Dziękujemy za odwiedzenie witryny Nature.com. Używana przez Ciebie wersja przeglądarki obsługuje CSS w ograniczonym zakresie. Aby zapewnić Ci najlepsze wrażenia, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Tymczasem, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy wyświetlać witrynę bez stylów i JavaScript.
Porowata krzemionka została przygotowana metodą sol-żel z pewnymi modyfikacjami w celu uzyskania makroporowatych cząstek. Cząstki te zostały derywatyzowane poprzez polimeryzację z odwracalnym addycyjnym fragmentowaniem łańcucha (RAFT) z N-fenylomaleimid-metylowinyloizocyjanianem (PMI) i styrenem w celu przygotowania interkalacji N-fenylomaleimidu fazy stacjonarnej polistyrenu (PMP). Wąskie kolumny ze stali nierdzewnej (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) zostały wypełnione poprzez pakowanie zawiesinowe. Oceniono rozdział na kolumnie PMP mieszaniny peptydów składającej się z pięciu peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucynoenkefalina) wydajność chromatograficzna) i trawienie trypsyną albuminy surowicy ludzkiej (HAS). W optymalnych warunkach elucji teoretyczna liczba płytek mieszaniny peptydów wynosi aż 280 000 płytek/m². Porównując wydajność separacji opracowanej kolumny z komercyjną kolumną Ascentis Express RP-Amide, zaobserwowano, że wydajność separacji kolumny PMP była lepsza od kolumny komercyjnej pod względem efektywności separacji i rozdzielczości.
W ostatnich latach przemysł biofarmaceutyczny stał się rozwijającym się rynkiem globalnym, notując znaczny wzrost udziału w rynku. Wraz z gwałtownym wzrostem przemysłu biofarmaceutycznego1,2,3, analiza peptydów i białek stała się niezwykle pożądana. Oprócz peptydu docelowego, podczas syntezy peptydu powstaje szereg zanieczyszczeń, co wymaga oczyszczania chromatograficznego w celu uzyskania peptydów o pożądanej czystości. Analiza i charakteryzacja białek w płynach ustrojowych, tkankach i komórkach jest niezwykle trudnym zadaniem ze względu na dużą liczbę potencjalnie wykrywalnych substancji w jednej próbce. Chociaż spektrometria mas jest skutecznym narzędziem do sekwencjonowania peptydów i białek, jeśli takie próbki zostaną wstrzyknięte do spektrometru mas w jednym przejściu, rozdział nie będzie idealny. Problem ten można złagodzić, wdrażając rozdziały za pomocą chromatografii cieczowej (LC) przed analizą MS, co zmniejszy liczbę analitów wprowadzanych do spektrometru mas w danym momencie4,5,6. Ponadto podczas rozdziału w fazie ciekłej anality mogą być skupione w wąskich obszarach, co powoduje koncentrację tych analitów i poprawia czułość wykrywania metodą MS. Chromatografia cieczowa (LC) znacznie się rozwinęła w ciągu ostatniej dekady i stała się popularną techniką w analizie proteomicznej7,8,9,10.
Chromatografia cieczowa z odwróconą fazą (RP-LC) jest szeroko stosowana do oczyszczania i rozdzielania mieszanin peptydów przy użyciu oktadecylo-modyfikowanej krzemionki (ODS) jako fazy stacjonarnej11,12,13. Jednakże fazy stacjonarne RP nie zapewniają zadowalającego rozdzielania peptydów i białek ze względu na ich złożoną strukturę i amfifilową naturę14,15. Dlatego do analizy peptydów i białek z polarnymi i niepolarnymi cząsteczkami w celu interakcji z tymi analitami i ich zatrzymania wymagane są specjalnie zaprojektowane fazy stacjonarne16. Chromatografia w trybie mieszanym, która zapewnia interakcje multimodalne, może być alternatywą dla RP-LC w przypadku rozdzielania peptydów, białek i innych złożonych mieszanin. Przygotowano kilka faz stacjonarnych w trybie mieszanym, a kolumny wypełnione tymi fazami zostały użyte do rozdzielania peptydów i białek17,18,19,20,21. Fazy stacjonarne w trybie mieszanym (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalacja polarna/RPLC) nadają się do rozdzielania peptydów i białek ze względu na obecność zarówno grup polarnych, jak i niepolarnych22,23,24,25,26,27,28. Podobnie, polarne interkalujące fazy stacjonarne z kowalencyjnie wiązanymi grupami polarnymi wykazują dobrą siłę rozdzielania i wyjątkową selektywność dla analitów polarnych i niepolarnych, ponieważ rozdział zależy od interakcji między analitem a fazą stacjonarną. Oddziaływania multimodalne29, 30, 31, 32. Ostatnio Zhang i in. 30 przygotował stacjonarną fazę poliaminową z grupą dodecylową i z powodzeniem oddzielił węglowodory, leki przeciwdepresyjne, flawonoidy, nukleozydy, estrogeny i kilka innych analitów. Interkalator polarny ma zarówno grupy polarne, jak i niepolarne, dzięki czemu można go stosować do rozdzielania peptydów i białek, które mają zarówno części hydrofobowe, jak i hydrofilowe. Kolumny polarne (np. kolumny C18 z amidem) są dostępne w sprzedaży pod nazwą handlową Ascentis Express RP-Amide columns, ale kolumny te służą wyłącznie do analizy aminy 33.
W niniejszym badaniu przygotowano fazę stacjonarną z polarnym osadzeniem (polistyren z N-fenylomaleimidem) i oceniono ją pod kątem rozdziału peptydów i produktów trawienia trypsyną HSA. Fazę stacjonarną przygotowano, stosując następującą strategię. Porowate cząstki krzemionki przygotowano zgodnie z procedurą podaną w naszej poprzedniej publikacji z pewnymi modyfikacjami protokołu przygotowania. Proporcje mocznika, glikolu polietylenowego (PEG), TMOS i kwasu octowego dostosowano w celu przygotowania cząstek krzemionki o dużym rozmiarze porów. Następnie zsyntetyzowano nowy ligand, izocyjanian fenylomaleimidu i metylowinylu, i użyto go do derywatyzacji cząstek krzemionki w celu przygotowania polarnej fazy stacjonarnej. Otrzymaną fazę stacjonarną umieszczono w kolumnie ze stali nierdzewnej (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) przy użyciu zoptymalizowanego schematu upakowania. Wypełnienie kolumny wspomagane jest wibracjami mechanicznymi, aby zapewnić utworzenie jednorodnego złoża w kolumnie. Oceń rozdział w kolumnie z upakowanym mieszanin peptydów składających się z pięć peptydów; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucyna enkefalina) oraz trypsyna trawiona albuminą surowicy ludzkiej (HAS). Zaobserwowano, że mieszanina peptydów i trypsyna trawiona HSA rozdzielały się z dobrą rozdzielczością i wydajnością. Wydajność rozdzielania kolumny PMP porównano z wydajnością kolumny Ascentis Express RP-Amide. Zaobserwowano, że zarówno peptydy, jak i białka były dobrze rozdzielone i wydajne na kolumnie PMP, która była wydajniejsza niż kolumna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (glikol polietylenowy), mocznik, kwas octowy, trimetoksyortokrzemian (TMOS), trimetylochlorosilan (TMCS), trypsyna, albumina surowicy ludzkiej (HSA), chlorek amonu, mocznik, heksan, metylodisilazan (HMDS), chlorek metakryloilu (MC), styren, 4-hydroksy-TEMPO, nadtlenek benzoilu (BPO), acetonitryl klasy HPLC (ACN), metanol, 2-propanol i aceton zakupiony od firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Mieszaninę mocznika (8 g), glikolu polietylenowego (8 g) i 8 ml 0,01 N kwasu octowego mieszano przez 10 minut, a następnie dodano 24 ml TMOS w warunkach lodowatej wody. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 40°C przez 6 godzin, a następnie w temperaturze 120°C przez 8 godzin w autoklawie ze stali nierdzewnej. Wodę odlano, a pozostały materiał suszono w temperaturze 70°C przez 12 godzin. Wysuszoną miękką masę zmielono na gładko w piecu i kalcynowano w temperaturze 550°C przez 12 godzin. Przygotowano i scharakteryzowano trzy partie w celu sprawdzenia powtarzalności wielkości cząstek, wielkości porów i powierzchni.
Poprzez modyfikację powierzchni cząstek krzemionki wstępnie zsyntetyzowanym ligandem fenylomaleimidem-metylowinyloizocyjanianem (PCMP), a następnie polimeryzację radialną ze styrenem, otrzymano związek zawierający grupy polarne. Faza stacjonarna dla agregatów i łańcuchów polistyrenowych. Proces przygotowania opisano poniżej.
N-fenylomaleimid (200 mg) i izocyjanian metylowinylu (100 mg) rozpuszczono w suchym toluenie, a następnie do kolby reakcyjnej dodano 0,1 ml 2,2′-azoizobutyronitrylu (AIBN) w celu przygotowania kopolimeru fenylomaleimidu i izocyjanianu metylowinylu (PMCP). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 60°C przez 3 godziny, przefiltrowano i wysuszono w piecu w temperaturze 40°C przez 3 godziny.
Wysuszone cząstki krzemionki (2 g) rozproszono w suchym toluenie (100 ml), mieszano i poddano działaniu ultradźwięków w okrągłodennej kolbie o pojemności 500 ml przez 10 minut. PMCP (10 mg) rozpuszczono w toluenie i dodawano kroplami do kolby reakcyjnej za pomocą wkraplacza. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia w 100°C przez 8 godzin, przefiltrowano i przemyto acetonem, a następnie suszono w temperaturze 60°C przez 3 godziny. Następnie cząstki krzemionki związane z PMCP (100 g) rozpuszczono w toluenie (200 ml) i dodano 4-hydroksy-TEMPO (2 ml) w obecności 100 µl dilaurynianu dibutylocyny jako katalizatora. Mieszaninę mieszano w temperaturze 50°C przez 8 godzin, filtrowano i suszono w temperaturze 50°C przez 3 godziny.
Styren (1 ml), nadtlenek benzoilu BPO (0,5 ml) oraz cząstki krzemionki przyłączone do TEMPO-PMCP (1,5 g) rozproszono w toluenie i przedmuchano azotem. Polimeryzację styrenu prowadzono w temperaturze 100°C przez 12 godzin. Otrzymany produkt przemyto metanolem i suszono w temperaturze 60°C przez noc. Ogólny schemat reakcji pokazano na rysunku 1.
Próbki odgazowywano w temperaturze 393 K przez 1 godzinę, aby uzyskać ciśnienie resztkowe mniejsze niż 10-3 Torr. Ilość N2 zaadsorbowanego przy ciśnieniu względnym P/P0 = 0,99 została użyta do określenia całkowitej objętości porów. Morfologię gołych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem zbadano za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonia). Wysuszone próbki (gołe cząstki krzemionki i cząstki krzemionki związane z ligandem) umieszczono na aluminiowej kolumnie za pomocą taśmy węglowej samoprzylepnej. Złoto zostało naniesione na próbki za pomocą napylarki Q150T, a następnie na próbkach osadzono warstwę Au o grubości 5 nm. Poprawia to wydajność procesu przy użyciu niskich napięć i zapewnia drobnoziarniste, zimne napylanie. Do analizy pierwiastkowej użyto analizatora pierwiastkowego Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Analizator wielkości cząstek Malvern (Worcestershire, Wielka Brytania) Mastersizer 2000 do uzyskania rozkładu wielkości cząstek użyto. Nagie cząstki krzemionki i cząstki krzemionki związane z ligandem (po 5 mg) rozproszono w 5 ml izopropanolu, poddano działaniu ultradźwięków przez 10 minut, zawirowano przez 5 minut i umieszczono na stole optycznym urządzenia Mastersizer. Analizę termograwimetryczną przeprowadzono z szybkością 5 °C na minutę w zakresie temperatur od 30 do 800 °C.
Kolumny ze stali nierdzewnej o wąskim otworze, wyłożone szkłem i o wymiarach (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej), wypełniono metodą pakowania zawiesinowego, stosując tę ​​samą procedurę, która została opisana w Ref. 31.Kolumna ze stali nierdzewnej (wyłożona szkłem, 100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) z przyłączem wylotowym zawierającym 1 µm spieku została podłączona do pakera zawiesinowego (Alltech Deerfield, IL, USA). Przygotuj zawiesinę fazy stacjonarnej, zawieszając 150 mg fazy stacjonarnej w 1,2 ml metanolu i przesyłając ją do kolumny magazynowej. Metanol został użyty jako rozpuszczalnik zawiesiny, a także jako rozpuszczalnik napędowy. Napełnij kolumnę sekwencyjnie, stosując ciśnienia 100 MP przez 10 minut, 80 MP przez 15 minut i 60 MP przez 30 minut. Podczas pakowania zastosowano wibracje mechaniczne za pomocą dwóch wstrząsarek kolumn GC (Alltech, Deerfield, IL, USA), aby zapewnić równomierne upakowanie kolumny. Zamknij paker zawiesinowy i powoli uwolnij ciśnienie, aby zapobiec jakimkolwiek uszkodzeniom wewnątrz kolumny. Odłącz kolumnę od jednostki pakowania zawiesiny i podłącz inną złączkę do wlotu i do System LC w celu sprawdzenia jego wydajności.
Zbudowano pompę LC (10AD Shimadzu, Japonia), wtryskiwacz (Valco (USA) C14 W.05) z pętlą wtryskową 50 nL, odgazowywacz membrany (Shimadzu DGU-14A), okienko kapilarne UV-VIS. Specjalne urządzenie µLC, detektor (UV-2075) i mikrokolumny wyłożone szkłem. Zastosowano bardzo wąskie i krótkie przewody łączące, aby zminimalizować efekt dodatkowego poszerzenia pasma kolumny. Po zapakowaniu, kapilary (50 μm, średnica wewnętrzna 365 mm) i kapilary z redukcją (50 μm) zostały zainstalowane na wylocie 1/16″ z reduktora. Zbieranie danych i przetwarzanie chromatograficzne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Multichro 2000. Monitorowanie przy 254 nm. Anality badano pod kątem absorbancji UV. Dane chromatograficzne analizowano za pomocą OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina z surowicy ludzkiej, liofilizowany proszek, ≥ 96% (elektroforeza w żelu agarozowym) 3 mg zmieszane z trypsyną (1,5 mg), 4,0 M mocznikiem (1 ml) i 0,2 M wodorowęglanem amonu (1 ml). Roztwór mieszano przez 10 minut i przechowywano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 6 godzin, a następnie schłodzono 1 ml 0,1% TFA. Roztwór przefiltrowano i przechowywano w temperaturze poniżej 4°C.
Rozdział mieszanin peptydów i produktów trawienia trypsyną HSA oceniano oddzielnie na kolumnach PMP. Sprawdź rozdział mieszaniny peptydów i produktów trawienia trypsyną HSA na kolumnie PMP i porównaj wyniki z wynikami uzyskanymi na kolumnie Ascentis Express RP-Amide. Teoretyczną liczbę półek oblicza się w następujący sposób:
Na FIG. 2 przedstawiono obrazy SEM gołych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem. Obrazy SEM gołych cząstek krzemionki (A, B) pokazują, że w przeciwieństwie do naszych poprzednich badań, cząstki te są kuliste, wydłużone lub mają nieregularną symetrię. Powierzchnia cząstek krzemionki związanych z ligandem (C, D) jest gładsza od powierzchni gołych cząstek krzemionki, co może być spowodowane powłoką łańcuchów polistyrenowych na powierzchni cząstek krzemionki.
Obrazy uzyskane za pomocą mikroskopu elektronowego skaningowego przedstawiające gołe cząstki krzemionki (A, B) i cząstki krzemionki związane ligandem (C, D).
Rozkład wielkości cząstek gołych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych ligandem pokazano na rysunku 3(A). Krzywe rozkładu wielkości cząstek objętościowo wykazały, że wielkość cząstek krzemionki wzrosła po modyfikacji chemicznej (rys. 3A). Dane dotyczące rozkładu wielkości cząstek cząstek krzemionki z bieżącego badania i poprzedniego badania porównano w tabeli 1(A). Objętościowy rozmiar cząstek d(0,5) PMP wynosi 3,36 μm, w porównaniu z naszym poprzednim badaniem z wartością d(0,5) równą 3,05 μm (cząstki krzemionki związane polistyrenem)34. Ta partia miała węższy rozkład wielkości cząstek w porównaniu z naszym poprzednim badaniem ze względu na różne stosunki PEG, mocznika, TMOS i kwasu octowego w mieszaninie reakcyjnej. Rozmiar cząstek fazy PMP jest nieco większy niż w przypadku fazy cząstek krzemionki związanej polistyrenem, którą badaliśmy wcześniej. Oznacza to, że funkcjonalizacja powierzchni cząstek krzemionki styrenem spowodowała osadzenie się tylko warstwa polistyrenu (0,97 µm) na powierzchni krzemionki, natomiast w fazie PMP grubość warstwy wynosiła 1,38 µm.
Rozkład wielkości cząstek (A) i rozkład wielkości porów (B) gołych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem.
Wielkość porów, objętość porów i powierzchnia cząstek krzemionki z bieżącego badania podano w Tabeli 1(B). Profile PSD gołych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem pokazano na Rysunku 3(B). Wyniki są porównywalne z naszymi poprzednimi badaniami. Wielkość porów gołych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem wynosi odpowiednio 310 i 241, co wskazuje, że wielkość porów zmniejsza się o 69 po modyfikacji chemicznej, jak pokazano w Tabeli 1(B), a zmiana krzywej jest pokazana na Rysunku 3(B). Podobnie objętość porów cząstek krzemionki zmniejszyła się z 0,67 do 0,58 cm3/g po modyfikacji chemicznej. Powierzchnia właściwa obecnie badanych cząstek krzemionki wynosi 116 m2/g, co jest porównywalne z naszymi poprzednimi badaniami (124 m2/g). Jak pokazano w Tabeli 1(B), powierzchnia (m2/g) cząstek krzemionki również zmniejszyła się z 116 m2/g do 105 m2/g po modyfikacji chemicznej.
Wyniki analizy pierwiastkowej fazy stacjonarnej przedstawiono w tabeli 2. Obciążenie węglem obecnej fazy stacjonarnej wynosi 6,35%, co jest wartością niższą od obciążenia węglem w naszych poprzednich badaniach (cząstki krzemionki związanej z polistyrenem, odpowiednio 7,93%35 i 10,21%) 42. Obciążenie węglem obecnej fazy stacjonarnej jest niskie, ponieważ w przygotowaniu obecnego SP, oprócz styrenu, użyto kilku polarnych ligandów, takich jak fenylomaleimid-metylowinyloizocyjanian (PCMP) i 4-hydroksy-TEMPO. Procentowa zawartość azotu w obecnej fazie stacjonarnej wynosi 2,21%, w porównaniu do 0,1735 i 0,85% wagowych azotu w poprzednich badaniach, odpowiednio. Oznacza to, że % wagowy azotu jest wyższy w obecnej fazie stacjonarnej ze względu na fenylomaleimid. Podobnie, obciążenia węglem produktów (4) i (5) wynosiły 2,7% i odpowiednio 2,9%, podczas gdy obciążenie węglem produktu końcowego (6) wynosiło 6,35%, jak pokazano w tabeli 2. Utratę masy sprawdzono przy użyciu fazy stacjonarnej PMP, a krzywą TGA przedstawiono na rysunku 4. Krzywa TGA pokazuje utratę masy na poziomie 8,6%, co dobrze zgadza się z obciążeniem węglem (6,35%), ponieważ ligandy zawierają nie tylko C, ale także N, O i H.
Ligand fenylomaleimidowo-metylowinyloizocyjanianowy wybrano do modyfikacji powierzchni cząstek krzemionki, ponieważ zawiera polarne grupy fenylomaleimidowe i grupy winyloizocyjanianowe. Grupy winyloizocyjanianowe mogą dalej reagować ze styrenem poprzez polimeryzację rodnikową żyjącą. Drugim powodem jest wprowadzenie grupy, która ma umiarkowaną interakcję z analitem i nie ma silnej interakcji elektrostatycznej między analitem a fazą stacjonarną, ponieważ fragment fenylomaleimidowy nie ma ładunku wirtualnego przy normalnym pH. Biegunowość fazy stacjonarnej można kontrolować za pomocą optymalnej ilości styrenu i czasu reakcji polimeryzacji rodnikowej. Ostatni etap reakcji (polimeryzacja rodnikowa) jest krytyczny i może zmienić biegunowość fazy stacjonarnej. Przeprowadzono analizę elementarną w celu sprawdzenia obciążenia węglem tych faz stacjonarnych. Zaobserwowano, że zwiększenie ilości styrenu i czasu reakcji zwiększyło obciążenie węglem fazy stacjonarnej i odwrotnie. SP przygotowane z różnymi stężeniami styrenu mają różne zawartości węgla. Ponownie załaduj te fazy stacjonarne do kolumn ze stali nierdzewnej i sprawdź ich wydajność chromatograficzną (selektywność, rozdzielczość, wartość N itp.). Na podstawie tych eksperymentów wybrano zoptymalizowaną formułę do przygotowania fazy stacjonarnej PMP, aby zapewnić kontrolowaną polarność i dobrą retencję analitu.
Pięć mieszanin peptydowych (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucyna enkefalina) poddano również ocenie przy użyciu kolumny PMP z zastosowaniem fazy ruchomej; 60/40 (v/v) acetonitryl/woda (0,1% TFA) przy szybkości przepływu 80 μl/min. W optymalnych warunkach elucji teoretyczna liczba półek (N) na kolumnę (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) wynosi 20 000 ± 100 (200 000 płytek/m²). Tabela 3 przedstawia wartości N dla trzech kolumn PMP, a chromatogramy przedstawiono na rysunku 5A. Szybka analiza na kolumnie PMP przy dużej szybkości przepływu (700 μl/min), pięć peptydów zostało eluowanych w ciągu jednej minuty, wartości N były bardzo dobre, 13 500 ± 330 na kolumnę (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej), co odpowiada 135 000 płytek/m (rysunek 5B). Trzy kolumny o identycznych rozmiarach (100 Kolumny o średnicy wewnętrznej 1,8 mm wypełniono trzema różnymi partiami fazy stacjonarnej PMP w celu sprawdzenia powtarzalności. Stężenie analitu dla każdej kolumny rejestrowano, stosując optymalne warunki elucji oraz liczbę półek teoretycznych N i czas retencji, aby oddzielić tę samą mieszaninę testową na każdej kolumnie. Dane dotyczące powtarzalności dla kolumn PMP przedstawiono w tabeli 4. Powtarzalność kolumny PMP dobrze koreluje z bardzo niskimi wartościami %RSD, jak pokazano w tabeli 3.
Rozdział mieszaniny peptydów na kolumnie PMP (B) i kolumnie Ascentis Express RP-Amide (A); faza ruchoma 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), wymiary kolumny PMP (100 × 1,8 mm); analityczny Kolejność elucji związków: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (kwas leucynowy (enkefalina)).
Kolumnę PMP (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) poddano ocenie pod kątem rozdziału produktów trawienia trypsyną albuminy surowicy ludzkiej w chromatografii cieczowej wysokosprawnej. Chromatogram na rysunku 6 pokazuje, że próbka jest dobrze rozdzielona, ​​a rozdzielczość jest bardzo dobra. Produkty trawienia HSA analizowano przy przepływie 100 µl/min, fazie ruchomej 70/30 acetonitryl/woda i 0,1% TFA. Jak pokazano na chromatogramie (rysunek 6), produkt trawienia HSA został podzielony na 17 pików odpowiadających 17 peptydom. Obliczono wydajność rozdziału każdego piku w produkcie trawienia HSA, a wartości podano w tabeli 5.
Trypsynę HSA (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) rozdzielono na kolumnie PMP; szybkość przepływu (100 µl/min), faza ruchoma 60/40 acetonitryl/woda z 0,1% TFA.
gdzie L jest długością kolumny, η jest lepkością fazy ruchomej, ΔP jest ciśnieniem wstecznym kolumny, a u jest prędkością liniową fazy ruchomej. Przepuszczalność kolumny PMP wynosiła 2,5 × 10-14 m2, szybkość przepływu wynosiła 25 μL/min, a użyto 60/40 v/v ACN/woda. Przepuszczalność kolumny PMP (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) była podobna do tej z naszego poprzedniego badania Ref.34. Przepuszczalność kolumny wypełnionej cząstkami porowatymi powierzchniowo wynosi: 1,7 × 10-15 dla cząstek 1,3 μm, 3,1 × 10-15 dla cząstek 1,7 μm, 5,2 × 10-15 i 2,5 × 10-14 m2 dla cząstek 2,6 μm Dla 5 Cząstki μm 43. Dlatego przepuszczalność fazy PMP jest podobna do przepuszczalności cząstek rdzeń-powłoka o wielkości 5 μm.
gdzie Wx jest masą kolumny wypełnionej chloroformem, Wy jest masą kolumny wypełnionej metanolem, a ρ jest gęstością rozpuszczalnika. Gęstości metanolu (ρ = 0,7866) i chloroformu (ρ = 1,484). Całkowita porowatość kolumn SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) 34 i kolumn C18-mocznik 31, które badaliśmy wcześniej, wynosiła odpowiednio 0,63 i 0,55. Oznacza to, że obecność ligandów mocznika zmniejsza przepuszczalność fazy stacjonarnej. Z drugiej strony, całkowita porowatość kolumny PMP (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) wynosi 0,60. Przepuszczalność kolumn PMP jest niższa niż kolumn wypełnionych cząstkami krzemionki związanymi C18, ponieważ w fazach stacjonarnych typu C18 faza C18 Ligandy są przyłączone do cząstek krzemionki jako łańcuchy liniowe, natomiast w fazach stacjonarnych typu polistyrenu wokół nich tworzy się stosunkowo gruba warstwa polimeru. W typowym eksperymencie porowatość kolumny oblicza się następująco:
Rysunek 7A,B przedstawia kolumnę PMP (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) i kolumnę Ascentis Express RP-Amide (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) przy użyciu tych samych warunków elucji (tj. 60/40 ACN/H2O i 0,1% TFA). ) z wykresu van Deemtera. Wybrane mieszaniny peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) przygotowano w 20 µl/min. Minimalna szybkość przepływu dla obu kolumn wynosi 800 µl/min. Minimalne wartości HETP przy optymalnej szybkości przepływu (80 µl/min) dla kolumny PMP i kolumny Ascentis Express RP-Amide wynosiły odpowiednio 2,6 µm i 3,9 µm. Wartości HETP wskazują, że wydajność rozdziału kolumny PMP (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) jest znacznie lepsza niż dostępnej komercyjnie kolumny Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej). Wykres van Deemtera na rys. 7(A) pokazuje, że spadek wartości N wraz ze wzrostem przepływu nie jest istotna w porównaniu z naszymi poprzednimi badaniami. Wyższa wydajność separacji kolumny PMP (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) w porównaniu z kolumną Ascentis Express RP-Amide wynika z udoskonaleń kształtu i rozmiaru cząstek oraz złożonych procedur pakowania kolumny stosowanych w obecnej pracy34.
(A) Wykres van Deemtera (HETP w funkcji prędkości liniowej fazy ruchomej) uzyskany przy użyciu kolumny PMP (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) w 60/40 ACN/H2O z 0,1% TFA.(B) Wykres van Deemtera (HETP w funkcji prędkości liniowej fazy ruchomej) uzyskany przy użyciu kolumny Ascentis Express RP-Amide (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) w 60/40 ACN/H2O z 0,1% TFA.
Przygotowano i oceniono polarną fazę stacjonarną z polistyrenu pod kątem rozdziału syntetycznych mieszanin peptydów i produktów trawienia trypsyną albuminy surowicy ludzkiej (HAS) w chromatografii cieczowej wysokosprawnej. Wydajność chromatograficzna kolumn PMP dla mieszanin peptydów charakteryzuje się doskonałą wydajnością i rozdzielczością rozdziału. Lepsza wydajność rozdziału kolumn PMP wynika z wielu przyczyn, takich jak wielkość cząstek i wielkość porów cząstek krzemionki, kontrolowana synteza fazy stacjonarnej i złożone wypełnienie kolumny. Oprócz wysokiej wydajności rozdziału, niskie przeciwciśnienie w kolumnie przy wysokich natężeniach przepływu jest kolejną zaletą tej fazy stacjonarnej. Kolumny PMP charakteryzują się dobrą powtarzalnością i mogą być stosowane do analizy mieszanin peptydów i trawienia trypsyną różnych białek. Zamierzamy wykorzystać tę kolumnę do rozdziału produktów naturalnych, związków bioaktywnych z roślin leczniczych i ekstraktów grzybowych w chromatografii cieczowej. W przyszłości kolumny PMP zostaną również ocenione pod kątem rozdziału białek i przeciwciał monoklonalnych.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Badania nad systemami rozdziału peptydów metodą chromatografii w odwróconym układzie faz. Część I: Opracowanie protokołu charakteryzacji kolumny. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. i in. Ulepszone aktywne peptydy przeznaczone do leczenia chorób zakaźnych. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetyczne peptydy terapeutyczne: nauka i rynek. Odkrywanie leków. 15 (1-2) dzisiaj, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Zaawansowana chromatografia cieczowa proteomiczna.J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. i in. Zaawansowana chromatografia cieczowa połączona ze spektrometrią mas umożliwia włączenie szeroko ukierunkowanej metabolomiki i proteomiki.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM i Salisbury, JJ Rola UHPLC w rozwoju leków.J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. i Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty chromatografii cieczowej ultrawysokiego ciśnienia do szybkich rozdziałów. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA i Tchelitcheff, P. Zastosowanie chromatografii cieczowej ultrawysokowydajnej w rozwoju leków.J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. i in. Monolityczne makroporowate hydrożele przygotowane z emulsji o wysokiej fazie wewnętrznej typu olej w wodzie w celu wydajnego oczyszczania enterowirusów. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Rola chromatografii cieczowej w proteomice.J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. i Guillarme, D. Nowe trendy w rozdzielaniu terapeutycznych peptydów i białek metodą chromatografii cieczowej w fazie odwróconej: teoria i zastosowania. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC Dwuwymiarowe rozdzielanie peptydów przy użyciu układu RP-RP-HPLC z zastosowaniem różnych wartości pH w pierwszym i drugim wymiarze rozdzielania.J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. i in. Zbadano charakterystyki przenoszenia masy i wydajność kinetyczną kolumn chromatograficznych o wysokiej wydajności wypełnionych cząstkami C18 o wielkości poniżej 2 μm, w pełni i powierzchniowo porowatymi. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. i in. Najnowsze trendy i wyzwania analityczne w zakresie izolacji, identyfikacji i walidacji roślinnych peptydów bioaktywnych.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB i in. Krajobraz proteomiczny królestwa życia. Natura 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. i in. Dalsze przetwarzanie peptydów terapeutycznych metodą preparatywnej chromatografii cieczowej. Molecule (Bazylea, Szwajcaria) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. i Geng, X. Chromatografia w trybie mieszanym i jej zastosowanie do biopolimerów.J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. i Sun, Y. Ligandy do chromatografii białkowej w trybie mieszanym: zasada działania, charakterystyka i projektowanie. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).