Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasi CSS-ni cheklangan darajada qo‘llab-quvvatlaydi. Eng yaxshi tajriba uchun yangilangan brauzerdan foydalanishni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o‘chirib qo‘ying). Ayni paytda qo‘llab-quvvatlashning davom etishini ta’minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScript-larsiz ko‘rsatamiz.
G'ovakli kremniy zarralari makrog'ovak zarrachalarni olish uchun ba'zi o'zgartirishlar bilan sol-gel usuli bilan tayyorlangan. Bu zarralar N-fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PMI) va stirol bilan teskari qo'shilish bo'linish zanjiri o'tkazish (RAFT) polimerizatsiyasi orqali N-fenilmaleimid (MPP polipropilen) interkalatsiyasini tayyorlash uchun olingan. faza.Tor teshikli zanglamas po'latdan yasalgan ustunlar (100 × 1,8 mm id) atala qadoqlash bilan qadoqlangan. Besh peptiddan (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ileucle-Argly, Tyr-Sleu-Arg) tashkil topgan peptid aralashmasining PMP ustunini ajratish baholandi. xromatografik ko'rsatkichlar) va inson sarum albuminining (HAS) tripsin hazm bo'lishi. Optimal elutsiya sharoitida peptid aralashmasining nazariy plastinka soni 280 000 plastinka / m² ni tashkil qiladi. Ishlab chiqilgan ustunning ajratish ko'rsatkichlarini tijorat Ascentis Express RP-Amide ustuni bilan solishtirganda, PMP ustunining tijoriy ko'rsatkichlari va ajratish ustunining yuqori samaradorligi ekanligi kuzatildi. rezolyutsiya.
So'nggi yillarda biofarmatsevtika sanoati bozor ulushi sezilarli darajada ortib borayotgan global bozorga aylandi.Biofarmatsevtika sanoatining portlovchi o'sishi1,2,3 bilan peptidlar va oqsillarni tahlil qilish juda istaydi.Maqsadli peptidga qo'shimcha ravishda, peptid sintezi jarayonida bir nechta aralashmalar hosil bo'ladi, shuning uchun peptidlarning xromatografik istaklarini olishni talab qiladi. tozalik.Tana suyuqliklari, to'qimalari va hujayralaridagi oqsillarni tahlil qilish va tavsiflash bitta namunada potentsial aniqlanishi mumkin bo'lgan turlarning ko'pligi tufayli juda qiyin vazifadir. Mass-spektrometriya peptidlar va oqsillarni ketma-ketligini aniqlash uchun samarali vosita bo'lsa-da, agar bunday namunalar massa spektrometriga bir marta yuborilsa, uni ajratish muammosi suyuqlikni LC xromatografiyasi yordamida ideal bo'lishi mumkin emas. MS tahlilidan oldingi ajralishlar, bu ma'lum bir vaqtda massa spektrometriga kiruvchi analitlar sonini kamaytiradi4,5,6.Bundan tashqari, suyuqlik fazalarini ajratishda analitlar tor hududlarga yo'naltirilishi mumkin, shu bilan analitlar konsentratsiyalanadi va MSni aniqlash sezuvchanligi yaxshilanadi.Suyuqlik xromatografiyasi (LC) o'n yillikda sezilarli darajada rivojlangan va o'tgan davr mobaynida mashhur bo'lgan texnikaga aylandi. tahlil qilish7,8,9,10.
Teskari fazali suyuqlik xromatografiyasi (RP-LC) statsionar faza sifatida oktadesil modifikatsiyalangan kremniy dioksidi (ODS) yordamida peptid aralashmalarini tozalash va ajratish uchun keng qo'llaniladi11,12,13. Biroq, RP statsionar fazalari ularning murakkab tuzilishi va amfilik tabiati14 uchun peptidlar va oqsillarni qoniqarli ajratishni ta'minlamaydi. Ushbu analitlar bilan o'zaro ta'sir qilish va ularni ushlab turish uchun qutbli va qutb bo'lmagan qismlarga ega peptidlar va oqsillarni tahlil qilish uchun maxsus mo'ljallangan statsionar fazalar talab qilinadi16. Multimodal o'zaro ta'sirlarni ta'minlovchi aralash rejimli xromatografiya peptidlar, oqsillar va boshqa murakkab aralashmalarni ajratish uchun RP-LC ga alternativa bo'lishi mumkin. peptid va oqsillarni ajratish uchun ishlatilgan17,18,19,20,21.Aralash rejimli statsionar fazalar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, qutbli interkalatsiya/RPLC) ham qutbli, ham qutbsiz guruhlarning mavjudligi sababli peptid va oqsillarni ajratish uchun mos keladi22,23,24,275,228, stansiyalararo, polar 28. kovalent bog'langan qutbli guruhlarga ega bo'lgan fazalar qutbli va qutbsiz analitlar uchun yaxshi ajratish kuchi va noyob selektivlikni ko'rsatadi, chunki ajratish analit va statsionar faza o'rtasidagi o'zaro ta'sirga bog'liq. Multimodal shovqinlar 29, 30, 31, 32.Yaqinda Zhang va boshqalar. 30 dodesil bilan yakunlangan poliamin statsionar fazasini tayyorladi va uglevodorodlar, antidepressantlar, flavonoidlar, nukleozidlar, estrogenlar va boshqa bir qancha tahliliy moddalarni muvaffaqiyatli ajratdi. Polar interkalator ham qutbli, ham qutbsiz guruhlarga ega, shuning uchun ham gidrofobik, ham gidropofilik kolonnalarga ega bo'lgan peptidlar va oqsillarni ajratish uchun foydalanish mumkin. amid o'rnatilgan C18 ustunlari) Ascentis Express RP-Amide ustunlari savdo nomi ostida mavjud, ammo bu ustunlar faqat amin 33 tahlili uchun ishlatiladi.
Joriy tadqiqotda HSA ning peptidlari va tripsin hazm qilishlarini ajratish uchun qutbga o'rnatilgan statsionar faza (N-fenilmaleimid o'rnatilgan polistirol) tayyorlandi va baholandi. Statsionar faza quyidagi strategiyadan foydalangan holda tayyorlandi. Gözenekli silika zarralari oldingi nashrimizda keltirilgan protsedura bo'yicha tayyorlangan. glikol (PEG), TMOS, suv sirka kislotasi katta gözenekli kremniy zarralarini tayyorlash uchun o'rnatildi. Ikkinchidan, yangi ligand, fenilmaleimid-metil vinil izosiyanat sintez qilindi va polar o'rnatilgan statsionar fazani tayyorlash uchun silika zarralarini hosil qilish uchun foydalanildi. 1,8 mm id) optimallashtirilgan qadoqlash sxemasidan foydalangan holda. Ustun ichida bir hil to'shak hosil bo'lishini ta'minlash uchun ustun o'rash mexanik tebranish bilan yordam beradi. Beshta peptiddan iborat peptid aralashmalarining qadoqlangan ustunlar bo'linishini baholang; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) va tripsin hazm qilish inson zardobi albumini (HAS). Peptid aralashmasi va HSA tripsin hazm qilish yaxshi rezolyutsiya bilan ajralib turishi kuzatildi. RP-Amid ustuni. Ascentis Express RP-Amide ustunidan ko'ra samaraliroq bo'lgan PMP ustunida peptidlar va oqsillar yaxshi ajralishi va samarali ekanligi kuzatildi.
PEG (polietilen glikol), karbamid, sirka kislotasi, trimetoksi ortosilikat (TMOS), trimetilxlorosilan (TMCS), tripsin, inson zardobidagi albumin (HSA), ammoniy xlorid, karbamid, geksan metildisilazan (HMDS), metakriol (xlorid), 4-Hidroksi-TEMPO, Benzoil peroksid (BPO), HPLC darajasidagi asetonitril (ACN), metanol, 2-propanol va aseton Sigma-Aldrichdan (Sent-Luis, MO, AQSh) sotib olingan.
Karbamid (8 g), polietilen glikol (8 g) va 8 ml 0,01 n sirka kislotasi aralashmasi 10 daqiqa davomida aralashtiriladi, so'ngra muzdek sovuq sharoitda unga 24 ml TMOS qo'shiladi. Reaksiya aralashmasi 40 ° C da 6 soat davomida isitiladi va keyin 120 ° C suvsiz po'latda 8 soat davomida saqlanadi. to'kilgan va qoldiq material 12 soat davomida 70 ° C da quritilgan. Quritilgan yumshoq massa pechda silliq maydalangan va 12 soat davomida 550 ° C da kalsinlangan. Zarrachalar hajmi, gözenek hajmi va sirt maydoni bo'yicha takrorlanuvchanlikni tekshirish uchun uchta partiya tayyorlangan va tavsiflangan.
Oldindan sintez qilingan ligand fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PCMP) bilan kremniy zarralarini sirt modifikatsiyasi, so'ngra stirol bilan radial polimerizatsiya orqali qutbli guruhni o'z ichiga olgan birikma tayyorlandi. Agregatlar va polistirolli zanjirlar uchun statsionar bosqich.Tayyorlash jarayoni quyida tavsiflanadi.
N-fenilmaleimid (200 mg) va metil vinil izosiyanat (100 mg) quruq toluolda eritildi va 0,1 ml 2,2'-azoizobutironitril (AIBN) fenilmaleimid-metil vinil-polimer bilan aralashtirib tayyorlash uchun reaksiya kolbasiga qo'shildi. 3 soat davomida 60 ° C, filtrlanadi va pechda 3 soat davomida 40 ° C da quritiladi.
Quritilgan silika zarralari (2 g) quruq toluolda (100 ml) tarqaldi, aralashtirildi va 500 ml dumaloq tubi kolbada 10 daqiqa davomida sonikatsiya qilindi. PMCP (10 mg) toluolda eritildi va tomchilatib yuboriladigan voronka orqali reaksiya kolbasiga qo'shildi. Aralashma 1 soat davomida yuvilib, filtrlangan va filtrlangan. aseton va 60°C da 3 soat davomida quritiladi. Keyin PMCP bilan bog'langan silika zarralari (100 g) toluolda (200 ml) eritildi va 4-gidroksi-TEMPO (2 ml) 100 mkl dibutiltin dilaurat ishtirokida qo'shildi, aralashma 5 ° C da katalizator sifatida filtrlanadi. va 50°C da 3 soat davomida quritiladi.
Stirol (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) va TEMPO-PMCP bilan biriktirilgan silika zarralari (1,5 g) toluolda tarqaldi va azot bilan tozalandi. Stirolning polimerizatsiyasi 100 ° C da 12 soat davomida amalga oshirildi. Olingan mahsulot kechasi bilan yuvildi. umumiy reaksiya sxemasi 1-rasmda ko'rsatilgan.
Namunalar 10-3 Torr dan kam qoldiq bosimni olish uchun 1 soat davomida 393 K haroratda degazatsiya qilindi. P/P0 = 0,99 nisbiy bosimda adsorbsiyalangan N2 miqdori umumiy gözenek hajmini aniqlash uchun ishlatilgan. Yalang'och va ligand-bog'langan kremniy zarralarining morfologiyasi yuqori mikrotexnika, elektrotexnika tekshiruvi bilan tekshirildi. Tokio, Yaponiya). Quritilgan namunalar (yalang'och kremniy va ligand bilan bog'langan kremniy zarralari) yopishqoq uglerod lentasi yordamida alyuminiy ustunga joylashtirildi. Q150T purkagich yordamida namunalar ustiga oltin qo'yildi va namunalar ustiga 5 nm Au qatlami yotqizildi. Bu past kuchlanishdan foydalangan holda jarayon samaradorligini oshiradi. (Waltham, MA, AQSH) Elementar tahlil uchun Flash EA1112 element analizatoridan foydalanildi. Zarrachalar hajmi taqsimotini olish uchun Malvern (Worcestershire, Buyuk Britaniya) Mastersizer 2000 zarracha oʻlchami analizatoridan foydalanildi. Yalangʻoch silika zarralari va ligand bilan bogʻlangan kremniy zarralari (har biri 5 mg) 10000 dan 1000 ml dan 100 ml gacha boʻlgan zarrachalar miqdorida disperslangan. 5 daqiqa davomida vortekslangan va Mastersizerning optik dastgohiga joylashtirilgan. Termogravimetrik tahlil 30 dan 800 ° C gacha bo'lgan harorat oralig'ida daqiqada 5 ° C tezlikda amalga oshirildi.
Shisha bilan qoplangan zanglamaydigan po'latdan yasalgan o'lchamdagi tor teshikli ustunlar (100 × 1,8 mm id) atala qadoqlash usulidan foydalangan holda, Ref. 31. Zanglamaydigan po'latdan yasalgan ustun (shisha bilan qoplangan, 100 × 1,8 mm id) o'z ichiga 1 mkm fritni o'z ichiga olgan chiqish moslamasiga ulangan (Alltech Deerfield, IL, AQSH). 150 mg statsionar fazaga met.2 saqlash uchun statsionar fazali atala tayyorlang. kolonna. Metanol atala erituvchisi, shuningdek harakatlantiruvchi erituvchi sifatida ishlatilgan. 10 daqiqa davomida 100 MP, 15 daqiqa davomida 80 MP va 30 daqiqa davomida 60 MP bosim qo'llash orqali ustunni ketma-ket to'ldiring. Qadoqlash paytida ikkita GC ustunli silkitgich, Defields, Defieldsformni ta'minlash uchun mexanik tebranish qo'llanildi. ustun.Ajlama pakerni yoping va ustun ichidagi har qanday zararni oldini olish uchun bosimni sekin bo'shatib qo'ying. Ustunni atala qadoqlash moslamasidan ajratib oling va uning ishlashini tekshirish uchun kirish va LC tizimiga boshqa fittingni ulang.
LC nasosi (10AD Shimadzu, Yaponiya), injektor (Valco (AQSh) C14 W.05), 50 nL in'ektsiya halqasi, membrana degasser (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapillyar oynasi maxsus mLC qurilmasi detektori (UV-2075) va shishani juda qisqa tutashtirish uchun mo'ljallangan. Qo'shimcha ustunlar diapazoni kengayishining ta'siri. Qadoqlashdan so'ng kapillyarlar (50 mkm id 365 va reduksiya qiluvchi kapillyarlar (50 mkm) qisqartiruvchi birlashmaning 1/16" chiqish joyiga o'rnatildi. Ma'lumotlarni to'plash va xromatografik ishlov berish Multichro 2000 dasturi yordamida amalga oshirildi. Uskunaning so'rilishi uchun Anaxromm5 testi sinovidan o'tkazildi. ma'lumotlar OriginPro8 (Northampton, MA) tomonidan tahlil qilindi.
Inson zardobidan albumin, liyofillangan kukun, ≥ 96% (agaroz jeli elektroforezi) 3 mg tripsin (1,5 mg), 4,0 M karbamid (1 ml) va 0,2 M ammoniy bikarbonat (1 ml) bilan aralashtiriladi. Eritma 10 daqiqa davomida aralashtiriladi va keyin 7 ° C da suv hammomida 7 soat davomida 3 soat davomida saqlanadi. ml 0,1% TFA. Eritmani filtrlang va 4 °C dan past haroratda saqlang.
Peptid aralashmalari va HSA tripsin hazm qilishlari PMP ustunlarida alohida baholandi.PMP ustuni orqali HSA ning peptid aralashmasi va tripsin hazm bo‘lishini tekshiring va natijalarni Ascentis Express RP-Amide ustuni bilan solishtiring.Nazariy plastinka raqami quyidagicha hisoblanadi:
Yalang'och kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan silika zarralarining SEM tasvirlari shaklda ko'rsatilgan. 2 .Yalang'och kremniy zarralarining (A, B) SEM tasvirlari, avvalgi tadqiqotlarimizdan farqli o'laroq, bu zarrachalar sharsimon bo'lib, ularda zarralar cho'zilgan yoki tartibsiz simmetriyaga ega. silika zarralari yuzasi.
Yalang'och kremniy zarralari (A, B) va ligand bilan bog'langan silika zarralari (C, D) ning skanerlash elektron mikroskop tasvirlari.
Yalang'och kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan silika zarralarining zarracha o'lchami taqsimoti 3-rasmda ko'rsatilgan (A). Hajmiga asoslangan zarracha hajmi taqsimoti egri chizig'i kimyoviy modifikatsiyadan keyin silika zarralarining o'lchami ortganligini ko'rsatdi (3A-rasm). Hozirgi tadqiqotdan olingan kremniy zarralarining zarracha o'lchami taqsimoti ma'lumotlari va oldingi ish hajmi T-da taqqoslangan. d(0,5), PMP 3,36 mkm, ad(0,5) qiymati 3,05 mkm (polistirol bilan bog'langan kremniy zarralari) 34. Bu partiya PEG, karbamid, TMOS ning o'zgaruvchan nisbati tufayli zarracha hajmining taqsimlanishi torroq edi. Biz avval o‘rgangan polistirol bilan bog‘langan kremniy zarralari fazasidan kattaroqdir. Bu shuni anglatadiki, kremniy zarralarining stirol bilan sirt funksionallashuvi faqat kremniy yuzasida polistirol qatlamini (0,97 mkm) yotqizgan, PMP bosqichida qatlam qalinligi 1,38 mkm.
Yalang'och kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan silika zarralarining zarracha o'lchami taqsimoti (A) va gözenek hajmi taqsimoti (B).
Joriy tadqiqotning g'ovak o'lchami, g'ovak hajmi va kremniy zarrachalarining sirt maydoni 1-jadval (B) da keltirilgan. Yalang'och kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan silika zarralarining PSD profillari 3 (B) shaklda ko'rsatilgan. Natijalar bizning oldingi tadqiqotimiz bilan solishtirish mumkin. Yalang'och va ligand-bog'langan silika zarralarining g'ovak o'lchamlari 312 va 1(B)-jadvalda ko'rsatilganidek, kimyoviy modifikatsiyadan keyin g'ovak hajmi 69 ga qisqarishini ko'rsatadi va egri chiziqning o'zgarishi 3(B)-rasmda ko'rsatilgan. Xuddi shunday, kimyoviy modifikatsiyadan keyin kremniy zarralarining g'ovak hajmi 0,67 dan 0,58 sm3/g gacha kamaydi. m2/g, bu bizning oldingi tadqiqotimiz bilan solishtirish mumkin (124 m2/g). 1(B)-jadvalda ko'rsatilganidek, kimyoviy modifikatsiyadan keyin silika zarralarining sirt maydoni (m2/g) ham 116 m2/g dan 105 m2/g gacha kamaydi.
Statsionar fazaning elementar tahlil natijalari 2-jadvalda keltirilgan. Joriy statsionar fazaning uglerod yuklanishi 6,35% ni tashkil etadi, bu bizning oldingi tadqiqotimizdagi uglerod yuklanishidan past (polistirol bilan bog'langan kremniy zarralari, mos ravishda 7,93%35 va 10,21%) 42. Chunki tok fazasining uglerod yuklanishi past. SP, stirolga qo'shimcha ravishda, fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PCMP) va 4-gidroksi-TEMPO kabi ba'zi qutbli ligandlar ishlatilgan. Joriy statsionar fazada azotning og'irligi 2,21% ni tashkil qiladi, avvalgi tadqiqotlarga qaraganda, 0,1735 va 0,85% ni tashkil qiladi. Hozirgi statsionar fazada azot fenilmaleimid hisobiga yuqoriroq boʻladi. Xuddi shunday, (4) va (5) mahsulotlarning uglerod yuklari mos ravishda 2,7% va 2,9% ni tashkil etdi, 2-jadvalda ko'rsatilganidek, yakuniy mahsulotning uglerod yuki (6) 6,35% ni tashkil etdi. Vazn yo'qotishi PGA 4-rasmda ko'rsatilgan. egri chiziq 8,6% vazn yo'qotishini ko'rsatadi, bu uglerod yuklanishiga (6,35%) yaxshi mos keladi, chunki ligandlar nafaqat C, balki N, O va H ni ham o'z ichiga oladi.
Fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat ligand kremniy zarralarining sirtini o'zgartirish uchun tanlangan, chunki u qutbli fenilmaleimid guruhlari va vinilizosiyanat guruhlariga ega. Vinil izosiyanat guruhlari tirik radikal polimerizatsiya orqali stirol bilan yanada reaksiyaga kirishadi. analit va statsionar faza, chunki fenilmaleimid qismi normal pHda virtual zaryadga ega emas. Statsionar fazaning qutbliligi stirolning optimal miqdori va erkin radikal polimerizatsiyaning reaktsiya vaqti bilan boshqarilishi mumkin. Reaksiyaning oxirgi bosqichi (erkin radikal polimerizatsiya) juda muhim va statsionar polariteni o'zgartirishi mumkin. stirol miqdori va reaksiya vaqtining ortishi statsionar fazaning uglerod yuklanishini va aksincha, stirolning turli konsentratsiyasi bilan tayyorlangan SPlar turli xil uglerod yuklariga ega ekanligini kuzatdi. Shunga qaramay, bu statsionar fazalarni zanglamaydigan po'latdan yasalgan ustunlarga yuklang va ularning xromatografik ishlashini tekshiring (selektivlik, rezolyutsiya, N qiymati va boshqalar). boshqariladigan qutblilik va analitni yaxshi ushlab turish.
Beshta peptid aralashmasi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leysin enkefalin) ham mobil faza yordamida PMP ustuni yordamida baholandi; 60/40 (v/v) asetonitril/suv (0,1% TFA) 80 mkL/min oqim tezligida. Optimal elutsiya sharoitida har bir ustun uchun nazariy plastinka raqami (N) (100 × 1,8 mm id) 20 000 ± 100 ni tashkil qiladi (200 000 P3/m²T uchun P 3 nm qiymatini beradi). ustunlar va xromatogrammalar 5A-rasmda ko'rsatilgan. PMP ustunida yuqori oqim tezligida (700 mkl/min) tezkor tahlil, bir daqiqa ichida besh peptid elutsiya qilindi, N qiymatlari juda yaxshi, har bir ustun uchun 13500 ± 330 (100 × 1,8 mm id), 5 Fi3ure ga to'g'ri keladi (0 01 g) 5B). Uchta bir xil o'lchamdagi ustunlar (100 × 1,8 mm id) takrorlanuvchanlikni tekshirish uchun PMP statsionar fazasining uch xil partiyasi bilan o'ralgan. Har bir ustun uchun tahlil qiluvchi moddaning kontsentratsiyasi optimal elutsiya shartlari va nazariy plitalar soni N va har bir ustunda bir xil sinov aralashmasini ajratish uchun ushlab turish vaqti yordamida qayd etilgan. PMP ustunining takrorlanishi 3-jadvalda ko'rsatilganidek, juda past %RSD qiymatlari bilan yaxshi bog'liq.
PMP ustunida (B) va Ascentis Express RP-Amid ustunida (A) peptid aralashmasini ajratish; mobil faza 60/40 ACN / H2O (TFA 0,1%), PMP ustun o'lchamlari (100 × 1,8 mm id); Analitik birikmalarning elutsiya tartibi: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) va 5 (leytsin) kislota enkefalin)).
PMP ustuni (100 × 1,8 mm identifikator) yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasida inson sarum albuminining triptik hazm bo'lishini ajratish uchun baholandi. 6-rasmdagi xromatogramma namuna yaxshi ajratilganligini va ruxsati juda yaxshi ekanligini ko'rsatadi. HSA hazm qilishlari 100 µL/suv va mobil faza 3 le/0ni, mobil faza 3 le/0 ni, oqim tezligi yordamida tahlil qilindi. 0,1% TFA. Xromatogrammada ko'rsatilganidek (6-rasm) HSA hazm qilish 17 peptidga mos keladigan 17 tepalikka bo'lingan. HSA hazm qilishdagi har bir tepalikning ajratish samaradorligi hisoblangan va qiymatlar 5-jadvalda keltirilgan.
HSA (100 × 1,8 mm id) ning triptik hazmi PMP ustunida ajratilgan; oqim tezligi (100 µL/min), mobil faza 60/40 asetonitril/suv 0,1% TFA.
Bu erda L - ustun uzunligi, ē - mobil fazaning yopishqoqligi, DP - ustunning orqa bosimi va u - harakatlanuvchi fazaning chiziqli tezligi. PMP ustunining o'tkazuvchanligi 2,5 × 10-14 m2, oqim tezligi 25 mkL/min, suvning 60/40 v/v AC0N uchun ishlatildi. 1,8 mm id) bizning oldingi tadqiqotimiz Ref.34 ga o'xshash edi. Yuzaki g'ovakli zarrachalar bilan o'ralgan ustunning o'tkazuvchanligi: 1,3 mkm zarralar uchun 1,7 × 10-15, 1,7 mkm zarralar uchun 3,1 × 10-15, 5,2 × 1 × 10-2 va 5,2 × 10 m2. 2,6 mkm zarrachalar 5 mkm zarralar uchun 43.Shuning uchun PMP fazasining o'tkazuvchanligi 5 mkm yadro qobig'i zarrachalariga o'xshaydi.
Bu erda Wx xloroform bilan o'ralgan ustunning og'irligi, Wy - metanol bilan o'ralgan ustunning og'irligi va r - erituvchining zichligi. Metanol (r = 0,7866) va xloroform (r = 1,484) zichligi. Jami g'ovakligi SILICA-18 mm × PAR101. id) Biz ilgari o'rgangan 34 va C18-karbamid ustunlari 31 mos ravishda 0,63 va 0,55 edi. Bu karbamid ligandlarining mavjudligi statsionar fazaning o'tkazuvchanligini pasaytiradi, degan ma'noni anglatadi. Boshqa tomondan, PMP ustunining umumiy g'ovakliligi (100 × 1,8) PMP ustunining id60 ga nisbatan pastligi. C18 bilan bog'langan silika zarralari bilan o'ralgan ustunlar soni, chunki C18 tipidagi statsionar fazalarda C18 ligandlari silika zarrachalariga chiziqli zanjirlar sifatida biriktirilgan bo'lsa, polistirol tipidagi statsionar fazalarda uning atrofida nisbatan qalin polimer qatlami hosil bo'ladi.Odatiy tajribada ustunlar g'ovakligi quyidagicha hisoblanadi:
7A, B-rasmda PMP ustuni (100 × 1,8 mm identifikator) va Ascentis Express RP-Amid ustuni (100 × 1,8 mm id) bir xil elutsiya shartlaridan (ya'ni, 60/40 ACN/H2O va 0,1% TFA) foydalangan holda ko'rsatilgan. ) Van Deemter uchastkasi. Tanlangan peptid aralashmalari (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 µL da tayyorlangan/ Ikkala ustun uchun minimal oqim tezligi 800 µL/min. ustuni va Ascentis Express RP-Amide ustuni mos ravishda 2,6 mkm va 3,9 mkm edi. HETP qiymatlari PMP ustunining (100 × 1,8 mm identifikator) ajratish samaradorligi sotuvda mavjud bo'lgan Ascentis Express RP-Amide ustunidan (100 × 1,8 mmA7 ko'rsatilgan) ancha yaxshi ekanligini ko'rsatadi. oqim ortib borishi bilan N qiymatining kamayishi bizning oldingi tadqiqotimiz bilan solishtirganda ahamiyatli emas.PMP ustunining (100 × 1,8 mm id) Ascentis Express RP-Amide ustuniga nisbatan yuqori ajratish samaradorligi joriy ishda qo'llaniladigan zarrachalar shakli, o'lchami va murakkab ustunlarni qadoqlash tartib-qoidalarini yaxshilashga asoslangan34.
(A) 0,1% TFA bilan 60/40 ACN/H2O da PMP ustuni (100 × 1,8 mm id) yordamida olingan van Deemter grafigi (HETP va mobil fazaning chiziqli tezligi). id) 0,1% TFA bilan 60/40 ACN/H2O da.
Yuqori samarali suyuq xromatografiyada inson sarum albuminining (HAS) sintetik peptid aralashmalari va tripsin hazm bo'lishi uchun qutbga o'rnatilgan polistirol statsionar faza tayyorlandi va baholandi. Peptid aralashmalari uchun PMP ustunlarining xromatografik ishlashi ajratish samaradorligi va rezolyutsiyasida juda yaxshi. silika zarralarining o'lchami, statsionar fazaning boshqariladigan sintezi va murakkab ustunli qadoqlash. Yuqori ajratish samaradorligiga qo'shimcha ravishda, yuqori oqim tezligida ustunning past teskari bosimi bu statsionar fazaning yana bir afzalligi hisoblanadi. PMP ustunlari yaxshi takrorlanish qobiliyatiga ega va peptid aralashmalarini tahlil qilish va turli xil oqsillarni tripsin hazm qilish uchun ishlatilishi mumkin. suyuq xromatografiyada dorivor o'simliklar va qo'ziqorin ekstraktlari.Kelajakda PMP ustunlari oqsillar va monoklonal antikorlarni ajratish uchun ham baholanadi.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Peptidlarni ajratish tizimlarini teskari fazali xromatografiya bo'yicha tadqiqotlar I qism: Ustunni xarakterlash protokolini ishlab chiqish.J. Xromatografiya.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. va boshqalar. Yuqumli kasalliklarni davolash uchun mo'ljallangan takomillashtirilgan faol peptidlar.Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetik terapevtik peptidlar: fan va bozor. dori kashfiyoti.15 (1-2) bugun, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2019 (10.2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J. Xromatografiya.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. va boshqalar. Kengaytirilgan suyuqlik xromatografiyasi-mass spektrometriyasi keng maqsadli metabolomikani va proteomikani kiritish imkonini beradi.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Dori vositalarini ishlab chiqishda UHPLC ning roli.J. Sent. Sci.30 (8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Tez ajratish uchun ultra yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasining asosiy va amaliy jihatlari.J. Sent. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelicheff, P. Preparatni ishlab chiqishda ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasini qo'llash.J. Xromatografiya.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. va boshqalar. Enteroviruslarni samarali tozalash uchun suvda yog'li yuqori ichki fazali emulsiyalardan tayyorlangan monolit makroporozli gidrogellar.Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020 yil).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Proteomikada suyuq xromatografiyaning roli.J. Xromatografiya.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlar va oqsillarni teskari fazali suyuqlik xromatografiyasi ajratishning paydo bo'lgan tendentsiyalari: nazariya va ilovalar.J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC. Birinchi va ikkinchi ajratish o'lchovlarida turli pH qiymatlaridan foydalangan holda RP-RP-HPLC tizimi yordamida peptidlarni ikki o'lchovli ajratish.J. Sentabr Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. va boshqalar. C18 sub-2 mkm to'liq va yuzaki gözenekli zarrachalar bilan o'ralgan yuqori samarali xromatografik ustunlarning massa uzatish xususiyatlari va kinetik ko'rsatkichlari o'rganildi.J. Sentabr Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. va boshqalar. O'simliklarning bioaktiv peptidlarini ajratish, identifikatsiya qilish va tekshirishdagi so'nggi tendentsiyalar va analitik muammolar.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s002168-02 (s002168-0).
Mueller, JB va boshqalar. Hayot shohligining proteomik landshafti. Tabiat 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. va boshqalar. Preparativ suyuqlik xromatografiyasi orqali terapevtik peptidlarni quyi oqimda qayta ishlash. Molekula (Bazel, Shveytsariya) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Aralash rejimli xromatografiya va uning biopolimerlarga qo'llanilishi.J. Xromatografiya.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Aralash rejimli oqsil xromatografiyasi uchun ligandlar: printsipi, tavsifi va dizayni.J. Biotexnologiya.144(1), 3-11 (2009).