Grazas por visitar Nature.com. A versión do navegador que estás a usar ten compatibilidade limitada con CSS. Para obter a mellor experiencia, recomendámosche que uses un navegador actualizado (ou que desactives o modo de compatibilidade en Internet Explorer). Mentres tanto, para garantir a compatibilidade continua, mostraremos o sitio sen estilos nin JavaScript.
Preparáronse partículas de sílice porosas mediante un método sol-gel con algunhas modificacións para obter partículas macroporosas. Estas partículas derivatizáronse mediante polimerización por transferencia de cadea de fragmentación de adición reversible (RAFT) con N-fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PMI) e estireno para preparar a intercalación de N-fenilmaleimida da fase estacionaria de poliestireno (PMP). Empaquetáronse columnas de aceiro inoxidable de diámetro estreito (100 × 1,8 mm de diámetro interior) mediante empaquetado en suspensión. Avaliouse a separación en columnas PMP dunha mestura de péptidos composta por cinco péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) rendemento cromatográfico) e a dixestión con tripsina da albumina sérica humana (HAS). En condicións de elución óptimas, a conta teórica de placas da mestura de péptidos é de ata 280.000 placas/m². Comparando o rendemento de separación da columna desenvolvida coa comercial Na columna Ascentis Express RP-amida, observouse que o rendemento de separación da columna PMP era superior ao da columna comercial en termos de eficiencia de separación e resolución.
Nos últimos anos, a industria biofarmacéutica converteuse nun mercado global en expansión cun aumento substancial da cota de mercado. Co crecemento explosivo da industria biofarmacéutica1,2,3, a análise de péptidos e proteínas é moi desexada. Ademais do péptido diana, xéranse varias impurezas durante a síntese de péptidos, polo que se require unha purificación cromatográfica para obter péptidos da pureza desexada. A análise e caracterización de proteínas en fluídos corporais, tecidos e células é unha tarefa extremadamente desafiante debido ao gran número de especies potencialmente detectables nunha soa mostra. Aínda que a espectrometría de masas é unha ferramenta eficaz para a secuenciación de péptidos e proteínas, se estas mostras se inxectan no espectrómetro de masas nunha soa pasada, a separación non será ideal. Este problema pódese mitigar implementando separacións por cromatografía líquida (LC) antes da análise de MS, o que reducirá o número de analitos que entran no espectrómetro de masas nun momento dado4,5,6. Ademais, durante a separación de fase líquida, os analitos poden concentrarse en rexións estreitas, concentrando así estes analitos e mellorando a sensibilidade de detección de MS. A cromatografía líquida (LC) avanzou significativamente na última década e converteuse nunha técnica popular na análise proteómica7,8,9,10.
A cromatografía líquida de fase inversa (RP-LC) úsase amplamente para a purificación e separación de mesturas de péptidos utilizando sílice modificada con octadecilo (ODS) como fase estacionaria11,12,13. Non obstante, as fases estacionarias RP non proporcionan unha separación satisfactoria de péptidos e proteínas debido á súa estrutura complexa e natureza anfipática14,15. Polo tanto, requírense fases estacionarias especialmente deseñadas para analizar péptidos e proteínas con restos polares e non polares para interactuar con estes analitos e reteros16. A cromatografía de modo mixto, que proporciona interaccións multimodais, pode ser unha alternativa á RP-LC para a separación de péptidos, proteínas e outras mesturas complexas. Preparáronse varias fases estacionarias de modo mixto e utilizáronse columnas envasadas con estas fases para separacións de péptidos e proteínas17,18,19,20,21. As fases estacionarias de modo mixto (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalación polar/RPLC) son axeitadas para as separacións de péptidos e proteínas debido á presenza tanto de fases polares como non polares. grupos22,23,24,25,26,27,28. Do mesmo xeito, as fases estacionarias intercalantes polares con grupos polares unidos covalentemente mostran un bo poder de separación e unha selectividade única para analitos polares e non polares, xa que a separación depende da interacción entre o analito e a fase estacionaria. Interaccións multimodais 29, 30, 31, 32. Recentemente, Zhang et al. 30 prepararon unha fase estacionaria de poliamina terminada en dodecilo e separaron con éxito hidrocarburos, antidepresivos, flavonoides, nucleósidos, estróxenos e outros analitos. O intercalador polar ten grupos polares e non polares, polo que se pode usar para separar péptidos e proteínas que teñen restos hidrófobos e hidrófilos. As columnas incrustadas en polar (por exemplo, columnas C18 incrustadas en amida) están dispoñibles comercialmente co nome comercial de columnas Ascentis Express RP-Amide, pero estas columnas só se usan para a análise da amina 33.
No presente estudo, preparouse e avaliouse unha fase estacionaria polarmente incrustada (poliestireno incrustado en N-fenilmaleimida) para a separación de péptidos e dixeridos de tripsina de HSA. A fase estacionaria preparouse empregando a seguinte estratexia. As partículas de sílice porosas preparáronse segundo o procedemento indicado na nosa publicación anterior con algunhas modificacións no protocolo de preparación. Axustouse a proporción de urea, polietilenglicol (PEG), TMOS, auga e ácido acético para preparar partículas de sílice con poros de gran tamaño. En segundo lugar, sintetizouse un novo ligando, fenilmaleimida-metilvinisocianato, e utilizouse para derivatizar partículas de sílice para preparar unha fase estacionaria polarmente incrustada. A fase estacionaria resultante empaquetause nunha columna de aceiro inoxidable (100 × 1,8 mm de diámetro interior) empregando o esquema de empaquetamento optimizado. O empaquetamento da columna está asistido por vibración mecánica para garantir que se forme un leito homoxéneo dentro da columna. Avaliar a separación en columnas empaquetadas de mesturas de péptidos que consisten en cinco péptidos; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) e dixestión con tripsina de albumina sérica humana (HAS). Observouse que a mestura de péptidos e a dixestión con tripsina de HSA se separaban con boa resolución e eficiencia. Comparouse o rendemento de separación da columna PMP co da columna Ascentis Express RP-amida. Observouse que tanto os péptidos como as proteínas estaban ben resoltos e eran eficientes na columna PMP, que era máis eficiente que a columna Ascentis Express RP-amida.
PEG (polietilenglicol), urea, ácido acético, ortosilicato de trimetoxi (TMOS), clorosilano de trimetilo (TMCS), tripsina, albumina sérica humana (HSA), cloruro de amonio, urea, metildisilazano de hexano (HMDS), cloruro de metacriloílo (MC), estireno, 4-hidroxi-TEMPO, peróxido de benzoílo (BPO), acetonitrilo de grao HPLC (ACN), metanol, 2-propanol e acetona adquiridos a Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EUA).
Axitouse durante 10 minutos unha mestura de urea (8 g), polietilenglicol (8 g) e 8 mL de ácido acético 0,01 N, e despois engadíronse 24 mL de TMOS en condicións de xeo. A mestura de reacción quentouse a 40 °C durante 6 horas e despois a 120 °C durante 8 horas nun autoclave de aceiro inoxidable. A auga eliminouse e o material residual secouse a 70 °C durante 12 horas. A masa branda seca moeuse suavemente nun forno e calcinouse a 550 °C durante 12 horas. Preparáronse e caracterizáronse tres lotes para examinar a reproducibilidade no tamaño das partículas, o tamaño dos poros e a área superficial.
Mediante a modificación superficial das partículas de sílice cun ligando fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP) previamente sintetizado seguida de polimerización radial con estireno, preparouse un composto que contén un grupo polar. Fase estacionaria para agregados e cadeas de poliestireno. O proceso de preparación descríbese a continuación.
Disolvéronse N-fenilmaleimida (200 mg) e isocianato de metilvinilo (100 mg) en tolueno seco e engadíronse 0,1 mL de 2,2'-azoisobutironitrilo (AIBN) ao matraz de reacción para preparar o copolímero de fenilmaleimida-isocianato de metilvinilo (PMCP). A mestura quentouse a 60 °C durante 3 horas, filtrouse e secouse nun forno a 40 °C durante 3 horas.
As partículas de sílice secas (2 g) dispersáronse en tolueno seco (100 mL), axitáronse e sonicaron nun matraz de fondo redondo de 500 mL durante 10 min. O PMCP (10 mg) disolveuse en tolueno e engadiuse gota a gota ao matraz de reacción mediante un funil de goteo. A mestura someteuse a refluxo a 100 °C durante 8 horas, filtrouse e lavouse con acetona e secouse a 60 °C durante 3 horas. Despois, as partículas de sílice unidas a PMCP (100 g) disolveronse en tolueno (200 ml) e engadiuse 4-hidroxi-TEMPO (2 mL) en presenza de 100 µL de dilaurato de dibutilestaño como catalizador. A mestura axitouse a 50 °C durante 8 horas, filtrouse e secouse a 50 °C durante 3 horas.
Dispersáronse estireno (1 mL), peróxido de benzoílo BPO (0,5 mL) e partículas de sílice unidas a TEMPO-PMCP (1,5 g) en tolueno e purgáronse con nitróxeno. A polimerización do estireno levouse a cabo a 100 °C durante 12 horas. O produto resultante lavouse con metanol e secouse a 60 °C durante a noite. O esquema xeral da reacción móstrase na Figura 1.
As mostras foron desgasificadas a 393 K durante 1 hora para obter unha presión residual inferior a 10-3 Torr. A cantidade de N2 adsorbida a unha presión relativa de P/P0 = 0,99 utilizouse para determinar o volume total de poros. A morfoloxía das partículas de sílice espidas e unidas a ligando examinouse con microscopía electrónica de varrido (Hitachi High Technologies, Toquio, Xapón). As mostras secas (sílice espida e partículas de sílice unidas a ligando) colocáronse nunha columna de aluminio usando cinta adhesiva de carbono. As mostras foron chapadas con ouro usando un revestimento por pulverización catódica Q150T e depositouse unha capa de Au de 5 nm sobre as mostras. Isto mellora a eficiencia do proceso usando baixas voltaxes e proporciona pulverización catódica en frío de gran fino. Utilizouse un analizador elemental Thermo Electron (Waltham, MA, EUA) Flash EA1112 para a análise elemental. Utilizouse un analizador de tamaño de partícula Malvern (Worcestershire, Reino Unido) Mastersizer 2000 para obter a distribución do tamaño de partícula. Partículas de sílice espidas e As partículas de sílice unidas a ligando (5 mg cada unha) dispersáronse en 5 mL de isopropanol, sonicáronse durante 10 min, vortexáronse durante 5 min e colocáronse no banco óptico do Mastersizer. A análise termogravimétrica realizouse a unha velocidade de 5 °C por minuto nun rango de temperatura de 30 a 800 °C.
Empaquetaronse columnas de aceiro inoxidable revestidas de vidro de diámetro estreito con dimensións (100 × 1,8 mm de diámetro interior) empregando o método de empaquetado en suspensión, aplicando o mesmo procedemento empregado na Ref. 31. Unha columna de aceiro inoxidable (revestida de vidro, 100 × 1,8 mm de diámetro interior) cunha conexión de saída que contiña unha frita de 1 µm conectouse a un empaquetador de suspensión (Alltech Deerfield, IL, EUA). Preparouse unha suspensión de fase estacionaria suspendendo 150 mg de fase estacionaria en 1,2 mL de metanol e enviámola á columna de almacenamento. Utilizouse metanol como disolvente da suspensión, así como como disolvente propulsor. Encher a columna secuencialmente aplicando presións de 100 MP durante 10 minutos, 80 MP durante 15 minutos e 60 MP durante 30 minutos. Durante o empaquetamento, aplicouse vibración mecánica con dous axitadores de columna GC (Alltech, Deerfield, IL, EUA) para garantir un empaquetamento uniforme da columna. Pechar o empaquetador de suspensión e liberar a presión lentamente para evitar danos dentro da columna. Desconectar a columna da unidade de empaquetamento de suspensión e conectar outra conexión á entrada e ao sistema LC para comprobar o seu rendemento.
Construíuse unha bomba LC (10AD Shimadzu, Xapón), un inxector (Valco (EUA) C14 W.05) cun bucle de inxección de 50 nL, un desgasificador de membrana (Shimadzu DGU-14A), unha xanela capilar UV-VIS, un detector de dispositivo µLC especial (UV-2075) e microcolumnas revestidas de vidro. Utilizouse un tubo de conexión moi estreito e curto para minimizar o efecto do ensanche adicional da banda da columna. Despois do empaquetado, instaláronse capilares (50 μm de diámetro interior 365) e capilares de unión redutora (50 μm) na saída de 1/16″ da unión redutora. A recollida de datos e o procesamento cromatográfico realizáronse mediante o software Multichro 2000. A monitorización a 254 nm. Os analitos analizáronse para a absorbancia UV. Os datos cromatográficos analizáronse con OriginPro8 (Northampton, MA).
Albúmina de soro humano, po liofilizado, ≥ 96 % (electroforese en xel de agarosa) 3 mg mesturados con tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 mL) e bicarbonato de amonio 0,2 M (1 mL). A solución axitouse durante 10 minutos e mantívose nun baño de auga a 37 °C durante 6 horas, e despois inactivouse con 1 mL de TFA ao 0,1 %. Filtrar a solución e almacenar por debaixo de 4 °C.
A separación das mesturas de péptidos e os dixeridos de tripsina HSA avaliouse por separado en columnas PMP. Comprobe a separación da mestura de péptidos e o dixerido de tripsina de HSA pola columna PMP e compare os resultados coa columna Ascentis Express RP-Amide. O número de placa teórica calcúlase do seguinte xeito:
As imaxes SEM de partículas de sílice espidas e partículas de sílice unidas a ligando móstranse na FIG. 2. As imaxes SEM de partículas de sílice espidas (A, B) mostran que, en contraste cos nosos estudos anteriores, estas partículas son esféricas, nas que as partículas son alongadas ou teñen simetría irregular. A superficie das partículas de sílice unidas a ligando (C, D) é máis lisa que a das partículas de sílice espidas, o que pode deberse ao revestimento de cadeas de poliestireno na superficie das partículas de sílice.
Imaxes de microscopio electrónico de varrido de partículas de sílice espidas (A, B) e partículas de sílice con ligando (C, D).
As distribucións de tamaño de partícula das partículas de sílice espidas e das partículas de sílice unidas a ligandos móstranse na Figura 3(A). As curvas de distribución de tamaño de partícula baseadas no volume mostraron que o tamaño das partículas de sílice aumentou despois da modificación química (Fig. 3A). Os datos de distribución de tamaño de partícula das partículas de sílice do estudo actual e do estudo anterior compáranse na Táboa 1(A). O tamaño de partícula baseado no volume, d(0,5), do PMP é de 3,36 μm, en comparación co noso estudo anterior cun valor ad(0,5) de 3,05 μm (partículas de sílice unidas a poliestireno)34. Este lote tiña unha distribución de tamaño de partícula máis estreita en comparación co noso estudo anterior debido ás proporcións variables de PEG, urea, TMOS e ácido acético na mestura de reacción. O tamaño de partícula da fase PMP é lixeiramente maior que o da fase de partículas de sílice unidas a poliestireno que estudamos anteriormente. Isto significa que a funcionalización superficial das partículas de sílice con estireno só depositou unha capa de poliestireno (0,97 µm) na superficie da sílice, mentres que na fase PMP O grosor da capa foi de 1,38 µm.
Distribución do tamaño das partículas (A) e distribución do tamaño dos poros (B) de partículas de sílice espidas e partículas de sílice unidas a ligandos.
O tamaño dos poros, o volume dos poros e a área superficial das partículas de sílice do estudo actual indícanse na Táboa 1(B). Os perfís de densidade espectral de potencia (PSD) das partículas de sílice espidas e das partículas de sílice unidas a ligandos móstranse na Figura 3(B). Os resultados son comparables aos do noso estudo anterior. Os tamaños dos poros das partículas de sílice espidas e unidas a ligandos son 310 e 241, respectivamente, o que indica que o tamaño dos poros diminúe en 69 despois da modificación química, como se mostra na Táboa 1(B), e o cambio da curva móstrase na Fig. 3(B). Do mesmo xeito, o volume dos poros das partículas de sílice diminuíu de 0,67 a 0,58 cm3/g despois da modificación química. A área superficial específica das partículas de sílice estudadas actualmente é de 116 m2/g, o que é comparable ao noso estudo anterior (124 m2/g). Como se mostra na Táboa 1(B), a área superficial (m2/g) das partículas de sílice tamén diminuíu de 116 m2/g a 105 m2/g despois da modificación química. modificación.
Os resultados da análise elemental da fase estacionaria móstranse na Táboa 2. A carga de carbono da fase estacionaria actual é do 6,35 %, que é inferior á carga de carbono do noso estudo anterior (partículas de sílice unidas a poliestireno, 7,93 %35 e 10,21 %, respectivamente) 42. A carga de carbono da fase estacionaria actual é baixa, xa que na preparación do SP actual, ademais do estireno, utilizáronse algúns ligandos polares como o fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP) e o 4-hidroxi-TEMPO. A porcentaxe en peso de nitróxeno da fase estacionaria actual é do 2,21 %, en comparación co 0,1735 e o 0,85 % en peso de nitróxeno en estudos anteriores, respectivamente. Isto significa que a porcentaxe en peso de nitróxeno é maior na fase estacionaria actual debido á fenilmaleimida. Do mesmo xeito, as cargas de carbono dos produtos (4) e (5) foron do 2,7 % e do 2,9 %, respectivamente, mentres que a carga de carbono do produto final O produto (6) foi do 6,35 %, como se mostra na Táboa 2. A perda de peso comprobouse coa fase estacionaria PMP e a curva TGA móstrase na Figura 4. A curva TGA mostra unha perda de peso do 8,6 %, o que concorda ben coa carga de carbono (6,35 %) porque os ligandos conteñen non só C senón tamén N, O e H.
O ligando fenilmaleimida-metilvinilisocianato foi escollido para a modificación superficial das partículas de sílice porque ten grupos fenilmaleimida polares e grupos vinilisocianato. Os grupos isocianato de vinilo poden reaccionar ademais co estireno mediante a polimerización radical viva. A segunda razón é inserir un grupo que teña unha interacción moderada co analito e non unha forte interacción electrostática entre o analito e a fase estacionaria, xa que a porción fenilmaleimida non ten carga virtual a pH normal. A polaridade da fase estacionaria pódese controlar mediante a cantidade óptima de estireno e o tempo de reacción da polimerización radical libre. O último paso da reacción (polimerización radical libre) é crítico e pode cambiar a polaridade da fase estacionaria. Realizouse unha análise elemental para comprobar a carga de carbono destas fases estacionarias. Observouse que aumentar a cantidade de estireno e o tempo de reacción aumentaba a carga de carbono da fase estacionaria e viceversa. Os SP preparados con diferentes concentracións de estireno teñen diferentes cargas de carbono. De novo, cárguense estas fases estacionarias en columnas de aceiro inoxidable e comprobense as súas propiedades cromatográficas. rendemento (selectividade, resolución, valor N, etc.). Baseándose nestes experimentos, seleccionouse unha formulación optimizada para preparar a fase estacionaria PMP para garantir unha polaridade controlada e unha boa retención do analito.
Tamén se avaliaron cinco mesturas de péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) empregando unha columna PMP cunha fase móbil; 60/40 (v/v) de acetonitrilo/auga (0,1 % de TFA) a un caudal de 80 μL/min. En condicións de elución óptimas, o número teórico de placas (N) por columna (100 × 1,8 mm de diámetro interior) é de 20.000 ± 100 (200.000 placas/m²). A táboa 3 mostra os valores de N para as tres columnas de PMP e os cromatogramas móstranse na figura 5A. Análise rápida nunha columna de PMP a un caudal elevado (700 μL/min), eluíronse cinco péptidos nun minuto, os valores de N foron moi bos, 13.500 ± 330 por columna (100 × 1,8 mm de diámetro interior), o que corresponde a 135.000 placas/m (figura 5B). Tres columnas de tamaño idéntico (100 × 1,8 mm de diámetro interior) empaquetaronse con tres lotes diferentes de fase estacionaria de PMP para comprobar a reproducibilidade. O A concentración de analito para cada columna rexistrouse empregando as condicións de elución óptimas e o número de pratos teóricos N e o tempo de retención para separar a mesma mestura de proba en cada columna. Os datos de reproducibilidade para as columnas PMP móstranse na Táboa 4. A reproducibilidade da columna PMP correlaciónase ben con valores moi baixos de %RSD, como se mostra na Táboa 3.
Separación da mestura de péptidos na columna de PMP (B) e na columna de Ascentis Express RP-amida (A); fase móbil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensións da columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior); analítica. A orde de elución dos compostos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) e 5 (leucina) (encefalina ácida).
Avaliouse unha columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) para a separación de dixeridos trípticos de albumina sérica humana en cromatografía líquida de alta resolución. O cromatograma da Figura 6 mostra que a mostra está ben separada e a resolución é moi boa. Os dixeridos de HSA analizáronse usando un caudal de 100 µL/min, fase móbil 70/30 acetonitrilo/auga e 0,1 % de TFA. Como se mostra no cromatograma (Figura 6), a dixestión de HSA dividiuse en 17 picos correspondentes a 17 péptidos. Calculouse a eficiencia de separación de cada pico no dixerido de HSA e os valores indícanse na Táboa 5.
Separouse un dixesto tríptico de HSA (100 × 1,8 mm de diámetro interior) nunha columna PMP; caudal (100 µL/min), fase móbil 60/40 acetonitrilo/auga con 0,1 % de TFA.
onde L é a lonxitude da columna, η é a viscosidade da fase móbil, ΔP é a contrapresión da columna e u é a velocidade lineal da fase móbil. A permeabilidade da columna PMP foi de 2,5 × 10-14 m2, o caudal foi de 25 μL/min e utilizouse ACN/auga 60/40 v/v. A permeabilidade da columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) foi similar á do noso estudo anterior Ref.34. A permeabilidade da columna chea de partículas superficialmente porosas é: 1,7 × 10-15 para partículas de 1,3 μm, 3,1 × 10-15 para partículas de 1,7 μm, 5,2 × 10-15 e 2,5 × 10-14 m2 para partículas de 2,6 μm para partículas de 5 μm 43. Polo tanto, a permeabilidade da fase PMP é similar á das partículas núcleo-casca de 5 μm.
onde Wx é o peso da columna recheada con cloroformo, Wy é o peso da columna recheada con metanol e ρ é a densidade do disolvente. As densidades de metanol (ρ = 0,7866) e cloroformo (ρ = 1,484). A porosidade total das columnas SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm de diámetro interior) 34 e columnas C18-Urea 31 que estudamos anteriormente foron de 0,63 e 0,55, respectivamente. Isto significa que a presenza de ligandos de urea reduce a permeabilidade da fase estacionaria. Por outra banda, a porosidade total da columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) é de 0,60. A permeabilidade das columnas PMP é menor que a das columnas recheadas con partículas de sílice con enlaces C18 porque nas fases estacionarias de tipo C18 os ligandos C18 están unidos ás partículas de sílice como cadeas lineais, mentres que nas fases estacionarias de tipo poliestireno, a capa de polímero relativamente grosa é formado ao seu redor. Nun experimento típico, a porosidade da columna calcúlase como:
As figuras 7A e 7B mostran a columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) e a columna Ascentis Express RP-amida (100 × 1,8 mm de diámetro interior) empregando as mesmas condicións de elución (é dicir, 60/40 ACN/H2O e 0,1 % de TFA) do gráfico de van Deemter. As mesturas de péptidos seleccionadas (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) preparáronse en 20 µL. O caudal mínimo para ambas columnas é de 800 µL/min. Os valores mínimos de HETP ao caudal óptimo (80 µL/min) para a columna PMP e a columna Ascentis Express RP-Amide foron de 2,6 µm e 3,9 µm, respectivamente. Os valores de HETP indican que a eficiencia de separación da columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) é moito mellor que a da columna Ascentis Express RP-Amide dispoñible comercialmente (100 × 1,8 mm de diámetro interior). O gráfico de van Deemter na figura 7(A) mostra que a diminución do valor de N co aumento do caudal non é significativa en comparación co noso estudo anterior. A maior eficiencia de separación da columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) en comparación á columna de RP-amida de Ascentis Express baséase en melloras na forma e tamaño das partículas e nos complexos procedementos de empaquetado de columnas empregados no traballo actual34.
(A) Gráfico de van Deemter (HETP fronte a velocidade lineal da fase móbil) obtido usando unha columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) en 60/40 ACN/H2O con 0,1 % de TFA. (B) Gráfico de van Deemter (HETP fronte a velocidade lineal da fase móbil) obtido usando unha columna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm de diámetro interior) en 60/40 ACN/H2O con 0,1 % de TFA.
Preparouse e avaliouse unha fase estacionaria de poliestireno incrustado en capas polares para a separación de mesturas de péptidos sintéticos e dixeridos con tripsina de albumina sérica humana (HAS) en cromatografía líquida de alta resolución. O rendemento cromatográfico das columnas PMP para mesturas de péptidos é excelente en canto a eficiencia e resolución de separación. O mellor rendemento de separación das columnas PMP débese a unha variedade de razóns, como o tamaño das partículas e o tamaño dos poros das partículas de sílice, a síntese controlada da fase estacionaria e o empaquetamento complexo da columna. Ademais da alta eficiencia de separación, a baixa contrapresión da columna a altas taxas de fluxo é outra vantaxe desta fase estacionaria. As columnas PMP presentan unha boa reproducibilidade e pódense usar para a análise de mesturas de péptidos e a dixestión con tripsina de varias proteínas. Pretendemos usar esta columna para a separación de produtos naturais, compostos bioactivos de plantas medicinais e extractos de fungos en cromatografía líquida. No futuro, as columnas PMP tamén se avaliarán para a separación de proteínas e anticorpos monoclonais.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. e Petersson, P. Investigación sobre sistemas de separación de péptidos mediante cromatografía de fase invertida Parte I: Desenvolvemento dun protocolo de caracterización de columnas. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Péptidos activos mellorados deseñados para o tratamento de enfermidades infecciosas. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. e Khrestchatisky, M. Péptidos terapéuticos sintéticos: ciencia e mercado. Descubrimento de fármacos. 15 (1-2) hoxe, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD e Shen, Y. Cromatografía líquida proteómica avanzada. J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. A cromatografía líquida-espectrometría de masas avanzada permite a incorporación de metabolómica e proteómica de amplo alcance. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM e Salisbury, JJ O papel da UHPLC no desenvolvemento de fármacos. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. e Clausen, AM Aspectos fundamentais e prácticos da cromatografía líquida a presión ultraalta para separacións rápidas. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA e Tchelitcheff, P. Aplicación da cromatografía líquida de ultra alta resolución no desenvolvemento de fármacos. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidroxeles macroporosos monolíticos preparados a partir de emulsións de alta fase interna de aceite en auga para a purificación eficiente de enterovirus. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. e Wilkins, JA. O papel da cromatografía líquida na proteómica. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. e Guillarme, D. Tendencias emerxentes nas separacións por cromatografía líquida en fase inversa de péptidos e proteínas terapéuticas: teoría e aplicacións. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE e Gebler, JC. Separación bidimensional de péptidos mediante un sistema RP-RP-HPLC con diferentes valores de pH na primeira e segunda dimensión de separación. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Investigáronse as características de transferencia de masa e o rendemento cinético de columnas cromatográficas de alta eficiencia recheas con partículas C18 sub-2 μm totalmente e superficialmente porosas. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tendencias recentes e desafíos analíticos no illamento, identificación e validación de péptidos bioactivos vexetais. anus. anus biological. Chemical. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. A paisaxe proteómica do reino da vida. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Procesamento augas abaixo de péptidos terapéuticos mediante cromatografía líquida preparativa. Molecule (Basilea, Suíza) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. e Geng, X. Cromatografía de modo mixto e a súa aplicación a biopolímeros. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. e Sun, Y. Ligandos para cromatografía de proteínas en modo mixto: principio, caracterización e deseño. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).