Ви благодариме што ја посетивте Nature.com. Верзијата на прелистувачот што ја користите има ограничена поддршка за CSS. За најдобро искуство, препорачуваме да користите ажуриран прелистувач (или да го исклучите режимот на компатибилност во Internet Explorer). Во меѓувреме, за да обезбедиме континуирана поддршка, ќе ја прикажеме страницата без стилови и JavaScript.
Порозни силициумски честички беа подготвени со метод на сол-гел со некои модификации за да се добијат макропорозни честички. Овие честички беа дериватизирани со полимеризација со реверзибилна адициона фрагментација на синџирот (RAFT) со N-фенилмалеимид-метилвинилизоцијанат (PMI) и стирен за да се подготви интеркалација на N-фенилмалеимид на стационарната фаза од полистирен (PMP). Колони од не'рѓосувачки челик со тесен отвор (100 × 1,8 mm id) беа спакувани со пакување во кашеста маса. Оценето е одвојување на PMP колона на пептидна мешавина составена од пет пептиди (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, леуцин енкефалин) (хроматографска изведба) и трипсинска дигестија на човечки серумски албумин (HAS). Под оптимални услови на елуирање, теоретскиот број на плочи од пептидната мешавина е дури 280.000 плочи/m². Споредувајќи ја ефикасноста на одвојување на развиената колона со комерцијалната Ascentis Во колоната Express RP-Amide, беше забележано дека перформансите на сепарација на PMP колоната беа подобри од комерцијалната колона во однос на ефикасноста на сепарацијата и резолуцијата.
Во последниве години, биофармацевтската индустрија стана глобален пазар во експанзија со значително зголемување на пазарниот удел. Со експлозивниот раст на биофармацевтската индустрија1,2,3, анализата на пептиди и протеини е многу посакувана. Покрај целниот пептид, за време на синтезата на пептид се генерираат неколку нечистотии, што бара хроматографско прочистување за да се добијат пептиди со посакуваната чистота. Анализата и карактеризацијата на протеините во телесни течности, ткива и клетки е исклучително предизвикувачка задача поради големиот број потенцијално детектабилни видови во еден примерок. Иако масената спектрометрија е ефикасна алатка за секвенционирање на пептиди и протеини, ако таквите примероци се инјектираат во масениот спектрометар во едно поминување, одвојувањето нема да биде идеално. Овој проблем може да се ублажи со имплементација на одвојувања со течна хроматографија (LC) пред MS анализата, што ќе го намали бројот на аналити што влегуваат во масениот спектрометар во дадено време4,5,6. Покрај тоа, за време на одвојувањето на течната фаза, аналитите можат да се фокусираат во тесни региони, со што се концентрираат овие аналити и се подобрува чувствителноста на MS детекција. Течната хроматографија (LC) значително напредна. во текот на изминатата деценија и стана популарна техника во протеомската анализа7,8,9,10.
Течната хроматографија со обратна фаза (RP-LC) е широко користена за прочистување и одвојување на пептидни мешавини со употреба на октадецил-модифициран силициум диоксид (ODS) како стационарна фаза11,12,13. Сепак, стационарните фази на RP не обезбедуваат задоволително одвојување на пептидите и протеините поради нивната комплексна структура и амфифилна природа14,15. Затоа, потребни се специјално дизајнирани стационарни фази за анализа на пептиди и протеини со поларни и неполарни делови за да комуницираат со и да ги задржат овие аналити16. Хроматографијата со мешан режим, која обезбедува мултимодални интеракции, може да биде алтернатива на RP-LC за одвојување на пептиди, протеини и други сложени мешавини. Подготвени се неколку стационарни фази со мешан режим, а колони спакувани со овие фази се користени за одвојување на пептиди и протеини17,18,19,20,21. Стационарните фази со мешан режим (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, поларна интеркалација/RPLC) се погодни за одвојување на пептиди и протеини поради присуството и на поларни и на неполарни. групи22,23,24,25,26,27,28. Слично на тоа, поларните интеркалативни стационарни фази со ковалентно врзани поларни групи покажуваат добра моќ на сепарација и единствена селективност за поларните и неполарните аналити, бидејќи сепарацијата зависи од интеракцијата помеѓу аналитот и стационарната фаза. Мултимодални интеракции29, 30, 31, 32. Неодамна, Zhang et al. 30 подготвија додецил-терминирана полиаминска стационарна фаза и успешно одвоија јаглеводороди, антидепресиви, флавоноиди, нуклеозиди, естрогени и неколку други аналити. Поларниот интеркалатор има и поларни и неполарни групи, така што може да се користи за одвојување на пептиди и протеини кои имаат и хидрофобни и хидрофилни делови. Поларно вградени колони (на пр., C18 колони вградени во амиди) се комерцијално достапни под трговското име Ascentis Express RP-Amide колони, но овие колони се користат само за анализа на амин 33.
Во тековната студија, беше подготвена и оценета поларно вградена стационарна фаза (полистирен вграден во N-фенилмалеимид) за одвојување на пептиди и трипсински дигести на HSA. Стационарната фаза беше подготвена со користење на следната стратегија. Порозните силициумски честички беа подготвени според постапката дадена во нашата претходна публикација со некои модификации на протоколот за подготовка. Односот на уреа, полиетилен гликол (PEG), TMOS, вода и оцетна киселина беше прилагоден за да се подготват силициумски честички со голема големина на порите. Второ, беше синтетизиран нов лиганд, фенилмалеимид-метил винил изоцијанат, кој беше употребен за дериватизација на силициумските честички за да се подготви поларна вградена стационарна фаза. Добиената стационарна фаза беше спакувана во колона од не'рѓосувачки челик (100 × 1,8 mm id) со користење на оптимизирана шема на пакување. Пакувањето на колоната е потпомогнато со механички вибрации за да се обезбеди формирање на хомоген слој во колоната. Оценете го одвојувањето на пептидните мешавини во спакуваната колона што се состои од пет пептиди; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Леуцин Енкефалин) и трипсин дигест на човечки серумски албумин (HAS). Беше забележано дека смесата од пептиди и трипсин дигестот на HSA се одвојуваат со добра резолуција и ефикасност. Перформансите на одвојување на PMP колоната беа споредени со оние на Ascentis Express RP-Amide колоната. Беше забележано дека и пептидите и протеините се добро растворени и ефикасни на PMP колоната, што беше поефикасно од колоната Ascentis Express RP-Amide.
PEG (полиетилен гликол), уреа, оцетна киселина, триметокси ортосиликат (TMOS), триметил хлоросилан (TMCS), трипсин, хуман серумски албумин (HSA), амониум хлорид, уреа, хексан метилдисилазан (HMDS), метакрилоил хлорид (MC), стирен, 4-хидрокси-TEMPO, бензоил пероксид (BPO), ацетонитрил од HPLC степен (ACN), метанол, 2-пропанол и ацетон купени од Sigma-Aldrich (Сент Луис, Мисури, САД).
Мешавина од уреа (8 g), полиетилен гликол (8 g) и 8 mL 0,01 N оцетна киселина се мешаше 10 минути, а потоа 24 mL TMOS беа додадени во ледено ладни услови. Реакционата смеса се загреваше на 40°C 6 часа, а потоа на 120°C 8 часа во автоклав од не'рѓосувачки челик. Водата се истураше и преостанатиот материјал се сушеше на 70°C 12 часа. Сушената мека маса беше мазно мелена во печка и калцинирана на 550°C 12 часа. Три серии беа подготвени и карактеризирани за да се испита репродуктивноста во големината на честичките, големината на порите и површината.
Со површинска модификација на силициумските честички со претходно синтетизиран лиганд фенилмалеимид-метилвинилизоцијанат (PCMP), проследено со радијална полимеризација со стирен, беше подготвено соединение што содржи поларна група. Стационарна фаза за агрегати и полистиренски ланци. Процесот на подготовка е опишан подолу.
N-фенилмалеимид (200 mg) и метил винил изоцијанат (100 mg) беа растворени во сув толуен, а 0,1 mL 2,2′-азоизобутиронитрил (AIBN) беше додаден во реакционата колба за да се подготви кополимер на фенилмалеимид-метил винил изоцијанат (PMCP). Смесата беше загревана на 60°C во тек на 3 часа, филтрирана и сушена во рерна на 40°C во тек на 3 часа.
Сушените силициумски честички (2 g) беа дисперзирани во сув толуен (100 mL), промешани и сонифицирани во колба со тркалезно дно од 500 mL во текот на 10 минути. PMCP (10 mg) беше растворен во толуен и додаден капка по капка во реакционата колба преку инка за капкање. Смесата беше рефлуксирана на 100°C во текот на 8 часа, филтрирана и измиена со ацетон и сушена на 60°C во текот на 3 часа. Потоа, PMCP-врзаните силициумски честички (100 g) беа растворени во толуен (200 ml) и беше додаден 4-хидрокси-TEMPO (2 mL) во присуство на 100 µL дибутилтин дилаурат како катализатор. Смесата беше мешана на 50°C во текот на 8 часа, филтрирана и сушена на 50°C во текот на 3 часа.
Стирен (1 mL), бензоил пероксид BPO (0,5 mL) и TEMPO-PMCP-прикачени силициумски честички (1,5 g) беа дисперзирани во толуен и прочистени со азот. Полимеризацијата на стиренот беше извршена на 100°C во тек на 12 часа. Добиениот производ беше измиен со метанол и сушен на 60°C преку ноќ. Целокупната шема на реакција е прикажана на Слика 1.
Примероците беа дегасифицирани на 393 K во тек на 1 час за да се добие преостанат притисок помал од 10-3 Torr. Количината на N2 адсорбирана при релативен притисок од P/P0 = 0,99 беше искористена за да се одреди вкупниот волумен на порите. Морфологијата на голите и лиганд-врзаните честички на силициум диоксид беше испитана со скенирачка електронска микроскопија (Hitachi High Technologies, Токио, Јапонија). Сушените примероци (гола силициум диоксид и лиганд-врзани честички на силициум диоксид) беа поставени на алуминиумска колона со помош на леплива јаглеродна лента. Примероците беа обложени со злато со помош на распрскувач Q150T, а на примероците беше нанесен слој од Au од 5 nm. Ова ја подобрува ефикасноста на процесот со користење на ниски напони и обезбедува фино зрнесто, ладно распрскување. За елементарна анализа беше користен елементарен анализатор Thermo Electron (Волтам, Масачусетс, САД). За да се добие распределбата на големината на честичките беше користен анализатор на големина на честички Malvern (Вустершир, Велика Британија) Mastersizer 2000. Голи силициумски честички и лиганд-врзан силициум диоксид Честичките (по 5 mg секоја) беа дисперзирани во 5 mL изопропанол, соникирани 10 минути, вртложни мешалки 5 минути и поставени на оптичката маса на Mastersizer. Термогравиметриската анализа беше извршена со брзина од 5 °C во минута во температурен опсег од 30 до 800 °C.
Теснозбирни колони од не'рѓосувачки челик обложени со стакло со димензии (100 × 1,8 mm внатрешно) беа спакувани со метод на пакување со кашеста маса, применувајќи ја истата постапка употребена во Реф. 31. Колона од не'рѓосувачки челик (обложена со стакло, 100 × 1,8 mm внатрешна површина) со излезен фитинг што содржи фрит од 1 µm беше поврзана со пакувач за кашеста маса (Alltech Deerfield, IL, САД). Подгответе кашеста маса од стационарна фаза со суспендирање на 150 mg стационарна фаза во 1,2 mL метанол и испратете ја во колоната за складирање. Метанолот беше користен како растворувач за кашеста маса, како и како погонски растворувач. Наполнете ја колоната последователно со примена на притисоци од 100 MP за 10 минути, 80 MP за 15 минути и 60 MP за 30 минути. За време на пакувањето, беа применети механички вибрации со два GC трескачи на колони (Alltech, Deerfield, IL, САД) за да се обезбеди рамномерно пакување на колоната. Затворете го пакувачот за кашеста маса и полека ослободете го притисокот за да спречите какво било оштетување во колоната. Исклучете ја колоната од единицата за пакување на кашеста маса и поврзете друг фитинг на влезот и на LC системот за да ги проверите неговите перформанси.
Конструирана е LC пумпа (10AD Shimadzu, Јапонија), инјектор (Valco (САД) C14 W.05) со инјекциска јамка од 50nL, мембрански дегасер (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS капиларен прозорец, специјален µLC детектор (UV-2075) и микроколони обложени со стакло. Користени се многу тесни и кратки цевки за поврзување за да се минимизира ефектот на дополнително проширување на колонската лента. По пакувањето, капиларите (50 μm id 365 и редуктивните капилари на спојување (50 μm) беа инсталирани на излезот од 1/16″ од редуктивниот спој. Собирањето податоци и хроматографската обработка беа извршени со користење на софтверот Multichro 2000. Мониторингот на 254 nm беше тестиран за UV апсорпција. Хроматографските податоци беа анализирани со OriginPro8 (Нортемптон, Масачусетс).
Албумин од човечки серум, лиофилизиран прав, ≥ 96% (електрофореза со агарозен гел) 3 mg измешан со трипсин (1,5 mg), 4,0 M уреа (1 mL) и 0,2 M амониум бикарбонат (1 mL). Растворот се мешаше 10 минути и се чуваше во водена бања на 37°C во тек на 6 часа, а потоа се гасеше со 1 mL 0,1% TFA. Филтрирајте го растворот и чувајте го под 4°C.
Одвојувањето на пептидните мешавини и трипсин дигестите на HSA беше оценето одделно на PMP колони. Проверете го одвојувањето на пептидната мешавина и трипсин дигестот на HSA со PMP колоната и споредете ги резултатите со колоната Ascentis Express RP-Amide. Теоретскиот број на плочата се пресметува на следниов начин:
SEM сликите на голи силициумски честички и лиганд-врзани силициумски честички се прикажани на Сл. 2. SEM сликите на голи силициумски честички (A, B) покажуваат дека, за разлика од нашите претходни студии, овие честички се сферични во кои честичките се издолжени или имаат неправилна симетрија. Површината на лиганд-врзаните силициумски честички (C, D) е помазна од онаа на голите силициумски честички, што може да се должи на облогата од полистиренски синџири на површината на силициумските честички.
Слики од скенирачки електронски микроскоп на голи честички од силициум диоксид (A, B) и честички од силициум диоксид поврзани со лиганд (C, D).
Распределбата на големината на честичките на голите силициумски честички и лиганд-врзаните силициумски честички се прикажани на Слика 3(A). Кривите на распределба на големината на честичките базирани на волумен покажаа дека големината на силициумските честички се зголемила по хемиската модификација (Слика 3A). Податоците за распределба на големината на честичките на силициумските честички од тековната и претходната студија се споредени во Табела 1(A). Големината на честичките базирани на волумен, d(0,5), на PMP е 3,36 μm, во споредба со нашата претходна студија со вредност ad(0,5) од 3,05 μm (честички од силициум врзани со полистирен)34. Оваа серија имаше потесна распределба на големината на честичките во споредба со нашата претходна студија поради различните соодноси на PEG, уреа, TMOS и оцетна киселина во реакционата смеса. Големината на честичките на PMP фазата е малку поголема од онаа на фазата на честички од силициум врзани со полистирен што претходно ја проучувавме. Ова значи дека површинската функционализација на силициумските честички со стирен таложила само слој од полистирен (0,97 µm) на површината на силициум, додека во PMP фазата дебелината на слојот била 1,38. µм.
Распределба на големината на честичките (A) и распределба на големината на порите (B) на голи честички од силициум диоксид и честички од силициум диоксид врзани со лиганд.
Големината на порите, волуменот на порите и површината на силициумските честички од оваа студија се дадени во Табела 1(Б). PSD профилите на голите силициумски честички и лиганд-врзаните силициумски честички се прикажани на Слика 3(Б). Резултатите се споредливи со нашата претходна студија. Големините на порите на голите и лиганд-врзаните силициумски честички се 310 и 241, соодветно, што укажува дека големината на порите се намалува за 69 по хемиската модификација, како што е прикажано во Табела 1(Б), а промената на кривата е прикажана на Слика 3(Б). Слично на тоа, волуменот на порите на силициумските честички се намалил од 0,67 на 0,58 cm3/g по хемиската модификација. Специфичната површина на силициумските честички што се проучуваат во моментов е 116 m2/g, што е споредливо со нашата претходна студија (124 m2/g). Како што е прикажано во Табела 1(Б), површината (m2/g) на силициумските честички исто така се намалила од 116 m2/g на 105 m2/g по хемиска модификација.
Резултатите од елементарната анализа на стационарната фаза се прикажани во Табела 2. Јаглеродното оптоварување на тековната стационарна фаза е 6,35%, што е помало од јаглеродното оптоварување на нашата претходна студија (честички силициум диоксид врзани со полистирен, 7,93%35 и 10,21%, соодветно)42. Јаглеродното оптоварување на тековната стационарна фаза е ниско, бидејќи во подготовката на тековната SP, покрај стиренот, беа користени и некои поларни лиганди како што се фенилмалеимид-метилвинилизоцијанат (PCMP) и 4-хидрокси-TEMPO. Тежинскиот процент на азот во тековната стационарна фаза е 2,21%, во споредба со 0,1735 и 0,85% по тежина азот во претходните студии, соодветно. Ова значи дека тежинскиот процент на азот е поголем во тековната стационарна фаза поради фенилмалеимидот. Слично на тоа, јаглеродните оптоварувања на производите (4) и (5) беа 2,7% и 2,9%, соодветно, додека јаглеродното оптоварување на финалниот производ (6) беше 6,35%, како што е прикажано во Табела 2. Губењето на тежината беше проверено со PMP стационарна фаза, а кривата TGA е прикажана на Слика 4. Кривата TGA покажува губење на тежината од 8,6%, што е во добра согласност со оптоварувањето со јаглерод (6,35%) бидејќи лигандите содржат не само C, туку и N, O и H.
Фенилмалеимид-метилвинилизоцијанат лигандот беше избран за површинска модификација на силициумските честички бидејќи има поларни фенилмалеимидни групи и винилизоцијанат групи. Винил изоцијанатните групи можат понатаму да реагираат со стирен преку жива радикална полимеризација. Втората причина е да се вметне група која има умерена интеракција со аналитот и нема силна електростатска интеракција помеѓу аналитот и стационарната фаза, бидејќи фенилмалеимидниот дел нема виртуелен полнеж при нормална pH вредност. Поларитетот на стационарната фаза може да се контролира со оптималната количина на стирен и времето на реакција на полимеризација со слободни радикали. Последниот чекор од реакцијата (полимеризација со слободни радикали) е критичен и може да ја промени поларитетот на стационарната фаза. Елементарна анализа беше извршена за да се провери оптоварувањето со јаглерод на овие стационарни фази. Беше забележано дека зголемувањето на количината на стирен и времето на реакција го зголемува оптоварувањето со јаглерод на стационарната фаза и обратно. SP подготвени со различни концентрации на стирен имаат различни оптоварувања со јаглерод. Повторно, ставете ги овие стационарни фази во колони од не'рѓосувачки челик и проверете ги нивните хроматографски перформанси (селективност, резолуција, N вредност, итн.). Врз основа на овие експерименти, беше избрана оптимизирана формулација за подготовка на стационарната фаза на PMP за да се обезбеди контролиран поларитет и добро задржување на аналитот.
Пет пептидни мешавини (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, леуцин енкефалин) беа исто така оценети со користење на PMP колона со мобилна фаза; 60/40 (v/v) ацетонитрил/вода (0,1% TFA) при проток од 80 μL/min. Под оптимални услови на елуирање, теоретскиот број на плочи (N) по колона (100 × 1,8 mm id) е 20.000 ± 100 (200.000 плочи/m²). Табела 3 ги дава вредностите на N за трите PMP колони, а хроматограмите се прикажани на Слика 5A. Брза анализа на PMP колона при висок проток (700 μL/min), пет пептиди беа елуирани во рок од една минута, вредностите на N беа многу добри, 13.500 ± 330 по колона (100 × 1,8 mm id), што одговара на 135.000 плочи/m² (Слика 5B). Три колони со идентична големина (100 × 1,8 mm id) беа спакувани со три различни серии на стационарна фаза на PMP за да се провери репродуктивноста. Концентрацијата на аналитот за секоја колона беше снимена со користење на оптимални услови за елуирање и бројот на теоретски плочи N и времето на задржување за да се одвои истата тест смеса на секоја колона. Податоците за репродуктивност за PMP колоните се прикажани во Табела 4. Репродуктивноста на PMP колоната добро корелира со многу ниски вредности на %RSD, како што е прикажано во Табела 3.
Одвојување на пептидна мешавина на PMP колона (B) и Ascentis Express RP-Амидна колона (A); мобилна фаза 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), димензии на PMP колоната (100 × 1,8 mm id); аналитички Редоследот на елуирање на соединенијата: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) и 5 ​​(леуцинска) киселина енкефалин)).
PMP колона (100 × 1,8 mm id) беше оценета за одвојување на триптички дигести на човечки серумски албумин во високо-перформансна течна хроматографија. Хроматограмот на Слика 6 покажува дека примерокот е добро одвоен и резолуцијата е многу добра. HSA дигестите беа анализирани со користење на брзина на проток од 100 µL/min, мобилна фаза 70/30 ацетонитрил/вода и 0,1% TFA. Како што е прикажано на хроматограмот (Слика 6), HSA дигестијата е поделена на 17 врвови што одговараат на 17 пептиди. Ефикасноста на одвојување на секој врв во HSA дигестот беше пресметана, а вредностите се дадени во Табела 5.
Триптичен дигест на HSA (100 × 1,8 mm id) беше одвоен на PMP колона; брзина на проток (100 µL/min), мобилна фаза 60/40 ацетонитрил/вода со 0,1% TFA.
каде што L е должината на колоната, η е вискозитетот на мобилната фаза, ΔP е повратниот притисок на колоната, а u е линеарната брзина на мобилната фаза. Пропустливоста на PMP колоната беше 2,5 × 10-14 m2, брзината на проток беше 25 μL/min, а беше користен 60/40 v/v ACN/вода. Пропустливоста на PMP колоната (100 × 1,8 mm id) беше слична на онаа од нашата претходна студија Ref.34. Пропустливоста на колоната исполнета со површински порозни честички е: 1,7 × 10-15 за честички од 1,3 μm, 3,1 × 10-15 за честички од 1,7 μm, 5,2 × 10-15 и 2,5 × 10-14 m2 за честички од 2,6 μm За честички од 5 μm 43. Затоа, пропустливоста на PMP фазата е слична на онаа на честичките од јадро-обвивка од 5 μm.
каде што Wx е тежината на колоната наполнета со хлороформ, Wy е тежината на колоната наполнета со метанол, а ρ е густината на растворувачот. Густини на метанол (ρ = 0,7866) и хлороформ (ρ = 1,484). Вкупната порозност на колоните SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 и колоните C18-Уреа 31 што претходно ги проучувавме беа 0,63 и 0,55, соодветно. Ова значи дека присуството на уреа лиганди ја намалува пропустливоста на стационарната фаза. Од друга страна, вкупната порозност на PMP колоната (100 × 1,8 mm id) е 0,60. Пропустливоста на PMP колоните е помала од онаа на колоните наполнети со C18-врзани силициумски честички, бидејќи во стационарните фази од типот C18, C18 лигандите се прикачени на силициумските честички како линеарни синџири, додека во стационарните фази од типот полистирен, се формира релативно дебел полимерен слој A. околу него. Во типичен експеримент, порозноста на колоната се пресметува како:
Слика 7А, Б ја прикажува колоната PMP (100 × 1,8 mm id) и колоната Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) користејќи ги истите услови на елуирање (т.е. 60/40 ACN/H2O и 0,1% TFA). ) од графиконот на ван Демтер. Одбрани пептидни мешавини (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Леуцин Енкефалин) беа подготвени во 20 µL. Минималната брзина на проток за обете колони е 800 µL/min. Минималните вредности на HETP при оптимална брзина на проток (80 µL/min) за PMP колоната и колоната Ascentis Express RP-Amide беа 2,6 µm и 3,9 µm, соодветно. Вредностите на HETP укажуваат дека ефикасноста на сепарација на PMP колоната (100 × 1,8 mm id) е многу подобра од комерцијално достапната колона Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id). Графиконот на ван Демтер на Сл. 7(A) покажува дека намалувањето на вредноста на N со зголемување на протокот не е значајно во споредба со нашата претходна студија. Повисоката ефикасност на сепарација на PMP колоната (100 × 1,8 mm id) id) во споредба со колоната Ascentis Express RP-Amide се базира на подобрувања во обликот, големината на честичките и сложените процедури за пакување на колоната што се користат во тековната работа34.
(A) дијаграм на ван Димтер (HETP наспроти линеарна брзина на мобилната фаза) добиен со употреба на PMP колона (100 × 1,8 mm id) во 60/40 ACN/H2O со 0,1% TFA. (B) дијаграм на ван Димтер (HETP наспроти линеарна брзина на мобилната фаза) добиен со употреба на колона Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) во 60/40 ACN/H2O со 0,1% TFA.
Стационарна фаза од поларно вграден полистирен беше подготвена и оценета за одвојување на синтетички пептидни мешавини и трипсински дигестии на човечки серумски албумин (HAS) во високо-перформансна течна хроматографија. Хроматографските перформанси на PMP колоните за пептидни мешавини се одлични во ефикасноста на одвојување и резолуцијата. Подобрените перформанси на одвојување на PMP колоните се должат на различни причини, како што се големината на честичките и големината на порите на силициумските честички, контролираната синтеза на стационарната фаза и комплексното пакување на колоната. Покрај високата ефикасност на одвојување, нискиот повратен притисок на колоната при високи брзини на проток е уште една предност на оваа стационарна фаза. PMP колоните покажуваат добра репродуктивност и можат да се користат за анализа на пептидни мешавини и трипсинска дигестија на различни протеини. Имаме намера да ја користиме оваа колона за одвојување на природни производи, биоактивни соединенија од лековити растенија и габични екстракти во течна хроматографија. Во иднина, PMP колоните ќе бидат оценети и за одвојување на протеини и моноклонални антитела.
Филд, ЈК, Еуерби, МР, Лау, Ј., Тегерсен, Х. и Петерсон, П. Истражување на системи за одвојување на пептиди со обратна фазна хроматографија, дел I: Развој на протокол за карактеризација на колони. J. Chromatography.1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Гомез, Б. и др. Подобрени активни пептиди дизајнирани за третман на заразни болести. Биотехнологија.Напредна.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Влиеге, П., Лисовски, В., Мартинез, Ј. и Крестчатиски, М. Синтетички терапевтски пептиди: науката и пазарот. откривање на лекови. 15 (1-2) денес, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Сие, Ф., Смит, РД и Шен, Ј. Напредна протеомска течна хроматографија. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Напредната течна хроматографија-масена спектрометрија овозможува вклучување на широко насочена метаболомика и протеомика. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Чеснат, СМ и Салисбери, ЏЈ Улогата на UHPLC во развојот на лекови. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Ву, Н. и Клаусен, АМ Фундаментални и практични аспекти на течна хроматографија под ултра висок притисок за брзи сепарации. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Рен, СА и Челичеф, П. Примена на ултра-високо-перформансна течна хроматографија во развојот на лекови. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Монолитни макропорозни хидрогели подготвени од емулзии со висока внатрешна фаза масло-во-вода за ефикасно прочистување на ентеровируси. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Ши, Ј., Ксијанг, Р., Хорват, К. и Вилкинс, ЈА Улогата на течната хроматографија во протеомиката. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Фекете, С., Веути, Ј.-Л. и Гиларме, Д. Нови трендови во одвојувањето на терапевтски пептиди и протеини со обратна фаза со течна хроматографија: теорија и примена. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Гилар, М., Оливова, П., Дејли, АЕ и Геблер, ЈЦ Дводимензионално раздвојување на пептиди со употреба на RP-RP-HPLC систем со употреба на различни pH вредности во првата и втората димензија на раздвојување. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Фелети, С. и др. Беа испитани карактеристиките на пренос на маса и кинетичките перформанси на високоефикасни хроматографски колони спакувани со C18 под 2 μm целосно и површински порозни честички. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Неодамнешни трендови и аналитички предизвици во изолацијата, идентификацијата и валидацијата на растителни биоактивни пептиди. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Протеомскиот пејзаж на царството на животот. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Низводна обработка на терапевтски пептиди со препаративна течна хроматографија. Molecule (Базел, Швајцарија) 26(15), 4688(2021).
Јанг, Ј. и Генг, Х. Мешана хроматографија и нејзина примена кај биополимери. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Жао, Г., Донг, X.-Y. и Сун, Y. Лиганди за мешана протеинска хроматографија: принцип, карактеризација и дизајн. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).