Asante kwa kutembelea Nature.com. Toleo la kivinjari unachotumia lina usaidizi mdogo kwa CSS. Kwa matumizi bora, tunapendekeza utumie kivinjari kilichosasishwa (au uzime hali ya utangamano katika Internet Explorer). Wakati huo huo, ili kuhakikisha usaidizi unaoendelea, tutaonyesha tovuti bila mitindo na JavaScript.
Chembe za silika zenye vinyweleo vilitayarishwa kwa njia ya sol-gel pamoja na marekebisho kadhaa ili kupata chembe zenye vinyweleo vikubwa. Chembe hizi zilitokana na upolimishaji wa uhamishaji wa mnyororo wa kugawanyika unaoweza kurekebishwa (RAFT) kwa kutumia N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) na styrene ili kuandaa mwingiliano wa N-phenylmaleimide wa awamu ya stationary ya polystyrene (PMP). Nguzo nyembamba za chuma cha pua (100 × 1.8 mm id) zilifungwa kwa kufungasha tope. Utenganishaji wa safu wima ya PMP uliotathminiwa wa mchanganyiko wa peptidi unaojumuisha peptidi tano (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) na usagaji wa trypsin wa albumin ya seramu ya binadamu (HAS). Chini ya hali bora ya utatuzi, idadi ya kinadharia ya sahani ya mchanganyiko wa peptidi ni kubwa kama sahani 280,000/m². Kulinganisha utendaji wa utenganishaji wa Katika safu wima iliyotengenezwa yenye safu wima ya kibiashara ya Ascentis Express RP-Amide, ilibainika kuwa utendaji wa utenganishaji wa safu wima ya PMP ulikuwa bora kuliko safu wima ya kibiashara katika suala la ufanisi na utatuzi wa utenganishaji.
Katika miaka ya hivi karibuni, tasnia ya dawa za kibiolojia imekuwa soko linalopanuka kimataifa na ongezeko kubwa la hisa ya soko. Kwa ukuaji mkubwa wa tasnia ya dawa za kibiolojia1,2,3, uchambuzi wa peptidi na protini unahitajika sana. Mbali na peptidi lengwa, uchafu kadhaa huzalishwa wakati wa usanisi wa peptidi, hivyo kuhitaji utakaso wa kromatografia ili kupata peptidi za usafi unaohitajika. Uchambuzi na uainishaji wa protini katika majimaji ya mwili, tishu na seli ni kazi ngumu sana kutokana na idadi kubwa ya spishi zinazoweza kugunduliwa katika sampuli moja. Ingawa spektrometri ya wingi ni zana bora ya mpangilio wa peptidi na protini, ikiwa sampuli kama hizo zitaingizwa kwenye spektrometri ya wingi kwa kupita mara moja, utengano hautakuwa mzuri. Tatizo hili linaweza kupunguzwa kwa kutekeleza utenganishaji wa kromatografia ya kioevu (LC) kabla ya uchambuzi wa MS, ambao utapunguza idadi ya uchanganuzi unaoingia kwenye spektrometri ya wingi kwa wakati fulani4,5,6. Kwa kuongezea, wakati wa utenganishaji wa awamu ya kioevu, uchanganuzi unaweza kulenga katika maeneo nyembamba, na hivyo kuzingatia uchanganuzi huu na kuboresha ugunduzi wa MS. Unyeti. Kromatografia ya kimiminika (LC) imeendelea kwa kiasi kikubwa katika muongo mmoja uliopita na imekuwa mbinu maarufu katika uchanganuzi wa proteomiki7,8,9,10.
Kromatografia ya kioevu ya awamu iliyogeuzwa (RP-LC) hutumika sana kwa ajili ya utakaso na utenganishaji wa michanganyiko ya peptidi kwa kutumia silika iliyobadilishwa na oktadesili (ODS) kama awamu ya kudumu11,12,13.Hata hivyo, awamu za kudumu za RP hazitoi utenganishaji wa kuridhisha wa peptidi na protini kutokana na muundo wao tata na asili ya amfifili 14,15.Kwa hivyo, awamu za kudumu zilizoundwa maalum zinahitajika kuchanganua peptidi na protini zenye sehemu za polar na zisizo za polar ili kuingiliana na kuhifadhi uchanganuzi huu16. Kromatografia ya hali mchanganyiko, ambayo hutoa mwingiliano wa hali nyingi, inaweza kuwa mbadala wa RP-LC kwa utenganishaji wa peptidi, protini, na michanganyiko mingine tata. Awamu kadhaa za kudumu za hali mchanganyiko zimeandaliwa, na nguzo zilizojaa awamu hizi zimetumika kwa utenganishaji wa peptidi na protini17,18,19,20,21. Awamu za kudumu za hali mchanganyiko (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, mwingiliano wa polar/RPLC) zinafaa kwa utenganishaji wa peptidi na protini unaotokana na kwa uwepo wa vikundi vyote vya polar na visivyo vya polar22,23,24,25,26,27,28. Vile vile, awamu zisizobadilika za polar zenye vikundi vya polar vilivyounganishwa kwa ushirikiano huonyesha nguvu nzuri ya utengano na uteuzi wa kipekee kwa wachambuzi wa polar na wasio wa polar, kwani utengano hutegemea mwingiliano kati ya wachambuzi na awamu zisizobadilika. Mwingiliano wa hali nyingi 29, 30, 31, 32. Hivi majuzi, Zhang et al. 30 waliandaa awamu ya poliamini iliyosimamishwa na dodecyl na kutenganisha hidrokaboni, dawamfadhaiko, flavonoids, nyukleosides, estrojeni, na wachambuzi wengine kadhaa kwa mafanikio. Kiunganishi cha polar kina vikundi vya polar na visivyo vya polar, kwa hivyo kinaweza kutumika kutenganisha peptidi na protini ambazo zina sehemu za hidrofobi na hidrofili. Nguzo zilizopachikwa polar (km, nguzo za C18 zilizopachikwa amide) zinapatikana kibiashara chini ya jina la biashara Ascentis Express RP-Amide nguzo, lakini nguzo hizi zinatumika kwa uchambuzi wa amini 33 pekee.
Katika utafiti wa sasa, awamu ya kudumu iliyopachikwa polar (polistyrene iliyopachikwa polar-phenylmaleimide) iliandaliwa na kutathminiwa kwa ajili ya utenganisho wa peptidi na trypsin digestions ya HSA. Awamu ya kudumu iliandaliwa kwa kutumia mkakati ufuatao. Chembe za silika zenye vinyweleo ziliandaliwa kulingana na utaratibu uliotolewa katika chapisho letu lililopita pamoja na marekebisho kadhaa ya itifaki ya maandalizi. Uwiano wa urea, polyethilini glikoli (PEG), TMOS, asidi asetiki ya maji ulirekebishwa ili kuandaa chembe za silika zenye ukubwa mkubwa wa vinyweleo. Pili, ligand mpya, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, ilitengenezwa na kutumika kupata chembe za silika ili kuandaa awamu ya kudumu iliyopachikwa polar. Awamu ya kudumu iliyotokana iliwekwa kwenye safu ya chuma cha pua (100 × 1.8 mm id) kwa kutumia mpango bora wa kufungasha. Ufungashaji wa safu unasaidiwa na mtetemo wa kiufundi ili kuhakikisha kitanda chenye umbo moja huundwa ndani ya safu. Tathmini utenganisho wa safu wima zilizopakiwa wa michanganyiko ya peptidi yenye peptidi tano; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) na usagaji wa Trypsin wa albumini ya seramu ya binadamu (HAS). Mchanganyiko wa peptidi na usagaji wa trypsin wa HSA ulizingatiwa kutengana kwa ubora na ufanisi mzuri. Utendaji wa utenganishaji wa safu ya PMP ulilinganishwa na ule wa safu ya Ascentis Express RP-Amide. Peptidi na protini zote mbili zilizingatiwa kuwa zimetatuliwa vizuri na zenye ufanisi kwenye safu ya PMP, ambayo ilikuwa na ufanisi zaidi kuliko safu ya Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polyethilini Glykoli), Urea, Asidi Asetiki, Trimethoksi Orthosilikati (TMOS), Trimethili Klorosilane (TMCS), Trypsin, Seramu ya Binadamu Albumini (HSA), Ammonium Kloridi, Urea, Heksani Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Kloridi (MC), Styrene, 4-Hydroksi-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), HPLC Daraja Acetonitrile (ACN), Methanoli, 2-Propanoli, na Asetoni Zilizonunuliwa kutoka Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Marekani).
Mchanganyiko wa urea (8 g), polyethilini glikoli (8 g), na mililita 8 za asidi asetiki 0.01 N ulichanganywa kwa dakika 10, na kisha mililita 24 za TMOS ziliongezwa hapo chini ya hali ya baridi kali. Mchanganyiko wa mmenyuko ulipashwa joto kwa 40°C kwa saa 6 na kisha kwa 120°C kwa saa 8 kwenye autoclave ya chuma cha pua. Maji yalimiminwa na mabaki yalikaushwa kwa 70°C kwa saa 12. Uzito laini uliokaushwa ulisagwa laini katika oveni na kuchanganywa kwa 550°C kwa saa 12. Makundi matatu yalitayarishwa na kubainishwa ili kuchunguza uwezekano wa kuzaliana tena kwa ukubwa wa chembe, ukubwa wa vinyweleo na eneo la uso.
Kwa urekebishaji wa uso wa chembe za silika kwa kutumia ligand phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) iliyotengenezwa awali ikifuatiwa na upolimishaji wa radial kwa kutumia styrene, kiwanja chenye kundi la polar kilitayarishwa. Awamu ya utulivu kwa ajili ya viunganishi na minyororo ya polistyrene. Mchakato wa maandalizi umeelezwa hapa chini.
N-phenylmaleimide (200 mg) na isosianate ya methyl vinyl (100 mg) ziliyeyushwa katika toluini kavu, na 0.1 mL ya 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) iliongezwa kwenye chupa ya mmenyuko ili kuandaa kopolymeri ya isosianate ya phenylmaleimide-methyl vinyl (PMCP).. Mchanganyiko huo ulipashwa moto kwa 60°C kwa saa 3, ukachujwa na kukaushwa katika oveni kwa 40°C kwa saa 3.
Chembe za silika zilizokaushwa (2 g) zilitawanywa katika toluini kavu (100 mL), zikachanganywa na kuchanganywa katika chupa ya chini ya duara ya mL 500 kwa dakika 10. PMCP (10 mg) iliyeyushwa katika toluini na kuongezwa kwa njia ya matone kwenye chupa ya mmenyuko kupitia funeli inayodondoka. Mchanganyiko huo ulirudishwa kwenye 100°C kwa saa 8, ukachujwa na kuoshwa na asetoni na kukaushwa kwa 60°C kwa saa 3. Kisha, chembe za silika zilizounganishwa na PMCP (100 g) ziliyeyushwa katika toluini (200 ml) na 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) iliongezwa mbele ya 100 µL ya dibutyltin dilaurate kama kichocheo. Mchanganyiko huo ulichanganywa kwa 50°C kwa saa 8, ukachujwa na kukaushwa kwa 50°C kwa saa 3.
Styrene (1 mL), benzoyl peroxide BPO (0.5 mL), na chembe za silika zilizounganishwa na TEMPO-PMCP (1.5 g) zilitawanywa katika toluini na kusafishwa kwa nitrojeni. Upolimishaji wa styrene ulifanyika kwa 100°C kwa saa 12. Bidhaa iliyotokana ilioshwa na methanoli na kukaushwa kwa 60°C usiku kucha. Mpango wa jumla wa mmenyuko unaonyeshwa kwenye Mchoro 1.
Sampuli ziliondolewa gesi kwa 393 K kwa saa 1 ili kupata shinikizo lililobaki la chini ya 10-3 Torr. Kiasi cha N2 kilichofyonzwa kwa shinikizo la P/P0 = 0.99 kilitumika kubaini jumla ya ujazo wa vinyweleo. Mofolojia ya chembe za silika zilizo wazi na zilizounganishwa na ligand ilichunguzwa kwa hadubini ya elektroni ya kuchanganua (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japani). Sampuli zilizokaushwa (chembe za silika zilizo wazi na chembe za silika zilizounganishwa na ligand) ziliwekwa kwenye safu ya alumini kwa kutumia mkanda wa kaboni unaonata. Dhahabu ilipakwa kwenye sampuli kwa kutumia kifuniko cha sputter cha Q150T, na safu ya Au ya 5 nm iliwekwa kwenye sampuli. Hii inaboresha ufanisi wa mchakato kwa kutumia volteji za chini na hutoa chembe laini, na matone baridi. Kichambuzi cha elementi cha Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 kilitumika kwa uchambuzi wa elementi. Kichambuzi cha ukubwa wa chembe cha Malvern (Worcestershire, Uingereza) Mastersizer 2000 kilitumika kupata usambazaji wa ukubwa wa chembe. Silika iliyochimbwa chembe na chembe za silika zilizounganishwa na ligand (5 mg kila moja) zilitawanywa katika mL 5 za isopropanol, zikatolewa kwa sauti kwa dakika 10, zikatolewa kwa mvuke kwa dakika 5, na kuwekwa kwenye benchi la macho la Mastersizer. Uchambuzi wa halijoto ulifanywa kwa kiwango cha 5 °C kwa dakika katika kiwango cha halijoto cha 30 hadi 800 °C.
Nguzo nyembamba za chuma cha pua zilizofunikwa kwa kioo zenye kipenyo cha milimita 100 × 1.8 zilifungwa kwa kutumia mbinu ya kufungasha tope, zikitumia utaratibu uleule uliotumika katika Marejeleo. 31. Safu wima ya chuma cha pua (iliyofunikwa kwa glasi, 100 × 1.8 mm id) yenye sehemu ya kutolea iliyo na frit ya µm 1 iliunganishwa kwenye kifungashio cha tope (Alltech Deerfield, IL, Marekani). Tayarisha tope la awamu isiyosimama kwa kusimamisha miligramu 150 za awamu isiyosimama katika 1.2 mL ya methanoli na uitume kwenye safu wima ya kuhifadhi. Methanoli ilitumika kama kiyeyusho cha tope pamoja na kiyeyusho cha kusongesha. Jaza safu wima mfululizo kwa kutumia shinikizo la 100 MP kwa dakika 10, 80 MP kwa dakika 15, na 60 MP kwa dakika 30. Wakati wa kufungasha, mtetemo wa mitambo ulitumika kwa vishikio viwili vya safu wima vya GC (Alltech, Deerfield, IL, Marekani) ili kuhakikisha ufungashaji sawa wa safu wima. Funga kifungashio cha tope na uachilie shinikizo polepole ili kuzuia uharibifu wowote ndani ya safu wima. Tenganisha safu wima kutoka kwa kitengo cha kufungashia tope na uunganishe kifungashio kingine kwenye ingizo na kwenye mfumo wa LC ili kuangalia ikiwa utendaji.
Pampu ya LC (10AD Shimadzu, Japani), sindano (Valco (USA) C14 W.05) yenye kitanzi cha sindano cha 50nL, degasser ya utando (Shimadzu DGU-14A), dirisha la kapilari la UV-VIS lilijengwa. Kigunduzi maalum cha kifaa cha µLC (UV-2075) na safu ndogo zilizofunikwa kwa glasi. Tumia mirija nyembamba sana na fupi ya kuunganisha ili kupunguza athari ya upanuzi wa bendi ya ziada ya safu. Baada ya kufungasha, kapilari (50 μm id 365 na kapilari za muungano zinazopunguza (50 μm) ziliwekwa kwenye sehemu ya kutolea nje ya inchi 1/16 ya muungano unaopunguza. Ukusanyaji wa data na usindikaji wa kromatografiki ulifanyika kwa kutumia programu ya Multichro 2000. Ufuatiliaji katika 254 nm Analytes ulijaribiwa kwa unyonyaji wa UV. Data ya kromatografiki ilichambuliwa na OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumini kutoka kwa seramu ya binadamu, unga uliochanganywa na lyofili, ≥ 96% (electrophoresis ya jeli ya agarose) 3 mg iliyochanganywa na trypsin (1.5 mg), 4.0 M urea (1 mL), na 0.2 M ammonium bikaboneti (1 mL). Mmumunyo ulichanganywa kwa dakika 10 na kuwekwa kwenye maji ya kuogea kwa nyuzi joto 37 kwa saa 6, kisha ukawashwa na 1 mL ya 0.1% TFA. Chuja mchanganyiko na uhifadhi chini ya nyuzi joto 4.
Mgawanyo wa michanganyiko ya peptidi na usagaji wa tripsini ya HSA ulitathminiwa kando kwenye safu wima za PMP. Angalia mgawanyo wa mchanganyiko wa peptidi na usagaji wa tripsini ya HSA kwa safu wima ya PMP na ulinganishe matokeo na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide. Nambari ya bamba la kinadharia imehesabiwa kama ifuatavyo:
Picha za SEM za chembe za silika tupu na chembe za silika zilizounganishwa na ligand zinaonyeshwa kwenye Mchoro 2. Picha za SEM za chembe za silika tupu (A, B) zinaonyesha kwamba, tofauti na tafiti zetu za awali, chembe hizi ni za duara ambapo chembe hizo zimerefushwa au zina ulinganifu usio wa kawaida. Uso wa chembe za silika zilizounganishwa na ligand (C, D) ni laini kuliko ule wa chembe za silika tupu, ambazo zinaweza kuwa kutokana na mipako ya minyororo ya polistirini kwenye uso wa chembe za silika.
Kuchanganua picha za darubini ya elektroni za chembe tupu za silika (A, B) na chembe za silika zilizounganishwa na ligandi (C, D).
Usambazaji wa ukubwa wa chembe za chembe za silika tupu na chembe za silika zilizounganishwa na ligand zinaonyeshwa kwenye Mchoro 3(A). Mikunjo ya usambazaji wa ukubwa wa chembe inayotegemea ujazo ilionyesha kuwa ukubwa wa chembe za silika uliongezeka baada ya marekebisho ya kemikali (Mchoro 3A). Data ya usambazaji wa ukubwa wa chembe za chembe za silika kutoka kwa utafiti wa sasa na utafiti uliopita inalinganishwa katika Jedwali 1(A). Ukubwa wa chembe inayotegemea ujazo, d(0.5), wa PMP ni 3.36 μm, ikilinganishwa na utafiti wetu wa awali wenye thamani ya ad(0.5) ya 3.05 μm (chembe za silika zilizounganishwa na polystyrene)34. Kundi hili lilikuwa na usambazaji mdogo wa ukubwa wa chembe ikilinganishwa na utafiti wetu wa awali kutokana na uwiano tofauti wa PEG, urea, TMOS, na asidi asetiki katika mchanganyiko wa mmenyuko. Ukubwa wa chembe wa awamu ya PMP ni mkubwa kidogo kuliko ule wa awamu ya chembe za silika zilizounganishwa na polystyrene tuliyosoma hapo awali. Hii ina maana kwamba utendaji kazi wa uso wa chembe za silika zenye styrene uliweka safu ya polystyrene pekee (0.97 µm) kwenye uso wa silika, ilhali katika awamu ya PMP unene wa safu ulikuwa 1.38 µm.
Usambazaji wa ukubwa wa chembe (A) na usambazaji wa ukubwa wa vinyweleo (B) vya chembe tupu za silika na chembe za silika zilizofungwa na ligandi.
Ukubwa wa vinyweleo, ujazo wa vinyweleo na eneo la uso wa chembe za silika za utafiti wa sasa zimetolewa katika Jedwali 1(B). Wasifu wa PSD wa chembe za silika tupu na chembe za silika zilizounganishwa na ligand zinaonyeshwa katika Mchoro 3(B). Matokeo yanafanana na utafiti wetu uliopita. Ukubwa wa vinyweleo vya chembe za silika tupu na zilizounganishwa na ligand ni 310 na 241, mtawalia, ambayo inaonyesha kwamba ukubwa wa vinyweleo hupungua kwa 69 baada ya marekebisho ya kemikali, kama inavyoonyeshwa katika Jedwali 1(B), na mabadiliko ya mkunjo yanaonyeshwa katika Mchoro 3(B). Vivyo hivyo, ujazo wa vinyweleo vya chembe za silika ulipungua kutoka 0.67 hadi 0.58 cm3/g baada ya marekebisho ya kemikali. Eneo maalum la uso wa chembe za silika zilizosomwa kwa sasa ni 116 m2/g, ambalo linalingana na utafiti wetu wa awali (124 m2/g). Kama inavyoonyeshwa katika Jedwali 1(B), eneo la uso (m2/g) la chembe za silika pia lilipungua kutoka 116 m2/g hadi 105 m2/g baada ya marekebisho ya kemikali.
Matokeo ya uchambuzi wa elementi wa awamu ya sasa isiyobadilika yanaonyeshwa katika Jedwali la 2. Upakiaji wa kaboni wa awamu ya sasa isiyobadilika ni 6.35%, ambayo ni chini kuliko upakiaji wa kaboni wa utafiti wetu uliopita (chembe za silika zilizounganishwa na polystyrene, 7.93%35 na 10.21%, mtawalia) 42. Upakiaji wa kaboni wa awamu ya sasa isiyobadilika ni mdogo, Kwa sababu katika utayarishaji wa SP ya sasa, pamoja na styrene, baadhi ya ligandi za polar kama vile phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) na 4-hydroxy-TEMPO zilitumika. Asilimia ya uzito wa nitrojeni ya awamu ya sasa isiyobadilika ni 2.21%, ikilinganishwa na 0.1735 na 0.85% kwa uzito wa nitrojeni katika masomo ya awali, mtawalia. Hii ina maana kwamba % ya uzito wa nitrojeni ni kubwa zaidi katika awamu ya sasa isiyobadilika kutokana na phenylmaleimide. Vile vile, upakiaji wa kaboni wa bidhaa (4) na (5) ulikuwa 2.7% na 2.9%, mtawalia, huku Upakiaji wa kaboni wa bidhaa ya mwisho (6) ulikuwa 6.35%, kama inavyoonyeshwa kwenye Jedwali la 2. Kupunguza uzito kuliangaliwa kwa awamu ya PMP isiyosimama, na mkunjo wa TGA unaonyeshwa kwenye Mchoro 4. Mkunjo wa TGA unaonyesha kupungua kwa uzito kwa 8.6%, ambayo inalingana vyema na upakiaji wa kaboni (6.35%) kwa sababu ligandi hazina C pekee bali pia N, O, na H.
Ligand ya phenylmaleimide-methylvinylisocyanate ilichaguliwa kwa ajili ya urekebishaji wa uso wa chembe za silika kwa sababu ina vikundi vya phenylmaleimide vya polar na vikundi vya vinylisocyanate. Vikundi vya isocyanate vya vinyl vinaweza kuguswa zaidi na styrene kwa upolimishaji hai wa radical. Sababu ya pili ni kuingiza kikundi ambacho kina mwingiliano wa wastani na analyte na hakuna mwingiliano mkubwa wa umeme kati ya analyte na awamu ya stationary, kwa kuwa sehemu ya phenylmaleimide haina chaji pepe kwenye pH ya kawaida. Polarity ya awamu ya stationary inaweza kudhibitiwa kwa kiwango bora cha styrene na muda wa mmenyuko wa upolimishaji wa radical huru. Hatua ya mwisho ya mmenyuko (upolimishaji wa radical huru) ni muhimu na inaweza kubadilisha polarity ya awamu ya stationary. Uchambuzi wa elementi ulifanywa ili kuangalia mzigo wa kaboni wa awamu hizi za stationary. Ilibainika kuwa kuongeza kiasi cha styrene na muda wa mmenyuko kuliongeza mzigo wa kaboni wa awamu ya stationary na kinyume chake. SP zilizoandaliwa na viwango tofauti vya styrene zina mzigo tofauti wa kaboni. Tena, pakia awamu hizi za stationary kwenye chuma cha pua. safu wima na kuangalia utendaji wao wa kromatografi (uchaguzi, azimio, thamani ya N, n.k.). Kulingana na majaribio haya, uundaji ulioboreshwa ulichaguliwa ili kuandaa awamu ya PMP isiyobadilika ili kuhakikisha polarity iliyodhibitiwa na uhifadhi mzuri wa uchanganuzi.
Michanganyiko mitano ya peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) pia ilitathminiwa kwa kutumia safu wima ya PMP kwa kutumia awamu inayosogea; 60/40 (v/v) asetonitrile/maji (0.1% TFA) kwa kiwango cha mtiririko cha 80 μL/dakika. Chini ya hali bora ya uondoaji, nambari ya kinadharia ya sahani (N) kwa kila safu (100 × 1.8 mm id) ni 20,000 ± 100 (sahani 200,000/m²). Jedwali la 3 linatoa thamani za N kwa safu tatu za PMP na kromatogramu zinaonyeshwa kwenye Mchoro 5A. Uchambuzi wa haraka kwenye safu ya PMP kwa kiwango cha juu cha mtiririko (700 μL/dakika), peptidi tano ziliondolewa ndani ya dakika moja, thamani za N zilikuwa nzuri sana, 13,500 ± 330 kwa kila safu (100 × 1.8 mm id), Inalingana na sahani 135,000/m2 (Mchoro 5B). Safu tatu za ukubwa sawa (100 × 1.8 mm id) zilijaa sehemu tatu tofauti za awamu ya PMP iliyosimama ili kuangalia. urejeleaji. Mkusanyiko wa uchanganuzi kwa kila safu ulirekodiwa kwa kutumia hali bora za ueleweshaji na idadi ya mabamba ya kinadharia N na muda wa kuhifadhi ili kutenganisha mchanganyiko sawa wa jaribio kwenye kila safu. Data ya urejeleaji kwa safu wima za PMP imeonyeshwa katika Jedwali la 4. Urejeleaji wa safu wima ya PMP unahusiana vyema na thamani za chini sana za %RSD, kama inavyoonyeshwa katika Jedwali la 3.
Mgawanyiko wa mchanganyiko wa peptidi kwenye safu wima ya PMP (B) na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide (A); awamu inayotembea 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), vipimo vya safu wima ya PMP (100 × 1.8 mm id); uchambuzi Mpangilio wa utatuzi wa misombo: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) na 5 (leusini) asidi enkephalin)).
Safu wima ya PMP (100 × 1.8 mm id) ilitathminiwa kwa ajili ya kutenganisha mirija ya tryptic ya albino ya seramu ya binadamu katika kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa juu. Kromatografia katika Mchoro 6 inaonyesha kuwa sampuli imetenganishwa vizuri na azimio ni nzuri sana. Mirija ya HSA ilichambuliwa kwa kutumia kiwango cha mtiririko cha 100 µL/min, awamu ya kuhama 70/30 asetonitrile/maji na 0.1% TFA. Kama inavyoonyeshwa kwenye kromatografia (Mchoro 6), usagaji wa HSA umegawanywa katika vilele 17 vinavyolingana na peptidi 17. Ufanisi wa utenganishaji wa kila kilele katika mirija ya HSA ulihesabiwa na thamani zimetolewa katika Jedwali 5.
Kiwango cha tryptic cha HSA (100 × 1.8 mm id) kilitenganishwa kwenye safu wima ya PMP; kiwango cha mtiririko (100 µL/dakika), awamu ya kuhama ya asetonitrile 60/40/maji yenye 0.1% TFA.
ambapo L ni urefu wa safu, η ni mnato wa awamu inayotembea, ΔP ni shinikizo la nyuma la safu, na u ni kasi ya mstari wa awamu inayotembea. Upenyezaji wa safu wima ya PMP ulikuwa 2.5 × 10-14 m2, kiwango cha mtiririko kilikuwa 25 μL/min, na 60/40 v/v ACN/maji ilitumika. Upenyezaji wa safu wima ya PMP (100 × 1.8 mm id) ulikuwa sawa na ule wa utafiti wetu uliopita Ref.34. Upenyezaji wa safu wima iliyojaa chembe zenye vinyweleo vya juu juu ni: 1.7 × 10-15 kwa chembe za 1.3 μm, 3.1 × 10-15 kwa chembe za 1.7 μm, 5.2 × 10-15 na 2.5 × 10-14 m2 kwa chembe za 2.6 μm. Kwa chembe za 5 μm. 43. Kwa hivyo, upenyezaji wa awamu ya PMP ni sawa na ule wa chembe za ganda la msingi la 5 μm.
ambapo Wx ni uzito wa safu iliyojaa klorofomu, Wy ni uzito wa safu iliyojaa methanoli, na ρ ni msongamano wa kiyeyusho. Uzito wa methanoli (ρ = 0.7866) na klorofomu (ρ = 1.484). Jumla ya unyeyusho wa nguzo za SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 na nguzo za C18-Urea 31 ambazo tulizisoma hapo awali zilikuwa 0.63 na 0.55, mtawalia. Hii ina maana kwamba uwepo wa ligandi za urea hupunguza unyeyusho wa awamu ya stationary. Kwa upande mwingine, jumla ya unyeyusho wa safu wima ya PMP (100 × 1.8 mm id) ni 0.60. Unyeyusho wa nguzo za PMP ni mdogo kuliko ule wa nguzo zilizojaa chembe za silika zilizounganishwa na C18 kwa sababu katika awamu za stationary za aina ya C18 ligandi za C18 zimeunganishwa na chembe za silika kama minyororo ya mstari, huku katika awamu za stationary za aina ya polystyrene, A yenye unene kiasi. Safu ya polima huundwa kuizunguka. Katika jaribio la kawaida, unyeyuko wa safu huhesabiwa kama:
Mchoro 7A,B unaonyesha safu wima ya PMP (kitambulisho cha 100 × 1.8 mm) na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide (kitambulisho cha 100 × 1.8 mm) kwa kutumia hali sawa za utatuzi (yaani, 60/40 ACN/H2O na 0.1% TFA). ) ya ploti ya van Deemter. Michanganyiko ya peptidi iliyochaguliwa (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ilitayarishwa katika 20 µL/ Kiwango cha chini cha mtiririko kwa safu zote mbili ni 800 µL/dakika. Thamani za chini kabisa za HETP kwa kiwango bora cha mtiririko (80 µL/dakika) kwa safu wima ya PMP na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide zilikuwa 2.6 µm na 3.9 µm, mtawalia. Thamani za HETP zinaonyesha kuwa ufanisi wa utengano wa safu wima ya PMP (100 × 1.8 mm id) ni bora zaidi kuliko safu wima ya Ascentis Express RP-Amide inayopatikana kibiashara (100 × 1.8 mm id). Mchoro wa van Deemter katika Mchoro 7(A) unaonyesha kuwa kupungua kwa thamani ya N kwa mtiririko unaoongezeka si muhimu ikilinganishwa na utafiti wetu uliopita. Ufanisi mkubwa zaidi wa utengano wa safu wima ya PMP (100 × 1.8 mm id) ikilinganishwa na safu wima ya Ascentis Express RP-Amide inategemea maboresho katika umbo la chembe, ukubwa, na taratibu changamano za kufungasha safu wima zinazotumika katika kazi ya sasa34.
(A) njama ya van Deemter (kasi ya mstari ya HETP dhidi ya awamu ya simu) iliyopatikana kwa kutumia safu wima ya PMP (kitambulisho cha 100 × 1.8 mm) katika 60/40 ACN/H2O yenye 0.1% TFA.(B) njama ya van Deemter (kasi ya mstari ya mstari ya awamu ya simu) iliyopatikana kwa kutumia safu wima ya Ascentis Express RP-Amide (kitambulisho cha 100 × 1.8 mm) katika 60/40 ACN/H2O yenye 0.1% TFA.
Awamu ya polima iliyopachikwa polima iliandaliwa na kutathminiwa kwa ajili ya kutenganisha michanganyiko ya peptidi sanisi na usagaji wa tripsini ya albino ya seramu ya binadamu (HAS) katika kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa juu. Utendaji wa kromatografia wa nguzo za PMP kwa michanganyiko ya peptidi ni bora katika ufanisi na utatuzi wa utenganishaji. Utendaji ulioboreshwa wa utenganishaji wa nguzo za PMP unatokana na sababu mbalimbali, kama vile ukubwa wa chembe na ukubwa wa vinyweleo vya chembe za silika, usanisi uliodhibitiwa wa awamu ya stationary, na ufungashaji tata wa nguzo. Mbali na ufanisi mkubwa wa utenganishaji, shinikizo la chini la nyuma la nguzo kwa viwango vya juu vya mtiririko ni faida nyingine ya awamu hii ya stationary. Nguzo za PMP zinaonyesha urejelezaji mzuri na zinaweza kutumika kwa uchambuzi wa michanganyiko ya peptidi na usagaji wa tripsini wa protini mbalimbali. Tunakusudia kutumia safu hii kwa ajili ya kutenganisha bidhaa asilia, misombo hai ya kibiolojia kutoka kwa mimea ya dawa na dondoo za kuvu katika kromatografia ya kioevu. Katika siku zijazo, nguzo za PMP pia zitatathminiwa kwa ajili ya kutenganisha protini na kingamwili za monokloni.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Utafiti kuhusu Mifumo ya Utenganishaji wa Peptidi kwa Kromatografia ya Awamu Iliyogeuzwa Sehemu ya I: Ukuzaji wa Itifaki ya Uainishaji wa Safu.J. Kromatografia.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Peptidi hai zilizoboreshwa zilizoundwa kwa ajili ya matibabu ya magonjwa ya kuambukiza. Bioteknolojia.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptidi za tiba sanisi: sayansi na soko. ugunduzi wa dawa.15 (1-2) leo, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografia ya Kioevu ya Proteomiki ya Juu.J. Kromatografia.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kipengele cha hali ya juu cha kromatografia ya kioevu-spektrometria ya wingi huwezesha kuingizwa kwa metabolomiki zilizolengwa kwa upana na proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Jukumu la UHPLC katika ukuzaji wa dawa.J. Septemba. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Vipengele vya msingi na vitendo vya kromatografia ya kioevu yenye shinikizo kubwa kwa ajili ya utenganishaji wa haraka.J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Matumizi ya kromatografia ya kioevu yenye utendaji wa hali ya juu sana katika utengenezaji wa dawa.J. Kromatografia.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrojeli zenye vinyweleo vingi vya monolithic zilizotayarishwa kutoka kwa emulsions za awamu ya ndani ya mafuta-ndani-ya-maji kwa ajili ya utakaso bora wa enterovirusi.Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Jukumu la kromatografia ya kioevu katika proteomics.J. Kromatografia.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Mitindo inayoibuka katika utenganishaji wa kromatografia ya kioevu ya awamu iliyobadilishwa ya peptidi na protini za matibabu: nadharia na matumizi.J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Mgawanyiko wa peptidi zenye pande mbili kwa kutumia mfumo wa RP-RP-HPLC kwa kutumia thamani tofauti za pH katika vipimo vya kwanza na vya pili vya mgawanyo.J. Septemba. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Sifa za uhamisho wa wingi na utendaji wa kinetiki wa nguzo za kromatografia zenye ufanisi mkubwa zilizojaa chembe ndogo za C18 μm zenye vinyweleo kamili na vya juu juu zilichunguzwa. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Mitindo ya hivi karibuni na changamoto za uchambuzi katika utenganishaji, utambuzi na uthibitishaji wa peptidi hai za mimea. anus. biological mkundu.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Mandhari ya proteomiki ya ufalme wa uzima.Asili 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Usindikaji wa chini wa peptidi za matibabu kwa kutumia kromatografia ya kioevu ya maandalizi. Molekuli (Basel, Uswisi) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografia ya hali mchanganyiko na matumizi yake kwa biopolimia.J. Kromatografia.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands kwa kromatografia ya protini ya hali mchanganyiko: kanuni, uainishaji, na muundo.J. Bioteknolojia.144(1), 3-11 (2009).