Terima kasih kerana melayari Nature.com. Versi pelayar yang anda gunakan mempunyai sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau mematikan mod keserasian dalam Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami akan memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Zarah silika berliang disediakan melalui kaedah sol-gel dengan beberapa pengubahsuaian untuk mendapatkan zarah makroberliang. Zarah-zarah ini telah diderivatisasi melalui pempolimeran pemindahan rantai pemecahan penambahan boleh balik (RAFT) dengan N-fenilmaleimida-metilvinilisosianat (PMI) dan stirena untuk menyediakan interkalasi N-fenilmaleimida bagi fasa pegun polistirena (PMP). Lajur keluli tahan karat lubang sempit (100 × 1.8 mm id) telah dibungkus melalui pembungkusan buburan. Pemisahan lajur PMP yang dinilai bagi campuran peptida yang terdiri daripada lima peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusin enkephalin) prestasi kromatografi) dan pencernaan tripsin albumin serum manusia (HAS). Di bawah keadaan elusi optimum, kiraan plat teori campuran peptida adalah setinggi 280,000 plat/m². Membandingkan prestasi pemisahan lajur yang dibangunkan dengan Ascentis komersial Dalam lajur RP-Amida Ekspres, diperhatikan bahawa prestasi pemisahan lajur PMP adalah lebih baik daripada lajur komersial dari segi kecekapan dan resolusi pemisahan.
Dalam beberapa tahun kebelakangan ini, industri biofarmaseutikal telah menjadi pasaran global yang berkembang pesat dengan peningkatan ketara dalam bahagian pasaran. Dengan pertumbuhan pesat industri biofarmaseutikal1,2,3, analisis peptida dan protein sangat diperlukan. Selain peptida sasaran, beberapa bendasing dihasilkan semasa sintesis peptida, justeru memerlukan penulenan kromatografi untuk mendapatkan peptida dengan ketulenan yang diingini. Analisis dan pencirian protein dalam cecair badan, tisu dan sel merupakan tugas yang sangat mencabar kerana bilangan spesies yang berpotensi dikesan dalam satu sampel. Walaupun spektrometri jisim merupakan alat yang berkesan untuk penjujukan peptida dan protein, jika sampel tersebut disuntik ke dalam spektrometer jisim dalam satu laluan, pemisahan tidak akan ideal. Masalah ini boleh dikurangkan dengan melaksanakan pemisahan kromatografi cecair (LC) sebelum analisis MS, yang akan mengurangkan bilangan analit yang memasuki spektrometer jisim pada masa tertentu4,5,6. Di samping itu, semasa pemisahan fasa cecair, analit boleh difokuskan di kawasan sempit, justeru menumpukan analit ini dan meningkatkan kepekaan pengesanan MS. Kromatografi cecair (LC) telah telah maju dengan ketara sejak sedekad yang lalu dan telah menjadi teknik yang popular dalam analisis proteomik7,8,9,10.
Kromatografi cecair fasa terbalik (RP-LC) digunakan secara meluas untuk penulenan dan pemisahan campuran peptida menggunakan silika diubah suai oktadesil (ODS) sebagai fasa pegun11,12,13. Walau bagaimanapun, fasa pegun RP tidak memberikan pemisahan peptida dan protein yang memuaskan kerana struktur kompleks dan sifat amfifiliknya 14,15. Oleh itu, fasa pegun yang direka khas diperlukan untuk menganalisis peptida dan protein dengan bahagian polar dan bukan polar untuk berinteraksi dan mengekalkan analit ini16. Kromatografi mod campuran, yang menyediakan interaksi multimodal, boleh menjadi alternatif kepada RP-LC untuk pemisahan peptida, protein dan campuran kompleks lain. Beberapa fasa pegun mod campuran telah disediakan, dan lajur yang diisi dengan fasa ini telah digunakan untuk pemisahan peptida dan protein17,18,19,20,21. Fasa pegun mod campuran (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalasi polar/RPLC) sesuai untuk pemisahan peptida dan protein kerana kehadiran kedua-dua polar dan kumpulan bukan polar22,23,24,25,26,27,28. Begitu juga, fasa pegun interkalasi polar dengan kumpulan polar yang terikat secara kovalen menunjukkan kuasa pemisahan yang baik dan selektiviti unik untuk analit polar dan bukan polar, kerana pemisahan bergantung pada interaksi antara analit dan fasa pegun. Interaksi multimodal 29, 30, 31, 32. Baru-baru ini, Zhang et al. 30 menyediakan fasa pegun poliamina yang ditamatkan dodesil dan berjaya memisahkan hidrokarbon, antidepresan, flavonoid, nukleosida, estrogen dan beberapa analit lain. Interkalator polar mempunyai kumpulan polar dan bukan polar, jadi ia boleh digunakan untuk memisahkan peptida dan protein yang mempunyai kedua-dua bahagian hidrofobik dan hidrofilik. Lajur terbenam polar (cth., lajur C18 terbenam amida) boleh didapati secara komersial di bawah nama dagangan lajur Ascentis Express RP-Amide, tetapi lajur ini hanya digunakan untuk analisis amina 33.
Dalam kajian semasa, fasa pegun terbenam kutub (polistirena terbenam N-fenilmaleimida) telah disediakan dan dinilai untuk pemisahan peptida dan pencernaan tripsin HSA. Fasa pegun disediakan menggunakan strategi berikut. Zarah silika berliang disediakan mengikut prosedur yang diberikan dalam penerbitan kami sebelum ini dengan beberapa pengubahsuaian pada protokol penyediaan. Nisbah urea, polietilena glikol (PEG), TMOS, asid asetik air telah diselaraskan untuk menyediakan zarah silika dengan saiz liang yang besar. Kedua, ligan baharu, fenilmaleimida-metil vinil isosianat, telah disintesis dan digunakan untuk menghasilkan zarah silika bagi menyediakan fasa pegun terbenam kutub. Fasa pegun yang terhasil telah dimasukkan ke dalam lajur keluli tahan karat (100 × 1.8 mm id) menggunakan skema pembungkusan yang dioptimumkan. Pembungkusan lajur dibantu dengan getaran mekanikal untuk memastikan lapisan homogen terbentuk di dalam lajur. Nilaikan pemisahan lajur yang dibungkus bagi campuran peptida yang terdiri daripada lima peptida; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leusina Enkephalin) dan pencernaan Tripsin albumin serum manusia (HAS). Campuran peptida dan pencernaan tripsin HSA diperhatikan terpisah dengan resolusi dan kecekapan yang baik. Prestasi pemisahan lajur PMP dibandingkan dengan lajur Ascentis Express RP-Amida. Kedua-dua peptida dan protein diperhatikan terlarut dengan baik dan cekap pada lajur PMP, yang lebih cekap daripada lajur Ascentis Express RP-Amida.
PEG (Polietilena Glikol), Urea, Asid Asetik, Trimetoksi Ortosilikat (TMOS), Trimetil Klorosilane (TMCS), Tripsin, Albumin Serum Manusia (HSA), Ammonium Klorida, Urea, Heksana Metildisilazane (HMDS), Metakriloil Klorida (MC), Stirena, 4-Hidroksi-TEMPO, Benzoil Peroksida (BPO), Asetonitril Gred HPLC (ACN), Metanol, 2-Propanol dan Aseton Dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Amerika Syarikat).
Campuran urea (8 g), polietilena glikol (8 g), dan 8 mL asid asetik 0.01 N telah dikacau selama 10 minit, dan kemudian 24 mL TMOS telah ditambah ke dalamnya dalam keadaan sejuk berais. Campuran tindak balas dipanaskan pada suhu 40°C selama 6 jam dan kemudian pada suhu 120°C selama 8 jam dalam autoklaf keluli tahan karat. Air dituang dan bahan baki dikeringkan pada suhu 70°C selama 12 jam. Jisim lembut kering dikisar halus dalam ketuhar dan dikalsin pada suhu 550°C selama 12 jam. Tiga kelompok telah disediakan dan dicirikan untuk mengkaji kebolehulangan dalam saiz zarah, saiz liang dan luas permukaan.
Melalui pengubahsuaian permukaan zarah silika dengan ligan pra-sintesis fenilaleimida-metilvinilisosianat (PCMP) diikuti dengan pempolimeran jejari dengan stirena, sebatian yang mengandungi kumpulan polar telah disediakan. Fasa pegun untuk agregat dan rantai polistirena. Proses penyediaan diterangkan di bawah.
N-fenilmaleimida (200 mg) dan metil vinil isosianat (100 mg) telah dilarutkan dalam toluena kering, dan 0.1 mL 2,2′-azoisobutironitrile (AIBN) telah ditambah ke dalam kelalang tindak balas untuk menyediakan kopolimer fenilmaleimida-metil vinil isosianat (PMCP). Campuran tersebut dipanaskan pada suhu 60°C selama 3 jam, ditapis dan dikeringkan dalam ketuhar pada suhu 40°C selama 3 jam.
Zarah silika kering (2 g) telah disebarkan dalam toluena kering (100 mL), dikacau dan disonikasi dalam kelalang dasar bulat 500 mL selama 10 minit. PMCP (10 mg) telah dilarutkan dalam toluena dan ditambah setitik demi setitik ke dalam kelalang tindak balas melalui corong titisan. Campuran tersebut telah direfluks pada suhu 100°C selama 8 jam, ditapis dan dibasuh dengan aseton dan dikeringkan pada suhu 60°C selama 3 jam. Kemudian, zarah silika yang terikat dengan PMCP (100 g) telah dilarutkan dalam toluena (200 ml) dan 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) telah ditambah dengan kehadiran 100 µL dibutiltin dilaurat sebagai mangkin. Campuran tersebut telah dikacau pada suhu 50°C selama 8 jam, ditapis dan dikeringkan pada suhu 50°C selama 3 jam.
Stirena (1 mL), benzoil peroksida BPO (0.5 mL), dan zarah silika yang dilekatkan TEMPO-PMCP (1.5 g) telah disebarkan dalam toluena dan disingkirkan dengan nitrogen. Pempolimeran stirena telah dijalankan pada suhu 100°C selama 12 jam. Produk yang terhasil telah dibasuh dengan metanol dan dikeringkan pada suhu 60°C semalaman. Skim tindak balas keseluruhan ditunjukkan dalam Rajah 1.
Sampel dinyahgas pada 393 K selama 1 jam untuk mendapatkan tekanan baki kurang daripada 10-3 Torr. Jumlah N2 yang terserap pada tekanan relatif P/P0 = 0.99 digunakan untuk menentukan jumlah isipadu liang. Morfologi zarah silika kosong dan terikat ligan telah diperiksa dengan mikroskop elektron imbasan (Hitachi High Technologies, Tokyo, Jepun). Sampel kering (silika kosong dan zarah silika terikat ligan) diletakkan pada lajur aluminium menggunakan pita karbon pelekat. Emas disalut pada sampel menggunakan penyalut percikan Q150T, dan lapisan Au 5 nm dimendapkan pada sampel. Ini meningkatkan kecekapan proses menggunakan voltan rendah dan memberikan percikan sejuk berbutir halus. Penganalisis unsur Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 telah digunakan untuk analisis unsur. Penganalisis saiz zarah Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 telah digunakan untuk mendapatkan taburan saiz zarah. Zarah silika kosong dan silika terikat ligan Zarah (5 mg setiap satu) telah disebarkan dalam 5 mL isopropanol, disonikasi selama 10 minit, divorteks selama 5 minit, dan diletakkan di atas meja optik Mastersizer. Analisis termogravimetri telah dilakukan pada kadar 5 °C seminit dalam julat suhu 30 hingga 800 °C.
Lajur lubang sempit keluli tahan karat berlapis kaca dengan dimensi (100 × 1.8 mm id) telah dibungkus menggunakan kaedah pembungkusan buburan, menggunakan prosedur yang sama yang digunakan dalam Ruj. 31. Satu tiang keluli tahan karat (berlapik kaca, 100 × 1.8 mm id) dengan kelengkapan alur keluar yang mengandungi frit 1 µm telah disambungkan kepada pembungkus buburan (Alltech Deerfield, IL, USA). Sediakan buburan fasa pegun dengan menggantung 150 mg fasa pegun dalam 1.2 mL metanol dan hantarkannya ke tiang penyimpanan. Metanol telah digunakan sebagai pelarut buburan serta pelarut pendorong. Isi tiang secara berurutan dengan mengenakan tekanan 100 MP selama 10 minit, 80 MP selama 15 minit, dan 60 MP selama 30 minit. Semasa pembungkusan, getaran mekanikal dikenakan dengan dua penggoncang tiang GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) untuk memastikan pembungkusan tiang yang seragam. Tutup pembungkus buburan dan lepaskan tekanan secara perlahan-lahan untuk mengelakkan sebarang kerosakan di dalam tiang. Putuskan sambungan tiang daripada unit pembungkusan buburan dan sambungkan kelengkapan lain ke saluran masuk dan ke sistem LC untuk memeriksa prestasinya.
Sebuah pam LC (10AD Shimadzu, Jepun), penyuntik (Valco (USA) C14 W.05) dengan gelung suntikan 50nL, penyahgas membran (Shimadzu DGU-14A), tingkap kapilari UV-VIS telah dibina. Pengesan peranti µLC khas (UV-2075) dan mikrokolum berlapis kaca. Gunakan tiub penyambung yang sangat sempit dan pendek untuk meminimumkan kesan pelebaran jalur kolum tambahan. Selepas pembungkusan, kapilari (50 μm id 365 dan kapilari kesatuan penurun (50 μm) dipasang pada saluran keluar 1/16″ kesatuan penurun. Pengumpulan data dan pemprosesan kromatografi dilakukan menggunakan perisian Multichro 2000. Pemantauan pada 254 nm Analit telah diuji untuk penyerapan UV. Data kromatografi dianalisis oleh OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin daripada serum manusia, serbuk liofilisasi, ≥ 96% (elektroforesis gel agarosa) 3 mg dicampur dengan tripsin (1.5 mg), 4.0 M urea (1 mL), dan 0.2 M ammonium bikarbonat (1 mL). Larutan dikacau selama 10 minit dan disimpan dalam mandian air pada suhu 37°C selama 6 jam, kemudian didinginkan dengan 1 mL 0.1% TFA. Tapis larutan dan simpan di bawah 4 °C.
Pemisahan campuran peptida dan pencernaan tripsin HSA dinilai secara berasingan pada lajur PMP. Periksa pemisahan campuran peptida dan pencernaan tripsin HSA oleh lajur PMP dan bandingkan hasilnya dengan lajur Ascentis Express RP-Amida. Nombor plat teori dikira seperti berikut:
Imej SEM zarah silika kosong dan zarah silika terikat ligan ditunjukkan dalam Rajah 2. Imej SEM zarah silika kosong (A, B) menunjukkan bahawa, berbeza dengan kajian kami sebelum ini, zarah-zarah ini berbentuk sfera di mana zarah-zarahnya memanjang atau mempunyai simetri yang tidak sekata. Permukaan zarah silika terikat ligan (C, D) adalah lebih licin daripada zarah silika kosong, yang mungkin disebabkan oleh lapisan rantai polistirena pada permukaan zarah silika.
Imej mikroskop elektron imbasan zarah silika kosong (A, B) dan zarah silika terikat ligan (C, D).
Taburan saiz zarah bagi zarah silika kosong dan zarah silika terikat ligan ditunjukkan dalam Rajah 3(A). Lengkung taburan saiz zarah berasaskan isipadu menunjukkan bahawa saiz zarah silika meningkat selepas pengubahsuaian kimia (Rajah 3A). Data taburan saiz zarah bagi zarah silika daripada kajian semasa dan kajian sebelumnya dibandingkan dalam Jadual 1(A). Saiz zarah berasaskan isipadu, d(0.5), bagi PMP ialah 3.36 μm, berbanding kajian kami sebelum ini dengan nilai ad(0.5) sebanyak 3.05 μm (zarah silika terikat polistirena)34. Kelompok ini mempunyai taburan saiz zarah yang lebih sempit berbanding kajian kami sebelum ini disebabkan oleh nisbah PEG, urea, TMOS dan asid asetik yang berbeza-beza dalam campuran tindak balas. Saiz zarah fasa PMP sedikit lebih besar daripada fasa zarah silika terikat polistirena yang kami kaji sebelum ini. Ini bermakna bahawa pemfungsian permukaan zarah silika dengan stirena hanya memendapkan lapisan polistirena (0.97 µm) pada permukaan silika, manakala dalam fasa PMP ketebalan lapisan adalah 1.38 µm.
Taburan saiz zarah (A) dan taburan saiz liang (B) zarah silika kosong dan zarah silika terikat ligan.
Saiz liang, isipadu liang dan luas permukaan zarah silika bagi kajian semasa diberikan dalam Jadual 1(B). Profil PSD bagi zarah silika kosong dan zarah silika terikat ligan ditunjukkan dalam Rajah 3(B). Keputusannya setanding dengan kajian kami sebelum ini. Saiz liang zarah silika kosong dan terikat ligan masing-masing ialah 310 dan 241, yang menunjukkan bahawa saiz liang berkurangan sebanyak 69 selepas pengubahsuaian kimia, seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 1(B), dan perubahan lengkung ditunjukkan dalam Rajah 3(B). Begitu juga, isipadu liang zarah silika berkurangan daripada 0.67 kepada 0.58 cm3/g selepas pengubahsuaian kimia. Luas permukaan spesifik zarah silika yang sedang dikaji ialah 116 m2/g, yang setanding dengan kajian kami sebelum ini (124 m2/g). Seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 1(B), luas permukaan (m2/g) zarah silika juga berkurangan daripada 116 m2/g kepada 105 m2/g selepas pengubahsuaian kimia. pengubahsuaian.
Keputusan analisis unsur fasa pegun ditunjukkan dalam Jadual 2. Beban karbon fasa pegun semasa adalah 6.35%, yang lebih rendah daripada beban karbon kajian kami sebelum ini (zarah silika terikat polistirena, masing-masing 7.93%35 dan 10.21%). Beban karbon fasa pegun semasa adalah rendah. Kerana dalam penyediaan SP semasa, selain stirena, beberapa ligan polar seperti fenilaleimida-metilvinilisosianat (PCMP) dan 4-hidroksi-TEMPO telah digunakan. Peratus berat nitrogen fasa pegun semasa adalah 2.21%, berbanding 0.1735 dan 0.85% berat nitrogen dalam kajian terdahulu. Ini bermakna bahawa peratusan berat nitrogen adalah lebih tinggi dalam fasa pegun semasa disebabkan oleh fenilaleimida. Begitu juga, beban karbon produk (4) dan (5) masing-masing adalah 2.7% dan 2.9%, manakala beban karbon akhir Produk (6) ialah 6.35%, seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 2. Penurunan berat telah diperiksa dengan fasa pegun PMP, dan lengkung TGA ditunjukkan dalam Rajah 4. Lengkung TGA menunjukkan penurunan berat sebanyak 8.6%, yang sepadan dengan pemuatan karbon (6.35%) kerana ligan bukan sahaja mengandungi C tetapi juga N, O, dan H.
Ligan fenilaleimida-metilvinilisosianat dipilih untuk pengubahsuaian permukaan zarah silika kerana ia mempunyai kumpulan fenilaleimida polar dan kumpulan vinilisosianat. Kumpulan vinil isosianat boleh bertindak balas selanjutnya dengan stirena melalui pempolimeran radikal hidup. Sebab kedua adalah untuk memasukkan kumpulan yang mempunyai interaksi sederhana dengan analit dan tiada interaksi elektrostatik yang kuat antara analit dan fasa pegun, kerana bahagian fenilaleimida tidak mempunyai cas maya pada pH normal. Kekutuban fasa pegun boleh dikawal oleh jumlah stirena yang optimum dan masa tindak balas pempolimeran radikal bebas. Langkah terakhir tindak balas (pempolimeran radikal bebas) adalah kritikal dan boleh mengubah kekutuban fasa pegun. Analisis unsur telah dilakukan untuk memeriksa pemuatan karbon fasa pegun ini. Diperhatikan bahawa peningkatan jumlah stirena dan masa tindak balas meningkatkan pemuatan karbon fasa pegun dan sebaliknya. SP yang disediakan dengan kepekatan stirena yang berbeza mempunyai pemuatan karbon yang berbeza. Sekali lagi, muatkan fasa pegun ini ke dalam lajur keluli tahan karat dan periksa prestasi kromatografinya. (selektiviti, resolusi, nilai N, dll.). Berdasarkan eksperimen ini, formulasi yang dioptimumkan telah dipilih untuk menyediakan fasa pegun PMP bagi memastikan kekutuban terkawal dan pengekalan analit yang baik.
Lima campuran peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusin enkephalin) juga dinilai menggunakan lajur PMP menggunakan fasa bergerak; 60/40 (v/v) asetonitril/air (0.1% TFA) pada kadar aliran 80 μL/min. Di bawah keadaan elusi optimum, nombor plat teori (N) setiap lajur (100 × 1.8 mm id) ialah 20,000 ± 100 (200,000 plat/m²). Jadual 3 memberikan nilai N untuk tiga lajur PMP dan kromatogram ditunjukkan dalam Rajah 5A. Analisis pantas pada lajur PMP pada kadar aliran tinggi (700 μL/min), lima peptida dielusi dalam masa satu minit, nilai N adalah sangat baik, 13,500 ± 330 setiap lajur (100 × 1.8 mm id), Sepadan dengan 135,000 plat/m (Rajah 5B). Tiga lajur bersaiz sama (100 × 1.8 mm id) telah diisi dengan tiga lot fasa pegun PMP yang berbeza untuk memeriksa kebolehulangan. Kepekatan analit bagi setiap lajur telah direkodkan menggunakan keadaan elusi optimum dan bilangan plat teori N dan masa pengekalan untuk memisahkan campuran ujian yang sama pada setiap lajur. Data kebolehulangan untuk lajur PMP ditunjukkan dalam Jadual 4. Kebolehulangan lajur PMP berkorelasi baik dengan nilai %RSD yang sangat rendah, seperti yang ditunjukkan dalam Jadual 3.
Pemisahan campuran peptida pada lajur PMP (B) dan lajur Ascentis Express RP-Amida (A); fasa bergerak 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), dimensi lajur PMP (100 × 1.8 mm id); analitikal Tertib elusi sebatian: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) dan 5 (leusin) asid enkephalin)).
Satu lajur PMP (100 × 1.8 mm id) telah dinilai untuk pemisahan digest triptik albumin serum manusia dalam kromatografi cecair berprestasi tinggi. Kromatogram dalam Rajah 6 menunjukkan bahawa sampel dipisahkan dengan baik dan resolusinya sangat baik. Digest HSA dianalisis menggunakan kadar aliran 100 µL/min, fasa bergerak 70/30 asetonitril/air dan 0.1% TFA. Seperti yang ditunjukkan dalam kromatogram (Rajah 6), pencernaan HSA telah dibahagikan kepada 17 puncak yang sepadan dengan 17 peptida. Kecekapan pemisahan setiap puncak dalam digest HSA telah dikira dan nilainya diberikan dalam Jadual 5.
Satu digest triptik HSA (100 × 1.8 mm id) telah diasingkan pada lajur PMP; kadar aliran (100 µL/min), fasa bergerak 60/40 asetonitril/air dengan 0.1% TFA.
di mana L ialah panjang lajur, η ialah kelikatan fasa bergerak, ΔP ialah tekanan balik lajur, dan u ialah halaju linear fasa bergerak. Kebolehtelapan lajur PMP ialah 2.5 × 10-14 m2, kadar aliran ialah 25 μL/min, dan 60/40 v/v ACN/air telah digunakan. Kebolehtelapan lajur PMP (100 × 1.8 mm id) adalah serupa dengan kajian kami sebelum ini Ruj.34. Kebolehtelapan lajur yang dipenuhi dengan zarah berliang superfisial ialah: 1.7 × 10-15 untuk zarah 1.3 μm, 3.1 × 10-15 untuk zarah 1.7 μm, 5.2 × 10-15 dan 2.5 × 10-14 m2 untuk zarah 2.6 μm Untuk zarah 5 μm 43. Oleh itu, kebolehtelapan fasa PMP adalah serupa dengan zarah teras-cangkerang 5 μm.
di mana Wx ialah berat turus yang diisi dengan kloroform, Wy ialah berat turus yang diisi dengan metanol, dan ρ ialah ketumpatan pelarut. Ketumpatan metanol (ρ = 0.7866) dan kloroform (ρ = 1.484). Jumlah keliangan turus ZARAK SILIKA-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 dan C18-Urea turus 31 yang telah kita kaji sebelum ini masing-masing ialah 0.63 dan 0.55. Ini bermakna kehadiran ligan urea mengurangkan kebolehtelapan fasa pegun. Sebaliknya, jumlah keliangan turus PMP (100 × 1.8 mm id) ialah 0.60. Kebolehtelapan turus PMP adalah lebih rendah daripada turus yang diisi dengan zarah silika terikat C18 kerana dalam fasa pegun jenis C18, ligan C18 dilekatkan pada zarah silika sebagai rantai linear, manakala dalam fasa pegun jenis polistirena, lapisan polimer yang agak tebal terbentuk di sekitar Dalam eksperimen biasa, keliangan lajur dikira sebagai:
Rajah 7A,B menunjukkan lajur PMP (100 × 1.8 mm id) dan lajur Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) menggunakan keadaan elusi yang sama (iaitu, 60/40 ACN/H2O dan 0.1% TFA). ) bagi plot van Deemter. Campuran peptida terpilih (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) telah disediakan dalam 20 µL/min. Kadar aliran minimum untuk kedua-dua lajur ialah 800 µL/min. Nilai HETP minimum pada kadar aliran optimum (80 µL/min) untuk lajur PMP dan lajur Ascentis Express RP-Amide masing-masing ialah 2.6 µm dan 3.9 µm. Nilai HETP menunjukkan bahawa kecekapan pemisahan lajur PMP (100 × 1.8 mm id) adalah jauh lebih baik daripada lajur Ascentis Express RP-Amide yang tersedia secara komersial (100 × 1.8 mm id). Plot van Deemter dalam Rajah 7(A) menunjukkan bahawa penurunan nilai N dengan peningkatan aliran adalah tidak ketara berbanding kajian kami sebelum ini. Kecekapan pemisahan lajur PMP yang lebih tinggi (100 × 1.8 mm id) berbanding lajur Ascentis Express RP-Amide adalah berdasarkan penambahbaikan dalam bentuk zarah, saiz dan prosedur pembungkusan lajur kompleks yang digunakan dalam kerja semasa34.
(A) plot van Deemter (HETP lawan halaju linear fasa bergerak) yang diperoleh menggunakan lajur PMP (100 × 1.8 mm id) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0.1% TFA.(B) plot van Deemter (HETP lawan halaju linear fasa bergerak) yang diperoleh menggunakan lajur Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0.1% TFA.
Fasa pegun polistirena terbenam kutub telah disediakan dan dinilai untuk pemisahan campuran peptida sintetik dan pencernaan tripsin albumin serum manusia (HAS) dalam kromatografi cecair berprestasi tinggi. Prestasi kromatografi lajur PMP untuk campuran peptida adalah sangat baik dalam kecekapan dan resolusi pemisahan. Prestasi pemisahan lajur PMP yang dipertingkatkan adalah disebabkan oleh pelbagai sebab, seperti saiz zarah dan saiz liang zarah silika, sintesis fasa pegun terkawal, dan pembungkusan lajur yang kompleks. Selain kecekapan pemisahan yang tinggi, tekanan balik lajur yang rendah pada kadar aliran yang tinggi adalah satu lagi kelebihan fasa pegun ini. Lajur PMP mempamerkan kebolehulangan yang baik dan boleh digunakan untuk analisis campuran peptida dan pencernaan tripsin pelbagai protein. Kami berhasrat untuk menggunakan lajur ini untuk pemisahan produk semula jadi, sebatian bioaktif daripada tumbuhan ubatan dan ekstrak kulat dalam kromatografi cecair. Pada masa hadapan, lajur PMP juga akan dinilai untuk pemisahan protein dan antibodi monoklonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Penyelidikan mengenai Sistem Pemisahan Peptida melalui Kromatografi Fasa Terbalik Bahagian I: Pembangunan Protokol Pencirian Lajur. J. Kromatografi.1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Peptida aktif yang dipertingkatkan direka untuk rawatan penyakit berjangkit. Bioteknologi.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptida terapeutik sintetik: sains dan pasaran. penemuan ubat.15 (1-2) hari ini, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi Cecair Proteomik Lanjutan.J. Kromatografi.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografi cecair lanjutan-spektrometri jisim membolehkan penggabungan metabolomik dan proteomik yang disasarkan secara meluas. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peranan UHPLC dalam pembangunan ubat.J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspek asas dan praktikal kromatografi cecair tekanan ultra tinggi untuk pemisahan pantas. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Aplikasi kromatografi cecair prestasi ultra tinggi dalam pembangunan ubat. J. Kromatografi.1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrogel makropori monolitik yang disediakan daripada emulsi fasa dalaman tinggi minyak dalam air untuk penulenan enterovirus yang cekap. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peranan kromatografi cecair dalam proteomik.J. Kromatografi.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Trend baru muncul dalam pemisahan kromatografi cecair fasa terbalik bagi peptida dan protein terapeutik: teori dan aplikasi. J. Pharmacy. Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan sistem RP-RP-HPLC menggunakan nilai pH yang berbeza dalam dimensi pemisahan pertama dan kedua. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Ciri-ciri pemindahan jisim dan prestasi kinetik lajur kromatografi berkecekapan tinggi yang dipenuhi dengan zarah C18 sub-2 μm yang berliang sepenuhnya dan superfisial telah dikaji. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Trend terkini dan cabaran analitikal dalam pengasingan, pengenalpastian dan pengesahan peptida bioaktif tumbuhan. anus. biologi anus. Kimia.410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB dkk. Landskap proteomik kerajaan kehidupan. Alam Semula Jadi 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Pemprosesan hiliran peptida terapeutik melalui kromatografi cecair preparatif. Molekul (Basel, Switzerland) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mod campuran dan aplikasinya kepada biopolimer.J. Kromatografi.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligan untuk kromatografi protein mod campuran: prinsip, pencirian dan reka bentuk. J. Bioteknologi.144(1), 3-11 (2009).