Nature.com saytiga tashrif buyurganingiz uchun tashakkur. Siz foydalanayotgan brauzer versiyasida CSS uchun cheklangan qo'llab-quvvatlash mavjud. Eng yaxshi tajriba uchun sizga yangilangan brauzerdan foydalanishingizni tavsiya qilamiz (yoki Internet Explorer-da moslik rejimini o'chirib qo'ying). Shu bilan birga, doimiy qo'llab-quvvatlashni ta'minlash uchun biz saytni uslublar va JavaScriptsiz namoyish qilamiz.
G'ovakli kremniy zarralari makrog'ovakli zarrachalarni olish uchun ba'zi modifikatsiyalar bilan sol-gel usuli bilan tayyorlandi. Bu zarrachalar polistirol (PMP) statsionar fazasining N-fenilmaleimid interkalatsiyasini tayyorlash uchun N-fenilmaleimid (PMI) va stirol bilan qaytariladigan qo'shimcha parchalanish zanjiri uzatish (RAFT) polimerizatsiyasi orqali hosil qilindi. Tor diametrli zanglamaydigan po'latdan yasalgan ustunlar (100 × 1,8 mm id) suspenziyali qadoqlash orqali qadoqlandi. Beshta peptiddan (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leysin enkefalin) xromatografik ko'rsatkichlar) va inson zardobidagi albuminning (HAS) tripsin hazm bo'lishidan iborat peptid aralashmasining PMP ustunini ajratish baholandi. Optimal elyutatsiya sharoitida peptid aralashmasining nazariy plastinka soni 280 000 plastinka/m² gacha yetadi. Ishlab chiqilgan ajratish ko'rsatkichlarini taqqoslash Tijorat Ascentis Express RP-Amide ustuni bilan ustunni taqqoslaganda, PMP ustunining ajratish samaradorligi va aniqligi jihatidan tijorat ustunidan ustun ekanligi kuzatildi.
So'nggi yillarda biofarmatsevtika sanoati bozor ulushi sezilarli darajada oshgan holda kengayib borayotgan global bozorga aylandi. Biofarmatsevtika sanoatining portlovchi o'sishi bilan1,2,3, peptidlar va oqsillarni tahlil qilish juda talabga ega. Maqsadli peptiddan tashqari, peptid sintezi paytida bir nechta aralashmalar hosil bo'ladi, shuning uchun kerakli tozalikdagi peptidlarni olish uchun xromatografik tozalash talab etiladi. Tana suyuqliklari, to'qimalari va hujayralaridagi oqsillarni tahlil qilish va tavsiflash bitta namunada potentsial ravishda aniqlanadigan turlarning ko'pligi sababli juda qiyin vazifadir. Mass-spektrometriya peptid va oqsillarni ketma-ketlashtirish uchun samarali vosita bo'lsa-da, agar bunday namunalar mass-spektrometrga bir o'tishda kiritilsa, ajratish ideal bo'lmaydi. Bu muammoni MS tahlilidan oldin suyuq xromatografiya (LC) ajratishni amalga oshirish orqali hal qilish mumkin, bu esa ma'lum bir vaqtda mass-spektrometrga kiradigan analitlar sonini kamaytiradi4,5,6. Bundan tashqari, suyuq fazani ajratish paytida analitlar tor mintaqalarga yo'naltirilishi mumkin, shu bilan bu analitlarni jamlash va MSni aniqlash sezgirligini oshirish mumkin.Suyuqlik Xromatografiya (XX) so'nggi o'n yillikda sezilarli darajada rivojlandi va proteomik tahlilda mashhur usulga aylandi7,8,9,10.
Teskari fazali suyuq xromatografiya (RP-LC) statsionar faza sifatida oktadetsil-modifikatsiyalangan kremniy (ODS) yordamida peptid aralashmalarini tozalash va ajratish uchun keng qo'llaniladi11,12,13. Biroq, RP statsionar fazalari murakkab tuzilishi va amfifil tabiati tufayli peptidlar va oqsillarni qoniqarli ajratishni ta'minlamaydi14,15. Shuning uchun, ushbu analitlar bilan o'zaro ta'sir qilish va ularni saqlab qolish uchun qutbli va qutbsiz qismlarga ega peptidlar va oqsillarni tahlil qilish uchun maxsus ishlab chiqilgan statsionar fazalar talab qilinadi16. Multimodal o'zaro ta'sirlarni ta'minlaydigan aralash rejimli xromatografiya peptidlar, oqsillar va boshqa murakkab aralashmalarni ajratish uchun RP-LC ga alternativa bo'lishi mumkin. Bir nechta aralash rejimli statsionar fazalar tayyorlandi va ushbu fazalar bilan to'ldirilgan ustunlar peptid va oqsillarni ajratish uchun ishlatilgan17,18,19,20,21. Aralash rejimli statsionar fazalar (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, qutb interkalatsiyasi/RPLC) peptid va oqsil uchun mos keladi. qutb va qutbsiz guruhlarning mavjudligi sababli ajralishlar22,23,24,25,26,27,28. Xuddi shunday, kovalent bog'langan qutb guruhlari bilan qutblararo interkalatsiyalanuvchi statsionar fazalar qutb va qutbsiz analitlar uchun yaxshi ajralish kuchini va noyob selektivlikni ko'rsatadi, chunki ajralish analit va statsionar faza o'rtasidagi o'zaro ta'sirga bog'liq. Multimodal o'zaro ta'sirlar 29, 30, 31, 32. Yaqinda Zhang va boshqalar. 30 dodetsil bilan tugatilgan poliamin statsionar fazasini tayyorladi va uglevodorodlar, antidepressantlar, flavonoidlar, nukleozidlar, estrogenlar va boshqa bir qancha analitlarni muvaffaqiyatli ajratdi. Qutb interkalatorida ham qutb, ham qutbsiz guruhlar mavjud, shuning uchun u ham gidrofob, ham gidrofil qismlarga ega bo'lgan peptidlar va oqsillarni ajratish uchun ishlatilishi mumkin. Qutbga o'rnatilgan ustunlar (masalan, amidga o'rnatilgan C18 ustunlari) Ascentis Express RP-Amide ustunlari savdo nomi ostida tijoratda mavjud, ammo bu ustunlar faqat 33 aminini tahlil qilish uchun ishlatiladi.
Joriy tadqiqotda qutbga joylashtirilgan statsionar faza (N-fenilmaleimidga joylashtirilgan polistirol) tayyorlandi va HSA ning peptidlari va tripsin digestlarini ajratish uchun baholandi. Statsionar faza quyidagi strategiya yordamida tayyorlandi. G'ovakli kremniy zarralari avvalgi nashrimizda keltirilgan protseduraga muvofiq, tayyorlash protokoliga ba'zi o'zgartirishlar kiritilgan holda tayyorlandi. Katta g'ovak o'lchamdagi kremniy zarralarini tayyorlash uchun karbamid, polietilen glikol (PEG), TMOS, suv sirka kislotasining nisbati sozlandi. Ikkinchidan, yangi ligand, fenilmaleimid-metil vinil izosiyanat sintez qilindi va qutbga joylashtirilgan statsionar fazani tayyorlash uchun kremniy zarralarini hosil qilish uchun ishlatildi. Olingan statsionar faza optimallashtirilgan qadoqlash sxemasidan foydalanib, zanglamaydigan po'latdan yasalgan ustunga (100 × 1,8 mm id) qadoqlandi. Ustun ichida bir hil qatlam hosil bo'lishini ta'minlash uchun ustunni qadoqlash mexanik tebranish bilan yordam beradi. Besh peptiddan iborat peptid aralashmalarining qadoqlangan ustunni ajratishini baholang; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) va inson zardobidagi albuminning (HAS) tripsin hazmi. HSA ning peptid aralashmasi va tripsin hazmi yaxshi aniqlik va samaradorlik bilan ajralib chiqqani kuzatildi. PMP ustunining ajratish ko'rsatkichi Ascentis Express RP-Amide ustunining ajratish ko'rsatkichi bilan taqqoslandi. PMP ustunida ham peptidlar, ham oqsillar yaxshi aniqlik va samaradorlik bilan ajralib chiqqani kuzatildi, bu esa Ascentis Express RP-Amide ustuniga qaraganda samaraliroq edi.
PEG (Polietilen glikol), karbamid, sirka kislotasi, trimetoksi ortosilikat (TMOS), trimetil xlorosilan (TMCS), tripsin, inson zardobidagi albumin (HSA), ammoniy xlorid, karbamid, geksan metildisilazan (HMDS), metakriloil xlorid (MC), stirol, 4-gidroksi-TEMPO, benzoil peroksid (BPO), HPLC darajasidagi asetonitril (ACN), metanol, 2-propanol va aseton Sigma-Aldrich (Sent-Luis, MO, AQSh) dan sotib olingan.
Karbamid (8 g), polietilen glikol (8 g) va 8 ml 0,01 N sirka kislotasi aralashmasi 10 daqiqa davomida aralashtirildi, so'ngra muzdek sharoitda 24 ml TMOS qo'shildi. Reaksiya aralashmasi zanglamaydigan po'latdan yasalgan avtoklavda 40°C da 6 soat, keyin esa 120°C da 8 soat davomida qizdirildi. Suv quyildi va qoldiq material 70°C da 12 soat davomida quritildi. Quritilgan yumshoq massa pechda silliq maydalandi va 550°C da 12 soat davomida kaltsiylandi. Zarrachalar hajmi, g'ovak hajmi va sirt maydoni bo'yicha takrorlanuvchanlikni tekshirish uchun uchta partiya tayyorlandi va tavsiflandi.
Kremniy zarralarini oldindan sintezlangan ligand fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PCMP) bilan sirt modifikatsiyasi va keyin stirol bilan radial polimerizatsiya orqali qutb guruhini o'z ichiga olgan birikma tayyorlandi. Agregatlar va polistirol zanjirlari uchun statsionar faza. Tayyorlash jarayoni quyida tavsiflangan.
N-fenilmaleimid (200 mg) va metil vinil izosiyanat (100 mg) quruq toluolda eritildi va fenilmaleimid-metil vinil izosiyanat kopolimerini (PMCP) tayyorlash uchun reaksiya kolbasiga 0,1 ml 2,2′-azoizobutironitril (AIBN) qo'shildi. Aralashma 60°C da 3 soat davomida qizdirildi, filtrlandi va 40°C da 3 soat davomida pechda quritildi.
Quritilgan kremniy zarralari (2 g) quruq toluolda (100 ml) eritib, aralashtirildi va 500 ml dumaloq tubli kolbada 10 daqiqa davomida ultratovush bilan ishlov berildi. PMCP (10 mg) toluolda eritildi va tomchilatib voronka orqali reaksiya kolbasiga tomchilatib qo'shildi. Aralashma 100°C da 8 soat davomida qayta lyuks qilindi, filtrlandi va aseton bilan yuvildi va 60°C da 3 soat davomida quritildi. Keyin PMCP bilan bog'langan kremniy zarralari (100 g) toluolda (200 ml) eritildi va katalizator sifatida 100 µL dibutiltin dilaurat ishtirokida 4-gidroksi-TEMPO (2 ml) qo'shildi. Aralashma 50°C da 8 soat davomida aralashtirildi, filtrlandi va 50°C da 3 soat davomida quritildi.
Stirol (1 ml), benzoil peroksid BPO (0,5 ml) va TEMPO-PMCP bilan biriktirilgan kremniy zarralari (1,5 g) toluolda eritilgan va azot bilan purkalgan. Stirolning polimerizatsiyasi 100°C da 12 soat davomida amalga oshirildi. Olingan mahsulot metanol bilan yuvildi va 60°C da bir kechada quritildi. Umumiy reaksiya sxemasi 1-rasmda ko'rsatilgan.
Namunalar 10-3 Torr dan kam qoldiq bosim olish uchun 393 K da 1 soat davomida gazsizlantirildi. Umumiy g'ovak hajmini aniqlash uchun P/P0 = 0.99 nisbiy bosimda adsorbsiyalangan N2 miqdori ishlatilgan. Yalang'och va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining morfologiyasi skanerlash elektron mikroskopi (Hitachi High Technologies, Tokio, Yaponiya) yordamida tekshirildi. Quritilgan namunalar (yalang'och kremniy va ligand bilan bog'langan kremniy zarralari) alyuminiy ustunga yopishqoq uglerod lentasi yordamida joylashtirildi. Q150T purkagich qoplamasi yordamida namunalarga oltin surtildi va namunalarga 5 nm Au qatlami qo'yildi. Bu past kuchlanishlardan foydalangan holda jarayon samaradorligini oshiradi va mayda donali, sovuq purkashni ta'minlaydi. Elementlarni tahlil qilish uchun Thermo Electron (Waltham, MA, AQSh) Flash EA1112 element analizatori ishlatilgan. Zarrachalar hajmini olish uchun Malvern (Worcestershire, Buyuk Britaniya) Mastersizer 2000 zarrachalar hajmini analizatori ishlatilgan. Tarqalishi. Yalang'och kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan kremniy zarralari (har biri 5 mg) 5 ml izopropanolda eritilgan, 10 daqiqa davomida ultratovush bilan ishlov berilgan, 5 daqiqa davomida vortekslangan va Mastersizerning optik skameykasiga joylashtirilgan. Termogravimetrik tahlil 30 dan 800 °C gacha bo'lgan harorat oralig'ida daqiqasiga 5 °C tezlikda amalga oshirildi.
Shisha bilan qoplangan zanglamaydigan po'latdan yasalgan tor diametrli o'lchamdagi (100 × 1,8 mm id) ustunlar havolada qo'llanilgan protsedura qo'llanilgan holda, shlamli qadoqlash usuli bilan qadoqlandi. 31. 1 µm fritli chiqish moslamasiga ega zanglamaydigan po'latdan yasalgan ustun (shisha bilan qoplangan, 100 × 1,8 mm id) shlamli qadoqlash moslamasiga (Alltech Deerfield, IL, AQSh) ulandi. 1,2 ml metanolga 150 mg statsionar fazani suspenziya qilish va saqlash ustuniga yuborish orqali statsionar fazali shlam tayyorlang. Metanol shlamli erituvchi sifatida ham, harakatlantiruvchi erituvchi sifatida ham ishlatilgan. Ustunni ketma-ket 10 daqiqa davomida 100 MP, 15 daqiqa davomida 80 MP va 30 daqiqa davomida 60 MP bosim o'tkazib to'ldiring. Qadoqlash paytida ustunning bir tekis qadoqlanishini ta'minlash uchun ikkita GC ustun silkitgichi (Alltech, Deerfield, IL, AQSh) bilan mexanik tebranish qo'llanildi. Ustun ichidagi har qanday shikastlanishning oldini olish uchun shlamli qadoqlash moslamasini yoping va bosimni asta-sekin tushiring. Ustunni shlamli qadoqlash moslamasidan ajratib oling va kirish va LC tizimiga boshqa fittingni ulang. uning ishlashini tekshirish uchun.
LC nasosi (10AD Shimadzu, Yaponiya), 50nL inyeksiya halqasi, membranali degasser (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapillyar oynasi bilan jihozlangan LC nasosi. Maxsus µLC qurilma detektori (UV-2075) va shisha bilan qoplangan mikroustunlar. Qo'shimcha ustun tasmasining kengayishi ta'sirini minimallashtirish uchun juda tor va qisqa ulash naychalaridan foydalaning. Qadoqlashdan so'ng, qaytaruvchi birlashmaning 1/16 dyuymli chiqish joyiga kapillyarlar (50 μm id 365 va qaytaruvchi birlashma kapillyarlari (50 μm) o'rnatildi. Ma'lumotlarni yig'ish va xromatografik ishlov berish Multichro 2000 dasturi yordamida amalga oshirildi. 254 nm da monitoring Analitlar UB yutilishini tekshirdi. Xromatografik ma'lumotlar OriginPro8 (Northampton, MA) tomonidan tahlil qilindi.
Inson zardobidan olingan albumin, liofilizatsiyalangan kukun, ≥ 96% (agaroza gel elektroforez) 3 mg tripsin (1,5 mg), 4,0 M karbamid (1 ml) va 0,2 M ammoniy bikarbonat (1 ml) bilan aralashtirildi. Eritma 10 daqiqa davomida aralashtirildi va 37°C da suv hammomida 6 soat davomida saqlandi, so'ngra 1 ml 0,1% TFA bilan so'ndi. Eritmani filtrlang va 4°C dan past haroratda saqlang.
Peptid aralashmalari va HSA tripsin digestlarini ajratish PMP ustunlarida alohida baholandi. PMP ustuni orqali HSA ning peptid aralashmasi va tripsin digestini ajratishni tekshiring va natijalarni Ascentis Express RP-Amide ustuni bilan taqqoslang. Nazariy plastinka raqami quyidagicha hisoblanadi:
Yalang'och kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining SEM tasvirlari 2-rasmda ko'rsatilgan. Yalang'och kremniy zarralarining SEM tasvirlari (A, B) shuni ko'rsatadiki, avvalgi tadqiqotlarimizdan farqli o'laroq, bu zarralar sharsimon bo'lib, ularda zarralar cho'zilgan yoki tartibsiz simmetriyaga ega. Ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining (C, D) yuzasi yalang'och kremniy zarralarinikiga qaraganda silliqroq, bu kremniy zarralari yuzasida polistirol zanjirlarining qoplanishi bilan bog'liq bo'lishi mumkin.
Yalang'och kremniy zarrachalarining (A, B) va ligand bilan bog'langan kremniy zarrachalarining (C, D) elektron mikroskop tasvirlarini skanerlash.
Yalang'och kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining zarracha kattaligi taqsimoti 3(A)-rasmda ko'rsatilgan. Hajmga asoslangan zarracha kattaligi taqsimoti egri chiziqlari kimyoviy modifikatsiyadan so'ng kremniy zarralarining kattaligi oshganligini ko'rsatdi (3A-rasm). Joriy tadqiqot va oldingi tadqiqotdan olingan kremniy zarralarining zarracha kattaligi taqsimoti ma'lumotlari 1(A)-jadvalda taqqoslanadi. PMP ning hajmga asoslangan zarracha kattaligi, d(0.5), bizning avvalgi tadqiqotimizga nisbatan 3.36 mkm ni tashkil qiladi, ad(0.5) qiymati 3.05 mkm (polistirol bilan bog'langan kremniy zarralari)34. Reaksiya aralashmasida PEG, karbamid, TMOS va sirka kislotasining turli nisbatlari tufayli bu partiya avvalgi tadqiqotimizga nisbatan torroq zarracha kattaligi taqsimotiga ega edi. PMP fazasining zarracha kattaligi biz ilgari o'rgangan polistirol bilan bog'langan kremniy zarrachalari fazasidan biroz kattaroq. Bu shuni anglatadiki, stirol bilan kremniy zarralarining sirt funksionalizatsiyasi kremniy yuzasiga faqat polistirol qatlamini (0.97 mkm) qo'ydi, PMP fazasida esa... qatlam qalinligi 1,38 µm edi.
Yalang'och kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining zarrachalar hajmi taqsimoti (A) va g'ovak hajmi taqsimoti (B).
Joriy tadqiqotning kremniy zarralarining g'ovak hajmi, g'ovak hajmi va sirt maydoni 1(B)-jadvalda keltirilgan. Yalang'och kremniy zarralari va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining PSD profillari 3(B)-rasmda ko'rsatilgan. Natijalar avvalgi tadqiqotimiz bilan taqqoslanadigan darajada. Yalang'och va ligand bilan bog'langan kremniy zarralarining g'ovak o'lchamlari mos ravishda 310 va 241 ni tashkil qiladi, bu 1(B)-jadvalda ko'rsatilganidek, kimyoviy modifikatsiyadan so'ng g'ovak hajmi 69 ga kamayganligini ko'rsatadi va egri chiziqning o'zgarishi 3(B)-rasmda ko'rsatilgan. Xuddi shunday, kimyoviy modifikatsiyadan so'ng kremniy zarralarining g'ovak hajmi 0,67 dan 0,58 sm3/g gacha kamaydi. Hozirda o'rganilayotgan kremniy zarralarining solishtirma sirt maydoni 116 m2/g ni tashkil qiladi, bu bizning oldingi tadqiqotimiz bilan taqqoslanadigan darajada (124 m2/g). 1(B)-jadvalda ko'rsatilganidek, kremniy zarralarining sirt maydoni (m2/g) ham 116 m2/g dan 105 gacha kamaydi. kimyoviy modifikatsiyadan keyin m2/g.
Statsionar fazaning elementar tahlil natijalari 2-jadvalda keltirilgan. Hozirgi statsionar fazaning uglerod yuklanishi 6,35% ni tashkil etadi, bu bizning oldingi tadqiqotimizdagi uglerod yuklanishidan past (polistirol bilan bog'langan kremniy zarralari, mos ravishda 7,93%35 va 10,21%) 42. Hozirgi statsionar fazaning uglerod yuklanishi past, chunki hozirgi SP ni tayyorlashda stiroldan tashqari, fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat (PCMP) va 4-gidroksi-TEMPO kabi ba'zi qutb ligandlari ishlatilgan. Hozirgi statsionar fazaning azot og'irlik foizi 2,21% ni tashkil qiladi, avvalgi tadqiqotlarda azotning og'irligi bo'yicha mos ravishda 0,1735 va 0,85% ga nisbatan. Bu shuni anglatadiki, hozirgi statsionar fazada azotning og'irlik foizi fenilmaleimid tufayli yuqoriroq. Xuddi shunday, (4) va (5) mahsulotlarning uglerod yuklanishi mos ravishda 2,7% va 2,9% ni tashkil etdi, yakuniy mahsulotning uglerod yuklanishi esa (6) 2-jadvalda ko'rsatilganidek, 6,35% ni tashkil etdi. Vazn yo'qotish PMP statsionar fazasi bilan tekshirildi va TGA egri chizig'i 4-rasmda ko'rsatilgan. TGA egri chizig'i 8,6% vazn yo'qotishini ko'rsatadi, bu uglerod yuklanishi (6,35%) bilan yaxshi mos keladi, chunki ligandlar nafaqat C, balki N, O va H ni ham o'z ichiga oladi.
Fenilmaleimid-metilvinilizosiyanat ligandi kremniy zarrachalarini sirt modifikatsiyasi uchun tanlangan, chunki u qutbli fenilmaleimid guruhlari va vinilizosiyanat guruhlariga ega. Vinil izosiyanat guruhlari stirol bilan jonli radikal polimerizatsiya orqali reaksiyaga kirishishi mumkin. Ikkinchi sabab, analit bilan o'rtacha o'zaro ta'sirga ega bo'lgan va analit va statsionar faza o'rtasida kuchli elektrostatik o'zaro ta'sirga ega bo'lmagan guruhni kiritishdir, chunki fenilmaleimid qismi normal pH da virtual zaryadga ega emas. Statsionar fazaning qutblanishi stirolning optimal miqdori va erkin radikal polimerizatsiya reaksiya vaqti bilan boshqarilishi mumkin. Reaksiyaning oxirgi bosqichi (erkin radikal polimerizatsiya) juda muhim va statsionar fazaning qutblanishini o'zgartirishi mumkin. Ushbu statsionar fazalarning uglerod yuklanishini tekshirish uchun elementar tahlil o'tkazildi. Stirol miqdorini va reaksiya vaqtini oshirish statsionar fazaning uglerod yuklanishini oshirishi va aksincha kuzatildi. Turli konsentratsiyali stirol bilan tayyorlangan SPlar turli xil uglerod yuklanishlariga ega. Yana bir bor, bu statsionar fazalarni zanglamaydigan po'lat ustunlarga joylashtiring va ularning Xromatografik ko'rsatkichlar (selektivlik, aniqlik, N qiymati va boshqalar). Ushbu tajribalar asosida, nazorat qilinadigan qutblanish va analitning yaxshi saqlanishini ta'minlash uchun PMP statsionar fazasini tayyorlash uchun optimallashtirilgan formula tanlandi.
Beshta peptid aralashmasi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leysin enkefalin) ham mobil fazadan foydalangan holda PMP ustuni yordamida baholandi; 60/40 (v/v) asetonitril/suv (0,1% TFA) 80 μL/min oqim tezligida. Optimal elyutatsiya sharoitida har bir ustun uchun nazariy plastinka raqami (N) (100 × 1,8 mm id) 20,000 ± 100 (200,000 plastinka/m²). 3-jadvalda uchta PMP ustunlari uchun N qiymatlari keltirilgan va xromatogrammalar 5A-rasmda ko'rsatilgan. Yuqori oqim tezligida (700 μL/min) PMP ustunida tezkor tahlil, bir daqiqa ichida beshta peptid elyut qilindi, N qiymatlari juda yaxshi edi, har bir ustun uchun 13,500 ± 330 (100 × 1,8 mm id), 135,000 plastinka/m ga to'g'ri keladi (5B-rasm). Tekshirish uchun uchta bir xil o'lchamdagi ustunlar (100 × 1,8 mm id) uchta turli xil PMP statsionar fazasi bilan to'ldirilgan. takrorlanuvchanlik. Har bir ustun uchun analit konsentratsiyasi optimal elyutatsiya sharoitlari va nazariy plitalar soni N va har bir ustunda bir xil sinov aralashmasini ajratish uchun saqlash vaqti yordamida qayd etildi. PMP ustunlari uchun takrorlanuvchanlik ma'lumotlari 4-jadvalda keltirilgan. PMP ustunining takrorlanuvchanligi 3-jadvalda ko'rsatilganidek, juda past %RSD qiymatlari bilan yaxshi bog'liq.
PMP ustunida (B) va Ascentis Express RP-Amide ustunida (A) peptid aralashmasini ajratish; mobil faza 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP ustun o'lchamlari (100 × 1.8 mm id); analitik birikmalarning elyutatsiya tartibi: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) va 5 (leytsin) kislota enkefalin)).
Yuqori samarali suyuq xromatografiyada inson zardobidagi albuminning triptik digestlarini ajratish uchun PMP ustuni (100 × 1,8 mm id) baholandi. 6-rasmdagi xromatogramma namunaning yaxshi ajratilganligini va aniqligi juda yaxshi ekanligini ko'rsatadi. HSA digestlari 100 µL/min oqim tezligi, harakatlanuvchi faza 70/30 asetonitril/suv va 0,1% TFA yordamida tahlil qilindi. Xromatogrammada ko'rsatilganidek (6-rasm), HSA digesti 17 peptidga mos keladigan 17 ta cho'qqiga bo'lingan. HSA digestidagi har bir cho'qqining ajratish samaradorligi hisoblab chiqildi va qiymatlar 5-jadvalda keltirilgan.
HSA ning triptik dayjesti (100 × 1,8 mm id) PMP ustunida ajratildi; oqim tezligi (100 µL/min), harakatlanuvchi faza 60/40 asetonitril/suv, 0,1% TFA bilan.
bu yerda L - ustun uzunligi, η - harakatlanuvchi fazaning yopishqoqligi, ΔP - ustunning orqa bosimi va u - harakatlanuvchi fazaning chiziqli tezligi. PMP ustunining o'tkazuvchanligi 2,5 × 10-14 m2, oqim tezligi 25 μL/min va 60/40 v/v ACN/suv ishlatilgan. PMP ustunining o'tkazuvchanligi (100 × 1,8 mm id) bizning oldingi tadqiqotimizdagi 34-havolaga o'xshash edi. Yuzaki g'ovakli zarrachalar bilan to'ldirilgan ustunning o'tkazuvchanligi: 1,3 μm zarrachalar uchun 1,7 × 10-15, 1,7 μm zarrachalar uchun 3,1 × 10-15, 2,6 μm zarrachalar uchun 5,2 × 10-15 va 2,5 × 10-14 m2. 5 μm zarrachalar uchun 43. Shuning uchun, PMP fazasining o'tkazuvchanligi 5 μm yadro-qobiq o'tkazuvchanligiga o'xshash. zarrachalar.
bu yerda Wx - xloroform bilan to'ldirilgan ustunning og'irligi, Wy - metanol bilan to'ldirilgan ustunning og'irligi va ρ - erituvchining zichligi. Metanol (ρ = 0.7866) va xloroform (ρ = 1.484) zichliklari. Biz ilgari o'rgangan SILICA ZARRACHALARI-C18 ustunlarining (100 × 1.8 mm id) 34 va C18-Urea ustunlarining 31 umumiy g'ovakliligi mos ravishda 0.63 va 0.55 ni tashkil etdi. Bu shuni anglatadiki, karbamid ligandlarining mavjudligi statsionar fazaning o'tkazuvchanligini pasaytiradi. Boshqa tomondan, PMP ustunining (100 × 1.8 mm id) umumiy g'ovakliligi 0.60 ga teng. PMP ustunlarining o'tkazuvchanligi C18 bilan bog'langan kremniy zarralari bilan to'ldirilgan ustunlarnikidan pastroq, chunki C18 tipidagi statsionar fazalarda C18 ligandlari kremniy zarralariga chiziqli zanjirlar sifatida biriktirilgan, polistirol tipidagi statsionar fazalarda esa A nisbatan qalinroq. uning atrofida polimer qatlami hosil bo'ladi. Odatdagi tajribada ustunning g'ovakliligi quyidagicha hisoblanadi:
7A, B-rasmlarda Van Deemter diagrammasining bir xil elyutsiya sharoitlaridan (ya'ni, 60/40 ACN/H2O va 0,1% TFA) foydalangan holda PMP ustuni (100 × 1,8 mm id) va Ascentis Express RP-Amide ustuni (100 × 1,8 mm id) ko'rsatilgan. Tanlangan peptid aralashmalari (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) 20 µL/da tayyorlandi. Ikkala ustun uchun ham minimal oqim tezligi 800 µL/min. PMP ustuni va Ascentis Express RP-Amide ustuni uchun optimal oqim tezligida (80 µL/min) minimal HETP qiymatlari mos ravishda 2,6 µm va 3,9 µm ni tashkil etdi. HETP qiymatlari PMP ustunining (100 × 1,8 mm id) ajratish samaradorligi tijoratda mavjud bo'lgan Ascentis Express RP-Amide ustuniga (100 × 1,8 mm id) qaraganda ancha yaxshi ekanligini ko'rsatadi. 7(A)-rasmdagi van Deemter diagrammasi oqimning oshishi bilan N qiymatining pasayishi avvalgi tadqiqotimizga nisbatan sezilarli emasligini ko'rsatadi. PMP ustunining (100 ×) yuqori ajratish samaradorligi Ascentis Express RP-Amide ustuniga nisbatan 1,8 mm id) qiymati joriy ishda qo'llanilgan zarrachalar shakli, o'lchami va murakkab ustunlarni qadoqlash protseduralaridagi yaxshilanishlarga asoslangan34.
(A) 0,1% TFA bilan 60/40 ACN/H2O da PMP ustuni (100 × 1,8 mm id) yordamida olingan van Deemter grafigi (HETP va mobil faza chiziqli tezligi).(B) 0,1% TFA bilan 60/40 ACN/H2O da Ascentis Express RP-Amide ustuni (100 × 1,8 mm id) yordamida olingan van Deemter grafigi (HETP va mobil faza chiziqli tezligi).
Yuqori samarali suyuq xromatografiyada inson zardobidagi albumin (HAS) ning sintetik peptid aralashmalari va tripsin digestlarini ajratish uchun qutbga o'rnatilgan polistirol statsionar faza tayyorlandi va baholandi. Peptid aralashmalari uchun PMP ustunlarining xromatografik ko'rsatkichlari ajratish samaradorligi va aniqligi jihatidan juda yaxshi. PMP ustunlarining yaxshilangan ajratish ko'rsatkichlari turli sabablarga ko'ra, masalan, kremniy zarrachalarining zarracha hajmi va g'ovak hajmi, statsionar fazaning boshqariladigan sintezi va murakkab ustunli qadoqlash bilan bog'liq. Yuqori ajratish samaradorligidan tashqari, yuqori oqim tezligida ustunning past orqa bosimi ushbu statsionar fazaning yana bir afzalligi hisoblanadi. PMP ustunlari yaxshi takrorlanuvchanlikni namoyish etadi va peptid aralashmalarini tahlil qilish va turli oqsillarning tripsin hazm bo'lishi uchun ishlatilishi mumkin. Biz ushbu ustundan suyuq xromatografiyada tabiiy mahsulotlarni, dorivor o'simliklardan bioaktiv birikmalarni va qo'ziqorin ekstraktlarini ajratish uchun foydalanishni rejalashtirmoqdamiz. Kelajakda PMP ustunlari oqsillarni ajratish va monoklonal antikorlar uchun ham baholanadi.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Teskari fazali xromatografiya yordamida peptid ajratish tizimlarini tadqiq qilish I qism: Ustun xarakteristikasi protokolini ishlab chiqish. J. Xromatografiya.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. va boshqalar. Yuqumli kasalliklarni davolash uchun mo'ljallangan takomillashtirilgan faol peptidlar. Biotexnologiya. Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Sintetik terapevtik peptidlar: fan va bozor. Dori kashfiyoti.15 (1-2) bugun, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kengaytirilgan proteomik suyuqlik xromatografiyasi. J. Xromatografiya. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. va boshqalar. Ilg'or suyuqlik xromatografiyasi-massa spektrometriyasi keng maqsadli metabolomika va proteomikani birlashtirish imkonini beradi. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM va Salisbury, JJ Dori vositalarini ishlab chiqishda UHPLC ning roli. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Tez ajratish uchun ultra yuqori bosimli suyuqlik xromatografiyasining fundamental va amaliy jihatlari. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Dori vositalarini ishlab chiqishda ultra yuqori samarali suyuqlik xromatografiyasini qo'llash. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. va boshqalar. Enteroviruslarni samarali tozalash uchun suvdagi moyli yuqori ichki fazali emulsiyalardan tayyorlangan monolitik makrogözenekli gidrogellar. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horvath, C. & Wilkins, JA Suyuq xromatografiyaning proteomikadagi roli. J. Xromatografiya. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Terapevtik peptidlar va oqsillarni teskari fazali suyuqlik xromatografiyasi bilan ajratishda paydo bo'layotgan tendentsiyalar: nazariya va qo'llanilishi. J. Pharmacy. Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Birinchi va ikkinchi ajratish o'lchamlarida turli pH qiymatlaridan foydalangan holda RP-RP-HPLC tizimi yordamida peptidlarni ikki o'lchovli ajratish. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. va boshqalar. To'liq va yuzaki g'ovakli zarrachalar bilan to'ldirilgan yuqori samarali xromatografik ustunlarning massa uzatish xususiyatlari va kinetik ko'rsatkichlari o'rganildi. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. va boshqalar. O'simlik bioaktiv peptidlarini ajratish, identifikatsiyalash va tasdiqlashdagi so'nggi tendentsiyalar va analitik muammolar. anus. biological anus. Chemical.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB va boshqalar. Hayot shohligining proteomik manzarasi. Tabiat 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. va boshqalar. Preparativ suyuqlik xromatografiyasi yordamida terapevtik peptidlarni quyi oqimga qayta ishlash. Molecule (Bazel, Shveytsariya) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Aralash rejimli xromatografiya va uning biopolimerlarga qo'llanilishi. J. Xromatografiya. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. va Sun, Y. Aralash rejimdagi oqsil xromatografiyasi uchun ligandlar: printsip, tavsif va dizayn. J. Biotexnologiya.144(1), 3-11 (2009).