Grazzi talli żort Nature.com. Il-verżjoni tal-browser li qed tuża għandha appoġġ limitat għas-CSS. Għall-aħjar esperjenza, nirrakkomandaw li tuża browser aġġornat (jew titfi l-modalità ta' kompatibilità fl-Internet Explorer). Sadanittant, biex niżguraw appoġġ kontinwu, se nuru s-sit mingħajr stili u JavaScript.
Partiċelli porużi tas-silika ġew ippreparati b'metodu sol-gel b'xi modifiki biex jinkisbu partiċelli makroporużi. Dawn il-partiċelli ġew derivatizzati permezz ta' polimerizzazzjoni ta' trasferiment ta' katina ta' frammentazzjoni ta' żieda riversibbli (RAFT) b'N-phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PMI) u styrene biex tiġi ppreparata l-interkalazzjoni ta' N-phenylmaleimide tal-fażi stazzjonarja tal-polistirene (PMP). Kolonni tal-istainless steel b'dijametru dejqa (100 × 1.8 mm id) ġew ippakkjati permezz ta' ppakkjar ta' demel likwidu. Evalwata s-separazzjoni tal-kolonna PMP ta' taħlita ta' peptidi li tikkonsisti f'ħames peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) prestazzjoni kromatografika) u diġestjoni tat-tripsina tal-albumina tas-serum uman (HAS). Taħt kundizzjonijiet ottimali ta' eluzzjoni, l-għadd teoretiku tal-pjanċi tat-taħlita tal-peptidi huwa għoli daqs 280,000 pjanċa/m². It-tqabbil tal-prestazzjoni tas-separazzjoni tal-kolonna żviluppata mal-kummerċjali Fil-kolonna Ascentis Express RP-Amide, ġie osservat li l-prestazzjoni tas-separazzjoni tal-kolonna PMP kienet superjuri għall-kolonna kummerċjali f'termini ta' effiċjenza u riżoluzzjoni tas-separazzjoni.
Fi snin reċenti, l-industrija bijofarmaċewtika saret suq globali li qed jespandi b'żieda sostanzjali fis-sehem tas-suq. Bit-tkabbir splussiv tal-industrija bijofarmaċewtika1,2,3, l-analiżi tal-peptidi u l-proteini hija mixtieqa ħafna. Minbarra l-peptid fil-mira, diversi impuritajiet jiġu ġġenerati waqt is-sintesi tal-peptidi, u b'hekk teħtieġ purifikazzjoni kromatografika biex jinkisbu peptidi tal-purità mixtieqa. L-analiżi u l-karatterizzazzjoni tal-proteini fil-fluwidi tal-ġisem, fit-tessuti u fiċ-ċelloli hija kompitu estremament ta' sfida minħabba n-numru kbir ta' speċi potenzjalment skoperti f'kampjun wieħed. Għalkemm l-ispettrometrija tal-massa hija għodda effettiva għas-sekwenzar tal-peptidi u l-proteini, jekk kampjuni bħal dawn jiġu injettati fl-ispettrometru tal-massa f'pass wieħed, is-separazzjoni ma tkunx ideali. Din il-problema tista' tiġi mitigata billi jiġu implimentati separazzjonijiet tal-kromatografija likwida (LC) qabel l-analiżi tal-MS, li tnaqqas in-numru ta' analiti li jidħlu fl-ispettrometru tal-massa f'ħin partikolari4,5,6. Barra minn hekk, waqt is-separazzjoni tal-fażi likwida, l-analiti jistgħu jiġu ffukati f'reġjuni dojoq, u b'hekk jikkonċentraw dawn l-analiti u jtejbu s-sensittività tad-detezzjoni tal-MS. Il-kromatografija likwida (LC) avvanzat b'mod sinifikanti matul l-aħħar għaxar snin u saret... teknika popolari fl-analiżi proteomika7,8,9,10.
Il-kromatografija likwida b'fażi inversa (RP-LC) tintuża ħafna għall-purifikazzjoni u s-separazzjoni ta' taħlitiet ta' peptidi bl-użu ta' silika modifikata bl-ottadeċil (ODS) bħala l-fażi stazzjonarja11,12,13. Madankollu, il-fażijiet stazzjonarji RP ma jipprovdux separazzjoni sodisfaċenti ta' peptidi u proteini minħabba l-istruttura kumplessa u n-natura anfifilika tagħhom14,15. Għalhekk, huma meħtieġa fażijiet stazzjonarji ddisinjati apposta biex jiġu analizzati peptidi u proteini b'partijiet polari u mhux polari biex jinteraġixxu ma' u jżommu dawn l-analiti16. Il-kromatografija f'modalità mħallta, li tipprovdi interazzjonijiet multimodali, tista' tkun alternattiva għall-RP-LC għas-separazzjoni ta' peptidi, proteini, u taħlitiet kumplessi oħra. Ġew ippreparati diversi fażijiet stazzjonarji f'modalità mħallta, u kolonni ppakkjati b'dawn il-fażijiet intużaw għal separazzjonijiet ta' peptidi u proteini17,18,19,20,21. Il-fażijiet stazzjonarji f'modalità mħallta (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalazzjoni polari/RPLC) huma adattati għal separazzjonijiet ta' peptidi u proteini minħabba l-preżenza kemm ta' komponenti polari kif ukoll mhux polari. gruppi22,23,24,25,26,27,28. Bl-istess mod, fażijiet stazzjonarji interkalanti polari bi gruppi polari marbuta b'mod kovalenti juru qawwa ta' separazzjoni tajba u selettività unika għal analiti polari u mhux polari, peress li s-separazzjoni tiddependi fuq l-interazzjoni bejn l-analit u l-fażi stazzjonarja. Interazzjonijiet multimodali 29, 30, 31, 32. Riċentement, Zhang et al. 30 ħejjew fażi stazzjonarja ta' poliamina terminata bid-dodeċil u sseparaw b'suċċess idrokarburi, antidipressanti, flavonojdi, nukleosidi, estroġeni, u diversi analiti oħra. L-interkalatur polari għandu kemm gruppi polari kif ukoll mhux polari, għalhekk jista' jintuża biex jissepara peptidi u proteini li għandhom kemm partijiet idrofobiċi kif ukoll idrofiliċi. Kolonni inkorporati polari (eż., kolonni C18 inkorporati amide) huma disponibbli kummerċjalment taħt l-isem kummerċjali kolonni Ascentis Express RP-Amide, iżda dawn il-kolonni jintużaw għall-analiżi tal-amina 33 biss.
Fl-istudju attwali, fażi stazzjonarja inkorporata b'mod polari (polistirene inkorporat b'N-phenylmaleimide) ġiet ippreparata u evalwata għas-separazzjoni ta' peptidi u diġesti ta' tripsina ta' HSA. Il-fażi stazzjonarja ġiet ippreparata bl-użu tal-istrateġija li ġejja. Partiċelli tas-silika porużi ġew ippreparati skont il-proċedura mogħtija fil-pubblikazzjoni preċedenti tagħna b'xi modifiki għall-protokoll ta' preparazzjoni. Il-proporzjon ta' urea, polietilen glikol (PEG), TMOS, ilma u aċidu aċetiku ġie aġġustat biex jipprepara partiċelli tas-silika b'daqs kbir ta' pori. It-tieni, ligand ġdid, phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate, ġie sintetizzat u użat biex jidderivatizza l-partiċelli tas-silika biex jipprepara fażi stazzjonarja inkorporata b'mod polari. Il-fażi stazzjonarja li rriżultat ġiet ippakkjata f'kolonna tal-istainless steel (100 × 1.8 mm id) bl-użu tal-iskema tal-ippakkjar ottimizzata. L-ippakkjar tal-kolonna huwa assistit b'vibrazzjoni mekkanika biex jiżgura li jiġi ffurmat sodda omoġenja fil-kolonna. Evalwa s-separazzjoni tal-kolonna ppakkjata ta' taħlitiet ta' peptidi li jikkonsistu f'ħames peptidi; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) u diġestjoni tat-tripsina tal-albumina tas-serum uman (HAS). It-taħlita tal-peptidi u d-diġestjoni tat-tripsina tal-HSA dehru li jisseparaw b'riżoluzzjoni u effiċjenza tajba. Il-prestazzjoni tas-separazzjoni tal-kolonna PMP ġiet imqabbla ma' dik tal-kolonna Ascentis Express RP-Amide. Kemm il-peptidi kif ukoll il-proteini dehru li huma riżolti tajjeb u effiċjenti fuq il-kolonna PMP, li kienet aktar effiċjenti mill-kolonna Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polietilen Glikol), Urea, Aċidu Aċetiku, Trimetossi Ortosilikat (TMOS), Trimetil Klorosilan (TMCS), Tripsina, Albumina tas-Serum Uman (HSA), Klorur tal-Ammonju, Urea, Esan Metildisilazan (HMDS), Klorur tal-Metakrilojl (MC), Stirene, 4-Idrossi-TEMPO, Perossidu tal-Benzojl (BPO), Aċetonitril ta' Grad HPLC (ACN), Metanol, 2-Propanol, u Aċetun Mixtrija minn Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Taħlita ta' urea (8 g), polietilen glikol (8 g), u 8 mL ta' aċidu aċetiku 0.01 N tħawdet għal 10 minuti, u mbagħad 24 mL ta' TMOS ġew miżjuda magħha f'kundizzjonijiet kesħin bis-silġ. It-taħlita ta' reazzjoni ssaħħan f'40°C għal 6 sigħat u mbagħad f'120°C għal 8 sigħat f'awtoklav tal-istainless steel. L-ilma tferra' u l-materjal residwu tnixxef f'70°C għal 12-il siegħa. Il-massa ratba mnixxfa ġiet mitħuna bla xkiel f'forn u kalċinata f'550°C għal 12-il siegħa. Tliet lottijiet ġew ippreparati u kkaratterizzati biex tiġi eżaminata r-riproduċibbiltà fid-daqs tal-partiċelli, id-daqs tal-pori u l-erja tal-wiċċ.
Permezz ta' modifikazzjoni tal-wiċċ tal-partiċelli tas-silika bil-ligand phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) sintetizzat minn qabel segwit minn polimerizzazzjoni radjali bl-istirene, ġie ppreparat kompost li fih grupp polari. Fażi stazzjonarja għal aggregati u ktajjen tal-polistirene. Il-proċess ta' preparazzjoni huwa deskritt hawn taħt.
N-phenylmaleimide (200 mg) u methyl vinyl isocyanate (100 mg) ġew maħlula f'toluene niexef, u 0.1 mL ta' 2,2′-azoisobutyronitrile (AIBN) ġie miżjud mal-flixkun tar-reazzjoni biex jiġi ppreparat il-kopolimeru phenylmaleimide-methyl vinyl isocyanate (PMCP). It-taħlita ġiet saħħna f'60°C għal 3 sigħat, iffiltrata u mnixxfa f'forn f'40°C għal 3 sigħat.
Partiċelli tas-silika mnixxfa (2 g) ġew imxerrda f'toluene niexef (100 mL), imħawda u sonikati fi flask b'qiegħ tond ta' 500 mL għal 10 minuti. PMCP (10 mg) ġie maħlul fit-toluene u miżjud qatra qatra mal-flask tar-reazzjoni permezz ta' lembut tat-tqattigħ. It-taħlita ġiet riflussata f'100°C għal 8 sigħat, iffiltrata u maħsula bl-aċetun u mnixxfa f'60°C għal 3 sigħat. Imbagħad, partiċelli tas-silika marbuta mal-PMCP (100 g) ġew maħlula f'toluene (200 ml) u 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) ġie miżjud fil-preżenza ta' 100 µL ta' dibutyltin dilaurate bħala katalist. It-taħlita ġiet imħawda f'50°C għal 8 sigħat, iffiltrata u mnixxfa f'50°C għal 3 sigħat.
Styrene (1 mL), benzoyl peroxide BPO (0.5 mL), u partiċelli tas-silika mwaħħla ma' TEMPO-PMCP (1.5 g) ġew imxerrda fit-toluene u mnaddfa bin-nitroġenu. Il-polimerizzazzjoni tal-styrene twettqet f'100°C għal 12-il siegħa. Il-prodott li rriżulta nħasel bil-metanol u tnixxef f'60°C matul il-lejl. L-iskema ġenerali tar-reazzjoni hija murija fil-Figura 1.
Il-kampjuni tneħħew mill-gass f'temperatura ta' 393 K għal siegħa biex tinkiseb pressjoni residwa ta' inqas minn 10-3 Torr. L-ammont ta' N2 assorbit fi pressjoni relattiva ta' P/P0 = 0.99 intuża biex jiġi ddeterminat il-volum totali tal-pori. Il-morfoloġija tal-partiċelli tas-silika mikxufa u marbuta mal-ligand ġiet eżaminata b'mikroskopija elettronika tal-iskannjar (Hitachi High Technologies, Tokyo, Ġappun). Kampjuni mnixxfa (silika mikxufa u partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand) tqiegħdu fuq kolonna tal-aluminju bl-użu ta' tejp tal-karbonju adeżiv. Id-deheb ġie indurat fuq il-kampjuni bl-użu ta' kisi tal-isputtering Q150T, u saff ta' Au ta' 5 nm ġie depożitat fuq il-kampjuni. Dan itejjeb l-effiċjenza tal-proċess bl-użu ta' vultaġġi baxxi u jipprovdi sputtering kiesaħ b'qamħ fin. Analizzatur elementali Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 intuża għall-analiżi elementali. Analizzatur tad-daqs tal-partiċelli Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 intuża biex tinkiseb id-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli. Partiċelli tas-silika mikxufa u Partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand (5 mg kull wieħed) ġew imxerrda f'5 mL ta' isopropanol, sonikati għal 10 minuti, vortexjati għal 5 minuti, u mqiegħda fuq il-bank ottiku tal-Mastersizer. L-analiżi termogravimetrika twettqet b'rata ta' 5 °C kull minuta fuq medda ta' temperatura ta' 30 sa 800 °C.
Kolonni ta' l-istainless steel miksija bil-ħġieġ b'dijametru dejqa ta' (100 × 1.8 mm id) ġew ippakkjati bl-użu tal-metodu ta' ppakkjar bit-taħlita, bl-applikazzjoni tal-istess proċedura użata fir-Ref. 31. Kolonna tal-istainless steel (miksija bil-ħġieġ, 100 × 1.8 mm id) b'fitting tal-ħruġ li fih frit ta' 1 µm ġiet imqabbda ma' packer tat-taħlita (Alltech Deerfield, IL, USA). Ipprepara taħlita ta' fażi stazzjonarja billi tissospendi 150 mg ta' fażi stazzjonarja f'1.2 mL ta' metanol u ibgħatha lejn il-kolonna tal-ħażna. Il-metanol intuża bħala s-solvent tat-taħlita kif ukoll is-solvent tal-propulsjoni. Imla l-kolonna sekwenzjalment billi tapplika pressjonijiet ta' 100 MP għal 10 minuti, 80 MP għal 15-il minuta, u 60 MP għal 30 minuta. Waqt l-ippakkjar, ġiet applikata vibrazzjoni mekkanika b'żewġ shakers tal-kolonna GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) biex tiżgura ippakkjar uniformi tal-kolonna. Agħlaq il-packer tat-taħlita u erħi l-pressjoni bil-mod biex tevita kwalunkwe ħsara fil-kolonna. Skonnettja l-kolonna mill-unità tal-ippakkjar tat-taħlita u qabbad fitting ieħor mad-daħla u mas-sistema LC biex tivverifika l-prestazzjoni tagħha.
Inbnew pompa LC (10AD Shimadzu, Ġappun), injettur (Valco (USA) C14 W.05) b'linja ta' injezzjoni ta' 50nL, degassatur tal-membrana (Shimadzu DGU-14A), tieqa kapillari UV-VIS. Intużaw ditekter speċjali tal-apparat µLC (UV-2075) u mikrokolonni miksija bil-ħġieġ. Użaw tubi ta' konnessjoni dojoq ħafna u qosra biex jimminimizzaw l-effett tat-twessigħ żejjed tal-faxxa tal-kolonna. Wara l-ippakkjar, ġew installati kapillari (50 μm id 365) u kapillari ta' unjoni li tnaqqas (50 μm) fl-iżbokk ta' 1/16″ tal-unjoni li tnaqqas. Il-ġbir tad-dejta u l-ipproċessar kromatografiku saru bl-użu tas-softwer Multichro 2000. Monitoraġġ f'254 nm. L-analiti ġew ittestjati għall-assorbenza UV. Id-dejta kromatografika ġiet analizzata minn OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumina minn serum uman, trab lijofilizzat, ≥ 96% (elettroforesi bil-ġel tal-agarose) 3 mg imħallta ma' tripsina (1.5 mg), 4.0 M urea (1 mL), u 0.2 M bikarbonat tal-ammonju (1 mL). Is-soluzzjoni tħawdet għal 10 minuti u nżammet f'banju tal-ilma f'37°C għal 6 sigħat, imbagħad ġiet imkessħa b'1 mL ta' 0.1% TFA. Iffiltra s-soluzzjoni u aħżenha taħt l-4 °C.
Is-separazzjoni tat-taħlitiet tal-peptidi u d-diġesti tat-tripsina HSA ġew evalwati separatament fuq kolonni PMP. Iċċekkja s-separazzjoni tat-taħlita tal-peptidi u d-diġesti tat-tripsina tal-HSA mill-kolonna PMP u qabbel ir-riżultati mal-kolonna Ascentis Express RP-Amide. In-numru teoretiku tal-pjanċa huwa kkalkulat kif ġej:
Immaġnijiet SEM ta' partiċelli tas-silika mikxufa u partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand huma murija fil-FIG. 2. Immaġnijiet SEM ta' partiċelli tas-silika mikxufa (A, B) juru li, b'kuntrast mal-istudji preċedenti tagħna, dawn il-partiċelli huma sferiċi fejn il-partiċelli huma tawwalin jew għandhom simetrija irregolari. Il-wiċċ tal-partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand (C, D) huwa aktar lixx minn dak tal-partiċelli tas-silika mikxufa, li jista' jkun minħabba l-kisi ta' ktajjen tal-polistirene fuq il-wiċċ tal-partiċelli tas-silika.
Immaġnijiet ta' mikroskopju elettroniku ta' skennjar ta' partiċelli tas-silika vojta (A, B) u partiċelli tas-silika marbuta ma' ligand (C, D).
Id-distribuzzjonijiet tad-daqs tal-partiċelli tal-partiċelli tas-silika vojta u l-partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand huma murija fil-Figura 3(A). Il-kurvi tad-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli bbażati fuq il-volum urew li d-daqs tal-partiċelli tas-silika żdied wara modifika kimika (Fig. 3A). Id-dejta tad-distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli tal-partiċelli tas-silika mill-istudju attwali u l-istudju preċedenti hija mqabbla fit-Tabella 1(A). Id-daqs tal-partiċelli bbażat fuq il-volum, d(0.5), tal-PMP huwa 3.36 μm, meta mqabbel mal-istudju preċedenti tagħna b'valur ad(0.5) ta' 3.05 μm (partiċelli tas-silika marbuta mal-polistirene)34. Dan il-lott kellu distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli idjaq meta mqabbel mal-istudju preċedenti tagħna minħabba l-proporzjonijiet varjabbli ta' PEG, urea, TMOS, u aċidu aċetiku fit-taħlita tar-reazzjoni. Id-daqs tal-partiċelli tal-fażi PMP huwa kemxejn akbar minn dak tal-fażi tal-partiċelli tas-silika marbuta mal-polistirene li studjajna qabel. Dan ifisser li l-funzjonalizzazzjoni tal-wiċċ tal-partiċelli tas-silika bl-istirene ddepożitat biss saff tal-polistirene (0.97 µm) fuq il-wiċċ tas-silika, filwaqt li fil-fażi PMP Il-ħxuna tas-saff kienet ta' 1.38 µm.
Distribuzzjoni tad-daqs tal-partiċelli (A) u distribuzzjoni tad-daqs tal-pori (B) ta' partiċelli tas-silika vojta u partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand.
Id-daqs tal-pori, il-volum tal-pori u l-erja tal-wiċċ tal-partiċelli tas-silika tal-istudju attwali huma mogħtija fit-Tabella 1(B). Il-profili PSD tal-partiċelli tas-silika mikxufa u l-partiċelli tas-silika marbuta mal-ligand huma murija fil-Figura 3(B). Ir-riżultati huma komparabbli mal-istudju preċedenti tagħna. Id-daqsijiet tal-pori tal-partiċelli tas-silika mikxufa u marbuta mal-ligand huma 310 u 241, rispettivament, li jindika li d-daqs tal-pori jonqos b'69 ​​wara l-modifika kimika, kif muri fit-Tabella 1(B), u l-bidla tal-kurva hija murija fil-Fig. 3(B). Bl-istess mod, il-volum tal-pori tal-partiċelli tas-silika naqas minn 0.67 għal 0.58 cm3/g wara l-modifika kimika. L-erja tal-wiċċ speċifika tal-partiċelli tas-silika studjati bħalissa hija 116 m2/g, li hija komparabbli mal-istudju preċedenti tagħna (124 m2/g). Kif muri fit-Tabella 1(B), l-erja tal-wiċċ (m2/g) tal-partiċelli tas-silika naqset ukoll minn 116 m2/g għal 105 m2/g wara l-modifika kimika. modifika.
Ir-riżultati tal-analiżi elementali tal-fażi stazzjonarja huma murija fit-Tabella 2. It-tagħbija tal-karbonju tal-fażi stazzjonarja attwali hija ta' 6.35%, li hija inqas mit-tagħbija tal-karbonju tal-istudju preċedenti tagħna (partiċelli tas-silika marbuta mal-polistirene, 7.93%35 u 10.21%, rispettivament) 42. It-tagħbija tal-karbonju tal-fażi stazzjonarja attwali hija baxxa, Minħabba li fil-preparazzjoni tal-SP attwali, minbarra l-istirene, intużaw xi ligandi polari bħal phenylmaleimide-methylvinylisocyanate (PCMP) u 4-hydroxy-TEMPO. Il-perċentwal tal-piż tan-nitroġenu tal-fażi stazzjonarja attwali huwa ta' 2.21%, meta mqabbel ma' 0.1735 u 0.85% bil-piż tan-nitroġenu fi studji preċedenti, rispettivament. Dan ifisser li l-perċentwal tal-piż tan-nitroġenu huwa ogħla fil-fażi stazzjonarja attwali minħabba l-phenylmaleimide. Bl-istess mod, it-tagħbijiet tal-karbonju tal-prodotti (4) u (5) kienu ta' 2.7% u 2.9%, rispettivament, filwaqt li t-tagħbija tal-karbonju tal-fażi finali Il-prodott (6) kien ta' 6.35%, kif muri fit-Tabella 2. It-telf fil-piż ġie ċċekkjat bil-fażi stazzjonarja PMP, u l-kurva TGA hija murija fil-Figura 4. Il-kurva TGA turi telf fil-piż ta' 8.6%, li huwa fi qbil tajjeb mat-tagħbija tal-karbonju (6.35%) għaliex il-ligandi mhux biss fihom C iżda wkoll N, O, u H.
Il-ligand fenilmaleimide-metilvinisoċjanat intgħażel għall-modifika tal-wiċċ tal-partiċelli tas-silika għaliex għandu gruppi polari fenilmaleimide u gruppi vinilisoċjanat. Il-gruppi tal-vinil isoċjanat jistgħu jirreaġixxu aktar mal-istirene permezz ta' polimerizzazzjoni radikali ħajja. It-tieni raġuni hija li tiddaħħal grupp li għandu interazzjoni moderata mal-analit u l-ebda interazzjoni elettrostatika qawwija bejn l-analit u l-fażi stazzjonarja, peress li l-parti fenilmaleimide m'għandhiex ċarġ virtwali f'pH normali. Il-polarità tal-fażi stazzjonarja tista' tiġi kkontrollata mill-ammont ottimali ta' stirene u l-ħin ta' reazzjoni tal-polimerizzazzjoni radikali ħielsa. L-aħħar pass tar-reazzjoni (polimerizzazzjoni radikali ħielsa) huwa kritiku u jista' jibdel il-polarità tal-fażi stazzjonarja. Twettqet analiżi elementali biex tiġi vverifikata t-tagħbija tal-karbonju ta' dawn il-fażijiet stazzjonarji. Ġie osservat li ż-żieda fl-ammont ta' stirene u l-ħin ta' reazzjoni żiedet it-tagħbija tal-karbonju tal-fażi stazzjonarja u viċi versa. L-SPs ippreparati b'konċentrazzjonijiet differenti ta' stirene għandhom tagħbijiet differenti tal-karbonju. Għal darb'oħra, għabbi dawn il-fażijiet stazzjonarji f'kolonni tal-istainless steel u ċċekkja l-kromatografija tagħhom. prestazzjoni (selettività, riżoluzzjoni, valur N, eċċ.). Abbażi ta' dawn l-esperimenti, intgħażlet formulazzjoni ottimizzata biex tipprepara l-fażi stazzjonarja tal-PMP biex tiżgura polarità kkontrollata u żamma tajba tal-analit.
Ħames taħlitiet ta' peptidi (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkephalin) ġew evalwati wkoll bl-użu ta' kolonna PMP bl-użu ta' fażi mobbli; 60/40 (v/v) aċetonitrile/ilma (0.1% TFA) b'rata ta' fluss ta' 80 μL/min. Taħt kundizzjonijiet ottimali ta' eluzzjoni, in-numru teoretiku tal-pjanċa (N) għal kull kolonna (100 × 1.8 mm id) huwa 20,000 ± 100 (200,000 pjanċa/m²). It-Tabella 3 tagħti l-valuri N għat-tliet kolonni PMP u l-kromatogrammi huma murija fil-Figura 5A. Analiżi mgħaġġla fuq kolonna PMP b'rata ta' fluss għolja (700 μL/min), ħames peptidi ġew elużi fi żmien minuta, il-valuri N kienu tajbin ħafna, 13,500 ± 330 għal kull kolonna (100 × 1.8 mm id), Jikkorrispondi għal 135,000 pjanċa/m (Figura 5B). Tliet kolonni ta' daqs identiku (100 × 1.8 mm id) ġew ippakkjati bi tliet lottijiet differenti ta' fażi stazzjonarja PMP biex tiġi vverifikata r-riproduċibbiltà. Il- Il-konċentrazzjoni tal-analit għal kull kolonna ġiet irreġistrata bl-użu tal-kundizzjonijiet ottimali ta' eluzzjoni u n-numru ta' pjanċi teoretiċi N u l-ħin ta' żamma biex tiġi separata l-istess taħlita tat-test fuq kull kolonna. Id-dejta tar-riproduċibbiltà għall-kolonni PMP hija murija fit-Tabella 4. Ir-riproduċibbiltà tal-kolonna PMP tikkorrelata sew ma' valuri baxxi ħafna ta' %RSD, kif muri fit-Tabella 3.
Separazzjoni tat-taħlita tal-peptidi fuq il-kolonna PMP (B) u l-kolonna Ascentis Express RP-Amide (A); fażi mobbli 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), dimensjonijiet tal-kolonna PMP (100 × 1.8 mm id); analitika L-ordni ta' eluzzjoni tal-komposti: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) u 5 (leucine) acid enkephalin)).
Kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) ġiet evalwata għas-separazzjoni ta' diġesti triptiċi ta' albumina tas-serum uman fi kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja. Il-kromatogramma fil-Figura 6 turi li l-kampjun huwa separat sew u r-riżoluzzjoni hija tajba ħafna. Id-diġesti tal-HSA ġew analizzati bl-użu ta' rata ta' fluss ta' 100 µL/min, fażi mobbli 70/30 aċetonitrile/ilma u 0.1% TFA. Kif muri fil-kromatogramma (Figura 6), id-diġestjoni tal-HSA ġiet maqsuma f'17-il quċċata li jikkorrispondu għal 17-il peptide. L-effiċjenza tas-separazzjoni ta' kull quċċata fid-diġestjoni tal-HSA ġiet ikkalkulata u l-valuri huma mogħtija fit-Tabella 5.
Diġest triptiku ta' HSA (100 × 1.8 mm id) ġie separat fuq kolonna PMP; rata ta' fluss (100 µL/min), fażi mobbli 60/40 aċetonitrile/ilma b'0.1% TFA.
Fejn L hija t-tul tal-kolonna, η hija l-viskożità tal-fażi mobbli, ΔP hija l-pressjoni ta' wara tal-kolonna, u u hija l-veloċità lineari tal-fażi mobbli. Il-permeabilità tal-kolonna PMP kienet 2.5 × 10-14 m2, ir-rata tal-fluss kienet 25 μL/min, u ntuża 60/40 v/v ACN/ilma. Il-permeabilità tal-kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) kienet simili għal dik tal-istudju preċedenti tagħna Ref.34. Il-permeabilità tal-kolonna ppakkjata b'partiċelli superfiċjalment porużi hija: 1.7 × 10-15 għal partiċelli ta' 1.3 μm, 3.1 × 10-15 għal partiċelli ta' 1.7 μm, 5.2 × 10-15 u 2.5 × 10-14 m2 għal partiċelli ta' 2.6 μm Għal partiċelli ta' 5 μm 43. Għalhekk, il-permeabilità tal-fażi PMP hija simili għal dik tal-partiċelli core-shell ta' 5 μm.
Fejn Wx huwa l-piż tal-kolonna ppakkjata bil-kloroform, Wy huwa l-piż tal-kolonna ppakkjata bil-metanol, u ρ hija d-densità tas-solvent. Id-densitajiet tal-metanol (ρ = 0.7866) u l-kloroform (ρ = 1.484). Il-porożità totali tal-kolonni SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1.8 mm id) 34 u l-kolonni C18-Urea 31 li studjajna qabel kienu 0.63 u 0.55, rispettivament. Dan ifisser li l-preżenza ta' ligandi tal-urea tnaqqas il-permeabilità tal-fażi stazzjonarja. Min-naħa l-oħra, il-porożità totali tal-kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) hija 0.60. Il-permeabilità tal-kolonni PMP hija aktar baxxa minn dik tal-kolonni ppakkjati b'partiċelli tas-silika marbuta mas-C18 għaliex fil-fażijiet stazzjonarji tat-tip C18 il-ligandi C18 huma mwaħħla mal-partiċelli tas-silika bħala ktajjen lineari, filwaqt li fil-fażijiet stazzjonarji tat-tip polistirene, is-saff tal-polimeru relattivament oħxon huwa iffurmat madwaru. F'esperiment tipiku, il-porożità tal-kolonna hija kkalkulata bħala:
Il-Figura 7A,B juru l-kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) u l-kolonna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) bl-użu tal-istess kundizzjonijiet ta' eluzzjoni (jiġifieri, 60/40 ACN/H2O u 0.1% TFA). ) tal-plott ta' van Deemter. Taħlitiet ta' peptidi magħżula (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) ġew ippreparati f'20 µL/ Ir-rata minima tal-fluss għaż-żewġ kolonni hija 800 µL/min. Il-valuri minimi tal-HETP bir-rata ottima tal-fluss (80 µL/min) għall-kolonna PMP u l-kolonna Ascentis Express RP-Amide kienu 2.6 µm u 3.9 µm, rispettivament. Il-valuri tal-HETP jindikaw li l-effiċjenza tas-separazzjoni tal-kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) hija ħafna aħjar mill-kolonna Ascentis Express RP-Amide disponibbli kummerċjalment (100 × 1.8 mm id). Il-plott ta' van Deemter fil-Fig. 7(A) juri li t-tnaqqis fil-valur N biż-żieda fil-fluss mhuwiex sinifikanti meta mqabbel mal-istudju preċedenti tagħna. L-effiċjenza ogħla tas-separazzjoni tal-kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) meta mqabbla għall-kolonna Ascentis Express RP-Amide hija bbażata fuq titjib fil-forma, id-daqs tal-partiċelli, u l-proċeduri kumplessi tal-ippakkjar tal-kolonni użati fix-xogħol attwali34.
(A) plott ta' van Deemter (HETP kontra l-veloċità lineari tal-fażi mobbli) miksub bl-użu ta' kolonna PMP (100 × 1.8 mm id) f'60/40 ACN/H2O b'0.1% TFA.(B) plott ta' van Deemter (HETP kontra l-veloċità lineari tal-fażi mobbli) miksub bl-użu ta' kolonna Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 mm id) f'60/40 ACN/H2O b'0.1% TFA.
Fażi stazzjonarja tal-polistirene inkorporata polari ġiet ippreparata u evalwata għas-separazzjoni ta' taħlitiet sintetiċi ta' peptidi u diġesti tat-tripsina tal-albumina tas-serum uman (HAS) fil-kromatografija likwida ta' prestazzjoni għolja. Il-prestazzjoni kromatografika tal-kolonni PMP għal taħlitiet ta' peptidi hija eċċellenti fl-effiċjenza u r-riżoluzzjoni tas-separazzjoni. Il-prestazzjoni mtejba tas-separazzjoni tal-kolonni PMP hija dovuta għal diversi raġunijiet, bħad-daqs tal-partiċelli u d-daqs tal-pori tal-partiċelli tas-silika, is-sintesi kkontrollata tal-fażi stazzjonarja, u l-ippakkjar kumpless tal-kolonni. Minbarra l-effiċjenza għolja tas-separazzjoni, il-pressjoni baxxa ta' wara tal-kolonna b'rati ta' fluss għoljin hija vantaġġ ieħor ta' din il-fażi stazzjonarja. Il-kolonni PMP juru riproduċibilità tajba u jistgħu jintużaw għall-analiżi ta' taħlitiet ta' peptidi u diġestjoni tat-tripsina ta' diversi proteini. Għandna l-ħsieb li nużaw din il-kolonna għas-separazzjoni ta' prodotti naturali, komposti bijoattivi minn pjanti mediċinali u estratti fungali fil-kromatografija likwida. Fil-futur, il-kolonni PMP se jiġu evalwati wkoll għas-separazzjoni ta' proteini u antikorpi monoklonali.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Riċerka dwar Sistemi ta' Separazzjoni tal-Peptidi permezz tal-Kromatografija ta' Fażi Inversa Parti I: Żvilupp ta' Protokoll ta' Karatterizzazzjoni tal-Kolonna. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Peptidi attivi mtejba ddisinjati għat-trattament ta' mard infettiv. Bijoteknoloġija Avvanzata. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Peptidi terapewtiċi sintetiċi: ix-xjenza u s-suq. skoperta ta' drogi. 15 (1-2) illum, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografija Likwida Proteomika Avvanzata. J. Kromatografija. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografija likwida avvanzata-spettrometrija tal-massa tippermetti l-inkorporazzjoni ta' metabolomika u proteomika mmirati b'mod wiesa'. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Ir-rwol tal-UHPLC fl-iżvilupp tal-mediċini. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspetti fundamentali u prattiċi tal-kromatografija likwida bi pressjoni ultra-għolja għal separazzjonijiet rapidi. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Applikazzjoni ta' kromatografija likwida ta' prestazzjoni ultra-għolja fl-iżvilupp ta' drogi. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Idroġels makroporużi monolitiċi ppreparati minn emulsjonijiet ta' fażi interna għolja ta' żejt fl-ilma għal purifikazzjoni effiċjenti ta' enteroviruses. Chemical. Britain. J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Ir-rwol tal-kromatografija likwida fil-proteomika. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. Xejriet emerġenti fis-separazzjonijiet tal-kromatografija likwida b'fażi inversa ta' peptidi u proteini terapewtiċi: teorija u applikazzjonijiet. J. Pharmacy. Biomedical Science. anus. 69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Separazzjoni bidimensjonali ta' peptidi bl-użu ta' sistema RP-RP-HPLC bl-użu ta' valuri ta' pH differenti fl-ewwel u t-tieni dimensjonijiet ta' separazzjoni. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Ġew investigati l-karatteristiċi tat-trasferiment tal-massa u l-prestazzjoni kinetika ta' kolonni kromatografiċi ta' effiċjenza għolja ppakkjati b'partiċelli C18 sub-2 μm kompletament u superfiċjalment porużi. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Xejriet riċenti u sfidi analitiċi fl-iżolament, l-identifikazzjoni u l-validazzjoni ta' peptidi bijoattivi tal-pjanti. anus. anus bijoloġiċi. Kimika. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Il-pajsaġġ proteomiku tar-renju tal-ħajja. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Ipproċessar 'l isfel minn peptidi terapewtiċi permezz ta' kromatografija likwida preparattiva. Molecule (Basel, l-Iżvizzera) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografija b'modalità mħallta u l-applikazzjoni tagħha għall-bijopolimeri. J. Kromatografija. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligandi għall-kromatografija tal-proteini f'modalità mħallta: prinċipju, karatterizzazzjoni, u disinn. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).