Dziękujemy za odwiedzenie witryny Nature.com. Wersja przeglądarki, której używasz, obsługuje CSS w ograniczonym zakresie. Aby uzyskać najlepsze efekty, zalecamy korzystanie z nowszej wersji przeglądarki (lub wyłączenie trybu zgodności w przeglądarce Internet Explorer). Tymczasem, aby zapewnić ciągłą obsługę, będziemy wyświetlać witrynę bez stylów i JavaScript.
Porowata krzemionka została przygotowana metodą sol-żel z pewnymi modyfikacjami w celu uzyskania makroporowatych cząstek. Cząstki te zostały derywatyzowane przez polimeryzację z odwracalnym addycyjnym fragmentowaniem łańcucha (RAFT) z N-fenylomaleimidem-metylowinyloizocyjanianem (PMI) i styrenem w celu przygotowania N-fenylomaleimidu interkalacji fazy stacjonarnej polistyrenu (PMP). Wąskie kolumny ze stali nierdzewnej (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) zostały wypełnione przez pakowanie zawiesinowe. Oceniono rozdział kolumny PMP mieszaniny peptydów składającej się z pięciu peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucyna enkefalina) wydajność chromatograficzna) i trawienie trypsyną albuminy surowicy ludzkiej (HAS). W optymalnych warunkach elucji teoretyczna liczba płytek mieszaniny peptydów wynosi aż 280 000 płytek/m². Porównując wydajność separacji opracowanej kolumny z komercyjną kolumną Ascentis Express RP-Amide, zaobserwowano, że wydajność separacji kolumny PMP była lepsza od kolumny komercyjnej pod względem efektywności separacji i rozdzielczości.
W ostatnich latach przemysł biofarmaceutyczny stał się rozwijającym się rynkiem globalnym, notując znaczny wzrost udziału w rynku. Wraz z eksplozywnym wzrostem przemysłu biofarmaceutycznego1,2,3 analiza peptydów i białek jest wysoce pożądana. Oprócz docelowego peptydu, podczas syntezy peptydu powstaje wiele zanieczyszczeń, co wymaga oczyszczania chromatograficznego w celu uzyskania peptydów o pożądanej czystości. Analiza i charakteryzowanie białek w płynach ustrojowych, tkankach i komórkach jest niezwykle trudnym zadaniem ze względu na dużą liczbę potencjalnie wykrywalnych gatunków w jednej próbce. Chociaż spektrometria masowa jest skutecznym narzędziem do sekwencjonowania peptydów i białek, jeśli takie próbki zostaną wstrzyknięte do spektrometru masowego w jednym przejściu, rozdział nie będzie idealny. Problem ten można złagodzić, wdrażając rozdziały za pomocą chromatografii cieczowej (LC) przed analizą MS, co zmniejszy liczbę analitów wprowadzanych do spektrometru masowego w danym momencie4,5,6. Ponadto podczas rozdziału fazy ciekłej anality można skupić w wąskich obszarach, co powoduje koncentrację tych analitów i poprawia czułość wykrywania metodą MS. Chromatografia cieczowa (LC) poczyniła znaczne postępy w ciągu ostatniej dekady i stała się popularną techniką w analizie proteomicznej7,8,9,10.
Chromatografia cieczowa w fazie odwróconej (RP-LC) jest szeroko stosowana do oczyszczania i rozdzielania mieszanin peptydów przy użyciu modyfikowanej oktadecylem krzemionki (ODS) jako fazy stacjonarnej11,12,13. Jednakże fazy stacjonarne RP nie zapewniają zadowalającego rozdzielania peptydów i białek ze względu na ich złożoną strukturę i amfifilową naturę14,15. Dlatego też, do analizy peptydów i białek z polarnymi i niepolarnymi cząsteczkami w celu interakcji z tymi analitami i ich zatrzymania, wymagane są specjalnie zaprojektowane fazy stacjonarne16. Chromatografia w trybie mieszanym, która zapewnia interakcje multimodalne, może być alternatywą dla RP-LC w przypadku rozdzielania peptydów, białek i innych złożonych mieszanin. Przygotowano kilka faz stacjonarnych w trybie mieszanym, a kolumny wypełnione tymi fazami zostały użyte do rozdzielania peptydów i białek17,18,19,20,21. Fazy stacjonarne w trybie mieszanym (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polarna interkalacja/RPLC) nadają się do rozdzielania peptydów i białek ze względu na obecność zarówno grup polarnych, jak i niepolarnych22,23,24,25,26,27,28. Podobnie, polarne interkalujące fazy stacjonarne z kowalencyjnie związanymi grupami polarnymi wykazują dobrą siłę rozdzielania i wyjątkową selektywność dla analitów polarnych i niepolarnych, ponieważ rozdzielanie zależy od interakcji między analitem a fazą stacjonarną. Interakcje multimodalne29, 30, 31, 32.Ostatnio Zhang i in. 30 przygotował stacjonarną fazę poliaminową zakończoną dodecylem i skutecznie oddzielił węglowodory, leki przeciwdepresyjne, flawonoidy, nukleozydy, estrogeny i kilka innych analitów. Interkalator polarny ma zarówno grupy polarne, jak i niepolarne, dzięki czemu można go stosować do rozdzielania peptydów i białek, które mają zarówno części hydrofobowe, jak i hydrofilowe. Kolumny polarne (np. kolumny C18 zatopione w amidzie) są dostępne w handlu pod nazwą handlową Ascentis Express RP-Amide columns, ale kolumny te służą wyłącznie do analizy aminy 33.
W niniejszym badaniu przygotowano i oceniono polarną fazę stacjonarną (polistyren zatopiony w N-fenylomaleimidzie) pod kątem rozdzielania peptydów i produktów trawienia trypsyną HSA. Fazę stacjonarną przygotowano, stosując następującą strategię. Porowate cząstki krzemionki przygotowano zgodnie z procedurą podaną w naszej poprzedniej publikacji z pewnymi modyfikacjami protokołu przygotowania. Proporcje mocznika, glikolu polietylenowego (PEG), TMOS i kwasu octowego w wodzie dostosowano w celu przygotowania cząstek krzemionki o dużym rozmiarze porów. Po drugie, zsyntetyzowano nowy ligand, fenylomaleimid-izocyjanian metylowinylu, i użyto go do derywatyzacji cząstek krzemionki w celu przygotowania polarnej osadzonej fazy stacjonarnej. Powstałą fazę stacjonarną umieszczono w kolumnie ze stali nierdzewnej (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) przy użyciu zoptymalizowanego schematu pakowania. Wypełnienie kolumny wspomagane jest wibracjami mechanicznymi w celu zapewnienia utworzenia jednorodnego złoża w kolumnie. Oceń rozdział w kolumnie wypełnionej mieszanin peptydów składających się z pięć peptydów; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) oraz trypsynowy produkt trawienia albuminy ludzkiej (HAS). Zaobserwowano, że mieszanina peptydów i trypsynowy produkt trawienia HSA rozdzieliły się z dobrą rozdzielczością i wydajnością. Wydajność rozdzielania kolumny PMP porównano z wydajnością kolumny Ascentis Express RP-Amide. Zaobserwowano, że zarówno peptydy, jak i białka rozdzieliły się dobrze i wydajnie na kolumnie PMP, która była wydajniejsza niż kolumna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (glikol polietylenowy), mocznik, kwas octowy, trimetoksyortokrzemian (TMOS), trimetylochlorosilan (TMCS), trypsyna, albumina surowicy ludzkiej (HSA), chlorek amonu, mocznik, heksan, metylodisilazan (HMDS), chlorek metakryloilu (MC), styren, 4-hydroksy-TEMPO, nadtlenek benzoilu (BPO), acetonitryl klasy HPLC (ACN), metanol, 2-propanol i aceton zakupiony od firmy Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Mieszaninę mocznika (8 g), glikolu polietylenowego (8 g) i 8 ml 0,01 N kwasu octowego mieszano przez 10 minut, a następnie dodano do niej 24 ml TMOS w warunkach lodowatej temperatury. Mieszaninę reakcyjną ogrzewano w temperaturze 40°C przez 6 godzin, a następnie w temperaturze 120°C przez 8 godzin w autoklawie ze stali nierdzewnej. Wodę odlano, a pozostały materiał suszono w temperaturze 70°C przez 12 godzin. Wysuszoną miękką masę zmielono na gładko w piecu i kalcynowano w temperaturze 550°C przez 12 godzin. Przygotowano i scharakteryzowano trzy partie w celu zbadania powtarzalności wielkości cząstek, wielkości porów i powierzchni.
Poprzez modyfikację powierzchni cząstek krzemionki wstępnie zsyntetyzowanym ligandem fenylomaleimid-metylowinyloizocyjanian (PCMP), a następnie polimeryzację radialną ze styrenem, przygotowano związek zawierający grupę polarną. Faza stacjonarna dla agregatów i łańcuchów polistyrenowych. Proces przygotowania opisano poniżej.
N-fenylomaleimid (200 mg) i izocyjanian metylowinylu (100 mg) rozpuszczono w suchym toluenie, a następnie do kolby reakcyjnej dodano 0,1 ml 2,2′-azoizobutyronitrylu (AIBN), aby przygotować kopolimer fenylomaleimidu i izocyjanianu metylowinylu (PMCP). Mieszaninę ogrzewano w temperaturze 60°C przez 3 godziny, przefiltrowano i wysuszono w piecu w temperaturze 40°C przez 3 godziny.
Wysuszone cząstki krzemionki (2 g) rozproszono w suchym toluenie (100 ml), mieszano i poddawano działaniu ultradźwięków w okrągłodennej kolbie o pojemności 500 ml przez 10 minut. PMCP (10 mg) rozpuszczono w toluenie i dodawano kroplami do kolby reakcyjnej za pomocą lejka wkraplającego. Mieszaninę ogrzewano w temperaturze wrzenia w 100°C przez 8 godzin, przefiltrowano i przemyto acetonem, a następnie suszono w temperaturze 60°C przez 3 godziny. Następnie cząstki krzemionki związane z PMCP (100 g) rozpuszczono w toluenie (200 ml) i dodano 4-hydroksy-TEMPO (2 ml) w obecności 100 µl dilaurynianu dibutylocyny jako katalizatora. Mieszaninę mieszano w temperaturze 50°C przez 8 godzin, filtrowano i suszono w temperaturze 50°C przez 3 godziny.
Styren (1 ml), nadtlenek benzoilu BPO (0,5 ml) i cząsteczki krzemionki przyłączone do TEMPO-PMCP (1,5 g) rozproszono w toluenie i przedmuchano azotem. Polimeryzację styrenu prowadzono w temperaturze 100°C przez 12 godzin. Otrzymany produkt przemyto metanolem i suszono w temperaturze 60°C przez noc. Ogólny schemat reakcji pokazano na rysunku 1.
Próbki odgazowywano w temperaturze 393 K przez 1 godzinę, aby uzyskać ciśnienie resztkowe mniejsze niż 10-3 Torr. Ilość N2 zaadsorbowanego przy ciśnieniu względnym P/P0 = 0,99 została użyta do określenia całkowitej objętości porów. Morfologię odsłoniętych i związanych z ligandem cząstek krzemionki zbadano za pomocą skaningowej mikroskopii elektronowej (Hitachi High Technologies, Tokio, Japonia). Wysuszone próbki (odsłonięte cząstki krzemionki i związane z ligandem cząstki krzemionki) umieszczono na aluminiowej kolumnie za pomocą taśmy węglowej. Złoto zostało pokryte na próbkach za pomocą napylarki Q150T, a na próbkach osadzono warstwę Au o grubości 5 nm. Poprawia to wydajność procesu przy użyciu niskich napięć i zapewnia drobnoziarniste, zimne napylanie. Do analizy pierwiastkowej użyto analizatora pierwiastkowego Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Analizator wielkości cząstek Malvern (Worcestershire, Wielka Brytania) Mastersizer 2000 do uzyskania rozkładu wielkości cząstek zastosowano. Nagie cząstki krzemionki i cząstki krzemionki związane z ligandem (po 5 mg) rozproszono w 5 ml izopropanolu, poddano działaniu ultradźwięków przez 10 minut, zawirowano przez 5 minut i umieszczono na stole optycznym urządzenia Mastersizer. Analizę termograwimetryczną przeprowadzono z szybkością 5 °C na minutę w zakresie temperatur od 30 do 800 °C.
Kolumny o wąskim otworze ze stali nierdzewnej wyłożone szkłem o wymiarach (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) wypełniono metodą pakowania zawiesinowego, stosując tę ​​samą procedurę, która została użyta w Ref. 31.Kolumna ze stali nierdzewnej (wyłożona szkłem, 100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) z przyłączem wylotowym zawierającym 1 µm spieku została podłączona do pakera zawiesinowego (Alltech Deerfield, IL, USA). Przygotuj zawiesinę fazy stacjonarnej, zawieszając 150 mg fazy stacjonarnej w 1,2 ml metanolu i prześlij ją do kolumny magazynowej. Metanol został użyty jako rozpuszczalnik zawiesiny, a także rozpuszczalnik napędowy. Napełnij kolumnę sekwencyjnie, stosując ciśnienia 100 MP przez 10 minut, 80 MP przez 15 minut i 60 MP przez 30 minut.Podczas pakowania zastosowano wibracje mechaniczne za pomocą dwóch wstrząsarek kolumn GC (Alltech, Deerfield, IL, USA), aby zapewnić równomierne upakowanie kolumny.Zamknij paker zawiesinowy i powoli uwolnij ciśnienie, aby zapobiec uszkodzeniom wewnątrz kolumny.Odłącz kolumnę od jednostki pakowania zawiesinowego i podłącz inną złączkę do wlotu i do System LC w celu sprawdzenia jego wydajności.
Pompa LC (10AD Shimadzu, Japonia), wtryskiwacz (Valco (USA) C14 W.05) z pętlą wtryskową 50 nL, odgazowywacz membranowy (Shimadzu DGU-14A), okno kapilarne UV-VIS zostały skonstruowane Specjalne urządzenie µLC detektor (UV-2075) i mikrokolumny wyłożone szkłem. Użyj bardzo wąskich i krótkich rurek łączących, aby zminimalizować efekt dodatkowego poszerzenia pasma kolumny. Po zapakowaniu kapilary (50 μm, średnica wewnętrzna 365) i kapilary ze złączką redukcyjną (50 μm) zostały zainstalowane przy wylocie 1/16″ złączki redukującej. Zbieranie danych i przetwarzanie chromatograficzne przeprowadzono przy użyciu oprogramowania Multichro 2000. Monitorowanie przy 254 nm Anality zostały przetestowane pod kątem absorbancji UV. Dane chromatograficzne zostały przeanalizowane przez OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina z surowicy ludzkiej, liofilizowany proszek, ≥ 96% (elektroforeza w żelu agarozowym) 3 mg zmieszane z trypsyną (1,5 mg), 4,0 M mocznikiem (1 ml) i 0,2 M wodorowęglanem amonu (1 ml). Roztwór mieszano przez 10 minut i przechowywano w łaźni wodnej w temperaturze 37°C przez 6 godzin, a następnie schłodzono 1 ml 0,1% TFA. Przefiltruj roztwór i przechowuj w temperaturze poniżej 4°C.
Rozdział mieszanin peptydów i produktów trawienia trypsyną HSA oceniano oddzielnie na kolumnach PMP. Sprawdź rozdział mieszaniny peptydów i produktów trawienia trypsyną HSA na kolumnie PMP i porównaj wyniki z wynikami na kolumnie Ascentis Express RP-Amide. Teoretyczną liczbę półek oblicza się w następujący sposób:
Obrazy SEM gołych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem pokazano na FIG. 2. Obrazy SEM gołych cząstek krzemionki (A, B) pokazują, że w przeciwieństwie do naszych poprzednich badań, cząstki te są kuliste, wydłużone lub mają nieregularną symetrię. Powierzchnia cząstek krzemionki związanych z ligandem (C, D) jest gładsza niż powierzchnia gołych cząstek krzemionki, co może być spowodowane powłoką łańcuchów polistyrenowych na powierzchni cząstek krzemionki.
Obrazy uzyskane za pomocą skaningowego mikroskopu elektronowego przedstawiające gołe cząstki krzemionki (A, B) i cząstki krzemionki związane z ligandem (C, D).
Rozkład wielkości cząstek gołych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem pokazano na rysunku 3(A). Krzywe rozkładu wielkości cząstek objętościowo wykazały, że wielkość cząstek krzemionki wzrosła po modyfikacji chemicznej (rys. 3A). Dane dotyczące rozkładu wielkości cząstek cząstek krzemionki z bieżącego badania i poprzedniego badania porównano w tabeli 1(A). Objętościowy rozmiar cząstek, d(0,5), PMP wynosi 3,36 μm, w porównaniu z naszym poprzednim badaniem, w którym wartość d(0,5) wynosiła 3,05 μm (cząstki krzemionki związane z polistyrenem)34. Ta partia miała węższy rozkład wielkości cząstek w porównaniu z naszym poprzednim badaniem ze względu na różne proporcje PEG, mocznika, TMOS i kwasu octowego w mieszaninie reakcyjnej. Rozmiar cząstek fazy PMP jest nieznacznie większy niż w przypadku fazy cząstek krzemionki związanej z polistyrenem, którą badaliśmy wcześniej. Oznacza to, że funkcjonalizacja powierzchni cząstek krzemionki styrenem spowodowała osadzenie się tylko warstwa polistyrenu (0,97 µm) na powierzchni krzemionki, podczas gdy w fazie PMP grubość warstwy wynosiła 1,38 µm.
Rozkład wielkości cząstek (A) i rozkład wielkości porów (B) cząstek krzemionki bez powłoki i cząstek krzemionki związanych z ligandem.
Wielkość porów, objętość porów i powierzchnia cząstek krzemionki z bieżącego badania podano w Tabeli 1(B). Profile PSD gołych cząstek krzemionki i cząstek krzemionki związanych z ligandem pokazano na Rysunku 3(B). Wyniki są porównywalne z naszymi poprzednimi badaniami. Rozmiary porów gołych i związanych z ligandem cząstek krzemionki wynoszą odpowiednio 310 i 241, co wskazuje, że rozmiar porów zmniejsza się o 69 po modyfikacji chemicznej, jak pokazano w Tabeli 1(B), a zmiana krzywej jest pokazana na Rysunku 3(B). Podobnie, objętość porów cząstek krzemionki zmniejszyła się z 0,67 do 0,58 cm3/g po modyfikacji chemicznej. Powierzchnia właściwa obecnie badanych cząstek krzemionki wynosi 116 m2/g, co jest porównywalne z naszymi poprzednimi badaniami (124 m2/g). Jak pokazano w Tabeli 1(B), powierzchnia (m2/g) cząstek krzemionki również zmniejszyła się z 116 m2/g do 105 m2/g po modyfikacji chemicznej.
Wyniki analizy pierwiastkowej fazy stacjonarnej przedstawiono w tabeli 2. Obciążenie węglem obecnej fazy stacjonarnej wynosi 6,35%, co jest wartością niższą od obciążenia węglem w naszych poprzednich badaniach (cząsteczki krzemionki związane polistyrenem, odpowiednio 7,93%35 i 10,21%) 42. Obciążenie węglem obecnej fazy stacjonarnej jest niskie, ponieważ w przygotowaniu obecnego SP, oprócz styrenu, użyto kilku polarnych ligandów, takich jak fenylomaleimid-metylowinyloizocyjanian (PCMP) i 4-hydroksy-TEMPO. Procentowa zawartość azotu w obecnej fazie stacjonarnej wynosi 2,21%, w porównaniu do odpowiednio 0,1735 i 0,85% azotu w poprzednich badaniach. Oznacza to, że % wagowy azotu jest wyższy w obecnej fazie stacjonarnej ze względu na fenylomaleimid. Podobnie, obciążenia węglem produktów (4) i (5) wynosiły 2,7% i 2,9%, odpowiednio, podczas gdy ładunek węglowy produktu końcowego (6) wynosił 6,35%, jak pokazano w tabeli 2. Utratę masy sprawdzono przy użyciu fazy stacjonarnej PMP, a krzywą TGA pokazano na rysunku 4. Krzywa TGA pokazuje utratę masy na poziomie 8,6%, co dobrze zgadza się z ładunkiem węglowym (6,35%), ponieważ ligandy zawierają nie tylko C, ale także N, O i H.
Ligand fenylomaleimidowo-metylowinyloizocyjanianowy został wybrany do modyfikacji powierzchni cząstek krzemionki, ponieważ ma polarne grupy fenylomaleimidowe i grupy winyloizocyjanianowe. Grupy winyloizocyjanianowe mogą dalej reagować ze styrenem poprzez polimeryzację rodnikową. Drugim powodem jest wstawienie grupy, która ma umiarkowaną interakcję z analitem i nie ma silnej interakcji elektrostatycznej między analitem a fazą stacjonarną, ponieważ cząsteczka fenylomaleimidowa nie ma ładunku wirtualnego przy normalnym pH. Biegunowość fazy stacjonarnej można kontrolować za pomocą optymalnej ilości styrenu i czasu reakcji polimeryzacji rodnikowej. Ostatni etap reakcji (polimeryzacja rodnikowa) jest krytyczny i może zmienić biegunowość fazy stacjonarnej. Przeprowadzono analizę elementarną w celu sprawdzenia obciążenia węglem tych faz stacjonarnych. Zaobserwowano, że zwiększenie ilości styrenu i czasu reakcji zwiększyło obciążenie węglem fazy stacjonarnej i odwrotnie. SP przygotowane z różnymi stężeniami styrenu mają różne ładunki węgla. Ponownie załaduj te fazy stacjonarne do kolumn ze stali nierdzewnej i sprawdź ich wydajność chromatograficzną (selektywność, rozdzielczość, wartość N itp.). Na podstawie tych eksperymentów wybrano zoptymalizowaną formułę do przygotowania fazy stacjonarnej PMP, aby zapewnić kontrolowaną polarność i dobrą retencję analitu.
Oceniono również pięć mieszanin peptydowych (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucyna enkefalina) przy użyciu kolumny PMP z fazą ruchomą; 60/40 (v/v) acetonitryl/woda (0,1% TFA) przy szybkości przepływu 80 μl/min. W optymalnych warunkach elucji teoretyczna liczba półek (N) na kolumnę (100 × 1,8 mm id) wynosi 20 000 ± 100 (200 000 płytek/m²). Tabela 3 przedstawia wartości N dla trzech kolumn PMP, a chromatogramy przedstawiono na rysunku 5A. Szybka analiza na kolumnie PMP przy dużej szybkości przepływu (700 μl/min), pięć peptydów zostało eluowanych w ciągu jednej minuty, wartości N były bardzo dobre, 13 500 ± 330 na kolumnę (100 × 1,8 mm id), co odpowiada 135 000 płytkom/m (rysunek 5B). Trzy kolumny o identycznych rozmiarach (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) wypełniono trzema różnymi partiami fazy stacjonarnej PMP w celu sprawdzenia powtarzalności. Stężenie analitu dla każdej kolumny rejestrowano, stosując optymalne warunki elucji oraz liczbę półek teoretycznych N i czas retencji, aby oddzielić tę samą mieszaninę testową na każdej kolumnie. Dane dotyczące powtarzalności dla kolumn PMP przedstawiono w tabeli 4. Powtarzalność kolumny PMP dobrze koreluje z bardzo niskimi wartościami %RSD, jak pokazano w tabeli 3.
Rozdział mieszaniny peptydów na kolumnie PMP (B) i kolumnie Ascentis Express RP-Amide (A); faza ruchoma 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), wymiary kolumny PMP (100 × 1,8 mm); analityczny Kolejność elucji związków: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) i 5 (kwas leucynowy (enkefalina)).
Kolumnę PMP (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) oceniono pod kątem rozdzielania produktów trawienia trypsyną albuminy surowicy ludzkiej w chromatografii cieczowej wysokosprawnej. Chromatogram na rysunku 6 pokazuje, że próbka jest dobrze rozdzielona, ​​a rozdzielczość jest bardzo dobra. Produkty trawienia HSA analizowano przy przepływie 100 µl/min, fazie ruchomej 70/30 acetonitryl/woda i 0,1% TFA. Jak pokazano na chromatogramie (rysunek 6), produkt trawienia HSA został podzielony na 17 pików odpowiadających 17 peptydom. Obliczono wydajność rozdzielania każdego piku w produkcie trawienia HSA, a wartości podano w tabeli 5.
Trawienie trypsyną HSA (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) rozdzielono na kolumnie PMP; szybkość przepływu (100 µl/min), faza ruchoma 60/40 acetonitryl/woda z 0,1% TFA.
gdzie L jest długością kolumny, η jest lepkością fazy ruchomej, ΔP jest ciśnieniem wstecznym kolumny, a u jest prędkością liniową fazy ruchomej. Przepuszczalność kolumny PMP wynosiła 2,5 × 10-14 m2, natężenie przepływu wynosiło 25 μl/min, a użyto 60/40 v/v ACN/woda. Przepuszczalność kolumny PMP (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) była podobna do przepuszczalności z naszego poprzedniego badania Ref.34. Przepuszczalność kolumny wypełnionej cząstkami powierzchniowo porowatymi wynosi: 1,7 × 10-15 dla cząstek 1,3 μm, 3,1 × 10-15 dla cząstek 1,7 μm, 5,2 × 10-15 i 2,5 × 10-14 m2 dla cząstek 2,6 μm Dla 5 Cząstki μm 43. Dlatego przepuszczalność fazy PMP jest podobna do przepuszczalności cząstek rdzeń-powłoka o wielkości 5 μm.
gdzie Wx jest masą kolumny wypełnionej chloroformem, Wy jest masą kolumny wypełnionej metanolem, a ρ jest gęstością rozpuszczalnika. Gęstości metanolu (ρ = 0,7866) i chloroformu (ρ = 1,484). Całkowita porowatość kolumn SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 i kolumn C18-Urea 31, które badaliśmy wcześniej, wynosiła odpowiednio 0,63 i 0,55. Oznacza to, że obecność ligandów mocznika zmniejsza przepuszczalność fazy stacjonarnej. Z drugiej strony całkowita porowatość kolumny PMP (100 × 1,8 mm id) wynosi 0,60. Przepuszczalność kolumn PMP jest niższa niż kolumn wypełnionych cząstkami krzemionki związanymi C18, ponieważ w fazach stacjonarnych typu C18 faza C18 Ligandy są przyłączone do cząstek krzemionki jako łańcuchy liniowe, natomiast w fazach stacjonarnych typu polistyrenu wokół nich tworzy się stosunkowo gruba warstwa polimeru. W typowym eksperymencie porowatość kolumny obliczana jest jako:
Rysunek 7A,B przedstawia kolumnę PMP (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) i kolumnę Ascentis Express RP-Amide (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) przy użyciu tych samych warunków elucji (tj. 60/40 ACN/H2O i 0,1% TFA).) z wykresu van Deemtera. Wybrane mieszaniny peptydów (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) przygotowano w 20 µl/min. Minimalna szybkość przepływu dla obu kolumn wynosi 800 µl/min. Minimalne wartości HETP przy optymalnej szybkości przepływu (80 µl/min) dla kolumny PMP i kolumny Ascentis Express RP-Amide wynosiły odpowiednio 2,6 µm i 3,9 µm. Wartości HETP wskazują, że wydajność separacji kolumny PMP (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) jest znacznie lepsza niż dostępnej w handlu kolumny Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej). Wykres van Deemtera na rys. 7(A) pokazuje, że spadek wartości N wraz ze wzrostem przepływu nie jest istotna w porównaniu z naszymi poprzednimi badaniami. Wyższa wydajność separacji kolumny PMP (100 × 1,8 mm średnicy wewnętrznej) w porównaniu z kolumną Ascentis Express RP-Amide wynika z udoskonaleń kształtu i rozmiaru cząstek oraz złożonych procedur pakowania kolumn stosowanych w obecnej pracy34.
(A) Wykres van Deemtera (HETP w funkcji prędkości liniowej fazy ruchomej) uzyskany przy użyciu kolumny PMP (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) w 60/40 ACN/H2O z 0,1% TFA.(B) Wykres van Deemtera (HETP w funkcji prędkości liniowej fazy ruchomej) uzyskany przy użyciu kolumny Ascentis Express RP-Amide (średnica wewnętrzna 100 × 1,8 mm) w 60/40 ACN/H2O z 0,1% TFA.
Przygotowano i oceniono polarną fazę stacjonarną z polistyrenu pod kątem rozdzielania syntetycznych mieszanin peptydów i produktów trawienia trypsyną albuminy surowicy ludzkiej (HAS) w chromatografii cieczowej wysokosprawnej. Wydajność chromatograficzna kolumn PMP dla mieszanin peptydów charakteryzuje się doskonałą wydajnością i rozdzielczością rozdziału. Lepsza wydajność rozdziału kolumn PMP wynika z wielu powodów, takich jak wielkość cząstek i wielkość porów cząstek krzemionki, kontrolowana synteza fazy stacjonarnej i złożone wypełnienie kolumny. Oprócz wysokiej wydajności rozdziału, niskie ciśnienie wsteczne kolumny przy wysokich natężeniach przepływu jest kolejną zaletą tej fazy stacjonarnej. Kolumny PMP wykazują dobrą powtarzalność i mogą być stosowane do analizy mieszanin peptydów i trawienia trypsyną różnych białek. Zamierzamy wykorzystać tę kolumnę do rozdzielania produktów naturalnych, związków bioaktywnych z roślin leczniczych i ekstraktów grzybowych w chromatografii cieczowej. W przyszłości kolumny PMP zostaną również ocenione pod kątem rozdzielania białek i przeciwciał monoklonalnych.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. i Petersson, P. Badania nad systemami rozdziału peptydów metodą chromatografii w odwróconej fazie. Część I: Opracowanie protokołu charakteryzacji kolumny. J. Chromatography. 1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. i in. Ulepszone aktywne peptydy przeznaczone do leczenia chorób zakaźnych. Biotechnologia. Zaawansowane. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. i Khrestchatisky, M. Syntetyczne peptydy terapeutyczne: nauka i rynek. Odkrywanie leków. 15 (1-2) dzisiaj, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD i Shen, Y. Zaawansowana proteomiczna chromatografia cieczowa. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. i in. Zaawansowana chromatografia cieczowa połączona ze spektrometrią mas umożliwia włączenie szeroko ukierunkowanej metabolomiki i proteomiki.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM i Salisbury, JJ Rola UHPLC w rozwoju leków.J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. i Clausen, AM Podstawowe i praktyczne aspekty chromatografii cieczowej ultrawysokiego ciśnienia do szybkich separacji. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA i Tchelitcheff, P. Zastosowanie chromatografii cieczowej ultrawysokosprawnej w rozwoju leków.J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. i in. Monolityczne makroporowate hydrożele przygotowane z emulsji o wysokiej fazie wewnętrznej typu olej w wodzie w celu wydajnego oczyszczania enterowirusów. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. i Wilkins, JA Rola chromatografii cieczowej w proteomice.J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. i Guillarme, D. Nowe trendy w rozdzielaniu terapeutycznych peptydów i białek metodą chromatografii cieczowej z odwróconą fazą: teoria i zastosowania. J. Pharmacy. Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE i Gebler, JC Dwuwymiarowe rozdzielanie peptydów przy użyciu układu RP-RP-HPLC z zastosowaniem różnych wartości pH w pierwszym i drugim wymiarze rozdzielania. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. i in. Zbadano charakterystyki przenoszenia masy i wydajność kinetyczną kolumn chromatograficznych o wysokiej wydajności wypełnionych cząstkami C18 o wielkości poniżej 2 μm, w pełni i powierzchniowo porowatymi. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. i in. Najnowsze trendy i wyzwania analityczne w zakresie izolacji, identyfikacji i walidacji roślinnych peptydów bioaktywnych.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB i in. Krajobraz proteomiczny królestwa życia. Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. i in. Dalsze przetwarzanie peptydów terapeutycznych metodą preparatywnej chromatografii cieczowej. Molecule (Bazylea, Szwajcaria) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. i Geng, X. Chromatografia w trybie mieszanym i jej zastosowanie do biopolimerów.J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. i Sun, Y. Ligandy do chromatografii białkowej w trybie mieszanym: zasada, charakterystyka i projekt. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).