланма детекторы (UV-2075) һәм пыяла тезелгән микроклумнар. 365 һәм кыскарту союз капиллярлары (50 μm) кыскарту союзының 1/16 розеткасына урнаштырылды, мәгълүмат җыю һәм хроматографик эшкәртү 254 nm мониторинг UV анализы өчен сынап каралды.
Альбумин кеше зарарыннан, лиофилизацияләнгән порошок, ≥ 96% (агароза гели электрофорезы) 3 мг трипсин (1,5 мг), 4,0 М карбамид (1 мл), һәм 0,2 М аммиак биарбонаты (1 мл) белән кушылган. Эремә 10 минутка кайнатылды һәм 4 ° C температурада 1 мл.
Пептид катнашмаларын һәм HSA трипсин ашламаларын аеру PMP баганаларында аерым бәяләнде. Пептид катнашмасының һәм HSAның трипсин ашказанының PMP баганасы белән аерылуын тикшерегез һәм нәтиҗәләрне Ascentis Express RP-Amide баганасы белән чагыштырыгыз. Теоретик тәлинкә саны түбәндәгечә исәпләнә:
Ялан кремний кисәкчәләренең SEM рәсемнәре һәм бәйләнгән кремний кисәкчәләре. 2 .Семик кремний кисәкчәләренең (A, B) рәсемнәре шуны күрсәтә: безнең алдагы тикшеренүләрдән аермалы буларак, бу кисәкчәләр сферик, аларда кисәкчәләр озын яки тәртипсез симметрия бар.
Ялан кремний кисәкчәләренең (А, В) һәм бәйләнгән кремний кисәкчәләренең (C, D) электрон микроскоп рәсемнәрен сканерлау.
Ялангач кремний кисәкчәләренең һәм лиганд белән бәйләнгән кремний кисәкчәләренең кисәкчәләре бүленеше 3-нче рәсемдә күрсәтелгән .Күләм күләмендәге кисәкчәләрнең зурлыгы тарату кәкреләре химик модификациядән соң кремний кисәкчәләренең зурлыгы артуын күрсәттеләр. реклама (0,5) кыйммәте 3.05 мм (полистирол белән бәйләнгән кремний кисәкчәләре) 34. Бу партия реакция катнашмасында PEG, карбамид, ТМОС һәм кисотик кислотаның төрле катнашлары аркасында үткән өйрәнү белән чагыштырганда таррак кисәкчәләр тарату булган. кремний өслегенә полистирол катламы (0,97 мм) салган, ә PMP фазасында катлам калынлыгы 1,38 мм булган.
Ясалма кремний кисәкчәләренең һәм бәйләнешле кремний кисәкчәләренең кисәкчәләр размеры (А) һәм күзәнәк зурлыгы бүленеше.
Агымдагы өйрәнүнең кремний кисәкчәләренең күзәнәк күләме, күзәнәк күләме һәм өслеге мәйданы 1 (В) таблицасында бирелгән. Ялан кремний кисәкчәләренең PSD профильләре һәм бәйләнешле кремний кисәкчәләре 3 нче рәсемдә күрсәтелгән. Нәтиҗә алдагы өйрәнүебез белән чагыштырыла. һәм сызыкның үзгәрүе 3 нче рәсемдә күрсәтелгән. м2 / г химик модификациядән соң.
Стационар этапны элементлы анализлау нәтиҗәләре 2-нче таблицада күрсәтелгән. Хәзерге стационар этапның углерод йөкләнеше 6,35% тәшкил итә, бу безнең алдагы өйрәнүнең углерод йөкләнешеннән түбәнрәк (полистирол белән бәйләнгән кремний кисәкчәләре, тиешенчә, 7,93% 35 һәм 10,21%) 42. фенилмалеймид-метилвинилисокянат (PCMP) һәм 4-гидрокси-ТЕМПО кулланылды. Хәзерге стационар этапның азотның авырлыгы 2,21% тәшкил итә, алдагы тикшеренүләрдә азотның авырлыгы буенча 0,1735 һәм 0,85% белән чагыштырганда. 2.
Фенилмалеймид-метилвинилисокянат лиганы кремний кисәкчәләрен өстән модификацияләү өчен сайланган, чөнки поляр фенилмалеймид төркемнәре һәм винилосокянат төркемнәре бар. Фенилмалеймидның нормаль рНда виртуаль корылмасы юк. Стационар этапның полярлыгы оптималь күләмдә стирол һәм ирекле радикаль полимеризациянең реакция вакыты белән идарә ителергә мөмкин. Реакциянең соңгы адымы (ирекле-радикаль полимеризация) критик һәм стационар этапның углерод йөкләнешен тикшерү өчен ясалды. Стационар фаза һәм киресенчә. Төрле концентрацияле стирол белән әзерләнгән СПлар төрле углерод йөкләүләренә ия. Моннан тыш, бу стационар этапларны пасовкасыз корыч баганаларга йөкләгез һәм аларның хроматографик күрсәткечләрен тикшерегез (сайлап алу, резолюция, N кыйммәте һ.б.).
Биш пептид катнашмасы (Гли-Тир, Гли-Лей-Тир, Гли-Гли-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, лейцин энкефалин) шулай ук ​​күчмә фаза ярдәмендә PMP баганасы ярдәмендә бәяләнде; 60/40 (v / v) ацетонитрил / су (0,1% TFA) 80 μL / мин. пептидлар бер минут эчендә чыгарылды, N кыйммәтләре бик яхшы, баганага 13,500 ± 330 (100 × 1,8 мм id), 135,000 тәлинкәгә туры килә (5Б рәсем). Өч төрле зурлыктагы баганалар (100 × 1,8 мм id) репродуктивлыкны тикшерү өчен өч төрле PMP стационар фазасы белән тутырылган. PMP баганалары өчен репродуктивлык мәгълүматлары 4 таблицада күрсәтелгән. PMP баганасының репродуктивлыгы бик түбән% RSD кыйммәтләре белән яхшы корреляцияләнә, таблицада күрсәтелгәнчә.
ПМП баганасында пептид катнашмасын аеру (B) һәм Ascentis Express RP-Amide баганасы (A); мобиль фаза 60/40 ACN / H2O (TFA 0,1%), PMP баганасы үлчәмнәре (100 × 1,8 мм id); аналитик Кушымталарның элитация тәртибе: 1 (Глы-Тир), 2 (Гли-Лей-Тир), 3 (Гли-Глы-Тир-Арг), 4 (Тир-Иле-Гли-Сер-Арг) һәм 5 (лейцин) кислотасы энкефалин).
PMP баганасы (100 × 1,8 мм id) югары җитештерүчән сыек хроматографиядә кеше зарарлы альбуминның триптик ашламаларын аеру өчен бәяләнде. 6-нчы рәсемдәге хроматограмма үрнәкнең яхшы аерылганын һәм резолюциянең бик яхшы булуын күрсәтә. 17 пептидка. HSA ашказанындагы һәр чокырның аеру эффективлыгы исәпләнде һәм кыйммәтләр 5 таблицада китерелгән.
PMP баганасында HSA (100 × 1,8 мм id) триптик ашказаны аерылды; агым тизлеге (100 µЛ / мин), күчмә фаза 60/40 ацетонитрил / су 0,1% TFA белән.
монда L - багана озынлыгы, η - мобиль фазаның ябышлыгы, ΔP - багананың арткы басымы, ә сез - күчмә фазаның сызыклы тизлеге. PMP баганасының үткәрүчәнлеге 2,5 × 10-14 м2, агым тизлеге 25 μL / мин, һәм 60/40 v / v ACN / су кулланылды. өстән тыш күзәнәк кисәкчәләр белән тутырылган багана: 1,7 мм кисәкчәләр өчен 1,7 × 10-15, 1,7 мм кисәкчәләр өчен 3,1 × 10-15, 2,2 мм кисәкчәләр өчен 2,5 × 10-14 м2 5 мм кисәкчәләр өчен 43. Шуңа күрә PMP фазасының үткәрүчәнлеге 5 мм үзәк-кабык кисәкчәләренә охшаган.
монда Wx - хлороформ белән тутырылган багананың авырлыгы, Wy - метанол белән тутырылган багананың авырлыгы, һәм ρ - эретүче тыгызлыгы. Метанол тыгызлыгы (ρ = 0.7866) һәм хлороформ (ρ = 1.484) .Силиканың ПАРТИКЛАР-C18 баганалары (100 × 1.8 мм). Бу карбамид лигандларының булуы стационар этапның үткәрүчәнлеген киметә дигәнне аңлата. Икенче яктан, PMP баганасының гомуми күзәнәклеге (100 × 1,8 мм id) 0,60. Аның тирәсендә чагыштырмача калын полимер катлам барлыкка килә. Типик экспериментта багананың күзәнәклеге түбәндәгечә исәпләнә:
Рәсем 7A, B PMP баганасын күрсәтә (100 × 1.8 мм id) һәм Ascentis Express RP-Amide баганасы (100 × 1.8 мм id) шул ук элитация шартларын кулланып (ягъни, 60/40 ACN / H2O һәм 0,1% TFA). ) вагон Демтер участогы. Сайланган пептид катнашмалары (Гли-Тир, Гли-Лей-Тир, Гли-Глы-Тир-Арг, Тир-Иле-Гли-Сер-Арг, Лейцин Энкефалин) 20 µL / ике багана өчен минималь агым тизлеге 800 µL / мин. 2.6 мм һәм 3,9 мм. HETP кыйммәтләре PMP баганасының (100 × 1,8 мм id) аерылу эффективлыгы коммерцияле Ascentis Express RP-Amide баганасына караганда күпкә яхшырак булуын күрсәтә. RP-Amide баганасы кисәкчәләрнең формасын, зурлыгын, хәзерге эштә кулланылган катлаулы багана төрү процедураларын яхшыртуга нигезләнгән34.
(А) ван Демтер сюжеты (HETP мобиль фаза сызыклы тизлеккә каршы) 60/40 ACN / H2O белән 0,1% TFA белән PMP баганасы (100 × 1,8 мм id) ярдәмендә алынган.
Поляр вируслы полистирол стационар этап әзерләнде һәм синтетик пептид катнашмаларын һәм трипсин ашламаларын югары җитештерүчән сыек хроматографиядә кеше серумы альбуминын (HAS) аеру өчен бәяләнде. Пептид катнашмалары өчен PMP баганаларының хроматографик күрсәткечләре аеру эффективлыгы һәм резолюциясе. катлаулы багана төрү. highгары аеру эффективлыгына өстәп, югары агым темпларында түбән багана басымы - бу стационар этапның тагын бер өстенлеге. ПМП баганалары яхшы үрчүчәнлекне күрсәтәләр һәм төрле протеиннарның пептид катнашмаларын анализлау өчен кулланыла ала. Без бу багананы табигый продуктларны аеру өчен кулланырга уйлыйбыз, дару үсемлекләреннән биоактив кушылмалар, шулай ук ​​сыек хроматография. антителалар.
Кыр, ДжК, Эверби, М.Р., Лау, Дж., Тøгерсен, Х. & Питерсон, П. Хрестоматия.1603, 113–129.https: //doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомес, Б. һ.б. Йогышлы авыруларны дәвалау өчен эшләнгән яхшыртылган актив пептидлар. Биотехнологияләр.
Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинес, Дж.
Си, Ф., Смит, РД & Шен, Y. Протеомик сыек хроматография. Хрестоматия. 1261, 78–90 (2012).
Лю, В.
Чеснут, СМ & Солсбери, Дж. Наркотиклар үсешендә UHPLC роле. 30 сентябрь (8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. & Клаузен, AM Тиз аерылу өчен ультра югары басымлы сыек хроматографиянең төп һәм практик аспектлары. 30 сентябрь (8), 1167-1182.https: //doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Наркотиклар үсешендә ультра югары җитештерүчән сыек хроматографияне куллану.J. Хрестоматия.1119 (1-2), 140-146.https: //doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Гу, Х. һ.б. Монолит макропорозлы гидрогеллар, судагы югары эчке фаза эмульсияләреннән энтеровирусларны эффектив чистарту өчен әзерләнгән. Химик.Британ.J. 401, 126051 (2020).
Ши, Y .., Сян, Р., Хорват, С. & Вилкинс, ЯА Протеомикада сыек хроматографиянең роле. Хрестоматия.А 1053 (1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Вейтей, Дж. Даруханә.Биомедицина Фән.анус.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П. 28 нче сентябрь (14), 1694-1703 (2005).
Фелетти, С. һ.б. Масса-күләм тапшыру характеристикалары һәм C18 суб-2 мм тулы һәм өстән тыш күзәнәк кисәкчәләр белән тутырылган югары эффектив хроматографик баганаларның кинетик эшләнеше тикшерелде. Сентябрь 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Пиовесана, С. һ.б. үсемлекләр биоактив пептидларын изоляцияләү, ачыклау һәм раслаудагы соңгы тенденцияләр һәм аналитик проблемалар. Химик.410 (15), 3425–3444.https: //doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Мюллер, Дж.Б. Тормыш патшалыгының протеомик пейзажы. Табигать 582 (7813), 592-596.https: //doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
ДеЛука, С.
Янг, Y .. & Генг, X. Катнаш режимлы хроматография һәм аны биополимерларга куллану.J. Хрестоматия.А 1218 (49), 8813–8825 (2011).
Чжао, Г., Донг, X.- Й. & Кояш, Й. Биотехнология.144 (1), 3-11 (2009).