Terima kasih telah mengunjungi Nature.com. Versi browser yang Anda gunakan memiliki dukungan terbatas untuk CSS. Untuk pengalaman terbaik, kami sarankan Anda menggunakan browser yang diperbarui (atau matikan mode kompatibilitas di Internet Explorer). Sementara itu, untuk memastikan dukungan berkelanjutan, kami akan menampilkan situs tanpa gaya dan JavaScript.
Partikel silika berpori disiapkan dengan metode sol-gel dengan beberapa modifikasi untuk memperoleh partikel makropori. Partikel-partikel ini diderivatisasi dengan polimerisasi rantai fragmentasi adisi reversibel (RAFT) dengan N-fenilmaleimida-metilvinilisosianat (PMI) dan stirena untuk menyiapkan fase stasioner interkalasi N-fenilmaleimida pada polistirena (PMP). Kolom baja tahan karat dengan lubang sempit (100 × 1,8 mm id) dikemas dengan pengepakan bubur. Evaluasi pemisahan kolom PMP dari campuran peptida yang terdiri dari lima peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) kinerja kromatografi) dan pencernaan tripsin dari albumin serum manusia (HAS). Dalam kondisi elusi yang optimal, jumlah pelat teoritis campuran peptida setinggi 280.000 pelat/m². Membandingkan kinerja pemisahan kolom yang dikembangkan dengan kolom Ascentis Express RP-Amide komersial, diamati bahwa kinerja pemisahan kolom PMP lebih unggul daripada kolom komersial dalam hal efisiensi dan resolusi pemisahan.
Dalam beberapa tahun terakhir, industri biofarmasi telah menjadi pasar global yang berkembang dengan peningkatan pangsa pasar yang substansial. Dengan pertumbuhan industri biofarmasi yang eksplosif1,2,3, analisis peptida dan protein sangat diinginkan. Selain peptida target, beberapa pengotor dihasilkan selama sintesis peptida, sehingga memerlukan pemurnian kromatografi untuk mendapatkan peptida dengan kemurnian yang diinginkan. Analisis dan karakterisasi protein dalam cairan tubuh, jaringan, dan sel merupakan tugas yang sangat menantang karena banyaknya spesies yang berpotensi terdeteksi dalam satu sampel. Meskipun spektrometri massa merupakan alat yang efektif untuk pengurutan peptida dan protein, jika sampel tersebut disuntikkan ke dalam spektrometer massa dalam satu lintasan, pemisahan tidak akan ideal. Masalah ini dapat dikurangi dengan menerapkan pemisahan kromatografi cair (LC) sebelum analisis MS, yang akan mengurangi jumlah analit yang memasuki spektrometer massa pada waktu tertentu4,5,6. Selain itu, selama pemisahan fase cair, analit dapat difokuskan di daerah yang sempit, sehingga mengonsentrasikan analit ini dan meningkatkan MS sensitivitas deteksi. Kromatografi cair (LC) telah berkembang secara signifikan selama dekade terakhir dan telah menjadi teknik populer dalam analisis proteomik7,8,9,10.
Kromatografi cair fase terbalik (RP-LC) digunakan secara luas untuk pemurnian dan pemisahan campuran peptida menggunakan silika yang dimodifikasi oktadesil (ODS) sebagai fase stasioner11,12,13. Namun, fase stasioner RP tidak memberikan pemisahan peptida dan protein yang memuaskan karena strukturnya yang kompleks dan sifat amfifiliknya14,15. Oleh karena itu, fase stasioner yang dirancang khusus diperlukan untuk menganalisis peptida dan protein dengan gugus polar dan non-polar untuk berinteraksi dengan dan mempertahankan analit ini16. Kromatografi mode campuran, yang menyediakan interaksi multimoda, dapat menjadi alternatif RP-LC untuk pemisahan peptida, protein, dan campuran kompleks lainnya. Beberapa fase stasioner mode campuran telah disiapkan, dan kolom yang diisi dengan fase-fase ini telah digunakan untuk pemisahan peptida dan protein17,18,19,20,21. Fase stasioner mode campuran (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalasi polar/RPLC) cocok untuk pemisahan peptida dan protein karena adanya gugus polar dan non-polar22,23,24,25,26,27,28. Demikian pula, fase stasioner interkalasi polar dengan gugus polar yang terikat secara kovalen menunjukkan daya pemisahan yang baik dan selektivitas unik untuk analit polar dan non-polar, karena pemisahan bergantung pada interaksi antara analit dan fase stasioner. Interaksi multimoda29, 30, 31, 32. Baru-baru ini, Zhang dkk. 30 menyiapkan fase stasioner poliamina berujung dodecyl dan berhasil memisahkan hidrokarbon, antidepresan, flavonoid, nukleosida, estrogen, dan beberapa analit lainnya. Interkalator polar memiliki gugus polar dan non-polar, sehingga dapat digunakan untuk memisahkan peptida dan protein yang memiliki gugus hidrofobik dan hidrofilik. Kolom tertanam polar (misalnya, kolom C18 tertanam amida) tersedia secara komersial dengan nama dagang kolom Ascentis Express RP-Amide, tetapi kolom ini digunakan untuk analisis amina 33 saja.
Dalam studi terkini, fase stasioner yang tertanam dalam polar (polistirena yang tertanam dalam N-fenilmaleimida) disiapkan dan dievaluasi untuk pemisahan peptida dan pencernaan tripsin dari HSA. Fase stasioner disiapkan menggunakan strategi berikut. Partikel silika berpori disiapkan menurut prosedur yang diberikan dalam publikasi kami sebelumnya dengan beberapa modifikasi pada protokol persiapan. Rasio urea, polietilen glikol (PEG), TMOS, asam asetat air disesuaikan untuk menyiapkan partikel silika dengan ukuran pori yang besar. Kedua, ligan baru, fenilmaleimida-metil vinil isocyanate, disintesis dan digunakan untuk menderivasi partikel silika untuk menyiapkan fase stasioner yang tertanam dalam polar. Fase stasioner yang dihasilkan dikemas ke dalam kolom baja tahan karat (id 100 × 1,8 mm) menggunakan skema pengemasan yang dioptimalkan. Pengemasan kolom dibantu dengan getaran mekanis untuk memastikan tempat tidur yang homogen terbentuk di dalam kolom. Mengevaluasi pemisahan kolom yang dikemas dari campuran peptida yang terdiri dari lima peptida; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) dan pencernaan tripsin dari serum albumin manusia (HAS). Campuran peptida dan pencernaan tripsin dari HSA diamati terpisah dengan resolusi dan efisiensi yang baik. Kinerja pemisahan kolom PMP dibandingkan dengan kolom Ascentis Express RP-Amide. Baik peptida maupun protein diamati terpecahkan dengan baik dan efisien pada kolom PMP, yang lebih efisien daripada kolom Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polietilen Glikol), Urea, Asam Asetat, Trimetoksi Ortosilikat (TMOS), Trimetil Klorosilan (TMCS), Tripsin, Albumin Serum Manusia (HSA), Amonium Klorida, Urea, Heksana Metildisilazana (HMDS), Metakriloil Klorida (MC), Stirena, 4-Hidroksi-TEMPO, Benzoil Peroksida (BPO), Asetonitril Mutu HPLC (ACN), Metanol, 2-Propanol, dan Aseton Dibeli dari Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, AS).
Campuran urea (8 g), polietilen glikol (8 g), dan 8 mL asam asetat 0,01 N diaduk selama 10 menit, lalu ditambahkan 24 mL TMOS ke dalamnya dalam kondisi dingin. Campuran reaksi dipanaskan pada suhu 40°C selama 6 jam, lalu pada suhu 120°C selama 8 jam dalam autoklaf baja tahan karat. Air dituang dan bahan sisa dikeringkan pada suhu 70°C selama 12 jam. Massa lunak yang sudah kering digiling halus dalam oven dan dikalsinasi pada suhu 550°C selama 12 jam. Tiga kelompok disiapkan dan dikarakterisasi untuk memeriksa reproduktifitas ukuran partikel, ukuran pori, dan luas permukaan.
Melalui modifikasi permukaan partikel silika dengan ligan fenilmaleimida-metilvinilisosianat (PCMP) yang telah disintesis sebelumnya, diikuti oleh polimerisasi radial dengan stirena, senyawa yang mengandung gugus polar telah disiapkan. Fase stasioner untuk agregat dan rantai polistirena. Proses persiapan dijelaskan di bawah ini.
N-fenilmaleimida (200 mg) dan metil vinil isosianat (100 mg) dilarutkan dalam toluena kering, dan 0,1 mL 2,2′-azoisobutironitril (AIBN) ditambahkan ke dalam tabung reaksi untuk menyiapkan kopolimer fenilmaleimida-metil vinil isosianat (PMCP). Campuran tersebut dipanaskan pada suhu 60°C selama 3 jam, disaring dan dikeringkan dalam oven pada suhu 40°C selama 3 jam.
Partikel silika kering (2 g) didispersikan dalam toluena kering (100 mL), diaduk, dan disonikasi dalam labu dasar bulat 500 mL selama 10 menit. PMCP (10 mg) dilarutkan dalam toluena dan ditambahkan tetes demi tetes ke dalam labu reaksi melalui corong tetes. Campuran tersebut direfluks pada suhu 100°C selama 8 jam, disaring, dan dicuci dengan aseton, lalu dikeringkan pada suhu 60°C selama 3 jam. Kemudian, partikel silika terikat PMCP (100 g) dilarutkan dalam toluena (200 ml), dan 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) ditambahkan dengan adanya 100 µL dibutiltin dilaurat sebagai katalis. Campuran tersebut diaduk pada suhu 50°C selama 8 jam, disaring, dan dikeringkan pada suhu 50°C selama 3 jam.
Stirena (1 mL), benzoil peroksida BPO (0,5 mL), dan partikel silika yang menempel pada TEMPO-PMCP (1,5 g) didispersikan dalam toluena dan dibersihkan dengan nitrogen. Polimerisasi stirena dilakukan pada suhu 100°C selama 12 jam. Produk yang dihasilkan dicuci dengan metanol dan dikeringkan pada suhu 60°C semalaman. Skema reaksi keseluruhan ditunjukkan pada Gambar 1.
Sampel didegaskan pada 393 K selama 1 jam untuk memperoleh tekanan sisa kurang dari 10-3 Torr. Jumlah N2 yang diadsorpsi pada tekanan relatif P/P0 = 0,99 digunakan untuk menentukan volume pori total. Morfologi partikel silika polos dan terikat ligan diperiksa dengan mikroskop elektron pemindaian (Hitachi High Technologies, Tokyo, Jepang). Sampel kering (partikel silika polos dan silika terikat ligan) ditempatkan pada kolom aluminium menggunakan pita karbon perekat. Emas disepuh pada sampel menggunakan pelapis sputter Q150T, dan lapisan Au 5 nm diendapkan pada sampel. Ini meningkatkan efisiensi proses menggunakan tegangan rendah dan memberikan butiran halus, sputtering dingin. Penganalisis unsur Thermo Electron (Waltham, MA, AS) Flash EA1112 digunakan untuk analisis unsur. Penganalisis ukuran partikel Malvern (Worcestershire, Inggris) Mastersizer 2000 digunakan untuk memperoleh distribusi ukuran partikel. Partikel silika telanjang dan partikel silika terikat ligan (masing-masing 5 mg) didispersikan dalam 5 mL isopropanol, disonikasi selama 10 menit, dipusarkan selama 5 menit, dan diletakkan pada bangku optik Mastersizer. Analisis termogravimetri dilakukan pada laju 5 °C per menit pada rentang suhu 30 hingga 800 °C.
Kolom berlubang sempit berbahan baja tahan karat berlapis kaca dengan dimensi (100 × 1,8 mm id) dikemas menggunakan metode pengepakan bubur, menerapkan prosedur yang sama yang digunakan dalam Ref. Bahasa Indonesia: 31. Kolom baja tahan karat (berlapis kaca, id 100 × 1,8 mm) dengan sambungan outlet yang berisi frit 1 µm dihubungkan ke pengemas bubur (Alltech Deerfield, IL, AS). Siapkan bubur fase stasioner dengan menangguhkan 150 mg fase stasioner dalam 1,2 mL metanol dan kirimkan ke kolom penyimpanan. Metanol digunakan sebagai pelarut bubur serta pelarut pendorong. Isi kolom secara berurutan dengan menerapkan tekanan 100 MP selama 10 menit, 80 MP selama 15 menit, dan 60 MP selama 30 menit. Selama pengepakan, getaran mekanis diterapkan dengan dua pengocok kolom GC (Alltech, Deerfield, IL, AS) untuk memastikan pengepakan kolom yang seragam. Tutup pengemas bubur dan lepaskan tekanan secara perlahan untuk mencegah kerusakan di dalam kolom. Lepaskan kolom dari unit pengepakan bubur dan hubungkan sambungan lain ke saluran masuk dan ke sistem LC untuk memeriksa kinerjanya.
Pompa LC (10AD Shimadzu, Jepang), injektor (Valco (AS) C14 W.05) dengan loop injeksi 50nL, degasser membran (Shimadzu DGU-14A), jendela kapiler UV-VIS dibangun Detektor perangkat µLC khusus (UV-2075) dan mikrokolom berlapis kaca. Gunakan tabung penghubung yang sangat sempit dan pendek untuk meminimalkan efek pelebaran pita kolom ekstra. Setelah pengemasan, kapiler (50 μm id 365 dan kapiler serikat pereduksi (50 μm) dipasang pada outlet 1/16″ dari serikat pereduksi. Pengumpulan data dan pemrosesan kromatografi dilakukan dengan menggunakan perangkat lunak Multichro 2000. Pemantauan pada 254 nm Analit diuji untuk absorbansi UV. Data kromatografi dianalisis oleh OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin dari serum manusia, bubuk beku-kering, ≥ 96% (elektroforesis gel agarosa) 3 mg dicampur dengan tripsin (1,5 mg), 4,0 M urea (1 mL), dan 0,2 M amonium bikarbonat (1 mL). Larutan diaduk selama 10 menit dan disimpan dalam penangas air pada suhu 37°C selama 6 jam, kemudian didinginkan dengan 1 mL TFA 0,1%. Saring larutan dan simpan di bawah suhu 4 °C.
Pemisahan campuran peptida dan pencernaan tripsin HSA dievaluasi secara terpisah pada kolom PMP. Periksa pemisahan campuran peptida dan pencernaan tripsin HSA oleh kolom PMP dan bandingkan hasilnya dengan kolom Ascentis Express RP-Amide. Nomor plat teoritis dihitung sebagai berikut:
Gambar SEM partikel silika polos dan partikel silika terikat ligan ditunjukkan pada GAMBAR 2. Gambar SEM partikel silika polos (A, B) menunjukkan bahwa, berbeda dengan penelitian kami sebelumnya, partikel ini berbentuk bulat yang mana partikelnya memanjang atau memiliki simetri tidak teratur. Permukaan partikel silika terikat ligan (C, D) lebih halus dibandingkan dengan partikel silika polos, yang mungkin disebabkan oleh lapisan rantai polistirena pada permukaan partikel silika.
Gambar mikroskop elektron pemindaian partikel silika polos (A, B) dan partikel silika terikat ligan (C, D).
Distribusi ukuran partikel partikel silika polos dan partikel silika terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 3(A). Kurva distribusi ukuran partikel berdasarkan volume menunjukkan bahwa ukuran partikel silika meningkat setelah modifikasi kimia (Gbr. 3A). Data distribusi ukuran partikel partikel silika dari penelitian saat ini dan penelitian sebelumnya dibandingkan dalam Tabel 1(A). Ukuran partikel berdasarkan volume, d(0,5), dari PMP adalah 3,36 μm, dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya dengan nilai ad(0,5) sebesar 3,05 μm (partikel silika terikat polistirena)34. Batch ini memiliki distribusi ukuran partikel yang lebih sempit dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya karena rasio PEG, urea, TMOS, dan asam asetat yang bervariasi dalam campuran reaksi. Ukuran partikel fase PMP sedikit lebih besar daripada fase partikel silika terikat polistirena yang kami pelajari sebelumnya. Ini berarti bahwa fungsionalisasi permukaan partikel silika dengan stirena hanya menyimpan lapisan polistirena (0,97 µm) pada permukaan silika, sedangkan pada fase PMP ketebalan lapisannya adalah 1,38 µm.
Distribusi ukuran partikel (A) dan distribusi ukuran pori (B) partikel silika polos dan partikel silika terikat ligan.
Ukuran pori, volume pori dan luas permukaan partikel silika dari penelitian saat ini diberikan dalam Tabel 1(B). Profil PSD partikel silika polos dan partikel silika terikat ligan ditunjukkan pada Gambar 3(B). Hasilnya sebanding dengan penelitian kami sebelumnya. Ukuran pori partikel silika polos dan partikel silika terikat ligan masing-masing adalah 310 dan 241, yang menunjukkan bahwa ukuran pori berkurang sebesar 69 setelah modifikasi kimia, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1(B), dan perubahan kurva ditunjukkan pada Gambar 3(B). Demikian pula, volume pori partikel silika menurun dari 0,67 menjadi 0,58 cm3/g setelah modifikasi kimia. Luas permukaan spesifik partikel silika yang dipelajari saat ini adalah 116 m2/g, yang sebanding dengan penelitian kami sebelumnya (124 m2/g). Seperti yang ditunjukkan pada Tabel 1(B), luas permukaan (m2/g) partikel silika juga menurun dari 116 m2/g menjadi 105 m2/g setelah modifikasi kimia.
Hasil analisis unsur fase stasioner ditunjukkan pada Tabel 2. Beban karbon fase stasioner saat ini adalah 6,35%, yang lebih rendah daripada beban karbon penelitian kami sebelumnya (partikel silika terikat polistirena, masing-masing 7,93%35 dan 10,21%)42. Beban karbon fase stasioner saat ini rendah, karena dalam persiapan SP saat ini, selain stirena, beberapa ligan polar seperti fenilmaleimida-metilvinilisosianat (PCMP) dan 4-hidroksi-TEMPO digunakan. Persentase berat nitrogen dari fase stasioner saat ini adalah 2,21%, dibandingkan dengan 0,1735 dan 0,85% berat nitrogen dalam penelitian sebelumnya, masing-masing. Ini berarti bahwa wt % nitrogen lebih tinggi dalam fase stasioner saat ini karena fenilmaleimida. Demikian pula, beban karbon produk (4) dan (5) masing-masing adalah 2,7% dan 2,9%. sedangkan muatan karbon pada produk akhir (6) adalah 6,35%, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 2. Kehilangan berat diperiksa dengan fase stasioner PMP, dan kurva TGA ditunjukkan pada Gambar 4. Kurva TGA menunjukkan kehilangan berat sebesar 8,6%, yang sesuai dengan muatan karbon (6,35%) karena ligan tidak hanya mengandung C tetapi juga N, O, dan H.
Ligand fenilmaleimida-metilvinilisosianat dipilih untuk modifikasi permukaan partikel silika karena memiliki gugus fenilmaleimida dan gugus vinilisosianat yang polar. Gugus vinil isosianat selanjutnya dapat bereaksi dengan stirena melalui polimerisasi radikal hidup. Alasan kedua adalah untuk memasukkan gugus yang memiliki interaksi sedang dengan analit dan tidak ada interaksi elektrostatik yang kuat antara analit dan fase stasioner, karena gugus fenilmaleimida tidak memiliki muatan virtual pada pH normal. Polaritas fase stasioner dapat dikontrol oleh jumlah stirena yang optimal dan waktu reaksi polimerisasi radikal bebas. Langkah terakhir reaksi (polimerisasi radikal bebas) sangat penting dan dapat mengubah polaritas fase stasioner. Analisis unsur dilakukan untuk memeriksa pemuatan karbon dari fase stasioner ini. Diamati bahwa peningkatan jumlah stirena dan waktu reaksi meningkatkan pemuatan karbon dari fase stasioner dan sebaliknya. SP yang disiapkan dengan konsentrasi stirena yang berbeda memiliki pemuatan karbon yang berbeda. Sekali lagi, beban fase stasioner ini ke dalam kolom baja tahan karat dan memeriksa kinerja kromatografinya (selektivitas, resolusi, nilai N, dll.). Berdasarkan percobaan ini, formulasi yang dioptimalkan dipilih untuk menyiapkan fase stasioner PMP untuk memastikan polaritas terkendali dan retensi analit yang baik.
Lima campuran peptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusin enkephalin) juga dievaluasi menggunakan kolom PMP menggunakan fase gerak; 60/40 (v/v) asetonitril/air (0,1% TFA) pada laju alir 80 μL/menit. Dalam kondisi elusi optimal, jumlah pelat teoritis (N) per kolom (100 × 1,8 mm id) adalah 20.000 ± 100 (200.000 pelat/m²). Tabel 3 memberikan nilai N untuk tiga kolom PMP dan kromatogram ditunjukkan pada Gambar 5A. Analisis cepat pada kolom PMP pada laju alir tinggi (700 μL/menit), lima peptida dielusi dalam waktu satu menit, nilai N sangat baik, 13.500 ± 330 per kolom (100 × 1,8 mm id), Sesuai dengan 135.000 pelat/m (Gambar 5B). Tiga berukuran identik Kolom (100 x 1,8 mm id) diisi dengan tiga lot fase stasioner PMP yang berbeda untuk memeriksa reproduktifitas. Konsentrasi analit untuk setiap kolom dicatat menggunakan kondisi elusi optimal dan jumlah pelat teoritis N serta waktu retensi untuk memisahkan campuran uji yang sama pada setiap kolom. Data reproduktifitas untuk kolom PMP ditunjukkan pada Tabel 4. Reproduktifitas kolom PMP berkorelasi baik dengan nilai %RSD yang sangat rendah, seperti yang ditunjukkan pada Tabel 3.
Pemisahan campuran peptida pada kolom PMP (B) dan kolom Ascentis Express RP-Amide (A); fase mobil 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), dimensi kolom PMP (100 × 1,8 mm id); analitis Urutan elusi senyawa: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) dan 5 (leusin) asam enkefalin)).
Kolom PMP (id 100 × 1,8 mm) dievaluasi untuk pemisahan digesti tripsin dari serum albumin manusia dalam kromatografi cair kinerja tinggi. Kromatogram pada Gambar 6 menunjukkan bahwa sampel terpisah dengan baik dan resolusinya sangat baik. Digesti HSA dianalisis menggunakan laju alir 100 µL/menit, fase gerak 70/30 asetonitril/air, dan 0,1% TFA. Seperti yang ditunjukkan dalam kromatogram (Gambar 6), digesti HSA telah dibagi menjadi 17 puncak yang sesuai dengan 17 peptida. Efisiensi pemisahan setiap puncak dalam digesti HSA dihitung dan nilainya diberikan dalam Tabel 5.
Intisari tripsin HSA (100 × 1,8 mm id) dipisahkan pada kolom PMP; laju alir (100 µL/menit), fase gerak 60/40 asetonitril/air dengan 0,1% TFA.
di mana L adalah panjang kolom, η adalah viskositas fase mobil, ΔP adalah tekanan balik kolom, dan u adalah kecepatan linier fase mobil. Permeabilitas kolom PMP adalah 2,5 × 10-14 m2, laju aliran adalah 25 μL/menit, dan 60/40 v/v ACN/air digunakan. Permeabilitas kolom PMP (100 × 1,8 mm id) mirip dengan penelitian kami sebelumnya Ref.34. Permeabilitas kolom yang dikemas dengan partikel berpori superfisial adalah: 1,7 × 10-15 untuk partikel 1,3 μm, 3,1 × 10-15 untuk partikel 1,7 μm, 5,2 × 10-15 dan 2,5 × 10-14 m2 untuk partikel 2,6 μm Untuk 5 μm partikel 43.Oleh karena itu, permeabilitas fase PMP serupa dengan partikel inti-kulit 5 μm.
di mana Wx adalah berat kolom yang diisi kloroform, Wy adalah berat kolom yang diisi metanol, dan ρ adalah massa jenis pelarut. Massa jenis metanol (ρ = 0,7866) dan kloroform (ρ = 1,484). Total porositas kolom SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 dan kolom C18-Urea 31 yang telah kita pelajari sebelumnya masing-masing adalah 0,63 dan 0,55. Ini berarti bahwa keberadaan ligan urea mengurangi permeabilitas fase stasioner. Di sisi lain, total porositas kolom PMP (100 × 1,8 mm id) adalah 0,60. Permeabilitas kolom PMP lebih rendah daripada kolom yang diisi partikel silika yang terikat C18 karena pada fase stasioner tipe C18 ligan C18 melekat pada partikel silika sebagai porositas linier. rantai, sedangkan pada fase stasioner tipe polistirena, lapisan polimer yang relatif tebal terbentuk di sekitarnya. Dalam percobaan umum, porositas kolom dihitung sebagai:
Gambar 7A,B menunjukkan kolom PMP (id 100 × 1,8 mm) dan kolom Ascentis Express RP-Amide (id 100 × 1,8 mm) menggunakan kondisi elusi yang sama (yaitu, 60/40 ACN/H2O dan 0,1% TFA). ) dari plot van Deemter. Campuran peptida terpilih (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) disiapkan dalam 20 µL/ Laju alir minimum untuk kedua kolom adalah 800 µL/menit. Nilai HETP minimum pada laju alir optimum (80 µL/menit) untuk kolom PMP dan kolom Ascentis Express RP-Amide masing-masing adalah 2,6 µm dan 3,9 µm. Nilai HETP menunjukkan bahwa efisiensi pemisahan kolom PMP (100 × 1,8 mm id) jauh lebih baik daripada kolom Ascentis Express RP-Amide yang tersedia secara komersial (100 × 1,8 mm id). Plot van Deemter pada Gambar 7(A) menunjukkan bahwa penurunan nilai N dengan peningkatan aliran tidak signifikan dibandingkan dengan penelitian kami sebelumnya. Efisiensi pemisahan yang lebih tinggi dari kolom PMP (100 × 1,8 mm id) dibandingkan dengan kolom Ascentis Express RP-Amide didasarkan pada peningkatan bentuk partikel, ukuran, dan prosedur pengemasan kolom kompleks yang digunakan dalam pekerjaan saat ini34.
(A) Plot van Deemter (HETP versus kecepatan linier fase gerak) diperoleh menggunakan kolom PMP (id 100 × 1,8 mm) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0,1% TFA. (B) Plot van Deemter (HETP versus kecepatan linier fase gerak) diperoleh menggunakan kolom Ascentis Express RP-Amide (id 100 × 1,8 mm) dalam 60/40 ACN/H2O dengan 0,1% TFA.
Fase stasioner polistirena yang tertanam dalam polar disiapkan dan dievaluasi untuk pemisahan campuran peptida sintetis dan pencernaan tripsin dari albumin serum manusia (HAS) dalam kromatografi cair kinerja tinggi. Kinerja kromatografi kolom PMP untuk campuran peptida sangat baik dalam hal efisiensi dan resolusi pemisahan. Peningkatan kinerja pemisahan kolom PMP disebabkan oleh berbagai alasan, seperti ukuran partikel dan ukuran pori partikel silika, sintesis fase stasioner yang terkontrol, dan pengepakan kolom yang kompleks. Selain efisiensi pemisahan yang tinggi, tekanan balik kolom yang rendah pada laju aliran tinggi merupakan keuntungan lain dari fase stasioner ini. Kolom PMP menunjukkan reproduktifitas yang baik dan dapat digunakan untuk analisis campuran peptida dan pencernaan tripsin dari berbagai protein. Kami bermaksud menggunakan kolom ini untuk pemisahan produk alami, senyawa bioaktif dari tanaman obat dan ekstrak jamur dalam kromatografi cair. Di masa mendatang, kolom PMP juga akan dievaluasi untuk pemisahan protein dan antibodi monoklonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Penelitian tentang Sistem Pemisahan Peptida dengan Kromatografi Fase Terbalik Bagian I: Pengembangan Protokol Karakterisasi Kolom.J. Kromatografi.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al.Peptida aktif yang ditingkatkan yang dirancang untuk pengobatan penyakit menular.Bioteknologi.Lanjutan.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptida terapeutik sintetis: sains dan pasar. Penemuan obat. 15 (1-2) hari ini, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi Cair Proteomik Tingkat Lanjut.J. Kromatografi.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. dkk. Kromatografi cair-spektrometri massa tingkat lanjut memungkinkan penggabungan metabolomik dan proteomik yang ditargetkan secara luas. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peran UHPLC dalam pengembangan obat.J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspek fundamental dan praktis kromatografi cair tekanan ultra tinggi untuk pemisahan cepat.J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Aplikasi kromatografi cair kinerja ultra tinggi dalam pengembangan obat.J. Kromatografi.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. dkk. Hidrogel makropori monolitik yang dibuat dari emulsi fase internal tinggi minyak dalam air untuk pemurnian enterovirus yang efisien. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peran kromatografi cair dalam proteomik.J. Kromatografi.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Tren yang muncul dalam pemisahan kromatografi cair fase terbalik dari peptida dan protein terapeutik: teori dan aplikasi. J. Farmasi. Ilmu Biomedis. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pemisahan peptida dua dimensi menggunakan sistem RP-RP-HPLC menggunakan nilai pH yang berbeda pada dimensi pemisahan pertama dan kedua.J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Karakteristik perpindahan massa dan kinerja kinetik kolom kromatografi efisiensi tinggi yang dikemas dengan partikel C18 sub-2 μm berpori penuh dan dangkal diselidiki.J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Tren terbaru dan tantangan analitis dalam isolasi, identifikasi dan validasi peptida bioaktif tanaman.anus.anus biologis.Kimia.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Pemandangan proteomik kerajaan kehidupan. Alam 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al.Pemrosesan hilir peptida terapeutik dengan kromatografi cair preparatif.Molekul (Basel, Swiss) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi mode campuran dan penerapannya pada biopolimer.J. Kromatografi.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligand untuk kromatografi protein mode campuran: prinsip, karakterisasi, dan desain. J. Bioteknologi. 144(1), 3-11 (2009).