Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi peramban yang Anda gunakan memiliki dukungan terbatas untuk CSS. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan peramban yang diperbarui (atau matikan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Partikel silika berpori disiapkan dengan metode sol-gel dengan beberapa modifikasi untuk mendapatkan partikel makropori. Partikel-partikel ini didervatisasi dengan polimerisasi transfer rantai fragmentasi adisi reversibel (RAFT) dengan N-fenilmaleimida-metilvinilisosianat (PMI) dan stirena untuk menyiapkan fase diam polistirena interkalasi N-fenilmaleimida (PMP). Kolom baja tahan karat berdiameter sempit (100 × 1,8 mm id) diisi dengan pengemasan bubur. Evaluasi pemisahan kolom PMP dari campuran peptida yang terdiri dari lima peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusin enkefalin) dan pencernaan tripsin albumin serum manusia (HAS). Di bawah kondisi elusi optimal, jumlah pelat teoritis campuran peptida mencapai 280.000. pelat/m². Dengan membandingkan kinerja pemisahan kolom yang dikembangkan dengan kolom komersial Ascentis Express RP-Amide, diamati bahwa kinerja pemisahan kolom PMP lebih unggul daripada kolom komersial dalam hal efisiensi pemisahan dan resolusi.
Dalam beberapa tahun terakhir, industri biofarmasi telah menjadi pasar global yang berkembang pesat dengan peningkatan pangsa pasar yang substansial. Dengan pertumbuhan industri biofarmasi yang eksplosif1,2,3, analisis peptida dan protein sangat dibutuhkan. Selain peptida target, beberapa pengotor dihasilkan selama sintesis peptida, sehingga memerlukan pemurnian kromatografi untuk mendapatkan peptida dengan kemurnian yang diinginkan. Analisis dan karakterisasi protein dalam cairan tubuh, jaringan, dan sel merupakan tugas yang sangat menantang karena banyaknya spesies yang berpotensi terdeteksi dalam satu sampel. Meskipun spektrometri massa merupakan alat yang efektif untuk pengurutan peptida dan protein, jika sampel tersebut diinjeksikan ke dalam spektrometer massa dalam satu kali proses, pemisahannya tidak akan ideal. Masalah ini dapat diatasi dengan menerapkan pemisahan kromatografi cair (LC) sebelum analisis MS, yang akan mengurangi jumlah analit yang masuk ke spektrometer massa pada waktu tertentu4,5,6. Selain itu, selama pemisahan fase cair, analit dapat difokuskan pada daerah yang sempit, sehingga memusatkan analit ini dan meningkatkan deteksi MS. Sensitivitas. Kromatografi cair (LC) telah mengalami kemajuan signifikan dalam dekade terakhir dan telah menjadi teknik populer dalam analisis proteomik7,8,9,10.
Kromatografi cair fase terbalik (RP-LC) banyak digunakan untuk pemurnian dan pemisahan campuran peptida menggunakan silika yang dimodifikasi oktadesil (ODS) sebagai fase diam11,12,13. Namun, fase diam RP tidak memberikan pemisahan peptida dan protein yang memuaskan karena struktur kompleks dan sifat amfifiliknya14,15. Oleh karena itu, fase diam yang dirancang khusus diperlukan untuk menganalisis peptida dan protein dengan gugus polar dan non-polar untuk berinteraksi dan mempertahankan analit ini16. Kromatografi mode campuran, yang menyediakan interaksi multimodal, dapat menjadi alternatif untuk RP-LC untuk pemisahan peptida, protein, dan campuran kompleks lainnya. Beberapa fase diam mode campuran telah disiapkan, dan kolom yang dikemas dengan fase ini telah digunakan untuk pemisahan peptida dan protein17,18,19,20,21. Fase diam mode campuran (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalasi polar/RPLC) cocok untuk Pemisahan peptida dan protein karena adanya gugus polar dan non-polar22,23,24,25,26,27,28. Demikian pula, fase diam interkalasi polar dengan gugus polar yang terikat secara kovalen menunjukkan daya pemisahan yang baik dan selektivitas unik untuk analit polar dan non-polar, karena pemisahan bergantung pada interaksi antara analit dan fase diam. Interaksi multimodal 29, 30, 31, 32. Baru-baru ini, Zhang dkk. 30 menyiapkan fase diam poliamina berujung dodecil dan berhasil memisahkan hidrokarbon, antidepresan, flavonoid, nukleosida, estrogen, dan beberapa analit lainnya. Interkalator polar memiliki gugus polar dan non-polar, sehingga dapat digunakan untuk memisahkan peptida dan protein yang memiliki bagian hidrofobik dan hidrofilik. Kolom yang disisipkan polar (misalnya, kolom C18 yang disisipkan amida) tersedia secara komersial dengan nama dagang kolom Ascentis Express RP-Amide, tetapi kolom ini hanya digunakan untuk analisis amina 33.
Dalam penelitian ini, fase diam polar (polystyrene yang mengandung N-phenylmaleimide) disiapkan dan dievaluasi untuk pemisahan peptida dan hasil digesti tripsin dari HSA. Fase diam disiapkan menggunakan strategi berikut. Partikel silika berpori disiapkan sesuai dengan prosedur yang diberikan dalam publikasi kami sebelumnya dengan beberapa modifikasi pada protokol persiapan. Rasio urea, polietilen glikol (PEG), TMOS, air, dan asam asetat disesuaikan untuk menyiapkan partikel silika dengan ukuran pori yang besar. Kedua, ligan baru, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, disintesis dan digunakan untuk mendervatisasi partikel silika untuk menyiapkan fase diam polar. Fase diam yang dihasilkan dikemas ke dalam kolom baja tahan karat (100 × 1,8 mm id) menggunakan skema pengemasan yang dioptimalkan. Pengemasan kolom dibantu dengan getaran mekanis untuk memastikan terbentuknya lapisan homogen di dalam kolom. Evaluasi pemisahan kolom yang dikemas dari campuran peptida yang terdiri dari lima peptida; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) dan hasil digesti tripsin dari albumin serum manusia (HAS). Campuran peptida dan hasil digesti tripsin dari HSA diamati terpisah dengan resolusi dan efisiensi yang baik. Kinerja pemisahan kolom PMP dibandingkan dengan kolom Ascentis Express RP-Amide. Baik peptida maupun protein diamati terpisah dengan baik dan efisien pada kolom PMP, yang lebih efisien daripada kolom Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polietilen Glikol), Urea, Asam Asetat, Trimetoksi Ortosilikat (TMOS), Trimetil Klorosilana (TMCS), Tripsin, Albumin Serum Manusia (HSA), Amonium Klorida, Urea, Heksana Metildisilazana (HMDS), Metakriloil Klorida (MC), Stirena, 4-Hidroksi-TEMPO, Benzoil Peroksida (BPO), Asetonitril Kelas HPLC (ACN), Metanol, 2-Propanol, dan Aseton dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, AS).
Campuran urea (8 g), polietilen glikol (8 g), dan 8 mL asam asetat 0,01 N diaduk selama 10 menit, kemudian ditambahkan 24 mL TMOS dalam kondisi dingin. Campuran reaksi dipanaskan pada suhu 40°C selama 6 jam dan kemudian pada suhu 120°C selama 8 jam dalam autoklaf baja tahan karat. Air dibuang dan bahan sisa dikeringkan pada suhu 70°C selama 12 jam. Massa lunak yang telah kering digiling halus dalam oven dan dikalsinasi pada suhu 550°C selama 12 jam. Tiga batch disiapkan dan dikarakterisasi untuk memeriksa reproduktivitas ukuran partikel, ukuran pori, dan luas permukaan.
Melalui modifikasi permukaan partikel silika dengan ligan fenilmaleimida-metilvinilisosianat (PCMP) yang telah disintesis sebelumnya, diikuti dengan polimerisasi radial dengan stirena, senyawa yang mengandung gugus polar disiapkan. Fase diam untuk agregat dan rantai polistirena. Proses preparasi dijelaskan di bawah ini.
N-fenilmaleimida (200 mg) dan metil vinil isosianat (100 mg) dilarutkan dalam toluena kering, dan 0,1 mL 2,2′-azoisobutironitril (AIBN) ditambahkan ke dalam labu reaksi untuk menyiapkan kopolimer fenilmaleimida-metil vinil isosianat (PMCP). Campuran dipanaskan pada suhu 60°C selama 3 jam, disaring, dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40°C selama 3 jam.
Partikel silika kering (2 g) didispersikan dalam toluena kering (100 mL), diaduk dan disonikasi dalam labu bulat 500 mL selama 10 menit. PMCP (10 mg) dilarutkan dalam toluena dan ditambahkan tetes demi tetes ke dalam labu reaksi melalui corong tetes. Campuran tersebut direfluks pada suhu 100°C selama 8 jam, disaring dan dicuci dengan aseton, lalu dikeringkan pada suhu 60°C selama 3 jam. Kemudian, partikel silika yang terikat PMCP (100 g) dilarutkan dalam toluena (200 ml) dan 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) ditambahkan dengan adanya 100 µL dibutiltin dilaurat sebagai katalis. Campuran tersebut diaduk pada suhu 50°C selama 8 jam, disaring, dan dikeringkan pada suhu 50°C selama 3 jam.
Stirena (1 mL), benzoil peroksida BPO (0,5 mL), dan partikel silika yang terikat TEMPO-PMCP (1,5 g) didispersikan dalam toluena dan dialiri gas nitrogen. Polimerisasi stirena dilakukan pada suhu 100°C selama 12 jam. Produk yang dihasilkan dicuci dengan metanol dan dikeringkan pada suhu 60°C semalaman. Skema reaksi keseluruhan ditunjukkan pada Gambar 1.
Sampel dihilangkan gasnya pada suhu 393 K selama 1 jam untuk mendapatkan tekanan sisa kurang dari 10⁻³ Torr. Jumlah N₂ yang teradsorpsi pada tekanan relatif P/P₀ = 0,99 digunakan untuk menentukan volume pori total. Morfologi partikel silika murni dan yang terikat ligan diperiksa dengan mikroskop elektron pemindaian (Hitachi High Technologies, Tokyo, Jepang). Sampel kering (partikel silika murni dan partikel silika yang terikat ligan) ditempatkan pada kolom aluminium menggunakan pita karbon perekat. Emas dilapisi pada sampel menggunakan pelapis semprot Q150T, dan lapisan Au 5 nm diendapkan pada sampel. Hal ini meningkatkan efisiensi proses menggunakan tegangan rendah dan memberikan butiran halus, penyemprotan dingin. Analisis unsur dilakukan menggunakan alat analisis unsur Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112. Analisis ukuran partikel dilakukan menggunakan alat analisis ukuran partikel Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000. Distribusi. Partikel silika telanjang dan partikel silika yang terikat ligan (masing-masing 5 mg) didispersikan dalam 5 mL isopropanol, disonikasi selama 10 menit, divortex selama 5 menit, dan ditempatkan pada bangku optik Mastersizer. Analisis termogravimetri dilakukan dengan laju 5 °C per menit pada rentang suhu 30 hingga 800 °C.
Kolom baja tahan karat berlapis kaca berdiameter sempit dengan dimensi (100 × 1,8 mm id) diisi menggunakan metode pengisian bubur, dengan menerapkan prosedur yang sama seperti yang digunakan dalam Ref. 31. Kolom baja tahan karat (berlapis kaca, 100 × 1,8 mm id) dengan fitting outlet berisi frit 1 µm dihubungkan ke slurry packer (Alltech Deerfield, IL, USA). Siapkan slurry fase diam dengan menangguhkan 150 mg fase diam dalam 1,2 mL metanol dan kirimkan ke kolom penyimpanan. Metanol digunakan sebagai pelarut slurry serta pelarut pendorong. Isi kolom secara berurutan dengan menerapkan tekanan 100 MPa selama 10 menit, 80 MPa selama 15 menit, dan 60 MPa selama 30 menit. Selama pengemasan, getaran mekanis diterapkan dengan dua shaker kolom GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) untuk memastikan pengemasan kolom yang seragam. Tutup slurry packer dan lepaskan tekanan secara perlahan untuk mencegah kerusakan di dalam kolom. Lepaskan kolom dari unit pengemasan slurry dan hubungkan fitting lain ke inlet dan ke sistem LC untuk memeriksa kinerjanya.
Pompa LC (10AD Shimadzu, Jepang), injektor (Valco (USA) C14 W.05) dengan loop injeksi 50 nL, degasser membran (Shimadzu DGU-14A), jendela kapiler UV-VIS, detektor perangkat µLC khusus (UV-2075), dan mikrokolom berlapis kaca dibangun. Tabung penghubung yang sangat sempit dan pendek digunakan untuk meminimalkan efek pelebaran pita kolom tambahan. Setelah pengemasan, kapiler (50 μm id 365) dan kapiler sambungan pereduksi (50 μm) dipasang pada outlet 1/16″ dari sambungan pereduksi. Pengumpulan data dan pemrosesan kromatografi dilakukan menggunakan perangkat lunak Multichro 2000. Pemantauan pada 254 nm. Analit diuji untuk absorbansi UV. Data kromatografi dianalisis oleh OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin dari serum manusia, bubuk liofilisasi, ≥ 96% (elektroforesis gel agarosa) 3 mg dicampur dengan tripsin (1,5 mg), urea 4,0 M (1 mL), dan amonium bikarbonat 0,2 M (1 mL). Larutan diaduk selama 10 menit dan disimpan dalam penangas air pada suhu 37°C selama 6 jam, kemudian dihentikan reaksinya dengan 1 mL TFA 0,1%. Saring larutan dan simpan di bawah 4 °C.
Pemisahan campuran peptida dan hasil digesti tripsin HSA dievaluasi secara terpisah pada kolom PMP. Periksa pemisahan campuran peptida dan hasil digesti tripsin HSA oleh kolom PMP dan bandingkan hasilnya dengan kolom Ascentis Express RP-Amide. Jumlah pelat teoritis dihitung sebagai berikut:
Gambar SEM dari partikel silika murni dan partikel silika yang terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 2. Gambar SEM partikel silika murni (A, B) menunjukkan bahwa, berbeda dengan penelitian kami sebelumnya, partikel-partikel ini berbentuk bulat dengan bentuk memanjang atau simetri tidak beraturan. Permukaan partikel silika yang terikat ligan (C, D) lebih halus daripada partikel silika murni, yang mungkin disebabkan oleh lapisan rantai polistirena pada permukaan partikel silika.
Gambar mikroskop elektron pemindaian dari partikel silika murni (A, B) dan partikel silika yang terikat ligan (C, D).
Distribusi ukuran partikel silika murni dan partikel silika terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 3(A). Kurva distribusi ukuran partikel berbasis volume menunjukkan bahwa ukuran partikel silika meningkat setelah modifikasi kimia (Gambar 3A). Data distribusi ukuran partikel silika dari penelitian saat ini dan penelitian sebelumnya dibandingkan pada Tabel 1(A). Ukuran partikel berbasis volume, d(0,5), PMP adalah 3,36 μm, dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya dengan nilai ad(0,5) sebesar 3,05 μm (partikel silika terikat polistirena)34. Batch ini memiliki distribusi ukuran partikel yang lebih sempit dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya karena rasio PEG, urea, TMOS, dan asam asetat yang bervariasi dalam campuran reaksi. Ukuran partikel fase PMP sedikit lebih besar daripada fase partikel silika terikat polistirena yang kami teliti sebelumnya. Ini berarti bahwa fungsionalisasi permukaan partikel silika dengan stirena hanya mengendapkan lapisan polistirena (0,97 µm) pada permukaan silika, sedangkan pada fase PMP ketebalan lapisannya adalah 1,38 µm.
Distribusi ukuran partikel (A) dan distribusi ukuran pori (B) partikel silika murni dan partikel silika yang terikat ligan.
Ukuran pori, volume pori, dan luas permukaan partikel silika dalam penelitian ini disajikan pada Tabel 1(B). Profil PSD partikel silika murni dan partikel silika terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 3(B). Hasilnya sebanding dengan penelitian kami sebelumnya. Ukuran pori partikel silika murni dan terikat ligan masing-masing adalah 310 dan 241, yang menunjukkan bahwa ukuran pori berkurang sebesar 69 setelah modifikasi kimia, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1(B), dan perubahan kurva ditunjukkan pada Gambar 3(B). Demikian pula, volume pori partikel silika menurun dari 0,67 menjadi 0,58 cm3/g setelah modifikasi kimia. Luas permukaan spesifik partikel silika yang diteliti saat ini adalah 116 m2/g, yang sebanding dengan penelitian kami sebelumnya (124 m2/g). Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1(B), luas permukaan (m2/g) partikel silika juga menurun dari 116 m2/g menjadi 105 m2/g setelah modifikasi kimia.
Hasil analisis unsur fase diam ditunjukkan pada Tabel 2. Beban karbon fase diam saat ini adalah 6,35%, yang lebih rendah daripada beban karbon penelitian kami sebelumnya (partikel silika terikat polistirena, masing-masing 7,93%35 dan 10,21%) 42. Beban karbon fase diam saat ini rendah, karena dalam pembuatan SP saat ini, selain stirena, beberapa ligan polar seperti fenilmaleimida-metilvinilisosianat (PCMP) dan 4-hidroksi-TEMPO digunakan. Persentase berat nitrogen fase diam saat ini adalah 2,21%, dibandingkan dengan 0,1735 dan 0,85% berat nitrogen dalam penelitian sebelumnya. Ini berarti bahwa persentase berat nitrogen lebih tinggi dalam fase diam saat ini karena fenilmaleimida. Demikian pula, beban karbon produk (4) dan (5) masing-masing adalah 2,7% dan 2,9%, sedangkan karbon Kandungan karbon pada produk akhir (6) adalah 6,35%, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2. Penurunan berat badan diperiksa dengan fase diam PMP, dan kurva TGA ditunjukkan pada Gambar 4. Kurva TGA menunjukkan penurunan berat badan sebesar 8,6%, yang sesuai dengan kandungan karbon (6,35%) karena ligan tidak hanya mengandung C tetapi juga N, O, dan H.
Ligand fenilmaleimida-metilvinilisosianat dipilih untuk modifikasi permukaan partikel silika karena memiliki gugus fenilmaleimida polar dan gugus vinilisosianat. Gugus vinilisosianat dapat bereaksi lebih lanjut dengan stirena melalui polimerisasi radikal hidup. Alasan kedua adalah untuk memasukkan gugus yang memiliki interaksi sedang dengan analit dan tidak ada interaksi elektrostatik yang kuat antara analit dan fase diam, karena bagian fenilmaleimida tidak memiliki muatan virtual pada pH normal. Polaritas fase diam dapat dikontrol oleh jumlah stirena optimal dan waktu reaksi polimerisasi radikal bebas. Langkah terakhir reaksi (polimerisasi radikal bebas) sangat penting dan dapat mengubah polaritas fase diam. Analisis unsur dilakukan untuk memeriksa muatan karbon dari fase diam ini. Diamati bahwa peningkatan jumlah stirena dan waktu reaksi meningkatkan muatan karbon fase diam dan sebaliknya. SP yang disiapkan dengan konsentrasi stirena yang berbeda memiliki muatan karbon yang berbeda. Sekali lagi, muatan fase diam ini fase ke dalam kolom baja tahan karat dan memeriksa kinerja kromatografinya (selektivitas, resolusi, nilai N, dll.). Berdasarkan percobaan ini, formulasi yang dioptimalkan dipilih untuk menyiapkan fase diam PMP guna memastikan polaritas terkontrol dan retensi analit yang baik.
Lima campuran peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusin enkephalin) juga dievaluasi menggunakan kolom PMP dengan fase gerak; Campuran 60/40 (v/v) asetonitril/air (0,1% TFA) dengan laju alir 80 μL/min. Di bawah kondisi elusi optimal, jumlah pelat teoritis (N) per kolom (100 × 1,8 mm id) adalah 20.000 ± 100 (200.000 pelat/m²). Tabel 3 memberikan nilai N untuk ketiga kolom PMP dan kromatogramnya ditunjukkan pada Gambar 5A. Analisis cepat pada kolom PMP dengan laju alir tinggi (700 μL/min), lima peptida dieluasi dalam satu menit, nilai N sangat baik, 13.500 ± 330 per kolom (100 × 1,8 mm id), sesuai dengan 135.000 pelat/m (Gambar 5B). Tiga kolom dengan ukuran identik. Kolom (100 × 1,8 mm id) diisi dengan tiga lot fase diam PMP yang berbeda untuk memeriksa reprodusibilitas. Konsentrasi analit untuk setiap kolom dicatat menggunakan kondisi elusi optimal dan jumlah pelat teoritis N serta waktu retensi untuk memisahkan campuran uji yang sama pada setiap kolom. Data reprodusibilitas untuk kolom PMP ditunjukkan pada Tabel 4. Reprodusibilitas kolom PMP berkorelasi baik dengan nilai %RSD yang sangat rendah, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3.
Pemisahan campuran peptida pada kolom PMP (B) dan kolom Ascentis Express RP-Amide (A); fase gerak 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensi kolom PMP (100 × 1,8 mm id); analitik. Urutan elusi senyawa: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) dan 5 (leusin) asam enkefalin)).
Kolom PMP (100 × 1,8 mm id) dievaluasi untuk pemisahan hasil digesti tripsin albumin serum manusia dalam kromatografi cair kinerja tinggi. Kromatogram pada Gambar 6 menunjukkan bahwa sampel terpisah dengan baik dan resolusinya sangat bagus. Hasil digesti HSA dianalisis menggunakan laju alir 100 µL/min, fase gerak 70/30 asetonitril/air dan 0,1% TFA. Seperti yang ditunjukkan pada kromatogram (Gambar 6), hasil digesti HSA telah terbagi menjadi 17 puncak yang sesuai dengan 17 peptida. Efisiensi pemisahan setiap puncak dalam hasil digesti HSA dihitung dan nilainya diberikan pada Tabel 5.
Hasil digesti tripsin dari HSA (100 × 1,8 mm id) dipisahkan pada kolom PMP; laju alir (100 µL/min), fase gerak 60/40 asetonitril/air dengan 0,1% TFA.
di mana L adalah panjang kolom, η adalah viskositas fase gerak, ΔP adalah tekanan balik kolom, dan u adalah kecepatan linier fase gerak. Permeabilitas kolom PMP adalah 2,5 × 10⁻¹⁴ m², laju alir 25 μL/min, dan digunakan ACN/air 60/40 v/v. Permeabilitas kolom PMP (100 × 1,8 mm id) serupa dengan penelitian kami sebelumnya Ref.34. Permeabilitas kolom yang diisi dengan partikel berpori permukaan adalah: 1,7 × 10⁻¹⁵ untuk partikel 1,3 μm, 3,1 × 10⁻¹⁵ untuk partikel 1,7 μm, 5,2 × 10⁻¹⁵ dan 2,5 × 10⁻¹⁴ m² untuk partikel 2,6 μm. Untuk partikel 5 μm 43.Oleh karena itu, permeabilitas fase PMP serupa dengan permeabilitas partikel inti-cangkang 5 μm.
di mana Wx adalah berat kolom yang diisi dengan kloroform, Wy adalah berat kolom yang diisi dengan metanol, dan ρ adalah densitas pelarut. Densitas metanol (ρ = 0,7866) dan kloroform (ρ = 1,484). Porositas total kolom SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 dan kolom C18-Urea 31 yang sebelumnya kami teliti masing-masing adalah 0,63 dan 0,55. Ini berarti bahwa keberadaan ligan urea mengurangi permeabilitas fase diam. Di sisi lain, porositas total kolom PMP (100 × 1,8 mm id) adalah 0,60. Permeabilitas kolom PMP lebih rendah daripada kolom yang diisi dengan partikel silika terikat C18 karena pada fase diam tipe C18, ligan C18 terikat pada partikel silika sebagai rantai linier, sedangkan pada Pada fase diam tipe polistirena, lapisan polimer yang relatif tebal terbentuk di sekitarnya. Dalam percobaan tipikal, porositas kolom dihitung sebagai:
Gambar 7A,B menunjukkan kolom PMP (100 × 1,8 mm id) dan kolom Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) menggunakan kondisi elusi yang sama (yaitu, 60/40 ACN/H2O dan 0,1% TFA). ) dari plot van Deemter. Campuran peptida terpilih (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) disiapkan dalam 20 µL/. Laju aliran minimum untuk kedua kolom adalah 800 µL/menit. Nilai HETP minimum pada laju aliran optimum (80 µL/menit) untuk kolom PMP dan kolom Ascentis Express RP-Amide masing-masing adalah 2,6 µm dan 3,9 µm. Nilai HETP menunjukkan bahwa efisiensi pemisahan kolom PMP (100 × 1,8 mm id) jauh lebih baik daripada kolom Ascentis Express RP-Amide yang tersedia secara komersial (100 × 1,8 mm id). Plot van Deemter pada Gambar 7(A) menunjukkan bahwa penurunan nilai N dengan meningkatnya laju aliran adalah tidak signifikan dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya. Efisiensi pemisahan yang lebih tinggi dari kolom PMP (100 × 1,8 mm id) dibandingkan dengan kolom Ascentis Express RP-Amide didasarkan pada peningkatan bentuk partikel, ukuran, dan prosedur pengemasan kolom yang kompleks yang digunakan dalam penelitian ini34.
(A) Grafik van Deemter (HETP versus kecepatan linier fase gerak) yang diperoleh menggunakan kolom PMP (100 × 1,8 mm id) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0,1% TFA. (B) Grafik van Deemter (HETP versus kecepatan linier fase gerak) yang diperoleh menggunakan kolom Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0,1% TFA.
Fase diam polistirena yang tertanam polar disiapkan dan dievaluasi untuk pemisahan campuran peptida sintetik dan hasil pencernaan tripsin dari albumin serum manusia (HAS) dalam kromatografi cair kinerja tinggi. Kinerja kromatografi kolom PMP untuk campuran peptida sangat baik dalam efisiensi pemisahan dan resolusi. Peningkatan kinerja pemisahan kolom PMP disebabkan oleh berbagai alasan, seperti ukuran partikel dan ukuran pori partikel silika, sintesis fase diam yang terkontrol, dan pengemasan kolom yang kompleks. Selain efisiensi pemisahan yang tinggi, tekanan balik kolom yang rendah pada laju aliran tinggi merupakan keuntungan lain dari fase diam ini. Kolom PMP menunjukkan reproduktivitas yang baik dan dapat digunakan untuk analisis campuran peptida dan pencernaan tripsin dari berbagai protein. Kami bermaksud menggunakan kolom ini untuk pemisahan produk alami, senyawa bioaktif dari tanaman obat dan ekstrak jamur dalam kromatografi cair. Di masa mendatang, kolom PMP juga akan dievaluasi untuk pemisahan protein dan antibodi monoklonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Penelitian tentang Sistem Pemisahan Peptida dengan Kromatografi Fase Terbalik Bagian I: Pengembangan Protokol Karakterisasi Kolom. J. Kromatografi. 1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Peptida aktif yang ditingkatkan dirancang untuk pengobatan penyakit menular. Bioteknologi. Lanjutan. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptida terapeutik sintetis: sains dan pasar. penemuan obat. 15 (1-2) hari ini, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi Cair Proteomik Tingkat Lanjut. J. Kromatografi. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografi cair-spektrometri massa tingkat lanjut memungkinkan penggabungan metabolomik dan proteomik yang ditargetkan secara luas. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peran UHPLC dalam pengembangan obat. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspek fundamental dan praktis kromatografi cair bertekanan ultra tinggi untuk pemisahan cepat. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Aplikasi kromatografi cair kinerja ultra tinggi dalam pengembangan obat. J. Kromatografi. 1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrogel makropori monolitik yang dibuat dari emulsi fase internal tinggi minyak dalam air untuk pemurnian enterovirus yang efisien. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peran kromatografi cair dalam proteomik. J. Kromatografi. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Tren baru dalam pemisahan peptida dan protein terapeutik dengan kromatografi cair fase terbalik: teori dan aplikasi. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan sistem RP-RP-HPLC dengan menggunakan nilai pH berbeda pada dimensi pemisahan pertama dan kedua. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Karakteristik perpindahan massa dan kinerja kinetik kolom kromatografi efisiensi tinggi yang diisi dengan partikel C18 sub-2 μm berpori penuh dan permukaan diselidiki. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Tren terkini dan tantangan analitis dalam isolasi, identifikasi dan validasi peptida bioaktif tanaman. anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB dkk. Lanskap proteomik kerajaan kehidupan. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Pemrosesan hilir peptida terapeutik dengan kromatografi cair preparatif. Molecule (Basel, Swiss) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran dan aplikasinya pada biopolimer. J. Kromatografi.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligand untuk kromatografi protein mode campuran: prinsip, karakterisasi, dan desain. J. Bioteknologi. 144(1), 3-11 (2009).