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Se prepararon partículas de sílice porosas mediante un método sol-gel con algunas modificaciones para obtener partículas macroporosas. Estas partículas se derivatizaron mediante polimerización por transferencia de cadena por adición-fragmentación reversible (RAFT) con N-fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PMI) y estireno para preparar la fase estacionaria de intercalación de poliestireno (PMP) con N-fenilmaleimida. Se empaquetaron columnas de acero inoxidable de diámetro estrecho (100 × 1,8 mm id) mediante empaquetamiento en suspensión. Se evaluó la separación en columna de PMP de una mezcla de péptidos compuesta por cinco péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) y la digestión con tripsina de albúmina sérica humana (HAS). En condiciones de elución óptimas, el recuento de platos teóricos de la mezcla de péptidos es tan alto como 280.000. platos/m². Al comparar el rendimiento de separación de la columna desarrollada con la columna comercial Ascentis Express RP-Amide, se observó que el rendimiento de separación de la columna PMP era superior al de la columna comercial en términos de eficiencia de separación y resolución.
En los últimos años, la industria biofarmacéutica se ha convertido en un mercado global en expansión con un aumento sustancial de su cuota de mercado. Con el crecimiento explosivo de la industria biofarmacéutica1,2,3, el análisis de péptidos y proteínas es muy demandado. Además del péptido objetivo, durante la síntesis de péptidos se generan varias impurezas, lo que requiere una purificación cromatográfica para obtener péptidos con la pureza deseada. El análisis y la caracterización de proteínas en fluidos corporales, tejidos y células es una tarea extremadamente compleja debido a la gran cantidad de especies potencialmente detectables en una sola muestra. Si bien la espectrometría de masas es una herramienta eficaz para la secuenciación de péptidos y proteínas, si dichas muestras se inyectan en el espectrómetro de masas en una sola pasada, la separación no será ideal. Este problema puede mitigarse mediante la implementación de separaciones por cromatografía líquida (LC) previas al análisis por espectrometría de masas, lo que reducirá la cantidad de analitos que ingresan al espectrómetro de masas en un momento dado4,5,6. Además, durante la separación en fase líquida, los analitos pueden enfocarse en regiones estrechas, concentrándolos y mejorando la detección por espectrometría de masas. sensibilidad. La cromatografía líquida (LC) ha avanzado significativamente en la última década y se ha convertido en una técnica popular en el análisis proteómico7,8,9,10.
La cromatografía líquida de fase inversa (RP-LC) se utiliza ampliamente para la purificación y separación de mezclas de péptidos utilizando sílice modificada con octadecilo (ODS) como fase estacionaria11,12,13. Sin embargo, las fases estacionarias de RP no proporcionan una separación satisfactoria de péptidos y proteínas debido a su compleja estructura y naturaleza anfifílica14,15. Por lo tanto, se requieren fases estacionarias especialmente diseñadas para analizar péptidos y proteínas con fracciones polares y no polares que interactúen con estos analitos y los retengan16. La cromatografía de modo mixto, que proporciona interacciones multimodales, puede ser una alternativa a la RP-LC para la separación de péptidos, proteínas y otras mezclas complejas. Se han preparado varias fases estacionarias de modo mixto y se han utilizado columnas empaquetadas con estas fases para separaciones de péptidos y proteínas17,18,19,20,21. Las fases estacionarias de modo mixto (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalación polar/RPLC) son adecuadas para separaciones de péptidos y proteínas debido a la presencia de grupos polares y no polares22,23,24,25,26,27,28 .De manera similar, las fases estacionarias intercalantes polares con grupos polares unidos covalentemente muestran un buen poder de separación y una selectividad única para analitos polares y no polares, ya que la separación depende de la interacción entre el analito y la fase estacionaria. Interacciones multimodales 29, 30, 31, 32.Recientemente, Zhang et al. 30 prepararon una fase estacionaria de poliamina terminada en dodecilo y separaron con éxito hidrocarburos, antidepresivos, flavonoides, nucleósidos, estrógenos y otros analitos. El intercalador polar tiene grupos polares y no polares, por lo que puede utilizarse para separar péptidos y proteínas que tienen porciones hidrofóbicas e hidrofílicas. Las columnas con polar incorporado (por ejemplo, columnas C18 con amida incorporada) están disponibles comercialmente bajo el nombre comercial Ascentis Express RP-Amide columns, pero estas columnas se utilizan únicamente para el análisis de la amina 33.
En el presente estudio, se preparó una fase estacionaria incrustada polar (poliestireno incrustado con N-fenilmaleimida) y se evaluó para la separación de péptidos y digestiones de tripsina de HSA. La fase estacionaria se preparó utilizando la siguiente estrategia. Se prepararon partículas de sílice porosas de acuerdo con el procedimiento dado en nuestra publicación anterior con algunas modificaciones al protocolo de preparación. La proporción de urea, polietilenglicol (PEG), TMOS, agua y ácido acético se ajustó para preparar partículas de sílice con un gran tamaño de poro. En segundo lugar, se sintetizó un nuevo ligando, fenilmaleimida-metil vinil isocianato, y se utilizó para derivatizar partículas de sílice para preparar una fase estacionaria incrustada polar. La fase estacionaria resultante se empaquetó en una columna de acero inoxidable (100 × 1,8 mm id) utilizando el esquema de empaque optimizado. El empaque de la columna se asiste con vibración mecánica para asegurar que se forme un lecho homogéneo dentro de la columna. Evaluar la separación de la columna empaquetada de mezclas de péptidos que consisten en cinco péptidos; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) y digestión con tripsina de albúmina sérica humana (HAS). Se observó que la mezcla de péptidos y la digestión con tripsina de HSA se separaron con buena resolución y eficiencia. El rendimiento de separación de la columna PMP se comparó con el de la columna Ascentis Express RP-Amide. Se observó que tanto los péptidos como las proteínas se resolvieron bien y de manera eficiente en la columna PMP, que fue más eficiente que la columna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polietilenglicol), urea, ácido acético, ortosilicato de trimetoxilo (TMOS), clorosilano de trimetilo (TMCS), tripsina, albúmina sérica humana (HSA), cloruro de amonio, urea, hexano metildisilazano (HMDS), cloruro de metacriloilo (MC), estireno, 4-hidroxi-TEMPO, peróxido de benzoilo (BPO), acetonitrilo de grado HPLC (ACN), metanol, 2-propanol y acetona adquiridos de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, EE. UU.).
Se agitó una mezcla de urea (8 g), polietilenglicol (8 g) y 8 ml de ácido acético 0,01 N durante 10 minutos, y luego se añadieron 24 ml de TMOS en condiciones de frío intenso. La mezcla de reacción se calentó a 40 °C durante 6 horas y luego a 120 °C durante 8 horas en un autoclave de acero inoxidable. Se decantó el agua y el material residual se secó a 70 °C durante 12 horas. La masa blanda seca se molió finamente en un horno y se calcinó a 550 °C durante 12 horas. Se prepararon y caracterizaron tres lotes para examinar la reproducibilidad en el tamaño de partícula, el tamaño de poro y el área superficial.
Mediante la modificación superficial de partículas de sílice con el ligando presintetizado fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP), seguida de polimerización radial con estireno, se preparó un compuesto que contiene un grupo polar. Fase estacionaria para agregados y cadenas de poliestireno. El proceso de preparación se describe a continuación.
Se disolvieron 200 mg de N-fenilmaleimida y 100 mg de isocianato de metilvinilo en tolueno seco, y se añadieron 0,1 mL de 2,2′-azoisobutironitrilo (AIBN) al matraz de reacción para preparar el copolímero de fenilmaleimida-isocianato de metilvinilo (PMCP). La mezcla se calentó a 60 °C durante 3 horas, se filtró y se secó en un horno a 40 °C durante 3 horas.
Las partículas de sílice secas (2 g) se dispersaron en tolueno seco (100 mL), se agitaron y se sonicaron en un matraz de fondo redondo de 500 mL durante 10 min. El PMCP (10 mg) se disolvió en tolueno y se añadió gota a gota al matraz de reacción a través de un embudo de goteo. La mezcla se sometió a reflujo a 100 °C durante 8 horas, se filtró y se lavó con acetona y se secó a 60 °C durante 3 horas. Luego, las partículas de sílice unidas a PMCP (100 g) se disolvieron en tolueno (200 ml) y se añadió 4-hidroxi-TEMPO (2 mL) en presencia de 100 µL de dilaurato de dibutilestaño como catalizador. La mezcla se agitó a 50 °C durante 8 horas, se filtró y se secó a 50 °C durante 3 horas.
Se dispersaron 1 mL de estireno, 0,5 mL de peróxido de benzoílo (BPO) y 1,5 g de partículas de sílice unidas a TEMPO-PMCP en tolueno y se purgaron con nitrógeno. La polimerización del estireno se llevó a cabo a 100 °C durante 12 horas. El producto resultante se lavó con metanol y se secó a 60 °C durante toda la noche. El esquema general de la reacción se muestra en la Figura 1.
Las muestras se desgasificaron a 393 K durante 1 hora para obtener una presión residual inferior a 10⁻³ Torr. La cantidad de N₂ adsorbida a una presión relativa de P/P₀ = 0,99 se utilizó para determinar el volumen total de poros. La morfología de las partículas de sílice desnudas y unidas a ligandos se examinó mediante microscopía electrónica de barrido (Hitachi High Technologies, Tokio, Japón). Las muestras secas (partículas de sílice desnudas y unidas a ligandos) se colocaron en una columna de aluminio utilizando cinta adhesiva de carbono. Se depositó oro sobre las muestras utilizando un recubridor por pulverización catódica Q150T, y se depositó una capa de Au de 5 nm sobre las muestras. Esto mejora la eficiencia del proceso utilizando bajos voltajes y proporciona una pulverización catódica fría de grano fino. Se utilizó un analizador elemental Thermo Electron (Waltham, MA, EE. UU.) Flash EA1112 para el análisis elemental. Se utilizó un analizador de tamaño de partícula Malvern (Worcestershire, Reino Unido) Mastersizer 2000 para obtener la distribución del tamaño de partícula. Las partículas de sílice y las partículas de sílice unidas a ligandos (5 mg cada una) se dispersaron en 5 ml de isopropanol, se sometieron a sonicación durante 10 minutos, se agitaron en un vórtex durante 5 minutos y se colocaron en el banco óptico del Mastersizer. El análisis termogravimétrico se realizó a una velocidad de 5 °C por minuto en un rango de temperatura de 30 a 800 °C.
Las columnas de acero inoxidable de diámetro estrecho revestidas de vidrio de dimensiones (100 × 1,8 mm id) se empacaron utilizando el método de empaquetamiento en suspensión, aplicando el mismo procedimiento utilizado en la Ref. 31. Una columna de acero inoxidable (revestida de vidrio, 100 × 1,8 mm de diámetro interno) con un accesorio de salida que contiene una frita de 1 µm se conectó a un empaquetador de lodos (Alltech Deerfield, IL, EE. UU.). Prepare una suspensión de fase estacionaria suspendiendo 150 mg de fase estacionaria en 1,2 mL de metanol y envíela a la columna de almacenamiento. El metanol se utilizó como disolvente de la suspensión y como disolvente propulsor. Llene la columna secuencialmente aplicando presiones de 100 MPa durante 10 minutos, 80 MPa durante 15 minutos y 60 MPa durante 30 minutos. Durante el empaquetado, se aplicó vibración mecánica con dos agitadores de columna GC (Alltech, Deerfield, IL, EE. UU.) para asegurar un empaquetado uniforme de la columna. Cierre el empaquetador de lodos y libere la presión lentamente para evitar cualquier daño dentro de la columna. Desconecte la columna de la unidad de empaquetado de lodos y conecte otro accesorio a la entrada y a el sistema LC para comprobar su rendimiento.
Se construyó una bomba LC (10AD Shimadzu, Japón), inyector (Valco (EE. UU.) C14 W.05) con bucle de inyección de 50 nL, desgasificador de membrana (Shimadzu DGU-14A), ventana capilar UV-VIS Detector de dispositivo µLC especial (UV-2075) y microcolumnas revestidas de vidrio. Se utilizó un tubo de conexión muy estrecho y corto para minimizar el efecto del ensanchamiento de banda de la columna extra. Después del empaquetado, se instalaron capilares (50 μm id 365 y capilares de unión reductora (50 μm) en la salida de 1/16″ de la unión reductora. La recolección de datos y el procesamiento cromatográfico se realizaron utilizando el software Multichro 2000. Monitoreo a 254 nm Los analitos se probaron para la absorbancia UV. Los datos cromatográficos fueron analizados por OriginPro8 (Northampton, MA).
Albúmina de suero humano, polvo liofilizado, ≥ 96% (electroforesis en gel de agarosa) 3 mg mezclados con tripsina (1,5 mg), urea 4,0 M (1 mL) y bicarbonato de amonio 0,2 M (1 mL). La solución se agitó durante 10 minutos y se mantuvo en un baño de agua a 37 °C durante 6 horas, luego se neutralizó con 1 mL de TFA al 0,1%. Filtre la solución y almacénela por debajo de 4 °C.
La separación de mezclas de péptidos y digestiones de tripsina de HSA se evaluó por separado en columnas PMP. Verifique la separación de la mezcla de péptidos y la digestión de tripsina de HSA mediante la columna PMP y compare los resultados con la columna Ascentis Express RP-Amide. El número de platos teóricos se calcula de la siguiente manera:
Las imágenes SEM de partículas de sílice sin recubrimiento y partículas de sílice con ligandos unidos se muestran en la FIG. 2. Las imágenes SEM de partículas de sílice sin recubrimiento (A, B) muestran que, a diferencia de nuestros estudios anteriores, estas partículas son esféricas, alargadas o con simetría irregular. La superficie de las partículas de sílice con ligandos unidos (C, D) es más lisa que la de las partículas de sílice sin recubrimiento, lo que puede deberse al recubrimiento de cadenas de poliestireno en la superficie de las partículas de sílice.
Imágenes de microscopio electrónico de barrido de partículas de sílice sin recubrimiento (A, B) y partículas de sílice unidas a ligandos (C, D).
Las distribuciones del tamaño de partícula de las partículas de sílice sin modificar y de las partículas de sílice unidas a ligandos se muestran en la Figura 3(A). Las curvas de distribución del tamaño de partícula basadas en el volumen mostraron que el tamaño de las partículas de sílice aumentó después de la modificación química (Fig. 3A). Los datos de distribución del tamaño de partícula de las partículas de sílice del presente estudio y del estudio anterior se comparan en la Tabla 1(A). El tamaño de partícula basado en el volumen, d(0,5), de PMP es de 3,36 μm, en comparación con nuestro estudio anterior con un valor ad(0,5) de 3,05 μm (partículas de sílice unidas a poliestireno)34. Este lote tuvo una distribución del tamaño de partícula más estrecha en comparación con nuestro estudio anterior debido a las proporciones variables de PEG, urea, TMOS y ácido acético en la mezcla de reacción. El tamaño de partícula de la fase PMP es ligeramente mayor que el de la fase de partículas de sílice unidas a poliestireno que estudiamos anteriormente. Esto significa que la funcionalización de la superficie de las partículas de sílice con estireno solo depositó una capa de poliestireno. (0,97 µm) en la superficie de sílice, mientras que en la fase PMP el espesor de la capa era de 1,38 µm.
Distribución del tamaño de partícula (A) y distribución del tamaño de poro (B) de partículas de sílice sin recubrimiento y partículas de sílice unidas a ligandos.
El tamaño de poro, el volumen de poro y el área superficial de las partículas de sílice del presente estudio se dan en la Tabla 1(B). Los perfiles PSD de partículas de sílice desnudas y partículas de sílice unidas a ligandos se muestran en la Figura 3(B). Los resultados son comparables a nuestro estudio anterior. Los tamaños de poro de las partículas de sílice desnudas y unidas a ligandos son 310 y 241, respectivamente, lo que indica que el tamaño de poro disminuye en 69 después de la modificación química, como se muestra en la Tabla 1(B), y el cambio de la curva se muestra en la Fig. 3(B). De manera similar, el volumen de poro de las partículas de sílice disminuyó de 0,67 a 0,58 cm3/g después de la modificación química. El área superficial específica de las partículas de sílice estudiadas actualmente es de 116 m2/g, que es comparable a nuestro estudio anterior (124 m2/g). Como se muestra en la Tabla 1(B), el área superficial (m2/g) de las partículas de sílice también disminuyó de 116 m2/g a 105 m2/g después de la modificación química.
Los resultados del análisis elemental de la fase estacionaria se muestran en la Tabla 2. La carga de carbono de la fase estacionaria actual es del 6,35%, que es menor que la carga de carbono de nuestro estudio anterior (partículas de sílice unidas con poliestireno, 7,93%35 y 10,21%, respectivamente) 42. La carga de carbono de la fase estacionaria actual es baja, porque en la preparación de la SP actual, además del estireno, se utilizaron algunos ligandos polares como fenilmaleimida-metilvinilisocianato (PCMP) y 4-hidroxi-TEMPO. El porcentaje en peso de nitrógeno de la fase estacionaria actual es del 2,21%, en comparación con el 0,1735 y el 0,85% en peso de nitrógeno en estudios anteriores, respectivamente. Esto significa que el % en peso de nitrógeno es mayor en la fase estacionaria actual debido a la fenilmaleimida. De manera similar, las cargas de carbono de los productos (4) y (5) fueron del 2,7% y del 2,9%, respectivamente, mientras que el La carga de carbono del producto final (6) fue del 6,35%, como se muestra en la Tabla 2. La pérdida de peso se verificó con la fase estacionaria PMP, y la curva TGA se muestra en la Figura 4. La curva TGA muestra una pérdida de peso del 8,6%, que está en buena concordancia con la carga de carbono (6,35%) porque los ligandos contienen no solo C sino también N, O y H.
El ligando fenilmaleimida-metilvinilisocianato fue elegido para la modificación superficial de partículas de sílice porque tiene grupos fenilmaleimida y vinilisocianato polares. Los grupos vinilisocianato pueden reaccionar más con estireno mediante polimerización radical viva. La segunda razón es insertar un grupo que tenga una interacción moderada con el analito y ninguna interacción electrostática fuerte entre el analito y la fase estacionaria, ya que la fracción fenilmaleimida no tiene carga virtual a pH normal. La polaridad de la fase estacionaria se puede controlar mediante la cantidad óptima de estireno y el tiempo de reacción de la polimerización radical libre. El último paso de la reacción (polimerización radical libre) es crítico y puede cambiar la polaridad de la fase estacionaria. Se realizó un análisis elemental para comprobar la carga de carbono de estas fases estacionarias. Se observó que aumentar la cantidad de estireno y el tiempo de reacción aumentaba la carga de carbono de la fase estacionaria y viceversa. Las SP preparadas con diferentes concentraciones de estireno tienen diferentes cargas de carbono. Nuevamente, cargue estas Se introdujeron fases estacionarias en columnas de acero inoxidable y se comprobó su rendimiento cromatográfico (selectividad, resolución, valor N, etc.). Basándose en estos experimentos, se seleccionó una formulación optimizada para preparar la fase estacionaria PMP con el fin de garantizar una polaridad controlada y una buena retención del analito.
También se evaluaron cinco mezclas de péptidos (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucina encefalina) utilizando una columna PMP con una fase móvil; 60/40 (v/v) acetonitrilo/agua (0,1% TFA) a un caudal de 80 μL/min. En condiciones óptimas de elución, el número de platos teóricos (N) por columna (100 × 1,8 mm id) es de 20.000 ± 100 (200.000 platos/m²). La Tabla 3 muestra los valores de N para las tres columnas PMP y los cromatogramas se muestran en la Figura 5A. Análisis rápido en una columna PMP a un caudal alto (700 μL/min), cinco péptidos se eluyeron en un minuto, los valores de N fueron muy buenos, 13.500 ± 330 por columna (100 × 1,8 mm id), corresponde a 135.000 platos/m (Figura 5B). Tres columnas de tamaño idéntico (100 × 1,8 mm Las columnas id) se llenaron con tres lotes diferentes de fase estacionaria PMP para comprobar la reproducibilidad. La concentración del analito para cada columna se registró utilizando las condiciones de elución óptimas y el número de platos teóricos N y el tiempo de retención para separar la misma mezcla de prueba en cada columna. Los datos de reproducibilidad para las columnas PMP se muestran en la Tabla 4. La reproducibilidad de la columna PMP se correlaciona bien con valores %RSD muy bajos, como se muestra en la Tabla 3.
Separación de la mezcla de péptidos en columna PMP (B) y columna Ascentis Express RP-Amide (A); fase móvil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensiones de la columna PMP (100 × 1,8 mm id); orden de elución analítica de los compuestos: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) y 5 (leucina) (encefalina ácida).
Se evaluó una columna PMP (100 × 1,8 mm id) para la separación de digestiones trípticas de albúmina sérica humana en cromatografía líquida de alto rendimiento. El cromatograma de la Figura 6 muestra que la muestra está bien separada y la resolución es muy buena. Las digestiones de HSA se analizaron utilizando un caudal de 100 µL/min, fase móvil 70/30 acetonitrilo/agua y 0,1 % TFA. Como se muestra en el cromatograma (Figura 6), la digestión de HSA se ha dividido en 17 picos correspondientes a 17 péptidos. Se calculó la eficiencia de separación de cada pico en la digestión de HSA y los valores se dan en la Tabla 5.
Un digesto tríptico de HSA (100 × 1,8 mm id) se separó en una columna PMP; caudal (100 µL/min), fase móvil 60/40 acetonitrilo/agua con 0,1% de TFA.
donde L es la longitud de la columna, η es la viscosidad de la fase móvil, ΔP es la contrapresión de la columna y u es la velocidad lineal de la fase móvil. La permeabilidad de la columna PMP fue de 2,5 × 10⁻¹⁴ m², el caudal fue de 25 μL/min y se utilizó una mezcla 60/40 v/v de ACN/agua. La permeabilidad de la columna PMP (100 × 1,8 mm id) fue similar a la de nuestro estudio anterior Ref.34. La permeabilidad de la columna rellena con partículas superficialmente porosas es: 1,7 × 10⁻¹⁵ para partículas de 1,3 μm, 3,1 × 10⁻¹⁵ para partículas de 1,7 μm, 5,2 × 10⁻¹⁵ y 2,5 × 10⁻¹⁴ m² para partículas de 2,6 μm. Para partículas de 5 μm 43.Por lo tanto, la permeabilidad de la fase PMP es similar a la de las partículas de núcleo-corteza de 5 μm.
donde Wx es el peso de la columna empaquetada con cloroformo, Wy es el peso de la columna empaquetada con metanol y ρ es la densidad del disolvente. Densidades de metanol (ρ = 0,7866) y cloroformo (ρ = 1,484). La porosidad total de las columnas de PARTÍCULAS DE SÍLICE-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 y columnas C18-Urea 31 que estudiamos previamente fueron 0,63 y 0,55, respectivamente. Esto significa que la presencia de ligandos de urea reduce la permeabilidad de la fase estacionaria. Por otro lado, la porosidad total de la columna PMP (100 × 1,8 mm id) es 0,60. La permeabilidad de las columnas PMP es menor que la de las columnas empaquetadas con partículas de sílice unidas a C18 porque en las fases estacionarias de tipo C18 los ligandos C18 están unidos a las partículas de sílice como lineales cadenas, mientras que en fases estacionarias de tipo poliestireno, se forma una capa de polímero relativamente gruesa a su alrededor. En un experimento típico, la porosidad de la columna se calcula como:
Las figuras 7A y 7B muestran la columna PMP (100 × 1,8 mm id) y la columna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) utilizando las mismas condiciones de elución (es decir, 60/40 ACN/H2O y 0,1 % TFA). ) del gráfico de van Deemter. Se prepararon mezclas de péptidos seleccionadas (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucina Encefalina) en 20 µL/ El caudal mínimo para ambas columnas es de 800 µL/min. Los valores mínimos de HETP al caudal óptimo (80 µL/min) para la columna PMP y la columna Ascentis Express RP-Amide fueron de 2,6 µm y 3,9 µm, respectivamente. Los valores de HETP indican que la eficiencia de separación de la columna PMP (100 × 1,8 mm id) es mucho mejor que la columna Ascentis Express RP-Amide disponible comercialmente (100 × 1,8 mm id). El gráfico de van Deemter en la Fig. 7(A) muestra que la disminución del valor de N con el aumento del caudal no es significativa en comparación con nuestro trabajo anterior. estudio.La mayor eficiencia de separación de la columna PMP (100 × 1,8 mm id) en comparación con la columna Ascentis Express RP-Amide se basa en mejoras en la forma y el tamaño de las partículas, y en los complejos procedimientos de empaquetamiento de la columna utilizados en el presente trabajo34.
(A) Gráfico de van Deemter (HETP frente a velocidad lineal de la fase móvil) obtenido utilizando una columna PMP (100 × 1,8 mm id) en 60/40 ACN/H2O con 0,1 % de TFA. (B) Gráfico de van Deemter (HETP frente a velocidad lineal de la fase móvil) obtenido utilizando una columna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) en 60/40 ACN/H2O con 0,1 % de TFA.
Se preparó y evaluó una fase estacionaria de poliestireno con polaridad incorporada para la separación de mezclas de péptidos sintéticos y digestiones de tripsina de albúmina sérica humana (HAS) en cromatografía líquida de alta resolución. El rendimiento cromatográfico de las columnas PMP para mezclas de péptidos es excelente en eficiencia de separación y resolución. El rendimiento de separación mejorado de las columnas PMP se debe a varias razones, como el tamaño de partícula y el tamaño de poro de las partículas de sílice, la síntesis controlada de la fase estacionaria y el empaquetamiento complejo de la columna. Además de la alta eficiencia de separación, la baja contrapresión de la columna a altas velocidades de flujo es otra ventaja de esta fase estacionaria. Las columnas PMP muestran buena reproducibilidad y pueden usarse para el análisis de mezclas de péptidos y digestión de tripsina de varias proteínas. Tenemos la intención de usar esta columna para la separación de productos naturales, compuestos bioactivos de plantas medicinales y extractos de hongos en cromatografía líquida. En el futuro, las columnas PMP también se evaluarán para la separación de proteínas y anticuerpos monoclonales.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. y Petersson, P. Investigación sobre sistemas de separación de péptidos mediante cromatografía de fase inversa Parte I: Desarrollo de un protocolo de caracterización de columnas. J. Chromatography. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Péptidos activos mejorados diseñados para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. y Khrestchatisky, M. Péptidos terapéuticos sintéticos: ciencia y mercado. Drug Discovery. 15 (1-2) Today, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD y Shen, Y. Cromatografía líquida proteómica avanzada. J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. La cromatografía líquida avanzada acoplada a espectrometría de masas permite la incorporación de metabolómica y proteómica de amplio alcance. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM y Salisbury, JJ El papel de la UHPLC en el desarrollo de fármacos. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. y Clausen, AM Aspectos fundamentales y prácticos de la cromatografía líquida de ultra alta presión para separaciones rápidas. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA y Tchelitcheff, P. Aplicación de la cromatografía líquida de ultra alto rendimiento en el desarrollo de fármacos. J. Chromatography. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrogeles macroporosos monolíticos preparados a partir de emulsiones de aceite en agua de alta fase interna para la purificación eficiente de enterovirus. Chemical Britain J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. y Wilkins, JA El papel de la cromatografía líquida en la proteómica. J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. y Guillarme, D. Tendencias emergentes en separaciones por cromatografía líquida de fase inversa de péptidos y proteínas terapéuticas: teoría y aplicaciones. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE y Gebler, JC Separación bidimensional de péptidos utilizando un sistema RP-RP-HPLC con diferentes valores de pH en la primera y segunda dimensión de separación. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Se investigaron las características de transferencia de masa y el rendimiento cinético de columnas cromatográficas de alta eficiencia empaquetadas con partículas C18 sub-2 μm totalmente y superficialmente porosas. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Tendencias recientes y desafíos analíticos en el aislamiento, identificación y validación de péptidos bioactivos de plantas.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. El panorama proteómico del reino de la vida. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Procesamiento posterior de péptidos terapéuticos mediante cromatografía líquida preparativa. Molecule (Basilea, Suiza) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. y Geng, X. Cromatografía de modo mixto y su aplicación a biopolímeros. J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. y Sun, Y. Ligandos para cromatografía de proteínas de modo mixto: principio, caracterización y diseño. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).