Tankewol foar jo besite oan Nature.com. De browserferzje dy't jo brûke hat beheinde stipe foar CSS. Foar de bêste ûnderfining advisearje wy jo in bywurke browser te brûken (of kompatibiliteitsmodus yn Internet Explorer út te skeakeljen). Yn 'e tuskentiid, om trochgeande stipe te garandearjen, sille wy de side sûnder stilen en JavaScript werjaan.
Poreuze silika-dieltsjes waarden taret troch in sol-gel-metoade mei wat oanpassingen om makroporeuze dieltsjes te krijen. Dizze dieltsjes waarden derivatisearre troch reversibele tafoegingfragmentaasjeketenoerdracht (RAFT) polymerisaasje mei N-fenylmaleimide-methylvinylisocyanaat (PMI) en styreen om N-fenylmaleimide-ynterkalaasje fan polystyreen (PMP) stasjonêre faze te meitsjen. Smalbore roestfrij stielen kolommen (100 × 1,8 mm id) waarden ynpakt troch slurrypakking. Evaluearre PMP-kolomskieding fan in peptidemingsel besteande út fiif peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkefaline) chromatografyske prestaasjes) en trypsine-spiisfertarring fan minsklik serumalbumine (HAS). Under optimale elúsjeomstannichheden is de teoretyske plaattelling fan it peptidemingsel sa heech as 280.000 platen/m². Fergeliking fan de skiedingsprestaasjes fan 'e ûntwikkele kolom mei de kommersjele Ascentis Express. RP-Amide-kolom, waard waarnommen dat de skiedingsprestaasjes fan 'e PMP-kolom superieur wiene oan 'e kommersjele kolom yn termen fan skiedingseffisjinsje en resolúsje.
Yn 'e lêste jierren is de biofarmaseutyske yndustry in útwreidzjende wrâldwide merk wurden mei in substansjele tanimming fan merkoandiel. Mei de eksplosive groei fan 'e biofarmaseutyske yndustry1,2,3 is de analyze fan peptiden en proteïnen tige winske. Neist it doelpeptide wurde ferskate ûnreinheden generearre tidens peptidesynteze, wêrtroch chromatografyske suvering nedich is om peptiden fan 'e winske suverens te krijen. De analyze en karakterisaasje fan proteïnen yn lichemsfloeistoffen, weefsels en sellen is in ekstreem útdaagjende taak fanwegen it grutte oantal potinsjeel detektearbere soarten yn ien stekproef. Hoewol massaspektrometry in effektyf ark is foar peptide- en proteïnesekwinsjearring, sil de skieding net ideaal wêze as sokke stekproeven yn ien pass yn 'e massaspektrometer ynjektearre wurde. Dit probleem kin wurde fermindere troch floeistofchromatografy (LC) skiedingen te ymplementearjen foar MS-analyze, wat it oantal analyten dat de massaspektrometer op in bepaald momint yngiet sil ferminderje4,5,6. Derneist kinne analyten tidens floeibere fazeskieding fokussearre wurde yn smelle regio's, wêrtroch dizze analyten konsintrearre wurde en de MS-deteksjegefoelichheid ferbettere wurdt. Floeistofchromatografy (LC) is de lêste tsien jier signifikant foarútgong makke en is in populêr wurden... technyk yn proteomyske analyze7,8,9,10.
Omkearde-faze floeistofchromatografy (RP-LC) wurdt breed brûkt foar de suvering en skieding fan peptidemingsels mei oktadecyl-modifisearre silika (ODS) as de stasjonêre faze11,12,13. RP stasjonêre fazen jouwe lykwols gjin befredigjende skieding fan peptiden en proteïnen fanwegen har komplekse struktuer en amfifile aard14,15. Dêrom binne spesjaal ûntworpen stasjonêre fazen nedich om peptiden en proteïnen te analysearjen mei poal- en net-poalgroepen om te ynteraksje mei en dizze analyten te behâlden16. Mixed-mode chromatografy, dy't multimodale ynteraksjes leveret, kin in alternatyf wêze foar RP-LC foar de skieding fan peptiden, proteïnen en oare komplekse mingsels. Ferskate mixed-mode stasjonêre fazen binne taret, en kolommen ynpakt mei dizze fazen binne brûkt foar peptide- en proteïneskiedingen17,18,19,20,21. Mixed-mode stasjonêre fazen (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, poalynterkalaasje/RPLC) binne geskikt foar peptide- en proteïneskiedingen fanwegen de oanwêzigens fan sawol poal- as net-poal groepen22,23,24,25,26,27,28. Op deselde wize litte poal-ynterkalearjende stasjonêre fazen mei kovalent bûne poalgroepen in goede skiedingskrêft en unike selektiviteit sjen foar poal- en net-poal-analyten, om't de skieding ôfhinklik is fan 'e ynteraksje tusken analyt en stasjonêre faze. Multimodale ynteraksjes29, 30, 31, 32. Koartlyn hawwe Zhang et al.30 in dodecyl-terminearre polyamine stasjonêre faze taret en mei súkses koalwetterstoffen, antidepressiva, flavonoïden, nukleosiden, estrogenen en ferskate oare analyten skieden.De poal-ynterkalator hat sawol poal- as net-poal-groepen, sadat it brûkt wurde kin om peptiden en proteïnen te skieden dy't sawol hydrofobe as hydrofile dielen hawwe.Poal-ynbêde kolommen (bygelyks amide-ynbêde C18-kolommen) binne kommersjeel beskikber ûnder de hannelsnamme Ascentis Express RP-Amide-kolommen, mar dizze kolommen wurde allinich brûkt foar de analyze fan amine33.
Yn 'e hjoeddeiske stúdzje waard in polar-ynbêde stasjonêre faze (N-fenylmaleimide-ynbêde polystyreen) taret en evaluearre foar skieding fan peptiden en trypsine-digesten fan HSA. De stasjonêre faze waard taret mei de folgjende strategy. Poreuze silika-dieltsjes waarden taret neffens de proseduere jûn yn ús foarige publikaasje mei wat oanpassingen oan it tariedingsprotokol. De ferhâlding fan urea, polyethyleenglycol (PEG), TMOS, wetter en azijnzuur waard oanpast om silika-dieltsjes mei in grutte poargrutte te meitsjen. Twadde, in nije ligand, fenylmaleimide-methylvinylisocyanaat, waard synthetisearre en brûkt om silika-dieltsjes te derivatisearjen om in polar-ynbêde stasjonêre faze te meitsjen. De resultearjende stasjonêre faze waard ynpakt yn in roestfrij stielen kolom (100 × 1,8 mm id) mei it optimalisearre ynpakskema. It kolomynpakjen wurdt holpen troch meganyske trilling om te soargjen dat in homogeen bêd binnen de kolom foarme wurdt. Evaluearje ynpakte kolomskieding fan peptidemingsels besteande út fiif peptiden; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) en Trypsine-digest fan minsklik serumalbumine (HAS). It peptidemingsel en trypsine-digest fan HSA waarden waarnommen mei goede resolúsje en effisjinsje te skieden. De skiedingsprestaasjes fan 'e PMP-kolom waarden fergelike mei dy fan' e Ascentis Express RP-Amide-kolom. Sawol peptiden as aaiwiten waarden waarnommen as goed oplost en effisjint op 'e PMP-kolom, dy't effisjinter wie as de Ascentis Express RP-Amide-kolom.
PEG (Polyethyleenglycol), Urea, Azijnzuur, Trimethoxyorthosilikaat (TMOS), Trimethylchlorosilaan (TMCS), Trypsine, Minsklik Serumalbumine (HSA), Ammoniumchloride, Urea, Hexaanmethyldisilazaan (HMDS), Methacryloylchloride (MC), Styreen, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoylperoxide (BPO), HPLC-kwaliteit acetonitril (ACN), Methanol, 2-Propanol, en Aceton Kocht fan Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, Feriene Steaten).
In mingsel fan urea (8 g), polyethyleenglycol (8 g), en 8 mL 0,01 N jittiksoer waard 10 minuten roerd, en doe waard 24 mL TMOS der ûnder iiskâlde omstannichheden oan tafoege. It reaksjemingsel waard 6 oeren ferwaarme by 40 °C en dêrnei 8 oeren by 120 °C yn in autoklaaf fan roestfrij stiel. It wetter waard ôfgetten en it oerbleaune materiaal waard 12 oeren droege by 70 °C. De droege sêfte massa waard glêd fermalen yn in oven en 12 oeren kalsinearre by 550 °C. Trije batches waarden taret en karakterisearre om de reprodusearberens yn dieltsjegrutte, poarjegrutte en oerflakte te ûndersiikjen.
Troch oerflakmodifikaasje fan silika-dieltsjes mei foar-synthetisearre ligand fenylmaleimide-methylvinylisocyanaat (PCMP) folge troch radiale polymerisaasje mei styreen, waard in ferbining mei in poalgroep taret. Stasjonêre faze foar aggregaten en polystyreenketens. It tariedingsproses wurdt hjirûnder beskreaun.
N-fenylmaleimide (200 mg) en metylvinylisocyanaat (100 mg) waarden oplost yn droech tolueen, en 0,1 mL 2,2′-azoisobutyronitril (AIBN) waard tafoege oan 'e reaksjekolf om fenylmaleimide-metylvinylisocyanaatkopolymeer (PMCP) te meitsjen. It mingsel waard 3 oeren ferwaarme by 60 °C, filtere en 3 oeren droege yn in oven by 40 °C.
Droege silikapartikels (2 g) waarden ferspraat yn droege tolueen (100 mL), roerd en sonikearre yn in rûnbodemkolf fan 500 mL foar 10 minuten. PMCP (10 mg) waard oplost yn tolueen en dripkes foar dripkes tafoege oan 'e reaksjekolf fia in driptrechter. It mingsel waard 8 oeren by 100 °C ûnder reflux ferwaarme, filtere en wosken mei aceton en 3 oeren by 60 °C droege. Dêrnei waarden PMCP-bûne silikapartikels (100 g) oplost yn tolueen (200 ml) en waard 4-hydroxy-TEMPO (2 mL) tafoege yn 'e oanwêzigens fan 100 µL dibutyltindilauraat as katalysator. It mingsel waard 8 oeren by 50 °C roerd, filtere en 3 oeren by 50 °C droege.
Styreen (1 mL), benzoylperoxide BPO (0,5 mL), en TEMPO-PMCP-oanhechte silika-dieltsjes (1,5 g) waarden ferspraat yn tolueen en mei stikstof suvere. De polymerisaasje fan styreen waard 12 oeren by 100 °C útfierd. It resultearjende produkt waard wosken mei methanol en oernachtich by 60 °C droege. It algemiene reaksjeskema wurdt werjûn yn figuer 1.
De samples waarden 1 oere lang ûntgast by 393 K om in restdruk fan minder as 10-3 Torr te krijen. De hoemannichte N2 dy't by in relative druk fan P/P0 = 0,99 adsorbearre waard, waard brûkt om it totale poarvolume te bepalen. De morfology fan bleate en ligand-bûne silikapartikels waard ûndersocht mei scanelektronenmikroskopie (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan). Droege samples (bleate silika en ligand-bûne silikapartikels) waarden op in aluminiumkolom pleatst mei kleefkoalstoftape. Goud waard op 'e samples oanbrocht mei in Q150T sputtercoater, en in 5 nm Au-laach waard op 'e samples ôfset. Dit ferbetteret de proseseffisjinsje mei lege spanningen en soarget foar fynkorrelige, kâlde sputtering. In Thermo Electron (Waltham, MA, FS) Flash EA1112 elemintanalysator waard brûkt foar elemintanalyze. In Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 dieltsjegrutteanalysator waard brûkt om de dieltsjegrutteferdieling te krijen. Neaken silikapartikels en ligand-bûne silikapartikels (5 mg elk) waarden ferspraat yn 5 mL isopropanol, 10 minuten sonikearre, 5 minuten vortexed, en pleatst op 'e optyske bank fan' e Mastersizer. Thermogravimetryske analyze waard útfierd mei in snelheid fan 5 °C per minuut oer in temperatuerberik fan 30 oant 800 °C.
Glêsfoerde roestfrij stielen kolommen mei smelle boring fan ôfmjittings (100 × 1,8 mm binnendiameter) waarden ynpakt mei de slurry-ynpakkingsmetoade, wêrby't deselde proseduere waard tapast dy't brûkt wurdt yn Ref. 31. In roestfrij stielen kolom (mei glêsbekleding, 100 × 1,8 mm binnendiameter) mei in útlaatfitting mei in 1 µm fritte waard ferbûn mei in slurrypakker (Alltech Deerfield, IL, Feriene Steaten). Meitsje in stasjonêre faze-slurry troch 150 mg stasjonêre faze te suspendearjen yn 1,2 mL metanol en it nei de opslachkolom te stjoeren. Metanol waard brûkt as it slurryoplosmiddel en ek as it driuwende oplosmiddel. Folje de kolom efterinoar troch druk fan 100 MP ta te passen foar 10 minuten, 80 MP foar 15 minuten en 60 MP foar 30 minuten. Tidens it ynpakken waard meganyske trilling tapast mei twa GC-kolomskodders (Alltech, Deerfield, IL, Feriene Steaten) om in unifoarme ynpakking fan 'e kolom te garandearjen. Slút de slurrypakker en lit de druk stadich los om skea yn 'e kolom te foarkommen. Meitsje de kolom los fan 'e slurrypakkingsienheid en ferbine in oare fitting mei de ynlaat en mei it LC-systeem om de prestaasjes te kontrolearjen.
In LC-pomp (10AD Shimadzu, Japan), ynjektor (Valco (USA) C14 W.05) mei 50nL ynjeksjelus, membraanûntgasser (Shimadzu DGU-14A), UV-VIS kapillêr finster waard boud. Spesjale µLC-apparaatdetektor (UV-2075) en glêsbeklaaide mikrokolommen. Brûk heul smelle en koarte ferbiningsbuizen om it effekt fan ekstra kolombânferbreding te minimalisearjen. Nei it ynpakken waarden kapillaren (50 μm id 365) en redusearjende unykapillaren (50 μm) ynstalleare by de 1/16″ útgong fan 'e redusearjende uny. Gegevensferzameling en chromatografyske ferwurking waarden dien mei Multichro 2000-software. Monitoaring by 254 nm. Analyten waarden hifke op UV-absorbânsje. Chromatografyske gegevens waarden analysearre troch OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumine út minsklik serum, lyofilisearre poeier, ≥ 96% (agarosegelelektroforese) 3 mg mingd mei trypsine (1,5 mg), 4,0 M urea (1 mL), en 0,2 M ammoniumbikarbonaat (1 mL). De oplossing waard 10 minuten roerd en 6 oeren yn in wetterbad by 37 °C hâlden, en doe blust mei 1 mL 0,1% TFA. Filterje de oplossing en bewarje ûnder 4 °C.
Skieding fan peptidemingsels en HSA-trypsinedigests waarden apart evaluearre op PMP-kolommen. Kontrolearje de skieding fan it peptidemingsel en trypsinedigest fan HSA troch de PMP-kolom en fergelykje de resultaten mei de Ascentis Express RP-Amide-kolom. It teoretyske plaatnûmer wurdt as folget berekkene:
SEM-ôfbyldings fan bleate silikapartikels en ligand-bûne silikapartikels wurde werjûn yn FIG. 2. SEM-ôfbyldings fan bleate silikapartikels (A, B) litte sjen dat, yn tsjinstelling ta ús eardere stúdzjes, dizze dieltsjes sferysk binne wêrby't de dieltsjes langwerpich binne of unregelmjittige symmetry hawwe. It oerflak fan 'e ligand-bûne silikapartikels (C, D) is glêder as dat fan 'e bleate silikapartikels, wat mooglik te tankjen is oan 'e coating fan polystyreenkettingen op it oerflak fan 'e silikapartikels.
Skannende elektronenmikroskoopôfbyldings fan bleate silikapartikels (A, B) en ligand-bûne silikapartikels (C, D).
De dieltsjegrutteferdielingen fan bleate silikapartikels en ligand-bûne silikapartikels wurde werjûn yn figuer 3(A). Folume-basearre dieltsjegrutteferdielingskurven lieten sjen dat de grutte fan 'e silikapartikels tanommen nei gemyske modifikaasje (fig. 3A). De dieltsjegrutteferdielingsgegevens fan 'e silikapartikels út 'e hjoeddeiske stúdzje en de foarige stúdzje wurde fergelike yn tabel 1(A). De folume-basearre dieltsjegrutte, d(0.5), fan PMP is 3.36 μm, yn ferliking mei ús foarige stúdzje mei in ad(0.5)-wearde fan 3.05 μm (polystyreen-bûne silikapartikels)34. Dizze batch hie in smelle dieltsjegrutteferdieling yn ferliking mei ús foarige stúdzje fanwegen de ferskillende ferhâldingen fan PEG, urea, TMOS en azijnsoer yn it reaksjemingsel. De dieltsjegrutte fan 'e PMP-faze is wat grutter as dy fan 'e polystyreen-bûne silikapartikelfaze dy't wy earder bestudearre hawwe. Dit betsjut dat oerflakfunksjonalisaasje fan silikapartikels mei styreen allinich in polystyreenlaach (0.97 µm) op it silika-oerflak ôfsette, wylst yn 'e PMP-faze de laachdikte wie 1,38 µm.
Partikelgrutteferdieling (A) en poargrutteferdieling (B) fan bleate silikapartikels en ligand-bûne silikapartikels.
De poargrutte, poarvolume en oerflakte fan 'e silikadieltsjes fan 'e hjoeddeiske stúdzje wurde jûn yn tabel 1(B). De PSD-profilen fan bleate silikadieltsjes en ligand-bûne silikadieltsjes wurde werjûn yn figuer 3(B). De resultaten binne te fergelykjen mei ús eardere stúdzje. De poargrutte fan 'e bleate en ligand-bûne silikadieltsjes binne respektivelik 310 en 241, wat oanjout dat de poargrutte mei 69 ôfnimt nei gemyske modifikaasje, lykas werjûn yn tabel 1(B), en de feroaring fan 'e kromme wurdt werjûn yn figuer 3(B). Op deselde wize naam it poarvolume fan 'e silikadieltsjes ôf fan 0,67 nei 0,58 cm3/g nei gemyske modifikaasje. It spesifike oerflakte fan 'e op it stuit bestudearre silikadieltsjes is 116 m2/g, wat te fergelykjen is mei ús eardere stúdzje (124 m2/g). Lykas werjûn yn tabel 1(B), naam it oerflakte (m2/g) fan 'e silikadieltsjes ek ôf fan 116 m2/g nei 105 m2/g nei gemyske modifikaasje. modifikaasje.
De resultaten fan elemintêre analyze fan 'e stasjonêre faze wurde werjûn yn tabel 2. De koalstoflading fan 'e hjoeddeiske stasjonêre faze is 6,35%, wat leger is as de koalstoflading fan ús foarige stúdzje (polystyreen-bonded silika-dieltsjes, 7,93%35 en 10,21%, respektivelik) 42. De koalstoflading fan 'e hjoeddeiske stasjonêre faze is leech, om't by de tarieding fan 'e hjoeddeiske SP, neist styreen, guon poallige liganden lykas fenylmaleimide-methylvinylisocyanaat (PCMP) en 4-hydroxy-TEMPO brûkt waarden. It stikstofgewichtpersintaazje fan 'e hjoeddeiske stasjonêre faze is 2,21%, fergelike mei 0,1735 en 0,85 gewichtsprosent stikstof yn eardere stúdzjes, respektivelik. Dit betsjut dat it gewichtsprosent stikstof heger is yn 'e hjoeddeiske stasjonêre faze fanwegen fenylmaleimide. Op deselde wize wiene de koalstofladingen fan produkten (4) en (5) respektivelik 2,7% en 2,9%, wylst de koalstoflading fan it einprodukt (6) wie 6,35%, lykas te sjen is yn tabel 2. It gewichtsferlies waard kontrolearre mei PMP stasjonêre faze, en de TGA-kromme wurdt werjûn yn figuer 4. De TGA-kromme lit in gewichtsferlies fan 8,6% sjen, wat yn goede oerienkomst is mei de koalstoflading (6,35%), om't de liganden net allinich C befetsje, mar ek N, O en H.
De fenylmaleimide-methylvinylisocyanaatligand waard keazen foar oerflakmodifikaasje fan silika-dieltsjes, om't it polêre fenylmaleimidegroepen en vinylisocyanaatgroepen hat. Vinylisocyanaatgroepen kinne fierder reagearje mei styreen troch libbene radikale polymerisaasje. De twadde reden is om in groep yn te foegjen dy't in matige ynteraksje hat mei de analyte en gjin sterke elektrostatyske ynteraksje tusken de analyte en de stasjonêre faze, om't de fenylmaleimide-groep gjin firtuele lading hat by normale pH. De polariteit fan 'e stasjonêre faze kin wurde kontroleare troch de optimale hoemannichte styreen en de reaksjetiid fan frije radikale polymerisaasje. De lêste stap fan 'e reaksje (frije radikale polymerisaasje) is kritysk en kin de polariteit fan 'e stasjonêre faze feroarje. Elemintêre analyze waard útfierd om de koalstoflading fan dizze stasjonêre fazen te kontrolearjen. It waard waarnommen dat it ferheegjen fan 'e hoemannichte styreen en de reaksjetiid de koalstoflading fan' e stasjonêre faze fergrutte en oarsom. SP's taret mei ferskillende konsintraasjes styreen hawwe ferskillende koalstofladingen. Laad dizze stasjonêre fazen wer yn roestfrij stielen kolommen en kontrolearje har chromatografyske prestaasjes (selektiviteit, resolúsje, N wearde, ensfh.). Op basis fan dizze eksperiminten waard in optimalisearre formulearring selektearre om de stasjonêre faze fan 'e PMP ta te rieden om kontroleare polariteit en goede analytretinsje te garandearjen.
Fiif peptidemingsels (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enkefaline) waarden ek evaluearre mei in PMP-kolom mei in mobile faze; 60/40 (v/v) acetonitril/wetter (0,1% TFA) by in streamsnelheid fan 80 μL/min. Under optimale eluasjeomstannichheden is it teoretyske plaatnûmer (N) per kolom (100 × 1,8 mm id) 20.000 ± 100 (200.000 platen/m²). Tabel 3 jout de N-wearden foar de trije PMP-kolommen en de chromatogrammen wurde werjûn yn figuer 5A. Snelle analyze op in PMP-kolom by hege streamsnelheid (700 μL/min), fiif peptiden waarden binnen ien minút eluearre, N-wearden wiene tige goed, 13.500 ± 330 per kolom (100 × 1,8 mm id), komt oerien mei 135.000 platen/m² (figuer 5B). Trije kolommen fan identike grutte (100 × 1,8 mm id) waarden ynpakt mei trije ferskillende partijen PMP stasjonêre faze om de reprodusearberens te kontrolearjen. De De analytekonsintraasje foar elke kolom waard opnommen mei de optimale elúsjebetingsten en it oantal teoretyske platen N en de retinsjetiid om itselde testmingsel op elke kolom te skieden. De reprodusearberensgegevens foar de PMP-kolommen wurde werjûn yn tabel 4. De reprodusearberens fan 'e PMP-kolom korrelearret goed mei tige lege %RSD-wearden, lykas werjûn yn tabel 3.
Skieding fan it peptidemingsel op PMP-kolom (B) en Ascentis Express RP-Amide-kolom (A); mobile faze 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), PMP-kolomôfmjittings (100 × 1,8 mm id); analytysk De elúsjefolchoarder fan 'e ferbiningen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) en 5 (leucine) soer enkefaline)).
In PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) waard evaluearre foar de skieding fan tryptyske digests fan minsklik serumalbumine yn hege prestaasjes floeistofchromatografy. It chromatogram yn figuer 6 lit sjen dat it monster goed skieden is en de resolúsje tige goed is. HSA-digests waarden analysearre mei in streamsnelheid fan 100 µL/min, mobile faze 70/30 acetonitril/wetter en 0,1% TFA. Lykas te sjen is yn it chromatogram (figuer 6), is de HSA-digest opdield yn 17 pieken dy't oerienkomme mei 17 peptiden. De skiedingseffisjinsje fan elke pyk yn 'e HSA-digest waard berekkene en de wearden wurde jûn yn tabel 5.
In tryptyske digest fan HSA (100 × 1,8 mm id) waard skieden op in PMP-kolom; streamingsnelheid (100 µL/min), mobile faze 60/40 acetonitril/wetter mei 0,1% TFA.
wêrby't L de kolomlingte is, η de viskositeit fan 'e mobile faze is, ΔP de tsjindruk fan 'e kolom is, en u de lineêre snelheid fan 'e mobile faze is. De permeabiliteit fan 'e PMP-kolom wie 2,5 × 10-14 m2, de streamsnelheid wie 25 μL/min, en 60/40 v/v ACN/wetter waard brûkt. De permeabiliteit fan 'e PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) wie fergelykber mei dy fan ús eardere stúdzje Ref.34. De permeabiliteit fan 'e kolom ynpakt mei oerflakkich poreuze dieltsjes is: 1,7 × 10-15 foar 1,3 μm dieltsjes, 3,1 × 10-15 foar 1,7 μm dieltsjes, 5,2 × 10-15 en 2,5 × 10-14 m2 foar 2,6 μm dieltsjes. Foar 5 μm dieltsjes 43. Dêrom is de permeabiliteit fan 'e PMP-faze fergelykber mei dy fan 5 μm kearn-skil dieltsjes.
wêrby't Wx it gewicht is fan 'e kolom dy't ynpakt is mei chloroform, Wy it gewicht is fan 'e kolom dy't ynpakt is mei metanol, en ρ de tichtheid fan it oplosmiddel is. Dichtheden fan metanol (ρ = 0.7866) en chloroform (ρ = 1.484). De totale porositeit fan SILICA PARTICLES-C18-kolommen (100 × 1.8 mm id) 34 en C18-Urea-kolommen 31 dy't wy earder bestudearre hawwe, wiene respektivelik 0.63 en 0.55. Dit betsjut dat de oanwêzigens fan ureumliganden de permeabiliteit fan 'e stasjonêre faze ferminderet. Oan 'e oare kant is de totale porositeit fan 'e PMP-kolom (100 × 1.8 mm id) 0.60. De permeabiliteit fan PMP-kolommen is leger as dy fan kolommen dy't ynpakt binne mei C18-bûne silika-dieltsjes, om't yn stasjonêre fazen fan it C18-type de C18-liganden oan 'e silika-dieltsjes as lineêre keatlingen fêstmakke binne, wylst yn stasjonêre fazen fan it polystyreen-type de relatyf dikke polymeerlaach wurdt deromhinne foarme. Yn in typysk eksperimint wurdt de kolomporositeit berekkene as:
Figuer 7A,B lit de PMP-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) en Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) sjen mei deselde eluasjebetingsten (d.w.s. 60/40 ACN/H2O en 0,1% TFA) fan 'e van Deemter-plot. Selektearre peptidemingsels (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) waarden taret yn 20 µL/ De minimale streamsnelheid foar beide kolommen is 800 µL/min. De minimale HETP-wearden by de optimale streamsnelheid (80 µL/min) foar de PMP-kolom en de Ascentis Express RP-Amide-kolom wiene respektivelik 2,6 µm en 3,9 µm. De HETP-wearden jouwe oan dat de skiedingseffisjinsje fan 'e PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) folle better is as de kommersjeel beskikbere Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 × 1,8 mm id). De van Deemter-plot yn Fig. 7(A) lit sjen dat de ôfname yn N-wearde mei tanimmende stream net signifikant is yn ferliking mei ús foarige stúdzje. De hegere skiedingseffisjinsje fan 'e PMP-kolom (100 × 1,8 mm id) yn ferliking mei de Ascentis Express RP-Amide-kolom is basearre op ferbetteringen yn dieltsjefoarm, grutte en komplekse kolompakkingsprosedueres dy't brûkt wurde yn it hjoeddeiske wurk34.
(A) van Deemter-plot (HETP versus lineêre snelheid fan mobile faze) krigen mei in PMP-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) yn 60/40 ACN/H2O mei 0,1% TFA. (B) van Deemter-plot (HETP versus lineêre snelheid fan mobile faze) krigen mei in Ascentis Express RP-Amide-kolom (100 × 1,8 mm binnendiameter) yn 60/40 ACN/H2O mei 0,1% TFA.
In polar-ynbêde polystyreen stasjonêre faze waard taret en evaluearre foar de skieding fan syntetyske peptidemingsels en trypsine-digestjes fan minsklik serumalbumine (HAS) yn hege prestaasjes floeistofchromatografy. De chromatografyske prestaasjes fan PMP-kolommen foar peptidemingsels binne poerbêst yn skiedingseffisjinsje en resolúsje. De ferbettere skiedingsprestaasjes fan PMP-kolommen binne te tankjen oan ferskate redenen, lykas de dieltsjegrutte en poarjegrutte fan 'e silika-dieltsjes, kontroleare synteze fan' e stasjonêre faze, en komplekse kolompakking. Neist hege skiedingseffisjinsje is lege kolom-tsjindruk by hege streamraten in oar foardiel fan dizze stasjonêre faze. PMP-kolommen litte goede reprodusearberens sjen en kinne brûkt wurde foar de analyze fan peptidemingsels en trypsine-digestje fan ferskate proteïnen. Wy binne fan doel dizze kolom te brûken foar de skieding fan natuerlike produkten, bioaktive ferbiningen út medisinale planten en skimmelekstrakten yn floeistofchromatografy. Yn 'e takomst sille PMP-kolommen ek evaluearre wurde foar de skieding fan proteïnen en monoklonale antistoffen.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Undersyk nei peptideskiedingssystemen troch omkearde fazechromatografy Diel I: Untwikkeling fan in kolomkarakterisaasjeprotokol. J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Ferbettere aktive peptiden ûntworpen foar de behanneling fan ynfeksjesykten. Biotechnology. Advanced. 36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Syntetyske terapeutyske peptiden: wittenskip en de merk. drug discovery. 15 (1-2) hjoed, 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Avansearre Proteomyske Liquid Chromatography. J. Chromatography. A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Avansearre floeistofchromatografy-massaspektrometry makket de ynkorporaasje fan breed rjochte metabolomika en proteomika mooglik. anus. Chim. Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ De rol fan UHPLC yn medisynûntwikkeling. J. Sep. Sci. 30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Fundamentele en praktyske aspekten fan ultrahege druk floeistofchromatografy foar rappe skiedingen. J. Sep. Sci. 30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Tapassing fan ultra-hege prestaasjes floeistofchromatografy yn medisynûntwikkeling. J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolityske makroporeuze hydrogels taret fan oalje-yn-wetter hege ynterne faze-emulsjes foar effisjinte suvering fan enterofirussen. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA De rol fan floeistofchromatografy yn proteomika. J. Chromatography. A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Opkommende trends yn omkearde-faze floeistofchromatografyske skiedingen fan terapeutyske peptiden en proteïnen: teory en tapassingen. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Twadiminsjonale skieding fan peptiden mei in RP-RP-HPLC-systeem mei ferskate pH-wearden yn 'e earste en twadde skiedingsdiminsjes. J. Sep. Sci. 28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. De massa-oerdrachtkarakteristiken en kinetyske prestaasjes fan heech-effisjinte chromatografyske kolommen ynpakt mei C18 sub-2 μm folslein en oerflakkich poreuze dieltsjes waarden ûndersocht. J. Sep. Sci. 43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Resinte trends en analytyske útdagings yn 'e isolaasje, identifikaasje en falidaasje fan plantbioaktive peptiden. anus. biologyske anus. Chemical. 410(15), 3425–3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. It proteomyske lânskip fan it keninkryk fan it libben. Nature 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Downstream-ferwurking fan terapeutyske peptiden troch preparative floeistofchromatografy. Molecule (Basel, Switserlân) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatography en de tapassing dêrfan op biopolymeren. J. Chromatography. A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Liganden foar mingde-modus proteïnechromatografy: prinsipe, karakterisaasje en ûntwerp. J. Biotechnology. 144(1), 3-11 (2009).