Merci fir Äre Besuch op Nature.com. D'Browserversioun, déi Dir benotzt, ënnerstëtzt CSS limitéiert. Fir déi bescht Erfahrung empfeelen mir Iech, en aktualiséierte Browser ze benotzen (oder de Kompatibilitéitsmodus am Internet Explorer auszeschalten). An der Zwëschenzäit, fir weider Ënnerstëtzung ze garantéieren, wäerte mir d'Websäit ouni Stiler a JavaScript uweisen.
Poréis Kieselerdeeler goufen duerch eng Sol-Gel-Method mat e puer Modifikatioune virbereet fir makroporéis Partikelen ze kréien. Dës Partikelen goufen duerch reversibel Additiounsfragmentatiounskettentransfer (RAFT) Polymerisatioun mat N-Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PMI) a Styrol derivatiséiert fir N-Phenylmaleimid-Interkalatioun vun der stationärer Polystyrol (PMP) Phase virzebereeden. Schmuelkaliber Edelstahlkolonnen (100 × 1,8 mm bannenzeg Duerchmiesser) goufen duerch Schlammpackung gepackt. Evaluatioun vun der PMP-Kolonnentrennung vun enger Peptidmëschung, déi aus fënnef Peptiden besteet (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) chromatographescher Leeschtung) an Trypsin-Verdauung vu mënschlechem Serumalbumin (HAS). Ënner optimalen Elutiounsbedingungen ass d'theoretesch Plackenzuel vun der Peptidmëschung bis zu 280.000 Placken/m². Vergläich vun der Trennungsleistung vun der entwéckelter Kolonn mat der kommerzieller Ascentis Express. RP-Amid-Kolonn, gouf observéiert, datt d'Trennleistung vun der PMP-Kolonn am Verglach mat der kommerzieller Kolonn wat d'Trennungseffizienz an d'Opléisung ugeet, besser war.
An de leschte Joren ass d'biopharmazeutesch Industrie zu engem wuessende globale Maart ginn, mat enger wesentlecher Erhéijung vum Maartundeel. Mat dem explosive Wuesstem vun der biopharmazeutesch Industrie1,2,3 ass d'Analyse vu Peptiden a Proteinen héich erwënscht. Zousätzlech zum Zilpeptid ginn e puer Ongereinheeten während der Peptidsynthese generéiert, sou datt eng chromatographesch Reinigung erfuerderlech ass fir Peptiden vun der gewënschter Rengheet ze kréien. D'Analyse a Charakteriséierung vu Proteinen a Kierperflëssegkeeten, Gewëss an Zellen ass eng extrem usprochsvoll Aufgab wéinst der grousser Zuel vu potenziell detektéierbare Spezies an enger eenzeger Prouf. Och wann d'Massenspektrometrie en effektivt Instrument fir Peptid- a Proteinsequenzéierung ass, ass d'Trennung net ideal, wann sou Proben an engem Duerchgang an de Massespektrometer injizéiert ginn. Dëst Problem kann duerch d'Ëmsetzung vu Flëssegkeetschromatographie (LC)-Trennungen virun der MS-Analyse geléist ginn, wat d'Zuel vun den Analyten, déi zu engem bestëmmten Zäitpunkt an de Massespektrometer kommen, reduzéiert4,5,6. Zousätzlech kënnen d'Analyten während der Flëssegkeetsphas-Trennung a schmuele Regiounen fokusséiert ginn, wouduerch dës Analyten konzentréiert ginn an d'MS-Detektiounsempfindlechkeet verbessert gëtt. Flëssegkeetschromatographie (LC) huet sech an de leschte Jore wesentlech entwéckelt a gouf zu enger populärer ... Technik an der proteomescher Analyse7,8,9,10.
Réckphas-Flëssegkeetschromatographie (RP-LC) gëtt wäit verbreet fir d'Reinigung an d'Trennung vu Peptidmëschungen mat Octadecyl-modifizéiertem Siliziumdioxid (ODS) als stationär Phas benotzt11,12,13. Wéinst hirer komplexer Struktur an amphiphiler Natur14,15 bidden RP-stationär Phasen awer keng zefriddestellend Trennung vu Peptiden a Proteinen. Dofir sinn speziell entwéckelt stationär Phasen noutwendeg fir Peptiden a Proteinen mat polaren an net-polaren Eenheeten z'analyséieren, fir mat dësen Analyten ze interagéieren an se ze behalen16. Gemëschte-Modus-Chromatographie, déi multimodal Interaktiounen ubitt, kann eng Alternativ zu RP-LC fir d'Trennung vu Peptiden, Proteinen an aner komplex Mëschunge sinn. Verschidde gemëschte-Modus-stationär Phasen goufen virbereet, a Kolonnen, déi mat dëse Phasen gepackt sinn, goufen fir Peptid- a Proteintrennungen benotzt17,18,19,20,21. Gemëschte-Modus-stationär Phasen (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar Interkalatioun/RPLC) si gëeegent fir Peptid- a Proteintrennungen wéinst der Präsenz vu souwuel polaren wéi och net-polaren... Gruppen22,23,24,25,26,27,28. Ähnlech weisen polar interkaléierend stationär Phasen mat kovalent gebonnenen polare Gruppen eng gutt Trennkraaft an eng eenzegaarteg Selektivitéit fir polar an net-polar Analyten, well d'Trennung vun der Interaktioun tëscht Analyt an stationärer Phas ofhänkt. Multimodal Interaktiounen29, 30, 31, 32. Viru kuerzem hunn den Zhang et al.30 eng Dodecyl-terminéiert Polyamin-stationär Phas virbereet an hunn erfollegräich Kuelewaasserstoffer, Antidepressiva, Flavonoiden, Nukleosiden, Östrogenen a verschidde aner Analyten getrennt. Den polaren Interkalator huet souwuel polar wéi och net-polar Gruppen, sou datt e benotzt ka ginn fir Peptiden a Proteinen ze trennen, déi souwuel hydrophob wéi och hydrophil Eenheeten hunn. Polar agebett Kolonnen (z.B. Amid-agebett C18 Kolonnen) sinn kommerziell ënner dem Handelsnumm Ascentis Express RP-Amide Kolonnen verfügbar, awer dës Kolonnen ginn nëmme fir d'Analyse vum Amin 33 benotzt.
An der aktueller Studie gouf eng polar agebett stationär Phas (N-Phenylmaleimid-agebett Polystyrol) virbereet an op d'Trennung vu Peptiden an Trypsin-Verdauungen vun HSA evaluéiert. Déi stationär Phas gouf mat der folgender Strategie virbereet. Poréis Siliziumdioxid-Partikelen goufen no der Prozedur aus eiser viregter Publikatioun mat e puer Modifikatiounen um Virbereedungsprotokoll virbereet. De Verhältnis vun Harnstoff, Polyethylenglykol (PEG), TMOS, Waasser Essigsäure gouf ugepasst fir Siliziumdioxid-Partikelen mat grousser Poregréisst virzebereeden. Zweetens gouf e neie Ligand, Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat, synthetiséiert a benotzt fir Siliziumdioxid-Partikelen ze derivatiséieren fir eng polar agebett stationär Phas virzebereeden. Déi resultéierend stationär Phas gouf an eng Edelstahlkolonn (100 × 1,8 mm Id) mat dem optiméierte Packungsschema gepackt. D'Kolonnpackung gëtt duerch mechanesch Schwéngung ënnerstëtzt fir sécherzestellen, datt e homogent Bett an der Kolonn geformt gëtt. Evaluéiert d'gepackt Kolonntrennung vu Peptidmëschungen, déi aus fënnef Peptiden bestinn; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) an Trypsin-Verdauung vu mënschlechem Serumalbumin (HAS). Et gouf observéiert, datt d'Peptidmëschung an den Trypsin-Verdauung vun HSA sech mat gudder Opléisung an Effizienz trennen. D'Trennleistung vun der PMP-Kolonn gouf mat där vun der Ascentis Express RP-Amid-Kolonn verglach. Souwuel Peptiden ewéi och Proteine ​​goufen als gutt opgeléist an effizient op der PMP-Kolonn observéiert, déi méi effizient war wéi d'Ascentis Express RP-Amid-Kolonn.
PEG (Polyethylenglykol), Harnstoff, Essigsäure, Trimethoxyorthosilikat (TMOS), Trimethylchlorsilan (TMCS), Trypsin, Mënschlecht Serumalbumin (HSA), Ammoniumchlorid, Harnstoff, Hexanmethyldisilazan (HMDS), Methacryloylchlorid (MC), Styrol, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoylperoxid (BPO), HPLC-Qualitéit Acetonitril (ACN), Methanol, 2-Propanol an Aceton. Kaaft vu Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Eng Mëschung aus Harnstoff (8 g), Polyethylenglykol (8 g) an 8 ml 0,01 N Essigsäure gouf 10 Minutte laang geréiert, an duerno goufen 24 ml TMOS ënner äiskale Konditiounen derbäigesat. D'Reaktiounsmëschung gouf 6 Stonnen bei 40 °C an duerno 8 Stonnen bei 120 °C an engem Autoklav aus Edelstol erhëtzt. D'Waasser gouf ofgegoss an dat reschtlecht Material gouf 12 Stonnen bei 70 °C gedréchent. Déi gedréchent mëll Mass gouf an engem Uewen glat gemuel a 12 Stonnen bei 550 °C kalzinéiert. Dräi Chargen goufen virbereet a charakteriséiert fir d'Reproduzéierbarkeet a punkto Partikelgréisst, Poregréisst a Fläch z'ënnersichen.
Duerch d'Uewerflächenmodifikatioun vu Silica-Partikelen mat dem virsynthetiséierte Ligand Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PCMP), gefollegt vun enger radialer Polymerisatioun mat Styrol, gouf eng polargrupphalteg Verbindung hiergestallt. Stationär Phas fir Aggregater a Polystyrolketten. De Virbereedungsprozess gëtt hei ënnendrënner beschriwwen.
N-Phenylmaleimid (200 mg) a Methylvinylisocyanat (100 mg) goufen an dréchenem Toluol opgeléist, an 0,1 ml 2,2'-Azoisobutyronitril (AIBN) goufen an de Reaktiounskolben bäigefüügt fir de Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat-Copolymer (PMCP) ze preparéieren. D'Mëschung gouf 3 Stonnen bei 60°C erhëtzt, gefiltert an 3 Stonnen an engem Uewen bei 40°C gedréchent.
Gedréchent Siliziumdioxid-Partikelen (2 g) goufen an dréchenem Toluol (100 ml) dispergéiert, an engem 500 ml Ronnbuedemkolben 10 Minutte laang geréiert an sonikéiert. PMCP (10 mg) gouf an Toluol opgeléist an iwwer en Tropfstrichter an de Reaktiounskolben bäigefüügt. D'Mëschung gouf 8 Stonnen bei 100 °C ënner Reflux gekacht, gefiltert a mat Aceton gewäsch an 3 Stonnen bei 60 °C gedréchent. Duerno goufen PMCP-gebonnen Siliziumdioxid-Partikelen (100 g) an Toluol (200 ml) opgeléist an 4-Hydroxy-TEMPO (2 ml) gouf a Präsenz vun 100 µL Dibutylzinndilaurat als Katalysator bäigefüügt. D'Mëschung gouf 8 Stonnen bei 50 °C geréiert, gefiltert an 3 Stonnen bei 50 °C gedréchent.
Styrol (1 ml), Benzoylperoxid BPO (0,5 ml) an TEMPO-PMCP-gebonnen Siliziumdioxid-Partikelen (1,5 g) goufen an Toluol dispergéiert a mat Stéckstoff gespullt. D'Polymerisatioun vum Styrol gouf 12 Stonnen bei 100 °C duerchgefouert. Dat resultéierend Produkt gouf mat Methanol gewäsch an iwwer Nuecht bei 60 °C gedréchent. De gesamte Reaktiounsschema gëtt an der Figur 1 gewisen.
D'Prouwe goufen 1 Stonn bei 393 K entgast, fir en Reschtdrock vu manner wéi 10-3 Torr z'erreechen. D'Quantitéit un N2, déi bei engem relativen Drock vu P/P0 = 0,99 adsorbéiert gouf, gouf benotzt fir de gesamte Porenvolumen ze bestëmmen. D'Morphologie vu plakege a ligandgebonnene Siliziumdioxid-Partikelen gouf mat Rasterelektronemikroskopie (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan) ënnersicht. Gedréchent Prouwe (plakeg Siliziumdioxid a ligandgebonnene Siliziumdioxid-Partikelen) goufen op eng Aluminiumsail mat Kuelestoffklebeband placéiert. Gold gouf op de Prouwe mat engem Q150T Sputterbeschichtungsapparat platéiert, an eng 5 nm Au-Schicht gouf op de Prouwe ofgesat. Dëst verbessert d'Prozesseffizienz mat niddrege Spannungen a suergt fir feinkäreg, kal Sputterung. En Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 Elementaranalysator gouf fir d'Elementaranalyse benotzt. E Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 Partikelgréisstanalysator gouf benotzt fir d'Partikelgréisstverdeelung ze kréien. Plakeg Siliziumdioxid-Partikelen a ligandgebonnene Siliziumdioxid-Partikelen (jee 5 mg) goufen an 5 ml Isopropanol dispergéiert, 10 Minutte laang sonikéiert, 5 Minutte laang gevirbelt an op der optescher Aarbechtsbank vum Mastersizer placéiert. D'thermogravimetrisch Analyse gouf mat enger Geschwindegkeet vu 5 °C pro Minutt iwwer engem Temperaturberäich vun 30 bis 800 °C duerchgefouert.
Glasgefütterte Sailen aus Edelstol mat schmuelem Laf mat Dimensiounen (100 × 1,8 mm i.d.) goufen mat der Schlammpackungsmethod gepackt, andeems déiselwecht Prozedur an der Ref. 31. Eng Edelstahlkolonn (mat Glas ausgekleet, 100 × 1,8 mm bannenzegen Duerchmiesser) mat engem Auslaaffitting mat engem 1 µm Frit gouf un e Schlammpacker (Alltech Deerfield, IL, USA) ugeschloss. E stationäre Schlamm gëtt virbereet andeems 150 mg stationär Phas an 1,2 ml Methanol suspendéiert a se an d'Späichersail geschéckt gëtt. Methanol gouf als Schlammléisungsmëttel souwéi als Undriffsmëttel benotzt. D'Kolonn gëtt sequenziell gefëllt andeems een Drock vun 100 MP fir 10 Minutten, 80 MP fir 15 Minutten a 60 MP fir 30 Minutten uwendet. Wärend dem Packen gouf mechanesch Schwéngungen mat zwee GC-Kolonneschüttel (Alltech, Deerfield, IL, USA) ugewannt fir eng gläichméisseg Packung vun der Kolonn ze garantéieren. De Schlammpacker zoumaachen a lues a lues den Drock lassloossen, fir Schied an der Kolonn ze vermeiden. D'Kolonn vun der Schlammpackeenheet trennen an eng aner Fitting un den Inlet an un den LC-System uschléissen, fir hir Leeschtung ze kontrolléieren.
Eng LC-Pompel (10AD Shimadzu, Japan), en Injektor (Valco (USA) C14 W.05) mat enger 50nL Injektiounsschleef, engem Membranentgaser (Shimadzu DGU-14A), engem UV-VIS Kapillarfënster gouf gebaut. E speziellen µLC-Detekter (UV-2075) a Mikrokolonnen mat Glas goufen zesummegesat. Ganz schmuel a kuerz Verbindungsschläich goufen benotzt fir den Effekt vun der zousätzlecher Bandverbreederung vun de Kolonnen ze minimiséieren. Nom Verpacken goufen Kapillaren (50 μm Id 365) a Reduktiounskapillaren (50 μm) um 1/16″ Ausgang vun der Reduktiounsunioun installéiert. D'Datenerfassung an d'chromatographesch Veraarbechtung goufen mat der Multichro 2000 Software duerchgefouert. Iwwerwaachung bei 254 nm. D'Analyten goufen op UV-Absorptioun getest. Chromatographesch Donnéeë goufen mat OriginPro8 (Northampton, MA) analyséiert.
Albumin aus mënschlechem Serum, lyophiliséiert Pulver, ≥ 96% (Agarosegelelektrophorese) 3 mg gemëscht mat Trypsin (1,5 mg), 4,0 M Harnstoff (1 ml) an 0,2 M Ammoniumbikarbonat (1 ml). D'Léisung gouf 10 Minutte laang geréiert an 6 Stonnen an engem Waasserbad bei 37°C gehale, duerno mat 1 ml 0,1% TFA ofgekillt. D'Léisung filteren a bei enger Temperatur vun 4 °C lageren.
D'Trennung vu Peptidmëschungen an HSA-Trypsin-Verdauungen gouf separat op PMP-Sailen evaluéiert. Kontrolléiert d'Trennung vun der Peptidmëschung an dem Trypsin-Verdauung vun HSA duerch d'PMP-Sail a vergläicht d'Resultater mat der Ascentis Express RP-Amid-Sail. Déi theoretesch Plackenzuel gëtt wéi follegt berechent:
SEM-Biller vu blanne Siliziumdioxid-Partikelen a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen sinn an der FIG. 2 gewisen. SEM-Biller vu blanne Siliziumdioxid-Partikelen (A, B) weisen, datt dës Partikelen am Géigesaz zu eise fréiere Studien kugelfërmeg sinn, bei deenen d'Partikelen verlängert sinn oder eng onregelméisseg Symmetrie hunn. D'Uewerfläch vun de Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen (C, D) ass méi glat wéi déi vun de blanne Siliziumdioxid-Partikelen, wat eventuell op d'Beschichtung vu Polystyrolketten op der Uewerfläch vun de Siliziumdioxid-Partikelen zeréckzeféiere ass.
Rasterelektronemikroskopbiller vu blanne Siliziumdioxid-Partikelen (A, B) a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen (C, D).
D'Partikelgréisstverdeelung vu blanke Siliziumdioxid-Partikelen a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen ass an der Figur 3(A) gewisen. Volumenbaséiert Partikelgréisstverdeelungskurven hunn gewisen, datt d'Gréisst vun de Siliziumdioxid-Partikelen no der chemescher Modifikatioun zougeholl huet (Fig. 3A). D'Partikelgréisstverdeelungsdaten vun de Siliziumdioxid-Partikelen aus der aktueller Studie an der viregter Studie sinn an der Tabell 1(A) verglach. Déi volumenbaséiert Partikelgréisst, d(0,5), vu PMP ass 3,36 μm, am Verglach zu eiser viregter Studie mat engem ad(0,5)-Wäert vun 3,05 μm (Polystyrol-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen)34. Dëse Charge hat eng méi enk Partikelgréisstverdeelung am Verglach zu eiser viregter Studie wéinst de variéierende Verhältnisser vu PEG, Harnstoff, TMOS an Essigsäure an der Reaktiounsmëschung. D'Partikelgréisst vun der PMP-Phase ass liicht méi grouss wéi déi vun der Polystyrol-gebonnener Siliziumdioxid-Partikelphase, déi mir virdru studéiert hunn. Dëst bedeit, datt d'Uewerflächenfunktionaliséierung vu Siliziumdioxid-Partikelen mat Styrol nëmmen eng Polystyrol-Schicht (0,97 µm) op der Siliziumdioxid-Uewerfläch ofgesat huet, während an der PMP-Phase d'Schichtdicke war 1,38 µm.
Partikelgréisstverdeelung (A) a Poregréisstverdeelung (B) vu blanke Siliziumdioxid-Partikelen a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen.
D'Poregréisst, de Porevolumen an d'Uewerfläch vun de Siliziumdioxid-Partikelen vun der aktueller Studie sinn an der Tabell 1(B) uginn. D'PSD-Profiler vun de blanke Siliziumdioxid-Partikelen a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen sinn an der Figur 3(B) gewisen. D'Resultater si vergläichbar mat eiser viregter Studie. D'Poregréissten vun de blanke a Ligand-gebonnene Siliziumdioxid-Partikelen sinn 310 respektiv 241, wat drop hiweist, datt d'Poregréisst no der chemescher Modifikatioun ëm 69 erofgeet, wéi an der Tabell 1(B) gewisen, an d'Ännerung vun der Kurve ass an der Fig. 3(B) gewisen. Ähnlech ass de Porevolumen vun de Siliziumdioxid-Partikelen no der chemescher Modifikatioun vun 0,67 op 0,58 cm3/g erofgaang. Déi spezifesch Uewerfläch vun de momentan ënnersichte Siliziumdioxid-Partikelen ass 116 m2/g, wat vergläichbar mat eiser viregter Studie (124 m2/g) ass. Wéi an der Tabell 1(B) gewisen, ass d'Uewerfläch (m2/g) vun de Siliziumdioxid-Partikelen och vun 116 m2/g op 105 m2/g no der chemescher Modifikatioun erofgaang. Modifikatioun.
D'Resultater vun der Elementaranalyse vun der stationärer Phas sinn an der Tabell 2 gewisen. D'Kuelestoffbelaaschtung vun der aktueller stationärer Phas ass 6,35%, wat méi niddreg ass wéi d'Kuelestoffbelaaschtung vun eiser viregter Studie (Polystyrol-gebonnen Siliziumdioxid-Partikelen, 7,93%35 respektiv 10,21%)42. D'Kuelestoffbelaaschtung vun der aktueller stationärer Phas ass niddreg, well bei der Virbereedung vum aktuellen SP, zousätzlech zu Styrol, e puer polare Liganden wéi Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PCMP) a 4-Hydroxy-TEMPO benotzt goufen. De Stéckstoffgewiichtsprozentsaz vun der aktueller stationärer Phas ass 2,21%, am Verglach zu 0,1735 respektiv 0,85 Gewiichtsprozentsaz Stéckstoff a fréiere Studien. Dëst bedeit, datt de Gewiichtsprozentsaz Stéckstoff an der aktueller stationärer Phas méi héich ass wéinst Phenylmaleimid. Ähnlech waren d'Kuelestoffbelaaschtungen vun de Produkter (4) an (5) 2,7% respektiv 2,9%, während d'Kuelestoffbelaaschtung vum Endprodukt (6) war 6,35%, wéi an der Tabell 2 gewisen. De Gewiichtsverloscht gouf mat PMP an der stationärer Phas iwwerpréift, an d'TGA-Kurve ass an der Figur 4 gewisen. D'TGA-Kurve weist e Gewiichtsverloscht vun 8,6%, wat a gudder Iwwereneestëmmung mat der Kuelestoffbelaaschtung (6,35%) ass, well d'Liganden net nëmmen C, mä och N, O an H enthalen.
De Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat-Ligand gouf fir d'Uewerflächenmodifikatioun vu Silica-Partikelen gewielt, well en polare Phenylmaleimidgruppen a Vinylisocyanatgruppen huet. Vinylisocyanatgruppen kënnen weider mat Styrol reagéieren duerch lieweg Radikalpolymerisatioun. Den zweete Grond ass et, eng Grupp anzeféieren, déi eng moderat Interaktioun mam Analyt huet an keng staark elektrostatesch Interaktioun tëscht dem Analyt an der stationärer Phas, well d'Phenylmaleimid-Eenheet keng virtuell Ladung bei normalem pH huet. D'Polaritéit vun der stationärer Phas kann duerch déi optimal Quantitéit u Styrol an d'Reaktiounszäit vun der fräier Radikalpolymerisatioun kontrolléiert ginn. De leschte Schrëtt vun der Reaktioun (fräi Radikalpolymerisatioun) ass kritesch a kann d'Polaritéit vun der stationärer Phas änneren. Eng Elementaranalyse gouf duerchgefouert fir d'Kuelestoffbelaaschtung vun dëse stationäre Phasen ze kontrolléieren. Et gouf observéiert, datt d'Erhéijung vun der Quantitéit u Styrol an der Reaktiounszäit d'Kuelestoffbelaaschtung vun der stationärer Phas erhéicht huet an ëmgekéiert. SPs, déi mat verschiddene Konzentratioune vu Styrol preparéiert goufen, hunn ënnerschiddlech Kuelestoffbelaaschtungen. Luet dës stationär Phasen nach eng Kéier an Edelstahlkolonnen a kontrolléiert hir chromatographesch Leeschtung (Selektivitéit, Opléisung, N2). Wäert, etc.). Baséierend op dësen Experimenter gouf eng optiméiert Formuléierung ausgewielt fir d'stationär PMP-Phase virzebereeden, fir eng kontrolléiert Polaritéit an eng gutt Analytretentioun ze garantéieren.
Fënnef Peptidmëschungen (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) goufen och mat enger PMP-Kolonn mat enger mobiler Phase evaluéiert; 60/40 (v/v) Acetonitril/Waasser (0,1% TFA) bei enger Duerchflussrate vun 80 μL/min. Ënner optimalen Elutiounsbedingungen ass d'theoretesch Plackenzuel (N) pro Kolonn (100 × 1,8 mm Id) 20.000 ± 100 (200.000 Placken/m²). Tabelle 3 weist d'N-Wäerter fir déi dräi PMP-Sailen an d'Chromatogrammer sinn an der Figur 5A gewisen. Schnell Analyse op enger PMP-Sail bei héijer Duerchflussrate (700 μL/min), fënnef Peptiden goufen bannent enger Minutt eluéiert, d'N-Wäerter ware ganz gutt, 13.500 ± 330 pro Kolonn (100 × 1,8 mm Id), entsprécht 135.000 Placken/m² (Figur 5B). Dräi identesch grouss Sailen (100 × 1,8 mm Id) goufen mat dräi verschiddene Chargen vun der stationärer PMP-Phase gepackt fir d'Reproduzéierbarkeet ze kontrolléieren. D'Analytkonzentratioun fir all Kolonn gouf mat den optimalen Elutiounsbedingungen an der Unzuel vun den theoretesche Placken N an der Retentiounszäit opgeholl, fir datselwecht Testmëschung op all Kolonn ze trennen. D'Reproduzéierbarkeetsdaten fir d'PMP-Kolonnen sinn an der Tabell 4 gewisen. D'Reproduzéierbarkeet vun der PMP-Kolonn korreléiert gutt mat ganz niddrege %RSD-Wäerter, wéi an der Tabell 3 gewisen.
Trennung vun der Peptidmëschung op der PMP-Kolonn (B) an der Ascentis Express RP-Amid-Kolonn (A); mobil Phase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), Dimensiounen vun der PMP-Kolonn (100 × 1,8 mm bannenzegen Duerchmiesser); analytesch Elutiounsreihenfolge vun de Verbindungen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) a 5 (Leucin-Säure-Enkephalin)).
Eng PMP-Kolonn (100 × 1,8 mm Id) gouf fir d'Trennung vun tryptesche Verdauungen aus mënschlechem Serumalbumin an der Héichleistungsflëssegkeetschromatographie evaluéiert. De Chromatogramm an der Figur 6 weist, datt d'Prouf gutt getrennt ass an d'Opléisung ganz gutt ass. HSA-Verdauungen goufen mat enger Duerchflussquote vun 100 µL/min, mobiler Phase 70/30 Acetonitril/Waasser an 0,1% TFA analyséiert. Wéi am Chromatogramm (Figur 6) gewisen, gouf d'HSA-Verdauung an 17 Peaks opgedeelt, déi 17 Peptiden entspriechen. D'Trennungseffizienz vun all Peak am HSA-Verdauung gouf berechent an d'Wäerter sinn an der Tabell 5 uginn.
Eng tryptesch Verdauung vun HSA (100 × 1,8 mm i.d.) gouf op enger PMP-Sail getrennt; Duerchflussrate (100 µL/min), mobil Phas 60/40 Acetonitril/Waasser mat 0,1% TFA.
wou L d'Kolonnenlängt ass, η d'Viskositéit vun der mobiler Phas ass, ΔP den Géigendrock vun der Kolonn ass, an u d'linear Geschwindegkeet vun der mobiler Phas ass. D'Permeabilitéit vun der PMP-Kolonn war 2,5 × 10-14 m2, d'Duerchflussquote war 25 μL/min, an 60/40 v/v ACN/Waasser gouf benotzt. D'Permeabilitéit vun der PMP-Kolonn (100 × 1,8 mm Id) war ähnlech wéi déi vun eiser viregter Studie Ref.34. D'Permeabilitéit vun der Kolonn, déi mat uewerflächlech porösen Partikelen gepackt ass, ass: 1,7 × 10-15 fir 1,3 μm Partikelen, 3,1 × 10-15 fir 1,7 μm Partikelen, 5,2 × 10-15 an 2,5 × 10-14 m2 fir 2,6 μm Partikelen. Fir 5 μm Partikelen 43. Dofir ass d'Permeabilitéit vun der PMP-Phas ähnlech wéi déi vu 5 μm Kär-Schuel-Partikelen.
woubei Wx d'Gewiicht vun der mat Chloroform gepackter Kolonn ass, Wy d'Gewiicht vun der mat Methanol gepackter Kolonn ass, an ρ d'Dicht vum Léisungsmëttel ass. D'Dicht vu Methanol (ρ = 0,7866) a Chloroform (ρ = 1,484). Déi total Porositéit vun de SILICA PARTICLES-C18 Kolonnen (100 × 1,8 mm bannenzegen Duerchmiesser) 34 an C18-Harnstoff Kolonnen 31, déi mir virdru studéiert hunn, waren 0,63 respektiv 0,55. Dëst bedeit, datt d'Präsenz vun Harnstoffliganden d'Permeabilitéit vun der stationärer Phas reduzéiert. Op der anerer Säit ass déi total Porositéit vun der PMP Kolonn (100 × 1,8 mm bannenzegen Duerchmiesser) 0,60. D'Permeabilitéit vu PMP Kolonnen ass méi niddreg wéi déi vu Kolonnen, déi mat C18-gebonnene Siliziumdioxidpartikelen gepackt sinn, well a stationäre Phasen vum C18-Typ d'C18 Liganden un d'Siliziumdioxidpartikelen als linear Ketten gebonne sinn, während a stationäre Phasen vum Polystyrol-Typ d'Eng relativ déck Polymerschicht ass. gëtt ronderëm geformt. An engem typeschen Experiment gëtt d'Porositéit vun der Kolonn wéi berechent:
Figur 7A,B weisen d'PMP-Kolonn (100 × 1,8 mm bannenzegen Duerchmiesser) an d'Ascentis Express RP-Amid-Kolonn (100 × 1,8 mm bannenzegen Duerchmiesser) mat de selwechten Elutiounsbedingungen (dh 60/40 ACN/H2O an 0,1% TFA) vum van Deemter-Diagramm. Ausgewielte Peptidmëschungen (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) goufen an 20 µL/ preparéiert. Déi minimal Duerchflussrate fir béid Kolonnen ass 800 µL/min. Déi minimal HETP-Wäerter bei der optimaler Duerchflussrate (80 µL/min) fir d'PMP-Kolonn an d'Ascentis Express RP-Amid-Kolonn waren 2,6 µm respektiv 3,9 µm. D'HETP-Wäerter weisen datt d'Trennungseffizienz vun der PMP-Kolonn (100 × 1,8 mm bannenzegen Duerchmiesser) vill besser ass wéi déi kommerziell verfügbar Ascentis Express RP-Amid-Kolonn (100 × 1,8 mm bannenzegen Duerchmiesser). De van Deemter-Diagramm an der Fig. 7(A) weist datt den Réckgang vum N-Wäert mat zouhuelendem Duerchfluss net signifikant ass am Verglach mat eiser viregter Studie. Déi méi héich Trennungseffizienz vun der PMP-Kolonn (100 × 1,8 mm id) am Verglach mat der Ascentis Express RP-Amide Kolonn baséiert op Verbesserungen an der Partikelform, der Gréisst an de komplexe Kolonnpackungsprozeduren, déi an der aktueller Aarbecht benotzt ginn34.
(A) van Deemter-Diagramm (HETP géint linear Geschwindegkeet vun der mobiler Phas) kritt mat enger PMP-Kolonn (100 × 1,8 mm bannenzeger Duerchmiesser) an 60/40 ACN/H2O mat 0,1% TFA. (B) van Deemter-Diagramm (HETP géint linear Geschwindegkeet vun der mobiler Phas) kritt mat enger Ascentis Express RP-Amid-Kolonn (100 × 1,8 mm bannenzeger Duerchmiesser) an 60/40 ACN/H2O mat 0,1% TFA.
Eng polar agebett Polystyrol-stationär Phas gouf preparéiert an evaluéiert fir d'Trennung vu synthetesche Peptidmëschungen an Trypsin-Verdauungen aus mënschlechem Serumalbumin (HAS) an der Héichleistungsflëssegkeetschromatographie. Déi chromatographesch Leeschtung vu PMP-Sailen fir Peptidmëschungen ass exzellent wat d'Trennungseffizienz an d'Opléisung ugeet. Déi verbessert Trennungsleistung vu PMP-Sailen ass op verschidde Grënn zeréckzeféieren, wéi d'Partikelgréisst an d'Poregréisst vun de Silica-Partikelen, d'kontrolléiert Synthese vun der stationärer Phas an d'komplex Kolonnepackung. Nieft der héijer Trennungseffizienz ass den niddrege Kolonne-Réckdrock bei héijen Duerchflussraten en anere Virdeel vun dëser stationärer Phas. PMP-Sailen weisen eng gutt Reproduzéierbarkeet op a kënne fir d'Analyse vu Peptidmëschungen an d'Trypsin-Verdauung vu verschiddene Proteinen benotzt ginn. Mir plangen dës Kolonn fir d'Trennung vun Naturprodukter, bioaktive Verbindungen aus Heelplanzen a Pilzextrakter an der Flëssegkeetschromatographie ze benotzen. An Zukunft ginn PMP-Sailen och fir d'Trennung vu Proteinen an monoklonalen Antikörper evaluéiert.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Fuerschung iwwer Peptid-Trennungssystemer duerch Réckphasenchromatographie Deel I: Entwécklung vun engem Kolonnecharakteriséierungsprotokoll. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Verbessert aktiv Peptide fir d'Behandlung vun infektiösen Krankheeten. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetesch therapeutesch Peptiden: Wëssenschaft an de Maart. Medikamentenentdeckung. 15 (1-2) haut, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Fortgeschratt Proteomesch Flëssegkeetschromatographie. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Fortgeschratt Flëssegkeetschromatographie-Massenspektrometrie erméiglecht d'Integratioun vu breet gezielte Metabolomik a Proteomik. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ D'Roll vun UHPLC an der Entwécklung vu Medikamenter. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Grondleeënd an praktesch Aspekter vun der Ultrahochdrockflëssegkeetschromatographie fir séier Trennungen. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Uwendung vun der Ultra-Héichleistungs-Flëssegkeetschromatographie an der Medikamentenentwécklung. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Monolithesch makroporös Hydrogelen, déi aus Ueleg-an-Waasser-Emulsiounen mat héijer interner Phas fir eng effizient Reinigung vun Enteroviren hiergestallt ginn. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA D'Roll vun der Flëssegkeetschromatographie an der Proteomik. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Nei Trends an der Reverse-Phase-Flëssegkeetschromatographie-Trennung vun therapeutesche Peptiden a Proteinen: Theorie an Uwendungen. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Zweedimensional Trennung vu Peptiden mat Hëllef vun engem RP-RP-HPLC-System mat verschiddene pH-Wäerter an der éischter an zweeter Trennungsdimensioun. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. D'Massentransfercharakteristiken an d'kinetesch Leeschtung vun héicheffiziente chromatographesche Kolonnen, déi mat C18 sub-2 μm voll a superficiell porösen Partikelen gepackt sinn, goufen ënnersicht. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Rezent Trends an analytesch Erausfuerderungen an der Isolatioun, Identifikatioun a Validatioun vu planzbioaktive Peptiden. anus. biological anus. Chemical. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Déi proteomesch Landschaft vum Räich vum Liewen. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Downstream-Veraarbechtung vun therapeutesche Peptiden duerch präparativ Flëssegkeetschromatographie. Molecule (Basel, Schwäiz) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-Mode Chromatographie an hir Uwendung op Biopolymeren. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Liganden fir Mixed-Mode Proteinchromatographie: Prinzip, Charakteriséierung an Design. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).