Ẹ ṣeun fún ṣíbẹ̀wò sí Nature.com. Ẹ̀yà ẹ̀rọ ìṣàwárí tí ẹ ń lò ní àtìlẹ́yìn díẹ̀ fún CSS. Fún ìrírí tí ó dára jùlọ, a gbà yín nímọ̀ràn pé kí ẹ lo ẹ̀rọ ìṣàwárí tí a ti mú gbóná (tàbí kí ẹ pa ipò ìbáramu nínú Internet Explorer). Ní ​​àkókò yìí, láti rí i dájú pé a ń tẹ̀síwájú láti ṣe àtìlẹ́yìn, a ó máa fi ojú-ọ̀nà náà hàn láìsí àwọn àṣà àti JavaScript.
A ṣe àwọn èròjà silica oníhò pẹ̀lú ọ̀nà sol-gel pẹ̀lú àwọn àtúnṣe díẹ̀ láti gba àwọn èròjà macroporous. A ṣe àwọn èròjà wọ̀nyí nípa lílo polymerization àfikún ìfọ́mọ́ra ẹ̀wọ̀n (RAFT) pẹ̀lú N-phenylmaleemide-methylvinylisocyanate (PMI) àti styrene láti pèsè ìsopọ̀ N-phenylmaleemide ti polystyrene (PMP) stainless phase. A fi àwọn ọ̀wọ́n irin alagbara tí ó ní dínkù (100 × 1.8 mm id) dí wọn nípa lílo slurry packing. A ṣe àyẹ̀wò ìyàsọ́tọ̀ ọ̀wọ̀n PMP ti adalu peptide kan tí ó ní àwọn peptide márùn-ún (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) àti ìjẹun trypsin ti albumin serum ènìyàn (HAS). Lábẹ́ àwọn ipò ìtújáde tí ó dára jùlọ, iye àwo ìjìnlẹ̀ ti adalu peptide náà ga tó àwọn àwo 280,000/m². Ní ìfiwéra iṣẹ́ ìyàsọ́tọ̀ ti ọ̀wọ̀n tí a ti ṣe àgbékalẹ̀ Pẹ̀lú ọ̀wọ́n Ascentis Express RP-Amide ti ìṣòwò, a ṣàkíyèsí pé iṣẹ́ ìpínyà ti ọ̀wọ́n PMP ga ju ọ̀wọ́n ìṣòwò lọ ní ti iṣẹ́ ìyàsọ́tọ̀ àti ìpinnu.
Ní àwọn ọdún àìpẹ́ yìí, ilé iṣẹ́ biopharmaceutical ti di ọjà àgbáyé tó ń gbòòrò sí i pẹ̀lú ìbísí nínú ìpín ọjà. Pẹ̀lú ìdàgbàsókè tó lágbára ti ilé iṣẹ́ biopharmaceutical1,2,3, ìwádìí àwọn peptides àti proteins ni a fẹ́ gidigidi. Yàtọ̀ sí peptide tí a fẹ́, ọ̀pọ̀lọpọ̀ àìmọ́ ni a ń ṣẹ̀dá nígbà ìṣẹ̀dá peptide, èyí tó ń béèrè fún ìwẹ̀nùmọ́ chromatographic láti gba àwọn peptides ti ìwẹ̀nùmọ́ tí a fẹ́. Ìwádìí àti ìṣàfihàn àwọn protein nínú omi ara, àsopọ ara àti sẹ́ẹ̀lì jẹ́ iṣẹ́ tó ṣòro gan-an nítorí iye àwọn ẹ̀yà tó ṣeé ṣe kí a rí nínú àyẹ̀wò kan ṣoṣo. Bó tilẹ̀ jẹ́ pé mass spectrometry jẹ́ ohun èlò tó munadoko fún ìtẹ̀lé peptide àti protein, tí a bá fi irú àwọn àpẹẹrẹ bẹ́ẹ̀ sínú mass spectrometer ní ìgbà kan ṣoṣo, ìyàsọ́tọ̀ náà kò ní dára. A lè dín ìṣòro yìí kù nípa ṣíṣe àwọn ìyàsọ́tọ̀ liquid chromatography (LC) kí a tó ṣe àyẹ̀wò MS, èyí tí yóò dín iye àwọn analytes tí ń wọ mass spectrometer kù ní àkókò kan pàtó4,5,6. Ní àfikún, nígbà ìyàsọ́tọ̀ liquid phase, a lè dojúkọ àwọn analytes ní àwọn agbègbè tó kéré, nípa bẹ́ẹ̀, a lè gbá àwọn analytes wọ̀nyí mọ́ra àti láti mú kí ìwádìí MS sunwọ̀n sí i. ìfàmọ́ra.Ìṣàyẹ̀wò chromatography omi (LC) ti lọ síwájú gidigidi ní ọdún mẹ́wàá tó kọjá, ó sì ti di ọ̀nà tó gbajúmọ̀ nínú ìṣàyẹ̀wò proteomic7,8,9,10.
A lo chromatography omi ti a yipada (RP-LC) fun mimọ ati pipin awọn adalu peptide nipa lilo silica ti a ṣe atunṣe octadecyl (ODS) gẹgẹbi ipele iduro11,12,13. Sibẹsibẹ, awọn ipele iduro RP ko pese ipinya ti o ni itẹlọrun ti awọn peptides ati awọn ọlọjẹ nitori eto idiju wọn ati iseda amphiphilic 14,15. Nitorinaa, awọn ipele iduro pataki ni a nilo lati ṣe itupalẹ awọn peptides ati awọn ọlọjẹ pẹlu awọn apakan polar ati ti kii ṣe polar lati ṣe ajọṣepọ pẹlu ati idaduro awọn itupalẹ wọnyi16. Chromatography ipo adalu, eyiti o pese awọn ibaraẹnisọrọ multimodal, le jẹ yiyan si RP-LC fun ipinya awọn peptides, awọn ọlọjẹ, ati awọn adalu idiju miiran. Ọpọlọpọ awọn ipele iduro adalu ti a ti pese, ati awọn ọwọn ti a fi awọn ipele wọnyi kun ti lo fun awọn ipinya peptide ati amuaradagba17,18,19,20,21. Awọn ipele iduro ipo adalu (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalation polar/RPLC) dara fun peptide ati amuaradagba Àwọn ìyàsọ́tọ̀ nítorí wíwà àwọn ẹgbẹ́ polar àti àwọn ẹgbẹ́ tí kì í ṣe polar22,23,24,25,26,27,28. Bákan náà, àwọn ìpele ìdúró polar pẹ̀lú àwọn ẹgbẹ́ polar tí a so pọ̀ ní covalent fi agbára ìyàsọ́tọ̀ tí ó dára hàn àti yíyàn aláìlẹ́gbẹ́ fún àwọn olùṣàyẹ̀wò polar àti àwọn tí kì í ṣe polar, nítorí pé ìyàsọ́tọ̀ sinmi lórí ìbáṣepọ̀ láàárín olùṣàyẹ̀wò àti ìpele ìdúró. Àwọn ìbáṣepọ̀ multimodal 29, 30, 31, 32. Láìpẹ́ yìí, Zhang àti àwọn ẹlòmíràn. 30 pèsè àkójọpọ̀ polyamine tí a ti parí pẹ̀lú dodecyl àti yíyà àwọn hydrocarbons, antidepressants, flavonoids, nucleosides, estrogens, àti ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn analytes mìíràn sọ́tọ̀ ní àṣeyọrí. Agbègbè ìsopọ̀ polar ní àwọn ẹgbẹ́ polar àti non-polar, nítorí náà a lè lò ó láti ya àwọn peptides àti àwọn protein tí wọ́n ní àwọn èròjà hydrophobic àti hydrophilic sọ́tọ̀. Àwọn ọ̀wọ́n tí a ti embedded polar (fún àpẹẹrẹ, àwọn ọ̀wọ́n C18 tí a ti amide embedded) wà ní ọjà lábẹ́ orúkọ ìṣòwò Ascentis Express RP-Amide columns, ṣùgbọ́n àwọn ọ̀wọ́n wọ̀nyí ni a lò fún ìṣàyẹ̀wò amine 33 nìkan.
Nínú ìwádìí lọ́wọ́lọ́wọ́, a pèsè ìpele ìdádúró polar-embedded (N-phenylmaleimide-embedded polystyrene) tí a sì ṣe àyẹ̀wò rẹ̀ fún ìyàsọ́tọ̀ àwọn peptides àti trypsin digests ti HSA. A pèsè ìpele ìdádúró nípa lílo ìlànà tó tẹ̀lé yìí. A pèsè àwọn patiku silica oníhò gẹ́gẹ́ bí ìlànà tí a fún wa nínú ìtẹ̀jáde wa tẹ́lẹ̀ pẹ̀lú àwọn àtúnṣe sí ìlànà ìṣètò. A ṣe àtúnṣe ìpíndọ́gba urea, polyethylene glycol (PEG), TMOS, omi acetic acid láti pèsè àwọn patiku silica pẹ̀lú ìwọ̀n ihò ńlá. Èkejì, a ṣe àgbékalẹ̀ ligand tuntun kan, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, a sì lò ó láti yọ àwọn patiku silica jáde láti pèsè ìpele ìdádúró polar kan. A kó ìpele ìdádúró tí ó yọrí sí sínú ọ̀wọ̀n irin alagbara (100 × 1.8 mm id) nípa lílo ètò ìpapọ̀ tí a ti mú dara síi. A ṣe ìrànlọ́wọ́ fún ìpapọ̀ ọ̀wọ̀n náà pẹ̀lú ìgbóná ẹ̀rọ láti rí i dájú pé a ṣe ìpele kan tí ó jọra láàrín ọ̀wọ̀n náà. Ṣe àyẹ̀wò ìyàsọ́tọ̀ ọ̀wọ̀n tí a kó jọ ti àwọn adalu peptide tí ó ní peptide márùn-ún; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) àti Trypsin digest ti albumin serum ènìyàn (HAS). A ṣe àkíyèsí pé àdàpọ̀ peptide àti trypsin digest ti HSA ya sọ́tọ̀ pẹ̀lú ìpinnu àti ìṣiṣẹ́ tó dára. A fi iṣẹ́ ìyàsọ́tọ̀ ti PMP wé ti Ascentis Express RP-Amide. A rí i pé àwọn peptide àti àwọn protein méjèèjì yanjú dáadáa wọ́n sì ṣiṣẹ́ dáadáa lórí PMP, èyí tó gbéṣẹ́ ju ti Ascentis Express RP-Amide lọ.
PEG (Polyethylene Glycol), Urea, Acetic Acid, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Trypsin, Human Serum Albumin (HSA), Ammonium Chloride, Urea, Hexane Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Chloride (MC), Styrene, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), HPLC Grade Acetonitrile (ACN), Methanol, 2-Propanol, àti Acetone. A rà á láti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
A da adalu urea (8 g), polyethylene glycol (8 g), ati 8 mL ti 0.01 N acetic acid pò fun iṣẹju mẹwa, lẹhinna a fi 24 mL ti TMOS kun un labẹ awọn ipo otutu ti yinyin. A mu adalu naa gbona ni 40°C fun wakati mẹfa lẹhinna ni 120°C fun wakati mẹjọ ninu autoclave irin alagbara kan. A da omi naa kuro a si gbẹ ohun ti o ku ni 70°C fun wakati 12. A lọ ibi-ara rirọ gbigbẹ naa dan ninu adiro a si fi calcine si ni 550°C fun wakati 12. A pese awọn ipele mẹta ati ṣe apejuwe lati ṣe ayẹwo bi a ṣe le ṣe atunṣe ni iwọn awọn patiku, iwọn awọn iho ati agbegbe oju.
Nípa ṣíṣe àtúnṣe ojú ilẹ̀ àwọn èròjà silica pẹ̀lú ligand phenylmaleimide-methylvinylisocyanate tí a ti ṣe àtúnṣe tẹ́lẹ̀ (PCMP) pẹ̀lú radial polymerization pẹ̀lú styrene, a pèsè èròjà kan tí ó ní ẹgbẹ́ polar. Ìpele ìdúró fún àwọn àkójọpọ̀ àti àwọn ẹ̀wọ̀n polystyrene. A ṣàlàyé ìlànà ìmúrasílẹ̀ ní ìsàlẹ̀ yìí.
A tú N-phenylmaleimide (200 mg) àti methyl vinyl isocyanate (100 mg) sínú toluene gbígbẹ, a sì fi 0.1 mL ti 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) kún inú ìgò ìṣe láti ṣe phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate copolymer (PMCP). A gbóná àdàpọ̀ náà ní 60°C fún wákàtí mẹ́ta, a yọ́ ọ, a sì gbẹ ẹ́ nínú ààrò ní 40°C fún wákàtí mẹ́ta.
A tú àwọn èròjà silica gbígbẹ (2 g) ká sínú toluene gbígbẹ (100 mL), a rú wọn, a sì fi wọ́n sínú ìgò ìsàlẹ̀ yíká 500 mL fún ìṣẹ́jú 10. A tú PMCP (10 mg) sínú toluene, a sì fi kún un sínú ìgò ìṣẹ́jú náà nípasẹ̀ ìgò ìṣàn omi. A tú àdàpọ̀ náà padà sí 100°C fún wákàtí 8, a yọ́ wọ́n, a sì fi acetone wẹ̀ wọ́n, a sì gbẹ wọ́n ní 60°C fún wákàtí 3. Lẹ́yìn náà, a tú àwọn èròjà silica tí a so mọ́ PMCP (100 g) sínú toluene (200 ml) a sì fi 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) kún un ní iwájú 100 µL ti dibutyltin dilaurate gẹ́gẹ́ bí ohun tí ó ń mú kí ó ṣiṣẹ́. A rú àdàpọ̀ náà ní 50°C fún wákàtí 8, a yọ́ wọ́n, a sì gbẹ wọ́n ní 50°C fún wákàtí 3.
A tú Styrene (1 mL), benzoyl peroxide BPO (0.5 mL), àti àwọn èròjà silica tí a so mọ́ TEMPO-PMCP (1.5 g) ká sínú toluene a sì fi nitrogen wẹ̀ wọ́n. A ṣe polymerization ti styrene ní 100°C fún wákàtí 12. A fi methanol fọ ọjà tí ó jáde, a sì gbẹ ẹ́ ní 60°C ní alẹ́ kan. Ètò ìṣe gbogbogbòò ni a fihàn nínú Àwòrán 1.
A yọ awọn ayẹwo naa kuro ni 393 K fun wakati kan lati gba titẹ ti o ku ti o kere ju 10-3 Torr. A lo iye N2 ti a fa sinu titẹ ibatan ti P/P0 = 0.99 lati pinnu iwọn didun gbogbo iho. A ṣe ayẹwo apẹrẹ awọn patikulu silica ti ko ni ati ti a so pọ mọ ligand pẹlu ohun elo ọlọjẹ elekitironi (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japan). A gbe awọn ayẹwo gbigbẹ (awọn patikulu silica ti ko ni ati awọn patikulu silica ti a so pọ mọ ligand) sori ọwọn aluminiomu nipa lilo teepu elekitironi. A fi wura bo awọn ayẹwo nipa lilo awọ-ara sputter Q150T, a si fi fẹlẹfẹlẹ Au 5 nm sori awọn ayẹwo naa. Eyi mu ṣiṣe ilana dara si nipa lilo awọn foliteji kekere ati pese ọkà ti o dara, sputtering tutu. A lo ohun elo itupalẹ elekitironi Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 fun itupalẹ elekitironi. A lo ohun elo itupalẹ iwọn particle 2000 Mastersizer lati gba pinpin iwọn particle. Silica ti ko ni ina A fọ́n àwọn èròjà àti àwọn èròjà sílíkà tí a so mọ́ ligand (5 mg ọ̀kọ̀ọ̀kan) ká sínú 5 mL ti isopropanol, a fi sonicated fún ìṣẹ́jú 10, a fi vortexed fún ìṣẹ́jú 5, a sì gbé e sí orí àga ìfọ́mọ́ra ti Mastersizer. A ṣe àyẹ̀wò thermogravimetric ní ìwọ̀n 5 °C fún ìṣẹ́jú kan lórí ìwọ̀n otútù 30 sí 800 °C.
A fi irin alagbara tí a fi gilasi ṣe àwọn ọ̀wọ́n tóóró tí a fi ìwọ̀n wọn ṣe (100 × 1.8 mm id) di wọn nípa lílo ọ̀nà ìdìpọ̀ slurry, a sì lo ìlànà kan náà tí a lò nínú Ref. 31. A so ọ̀wọ̀n irin alagbara kan (tí a fi gilasi ṣe, 100 × 1.8 mm id) pẹ̀lú ohun èlò ìjáde tí ó ní frit 1 µm mọ́ ohun èlò ìjáde slurry kan (Alltech Deerfield, IL, USA). Ṣe àgbékalẹ̀ ohun èlò ìjáde stadion kan nípa dídúró 150 mg ti standalone phase ní 1.2 mL ti methanol kí o sì fi ránṣẹ́ sí ọ̀wọ̀n ìpamọ́. A lo Methanol gẹ́gẹ́ bí ohun èlò ìjáde slurry àti ohun èlò ìfàsẹ́yìn. Kún ọ̀wọ̀n náà ní ìtẹ̀léra nípa lílo àwọn ìfúnpọ̀ 100 MP fún ìṣẹ́jú 10, 80 MP fún ìṣẹ́jú 15, àti 60 MP fún ìṣẹ́jú 30. Nígbà ìṣàkójọpọ̀, a lo ìgbọ̀nsẹ̀ mechanical pẹ̀lú àwọn ohun èlò ìfàsẹ́yìn GC méjì (Alltech, Deerfield, IL, USA) láti rí i dájú pé ìṣàkójọpọ̀ náà dọ́gba. Ti ohun èlò ìjáde slurry náà kí o sì tú ìfúnpọ̀ náà sílẹ̀ díẹ̀díẹ̀ láti dènà ìbàjẹ́ èyíkéyìí nínú ọ̀wọ̀n náà. Já ọ̀wọ̀n náà kúrò nínú ẹ̀rọ ìṣàkójọ slurry náà kí o sì so ohun èlò mìíràn mọ́ inú àti sí ètò LC láti ṣàyẹ̀wò iṣẹ́ rẹ̀.
Pọ́ọ̀pù LC kan (10AD Shimadzu, Japan), abẹ́rẹ́ (Valco (USA) C14 W.05) pẹ̀lú ìlopo abẹrẹ 50nL, degasser membrane (Shimadzu DGU-14A), fèrèsé capillary UV-VIS ni a ṣe. A ṣe àyẹ̀wò ẹ̀rọ µLC Special µLC (UV-2075) àti àwọn microcolumns tí a fi gilasi ṣe. Lo àwọn ọ̀pọ́ ìsopọ̀ tí ó gùn gan-an àti kúkúrú láti dín ipa ìfọ́pọ̀ ìpele ọ̀pọ́lọ́n kù. Lẹ́yìn ìfipamọ́, a fi àwọn capillaries (50 μm id 365 àti àwọn capillaries undincing union (50 μm) sí ibi ìta 1/16″ ti undincing union. A ṣe ìkójọ dátà àti ṣíṣe chromatographic nípa lílo sọ́fítíwọ́ọ̀kì Multichro 2000. A ṣe àyẹ̀wò ní 254 nm Analytes fún ìfàmọ́ra UV. OriginPro8 (Northampton, MA) ṣe àyẹ̀wò dátà Chromatographic.
Albumin láti inú serum ènìyàn, lulú lyophilized, ≥ 96% (agarose gel electrophoresis) 3 mg tí a dàpọ̀ mọ́ trypsin (1.5 mg), 4.0 M urea (1 mL), àti 0.2 M ammonium bicarbonate (1 mL). A rú omi náà fún ìṣẹ́jú mẹ́wàá, a sì tọ́jú rẹ̀ sínú omi ní 37°C fún wákàtí mẹ́fà, lẹ́yìn náà a pa á pẹ̀lú 1 mL ti 0.1% TFA. Fi omi náà sẹ́ kí o sì tọ́jú rẹ̀ sí ibi tí ó wà ní ìsàlẹ̀ 4°C.
A ṣe àyẹ̀wò ìyàsọ́tọ̀ àwọn àdàpọ̀ peptide àti àwọn ìdìpọ̀ trypsin HSA lọ́tọ̀ọ̀tọ̀ lórí àwọn ọ̀wọ́n PMP. Ṣàyẹ̀wò ìyàsọ́tọ̀ àdàpọ̀ peptide àti ìdìpọ̀ trypsin ti HSA nípasẹ̀ ọ̀wọ́n PMP kí o sì fi àwọn èsì wé ọ̀wọ́n Ascentis Express RP-Amide. A ṣírò nọ́mbà àwo ìwádìí gẹ́gẹ́ bí a ṣe ń wí yìí:
Àwòrán SEM ti àwọn èròjà silica tí kò ní ìta àti àwọn èròjà silica tí a so mọ́ ligand ni a fihàn nínú ÀWÒRÁN 2. Àwòrán SEM ti àwọn èròjà silica tí kò ní ìta (A, B) fihàn pé, ní ìyàtọ̀ sí àwọn ìkẹ́kọ̀ọ́ wa tẹ́lẹ̀, àwọn èròjà wọ̀nyí jẹ́ oníyípo nínú èyí tí àwọn èròjà náà ti gùn tàbí tí wọ́n ní ìṣọ̀kan tí kò báramu. Ojú àwọn èròjà silica tí a so mọ́ ligand (C, D) jẹ́ dídán ju ti àwọn èròjà silica tí kò ní ìta lọ, èyí tí ó lè jẹ́ nítorí ìbòrí àwọn ẹ̀wọ̀n polystyrene lórí ojú àwọn èròjà silica.
Ṣíṣàyẹ̀wò àwòrán microscope elekitironi ti awọn patikulu silica ti ko ni siliki (A, B) ati awọn patikulu silica ti a so pọ mọ ligand (C, D).
A fi àwọn ìpínkiri iwọn patiku ti awọn patikulu silica ti ko ni igbo ati awọn patikulu silica ti a so mọ ligand han ni Aworan 3(A). Awọn ìlà pinpin iwọn patiku ti a so mọ patiku fihan pe iwọn awọn patikulu silica pọ si lẹhin iyipada kemikali (Fig. 3A). A fi data pinpin iwọn patiku ti awọn patikulu silica lati inu iwadi lọwọlọwọ ati iwadi ti tẹlẹ we ninu Tabili 1(A). Iwọn patiku ti a so mọ patiku, d(0.5), ti PMP jẹ 3.36 μm, ni akawe pẹlu iwadi wa ti tẹlẹ pẹlu iye ad(0.5) ti 3.05 μm (awọn patikulu silica ti a so mọ polystyrene)34. Ipele yii ni pinpin iwọn patiku ti o kere ju ti iwadi wa ti tẹlẹ lọ nitori awọn ipin oriṣiriṣi ti PEG, urea, TMOS, ati acetic acid ninu adalu iṣe. Iwọn patiku ti ipele PMP tobi diẹ ju ti ipele patiku silica ti a kọ tẹlẹ lọ. Eyi tumọ si pe iṣẹ ṣiṣe dada ti awọn patikulu silica pẹlu styrene nikan fi fẹlẹfẹlẹ polystyrene (0.97 µm) silẹ lori dada silica, lakoko ti o wa ninu Ìpele PMP ni sisanra fẹlẹfẹlẹ naa jẹ 1.38 µm.
Pínpín ìwọ̀n pàtákì (A) àti ìpínkiri ìwọ̀n ihò (B) ti àwọn pàtákì sílíkì tí kò ní àlàfo àti àwọn pàtákì sílíkì tí a so mọ́ lígáńdì.
Iwọn iho, iwọn iho ati agbegbe oju ti awọn patikulu silica ti iwadi lọwọlọwọ ni a fihan ni Tabili 1(B). Awọn profaili PSD ti awọn patikulu silica ti ko ni igbo ati awọn patikulu silica ti a so pọ mọ ligand ni a fihan ni Aworan 3(B). Awọn abajade jẹ afiwe si iwadi wa ti tẹlẹ. Awọn iwọn iho ti awọn patikulu silica ti ko ni igbo ati ti a so pọ mọ ligand jẹ 310 ati 241, lẹsẹsẹ, eyiti o tọka si pe iwọn iho dinku nipasẹ 69 lẹhin iyipada kemikali, gẹgẹbi a ti fihan ni Tabili 1(B), ati iyipada ti ila naa ni a fihan ni Aworan 3(B). Bakanna, iwọn iho ti awọn patikulu silica dinku lati 0.67 si 0.58 cm3/g lẹhin iyipada kemikali. Agbegbe oju pato ti awọn patikulu silica ti a kẹkọọ lọwọlọwọ jẹ 116 m2/g, eyiti o jẹ afiwe pẹlu iwadi wa ti tẹlẹ (124 m2/g). Gẹgẹbi a ti fihan ni Tabili 1(B), agbegbe oju (m2/g) ti awọn patikulu silica tun dinku lati 116 m2/g si 105 m2/g lẹ́yìn àtúnṣe kẹ́míkà.
Àwọn àbájáde ìṣàyẹ̀wò èròjà ti ìpele ìdádúró ni a fihàn nínú Táblì 2. Ìrù erogba ti ìpele ìdádúró lọ́wọ́lọ́wọ́ jẹ́ 6.35%, èyí tí ó kéré sí ìrù erogba ti ìwádìí wa tẹ́lẹ̀ (àwọn èròjà silica tí a so pọ̀ mọ́ polystyrene, 7.93%35 àti 10.21%, lẹ́sẹẹsẹ) 42. Ìrù erogba ti ìpele ìdádúró lọ́wọ́lọ́wọ́ kéré, Nítorí pé nígbà tí a ń ṣe ìpèsè SP lọ́wọ́lọ́wọ́, ní àfikún sí styrene, a lo àwọn ligand polar bíi phenylmaleemide-methylvinylisocyanate (PCMP) àti 4-hydroxy-TEMPO. Ìwọ̀n nitrogen nínú ọgọ́rùn-ún ìpele ìdádúró lọ́wọ́lọ́wọ́ jẹ́ 2.21%, ní ìfiwéra pẹ̀lú 0.1735 àti 0.85% nípa ìwọ̀n nitrogen nínú àwọn ìwádìí ìṣáájú, lẹ́sẹẹsẹ. Èyí túmọ̀ sí wípé ìwúwo nitrogen ga ní ìpele ìdádúró lọ́wọ́lọ́wọ́ nítorí phenylmaleemide. Bákan náà, ìrù erogba ti àwọn ọjà (4) àti (5) jẹ́ 2.7% àti 2.9%, lẹ́sẹẹsẹ, nígbà tí ìrù erogba ti ọja ikẹhin (6) jẹ 6.35%, gẹgẹ bi a ti fihan ninu Tabili 2. A ṣe ayẹwo pipadanu iwuwo pẹlu ipele iduro PMP, ati pe a fihan titọ TGA ni Aworan 4. Titọ TGA fihan pipadanu iwuwo ti 8.6%, eyiti o baamu daradara pẹlu fifuye erogba (6.35%) nitori pe awọn ligands ko ni C nikan ṣugbọn N, O, ati H pẹlu.
A yan phenylmaleemide-methylvinylisocyanate ligand fun iyipada oju ilẹ ti awọn patikulu silica nitori o ni awọn ẹgbẹ polar phenylmaleemide ati awọn ẹgbẹ vinylisocyanate. Awọn ẹgbẹ isocyanate Vinyl le tun ṣe pẹlu styrene nipa gbigbe polymerization radical laaye. Idi keji ni lati fi ẹgbẹ kan ti o ni ibaraenisepo alabọde pẹlu analyte sii ati pe ko si ibaraenisepo electrostatic to lagbara laarin analyte ati ipele iduro, nitori pe apakan phenylmaleemide ko ni idiyele foju ni pH deede. A le ṣakoso polarity ti ipele iduro nipasẹ iye ti o dara julọ ti styrene ati akoko ibaraenisepo ti polymerization radical ọfẹ. Igbesẹ ikẹhin ti ibaraenisepo (polymerization free-radical) ṣe pataki o si le yi polarity ti ipele iduro pada. A ṣe itupalẹ elemental lati ṣayẹwo fifuye erogba ti awọn ipele iduro wọnyi. A ṣe akiyesi pe jijẹ iye styrene ati akoko ibaraenisepo mu fifuye erogba ti ipele iduro pọ si ati idakeji. Awọn SP ti a pese pẹlu awọn ifọkansi oriṣiriṣi ti styrene ni awọn fifuye erogba oriṣiriṣi. Lẹẹkansi, gbe awọn ipele iduro wọnyi sinu awọn ọwọn irin alagbara ki o ṣayẹwo wọn Iṣẹ́ chromatographic (yíyàn, ìpinnu, iye N, àti bẹ́ẹ̀ bẹ́ẹ̀ lọ). Ní ​​ìbámu pẹ̀lú àwọn àyẹ̀wò wọ̀nyí, a yan àgbékalẹ̀ tí a ṣe àtúnṣe láti ṣètò ìpele PMP tí ó dúró láti rí i dájú pé a ṣàkóso polarity àti ìdúró analyte tí ó dára.
A tún ṣe àyẹ̀wò àwọn àdàpọ̀ peptide márùn-ún (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) nípa lílo PMP column nípa lílo mobile phase; 60/40 (v/v) acetonitrile/omi (0.1% TFA) ní ìwọ̀n ìṣàn omi ti 80 μL/min. Lábẹ́ àwọn ipò ìtújáde tó dára jùlọ, nọ́mbà àwo ìwádìí (N) fún ọ̀wọ̀n kọ̀ọ̀kan (100 × 1.8 mm id) jẹ́ 20,000 ± 100 (200,000 àwo/m²). Táblì 3 fúnni ní àwọn ìwọ̀n N fún àwọn ọ̀wọ̀n PMP mẹ́ta náà àti pé a fihàn àwọn chromatograms nínú Àwòrán 5A. Ìwádìí kíákíá lórí ọ̀wọ̀n PMP kan ní ìwọ̀n ìṣàn omi gíga (700 μL/min), a yọ àwọn peptide márùn-ún kúrò láàrín ìṣẹ́jú kan, àwọn ìwọ̀n N dára gan-an, 13,500 ± 330 fún ọ̀wọ̀n kọ̀ọ̀kan (100 × 1.8 mm id), Ó bá àwọn àwo 135,000/m2 mu (Àwòrán 5B). A fi àwọn ọ̀wọ̀n mẹ́ta tí wọ́n ní ìwọ̀n kan náà (100 × 1.8 mm id) kún àwọn ọ̀wọ̀n mẹ́ta ti PMP tí ó dúró ní ìdúró láti ṣàyẹ̀wò Àtúnṣe. A ṣe àkọsílẹ̀ ìṣọ̀kan analyte fún ọ̀wọ̀n kọ̀ọ̀kan nípa lílo àwọn ipò ìtújáde tó dára jùlọ àti iye àwọn àwo ìwádìí N àti àkókò ìpamọ́ láti ya àdàpọ̀ ìdánwò kan náà sọ́tọ̀ lórí ọ̀wọ̀n kọ̀ọ̀kan. A fihàn dátà àtúnṣe fún àwọn ọ̀wọ̀n PMP nínú Táblì 4. Àtúnṣe ti ọ̀wọ̀n PMP bá àwọn iye %RSD tó kéré gan-an mu, gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn nínú Táblì 3.
Ìyàsọ́tọ̀ àdàpọ̀ peptide lórí ọ̀wọ́n PMP (B) àti ọ̀wọ́n Ascentis Express RP-Amide (A); ọ̀wọ́n fóónù 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), ìwọ̀n ọ̀wọ́n PMP (100 × 1.8 mm id); ìṣàyẹ̀wò Ìtòlẹ́sẹẹsẹ ìyọkúrò àwọn èròjà: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) àti 5 (leucine) acid enkephalin)).
A ṣe àyẹ̀wò ọ̀wọ̀n PMP kan (100 × 1.8 mm id) fún ìyàsọ́tọ̀ àwọn ìṣàn tryptic ti albumin serum ènìyàn nínú chromatography omi tó ga jùlọ. Chromatogram nínú Àwòrán 6 fihàn pé a yà àyẹ̀wò náà sọ́tọ̀ dáadáa àti pé ìpinnu náà dára gan-an. A ṣe àyẹ̀wò àwọn ìṣàn HSA nípa lílo ìwọ̀n ìṣàn ti 100 µL/min, fósí 70/30 acetonitrile/omi àti 0.1% TFA. Gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn nínú chromatogram (Àwòrán 6), a ti pín ìṣàn HSA sí àwọn òkè 17 tó bá peptide 17 mu. A ṣírò agbára ìpínyà ti òkè kọ̀ọ̀kan nínú ìṣàn HSA, a sì fún àwọn iye náà ní Táblì 5.
A ya ìṣàn omi HSA (100 × 1.8 mm id) sọ́tọ̀ lórí ọ̀wọ́n PMP kan; ìwọ̀n ìṣàn omi (100 µL/min), ìpele alágbéka 60/40 acetonitrile/omi pẹ̀lú 0.1% TFA.
Níbi tí L jẹ́ gígùn ọ̀wọ̀n, η ni ìfọ́sípò ti ìpele alágbéka, ΔP ni ìfúnpọ̀ ẹ̀yìn ọ̀wọ̀n, àti u ni iyàrá ìlà ti ìpele alágbéka. Ìfọ́sípò ti ọ̀wọ̀n PMP jẹ́ 2.5 × 10-14 m2, iwọ̀n ìṣàn náà jẹ́ 25 μL/ìṣẹ́jú kan, àti 60/40 v/v ACN/omi ni a lo. Ìfọ́sípò ti ọ̀wọ̀n PMP (100 × 1.8 mm id) jọ ti ìwádìí wa tẹ́lẹ̀ Ref.34. Ìfọ́sípò ti ọ̀wọ̀n tí a fi àwọn ọ̀wọ̀n oníhò tí ó wà lójú ni: 1.7 × 10-15 fún àwọn ọ̀wọ̀n 1.3 μm, 3.1 × 10-15 fún àwọn ọ̀wọ̀n 1.7 μm, 5.2 × 10-15 àti 2.5 × 10-14 m2 fún àwọn ọ̀wọ̀n 2.6 μm Fún àwọn ọ̀wọ̀n 5 μm 43. Nítorí náà, ìfọ́sípò ti ìpele PMP jọ ti àwọn ọ̀wọ̀n 5 μm oní-ikarahun.
Níbi tí Wx jẹ́ ìwọ̀n ọ̀wọ̀n tí a fi chloroform kún, Wy jẹ́ ìwọ̀n ọ̀wọ̀n tí a fi methanol kún, àti ρ ni ìwọ̀n solvent. Àwọn ìwọ̀n methanol (ρ = 0.7866) àti chloroform (ρ = 1.484). Àpapọ̀ porosity ti àwọn ọ̀wọ̀n SILICA PRITICLES-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 àti C18-Urea 31 tí a ti kẹ́kọ̀ọ́ tẹ́lẹ̀ jẹ́ 0.63 àti 0.55, lẹ́sẹẹsẹ. Èyí túmọ̀ sí wípé wíwà àwọn ligands urea dín agbára ìpele dúró kù. Ní ọwọ́ kejì ẹ̀wẹ̀, àpapọ̀ porosity ti ọ̀wọ̀n PMP (100 × 1.8 mm id) jẹ́ 0.60. Performance ti àwọn ọ̀wọ̀n PMP kéré ju ti àwọn ọ̀wọ̀n tí a fi àwọn patikulu silica tí a so pọ̀ mọ́ C18 nítorí pé nínú àwọn ìpele dúró C18, àwọn ligands C18 so mọ́ àwọn patikulu silica gẹ́gẹ́ bí ẹ̀wọ̀n ìlà, nígbàtí wọ́n wà nínú polystyrene-type standard Àwọn ìpele, a ṣe àgbékalẹ̀ ìpele polima A tó nípọn ní àyíká rẹ̀. Nínú àyẹ̀wò kan tí a ṣe déédéé, a ṣírò porosity column náà gẹ́gẹ́ bí:
Àwòrán 7A,B fi ọ̀wọ́n PMP (100 × 1.8 mm id) àti ọ̀wọ́n Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) hàn nípa lílo àwọn ipò ìtújáde kan náà (ìyẹn ni, 60/40 ACN/H2O àti 0.1% TFA). ) ti àwòrán van Deemter. A ṣe àdàpọ̀ peptide tí a yàn (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ní 20 µL/. Ìwọ̀n ìṣàn tó kéré jùlọ fún àwọn ọ̀wọ́n méjèèjì jẹ́ 800 µL/min. Àwọn ìwọ̀n HETP tó kéré jùlọ ní ìwọ̀n ìṣàn tó dára jùlọ (80 µL/min) fún ọ̀wọ́n PMP àti ọ̀wọ́n Ascentis Express RP-Amide jẹ́ 2.6 µm àti 3.9 µm, lẹ́sẹẹsẹ. Àwọn ìwọ̀n HETP fihàn pé ìṣiṣẹ́ ìyàsọ́tọ̀ ti ọ̀wọ́n PMP (100 × 1.8 mm id) dára ju ọ̀wọ́n Ascentis Express RP-Amide tí ó wà ní ọjà lọ (100 × 1.8 mm id). Àwòrán van Deemter nínú Àwòrán 7(A) fihàn pé ìdínkù nínú iye N pẹ̀lú ìṣàn tó ń pọ̀ sí i kò ṣe pàtàkì ní ìfiwéra pẹ̀lú ìwádìí wa tẹ́lẹ̀. Ìṣiṣẹ́ ìyàsọ́tọ̀ tó ga jùlọ ti ọ̀wọ́n PMP (100 × 1.8 mm id) ní ìfiwéra pẹ̀lú ọ̀wọ́n Ascentis Express RP-Amide dá lórí àwọn àtúnṣe nínú ìrísí pàǹtíkì, ìwọ̀n, àti àwọn ìlànà ìdìpọ̀ ọ̀wọ̀n tó díjú tí a lò nínú iṣẹ́ ìsinsìnyí34.
(A) àwòrán van Deemter (ìyàrá HETP sí ìyàrá líínì alágbéka) tí a rí nípa lílo ọ̀wọ̀n PMP (100 × 1.8 mm id) nínú 60/40 ACN/H2O pẹ̀lú 0.1% TFA.(B) àwòrán van Deemter (ìyàrá HETP sí ìyàrá líínì alágbéka) tí a rí nípa lílo ọ̀wọ̀n Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) nínú 60/40 ACN/H2O pẹ̀lú 0.1% TFA.
A ṣe àgbékalẹ̀ ìpele adaduro polystyrene kan tí a fi polar embedded tí a sì ṣe àgbékalẹ̀ rẹ̀ fún ìyàsọ́tọ̀ àwọn àdàpọ̀ peptide oníṣọ̀kan àti àwọn trypsin digests ti albumin serum ènìyàn (HAS) nínú chromatography omi tí ó ga jùlọ. Iṣẹ́ chromatographic ti àwọn ọ̀wọ́n PMP fún àwọn àdàpọ̀ peptide dára ní ṣíṣe àgbékalẹ̀ àti ìpinnu ìyàsọ́tọ̀. Iṣẹ́ ìyàsọ́tọ̀ tí ó dára síi ti àwọn ọ̀wọ́n PMP jẹ́ nítorí onírúurú ìdí, bí ìwọ̀n patiku àti ìwọ̀n ihò ti àwọn èròjà silica, ìṣètò ìṣàkóso ti ìpele adaduro, àti ìpapọ̀ ọ̀wọ̀n tí ó díjú. Ní àfikún sí iṣẹ́ ìyàsọ́tọ̀ gíga, titẹ ẹ̀yìn ọ̀wọ̀n kékeré ní àwọn ìwọ̀n ìṣàn gíga jẹ́ àǹfààní mìíràn ti ìpele adaduro yìí. Àwọn ọ̀wọ́n PMP fi ìtúnṣe rere hàn, a sì le lò ó fún ìṣàyẹ̀wò àwọn àdàpọ̀ peptide àti ìtújáde trypsin ti onírúurú èròjà protein. A ní èrò láti lo ọ̀wọ̀n yìí fún ìyàsọ́tọ̀ àwọn ọjà àdánidá, àwọn agbo ogun bioactive láti inú àwọn ewéko ìṣègùn àti àwọn ìyọkúrò fungus nínú chromatography omi. Ní ọjọ́ iwájú, a óò tún ṣe àgbékalẹ̀ àwọn ọ̀wọ́n PMP fún ìyàsọ́tọ̀ àwọn èròjà protein àti àwọn èròjà monoclonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Ìwádìí lórí Àwọn Ètò Ìyàsọ́tọ̀ Peptide nípasẹ̀ Ìṣàfihàn Kírómátírì Ìpele Ìyípadà Apá Kìíní: Ìdàgbàsókè Ìlànà Ìṣàfihàn Ọ̀wọ̀n kan.J. Kírómátírì.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. àti àwọn ẹlòmíràn. Àwọn peptides tó ń ṣiṣẹ́ tí a ṣe fún ìtọ́jú àwọn àrùn àkóràn. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Àwọn peptides ìtọ́jú oníṣẹ́-ọnà: ìmọ̀ sáyẹ́ǹsì àti ọjà. Ìwádìí oògùn.15 (1-2) lónìí, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. àti àwọn ẹlòmíràn. Ìwádìí ìṣàyẹ̀wò omi tó ti lọ síwájú ń jẹ́ kí a lè ṣe àkójọpọ̀ àwọn metabolomics àti proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ipa ti UHPLC ninu idagbasoke oogun.J. Oṣu Kẹsan. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Àwọn kókó pàtàkì àti ìṣe ti chromatography omi titẹ gíga fún ìyàsọ́tọ̀ kíákíá. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Lílo chromatography omi tó ga jùlọ nínú ìdàgbàsókè oògùn. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. àti àwọn ẹlòmíràn. Àwọn hydrogels macroporous monolithic tí a pèsè láti inú àwọn emulsions ìpele inú epo-nínú-omi fún ìwẹ̀nùmọ́ tó munadoko ti àwọn enteroviruses.Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ipa ti kiromatogirafi omi ninu awọn proteomics.J. Kiromatogirafi.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Àwọn ìdàgbàsókè tó ń yọjú nínú ìyàsọ́tọ̀ chromatography omi tó yí padà ti àwọn peptides àti àwọn protein tó ń ṣe ìtọ́jú: ìlànà àti àwọn ohun tí a lè lò. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Ìyàsọ́tọ̀ onípele méjì ti àwọn peptides nípa lílo ètò RP-RP-HPLC nípa lílo àwọn iye pH tó yàtọ̀ síra nínú àwọn ìwọ̀n ìpínyà àkọ́kọ́ àti kejì. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. àti àwọn ẹlòmíràn ni a ṣe ìwádìí nípa àwọn ànímọ́ ìyípadà ibi-pupọ àti iṣẹ́ kinetic ti àwọn ọ̀wọ́n chromatographic tí ó ní C18 sub-2 μm tí ó kún fún àwọn èròjà oníhò tí ó ní ojú tí ó sì ní ihò. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. àti àwọn ẹlòmíràn. Àwọn ìpèníjà onímọ̀ tuntun àti ìwádìí nínú ìyàsọ́tọ̀, ìdámọ̀ àti ìfìdí múlẹ̀ àwọn peptides bioactive ewéko.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB àti àwọn ẹlòmíràn. Ìrísí proteomic ti ìjọba ìyè.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. àti àwọn ẹlòmíràn. Ìṣiṣẹ́ ìsàlẹ̀ ti àwọn peptides ìtọ́jú nípasẹ̀ ìṣètò omi ìṣètò. Molecule (Basel, Switzerland) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Àdàpọ̀ ìrísí krómátọ́ọ̀gì àti lílò rẹ̀ sí àwọn biopolymers. J. Krómátọ́ọ̀gì.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands fún àkójọpọ̀ èròjà protein: ìlànà, ìṣàfihàn, àti ìṣètò. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).