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Las partículas de sílice porosa se prepararon mediante un método sol-gel con algunas modificaciones para obtener partículas macroporosas. Estas partículas se derivatizaron mediante polimerización por transferencia de cadena de fragmentación por adición reversible (RAFT) con N-fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PMI) y estireno para preparar la intercalación de N-fenilmaleimida de la fase estacionaria de poliestireno (PMP). Las columnas de acero inoxidable de diámetro estrecho (100 × 1,8 mm de diámetro interior) se rellenaron mediante relleno en suspensión. Se evaluó la separación en columna de PMP de una mezcla de péptidos que consta de cinco péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina), rendimiento cromatográfico) y digestión con tripsina de albúmina sérica humana (HAS). En condiciones óptimas de elución, el recuento teórico en placa de la mezcla de péptidos es de hasta 280.000. Al comparar el rendimiento de separación de la columna desarrollada con la columna comercial Ascentis Express RP-Amide, se observó que el rendimiento de separación de la columna PMP fue superior a la columna comercial en términos de eficiencia de separación y resolución.
En los últimos años, la industria biofarmacéutica se ha convertido en un mercado global en expansión con un aumento sustancial en la participación de mercado. Con el crecimiento explosivo de la industria biofarmacéutica1,2,3, el análisis de péptidos y proteínas es muy deseado. Además del péptido objetivo, se generan varias impurezas durante la síntesis de péptidos, lo que requiere purificación cromatográfica para obtener péptidos de la pureza deseada. El análisis y la caracterización de proteínas en fluidos corporales, tejidos y células es una tarea extremadamente desafiante debido a la gran cantidad de especies potencialmente detectables en una sola muestra. Aunque la espectrometría de masas es una herramienta eficaz para la secuenciación de péptidos y proteínas, si dichas muestras se inyectan en el espectrómetro de masas en una sola pasada, la separación no será ideal. Este problema se puede mitigar implementando separaciones por cromatografía líquida (LC) antes del análisis MS, lo que reducirá la cantidad de analitos que ingresan al espectrómetro de masas en un momento dado4,5,6. Además, durante la separación en fase líquida, los analitos se pueden enfocar en regiones estrechas, concentrándolos así y mejorando Sensibilidad de detección de MS. La cromatografía líquida (LC) ha avanzado significativamente durante la última década y se ha convertido en una técnica popular en el análisis proteómico7,8,9,10.
La cromatografía líquida de fase reversa (RP-LC) se usa ampliamente para la purificación y separación de mezclas de péptidos utilizando sílice modificada con octadecilo (ODS) como fase estacionaria11,12,13. Sin embargo, las fases estacionarias RP no proporcionan una separación satisfactoria de péptidos y proteínas debido a su estructura compleja y naturaleza anfifílica 14,15. Por lo tanto, se requieren fases estacionarias especialmente diseñadas para analizar péptidos y proteínas con grupos polares y no polares para interactuar con estos analitos y retenerlos16. La cromatografía de modo mixto, que proporciona interacciones multimodales, puede ser una alternativa a la RP-LC para la separación de péptidos, proteínas y otras mezclas complejas. Se han preparado varias fases estacionarias de modo mixto y se han utilizado columnas empaquetadas con estas fases para separaciones de péptidos y proteínas17,18,19,20,21. Las fases estacionarias de modo mixto (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polar Las técnicas de intercalación (RPLC) son adecuadas para la separación de péptidos y proteínas debido a la presencia de grupos polares y apolares22,23,24,25,26,27,28. De igual manera, las fases estacionarias intercalantes polares con grupos polares unidos covalentemente muestran un buen poder de separación y una selectividad única para analitos polares y apolares, ya que la separación depende de la interacción entre el analito y la fase estacionaria. Interacciones multimodales29, 30, 31, 32. Recientemente, Zhang et al. 30 preparó una fase estacionaria de poliamina con terminación en dodecilo y separó con éxito hidrocarburos, antidepresivos, flavonoides, nucleósidos, estrógenos y varios otros analitos. El intercalador polar tiene grupos polares y no polares, por lo que se puede utilizar para separar péptidos y proteínas que tienen fracciones tanto hidrofóbicas como hidrofílicas. Las columnas con incrustaciones polares (por ejemplo, columnas C18 con incrustaciones de amida) están disponibles comercialmente bajo el nombre comercial de columnas Ascentis Express RP-Amide, pero estas columnas se utilizan solo para el análisis de la amina 33.
En el estudio actual, se preparó una fase estacionaria incrustada polar (poliestireno incrustado en N-fenilmaleimida) y se evaluó para la separación de péptidos y digestos de tripsina de HSA. La fase estacionaria se preparó utilizando la siguiente estrategia. Las partículas de sílice porosa se prepararon de acuerdo con el procedimiento proporcionado en nuestra publicación anterior con algunas modificaciones al protocolo de preparación. La proporción de urea, polietilenglicol (PEG), TMOS, agua y ácido acético se ajustó para preparar partículas de sílice con un tamaño de poro grande. En segundo lugar, se sintetizó un nuevo ligando, fenilmaleimida-metil vinil isocianato, y se utilizó para derivatizar partículas de sílice para preparar una fase estacionaria incrustada polar. La fase estacionaria resultante se empaquetó en una columna de acero inoxidable (100 × 1,8 mm de diámetro interior) utilizando el esquema de empaquetamiento optimizado. El empaque de la columna se ayuda con vibración mecánica para garantizar que se forme un lecho homogéneo dentro de la columna. Evalúe la separación en columna empaquetada de mezclas de péptidos que constan de cinco péptidos; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) y digestión con tripsina de albúmina sérica humana (HAS). Se observó que la mezcla de péptidos y la digestión con tripsina de HSA se separaban con buena resolución y eficiencia. El rendimiento de separación de la columna PMP se comparó con el de la columna Ascentis Express RP-Amide. Se observó que tanto los péptidos como las proteínas estaban bien resueltos y eran eficientes en la columna PMP, que era más eficiente que la columna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicol), urea, ácido acético, ortosilicato de trimetoxi (TMOS), trimetilclorosilano (TMCS), tripsina, albúmina de suero humano (HSA), cloruro de amonio, urea, hexano metildisilazano (HMDS), cloruro de metacriloílo (MC), estireno, 4-hidroxi-TEMPO, peróxido de benzoilo (BPO), acetonitrilo de grado HPLC (ACN), metanol, 2-propanol y acetona adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).
Una mezcla de urea (8 g), polietilenglicol (8 g) y 8 ml de ácido acético 0,01 N se agitó durante 10 minutos y luego se añadieron 24 ml de TMOS en condiciones de hielo. La mezcla de reacción se calentó a 40 °C durante 6 horas y luego a 120 °C durante 8 horas en un autoclave de acero inoxidable. Se vertió el agua y el material residual se secó a 70 °C durante 12 horas. La masa blanda seca se molió suavemente en un horno y se calcinó a 550 °C durante 12 horas. Se prepararon y caracterizaron tres lotes para examinar la reproducibilidad en tamaño de partícula, tamaño de poro y área superficial.
Mediante la modificación superficial de partículas de sílice con el ligando presintetizado fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP), seguida de polimerización radial con estireno, se preparó un compuesto con grupos polares. Fase estacionaria para agregados y cadenas de poliestireno. El proceso de preparación se describe a continuación.
Se disolvieron N-fenilmaleimida (200 mg) e isocianato de metil vinilo (100 mg) en tolueno seco y se añadieron 0,1 mL de 2,2'-azoisobutironitrilo (AIBN) al matraz de reacción para preparar un copolímero de fenilmaleimida-isocianato de metil vinilo (PMCP). La mezcla se calentó a 60 °C durante 3 horas, se filtró y se secó en un horno a 40 °C durante 3 horas.
Las partículas de sílice secas (2 g) se dispersaron en tolueno seco (100 mL), se agitaron y se sonicaron en un matraz de fondo redondo de 500 mL durante 10 min. El PMCP (10 mg) se disolvió en tolueno y se añadió gota a gota al matraz de reacción a través de un embudo de goteo. La mezcla se calentó a reflujo a 100 °C durante 8 horas, se filtró y se lavó con acetona y se secó a 60 °C durante 3 horas. Luego, las partículas de sílice unidas a PMCP (100 g) se disolvieron en tolueno (200 ml) y se añadió 4-hidroxi-TEMPO (2 mL) en presencia de 100 µL de dilaurato de dibutilestaño como catalizador. La mezcla se agitó a 50 °C durante 8 horas, se filtró y se secó a 50 °C durante 3 horas.
Se dispersaron estireno (1 mL), peróxido de benzoilo BPO (0,5 mL) y partículas de sílice unidas a TEMPO-PMCP (1,5 g) en tolueno y se purgaron con nitrógeno. La polimerización del estireno se llevó a cabo a 100 °C durante 12 horas. El producto resultante se lavó con metanol y se secó a 60 °C durante la noche. El esquema de reacción general se muestra en la Figura 1.
Las muestras se desgasificaron a 393 K durante 1 hora para obtener una presión residual inferior a 10-3 Torr. La cantidad de N2 adsorbida a una presión relativa de P/P0 = 0,99 se utilizó para determinar el volumen poroso total. La morfología de las partículas de sílice desnudas y ligadas a ligando se examinó con microscopía electrónica de barrido (Hitachi High Technologies, Tokio, Japón). Las muestras secas (sílice desnuda y partículas de sílice ligadas a ligando) se colocaron en una columna de aluminio utilizando cinta adhesiva de carbono. Se recubrieron las muestras con oro utilizando un recubridor de pulverización catódica Q150T y se depositó una capa de Au de 5 nm sobre ellas. Esto mejora la eficiencia del proceso utilizando bajos voltajes y proporciona una pulverización catódica en frío de grano fino. Se utilizó un analizador elemental Thermo Electron (Waltham, MA, EE. UU.) Flash EA1112 para el análisis elemental. Se utilizó un analizador de tamaño de partícula Malvern (Worcestershire, Reino Unido) Mastersizer 2000 para obtener el tamaño de partícula. Las partículas de sílice desnudas y las partículas de sílice unidas a ligando (5 mg cada una) se dispersaron en 5 ml de isopropanol, se sonicaron durante 10 minutos, se agitaron en vórtex durante 5 minutos y se colocaron en el banco óptico del Mastersizer. El análisis termogravimétrico se realizó a una velocidad de 5 °C por minuto en un rango de temperatura de 30 a 800 °C.
Se rellenaron columnas de acero inoxidable de diámetro estrecho revestidas de vidrio de dimensiones (100 × 1,8 mm de diámetro interior) utilizando el método de rellenado en suspensión, aplicando el mismo procedimiento utilizado en la Ref. 31. Una columna de acero inoxidable (revestida de vidrio, 100 × 1,8 mm de diámetro interior) con un conector de salida que contenía una frita de 1 µm se conectó a un empaquetador de lechada (Alltech, Deerfield, IL, EE. UU.). Prepare una lechada de fase estacionaria suspendiendo 150 mg de fase estacionaria en 1,2 ml de metanol y envíela a la columna de almacenamiento. Se utilizó metanol como disolvente de la lechada, así como disolvente propulsor. Llene la columna secuencialmente aplicando presiones de 100 MP durante 10 minutos, 80 MP durante 15 minutos y 60 MP durante 30 minutos. Durante el empaquetamiento, se aplicó vibración mecánica con dos agitadores de columna de GC (Alltech, Deerfield, IL, EE. UU.) para asegurar un empaquetamiento uniforme de la columna. Cierre el empaquetador de lechada y libere la presión lentamente para evitar cualquier daño dentro de la columna. Desconecte la columna de la unidad de empaquetamiento de lechada y conecte otro conector al entrada y al sistema LC para comprobar su funcionamiento.
Se construyó una bomba LC (10AD Shimadzu, Japón), un inyector (Valco (EE. UU.) C14 W.05) con un bucle de inyección de 50 nL, un desgasificador de membrana (Shimadzu DGU-14A), una ventana capilar UV-VIS, un detector de dispositivo µLC especial (UV-2075) y microcolumnas revestidas de vidrio. Use tubos de conexión muy estrechos y cortos para minimizar el efecto del ensanchamiento de la banda de la columna adicional. Después del empaquetado, se instalaron capilares (50 μm de diámetro interior 365 y capilares de unión reductora (50 μm) en la salida de 1/16″ de la unión reductora. La recopilación de datos y el procesamiento cromatográfico se realizaron utilizando el software Multichro 2000. Monitoreo a 254 nm Los analitos se probaron para la absorbancia UV. Los datos cromatográficos se analizaron mediante OriginPro8 (Northampton, MA).
Albúmina de suero humano, polvo liofilizado, ≥ 96% (electroforesis en gel de agarosa) 3 mg mezclado con tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 mL) y bicarbonato de amonio 0,2 M (1 mL). La solución se agitó durante 10 minutos y se mantuvo en un baño de agua a 37 °C durante 6 horas, luego se enfrió con 1 mL de TFA al 0,1%. Filtrar la solución y almacenar por debajo de 4 °C.
La separación de mezclas de péptidos y digestos de tripsina de HSA se evaluaron por separado en columnas PMP. Verifique la separación de la mezcla de péptidos y el digesto de tripsina de HSA mediante la columna PMP y compare los resultados con la columna Ascentis Express RP-Amide. El número de plato teórico se calcula de la siguiente manera:
Las imágenes SEM de partículas de sílice desnudas y partículas de sílice unidas a ligando se muestran en la FIG. 2. Las imágenes SEM de partículas de sílice desnudas (A, B) muestran que, en contraste con nuestros estudios anteriores, estas partículas son esféricas en las que las partículas son alargadas o tienen simetría irregular. La superficie de las partículas de sílice unidas a ligando (C, D) es más lisa que la de las partículas de sílice desnudas, lo que puede deberse al recubrimiento de cadenas de poliestireno en la superficie de las partículas de sílice.
Imágenes de microscopio electrónico de barrido de partículas de sílice desnudas (A, B) y partículas de sílice unidas mediante ligando (C, D).
Las distribuciones de tamaño de partícula de partículas de sílice desnudas y partículas de sílice unidas a ligando se muestran en la Figura 3(A). Las curvas de distribución de tamaño de partícula basadas en volumen mostraron que el tamaño de las partículas de sílice aumentó después de la modificación química (Fig. 3A). Los datos de distribución de tamaño de partícula de las partículas de sílice del estudio actual y el estudio previo se comparan en la Tabla 1(A). El tamaño de partícula basado en volumen, d(0.5), de PMP es de 3.36 μm, en comparación con nuestro estudio previo con un valor d(0.5) de 3.05 μm (partículas de sílice unidas a poliestireno)34. Este lote tuvo una distribución de tamaño de partícula más estrecha en comparación con nuestro estudio previo debido a las proporciones variables de PEG, urea, TMOS y ácido acético en la mezcla de reacción. El tamaño de partícula de la fase de PMP es ligeramente mayor que el de la fase de partículas de sílice unidas a poliestireno que estudiamos previamente. Esto significa que la funcionalización de la superficie de las partículas de sílice con estireno solo depositó una capa de poliestireno. (0,97 µm) en la superficie de sílice, mientras que en la fase PMP el espesor de la capa fue de 1,38 µm.
Distribución del tamaño de partículas (A) y distribución del tamaño de poro (B) de partículas de sílice desnudas y partículas de sílice unidas a ligando.
El tamaño de poro, el volumen de poro y el área superficial de las partículas de sílice del estudio actual se dan en la Tabla 1 (B). Los perfiles PSD de partículas de sílice desnudas y partículas de sílice unidas a ligando se muestran en la Figura 3 (B). Los resultados son comparables a nuestro estudio anterior. Los tamaños de poro de las partículas de sílice desnudas y unidas a ligando son 310 y 241, respectivamente, lo que indica que el tamaño de poro disminuye en 69 después de la modificación química, como se muestra en la Tabla 1 (B), y el cambio de la curva se muestra en la Fig. 3 (B). De manera similar, el volumen de poro de las partículas de sílice disminuyó de 0,67 a 0,58 cm3 / g después de la modificación química. El área superficial específica de las partículas de sílice estudiadas actualmente es de 116 m2 / g, que es comparable a nuestro estudio anterior (124 m2 / g). Como se muestra en la Tabla 1 (B), el área superficial (m2 / g) de las partículas de sílice también disminuyó de 116 m2/g a 105 m2/g después de la modificación química.
Los resultados del análisis elemental de la fase estacionaria se muestran en la Tabla 2. La carga de carbono de la fase estacionaria actual es de 6.35%, que es menor que la carga de carbono de nuestro estudio anterior (partículas de sílice unidas con poliestireno, 7.93%35 y 10.21%, respectivamente) 42. La carga de carbono de la fase estacionaria actual es baja, porque en la preparación del SP actual, además de estireno, se utilizaron algunos ligandos polares como fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP) y 4-hidroxi-TEMPO. El porcentaje en peso de nitrógeno de la fase estacionaria actual es de 2.21%, en comparación con 0.1735 y 0.85% en peso de nitrógeno en estudios previos, respectivamente. Esto significa que el % en peso de nitrógeno es mayor en la fase estacionaria actual debido a la fenilmaleimida. De manera similar, las cargas de carbono de los productos (4) y (5) fueron 2.7% y 2.9%, respectivamente, mientras que la carga de carbono del producto final (6) fue de 6,35%, como se muestra en la Tabla 2. La pérdida de peso se verificó con la fase estacionaria PMP, y la curva TGA se muestra en la Figura 4. La curva TGA muestra una pérdida de peso de 8,6%, que está en buen acuerdo con la carga de carbono (6,35%) porque los ligandos contienen no solo C sino también N, O y H.
El ligando fenilmaleimida-metilvinilisocianato se eligió para la modificación superficial de partículas de sílice debido a sus grupos fenilmaleimida y vinilisocianato polares. Los grupos vinilisocianato pueden reaccionar con el estireno mediante polimerización radical viva. La segunda razón es insertar un grupo con una interacción moderada con el analito y sin una fuerte interacción electrostática entre este y la fase estacionaria, ya que la fracción fenilmaleimida no tiene carga virtual a pH normal. La polaridad de la fase estacionaria se puede controlar mediante la cantidad óptima de estireno y el tiempo de reacción de la polimerización por radicales libres. El último paso de la reacción (polimerización por radicales libres) es crítico y puede cambiar la polaridad de la fase estacionaria. Se realizó un análisis elemental para verificar la carga de carbono de estas fases estacionarias. Se observó que al aumentar la cantidad de estireno y el tiempo de reacción, aumentaba la carga de carbono de la fase estacionaria y viceversa. Los SP preparados con diferentes concentraciones de estireno tienen diferentes cargas de carbono. Cargas. Nuevamente, cargue estas fases estacionarias en columnas de acero inoxidable y verifique su desempeño cromatográfico (selectividad, resolución, valor N, etc.). Con base en estos experimentos, se seleccionó una formulación optimizada para preparar la fase estacionaria de PMP para asegurar una polaridad controlada y una buena retención del analito.
También se evaluaron cinco mezclas de péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) utilizando una columna PMP usando una fase móvil; 60/40 (v/v) acetonitrilo/agua (0,1 % TFA) a un caudal de 80 μL/min. En condiciones óptimas de elución, el número de platos teórico (N) por columna (100 × 1,8 mm de diámetro interior) es de 20 000 ± 100 (200 000 platos/m²). La tabla 3 muestra los valores de N para las tres columnas de PMP, y los cromatogramas se muestran en la figura 5A. En un análisis rápido en una columna de PMP a un caudal alto (700 μL/min), se eluyeron cinco péptidos en un minuto; los valores de N fueron muy buenos: 13 500 ± 330 por columna (100 × 1,8 mm de diámetro interior), lo que corresponde a 135 000 platos/m² (figura 5B). Tres columnas de tamaño idéntico (100 × 1,8 mm de diámetro interior) se rellenaron con tres lotes diferentes de fase estacionaria de PMP para comprobar la reproducibilidad. La concentración de analito para cada columna se registró utilizando las condiciones de elución óptimas y la cantidad de platos teóricos N y el tiempo de retención para separar la misma mezcla de prueba en cada columna. Los datos de reproducibilidad de las columnas de PMP se muestran en la Tabla 4. La reproducibilidad de la columna de PMP se correlaciona bien con valores muy bajos de %RSD, como se muestra en la Tabla 3.
Separación de la mezcla de péptidos en la columna PMP (B) y la columna Ascentis Express RP-Amide (A); fase móvil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensiones de la columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior); análisis El orden de elución de los compuestos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) y 5 (leucina) encefalina ácida)).
Se evaluó una columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) para la separación de digestos tripsídicos de albúmina sérica humana en cromatografía líquida de alta resolución. El cromatograma de la Figura 6 muestra que la muestra está bien separada y la resolución es muy buena. Los digestos de HSA se analizaron utilizando un caudal de 100 µL/min, fase móvil 70/30 acetonitrilo/agua y 0,1% TFA. Como se muestra en el cromatograma (Figura 6), la digestión con HSA se ha dividido en 17 picos correspondientes a 17 péptidos. Se calculó la eficiencia de separación de cada pico en el digesto de HSA y los valores se dan en la Tabla 5.
Se separó un digerido tripsídico de HSA (100 × 1,8 mm de diámetro interior) en una columna PMP; velocidad de flujo (100 µL/min), fase móvil 60/40 acetonitrilo/agua con 0,1 % de TFA.
donde L es la longitud de la columna, η es la viscosidad de la fase móvil, ΔP es la contrapresión de la columna y u es la velocidad lineal de la fase móvil. La permeabilidad de la columna PMP fue de 2,5 × 10-14 m2, el caudal fue de 25 μL/min y se utilizó 60/40 v/v de ACN/agua. La permeabilidad de la columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) fue similar a la de nuestro estudio anterior Ref.34. La permeabilidad de la columna rellena con partículas superficialmente porosas es: 1,7 × 10-15 para partículas de 1,3 μm, 3,1 × 10-15 para partículas de 1,7 μm, 5,2 × 10-15 y 2,5 × 10-14 m2 para partículas de 2,6 μm Para partículas de 5 μm 43. Por lo tanto, la permeabilidad de la fase PMP es similar a la de las partículas núcleo-capa de 5 μm.
Donde Wx es el peso de la columna rellena de cloroformo, Wy es el peso de la columna rellena de metanol y ρ es la densidad del disolvente. Las densidades del metanol (ρ = 0,7866) y del cloroformo (ρ = 1,484) se muestran en la figura. La porosidad total de las columnas SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm de diámetro interior) 34 y de las columnas C18-Urea 31 que estudiamos previamente fue de 0,63 y 0,55, respectivamente. Esto significa que la presencia de ligandos de urea reduce la permeabilidad de la fase estacionaria. Por otro lado, la porosidad total de la columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) es de 0,60. La permeabilidad de las columnas PMP es menor que la de las columnas rellenas de partículas de sílice unidas a C18 porque en las fases estacionarias de tipo C18 los ligandos C18 están unidos a las partículas de sílice. como cadenas lineales, mientras que en las fases estacionarias de tipo poliestireno, se forma una capa de polímero relativamente gruesa a su alrededor. En un experimento típico, la porosidad de la columna se calcula como:
Las figuras 7A,B muestran la columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) y la columna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm de diámetro interior) utilizando las mismas condiciones de elución (es decir, 60/40 ACN/H2O y 0,1 % de TFA). ) del gráfico de van Deemter. Se prepararon mezclas de péptidos seleccionados (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) en 20 µL/ El caudal mínimo para ambas columnas es de 800 µL/min. Los valores mínimos de HETP al caudal óptimo (80 µL/min) para la columna PMP y la columna Ascentis Express RP-Amide fueron de 2,6 µm y 3,9 µm, respectivamente. Los valores de HETP indican que la eficiencia de separación de la columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) es mucho mejor que la columna Ascentis Express RP-Amide disponible comercialmente (100 × 1,8 mm de diámetro interior). El gráfico de van Deemter en la Fig. 7(A) muestra que la disminución del valor de N con el aumento del flujo no es significativa en comparación con nuestro Estudio previo. La mayor eficiencia de separación de la columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) en comparación con la columna Ascentis Express RP-Amide se basa en mejoras en la forma y el tamaño de las partículas, y en los complejos procedimientos de empaquetamiento de la columna utilizados en el trabajo actual34.
(A) Gráfico de van Deemter (HETP versus velocidad lineal de la fase móvil) obtenido utilizando una columna PMP (100 × 1,8 mm de diámetro interior) en 60/40 ACN/H2O con 0,1 % de TFA.(B) Gráfico de van Deemter (HETP versus velocidad lineal de la fase móvil) obtenido utilizando una columna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm de diámetro interior) en 60/40 ACN/H2O con 0,1 % de TFA.
Se preparó y evaluó una fase estacionaria de poliestireno con incrustación polar para la separación de mezclas de péptidos sintéticos y digestos de tripsina de albúmina sérica humana (HAS) en cromatografía líquida de alta resolución. El rendimiento cromatográfico de las columnas de PMP para mezclas de péptidos es excelente en eficiencia de separación y resolución. El rendimiento de separación mejorado de las columnas de PMP se debe a una variedad de razones, como el tamaño de partícula y el tamaño de poro de las partículas de sílice, la síntesis controlada de la fase estacionaria y el empaque complejo de la columna. Además de la alta eficiencia de separación, la baja contrapresión de la columna a altos caudales es otra ventaja de esta fase estacionaria. Las columnas de PMP exhiben buena reproducibilidad y se pueden utilizar para el análisis de mezclas de péptidos y la digestión con tripsina de varias proteínas. Tenemos la intención de utilizar esta columna para la separación de productos naturales, compuestos bioactivos de plantas medicinales y extractos de hongos en cromatografía líquida. En el futuro, las columnas de PMP también se evaluarán para la separación de proteínas y anticuerpos monoclonales.
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