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Partículas de sílica porosas foram preparadas pelo método sol-gel com algumas modificações para obtenção de partículas macroporosas. Essas partículas foram derivatizadas por polimerização por transferência de cadeia por adição-fragmentação reversível (RAFT) com N-fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PMI) e estireno para preparar a fase estacionária de poliestireno intercalado com N-fenilmaleimida (PMP). Colunas de aço inoxidável de diâmetro interno estreito (100 × 1,8 mm d.i.) foram empacotadas por suspensão. Avaliou-se a separação em coluna de PMP de uma mistura de peptídeos composta por cinco peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina-encefalina) e a digestão com tripsina de albumina sérica humana (HAS). Sob condições ótimas de eluição, o número de pratos teóricos da mistura de peptídeos atingiu 280.000. placas/m². Comparando o desempenho de separação da coluna desenvolvida com a coluna comercial Ascentis Express RP-Amide, observou-se que o desempenho de separação da coluna PMP foi superior ao da coluna comercial em termos de eficiência de separação e resolução.
Nos últimos anos, a indústria biofarmacêutica tornou-se um mercado global em expansão, com um aumento substancial na participação de mercado. Com o crescimento explosivo da indústria biofarmacêutica^1,2,3, a análise de peptídeos e proteínas tornou-se altamente desejada. Além do peptídeo alvo, diversas impurezas são geradas durante a síntese de peptídeos, exigindo, portanto, purificação cromatográfica para a obtenção de peptídeos com a pureza desejada. A análise e caracterização de proteínas em fluidos corporais, tecidos e células é uma tarefa extremamente desafiadora devido ao grande número de espécies potencialmente detectáveis ​​em uma única amostra. Embora a espectrometria de massas seja uma ferramenta eficaz para o sequenciamento de peptídeos e proteínas, se essas amostras forem injetadas no espectrômetro de massas em uma única passagem, a separação não será ideal. Esse problema pode ser mitigado pela implementação de separações por cromatografia líquida (CL) antes da análise por espectrometria de massas, o que reduzirá o número de analitos que entram no espectrômetro de massas em um determinado momento^4,5,6. Além disso, durante a separação em fase líquida, os analitos podem ser concentrados em regiões estreitas, concentrando-os e melhorando a detecção por espectrometria de massas. sensibilidade. A cromatografia líquida (CL) avançou significativamente na última década e tornou-se uma técnica popular na análise proteômica7,8,9,10.
A cromatografia líquida de fase reversa (RP-LC) é amplamente utilizada para a purificação e separação de misturas de peptídeos, utilizando sílica modificada com octadecil (ODS) como fase estacionária^11,12,13. No entanto, as fases estacionárias de RP não proporcionam uma separação satisfatória de peptídeos e proteínas devido à sua estrutura complexa e natureza anfipática^14,15. Portanto, são necessárias fases estacionárias especialmente projetadas para analisar peptídeos e proteínas com grupos polares e apolares que interajam e retenham esses analitos¹⁶. A cromatografia de modo misto, que proporciona interações multimodais, pode ser uma alternativa à RP-LC para a separação de peptídeos, proteínas e outras misturas complexas. Diversas fases estacionárias de modo misto foram preparadas e colunas empacotadas com essas fases foram utilizadas para a separação de peptídeos e proteínas^{17,18,19,20,21}. Fases estacionárias de modo misto (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar) intercalação/RPLC) são adequadas para separações de peptídeos e proteínas devido à presença de grupos polares e apolares22,23,24,25,26,27,28. Da mesma forma, fases estacionárias intercalantes polares com grupos polares ligados covalentemente mostram bom poder de separação e seletividade única para analitos polares e apolares, uma vez que a separação depende da interação entre o analito e a fase estacionária. Interações multimodais29,30,31,32. Recentemente, Zhang et al. 30 preparou uma fase estacionária de poliamina com terminação dodecil e separou com sucesso hidrocarbonetos, antidepressivos, flavonoides, nucleosídeos, estrogênios e vários outros analitos. O intercalador polar possui grupos polares e apolares, portanto, pode ser usado para separar peptídeos e proteínas que possuem porções hidrofóbicas e hidrofílicas. Colunas com grupos polares incorporados (por exemplo, colunas C18 com grupos amida incorporados) estão disponíveis comercialmente sob o nome comercial Ascentis Express RP-Amide, mas essas colunas são usadas apenas para a análise de amina 33.
No presente estudo, uma fase estacionária com componente polar incorporado (poliestireno com N-fenilmaleimida incorporada) foi preparada e avaliada para a separação de peptídeos e digestos de tripsina de HSA. A fase estacionária foi preparada utilizando a seguinte estratégia: partículas de sílica porosas foram preparadas de acordo com o procedimento descrito em nossa publicação anterior, com algumas modificações no protocolo de preparação. A proporção de ureia, polietilenoglicol (PEG), TMOS, água e ácido acético foi ajustada para preparar partículas de sílica com poros de tamanho grande. Em seguida, um novo ligante, fenilmaleimida-metil vinil isocianato, foi sintetizado e utilizado para derivatizar as partículas de sílica e preparar a fase estacionária com componente polar incorporado. A fase estacionária resultante foi empacotada em uma coluna de aço inoxidável (100 × 1,8 mm d.i.) utilizando o esquema de empacotamento otimizado. O empacotamento da coluna foi auxiliado por vibração mecânica para garantir a formação de um leito homogêneo dentro da coluna. Avaliamos a separação em coluna empacotada de misturas de peptídeos compostas por cinco peptídeos. (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) e digestão tripsínica de albumina sérica humana (HSA). Observou-se que a mistura de peptídeos e a digestão tripsínica de HSA se separaram com boa resolução e eficiência. O desempenho de separação da coluna PMP foi comparado ao da coluna Ascentis Express RP-Amide. Tanto os peptídeos quanto as proteínas apresentaram boa resolução e eficiência na coluna PMP, que se mostrou mais eficiente que a coluna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polietilenoglicol), Ureia, Ácido Acético, Trimetoxi Ortossilicato (TMOS), Trimetil Clorosilano (TMCS), Tripsina, Albumina Sérica Humana (HSA), Cloreto de Amônio, Ureia, Hexano Metildisilazano (HMDS), Cloreto de Metacrilato (MC), Estireno, 4-Hidroxi-TEMPO, Peróxido de Benzoíla (BPO), Acetonitrila (ACN) de Grau HPLC, Metanol, 2-Propanol e Acetona. Adquiridos da Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
Uma mistura de ureia (8 g), polietilenoglicol (8 g) e 8 mL de ácido acético 0,01 N foi agitada por 10 minutos e, em seguida, adicionaram-se 24 mL de TMOS sob condições de resfriamento com gelo. A mistura reacional foi aquecida a 40 °C por 6 horas e, posteriormente, a 120 °C por 8 horas em uma autoclave de aço inoxidável. A água foi descartada e o material residual foi seco a 70 °C por 12 horas. A massa seca e macia foi moída em forno e calcinada a 550 °C por 12 horas. Três lotes foram preparados e caracterizados para verificar a reprodutibilidade do tamanho de partícula, tamanho de poro e área superficial.
Através da modificação da superfície de partículas de sílica com o ligante pré-sintetizado fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP), seguida de polimerização radial com estireno, foi preparado um composto contendo um grupo polar. Este composto serviu como fase estacionária para agregados e cadeias de poliestireno. O processo de preparação é descrito a seguir.
N-fenilmaleimida (200 mg) e isocianato de vinila de metila (100 mg) foram dissolvidos em tolueno seco, e 0,1 mL de 2,2′-azoisobutironitrila (AIBN) foi adicionado ao frasco de reação para preparar o copolímero de fenilmaleimida-isocianato de vinila de metila (PMCP). A mistura foi aquecida a 60 °C por 3 horas, filtrada e seca em estufa a 40 °C por 3 horas.
Partículas de sílica secas (2 g) foram dispersas em tolueno seco (100 mL), agitadas e sonicadas em um balão de fundo redondo de 500 mL por 10 min. PMCP (10 mg) foi dissolvido em tolueno e adicionado gota a gota ao balão de reação através de um funil de adição. A mistura foi refluxada a 100 °C por 8 horas, filtrada, lavada com acetona e seca a 60 °C por 3 horas. Em seguida, partículas de sílica ligadas ao PMCP (100 g) foram dissolvidas em tolueno (200 mL) e 4-hidroxi-TEMPO (2 mL) foi adicionado na presença de 100 µL de dilaurato de dibutilestanho como catalisador. A mistura foi agitada a 50 °C por 8 horas, filtrada e seca a 50 °C por 3 horas.
Estireno (1 mL), peróxido de benzoíla (BPO) (0,5 mL) e partículas de sílica com TEMPO-PMCP (1,5 g) foram dispersos em tolueno e purgados com nitrogênio. A polimerização do estireno foi realizada a 100 °C por 12 horas. O produto resultante foi lavado com metanol e seco a 60 °C durante a noite. O esquema geral da reação é mostrado na Figura 1.
As amostras foram desgaseificadas a 393 K durante 1 hora para obter uma pressão residual inferior a 10⁻³ Torr. A quantidade de N₂ adsorvida a uma pressão relativa de P/P₀ = 0,99 foi utilizada para determinar o volume total de poros. A morfologia das partículas de sílica nuas e ligadas a ligantes foi examinada por microscopia eletrônica de varredura (MEV) (Hitachi High Technologies, Tóquio, Japão). As amostras secas (partículas de sílica nua e sílica ligadas a ligantes) foram colocadas em uma coluna de alumínio utilizando fita adesiva de carbono. O ouro foi depositado sobre as amostras utilizando um metalizador por pulverização catódica Q150T, resultando em uma camada de 5 nm de Au. Isso melhora a eficiência do processo utilizando baixas voltagens e proporciona uma deposição por pulverização catódica a frio com grãos finos. Um analisador elementar Flash EA1112 da Thermo Electron (Waltham, MA, EUA) foi utilizado para a análise elementar. Um analisador de tamanho de partículas Mastersizer 2000 da Malvern (Worcestershire, Reino Unido) foi utilizado para obter a distribuição do tamanho das partículas. Sílica nua Partículas e partículas de sílica ligadas a ligantes (5 mg cada) foram dispersas em 5 mL de isopropanol, sonicadas por 10 min, agitadas em vórtex por 5 min e colocadas na bancada óptica do Mastersizer. A análise termogravimétrica foi realizada a uma taxa de 5 °C por minuto em uma faixa de temperatura de 30 a 800 °C.
Colunas de aço inoxidável revestidas de vidro com diâmetro interno estreito (100 × 1,8 mm) foram preenchidas usando o método de empacotamento de pasta, aplicando o mesmo procedimento usado na Ref. 31. Uma coluna de aço inoxidável (revestida de vidro, 100 × 1,8 mm de diâmetro interno) com uma conexão de saída contendo uma frita de 1 µm foi conectada a um empacotador de suspensão (Alltech, Deerfield, IL, EUA). Prepare uma suspensão da fase estacionária suspendendo 150 mg da fase estacionária em 1,2 mL de metanol e envie-a para a coluna de armazenamento. O metanol foi usado como solvente da suspensão, bem como solvente propulsor. Preencha a coluna sequencialmente aplicando pressões de 100 MPa por 10 minutos, 80 MPa por 15 minutos e 60 MPa por 30 minutos. Durante o empacotamento, vibração mecânica foi aplicada com dois agitadores de coluna GC (Alltech, Deerfield, IL, EUA) para garantir o empacotamento uniforme da coluna. Feche o empacotador de suspensão e libere a pressão lentamente para evitar danos à coluna. Desconecte a coluna da unidade de empacotamento de suspensão e conecte outra conexão à entrada e à saída. o sistema LC para verificar seu desempenho.
Uma bomba LC (10AD Shimadzu, Japão), um injetor (Valco (EUA) C14 W.05) com alça de injeção de 50 nL, um desgaseificador de membrana (Shimadzu DGU-14A), uma janela capilar UV-VIS e um detector de micro-ondas (UV-2075) foram utilizados. Tubos de conexão muito estreitos e curtos foram usados ​​para minimizar o efeito de alargamento de banda extracoluna. Após a montagem, capilares (50 μm de diâmetro interno) e capilares de união redutora (50 μm) foram instalados na saída de 1/16″ da união redutora. A coleta de dados e o processamento cromatográfico foram realizados utilizando o software Multichro 2000. O monitoramento foi feito a 254 nm. Os analitos foram testados por absorbância UV. Os dados cromatográficos foram analisados ​​pelo OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina de soro humano, pó liofilizado, ≥ 96% (eletroforese em gel de agarose) 3 mg misturados com tripsina (1,5 mg), ureia 4,0 M (1 mL) e bicarbonato de amônio 0,2 M (1 mL). A solução foi agitada por 10 minutos e mantida em banho-maria a 37 °C por 6 horas, sendo então neutralizada com 1 mL de TFA 0,1%. A solução foi filtrada e armazenada abaixo de 4 °C.
A separação de misturas de peptídeos e digestões tripsínicas de HSA foi avaliada separadamente em colunas PMP. Verifique a separação da mistura de peptídeos e da digestão tripsínica de HSA pela coluna PMP e compare os resultados com a coluna Ascentis Express RP-Amide. O número de pratos teóricos é calculado da seguinte forma:
As imagens de MEV (Microscopia Eletrônica de Varredura) de partículas de sílica sem revestimento e de partículas de sílica com ligantes são mostradas na FIG. 2. As imagens de MEV das partículas de sílica sem revestimento (A, B) mostram que, ao contrário de nossos estudos anteriores, essas partículas são esféricas, alongadas ou apresentam simetria irregular. A superfície das partículas de sílica com ligantes (C, D) é mais lisa do que a das partículas de sílica sem revestimento, o que pode ser devido ao revestimento de cadeias de poliestireno na superfície das partículas de sílica.
Imagens de microscopia eletrônica de varredura de partículas de sílica sem ligantes (A, B) e partículas de sílica ligadas a ligantes (C, D).
As distribuições de tamanho de partícula das partículas de sílica sem ligantes e das partículas de sílica ligadas a ligantes são mostradas na Figura 3(A). As curvas de distribuição de tamanho de partícula baseadas no volume mostraram que o tamanho das partículas de sílica aumentou após a modificação química (Fig. 3A). Os dados de distribuição de tamanho de partícula das partículas de sílica deste estudo e do estudo anterior são comparados na Tabela 1(A). O tamanho de partícula baseado no volume, d(0,5), do PMP é de 3,36 μm, comparado ao nosso estudo anterior com valor de ad(0,5) de 3,05 μm (partículas de sílica ligadas a poliestireno)34. Este lote apresentou uma distribuição de tamanho de partícula mais estreita em comparação com o nosso estudo anterior devido às diferentes proporções de PEG, ureia, TMOS e ácido acético na mistura de reação. O tamanho de partícula da fase PMP é ligeiramente maior do que o da fase de partículas de sílica ligadas a poliestireno que estudamos anteriormente. Isso significa que a funcionalização da superfície das partículas de sílica com estireno depositou apenas uma camada de poliestireno (0,97 µm). na superfície da sílica, enquanto na fase PMP a espessura da camada era de 1,38 µm.
Distribuição do tamanho das partículas (A) e distribuição do tamanho dos poros (B) de partículas de sílica puras e partículas de sílica ligadas a ligantes.
O tamanho dos poros, o volume dos poros e a área superficial das partículas de sílica deste estudo são apresentados na Tabela 1(B). Os perfis de distribuição do tamanho dos poros (PSD) das partículas de sílica sem ligantes e das partículas de sílica com ligantes são mostrados na Figura 3(B). Os resultados são comparáveis ​​aos do nosso estudo anterior. Os tamanhos dos poros das partículas de sílica sem ligantes e com ligantes são 310 e 241, respectivamente, o que indica que o tamanho dos poros diminui em 69 após a modificação química, conforme mostrado na Tabela 1(B), e a mudança na curva é mostrada na Figura 3(B). Da mesma forma, o volume dos poros das partículas de sílica diminuiu de 0,67 para 0,58 cm³/g após a modificação química. A área superficial específica das partículas de sílica estudadas neste estudo é de 116 m²/g, o que é comparável ao nosso estudo anterior (124 m²/g). Como mostrado na Tabela 1(B), a área superficial (m²/g) das partículas de sílica também diminuiu de 116 m²/g para 105 m²/g após a modificação química. modificação química.
Os resultados da análise elementar da fase estacionária são mostrados na Tabela 2. A carga de carbono da fase estacionária atual é de 6,35%, inferior à carga de carbono do nosso estudo anterior (partículas de sílica ligadas a poliestireno, 7,93%35 e 10,21%, respectivamente)42. A baixa carga de carbono da fase estacionária atual se deve ao fato de que, na preparação da SP atual, além do estireno, foram utilizados alguns ligantes polares, como fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP) e 4-hidroxi-TEMPO. A porcentagem em massa de nitrogênio da fase estacionária atual é de 2,21%, em comparação com 0,1735% e 0,85% em massa de nitrogênio em estudos anteriores, respectivamente. Isso significa que a porcentagem em massa de nitrogênio é maior na fase estacionária atual devido à presença de fenilmaleimida. Da mesma forma, as cargas de carbono dos produtos (4) e (5) foram de 2,7% e 2,9%, respectivamente, enquanto a A carga de carbono do produto final (6) foi de 6,35%, conforme mostrado na Tabela 2. A perda de peso foi verificada com a fase estacionária PMP e a curva TGA é mostrada na Figura 4. A curva TGA mostra uma perda de peso de 8,6%, o que está em boa concordância com a carga de carbono (6,35%) porque os ligantes contêm não apenas C, mas também N, O e H.
O ligante fenilmaleimida-metilvinilisocianato foi escolhido para a modificação da superfície de partículas de sílica por possuir grupos polares fenilmaleimida e vinilisocianato. Os grupos vinilisocianato podem reagir com o estireno por meio de polimerização radicalar controlada. A segunda razão é a inserção de um grupo que apresente interação moderada com o analito e não exerça forte interação eletrostática entre o analito e a fase estacionária, visto que a porção fenilmaleimida não possui carga virtual em pH normal. A polaridade da fase estacionária pode ser controlada pela quantidade ideal de estireno e pelo tempo de reação da polimerização radicalar. A última etapa da reação (polimerização radicalar) é crítica e pode alterar a polaridade da fase estacionária. A análise elementar foi realizada para verificar a carga de carbono dessas fases estacionárias. Observou-se que o aumento da quantidade de estireno e do tempo de reação aumentou a carga de carbono da fase estacionária e vice-versa. As fases estacionárias preparadas com diferentes concentrações de estireno apresentaram diferentes cargas de carbono. Novamente, a carga dessas fases estacionárias... fases em colunas de aço inoxidável e verificar seu desempenho cromatográfico (seletividade, resolução, valor N, etc.). Com base nesses experimentos, uma formulação otimizada foi selecionada para preparar a fase estacionária PMP, garantindo polaridade controlada e boa retenção do analito.
Cinco misturas de peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) também foram avaliadas usando uma coluna PMP com uma fase móvel; 60/40 (v/v) acetonitrila/água (0,1% TFA) a uma vazão de 80 μL/min. Sob condições ótimas de eluição, o número de pratos teóricos (N) por coluna (100 × 1,8 mm d.i.) é de 20.000 ± 100 (200.000 pratos/m²). A Tabela 3 apresenta os valores de N para as três colunas PMP e os cromatogramas são mostrados na Figura 5A. Na análise rápida em uma coluna PMP com alta vazão (700 μL/min), cinco peptídeos foram eluídos em um minuto, os valores de N foram muito bons, 13.500 ± 330 por coluna (100 × 1,8 mm d.i.), o que corresponde a 135.000 pratos/m² (Figura 5B). Três colunas de tamanho idêntico (100 × 1,8 mm) As colunas foram preenchidas com três lotes diferentes de fase estacionária PMP para verificar a reprodutibilidade. A concentração do analito em cada coluna foi registrada utilizando as condições de eluição otimizadas, o número de pratos teóricos (N) e o tempo de retenção para separar a mesma mistura de teste em cada coluna. Os dados de reprodutibilidade para as colunas PMP são apresentados na Tabela 4. A reprodutibilidade da coluna PMP apresenta boa correlação com valores de %RSD muito baixos, conforme mostrado na Tabela 3.
Separação da mistura de peptídeos em coluna PMP (B) e coluna Ascentis Express RP-Amide (A); fase móvel 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensões da coluna PMP (100 × 1,8 mm d.i.); analítica. A ordem de eluição dos compostos foi: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) e 5 (leucina) (encefalina ácida).
Uma coluna PMP (100 × 1,8 mm d.i.) foi avaliada para a separação de digestos trípticos de albumina sérica humana em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O cromatograma na Figura 6 mostra que a amostra está bem separada e a resolução é muito boa. Os digestos de HSA foram analisados ​​usando uma vazão de 100 µL/min, fase móvel composta por 70/30 acetonitrila/água e 0,1% de TFA. Como mostrado no cromatograma (Figura 6), a digestão da HSA foi separada em 17 picos correspondentes a 17 peptídeos. A eficiência de separação de cada pico no digesto de HSA foi calculada e os valores são apresentados na Tabela 5.
Um digerido tríptico de HSA (100 × 1,8 mm d.i.) foi separado em uma coluna PMP; vazão (100 µL/min), fase móvel 60/40 acetonitrila/água com 0,1% de TFA.
onde L é o comprimento da coluna, η é a viscosidade da fase móvel, ΔP é a contrapressão da coluna e u é a velocidade linear da fase móvel. A permeabilidade da coluna PMP foi de 2,5 × 10⁻¹⁴ m², a vazão foi de 25 μL/min e utilizou-se uma mistura de ACN/água na proporção de 60/40 v/v. A permeabilidade da coluna PMP (100 × 1,8 mm d.i.) foi semelhante à do nosso estudo anterior (Ref. 34). A permeabilidade da coluna preenchida com partículas superficialmente porosas é: 1,7 × 10⁻¹⁵ para partículas de 1,3 μm, 3,1 × 10⁻¹⁵ para partículas de 1,7 μm, 5,2 × 10⁻¹⁵ e 2,5 × 10⁻¹⁴ m² para partículas de 2,6 μm. Para partículas de 5 μm 43. Portanto, a permeabilidade da fase PMP é semelhante à das partículas núcleo-casca de 5 μm.
onde Wx é o peso da coluna preenchida com clorofórmio, Wy é o peso da coluna preenchida com metanol e ρ é a densidade do solvente. Densidades do metanol (ρ = 0,7866) e do clorofórmio (ρ = 1,484). A porosidade total das colunas de PARTÍCULAS DE SÍLICA-C18 (100 × 1,8 mm d.i.) 34 e das colunas de C18-Ureia 31 que estudamos anteriormente foi de 0,63 e 0,55, respectivamente. Isso significa que a presença de ligantes de ureia reduz a permeabilidade da fase estacionária. Por outro lado, a porosidade total da coluna PMP (100 × 1,8 mm d.i.) é de 0,60. A permeabilidade das colunas PMP é menor do que a das colunas preenchidas com partículas de sílica ligadas a C18 porque, nas fases estacionárias do tipo C18, os ligantes C18 estão ligados às partículas de sílica como filamentos lineares. cadeias, enquanto em fases estacionárias do tipo poliestireno, uma camada de polímero relativamente espessa se forma ao seu redor. Em um experimento típico, a porosidade da coluna é calculada como:
As figuras 7A e B mostram a coluna PMP (100 × 1,8 mm d.i.) e a coluna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm d.i.) usando as mesmas condições de eluição (ou seja, 60/40 ACN/H2O e 0,1% TFA). ) do gráfico de van Deemter. Misturas selecionadas de peptídeos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) foram preparadas em 20 µL/min. A vazão mínima para ambas as colunas é de 800 µL/min. Os valores mínimos de HETP na vazão ótima (80 µL/min) para a coluna PMP e a coluna Ascentis Express RP-Amide foram de 2,6 µm e 3,9 µm, respectivamente. Os valores de HETP indicam que a eficiência de separação da coluna PMP (100 × 1,8 mm d.i.) é muito melhor do que a da coluna comercial Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm d.i.). O gráfico de van Deemter na Figura 7(A) mostra que a diminuição no valor de N com o aumento da vazão não é significativa em comparação com nossos resultados anteriores. estudo.A maior eficiência de separação da coluna PMP (100 × 1,8 mm id) em comparação com a coluna Ascentis Express RP-Amide é baseada em melhorias na forma, tamanho e procedimentos complexos de empacotamento da coluna usados ​​no presente trabalho34.
(A) Gráfico de van Deemter (HETP versus velocidade linear da fase móvel) obtido usando uma coluna PMP (100 × 1,8 mm d.i.) em ACN/H2O 60/40 com 0,1% de TFA. (B) Gráfico de van Deemter (HETP versus velocidade linear da fase móvel) obtido usando uma coluna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm d.i.) em ACN/H2O 60/40 com 0,1% de TFA.
Uma fase estacionária de poliestireno com grupos polares incorporados foi preparada e avaliada para a separação de misturas de peptídeos sintéticos e digestões tripsínicas de albumina sérica humana (HAS) em cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE). O desempenho cromatográfico das colunas de poliestireno com grupos polares incorporados para misturas de peptídeos é excelente em termos de eficiência de separação e resolução. O desempenho de separação aprimorado das colunas de poliestireno com grupos polares incorporados deve-se a uma variedade de fatores, como o tamanho das partículas e o tamanho dos poros das partículas de sílica, a síntese controlada da fase estacionária e o empacotamento complexo da coluna. Além da alta eficiência de separação, a baixa contrapressão da coluna em altas taxas de fluxo é outra vantagem dessa fase estacionária. As colunas de poliestireno com grupos polares incorporados apresentam boa reprodutibilidade e podem ser usadas para a análise de misturas de peptídeos e digestão tripsínica de várias proteínas. Pretendemos usar essa coluna para a separação de produtos naturais, compostos bioativos de plantas medicinais e extratos fúngicos em cromatografia líquida. No futuro, as colunas de poliestireno com grupos polares incorporados também serão avaliadas para a separação de proteínas e anticorpos monoclonais.
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