Vielen Dank für Ihren Besuch auf Nature.com. Die von Ihnen verwendete Browserversion unterstützt CSS nur eingeschränkt. Für ein optimales Erlebnis empfehlen wir Ihnen, einen aktualisierten Browser zu verwenden (oder den Kompatibilitätsmodus in Internet Explorer zu deaktivieren). Um eine kontinuierliche Unterstützung zu gewährleisten, zeigen wir die Site in der Zwischenzeit ohne Stile und JavaScript an.
Poröse Silicapartikel wurden mittels Sol-Gel-Verfahren mit einigen Modifikationen hergestellt, um makroporöse Partikel zu erhalten. Diese Partikel wurden mittels reversibler Additions-Fragmentierungs-Kettentransfer-Polymerisation (RAFT) mit N-Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PMI) und Styrol derivatisiert, um die stationäre Phase N-Phenylmaleimid-Interkalation von Polystyrol (PMP) herzustellen. Englumige Edelstahlsäulen (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) wurden mittels Slurry-Packing gepackt. Die chromatographische Leistung der PMP-Säulentrennung eines Peptidgemisches bestehend aus fünf Peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) und die Trypsinverdauung von Humanserumalbumin (HAS) wurden ausgewertet. Unter optimalen Elutionsbedingungen beträgt die theoretische Bodenzahl des Peptidgemisches bis zu 280.000 Böden/m². Vergleich der Trennleistung Beim Vergleich der entwickelten Säule mit der kommerziellen Ascentis Express RP-Amid-Säule wurde beobachtet, dass die Trennleistung der PMP-Säule hinsichtlich Trenneffizienz und Auflösung der kommerziellen Säule überlegen war.
In den letzten Jahren hat sich die biopharmazeutische Industrie zu einem expandierenden globalen Markt mit deutlich gestiegenem Marktanteil entwickelt. Mit dem explosionsartigen Wachstum der biopharmazeutischen Industrie1,2,3 ist die Analyse von Peptiden und Proteinen äußerst gefragt. Neben dem Zielpeptid entstehen bei der Peptidsynthese verschiedene Verunreinigungen, die eine chromatographische Reinigung erfordern, um Peptide mit der gewünschten Reinheit zu erhalten. Die Analyse und Charakterisierung von Proteinen in Körperflüssigkeiten, Geweben und Zellen ist aufgrund der großen Anzahl potenziell nachweisbarer Spezies in einer einzigen Probe eine äußerst anspruchsvolle Aufgabe. Obwohl die Massenspektrometrie ein effektives Instrument zur Peptid- und Proteinsequenzierung ist, ist die Trennung nicht optimal, wenn solche Proben in einem Durchgang in das Massenspektrometer injiziert werden. Dieses Problem kann durch die Durchführung einer Flüssigchromatographie (LC)-Trennung vor der MS-Analyse gemildert werden, wodurch die Anzahl der gleichzeitig in das Massenspektrometer gelangenden Analyten reduziert wird4,5,6. Darüber hinaus können bei der Flüssigphasentrennung die Analyten in engen Bereichen fokussiert und dadurch konzentriert und die MS-Detektion verbessert werden. Empfindlichkeit. Die Flüssigkeitschromatographie (LC) hat im letzten Jahrzehnt erhebliche Fortschritte gemacht und ist zu einer beliebten Technik in der Proteomanalyse geworden7,8,9,10.
Die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (RP-LC) wird häufig zur Reinigung und Trennung von Peptidgemischen unter Verwendung von Octadecyl-modifiziertem Silica (ODS) als stationäre Phase verwendet11,12,13. Stationäre RP-Phasen ermöglichen jedoch aufgrund ihrer komplexen Struktur und amphiphilen Natur keine zufriedenstellende Trennung von Peptiden und Proteinen14,15. Daher sind speziell entwickelte stationäre Phasen erforderlich, um Peptide und Proteine ​​mit polaren und unpolaren Anteilen zu analysieren, die mit diesen Analyten interagieren und sie zurückhalten16. Die Mixed-Mode-Chromatographie, die multimodale Interaktionen ermöglicht, kann eine Alternative zur RP-LC zur Trennung von Peptiden, Proteinen und anderen komplexen Gemischen sein. Es wurden mehrere Mixed-Mode-Stationärphasen hergestellt und mit diesen Phasen gepackte Säulen für Peptid- und Proteintrennungen verwendet17,18,19,20,21. Mixed-Mode-Stationärphasen (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polare Interkalation/RPLC) eignen sich für Peptid- und Protein Trennungen aufgrund des Vorhandenseins sowohl polarer als auch unpolarer Gruppen22,23,24,25,26,27,28. Ebenso zeigen polare interkalierende stationäre Phasen mit kovalent gebundenen polaren Gruppen eine gute Trennleistung und einzigartige Selektivität für polare und unpolare Analyten, da die Trennung von der Wechselwirkung zwischen Analyt und stationärer Phase abhängt. Multimodale Wechselwirkungen 29, 30, 31, 32. Kürzlich haben Zhang et al. 30 hat eine stationäre Phase aus Polyamin mit Dodecyl-Terminus hergestellt und erfolgreich Kohlenwasserstoffe, Antidepressiva, Flavonoide, Nukleoside, Östrogene und mehrere andere Analyten getrennt. Der polare Interkalator hat sowohl polare als auch unpolare Gruppen und kann daher zum Trennen von Peptiden und Proteinen verwendet werden, die sowohl hydrophobe als auch hydrophile Anteile aufweisen. Polar eingebettete Säulen (z. B. in Amid eingebettete C18-Säulen) sind im Handel unter dem Handelsnamen Ascentis Express RP-Amid-Säulen erhältlich, diese Säulen werden jedoch nur für die Analyse von Amin 33 verwendet.
In der vorliegenden Studie wurde eine polar eingebettete stationäre Phase (N-Phenylmaleimid-eingebettetes Polystyrol) hergestellt und auf die Trennung von Peptiden und Trypsinverdauungen von HSA untersucht. Die stationäre Phase wurde unter Verwendung der folgenden Strategie hergestellt. Poröse Silicapartikel wurden gemäß dem in unserer früheren Veröffentlichung beschriebenen Verfahren hergestellt, mit einigen Modifikationen des Herstellungsprotokolls. Das Verhältnis von Harnstoff, Polyethylenglykol (PEG), TMOS, Wasser und Essigsäure wurde angepasst, um Silicapartikel mit großen Poren herzustellen. Zweitens wurde ein neuer Ligand, Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat, synthetisiert und zur Derivatisierung von Silicapartikeln verwendet, um eine polar eingebettete stationäre Phase herzustellen. Die resultierende stationäre Phase wurde unter Verwendung des optimierten Packungsschemas in eine Edelstahlsäule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) gepackt. Die Säulenpackung wird durch mechanische Vibration unterstützt, um sicherzustellen, dass sich innerhalb der Säule ein homogenes Bett bildet. Bewertung der Trennung von Peptidgemischen bestehend aus fünf Peptiden durch gepackte Säulen; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) und Trypsinverdau von menschlichem Serumalbumin (HAS). Es wurde beobachtet, dass die Peptidmischung und der Trypsinverdau von HSA mit guter Auflösung und Effizienz getrennt wurden. Die Trennleistung der PMP-Säule wurde mit der der Ascentis Express RP-Amid-Säule verglichen. Sowohl Peptide als auch Proteine ​​wurden auf der PMP-Säule gut aufgelöst und effizient getrennt, die effizienter war als die Ascentis Express RP-Amid-Säule.
PEG (Polyethylenglykol), Harnstoff, Essigsäure, Trimethoxyorthosilikat (TMOS), Trimethylchlorsilan (TMCS), Trypsin, Humanserumalbumin (HSA), Ammoniumchlorid, Harnstoff, Hexanmethyldisilazan (HMDS), Methacryloylchlorid (MC), Styrol, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoylperoxid (BPO), Acetonitril (ACN) in HPLC-Qualität, Methanol, 2-Propanol und Aceton, gekauft von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Eine Mischung aus Harnstoff (8 g), Polyethylenglykol (8 g) und 8 ml 0,01 N Essigsäure wurde 10 Minuten lang gerührt und dann unter eiskalten Bedingungen 24 ml TMOS hinzugefügt. Die Reaktionsmischung wurde 6 Stunden auf 40 °C und dann 8 Stunden auf 120 °C in einem Edelstahlautoklaven erhitzt. Das Wasser wurde abgegossen und das verbleibende Material 12 Stunden bei 70 °C getrocknet. Die getrocknete weiche Masse wurde in einem Ofen glatt gemahlen und 12 Stunden bei 550 °C kalziniert. Drei Chargen wurden hergestellt und charakterisiert, um die Reproduzierbarkeit von Partikelgröße, Porengröße und Oberfläche zu untersuchen.
Durch Oberflächenmodifizierung von Silicapartikeln mit dem vorsynthetisierten Liganden Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PCMP) und anschließende radiale Polymerisation mit Styrol wurde eine Verbindung mit polaren Gruppen hergestellt. Stationäre Phase für Aggregate und Polystyrolketten. Der Herstellungsprozess wird unten beschrieben.
N-Phenylmaleimid (200 mg) und Methylvinylisocyanat (100 mg) wurden in trockenem Toluol gelöst und 0,1 ml 2,2′-Azoisobutyronitril (AIBN) wurden dem Reaktionskolben hinzugefügt, um ein Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat-Copolymer (PMCP) herzustellen. Die Mischung wurde 3 Stunden lang auf 60 °C erhitzt, filtriert und 3 Stunden lang in einem Ofen bei 40 °C getrocknet.
Getrocknete Silicapartikel (2 g) wurden in trockenem Toluol (100 ml) dispergiert, gerührt und 10 Minuten lang in einem 500-ml-Rundkolben mit Ultraschall behandelt. PMCP (10 mg) wurde in Toluol gelöst und tropfenweise über einen Tropftrichter in den Reaktionskolben gegeben. Die Mischung wurde 8 Stunden bei 100 °C unter Rückfluss erhitzt, filtriert und mit Aceton gewaschen und 3 Stunden bei 60 °C getrocknet. Anschließend wurden PMCP-gebundene Silicapartikel (100 g) in Toluol (200 ml) gelöst und 4-Hydroxy-TEMPO (2 ml) in Gegenwart von 100 µl Dibutylzinndilaurat als Katalysator zugegeben. Die Mischung wurde 8 Stunden bei 50 °C gerührt, filtriert und 3 Stunden bei 50 °C getrocknet.
Styrol (1 ml), Benzoylperoxid BPO (0,5 ml) und mit TEMPO-PMCP verbundene Silicapartikel (1,5 g) wurden in Toluol dispergiert und mit Stickstoff gespült. Die Polymerisation des Styrols wurde 12 Stunden lang bei 100 °C durchgeführt. Das resultierende Produkt wurde mit Methanol gewaschen und über Nacht bei 60 °C getrocknet. Das gesamte Reaktionsschema ist in Abbildung 1 dargestellt.
Die Proben wurden 1 Stunde lang bei 393 K entgast, um einen Restdruck von weniger als 10-3 Torr zu erreichen. Die bei einem relativen Druck von P/P0 = 0,99 adsorbierte N2-Menge wurde zur Bestimmung des Gesamtporenvolumens verwendet. Die Morphologie der blanken und ligandengebundenen Silicapartikel wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan) untersucht. Getrocknete Proben (blanke und ligandengebundene Silicapartikel) wurden mithilfe von Kohlenstoffklebeband auf eine Aluminiumsäule aufgebracht. Die Proben wurden mit einem Q150T-Sputtercoater vergoldet und mit einer 5 nm dicken Au-Schicht abgeschieden. Dies verbessert die Prozesseffizienz bei niedrigen Spannungen und ermöglicht feinkörniges Kaltsputtern. Für die Elementaranalyse wurde ein Elementaranalysator Flash EA1112 von Thermo Electron (Waltham, MA, USA) verwendet. Zur Bestimmung der Partikelgröße wurde ein Partikelgrößenanalysator Mastersizer 2000 von Malvern (Worcestershire, UK) verwendet. Verteilung. Nackte Silicapartikel und ligandengebundene Silicapartikel (je 5 mg) wurden in 5 ml Isopropanol dispergiert, 10 Minuten lang mit Ultraschall behandelt, 5 Minuten lang gevortext und auf die optische Bank des Mastersizers gelegt. Die thermogravimetrische Analyse wurde mit einer Rate von 5 °C pro Minute über einen Temperaturbereich von 30 bis 800 °C durchgeführt.
Mit Glas ausgekleidete Edelstahlsäulen mit enger Bohrung und den Abmessungen (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) wurden mit der Aufschlämmungspackungsmethode gepackt, wobei dasselbe Verfahren wie in Ref. angewendet wurde. 31. Eine Edelstahlsäule (glasbeschichtet, 100 × 1,8 mm Innendurchmesser) mit einem Auslassanschluss mit einer 1-µm-Fritte wurde an einen Slurrypacker (Alltech, Deerfield, IL, USA) angeschlossen. Eine stationäre Phasensuspension wurde durch Suspendieren von 150 mg stationärer Phase in 1,2 ml Methanol hergestellt und zur Speichersäule geschickt. Methanol wurde sowohl als Slurry-Lösungsmittel als auch als Treibmittel verwendet. Die Säule wurde sequenziell mit Drücken von 100 MPa (10 Minuten), 80 MPa (15 Minuten) und 60 MPa (30 Minuten) gefüllt. Während des Packens wurden mechanische Vibrationen mit zwei GC-Säulenschüttlern (Alltech, Deerfield, IL, USA) erzeugt, um eine gleichmäßige Packung der Säule zu gewährleisten. Der Slurrypacker wurde geschlossen und der Druck langsam abgelassen, um Schäden in der Säule zu vermeiden. Die Säule wurde von der Slurrypackeinheit getrennt und ein weiterer Anschluss angeschlossen. zum Einlass und zum LC-System, um dessen Leistung zu überprüfen.
Es wurden eine LC-Pumpe (10AD Shimadzu, Japan), ein Injektor (Valco (USA) C14 W.05) mit 50-nl-Injektionsschleife, ein Membranentgaser (Shimadzu DGU-14A), ein UV-VIS-Kapillarfenster, ein spezieller µLC-Gerätedetektor (UV-2075) und glasbeschichtete Mikrosäulen konstruiert. Verwenden Sie sehr schmale und kurze Verbindungsschläuche, um den Effekt einer zusätzlichen Säulenbandverbreiterung zu minimieren. Nach dem Verpacken wurden Kapillaren (50 μm ID 365) und Reduzierstückkapillaren (50 μm) am 1/16-Zoll-Auslass des Reduzierstücks installiert. Die Datenerfassung und chromatographische Verarbeitung erfolgten mit der Software Multichro 2000. Überwachung bei 254 nm. Die Analyten wurden auf UV-Absorption getestet. Die chromatographischen Daten wurden mit OriginPro8 (Northampton, MA) analysiert.
Albumin aus menschlichem Serum, gefriergetrocknetes Pulver, ≥ 96 % (Agarose-Gelelektrophorese), 3 mg gemischt mit Trypsin (1,5 mg), 4,0 M Harnstoff (1 ml) und 0,2 M Ammoniumbicarbonat (1 ml). Die Lösung wurde 10 Minuten lang gerührt und 6 Stunden lang in einem Wasserbad bei 37 °C aufbewahrt, dann mit 1 ml 0,1 % TFA abgeschreckt. Die Lösung filtrieren und unter 4 °C lagern.
Die Trennung von Peptidmischungen und HSA-Trypsinverdauungen wurde separat auf PMP-Säulen ausgewertet. Überprüfen Sie die Trennung der Peptidmischung und der Trypsinverdauung von HSA durch die PMP-Säule und vergleichen Sie die Ergebnisse mit der Ascentis Express RP-Amid-Säule. Die theoretische Bodenzahl wird wie folgt berechnet:
SEM-Bilder von bloßen Silica-Partikeln und ligandengebundenen Silica-Partikeln sind in Abb. 2 dargestellt. SEM-Bilder von bloßen Silica-Partikeln (A, B) zeigen, dass diese Partikel im Gegensatz zu unseren früheren Untersuchungen kugelförmig sind und länglich sind oder eine unregelmäßige Symmetrie aufweisen. Die Oberfläche der ligandengebundenen Silica-Partikel (C, D) ist glatter als die der bloßen Silica-Partikel, was an der Beschichtung der Oberfläche der Silica-Partikel mit Polystyrolketten liegen kann.
Rasterelektronenmikroskop-Bilder von bloßen Silica-Partikeln (A, B) und ligandengebundenen Silica-Partikeln (C, D).
Die Partikelgrößenverteilungen von reinen Silicapartikeln und ligandengebundenen Silicapartikeln sind in Abbildung 3(A) dargestellt. Volumenbasierte Partikelgrößenverteilungskurven zeigten, dass die Größe der Silicapartikel nach der chemischen Modifikation zunahm (Abb. 3A). Die Daten zur Partikelgrößenverteilung der Silicapartikel aus der aktuellen und der vorherigen Studie werden in Tabelle 1(A) verglichen. Die volumenbasierte Partikelgröße d(0,5) von PMP beträgt 3,36 µm, verglichen mit unserer vorherigen Studie mit einem d(0,5)-Wert von 3,05 µm (polystyrolgebundene Silicapartikel)34. Diese Charge hatte aufgrund der unterschiedlichen Verhältnisse von PEG, Harnstoff, TMOS und Essigsäure im Reaktionsgemisch eine engere Partikelgrößenverteilung im Vergleich zu unserer vorherigen Studie. Die Partikelgröße der PMP-Phase ist geringfügig größer als die der zuvor untersuchten polystyrolgebundenen Silicapartikelphase. Dies bedeutet, dass die Oberflächenfunktionalisierung von Silicapartikeln mit Styrol nur eine Polystyrolschicht (0,97 µm) auf der Silica-Oberfläche, während in der PMP-Phase die Schichtdicke 1,38 µm betrug.
Partikelgrößenverteilung (A) und Porengrößenverteilung (B) von nackten Silicapartikeln und ligandengebundenen Silicapartikeln.
Die Porengröße, das Porenvolumen und die Oberfläche der Silicapartikel der vorliegenden Studie sind in Tabelle 1 (B) angegeben. Die PSD-Profile von nackten Silicapartikeln und ligandengebundenen Silicapartikeln sind in Abbildung 3 (B) dargestellt. Die Ergebnisse sind mit unserer vorherigen Studie vergleichbar. Die Porengrößen der nackten und ligandengebundenen Silicapartikel betragen 310 bzw. 241, was darauf hindeutet, dass die Porengröße nach der chemischen Modifikation um 69 abnimmt, wie in Tabelle 1 (B) gezeigt, und die Änderung der Kurve ist in Abbildung 3 (B) dargestellt. Ebenso verringerte sich das Porenvolumen der Silicapartikel nach der chemischen Modifikation von 0,67 auf 0,58 cm3/g. Die spezifische Oberfläche der aktuell untersuchten Silicapartikel beträgt 116 m2/g, was mit unserer vorherigen Studie (124 m2/g) vergleichbar ist. Wie in Tabelle 1 (B) gezeigt, verringerte sich auch die Oberfläche (m2/g) der Silicapartikel von 116 m2/g auf 105 m2/g nach chemischer Modifikation.
Die Ergebnisse der Elementaranalyse der stationären Phase sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Kohlenstoffbeladung der aktuellen stationären Phase beträgt 6,35 % und ist damit niedriger als die Kohlenstoffbeladung in unserer vorherigen Studie (polystyrolgebundene Silicapartikel, 7,93 %35 bzw. 10,21 %) 42. Die Kohlenstoffbeladung der aktuellen stationären Phase ist niedrig, da bei der Herstellung des aktuellen SP neben Styrol auch einige polare Liganden wie Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PCMP) und 4-Hydroxy-TEMPO verwendet wurden. Der Stickstoffanteil in der aktuellen stationären Phase beträgt 2,21 %, verglichen mit 0,1735 bzw. 0,85 % Stickstoff in vorherigen Studien. Das bedeutet, dass der Stickstoffanteil in der aktuellen stationären Phase aufgrund des Phenylmaleimids höher ist. Ebenso betrugen die Kohlenstoffbeladungen der Produkte (4) und (5) 2,7 % bzw. 2,9 %, während die Kohlenstoffbeladung des Endprodukts (6) betrug 6,35 %, wie in Tabelle 2 gezeigt. Der Gewichtsverlust wurde mit der stationären Phase von PMP überprüft und die TGA-Kurve ist in Abbildung 4 dargestellt. Die TGA-Kurve zeigt einen Gewichtsverlust von 8,6 %, was gut mit der Kohlenstoffbeladung (6,35 %) übereinstimmt, da die Liganden nicht nur C, sondern auch N, O und H enthalten.
Der Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat-Ligand wurde für die Oberflächenmodifizierung von Silicapartikeln gewählt, da er polare Phenylmaleimidgruppen und Vinylisocyanatgruppen aufweist. Vinylisocyanatgruppen können durch lebende radikalische Polymerisation weiter mit Styrol reagieren. Der zweite Grund ist die Einfügung einer Gruppe, die eine moderate Wechselwirkung mit dem Analyten und keine starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen dem Analyten und der stationären Phase aufweist, da die Phenylmaleimideinheit bei normalem pH-Wert keine virtuelle Ladung aufweist. Die Polarität der stationären Phase kann durch die optimale Styrolmenge und die Reaktionszeit der radikalischen Polymerisation gesteuert werden. Der letzte Schritt der Reaktion (radikalische Polymerisation) ist kritisch und kann die Polarität der stationären Phase verändern. Eine Elementaranalyse wurde durchgeführt, um die Kohlenstoffbeladung dieser stationären Phasen zu überprüfen. Es wurde beobachtet, dass eine Erhöhung der Styrolmenge und der Reaktionszeit die Kohlenstoffbeladung der stationären Phase erhöhte und umgekehrt. Mit unterschiedlichen Styrolkonzentrationen hergestellte SPs haben unterschiedliche Kohlenstoffbeladungen. Laden Sie diese stationären Phasen erneut in Edelstahlsäulen und überprüfen Sie ihre chromatographische Leistung (Selektivität, Auflösung, N Wert usw.). Basierend auf diesen Experimenten wurde eine optimierte Formulierung zur Herstellung der stationären PMP-Phase ausgewählt, um eine kontrollierte Polarität und gute Analytretention sicherzustellen.
Fünf Peptidmischungen (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) wurden ebenfalls mithilfe einer PMP-Säule unter Verwendung einer mobilen Phase ausgewertet; 60/40 (v/v) Acetonitril/Wasser (0,1 % TFA) bei einem Fluss von 80 μl/min. Unter optimalen Elutionsbedingungen beträgt die theoretische Bodenzahl (N) pro Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) 20.000 ± 100 (200.000 Böden/m²). Tabelle 3 zeigt die N-Werte für die drei PMP-Säulen, die Chromatogramme sind in Abbildung 5A dargestellt. Schnelle Analyse auf einer PMP-Säule bei hohem Fluss (700 μl/min), fünf Peptide wurden innerhalb einer Minute eluiert, die N-Werte waren sehr gut, 13.500 ± 330 pro Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser), entsprechend 135.000 Böden/m² (Abbildung 5B). Drei gleich große Säulen (100 × 1,8 mm id) wurden mit drei verschiedenen Chargen der stationären Phase PMP gepackt, um die Reproduzierbarkeit zu prüfen. Die Analytkonzentration für jede Säule wurde unter Verwendung der optimalen Elutionsbedingungen und der Anzahl der theoretischen Böden N und der Retentionszeit aufgezeichnet, um dieselbe Testmischung auf jeder Säule zu trennen. Die Reproduzierbarkeitsdaten für die PMP-Säulen sind in Tabelle 4 aufgeführt. Die Reproduzierbarkeit der PMP-Säule korreliert gut mit sehr niedrigen %RSD-Werten, wie in Tabelle 3 gezeigt.
Trennung des Peptidgemisches auf PMP-Säule (B) und Ascentis Express RP-Amid-Säule (A); mobile Phase 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), PMP-Säulenabmessungen (100 × 1,8 mm Innendurchmesser); analytisch. Die Elutionsreihenfolge der Verbindungen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) und 5 (Leucin)-saures Enkephalin).
Eine PMP-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) wurde für die Trennung tryptischer Verdauungen von menschlichem Serumalbumin in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie evaluiert. Das Chromatogramm in Abbildung 6 zeigt, dass die Probe gut getrennt ist und die Auflösung sehr gut ist. HSA-Verdaue wurden mit einer Flussrate von 100 µl/min, mobiler Phase 70/30 Acetonitril/Wasser und 0,1 % TFA analysiert. Wie im Chromatogramm (Abbildung 6) gezeigt, wurde der HSA-Verdau in 17 Peaks aufgeteilt, die 17 Peptiden entsprechen. Die Trenneffizienz jedes Peaks im HSA-Verdau wurde berechnet und die Werte sind in Tabelle 5 angegeben.
Ein tryptischer Verdau von HSA (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) wurde auf einer PMP-Säule getrennt; Flussrate (100 µl/min), mobile Phase 60/40 Acetonitril/Wasser mit 0,1 % TFA.
Dabei ist L die Säulenlänge, η die Viskosität der mobilen Phase, ΔP der Säulenrückdruck und u die lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase. Die Permeabilität der PMP-Säule betrug 2,5 × 10-14 m2, die Flussrate 25 μL/min und es wurde ein 60/40 v/v ACN/Wasser-Gemisch verwendet. Die Permeabilität der PMP-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) war ähnlich wie in unserer vorherigen Studie (Ref. 34). Die Permeabilität der mit oberflächlich porösen Partikeln gefüllten Säule beträgt: 1,7 × 10-15 für 1,3 μm große Partikel, 3,1 × 10-15 für 1,7 μm große Partikel, 5,2 × 10-15 und 2,5 × 10-14 m2 für 2,6 μm große Partikel. Für 5 μm große Partikel 43. Daher ist die Permeabilität der PMP-Phase ähnlich der von 5 μm großen Kern-Schale-Partikeln.
wobei Wx das Gewicht der mit Chloroform gefüllten Säule, Wy das Gewicht der mit Methanol gefüllten Säule und ρ die Dichte des Lösungsmittels ist. Die Dichten von Methanol (ρ = 0,7866) und Chloroform (ρ = 1,484) betragen. Die Gesamtporosität der zuvor untersuchten SILICA PARTICLES-C18-Säulen (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) 34 und C18-Urea-Säulen 31 betrug 0,63 bzw. 0,55. Dies bedeutet, dass die Anwesenheit von Harnstoffliganden die Permeabilität der stationären Phase verringert. Andererseits beträgt die Gesamtporosität der PMP-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) 0,60. Die Permeabilität von PMP-Säulen ist geringer als die von Säulen, die mit C18-gebundenen Silica-Partikeln gefüllt sind, da in stationären Phasen vom C18-Typ die C18-Liganden an die Silica-Partikel gebunden sind lineare Ketten, während sich in stationären Phasen vom Polystyroltyp eine relativ dicke Polymerschicht darum bildet. In einem typischen Experiment wird die Säulenporosität wie folgt berechnet:
Abbildung 7A,B zeigen die PMP-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) und die Ascentis Express RP-Amid-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) unter Verwendung der gleichen Elutionsbedingungen (d. h. 60/40 ACN/H2O und 0,1 % TFA). ) des Van-Deemter-Diagramms. Ausgewählte Peptidmischungen (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) wurden in 20 µL/min vorbereitet. Die minimale Flussrate für beide Säulen beträgt 800 µL/min. Die minimalen HETP-Werte bei der optimalen Flussrate (80 µL/min) für die PMP-Säule und die Ascentis Express RP-Amid-Säule betrugen 2,6 µm bzw. 3,9 µm. Die HETP-Werte zeigen, dass die Trennleistung der PMP-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) viel besser ist als die der kommerziell erhältlichen Ascentis Express RP-Amid-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser). Das Van-Deemter-Diagramm in Abb. 7(A) zeigt, dass der Rückgang des N-Wertes mit zunehmendem Fluss im Vergleich zu unserer vorherigen Studie nicht signifikant ist. Die höhere Trennleistung der Die PMP-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) im Vergleich zur Ascentis Express RP-Amid-Säule basiert auf Verbesserungen bei Partikelform, -größe und komplexen Säulenpackungsverfahren, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden34.
(A) Van-Deemter-Diagramm (HETP gegenüber linearer Geschwindigkeit der mobilen Phase), erhalten mit einer PMP-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) in 60/40 ACN/H2O mit 0,1 % TFA. (B) Van-Deemter-Diagramm (HETP gegenüber linearer Geschwindigkeit der mobilen Phase), erhalten mit einer Ascentis Express RP-Amid-Säule (100 × 1,8 mm Innendurchmesser) in 60/40 ACN/H2O mit 0,1 % TFA.
Eine polar eingebettete stationäre Phase aus Polystyrol wurde hergestellt und für die Trennung synthetischer Peptidmischungen und Trypsinverdauungen von Humanserumalbumin (HAS) in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie evaluiert. Die chromatographische Leistung von PMP-Säulen für Peptidmischungen ist hinsichtlich Trennleistung und Auflösung hervorragend. Die verbesserte Trennleistung von PMP-Säulen ist auf verschiedene Gründe zurückzuführen, wie z. B. die Partikelgröße und Porenweite der Silicapartikel, die kontrollierte Synthese der stationären Phase und die komplexe Säulenpackung. Neben der hohen Trennleistung ist der niedrige Säulenrückdruck bei hohen Flussraten ein weiterer Vorteil dieser stationären Phase. PMP-Säulen weisen eine gute Reproduzierbarkeit auf und können für die Analyse von Peptidmischungen und die Trypsinverdauung verschiedener Proteine ​​verwendet werden. Wir beabsichtigen, diese Säule für die Trennung von Naturstoffen, bioaktiven Verbindungen aus Heilpflanzen und Pilzextrakten in der Flüssigkeitschromatographie einzusetzen. Zukünftig werden PMP-Säulen auch für die Trennung von Proteinen und monoklonalen Antikörpern evaluiert.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Forschung zu Peptidtrennsystemen mittels Umkehrphasenchromatographie, Teil I: Entwicklung eines Protokolls zur Säulencharakterisierung.J. Chromatography.1603, 113–129.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Verbesserte aktive Peptide zur Behandlung von Infektionskrankheiten. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429.https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Synthetische therapeutische Peptide: Wissenschaft und Markt. Arzneimittelentdeckung. 15 (1-2) heute, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Fortschrittliche Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie ermöglicht die Einbeziehung breit ausgerichteter Metabolomik und Proteomik.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Die Rolle der UHPLC in der Arzneimittelentwicklung. J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Grundlegende und praktische Aspekte der Ultrahochdruck-Flüssigkeitschromatographie für schnelle Trennungen.J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182.https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Anwendung der Ultrahochleistungsflüssigkeitschromatographie in der Arzneimittelentwicklung.J. Chromatography.1119(1-2), 140-146.https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Monolithische makroporöse Hydrogele, hergestellt aus Öl-in-Wasser-Emulsionen mit hoher innerer Phase zur effizienten Reinigung von Enteroviren. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Die Rolle der Flüssigkeitschromatographie in der Proteomik. J. Chromatography.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Neue Trends bei der Trennung therapeutischer Peptide und Proteine ​​mittels Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie: Theorie und Anwendungen. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Zweidimensionale Trennung von Peptiden mittels eines RP-RP-HPLC-Systems unter Verwendung unterschiedlicher pH-Werte in der ersten und zweiten Trenndimension. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Die Massentransfereigenschaften und die kinetische Leistung von hocheffizienten Chromatographiesäulen, die mit vollständig und oberflächlich porösen C18-Partikeln unter 2 μm gefüllt sind, wurden untersucht. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al. Aktuelle Trends und analytische Herausforderungen bei der Isolierung, Identifizierung und Validierung pflanzlicher bioaktiver Peptide.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Die proteomische Landschaft des Reiches des Lebens.Nature 582(7813), 592-596.https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Downstream-Verarbeitung therapeutischer Peptide durch präparative Flüssigkeitschromatographie. Molecule (Basel, Schweiz) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-Mode-Chromatographie und ihre Anwendung auf Biopolymere.J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Liganden für die Mixed-Mode-Proteinchromatographie: Prinzip, Charakterisierung und Design.J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).