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Particelle di silice porosa sono state preparate con un metodo sol-gel con alcune modifiche per ottenere particelle macroporose. Queste particelle sono state derivatizzate mediante polimerizzazione a trasferimento di catena per addizione-frammentazione reversibile (RAFT) con N-fenilmaleimide-metilvinilisocianato (PMI) e stirene per preparare la fase stazionaria di intercalazione di N-fenilmaleimide di polistirene (PMP). Colonne in acciaio inossidabile a foro stretto (100 × 1,8 mm id) sono state riempite mediante impaccamento in sospensione. È stata valutata la separazione su colonna PMP di una miscela di peptidi composta da cinque peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) prestazioni cromatografiche) e digestione con tripsina dell'albumina sierica umana (HAS). In condizioni di eluizione ottimali, il conteggio teorico dei piatti della miscela di peptidi è pari a 280.000 piatti/m². Confrontando le prestazioni di separazione della colonna sviluppata con la colonna commerciale Ascentis Express RP-Amide, si è osservato che le prestazioni di separazione della colonna PMP erano superiori a quelle della colonna commerciale in termini di efficienza di separazione e risoluzione.
Negli ultimi anni, l'industria biofarmaceutica è diventata un mercato globale in espansione con un aumento sostanziale della quota di mercato. Con la crescita esplosiva dell'industria biofarmaceutica1,2,3, l'analisi di peptidi e proteine ​​è altamente desiderata. Oltre al peptide target, durante la sintesi peptidica vengono generate diverse impurità, pertanto è necessaria la purificazione cromatografica per ottenere peptidi della purezza desiderata. L'analisi e la caratterizzazione delle proteine ​​nei fluidi corporei, nei tessuti e nelle cellule è un compito estremamente impegnativo a causa del grande numero di specie potenzialmente rilevabili in un singolo campione. Sebbene la spettrometria di massa sia uno strumento efficace per il sequenziamento di peptidi e proteine, se tali campioni vengono iniettati nello spettrometro di massa in un unico passaggio, la separazione non sarà ideale. Questo problema può essere mitigato implementando separazioni mediante cromatografia liquida (LC) prima dell'analisi MS, che ridurrà il numero di analiti che entrano nello spettrometro di massa in un dato momento4,5,6. Inoltre, durante la separazione in fase liquida, gli analiti possono essere focalizzati in regioni ristrette, concentrando così questi analiti e miglioramento della sensibilità di rilevamento MS. La cromatografia liquida (LC) ha compiuto progressi significativi nell'ultimo decennio ed è diventata una tecnica popolare nell'analisi proteomica7,8,9,10.
La cromatografia liquida a fase inversa (RP-LC) è ampiamente utilizzata per la purificazione e la separazione di miscele di peptidi utilizzando silice modificata con ottadecile (ODS) come fase stazionaria11,12,13. Tuttavia, le fasi stazionarie RP non forniscono una separazione soddisfacente di peptidi e proteine ​​a causa della loro struttura complessa e natura anfifilica14,15. Pertanto, sono necessarie fasi stazionarie appositamente progettate per analizzare peptidi e proteine ​​con porzioni polari e non polari per interagire con e trattenere questi analiti16. La cromatografia a modalità mista, che fornisce interazioni multimodali, può essere un'alternativa alla RP-LC per la separazione di peptidi, proteine ​​e altre miscele complesse. Sono state preparate diverse fasi stazionarie a modalità mista e colonne riempite con queste fasi sono state utilizzate per la separazione di peptidi e proteine17,18,19,20,21. Fasi stazionarie a modalità mista (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalazione polare/RPLC) sono adatti per la separazione di peptidi e proteine ​​grazie alla presenza di gruppi sia polari che non polari22,23,24,25,26,27,28. Allo stesso modo, le fasi stazionarie intercalanti polari con gruppi polari legati covalentemente mostrano un buon potere di separazione e una selettività unica per analiti polari e non polari, poiché la separazione dipende dall'interazione tra analita e fase stazionaria. Interazioni multimodali 29, 30, 31, 32. Recentemente, Zhang et al. 30 hanno preparato una fase stazionaria di poliammina terminata con dodecile e hanno separato con successo idrocarburi, antidepressivi, flavonoidi, nucleosidi, estrogeni e diversi altri analiti. L'intercalante polare ha sia gruppi polari che non polari, quindi può essere utilizzato per separare peptidi e proteine ​​che hanno sia porzioni idrofobiche che idrofile. Le colonne con gruppi polari incorporati (ad esempio, colonne C18 con gruppi ammidici incorporati) sono disponibili in commercio con il nome commerciale Ascentis Express RP-Amide, ma queste colonne sono utilizzate solo per l'analisi dell'ammina 33.
Nel presente studio, è stata preparata e valutata una fase stazionaria con fase polare incorporata (polistirene con N-fenilmaleimide incorporata) per la separazione di peptidi e digeriti di tripsina di HSA. La fase stazionaria è stata preparata utilizzando la seguente strategia. Particelle di silice porosa sono state preparate secondo la procedura descritta nella nostra precedente pubblicazione con alcune modifiche al protocollo di preparazione. Il rapporto tra urea, polietilenglicole (PEG), TMOS, acqua e acido acetico è stato regolato per preparare particelle di silice con pori di grandi dimensioni. In secondo luogo, è stato sintetizzato un nuovo ligando, fenilmaleimide-metil vinil isocianato, e utilizzato per derivatizzare le particelle di silice al fine di preparare una fase stazionaria con fase polare incorporata. La fase stazionaria risultante è stata impaccata in una colonna di acciaio inossidabile (100 × 1,8 mm di diametro interno) utilizzando lo schema di impaccamento ottimizzato. L'impaccamento della colonna è assistito da vibrazioni meccaniche per garantire la formazione di un letto omogeneo all'interno della colonna. Valutare la separazione in colonna impaccata di miscele di peptidi costituite da cinque peptidi; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) e digestione con tripsina dell'albumina sierica umana (HAS). È stato osservato che la miscela di peptidi e la digestione con tripsina dell'HSA si separano con buona risoluzione ed efficienza. Le prestazioni di separazione della colonna PMP sono state confrontate con quelle della colonna Ascentis Express RP-Amide. Sia i peptidi che le proteine ​​sono risultati ben risolti ed efficienti sulla colonna PMP, che è risultata più efficiente della colonna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (glicole polietilenico), urea, acido acetico, trimetossi ortosilicato (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albumina sierica umana (HSA), cloruro di ammonio, urea, esano metildisilazano (HMDS), cloruro di metacriloile (MC), stirene, 4-idrossi-TEMPO, perossido di benzoile (BPO), acetonitrile (ACN) di grado HPLC, metanolo, 2-propanolo e acetone acquistati da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Una miscela di urea (8 g), polietilenglicole (8 g) e 8 mL di acido acetico 0,01 N è stata agitata per 10 minuti, quindi sono stati aggiunti 24 mL di TMOS in condizioni di ghiaccio. La miscela di reazione è stata riscaldata a 40 °C per 6 ore e poi a 120 °C per 8 ore in un'autoclave di acciaio inossidabile. L'acqua è stata eliminata e il materiale residuo è stato essiccato a 70 °C per 12 ore. La massa morbida essiccata è stata macinata finemente in forno e calcinata a 550 °C per 12 ore. Sono stati preparati e caratterizzati tre lotti per esaminare la riproducibilità in termini di dimensione delle particelle, dimensione dei pori e area superficiale.
Mediante la modifica superficiale di particelle di silice con il ligando pre-sintetizzato fenilmaleimmide-metilvinilisocianato (PCMP), seguita da polimerizzazione radiale con stirene, è stato preparato un composto contenente gruppi polari. Fase stazionaria per aggregati e catene di polistirene. Il processo di preparazione è descritto di seguito.
N-fenilmaleimmide (200 mg) e metil vinil isocianato (100 mg) sono stati disciolti in toluene anidro e 0,1 mL di 2,2′-azoisobutirronitrile (AIBN) sono stati aggiunti al pallone di reazione per preparare il copolimero fenilmaleimmide-metil vinil isocianato (PMCP). La miscela è stata riscaldata a 60 °C per 3 ore, filtrata e essiccata in forno a 40 °C per 3 ore.
Particelle di silice essiccate (2 g) sono state disperse in toluene anidro (100 mL), agitate e sonicizzate in un pallone a fondo tondo da 500 mL per 10 min. PMCP (10 mg) è stato disciolto in toluene e aggiunto goccia a goccia al pallone di reazione tramite un imbuto gocciolatore. La miscela è stata riscaldata a riflusso a 100 °C per 8 ore, filtrata, lavata con acetone e asciugata a 60 °C per 3 ore. Successivamente, particelle di silice legate a PMCP (100 g) sono state disciolte in toluene (200 ml) e 4-idrossi-TEMPO (2 mL) è stato aggiunto in presenza di 100 µL di dilaurato di dibutilstagno come catalizzatore. La miscela è stata agitata a 50 °C per 8 ore, filtrata e asciugata a 50 °C per 3 ore.
Stirene (1 mL), perossido di benzoile BPO (0,5 mL) e particelle di silice legate a TEMPO-PMCP (1,5 g) sono stati dispersi in toluene e spurgati con azoto. La polimerizzazione dello stirene è stata condotta a 100 °C per 12 ore. Il prodotto risultante è stato lavato con metanolo e asciugato a 60 °C per tutta la notte. Lo schema generale della reazione è mostrato in Figura 1.
I campioni sono stati degassati a 393 K per 1 ora per ottenere una pressione residua inferiore a 10-3 Torr. La quantità di N2 adsorbita a una pressione relativa di P/P0 = 0,99 è stata utilizzata per determinare il volume totale dei pori. La morfologia delle particelle di silice nude e legate a ligandi è stata esaminata con microscopia elettronica a scansione (Hitachi High Technologies, Tokyo, Giappone). I campioni essiccati (particelle di silice nude e legate a ligandi) sono stati posizionati su una colonna di alluminio utilizzando nastro adesivo al carbonio. L'oro è stato placcato sui campioni utilizzando un evaporatore a sputtering Q150T e uno strato di Au di 5 nm è stato depositato sui campioni. Ciò migliora l'efficienza del processo utilizzando basse tensioni e fornisce una deposizione a freddo a grana fine. Per l'analisi elementare è stato utilizzato un analizzatore elementare Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Per ottenere distribuzione delle dimensioni delle particelle. Particelle di silice non modificate e particelle di silice legate a ligandi (5 mg ciascuna) sono state disperse in 5 mL di isopropanolo, sonicati per 10 min, agitati con vortex per 5 min e posizionati sul banco ottico del Mastersizer. L'analisi termogravimetrica è stata eseguita a una velocità di 5 °C al minuto in un intervallo di temperatura da 30 a 800 °C.
Colonne a foro stretto in acciaio inox rivestite di vetro di dimensioni (100 × 1,8 mm id) sono state riempite utilizzando il metodo di riempimento a sospensione, applicando la stessa procedura utilizzata nel Rif. 31. Una colonna in acciaio inox (rivestita in vetro, 100 × 1,8 mm di diametro interno) con un raccordo di uscita contenente un filtro poroso da 1 µm è stata collegata a un packer per sospensioni (Alltech, Deerfield, IL, USA). Preparare una sospensione della fase stazionaria sospendendo 150 mg di fase stazionaria in 1,2 mL di metanolo e inviarla alla colonna di stoccaggio. Il metanolo è stato utilizzato sia come solvente per la sospensione che come solvente di propulsione. Riempire la colonna sequenzialmente applicando pressioni di 100 MPa per 10 minuti, 80 MPa per 15 minuti e 60 MPa per 30 minuti. Durante il riempimento, è stata applicata una vibrazione meccanica con due agitatori per colonne GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) per garantire un riempimento uniforme della colonna. Chiudere il packer per sospensioni e rilasciare lentamente la pressione per evitare danni all'interno della colonna. Scollegare la colonna dall'unità di riempimento per sospensioni e collegare un altro raccordo all'ingresso e al LC. sistema per verificarne le prestazioni.
È stata costruita una pompa LC (10AD Shimadzu, Giappone), un iniettore (Valco (USA) C14 W.05) con anello di iniezione da 50 nL, un degassatore a membrana (Shimadzu DGU-14A), una finestra capillare UV-VIS, un rivelatore speciale per dispositivo µLC (UV-2075) e microcolonne rivestite in vetro. Utilizzare tubi di collegamento molto stretti e corti per minimizzare l'effetto di allargamento della banda extra della colonna. Dopo l'imballaggio, i capillari (50 μm id 365) e i capillari di riduzione (50 μm) sono stati installati all'uscita da 1/16″ del raccordo di riduzione. La raccolta dati e l'elaborazione cromatografica sono state eseguite utilizzando il software Multichro 2000. Monitoraggio a 254 nm. Gli analiti sono stati testati per l'assorbanza UV. I dati cromatografici sono stati analizzati da OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina da siero umano, polvere liofilizzata, ≥ 96% (elettroforesi su gel di agarosio) 3 mg mescolati con tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 mL) e bicarbonato di ammonio 0,2 M (1 mL). La soluzione è stata agitata per 10 minuti e mantenuta in un bagno termostatico a 37 °C per 6 ore, quindi bloccata con 1 mL di TFA allo 0,1%. Filtrare la soluzione e conservarla a temperatura inferiore a 4 °C.
La separazione delle miscele di peptidi e dei digeriti di tripsina dell'HSA è stata valutata separatamente su colonne PMP. Verificare la separazione della miscela di peptidi e del digerito di tripsina dell'HSA mediante la colonna PMP e confrontare i risultati con la colonna Ascentis Express RP-Amide. Il numero di piatti teorici viene calcolato come segue:
Le immagini SEM delle particelle di silice non rivestite e delle particelle di silice legate a ligandi sono mostrate in FIG. 2. Le immagini SEM delle particelle di silice non rivestite (A, B) mostrano che, a differenza dei nostri studi precedenti, queste particelle sono sferiche, allungate o presentano una simmetria irregolare. La superficie delle particelle di silice legate a ligandi (C, D) è più liscia di quella delle particelle di silice non rivestite, il che potrebbe essere dovuto al rivestimento di catene di polistirene sulla superficie delle particelle di silice.
Immagini al microscopio elettronico a scansione di particelle di silice non rivestite (A, B) e particelle di silice legate a ligandi (C, D).
Le distribuzioni delle dimensioni delle particelle di silice nuda e di silice legata a ligandi sono mostrate nella Figura 3(A). Le curve di distribuzione delle dimensioni delle particelle basate sul volume hanno mostrato che la dimensione delle particelle di silice è aumentata dopo la modifica chimica (Fig. 3A). I ​​dati di distribuzione delle dimensioni delle particelle di silice dello studio attuale e dello studio precedente sono confrontati nella Tabella 1(A). La dimensione delle particelle basata sul volume, d(0,5), di PMP è di 3,36 μm, rispetto al nostro studio precedente con un valore ad(0,5) di 3,05 μm (particelle di silice legate al polistirene)34. Questo lotto aveva una distribuzione delle dimensioni delle particelle più stretta rispetto al nostro studio precedente a causa dei rapporti variabili di PEG, urea, TMOS e acido acetico nella miscela di reazione. La dimensione delle particelle della fase PMP è leggermente maggiore di quella della fase di particelle di silice legate al polistirene che abbiamo studiato in precedenza. Ciò significa che la funzionalizzazione superficiale delle particelle di silice con stirene ha depositato solo uno strato di polistirene (0,97 µm) sulla superficie della silice, mentre nella fase PMP lo spessore dello strato era di 1,38 µm.
Distribuzione delle dimensioni delle particelle (A) e distribuzione delle dimensioni dei pori (B) di particelle di silice nude e particelle di silice legate a ligandi.
La dimensione dei pori, il volume dei pori e l'area superficiale delle particelle di silice del presente studio sono riportati nella Tabella 1(B). I profili PSD delle particelle di silice nude e delle particelle di silice legate al ligando sono mostrati nella Figura 3(B). I risultati sono paragonabili al nostro studio precedente. Le dimensioni dei pori delle particelle di silice nude e legate al ligando sono rispettivamente 310 e 241, il che indica che la dimensione dei pori diminuisce di 69 dopo la modifica chimica, come mostrato nella Tabella 1(B), e la variazione della curva è mostrata nella Fig. 3(B). Allo stesso modo, il volume dei pori delle particelle di silice è diminuito da 0,67 a 0,58 cm3/g dopo la modifica chimica. L'area superficiale specifica delle particelle di silice attualmente studiate è di 116 m2/g, che è paragonabile al nostro studio precedente (124 m2/g). Come mostrato nella Tabella 1(B), l'area superficiale (m2/g) delle particelle di silice è diminuita anche da 116 m2/g a 105 m2/g dopo modifica chimica.
I risultati dell'analisi elementare della fase stazionaria sono mostrati nella Tabella 2. Il carico di carbonio dell'attuale fase stazionaria è del 6,35%, che è inferiore al carico di carbonio del nostro studio precedente (particelle di silice legate al polistirene, rispettivamente 7,93%35 e 10,21%) 42. Il carico di carbonio dell'attuale fase stazionaria è basso, perché nella preparazione dell'attuale SP, oltre allo stirene, sono stati utilizzati alcuni ligandi polari come fenilmaleimmide-metilvinilisocianato (PCMP) e 4-idrossi-TEMPO. La percentuale in peso di azoto dell'attuale fase stazionaria è del 2,21%, rispetto allo 0,1735 e allo 0,85% in peso di azoto negli studi precedenti, rispettivamente. Ciò significa che la % in peso di azoto è maggiore nell'attuale fase stazionaria a causa della fenilmaleimmide. Allo stesso modo, i carichi di carbonio dei prodotti (4) e (5) erano rispettivamente del 2,7% e 2,9%, rispettivamente, mentre il carico di carbonio del prodotto finale (6) era del 6,35%, come mostrato nella Tabella 2. La perdita di peso è stata verificata con fase stazionaria PMP e la curva TGA è mostrata nella Figura 4. La curva TGA mostra una perdita di peso dell'8,6%, che è in buon accordo con il carico di carbonio (6,35%) perché i ligandi contengono non solo C ma anche N, O e H.
Il ligando fenilmaleimmide-metilvinilisocianato è stato scelto per la modifica superficiale delle particelle di silice perché possiede gruppi fenilmaleimmide polari e gruppi vinilisocianato. I gruppi vinilisocianato possono reagire ulteriormente con lo stirene tramite polimerizzazione radicalica vivente. Il secondo motivo è quello di inserire un gruppo che abbia un'interazione moderata con l'analita e nessuna forte interazione elettrostatica tra l'analita e la fase stazionaria, poiché la porzione fenilmaleimmide non ha carica virtuale a pH normale. La polarità della fase stazionaria può essere controllata dalla quantità ottimale di stirene e dal tempo di reazione della polimerizzazione radicalica. L'ultimo passaggio della reazione (polimerizzazione radicalica) è critico e può modificare la polarità della fase stazionaria. È stata eseguita un'analisi elementare per verificare il carico di carbonio di queste fasi stazionarie. È stato osservato che l'aumento della quantità di stirene e del tempo di reazione aumentava il carico di carbonio della fase stazionaria e viceversa. Le fasi stazionarie preparate con diverse concentrazioni di stirene hanno un diverso carico di carbonio caricamenti. Di nuovo, caricare queste fasi stazionarie in colonne di acciaio inossidabile e verificarne le prestazioni cromatografiche (selettività, risoluzione, valore N, ecc.). Sulla base di questi esperimenti, è stata selezionata una formulazione ottimizzata per preparare la fase stazionaria PMP per garantire una polarità controllata e una buona ritenzione dell'analita.
Sono state inoltre valutate cinque miscele di peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) utilizzando una colonna PMP con una fase mobile; 60/40 (v/v) acetonitrile/acqua (0,1% TFA) a una velocità di flusso di 80 μL/min.In condizioni di eluizione ottimali, il numero di piatti teorici (N) per colonna (100 × 1,8 mm id) è 20.000 ± 100 (200.000 piatti/m²).La Tabella 3 riporta i valori N per le tre colonne PMP e i cromatogrammi sono mostrati nella Figura 5A.Analisi rapida su una colonna PMP ad alta velocità di flusso (700 μL/min), cinque peptidi sono stati eluiti entro un minuto, i valori N erano molto buoni, 13.500 ± 330 per colonna (100 × 1,8 mm id), corrispondente a 135.000 piatti/m (Figura 5B).Tre colonne di dimensioni identiche (100 × 1,8 mm id) sono state riempite con Sono stati utilizzati tre lotti diversi di fase stazionaria PMP per verificare la riproducibilità. La concentrazione dell'analita per ciascuna colonna è stata registrata utilizzando le condizioni di eluizione ottimali e il numero di piatti teorici N e il tempo di ritenzione per separare la stessa miscela di prova su ciascuna colonna. I dati di riproducibilità per le colonne PMP sono riportati nella Tabella 4. La riproducibilità della colonna PMP è ben correlata con valori %RSD molto bassi, come mostrato nella Tabella 3.
Separazione della miscela di peptidi su colonna PMP (B) e colonna Ascentis Express RP-Amide (A); fase mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensioni della colonna PMP (100 × 1,8 mm id); analitica L'ordine di eluizione dei composti: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) e 5 (leucina) acido encefalina)).
È stata valutata una colonna PMP (100 × 1,8 mm di diametro interno) per la separazione di digesti triptici di albumina sierica umana in cromatografia liquida ad alte prestazioni. Il cromatogramma in Figura 6 mostra che il campione è ben separato e la risoluzione è molto buona. I digesti di HSA sono stati analizzati utilizzando una velocità di flusso di 100 µL/min, fase mobile 70/30 acetonitrile/acqua e 0,1% TFA. Come mostrato nel cromatogramma (Figura 6), la digestione di HSA è stata suddivisa in 17 picchi corrispondenti a 17 peptidi. L'efficienza di separazione di ciascun picco nel digesto di HSA è stata calcolata e i valori sono riportati nella Tabella 5.
Un digestato triptico di HSA (100 × 1,8 mm di diametro interno) è stato separato su una colonna PMP; velocità di flusso (100 µL/min), fase mobile 60/40 acetonitrile/acqua con 0,1% di TFA.
dove L è la lunghezza della colonna, η è la viscosità della fase mobile, ΔP è la contropressione della colonna e u è la velocità lineare della fase mobile. La permeabilità della colonna PMP era 2,5 × 10-14 m2, la velocità di flusso era 25 μL/min e veniva utilizzata una miscela 60/40 v/v di ACN/acqua. La permeabilità della colonna PMP (100 × 1,8 mm id) era simile a quella del nostro precedente studio Rif.34. La permeabilità della colonna riempita con particelle superficialmente porose è: 1,7 × 10-15 per particelle da 1,3 μm, 3,1 × 10-15 per particelle da 1,7 μm, 5,2 × 10-15 e 2,5 × 10-14 m2 per particelle da 2,6 μm. Per particelle da 5 μm 43. Pertanto, la permeabilità della La fase PMP è simile a quella delle particelle core-shell da 5 μm.
dove Wx è il peso della colonna riempita con cloroformio, Wy è il peso della colonna riempita con metanolo e ρ è la densità del solvente. Densità del metanolo (ρ = 0,7866) e del cloroformio (ρ = 1,484). La porosità totale delle colonne SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 e delle colonne C18-Urea 31 che abbiamo studiato in precedenza erano rispettivamente 0,63 e 0,55. Ciò significa che la presenza di ligandi di urea riduce la permeabilità della fase stazionaria. D'altra parte, la porosità totale della colonna PMP (100 × 1,8 mm id) è 0,60. La permeabilità delle colonne PMP è inferiore a quella delle colonne riempite con particelle di silice legate a C18 perché nelle fasi stazionarie di tipo C18 i ligandi C18 sono attaccati alle particelle di silice come lineari catene, mentre nelle fasi stazionarie di tipo polistirene, si forma uno strato polimerico relativamente spesso attorno ad esso. In un esperimento tipico, la porosità della colonna viene calcolata come:
La Figura 7A,B mostra la colonna PMP (100 × 1,8 mm id) e la colonna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) utilizzando le stesse condizioni di eluizione (ovvero, 60/40 ACN/H2O e 0,1% TFA). ) del grafico di van Deemter. Sono state preparate miscele di peptidi selezionate (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) in 20 µL/ La velocità di flusso minima per entrambe le colonne è 800 µL/min. I valori HETP minimi alla velocità di flusso ottimale (80 µL/min) per la colonna PMP e la colonna Ascentis Express RP-Amide erano rispettivamente 2,6 µm e 3,9 µm. I valori HETP indicano che l'efficienza di separazione della colonna PMP (100 × 1,8 mm id) è molto migliore della colonna Ascentis Express RP-Amide disponibile in commercio (100 × 1,8 mm id). Il grafico di van Deemter in Fig. 7(A) mostra che la diminuzione del valore N con l'aumento del flusso non è significativa rispetto al nostro studio precedente. La maggiore efficienza di separazione La differenza tra la colonna PMP (100 × 1,8 mm di diametro interno) e la colonna Ascentis Express RP-Amide si basa su miglioramenti nella forma delle particelle, nelle dimensioni e nelle complesse procedure di riempimento della colonna utilizzate nel presente lavoro34.
(A) Grafico di van Deemter (HETP rispetto alla velocità lineare della fase mobile) ottenuto utilizzando una colonna PMP (100 × 1,8 mm di diametro interno) in ACN/H2O 60/40 con 0,1% di TFA. (B) Grafico di van Deemter (HETP rispetto alla velocità lineare della fase mobile) ottenuto utilizzando una colonna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm di diametro interno) in ACN/H2O 60/40 con 0,1% di TFA.
È stata preparata e valutata una fase stazionaria di polistirene con fasi polari incorporate per la separazione di miscele di peptidi sintetici e digeriti di tripsina di albumina sierica umana (HAS) mediante cromatografia liquida ad alte prestazioni. Le prestazioni cromatografiche delle colonne PMP per le miscele di peptidi sono eccellenti in termini di efficienza di separazione e risoluzione. Le migliori prestazioni di separazione delle colonne PMP sono dovute a una serie di fattori, come la dimensione delle particelle e la dimensione dei pori delle particelle di silice, la sintesi controllata della fase stazionaria e il complesso riempimento della colonna. Oltre all'elevata efficienza di separazione, la bassa contropressione della colonna ad alte velocità di flusso rappresenta un ulteriore vantaggio di questa fase stazionaria. Le colonne PMP mostrano una buona riproducibilità e possono essere utilizzate per l'analisi di miscele di peptidi e digestione di tripsina di diverse proteine. Prevediamo di utilizzare questa colonna per la separazione di prodotti naturali, composti bioattivi da piante medicinali ed estratti fungini mediante cromatografia liquida. In futuro, le colonne PMP saranno valutate anche per la separazione di proteine ​​e anticorpi monoclonali.
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