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Poröse Silicapartikel wurden mittels eines Sol-Gel-Verfahrens mit einigen Modifikationen zur Herstellung makroporöser Partikel hergestellt. Diese Partikel wurden durch reversible Additions-Fragmentierungs-Kettenübertragungs-Polymerisation (RAFT) mit N-Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PMI) und Styrol derivatisiert, um eine N-Phenylmaleimid-Interkalation von Polystyrol (PMP) als stationäre Phase zu erhalten. Edelstahlsäulen mit engem Innendurchmesser (100 × 1,8 mm ID) wurden mittels Slurry-Packung befüllt. Die Trennung eines Peptidgemisches bestehend aus fünf Peptiden (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) und die Trypsinverdauung von humanem Serumalbumin (HAS) wurden mittels PMP-Säulenchromatographie evaluiert. Unter optimalen Elutionsbedingungen beträgt die theoretische Bodenzahl des Peptidgemisches bis zu 280.000 Böden/m². Die Trennleistung wurde verglichen. Beim Vergleich der entwickelten Säule mit der kommerziellen Ascentis Express RP-Amide-Säule zeigte sich, dass die Trennleistung der PMP-Säule hinsichtlich Trenneffizienz und Auflösung der kommerziellen Säule überlegen war.
In den letzten Jahren hat sich die biopharmazeutische Industrie zu einem expandierenden globalen Markt mit einem deutlichen Anstieg des Marktanteils entwickelt. Mit dem explosiven Wachstum der biopharmazeutischen Industrie^1,2,3 steigt der Bedarf an der Analyse von Peptiden und Proteinen. Neben dem Zielpeptid entstehen bei der Peptidsynthese zahlreiche Verunreinigungen, die eine chromatographische Reinigung erfordern, um Peptide der gewünschten Reinheit zu erhalten. Die Analyse und Charakterisierung von Proteinen in Körperflüssigkeiten, Geweben und Zellen ist aufgrund der Vielzahl potenziell nachweisbarer Spezies in einer einzelnen Probe eine äußerst anspruchsvolle Aufgabe. Obwohl die Massenspektrometrie ein effektives Werkzeug für die Peptid- und Proteinsequenzierung ist, ist die Trennung nicht optimal, wenn solche Proben in einem einzigen Durchgang in das Massenspektrometer injiziert werden. Dieses Problem lässt sich durch die Implementierung von Flüssigchromatographie-(LC)-Trennungen vor der MS-Analyse abmildern, wodurch die Anzahl der Analyten, die gleichzeitig in das Massenspektrometer gelangen, reduziert wird^4,5,6. Darüber hinaus können Analyten während der Flüssigphasentrennung in engen Bereichen fokussiert werden, wodurch sie konzentriert und die MS-Detektion verbessert wird. Empfindlichkeit. Die Flüssigkeitschromatographie (LC) hat sich im letzten Jahrzehnt deutlich weiterentwickelt und ist zu einer beliebten Technik in der Proteomanalyse geworden7,8,9,10.
Die Umkehrphasen-Flüssigkeitschromatographie (RP-LC) wird häufig zur Reinigung und Trennung von Peptidgemischen eingesetzt, wobei octadecylmodifiziertes Silicagel (ODS) als stationäre Phase dient^11,12,13. Aufgrund der komplexen Struktur und des amphiphilen Charakters von Peptiden und Proteinen bieten RP-Phasen jedoch keine zufriedenstellende Trennung^14,15. Daher sind speziell entwickelte stationäre Phasen erforderlich, um Peptide und Proteine ​​mit polaren und unpolaren Gruppen zu analysieren, die mit diesen Analyten interagieren und sie binden¹⁶. Die Mixed-Mode-Chromatographie, die multimodale Interaktionen ermöglicht, kann eine Alternative zur RP-LC für die Trennung von Peptiden, Proteinen und anderen komplexen Gemischen darstellen. Verschiedene Mixed-Mode-Phasen wurden hergestellt, und mit diesen Phasen gepackte Säulen wurden für die Peptid- und Proteintrennung verwendet^{17,18,19,20,21}. Mixed-Mode-Phasen (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, polare Interkalation/RPLC) eignen sich für die Trennung von Peptiden und Proteinen. Trennungen aufgrund des Vorhandenseins sowohl polarer als auch unpolarer Gruppen^{22,23,24,25,26,27,28}. Ebenso zeigen polare interkalierende stationäre Phasen mit kovalent gebundenen polaren Gruppen ein gutes Trennvermögen und eine einzigartige Selektivität für polare und unpolare Analyten, da die Trennung von der Wechselwirkung zwischen Analyt und stationärer Phase abhängt. Multimodale Wechselwirkungen^29,30,31,32. Kürzlich berichteten Zhang et al. 30 stellten eine Dodecyl-terminierte Polyamin-Stationärphase her und trennten erfolgreich Kohlenwasserstoffe, Antidepressiva, Flavonoide, Nukleoside, Östrogene und verschiedene andere Analyten. Der polare Interkalator besitzt sowohl polare als auch unpolare Gruppen und eignet sich daher zur Trennung von Peptiden und Proteinen mit sowohl hydrophoben als auch hydrophilen Anteilen. Säulen mit eingebetteten polaren Gruppen (z. B. Amid-eingebettete C18-Säulen) sind unter dem Handelsnamen Ascentis Express RP-Amide-Säulen kommerziell erhältlich, werden jedoch ausschließlich zur Analyse von Amin 33 verwendet.
In der vorliegenden Studie wurde eine polare stationäre Phase (N-Phenylmaleimid-haltiges Polystyrol) hergestellt und hinsichtlich ihrer Eignung zur Trennung von Peptiden und Trypsin-Digesten von HSA untersucht. Die stationäre Phase wurde nach folgender Strategie hergestellt: Poröse Silicapartikel wurden gemäß dem in unserer vorherigen Publikation beschriebenen Verfahren mit einigen Modifikationen des Herstellungsprotokolls hergestellt. Das Verhältnis von Harnstoff, Polyethylenglykol (PEG), TMOS, Wasser und Essigsäure wurde angepasst, um Silicapartikel mit großer Porengröße zu erhalten. Anschließend wurde ein neuer Ligand, Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat, synthetisiert und zur Derivatisierung der Silicapartikel verwendet, um eine polare stationäre Phase herzustellen. Die resultierende stationäre Phase wurde mithilfe des optimierten Packungsschemas in eine Edelstahlsäule (100 × 1,8 mm ID) gepackt. Die Säulenpackung wurde durch mechanische Vibration unterstützt, um die Bildung eines homogenen Bettes in der Säule zu gewährleisten. Die Trennung von Peptidgemischen aus fünf Peptiden in der gepackten Säule wurde untersucht. (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) und Trypsin-Digest von humanem Serumalbumin (HAS). Die Peptidmischung und der Trypsin-Digest von HSA wurden mit guter Auflösung und Effizienz getrennt. Die Trennleistung der PMP-Säule wurde mit der der Ascentis Express RP-Amide-Säule verglichen. Sowohl Peptide als auch Proteine ​​wurden auf der PMP-Säule gut und effizient getrennt, die eine höhere Trennleistung als die Ascentis Express RP-Amide-Säule aufwies.
PEG (Polyethylenglykol), Harnstoff, Essigsäure, Trimethoxyorthosilikat (TMOS), Trimethylchlorsilan (TMCS), Trypsin, Humanserumalbumin (HSA), Ammoniumchlorid, Harnstoff, Hexanmethyldisilazan (HMDS), Methacryloylchlorid (MC), Styrol, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoylperoxid (BPO), Acetonitril (ACN) in HPLC-Qualität, Methanol, 2-Propanol und Aceton wurden von Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA) bezogen.
Eine Mischung aus Harnstoff (8 g), Polyethylenglykol (8 g) und 8 ml 0,01 N Essigsäure wurde 10 Minuten lang gerührt. Anschließend wurden unter Eiskühlung 24 ml TMOS zugegeben. Die Reaktionsmischung wurde in einem Edelstahlautoklaven 6 Stunden bei 40 °C und anschließend 8 Stunden bei 120 °C erhitzt. Das Wasser wurde abgegossen und der Rückstand 12 Stunden bei 70 °C getrocknet. Die getrocknete, weiche Masse wurde im Ofen fein vermahlen und 12 Stunden bei 550 °C kalziniert. Drei Ansätze wurden hergestellt und charakterisiert, um die Reproduzierbarkeit von Partikelgröße, Porengröße und Oberfläche zu untersuchen.
Durch Oberflächenmodifizierung von Siliciumdioxidpartikeln mit dem präsynthetisierten Liganden Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PCMP) und anschließende radiale Polymerisation mit Styrol wurde eine polargruppenhaltige Verbindung hergestellt. Diese dient als stationäre Phase für Aggregate und Polystyrolketten. Der Herstellungsprozess wird im Folgenden beschrieben.
N-Phenylmaleimid (200 mg) und Methylvinylisocyanat (100 mg) wurden in trockenem Toluol gelöst und 0,1 ml 2,2′-Azoisobutyronitril (AIBN) zugegeben, um das Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat-Copolymer (PMCP) herzustellen. Das Gemisch wurde 3 Stunden bei 60 °C erhitzt, filtriert und 3 Stunden bei 40 °C im Trockenschrank getrocknet.
Getrocknete Siliciumdioxidpartikel (2 g) wurden in trockenem Toluol (100 ml) dispergiert, in einem 500-ml-Rundkolben 10 min lang gerührt und ultraschallbehandelt. PMCP (10 mg) wurde in Toluol gelöst und tropfenweise über einen Tropftrichter in den Reaktionskolben gegeben. Das Gemisch wurde 8 Stunden lang unter Rückfluss bei 100 °C erhitzt, filtriert, mit Aceton gewaschen und 3 Stunden lang bei 60 °C getrocknet. Anschließend wurden PMCP-gebundene Siliciumdioxidpartikel (100 g) in Toluol (200 ml) gelöst und 4-Hydroxy-TEMPO (2 ml) in Gegenwart von 100 µl Dibutylzinndilaurat als Katalysator zugegeben. Das Gemisch wurde 8 Stunden lang bei 50 °C gerührt, filtriert und 3 Stunden lang bei 50 °C getrocknet.
Styrol (1 ml), Benzoylperoxid (BPO, 0,5 ml) und mit TEMPO-PMCP funktionalisierte Silicapartikel (1,5 g) wurden in Toluol dispergiert und mit Stickstoff gespült. Die Polymerisation des Styrols erfolgte 12 Stunden lang bei 100 °C. Das resultierende Produkt wurde mit Methanol gewaschen und über Nacht bei 60 °C getrocknet. Das Gesamtreaktionsschema ist in Abbildung 1 dargestellt.
Die Proben wurden 1 Stunde lang bei 393 K entgast, um einen Restdruck von weniger als 10⁻³ Torr zu erreichen. Die Menge des bei einem relativen Druck von P/P₀ = 0,99 adsorbierten N₂ wurde zur Bestimmung des Gesamtporenvolumens verwendet. Die Morphologie von unbeschichteten und ligandengebundenen Siliciumdioxidpartikeln wurde mittels Rasterelektronenmikroskopie (Hitachi High Technologies, Tokio, Japan) untersucht. Getrocknete Proben (unbeschichtete und ligandengebundene Siliciumdioxidpartikel) wurden mithilfe von Kohlenstoffklebeband auf einer Aluminiumsäule fixiert. Anschließend wurde mit einem Q150T Sputter-Coater eine 5 nm dicke Goldschicht auf die Proben aufgebracht. Dies verbessert die Prozesseffizienz durch die Verwendung niedriger Spannungen und ermöglicht ein feinkörniges, kaltes Sputtern. Für die Elementaranalyse wurde ein Thermo Electron (Waltham, MA, USA) Flash EA1112 Elementaranalysator verwendet. Die Partikelgröße wurde mit einem Malvern (Worcestershire, UK) Mastersizer 2000 Partikelgrößenanalysator bestimmt. Verteilung. Nackte Siliciumdioxidpartikel und ligandengebundene Siliciumdioxidpartikel (jeweils 5 mg) wurden in 5 ml Isopropanol dispergiert, 10 min lang ultraschallbehandelt, 5 min lang mit einem Vortexmischer gemischt und auf den optischen Tisch des Mastersizers gegeben. Die thermogravimetrische Analyse wurde mit einer Heizrate von 5 °C pro Minute im Temperaturbereich von 30 bis 800 °C durchgeführt.
Mit der Schlammpackungsmethode wurden glasbeschichtete Edelstahlsäulen mit schmalem Innendurchmesser (100 × 1,8 mm ID) nach dem gleichen Verfahren wie in Ref. beschrieben gepackt. 31. Eine Edelstahlsäule (glasemailliert, 100 × 1,8 mm Innendurchmesser) mit einem Auslassanschluss, der eine 1 µm Fritte enthielt, wurde an einen Slurrypacker (Alltech, Deerfield, IL, USA) angeschlossen. Eine Suspension der stationären Phase wurde hergestellt, indem 150 mg der stationären Phase in 1,2 ml Methanol suspendiert und in die Speichersäule gegeben wurden. Methanol diente sowohl als Lösungsmittel für die Suspension als auch als Treibmittel. Die Säule wurde sequenziell mit folgenden Drücken befüllt: 100 MPa für 10 Minuten, 80 MPa für 15 Minuten und 60 MPa für 30 Minuten. Während des Packvorgangs wurde die Säule mit zwei GC-Säulenschüttlern (Alltech, Deerfield, IL, USA) mechanisch vibriert, um eine gleichmäßige Packung zu gewährleisten. Der Slurrypacker wurde geschlossen und der Druck langsam abgelassen, um Beschädigungen der Säule zu vermeiden. Die Säule wurde vom Slurrypacker getrennt und ein weiterer Anschluss angeschlossen. zum Einlass und zum LC-System, um dessen Leistungsfähigkeit zu überprüfen.
Eine LC-Pumpe (10AD Shimadzu, Japan), ein Injektor (Valco (USA) C14 W.05) mit 50-nL-Injektionsschleife, ein Membranentgaser (Shimadzu DGU-14A), ein UV-VIS-Kapillarfenster, ein spezieller µLC-Detektor (UV-2075) und glasbeschichtete Mikrosäulen wurden verwendet. Sehr schmale und kurze Verbindungsschläuche minimierten die Bandenverbreiterung durch zusätzliche Säulen. Nach dem Verpacken wurden Kapillaren (50 µm, ID 365) und Reduzierverschraubungen (50 µm) am 1/16″-Ausgang der Reduzierverschraubung installiert. Die Datenerfassung und chromatographische Auswertung erfolgten mit der Software Multichro 2000. Die Analyten wurden bei 254 nm auf UV-Absorption untersucht. Die chromatographischen Daten wurden mit OriginPro8 (Northampton, MA) analysiert.
3 mg humanes Serumalbumin (lyophilisiertes Pulver, ≥ 96 %, Agarose-Gelelektrophorese) wurden mit 1,5 mg Trypsin, 1 ml 4,0 M Harnstoff und 1 ml 0,2 M Ammoniumbicarbonat vermischt. Die Lösung wurde 10 Minuten gerührt und 6 Stunden in einem Wasserbad bei 37 °C inkubiert. Anschließend wurde die Reaktion mit 1 ml 0,1%iger Trifluoressigsäure (TFA) gestoppt. Die Lösung wurde filtriert und unter 4 °C gelagert.
Die Trennung von Peptidgemischen und HSA-Trypsin-Digesten wurde separat auf PMP-Säulen untersucht. Überprüfen Sie die Trennung des Peptidgemisches und des Trypsin-Digestes von HSA mittels der PMP-Säule und vergleichen Sie die Ergebnisse mit der Ascentis Express RP-Amide-Säule. Die theoretische Bodenzahl wird wie folgt berechnet:
Abbildung 2 zeigt REM-Aufnahmen von unbeschichteten und ligandengebundenen Siliciumdioxidpartikeln. Die REM-Aufnahmen der unbeschichteten Siliciumdioxidpartikel (A, B) zeigen, dass diese Partikel – im Gegensatz zu unseren früheren Untersuchungen – kugelförmig sind, jedoch länglich oder eine unregelmäßige Symmetrie aufweisen. Die Oberfläche der ligandengebundenen Siliciumdioxidpartikel (C, D) ist glatter als die der unbeschichteten Siliciumdioxidpartikel, was auf die Beschichtung der Siliciumdioxidpartikel mit Polystyrolketten zurückzuführen sein könnte.
Rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen von unbeschichteten Siliciumdioxidpartikeln (A, B) und Liganden-gebundenen Siliciumdioxidpartikeln (C, D).
Die Partikelgrößenverteilungen von unbeschichteten und ligandengebundenen Siliciumdioxidpartikeln sind in Abbildung 3(A) dargestellt. Die volumenbasierten Partikelgrößenverteilungskurven zeigen, dass die Größe der Siliciumdioxidpartikel nach der chemischen Modifizierung zunimmt (Abb. 3A). Die Partikelgrößenverteilungsdaten der Siliciumdioxidpartikel aus der vorliegenden und einer früheren Studie sind in Tabelle 1(A) verglichen. Die volumenbasierte Partikelgröße d(0,5) von PMP beträgt 3,36 µm, verglichen mit einem Wert von 3,05 µm für ad(0,5) in unserer vorherigen Studie (Polystyrol-gebundene Siliciumdioxidpartikel)³⁴. Diese Charge wies aufgrund der unterschiedlichen Verhältnisse von PEG, Harnstoff, TMOS und Essigsäure in der Reaktionsmischung eine engere Partikelgrößenverteilung auf als unsere vorherige Studie. Die Partikelgröße der PMP-Phase ist etwas größer als die der von uns zuvor untersuchten Polystyrol-gebundenen Siliciumdioxidpartikelphase. Dies bedeutet, dass die Oberflächenfunktionalisierung der Siliciumdioxidpartikel mit Styrol lediglich eine Polystyrolschicht (0,97 µm) auf der Oberfläche abgelagert hat. auf der Siliziumdioxid-Oberfläche, während die Schichtdicke in der PMP-Phase 1,38 µm betrug.
Partikelgrößenverteilung (A) und Porengrößenverteilung (B) von unbeschichteten Silicapartikeln und Liganden-gebundenen Silicapartikeln.
Die Porengröße, das Porenvolumen und die spezifische Oberfläche der Siliciumdioxidpartikel dieser Studie sind in Tabelle 1(B) aufgeführt. Die Porengrößenverteilungsprofile (PSD) von unmodifizierten und ligandengebundenen Siliciumdioxidpartikeln sind in Abbildung 3(B) dargestellt. Die Ergebnisse sind mit unserer vorherigen Studie vergleichbar. Die Porengrößen der unmodifizierten und ligandengebundenen Siliciumdioxidpartikel betragen 310 bzw. 241 Å, was bedeutet, dass die Porengröße nach der chemischen Modifizierung um 69 Å abnimmt (siehe Tabelle 1(B)). Der Kurvenverlauf ist in Abbildung 3(B) dargestellt. Ebenso verringerte sich das Porenvolumen der Siliciumdioxidpartikel nach der chemischen Modifizierung von 0,67 auf 0,58 cm³/g. Die spezifische Oberfläche der untersuchten Siliciumdioxidpartikel beträgt 116 m²/g und ist damit vergleichbar mit dem Wert unserer vorherigen Studie (124 m²/g). Wie in Tabelle 1(B) dargestellt, verringerte sich auch die spezifische Oberfläche (m²/g) der Siliciumdioxidpartikel von 116 m²/g auf 100 Å. 105 m2/g nach chemischer Modifizierung.
Die Ergebnisse der Elementaranalyse der stationären Phase sind in Tabelle 2 dargestellt. Die Kohlenstoffbeladung der aktuellen stationären Phase beträgt 6,35 % und ist damit niedriger als die Kohlenstoffbeladung unserer vorherigen Studie (Polystyrol-gebundene Silicapartikel, 7,93 %³⁵ bzw. 10,21 %)⁴². Die niedrige Kohlenstoffbeladung der aktuellen stationären Phase ist darauf zurückzuführen, dass bei ihrer Herstellung neben Styrol auch polare Liganden wie Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat (PCMP) und 4-Hydroxy-TEMPO verwendet wurden. Der Stickstoffgehalt der aktuellen stationären Phase beträgt 2,21 Gew.-%, verglichen mit 0,1735 Gew.-% bzw. 0,85 Gew.-% in früheren Studien. Dies bedeutet, dass der Stickstoffgehalt in der aktuellen stationären Phase aufgrund des Phenylmaleimids höher ist. Die Kohlenstoffbeladungen der Produkte (4) und (5) betrugen 2,7 % bzw. 2,9 %, während die Kohlenstoffbeladung des Endprodukts … (6) betrug 6,35 %, wie in Tabelle 2 dargestellt. Der Gewichtsverlust wurde mit PMP als stationärer Phase überprüft, und die TGA-Kurve ist in Abbildung 4 dargestellt. Die TGA-Kurve zeigt einen Gewichtsverlust von 8,6 %, was gut mit der Kohlenstoffbeladung (6,35 %) übereinstimmt, da die Liganden nicht nur C, sondern auch N, O und H enthalten.
Der Phenylmaleimid-Methylvinylisocyanat-Ligand wurde aufgrund seiner polaren Phenylmaleimid- und Vinylisocyanatgruppen zur Oberflächenmodifizierung von Silicapartikeln ausgewählt. Die Vinylisocyanatgruppen können durch lebende radikalische Polymerisation mit Styrol weiterreagieren. Ein weiterer Grund für die Wahl des Liganden ist die Einführung einer Gruppe, die eine moderate Wechselwirkung mit dem Analyten aufweist und keine starke elektrostatische Wechselwirkung zwischen Analyt und stationärer Phase bedingt, da die Phenylmaleimid-Gruppe bei normalem pH-Wert keine virtuelle Ladung trägt. Die Polarität der stationären Phase lässt sich durch die optimale Styrolmenge und die Reaktionszeit der radikalischen Polymerisation steuern. Der letzte Reaktionsschritt (radikalische Polymerisation) ist kritisch und kann die Polarität der stationären Phase verändern. Zur Bestimmung der Kohlenstoffbeladung der stationären Phasen wurde eine Elementaranalyse durchgeführt. Dabei zeigte sich, dass eine Erhöhung der Styrolmenge und der Reaktionszeit die Kohlenstoffbeladung der stationären Phase erhöht und umgekehrt. Stationäre Phasen, die mit unterschiedlichen Styrolkonzentrationen hergestellt wurden, weisen unterschiedliche Kohlenstoffbeladungen auf. Die stationären Phasen wurden erneut in Edelstahlsäulen geladen und ihre chromatographische Leistung (Selektivität, Auflösung, N) überprüft. Auf Grundlage dieser Experimente wurde eine optimierte Formulierung ausgewählt, um die stationäre Phase des PMP herzustellen und so eine kontrollierte Polarität und eine gute Analytretention zu gewährleisten.
Fünf Peptidmischungen (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) wurden ebenfalls mit Hilfe einer PMP-Säule unter Verwendung einer mobilen Phase untersucht; 60/40 (v/v) Acetonitril/Wasser (0,1 % TFA) bei einer Flussrate von 80 μL/min. Unter optimalen Elutionsbedingungen beträgt die theoretische Bodenzahl (N) pro Säule (100 × 1,8 mm ID) 20.000 ± 100 (200.000 Böden/m²). Tabelle 3 zeigt die N-Werte für die drei PMP-Säulen, und die Chromatogramme sind in Abbildung 5A dargestellt. Bei der Schnellanalyse auf einer PMP-Säule mit hoher Flussrate (700 μL/min) wurden fünf Peptide innerhalb einer Minute eluiert. Die N-Werte waren sehr gut: 13.500 ± 330 pro Säule (100 × 1,8 mm ID), entsprechend 135.000 Böden/m² (Abbildung 5B). Drei Säulen gleicher Größe (100 × 1,8 mm ID) wurden verwendet. Zur Überprüfung der Reproduzierbarkeit wurden Säulen mit drei verschiedenen Chargen PMP-Stationärphase gepackt. Die Analytkonzentration wurde für jede Säule unter Verwendung der optimalen Elutionsbedingungen und der theoretischen Bodenzahl N sowie der Retentionszeit zur Trennung desselben Testgemisches auf jeder Säule bestimmt. Die Reproduzierbarkeitsdaten für die PMP-Säulen sind in Tabelle 4 dargestellt. Die Reproduzierbarkeit der PMP-Säule korreliert gut mit sehr niedrigen %RSD-Werten (siehe Tabelle 3).
Trennung des Peptidgemisches an einer PMP-Säule (B) und einer Ascentis Express RP-Amid-Säule (A); mobile Phase 60/40 ACN/H₂O (0,1 % TFA), Abmessungen der PMP-Säule (100 × 1,8 mm ID); analytische Elutionsreihenfolge der Verbindungen: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) und 5 (Leucin) (Säure-Enkephalin).
Eine PMP-Säule (100 × 1,8 mm ID) wurde für die Trennung tryptischer Digeste von humanem Serumalbumin (HSA) mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) evaluiert. Das Chromatogramm in Abbildung 6 zeigt eine gute Trennung der Probe und eine sehr gute Auflösung. Die HSA-Digeste wurden mit einer Flussrate von 100 µL/min und einer mobilen Phase aus 70/30 Acetonitril/Wasser und 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) analysiert. Wie im Chromatogramm (Abbildung 6) dargestellt, wurde das HSA-Digest in 17 Peaks aufgespalten, die 17 Peptiden entsprechen. Die Trenneffizienz jedes Peaks im HSA-Digest wurde berechnet; die Werte sind in Tabelle 5 aufgeführt.
Ein tryptisches Digest von HSA (100 × 1,8 mm ID) wurde auf einer PMP-Säule getrennt; Flussrate (100 µL/min), mobile Phase 60/40 Acetonitril/Wasser mit 0,1% TFA.
Dabei ist L die Säulenlänge, η die Viskosität der mobilen Phase, ΔP der Gegendruck in der Säule und u die lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase. Die Permeabilität der PMP-Säule betrug 2,5 × 10⁻¹⁴ m², die Flussrate 25 μL/min und es wurde ein 60/40 (v/v) ACN/Wasser-Gemisch verwendet. Die Permeabilität der PMP-Säule (100 × 1,8 mm ID) war vergleichbar mit der unserer vorherigen Studie (Ref. 34). Die Permeabilität der mit oberflächlich porösen Partikeln gepackten Säule beträgt: 1,7 × 10⁻¹⁵ m² für 1,3 μm-Partikel, 3,1 × 10⁻¹⁵ m² für 1,7 μm-Partikel, 5,2 × 10⁻¹⁵ m² und 2,5 × 10⁻¹⁴ m² für 2,6 μm-Partikel. 43. Daher ist die Permeabilität der PMP-Phase ähnlich der von 5 μm Kern-Schale-Partikeln.
Dabei ist Wx das Gewicht der mit Chloroform gefüllten Säule, Wy das Gewicht der mit Methanol gefüllten Säule und ρ die Dichte des Lösungsmittels. Die Dichten von Methanol (ρ = 0,7866) und Chloroform (ρ = 1,484) betragen [Wert fehlt]. Die Gesamtporosität der zuvor untersuchten SILICA PARTICLES-C18-Säulen (100 × 1,8 mm ID)³⁴ und C18-Harnstoff-Säulen³¹ betrug 0,63 bzw. 0,55. Dies bedeutet, dass die Anwesenheit von Harnstoffliganden die Permeabilität der stationären Phase verringert. Die Gesamtporosität der PMP-Säule (100 × 1,8 mm ID) beträgt hingegen 0,60. Die Permeabilität von PMP-Säulen ist geringer als die von Säulen, die mit C18-gebundenen Silicapartikeln gefüllt sind, da in stationären Phasen vom C18-Typ die C18-Liganden an die Silicapartikel gebunden sind. Bei stationären Phasen vom Polystyroltyp bilden sich lineare Polymerketten, während sich um diese herum eine relativ dicke Polymerschicht bildet. In einem typischen Experiment wird die Säulenporosität wie folgt berechnet:
Abbildung 7A,B zeigt die PMP-Säule (100 × 1,8 mm ID) und die Ascentis Express RP-Amid-Säule (100 × 1,8 mm ID) unter Verwendung der gleichen Elutionsbedingungen (d. h. 60/40 ACN/H2O und 0,1 % TFA). ) des van-Deemter-Diagramms. Ausgewählte Peptidmischungen (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucin-Enkephalin) wurden in 20 µL/min hergestellt. Die minimale Flussrate für beide Säulen beträgt 800 µL/min. Die minimalen HETP-Werte bei der optimalen Flussrate (80 µL/min) betrugen für die PMP-Säule 2,6 µm und für die Ascentis Express RP-Amide-Säule 3,9 µm. Die HETP-Werte zeigen, dass die Trenneffizienz der PMP-Säule (100 × 1,8 mm ID) deutlich besser ist als die der kommerziell erhältlichen Ascentis Express RP-Amide-Säule (100 × 1,8 mm ID). Das van-Deemter-Diagramm in Abb. 7(A) zeigt, dass die Abnahme des N-Wertes mit zunehmender Flussrate im Vergleich zu unserer vorherigen Studie nicht signifikant ist. Die höhere Trenneffizienz der Die PMP-Säule (100 × 1,8 mm ID) im Vergleich zur Ascentis Express RP-Amide-Säule basiert auf Verbesserungen in Partikelform, -größe und komplexen Säulenpackungsverfahren, die in der vorliegenden Arbeit verwendet wurden34.
(A) Van-Deemter-Diagramm (HETP gegen die lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase), aufgenommen mit einer PMP-Säule (100 × 1,8 mm ID) in 60/40 ACN/H2O mit 0,1 % TFA. (B) Van-Deemter-Diagramm (HETP gegen die lineare Geschwindigkeit der mobilen Phase), aufgenommen mit einer Ascentis Express RP-Amide-Säule (100 × 1,8 mm ID) in 60/40 ACN/H2O mit 0,1 % TFA.
Eine polar eingebettete Polystyrol-Phase wurde hergestellt und hinsichtlich ihrer Eignung zur Trennung synthetischer Peptidgemische und Trypsinverdauprodukte von humanem Serumalbumin (HAS) in der Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) evaluiert. Die chromatographische Leistung der PMP-Säulen für Peptidgemische ist hinsichtlich Trenneffizienz und Auflösung exzellent. Die verbesserte Trennleistung der PMP-Säulen ist auf verschiedene Faktoren zurückzuführen, wie z. B. die Partikel- und Porengröße der Silicapartikel, die kontrollierte Synthese der stationären Phase und die komplexe Säulenpackung. Neben der hohen Trenneffizienz ist der niedrige Säulengegendruck bei hohen Flussraten ein weiterer Vorteil dieser stationären Phase. PMP-Säulen weisen eine gute Reproduzierbarkeit auf und eignen sich zur Analyse von Peptidgemischen und Trypsinverdauprodukten verschiedener Proteine. Wir beabsichtigen, diese Säule zur Trennung von Naturstoffen, bioaktiven Verbindungen aus Heilpflanzen und Pilzextrakten in der Flüssigkeitschromatographie einzusetzen. Zukünftig sollen PMP-Säulen auch für die Trennung von Proteinen und monoklonalen Antikörpern evaluiert werden.
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