نشكرك على زيارة Nature.com. إصدار المتصفح الذي تستخدمه يدعم CSS بشكل محدود. للحصول على أفضل تجربة، نوصيك باستخدام متصفح محدث (أو إيقاف تشغيل وضع التوافق في Internet Explorer). في غضون ذلك، لضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط وJavaScript.
تم تحضير جزيئات السيليكا المسامية بطريقة السول-جيل مع بعض التعديلات للحصول على جزيئات كبيرة المسام. تم اشتقاق هذه الجزيئات عن طريق بلمرة نقل سلسلة التجزئة بالإضافة العكسية (RAFT) مع N-فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات (PMI) والستايرين لإعداد تداخل N-فينيل ماليميد للطور الثابت من البوليسترين (PMP). تم تعبئة أعمدة من الفولاذ المقاوم للصدأ ذات ثقب ضيق (100 × 1.8 مم قطر داخلي) عن طريق التعبئة الطينية. تم تقييم فصل عمود PMP لمزيج الببتيد المكون من خمسة ببتيدات (Gly-Tyr و Gly-Leu-Tyr و Gly-Gly-Tyr-Arg و Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg و leucine enkephalin) (الأداء الكروماتوغرافي) وهضم التربسين لألبومين المصل البشري (HAS). في ظل ظروف الإيلوشن المثلى، يكون عدد الصفائح النظرية لمزيج الببتيد مرتفعًا مثل 280,000 لوحة/م². وبمقارنة أداء الفصل للعمود المتطور مع عمود Ascentis Express RP-Amide التجاري، لوحظ أن أداء الفصل لعمود PMP كان متفوقًا على العمود التجاري من حيث كفاءة الفصل والدقة.
في السنوات الأخيرة، أصبحت صناعة الأدوية الحيوية سوقًا عالميًا متوسعًا مع زيادة كبيرة في حصتها السوقية. ومع النمو الهائل لصناعة الأدوية الحيوية1،2،3، أصبح تحليل الببتيدات والبروتينات أمرًا مرغوبًا فيه للغاية. فبالإضافة إلى الببتيد المستهدف، تتولد العديد من الشوائب أثناء تخليق الببتيد، مما يتطلب تنقية كروماتوغرافية للحصول على ببتيدات بالنقاء المطلوب. يُعد تحليل وتوصيف البروتينات في سوائل الجسم والأنسجة والخلايا مهمة بالغة الصعوبة نظرًا للعدد الكبير من الأنواع التي يمكن اكتشافها في عينة واحدة. وعلى الرغم من أن مطياف الكتلة أداة فعالة لتسلسل الببتيدات والبروتينات، إلا أنه إذا تم حقن هذه العينات في مطياف الكتلة في تمريرة واحدة، فلن يكون الفصل مثاليًا. ويمكن التخفيف من هذه المشكلة من خلال تطبيق عمليات فصل كروماتوغرافيا السائل (LC) قبل تحليل مطياف الكتلة، مما يقلل من عدد المُحللات التي تدخل مطياف الكتلة في وقت معين4،5،6. بالإضافة إلى ذلك، أثناء فصل الطور السائل، يمكن تركيز المُحللات في مناطق ضيقة، وبالتالي تركيز هذه المحللات وتحسين حساسية الكشف باستخدام تقنية MS. لقد تطورت تقنية الكروماتوغرافيا السائلة (LC) بشكل كبير خلال العقد الماضي وأصبحت تقنية شائعة في التحليل البروتيني7،8،9،10.
تُستخدم كروماتوغرافيا السائل ذات الطور العكسي (RP-LC) على نطاق واسع لتنقية وفصل مخاليط الببتيد باستخدام السيليكا المعدلة بالأوكتاديسيل (ODS) كمرحلة ثابتة11،12،13. ومع ذلك، لا توفر المراحل الثابتة RP فصلًا مرضيًا للببتيدات والبروتينات نظرًا لبنيتها المعقدة وطبيعتها المحبة للماء14،15. لذلك، هناك حاجة إلى مراحل ثابتة مصممة خصيصًا لتحليل الببتيدات والبروتينات ذات الوحدات القطبية وغير القطبية للتفاعل مع هذه المحللات والاحتفاظ بها16. يمكن أن تكون الكروماتوغرافيا ذات الوضع المختلط، التي توفر تفاعلات متعددة الوسائط، بديلاً عن RP-LC لفصل الببتيدات والبروتينات والمخاليط المعقدة الأخرى. تم تحضير العديد من المراحل الثابتة ذات الوضع المختلط، وتم استخدام أعمدة معبأة بهذه المراحل للببتيد والبروتين الفصل 17، 18، 19، 20، 21. تُعدّ الأطوار الثابتة مختلطة الأنماط (WAX/RPLC، HILIC/RPLC، التداخل القطبي/RPLC) مناسبة لفصل الببتيدات والبروتينات نظرًا لوجود مجموعات قطبية وغير قطبية 22، 23، 24، 25، 26، 27، 28. وبالمثل، تُظهر الأطوار الثابتة المتداخلة القطبية ذات المجموعات القطبية المرتبطة تساهميًا قوة فصل جيدة وانتقائية فريدة للمحللات القطبية وغير القطبية، حيث يعتمد الفصل على التفاعل بين المحلل والطور الثابت. التفاعلات متعددة الأنماط 29، 30، 31، 32. مؤخرًا، أجرى تشانغ وآخرون دراسةً. تم إعداد طور ثابت من البولي أمين منتهي بالدوديسيل وفصل بنجاح الهيدروكربونات ومضادات الاكتئاب والفلافونويدات والنوكليوسيدات والإستروجينات والعديد من المحللات الأخرى. يحتوي المتداخل القطبي على مجموعات قطبية وغير قطبية، لذلك يمكن استخدامه لفصل الببتيدات والبروتينات التي تحتوي على مجموعات كارهة للماء ومحبة للماء. تتوفر الأعمدة المضمنة القطبية (على سبيل المثال، أعمدة C18 المضمنة بالأميد) تجاريًا تحت الاسم التجاري أعمدة Ascentis Express RP-Amide، ولكن تُستخدم هذه الأعمدة لتحليل الأمين 33 فقط.
في الدراسة الحالية، تم تحضير طور ثابت مدمج قطبيًا (بوليسترين مدمج بـ N-فينيل ماليميد) وتقييمه لفصل الببتيدات وهضم التربسين لـ HSA. تم تحضير الطور الثابت باستخدام الاستراتيجية التالية. تم تحضير جزيئات السيليكا المسامية وفقًا للإجراء الموضح في منشورنا السابق مع بعض التعديلات على بروتوكول التحضير. تم تعديل نسبة اليوريا والبولي إيثيلين جلايكول (PEG) وTMOS وحمض الأسيتيك المائي لإعداد جزيئات السيليكا ذات حجم المسام الكبير. ثانيًا، تم تصنيع ربيطة جديدة، فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات، واستخدامها لاشتقاق جزيئات السيليكا لإعداد طور ثابت مدمج قطبيًا. تم تعبئة الطور الثابت الناتج في عمود من الفولاذ المقاوم للصدأ (100 × 1.8 مم قطر داخلي) باستخدام مخطط التعبئة الأمثل. يتم مساعدة تعبئة العمود بالاهتزاز الميكانيكي لضمان تكوين طبقة متجانسة داخل العمود. تقييم فصل العمود المعبأ لمخاليط الببتيد المكونة من خمسة ببتيدات؛ (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، Leucine Enkephalin) وهضم التربسين لألبومين المصل البشري (HAS). لوحظ أن خليط الببتيد وهضم التربسين لـ HSA ينفصلان بدقة وكفاءة جيدة. تمت مقارنة أداء فصل عمود PMP بأداء عمود Ascentis Express RP-Amide. لوحظ أن كل من الببتيدات والبروتينات تم حلها بشكل جيد وفعال على عمود PMP، والذي كان أكثر كفاءة من عمود Ascentis Express RP-Amide.
PEG (بولي إيثيلين جلايكول)، اليوريا، حمض الأسيتيك، ثلاثي ميثوكسي أورثوسيليكات (TMOS)، ثلاثي ميثيل كلورو سيلان (TMCS)، التربسين، ألبومين المصل البشري (HSA)، كلوريد الأمونيوم، اليوريا، هيكسان ميثيل ديسيلازان (HMDS)، كلوريد الميثاكريلول (MC)، ستايرين، 4-هيدروكسي تيمبو، بنزويل بيروكسيد (BPO)، أسيتونتريل عالي الأداء (ACN)، ميثانول، 2-بروبانول، وأسيتون تم شراؤها من شركة سيجما ألدريتش (سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية).
تم تقليب خليط من اليوريا (8 جم) وبولي إيثيلين جلايكول (8 جم) و8 مل من حمض الأسيتيك 0.01 ن لمدة 10 دقائق، ثم تمت إضافة 24 مل من TMOS إليه في ظل ظروف الجليد الباردة. تم تسخين خليط التفاعل عند 40 درجة مئوية لمدة 6 ساعات ثم عند 120 درجة مئوية لمدة 8 ساعات في وعاء من الفولاذ المقاوم للصدأ. تم سكب الماء وتجفيف المادة المتبقية عند 70 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. تم طحن الكتلة الناعمة المجففة في فرن وتكليسها عند 550 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. تم تحضير ثلاث دفعات وتوصيفها لفحص إمكانية إعادة الإنتاج في حجم الجسيمات وحجم المسام ومساحة السطح.
بتعديل سطح جسيمات السيليكا باستخدام ربيطة فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات (PCMP) المُصنّعة مسبقًا، متبوعةً ببلمرة شعاعية باستخدام الستايرين، تم تحضير مركب يحتوي على مجموعة قطبية. طور ثابت للركام وسلاسل البوليسترين. عملية التحضير موصوفة أدناه.
تم إذابة N-فينيل ماليميد (200 ملغ) وميثيل فينيل إيزوسيانات (100 ملغ) في التولوين الجاف، وتمت إضافة 0.1 مل من 2،2'-أزويزوبيوتيرونيتريل (AIBN) إلى قارورة التفاعل لإعداد كوبوليمر فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات (PMCP). تم تسخين الخليط عند 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، وتم ترشيحه وتجفيفه في فرن عند 40 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
تم تشتيت جزيئات السيليكا المجففة (2 جم) في التولوين الجاف (100 مل)، وحركت وخضعت للموجات فوق الصوتية في قارورة ذات قاع مستدير سعة 500 مل لمدة 10 دقائق. تم إذابة PMCP (10 مجم) في التولوين وإضافته قطرة قطرة إلى قارورة التفاعل عبر قمع التنقيط. تم إعادة غمر الخليط في الماء عند 100 درجة مئوية لمدة 8 ساعات، وتم ترشيحه وغسله بالأسيتون وتجفيفه عند 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. بعد ذلك، تم إذابة جزيئات السيليكا المرتبطة بـ PMCP (100 جم) في التولوين (200 مل) وتمت إضافة 4-هيدروكسي-TEMPO (2 مل) في وجود 100 ميكرولتر من ثنائي بوتيل القصدير ديلورات كمحفز. تم تقليب الخليط عند 50 درجة مئوية لمدة 8 ساعات، وتم ترشيحه وتجفيفه عند 50 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
تم تشتيت جزيئات السيليكا المرتبطة بـ TEMPO-PMCP (1.5 جم) من الستايرين (1 مل)، وبنزويل بيروكسيد BPO (0.5 مل)، في التولوين وتطهيرها بالنيتروجين. تم إجراء بلمرة الستايرين عند 100 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. تم غسل المنتج الناتج بالميثانول وتجفيفه عند 60 درجة مئوية طوال الليل. يظهر مخطط التفاعل العام في الشكل 1.
تم تفريغ العينات من الغازات عند درجة حرارة 393 كلفن لمدة ساعة واحدة للحصول على ضغط متبقي أقل من 10-3 تور. تم استخدام كمية N2 الممتزة عند ضغط نسبي P/P0 = 0.99 لتحديد إجمالي حجم المسام. تم فحص مورفولوجيا جزيئات السيليكا العارية والمرتبطة بالربيط باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (هيتاشي للتكنولوجيا العالية، طوكيو، اليابان). تم وضع العينات المجففة (السيليكا العارية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالربيط) على عمود من الألومنيوم باستخدام شريط كربون لاصق. تم طلاء العينات بالذهب باستخدام طلاء الرش Q150T، وتم ترسيب طبقة من الذهب 5 نانومتر على العينات. هذا يحسن كفاءة العملية باستخدام الفولتية المنخفضة ويوفر حبيبات دقيقة، رش بارد. تم استخدام محلل العناصر Flash EA1112 من شركة Thermo Electron (والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) للتحليل العنصري. جهاز Mastersizer من شركة Malvern (ووسترشاير، المملكة المتحدة). تم استخدام جهاز تحليل حجم الجسيمات 2000 للحصول على توزيع حجم الجسيمات. تم تشتيت جزيئات السيليكا العارية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالربيط (5 ملغ لكل منهما) في 5 مل من الأيزوبروبانول، وتم الموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق، والدوامة لمدة 5 دقائق، ووضعها على المقعد البصري لجهاز Mastersizer. تم إجراء التحليل الوزني الحراري بمعدل 5 درجات مئوية في الدقيقة على مدى نطاق درجة حرارة يتراوح من 30 إلى 800 درجة مئوية.
تم تعبئة أعمدة ضيقة من الفولاذ المقاوم للصدأ مبطنة بالزجاج بأبعاد (100 × 1.8 مم قطر داخلي) باستخدام طريقة التعبئة بالطين، مع تطبيق نفس الإجراء المستخدم في المرجع. 31. عمود من الفولاذ المقاوم للصدأ (مبطن بالزجاج، 100 × 1.8 مم قطر داخلي) مزود بمنفذ مخرج يحتوي على فريت بسمك 1 ميكرومتر، متصل بوحدة تعبئة الملاط (Alltech Deerfield، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية). حضّر ملاطًا ثابت الطور بتعليق 150 ملغ من الطور الثابت في 1.2 مل من الميثانول، ثم أرسله إلى عمود التخزين. استُخدم الميثانول كمذيب للملاط وكمذيب للدفع. املأ العمود بالتتابع بتطبيق ضغوط 100 ميجا باسكال لمدة 10 دقائق، و80 ميجا باسكال لمدة 15 دقيقة، و60 ميجا باسكال لمدة 30 دقيقة. أثناء التعبئة، تم تطبيق اهتزاز ميكانيكي باستخدام هزازتي عمود GC (Alltech، Deerfield، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية) لضمان تعبئة موحدة للعمود. أغلق وحدة تعبئة الملاط وحرر الضغط ببطء لمنع أي تلف داخل العمود. افصل العمود عن وحدة تعبئة الملاط. وتوصيل تركيب آخر بالمدخل ونظام LC للتحقق من أدائه.
تم إنشاء مضخة LC (10AD Shimadzu، اليابان)، حاقن (Valco (الولايات المتحدة الأمريكية) C14 W.05) مع حلقة حقن 50nL، مزيل غاز الغشاء (Shimadzu DGU-14A)، نافذة شعرية UV-VIS، كاشف جهاز µLC خاص (UV-2075) وأعمدة مجهرية مبطنة بالزجاج. استخدم أنابيب توصيل ضيقة وقصيرة للغاية لتقليل تأثير توسيع نطاق العمود الإضافي. بعد التعبئة، تم تركيب الشعيرات الدموية (50 ميكرومتر id 365 وشعيرات اتحاد الاختزال (50 ميكرومتر) عند مخرج 1/16″ من اتحاد الاختزال. تم جمع البيانات والمعالجة الكروماتوغرافية باستخدام برنامج Multichro 2000. المراقبة عند 254 نانومتر تم اختبار المحللات لامتصاص الأشعة فوق البنفسجية. تم تحليل البيانات الكروماتوغرافية بواسطة OriginPro8 (نورثامبتون، ماساتشوستس).
ألبومين من مصل الإنسان، مسحوق مجفف بالتجميد، ≥ 96٪ (كهربائي هلام الأجاروز) 3 ملغ مختلطة مع التربسين (1.5 ملغ)، 4.0 م اليوريا (1 مل)، و 0.2 م بيكربونات الأمونيوم (1 مل). تم تحريك المحلول لمدة 10 دقائق وحفظه في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات، ثم تم إخماده بـ 1 مل من 0.1٪ TFA. قم بتصفية المحلول وتخزينه أقل من 4 درجات مئوية.
تم تقييم فصل خليط الببتيد وهضم التربسين لـ HSA بشكل منفصل على أعمدة PMP. تحقق من فصل خليط الببتيد وهضم التربسين لـ HSA بواسطة عمود PMP وقارن النتائج بعمود Ascentis Express RP-Amide. يتم حساب رقم اللوحة النظري على النحو التالي:
تظهر صور المجهر الإلكتروني الماسح لجزيئات السيليكا العارية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالربيط في الشكل 2. تُظهر صور المجهر الإلكتروني الماسح لجزيئات السيليكا العارية (أ، ب) أنه على عكس دراساتنا السابقة، تكون هذه الجسيمات كروية حيث تكون الجسيمات ممدودة أو ذات تناسق غير منتظم. يكون سطح جزيئات السيليكا المرتبطة بالربيط (ج، د) أكثر سلاسة من سطح جزيئات السيليكا العارية، وقد يكون ذلك بسبب طلاء سلاسل البوليسترين على سطح جزيئات السيليكا.
صور المجهر الإلكتروني الماسح لجزيئات السيليكا العارية (أ، ب) وجزيئات السيليكا المرتبطة بالربيط (ج، د).
يظهر الشكل 3 (أ) توزيعات حجم الجسيمات لجسيمات السيليكا العارية وجسيمات السيليكا المرتبطة بالربيط. أظهرت منحنيات توزيع حجم الجسيمات المستندة إلى الحجم أن حجم جسيمات السيليكا زاد بعد التعديل الكيميائي (الشكل 3أ). تمت مقارنة بيانات توزيع حجم جسيمات جسيمات السيليكا من الدراسة الحالية والدراسة السابقة في الجدول 1 (أ). حجم الجسيمات المستند إلى الحجم، d(0.5)، لـ PMP هو 3.36 ميكرومتر، مقارنة بدراستنا السابقة بقيمة ad(0.5) البالغة 3.05 ميكرومتر (جسيمات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين)34. كان لهذه الدفعة توزيع أضيق لحجم الجسيمات مقارنة بدراستنا السابقة بسبب النسب المتفاوتة لـ PEG واليوريا وTMOS وحمض الأسيتيك في خليط التفاعل. حجم جسيم طور PMP أكبر قليلاً من حجم طور جسيمات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين الذي درسناه سابقًا. هذا يعني أن الوظيفة السطحية لـ ترسبت جزيئات السيليكا مع الستايرين طبقة من البوليسترين (0.97 ميكرومتر) فقط على سطح السيليكا، بينما في مرحلة PMP كان سمك الطبقة 1.38 ميكرومتر.
توزيع حجم الجسيمات (أ) وتوزيع حجم المسام (ب) لجزيئات السيليكا العارية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالربيط.
تم توضيح حجم المسام وحجم المسام ومساحة سطح جزيئات السيليكا للدراسة الحالية في الجدول 1 (ب). تظهر ملفات تعريف PSD لجزيئات السيليكا العارية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالربيط في الشكل 3 (ب). النتائج قابلة للمقارنة مع دراستنا السابقة. أحجام مسام جزيئات السيليكا العارية والمرتبطة بالربيط هي 310 و 241 على التوالي، مما يشير إلى أن حجم المسام ينخفض ​​بمقدار 69 بعد التعديل الكيميائي، كما هو موضح في الجدول 1 (ب)، ويظهر تغيير المنحنى في الشكل 3 (ب). وبالمثل، انخفض حجم مسام جزيئات السيليكا من 0.67 إلى 0.58 سم3/جم بعد التعديل الكيميائي. تبلغ المساحة السطحية النوعية لجزيئات السيليكا المدروسة حاليًا 116 م2/جم، وهي قابلة للمقارنة مع دراستنا السابقة (124 م2/جم). كما هو موضح في الجدول 1 (ب)، تبلغ المساحة السطحية (م2/جم) لـ وانخفضت أيضًا جزيئات السيليكا من 116 م2/جم إلى 105 م2/جم بعد التعديل الكيميائي.
تظهر نتائج التحليل العنصري للمرحلة الثابتة في الجدول 2. يبلغ تحميل الكربون للمرحلة الثابتة الحالية 6.35٪، وهو أقل من تحميل الكربون لدراستنا السابقة (جزيئات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين، 7.93٪35 و 10.21٪، على التوالي) 42. تحميل الكربون للمرحلة الثابتة الحالية منخفض، لأنه في تحضير SP الحالي، بالإضافة إلى الستايرين، تم استخدام بعض الربيطة القطبية مثل فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات (PCMP) و 4-هيدروكسي-TEMPO. تبلغ النسبة المئوية لوزن النيتروجين للمرحلة الثابتة الحالية 2.21٪، مقارنة بـ 0.1735 و 0.85٪ من وزن النيتروجين في الدراسات السابقة، على التوالي. وهذا يعني أن النسبة المئوية للوزن من النيتروجين أعلى في المرحلة الثابتة الحالية بسبب فينيل ماليميد. وبالمثل، كانت أحمال الكربون للمنتجات (4) و (5) 2.7٪ و 2.9% على التوالي، في حين أن تحميل الكربون للمنتج النهائي (6) كان 6.35%، كما هو موضح في الجدول 2. تم التحقق من فقدان الوزن باستخدام الطور الثابت PMP، ويظهر منحنى TGA في الشكل 4. يظهر منحنى TGA فقدانًا في الوزن بنسبة 8.6%، وهو ما يتفق جيدًا مع تحميل الكربون (6.35%) لأن الربيطة لا تحتوي فقط على C ولكن أيضًا على N وO وH.
تم اختيار ربيطة فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات لتعديل سطح جسيمات السيليكا لأنه يحتوي على مجموعات فينيل ماليميد قطبية ومجموعات فينيل إيزوسيانات. يمكن لمجموعات فينيل إيزوسيانات أن تتفاعل أيضًا مع الستيرين عن طريق بلمرة الجذور الحية. والسبب الثاني هو إدخال مجموعة لها تفاعل معتدل مع المحلل ولا يوجد تفاعل إلكتروستاتيكي قوي بين المحلل والطور الثابت، حيث لا تحتوي مجموعة فينيل ماليميد على شحنة افتراضية عند درجة الحموضة الطبيعية. يمكن التحكم في قطبية الطور الثابت من خلال الكمية المثلى من الستيرين ووقت تفاعل بلمرة الجذور الحرة. الخطوة الأخيرة من التفاعل (بلمرة الجذور الحرة) حاسمة ويمكن أن تغير قطبية الطور الثابت. تم إجراء التحليل العنصري للتحقق من تحميل الكربون لهذه المراحل الثابتة. وقد لوحظ أن زيادة كمية الستيرين ووقت التفاعل زاد من تحميل الكربون في الطور الثابت والعكس صحيح. تحتوي SPs المحضرة بتركيزات مختلفة من الستيرين على أحمال كربون مختلفة. مرة أخرى، قم بتحميل هذه المراحل الثابتة في أعمدة من الفولاذ المقاوم للصدأ وتحقق من أدائها الكروماتوغرافي (الانتقائية، الدقة، قيمة N، وما إلى ذلك). بناءً على هذه التجارب، تم اختيار تركيبة محسنة لإعداد المرحلة الثابتة PMP لضمان الاستقطاب المتحكم فيه والاحتفاظ الجيد بالمحلل.
تم أيضًا تقييم خمسة مخاليط ببتيدية (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، leucine enkephalin) باستخدام عمود PMP باستخدام الطور المتحرك؛ 60/40 (حجم/حجم) أسيتونتريل/ماء (0.1% TFA) بمعدل تدفق 80 ميكرولتر/دقيقة. في ظل ظروف الإيلوشن المثلى، يبلغ عدد اللوحات النظري (N) لكل عمود (100 × 1.8 مم قطر داخلي) 20000 ± 100 (200000 لوحة/م²). يوضح الجدول 3 قيم N لأعمدة PMP الثلاثة، وتظهر الكروماتوغرامات في الشكل 5A. تحليل سريع على عمود PMP بمعدل تدفق مرتفع (700 ميكرولتر/دقيقة)، تم إيلوشن خمسة ببتيدات في غضون دقيقة واحدة، وكانت قيم N جيدة جدًا، 13500 ± 330 لكل عمود (100 × 1.8 مم قطر داخلي)، يتوافق مع 135000 لوحة/م (الشكل 5B). ثلاثة أعمدة متطابقة الحجم (100 × 1.8 مم تم تعبئة الأعمدة (id) بثلاث دفعات مختلفة من الطور الثابت PMP للتحقق من إمكانية إعادة الإنتاج. تم تسجيل تركيز المحلل لكل عمود باستخدام ظروف الامتصاص المثلى وعدد الألواح النظرية N ووقت الاحتفاظ لفصل نفس خليط الاختبار على كل عمود. تظهر بيانات إعادة الإنتاج لأعمدة PMP في الجدول 4. ترتبط إعادة إنتاج عمود PMP بشكل جيد بقيم٪ RSD منخفضة للغاية، كما هو موضح في الجدول 3.
فصل خليط الببتيد على عمود PMP (B) وعمود Ascentis Express RP-Amide (A)؛ الطور المتحرك 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%)، أبعاد عمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي)؛ الترتيب التحليلي للمركبات: 1 (Gly-Tyr)، 2 (Gly-Leu-Tyr)، 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg)، 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) و5 (leucine) حمض الإنكيفالين).
تم تقييم عمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي) لفصل هضم التربسين لألبومين المصل البشري في كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء. يوضح الكروماتوغرام في الشكل 6 أن العينة منفصلة جيدًا والدقة جيدة جدًا. تم تحليل هضمات HSA باستخدام معدل تدفق 100 ميكرولتر / دقيقة، طور متحرك 70/30 أسيتونتريل / ماء و 0.1٪ TFA. كما هو موضح في الكروماتوغرام (الشكل 6)، تم تقسيم هضم HSA إلى 17 قمة تتوافق مع 17 ببتيدًا. تم حساب كفاءة فصل كل قمة في هضم HSA ويتم إعطاء القيم في الجدول 5.
تم فصل خلاصة التربسين من حمض الهيالورونيك (100 × 1.8 مم قطر داخلي) على عمود PMP؛ معدل التدفق (100 ميكرولتر/دقيقة)، الطور المتحرك 60/40 أسيتونتريل/ماء مع 0.1% TFA.
حيث L هو طول العمود، وη هي لزوجة الطور المتحرك، وΔP هو الضغط الخلفي للعمود، وu هي السرعة الخطية للطور المتحرك. كانت نفاذية عمود PMP 2.5 × 10-14 م2، وكان معدل التدفق 25 ميكرولتر/دقيقة، وتم استخدام 60/40 v/v ACN/ماء. كانت نفاذية عمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي) مماثلة لتلك الموجودة في دراستنا السابقة Ref.34. نفاذية العمود المعبأ بجسيمات مسامية سطحيًا هي: 1.7 × 10-15 لجسيمات 1.3 ميكرومتر، و3.1 × 10-15 لجسيمات 1.7 ميكرومتر، و5.2 × 10-15 و2.5 × 10-14 م2 لجسيمات 2.6 ميكرومتر لجسيمات 5 ميكرومتر 43. لذلك، فإن نفاذية طور PMP مماثلة لنفاذية جسيمات النواة والقشرة التي يبلغ حجمها 5 ميكرومتر.
حيث Wx هو وزن العمود المعبأ بالكلوروفورم، وWy هو وزن العمود المعبأ بالميثانول، وρ هي كثافة المذيب. كثافات الميثانول (ρ = 0.7866) والكلوروفورم (ρ = 1.484). كانت المسامية الكلية لأعمدة جسيمات السيليكا-C18 (100 × 1.8 مم قطر داخلي) 34 وأعمدة اليوريا-C18 31 التي درسناها سابقًا 0.63 و0.55 على التوالي. وهذا يعني أن وجود ربيطات اليوريا يقلل من نفاذية الطور الثابت. من ناحية أخرى، فإن المسامية الكلية لعمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي) هي 0.60. نفاذية أعمدة PMP أقل من نفاذية الأعمدة المعبأة بجسيمات السيليكا المرتبطة بـ C18 لأنه في المراحل الثابتة من نوع C18 ترتبط ربيطات C18 بجزيئات السيليكا كسلاسل خطية، بينما في المراحل الثابتة من نوع البوليسترين، تتشكل طبقة بوليمر سميكة نسبيًا حولها. في تجربة نموذجية، يتم حساب مسامية العمود على النحو التالي:
الشكل 7أ، ب يظهر عمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي) وعمود Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 مم قطر داخلي) باستخدام نفس ظروف الإيلوشن (أي 60/40 ACN/H2O و0.1% TFA). ) من مخطط فان ديمتر. تم تحضير مخاليط الببتيد المختارة (Gly-Tyr و Gly-Leu-Tyr و Gly-Gly-Tyr-Arg و Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg و Leucine Enkephalin) في 20 ميكرولتر/معدل التدفق الأدنى لكلا العمودين هو 800 ميكرولتر/دقيقة. كانت قيم HETP الدنيا عند معدل التدفق الأمثل (80 ميكرولتر/دقيقة) لعمود PMP وعمود Ascentis Express RP-Amide هي 2.6 ميكرومتر و3.9 ميكرومتر على التوالي. تشير قيم HETP إلى أن كفاءة فصل عمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي) أفضل بكثير من عمود Ascentis Express RP-Amide المتوفر تجاريًا (100 × 1.8 مم قطر داخلي). يوضح مخطط فان ديمتر في الشكل 7 (أ) أن الانخفاض في قيمة N مع زيادة التدفق ليس مهمًا مقارنةً بـ دراستنا السابقة. تعتمد كفاءة الفصل الأعلى لعمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي) مقارنة بعمود Ascentis Express RP-Amide على التحسينات في شكل الجسيمات وحجمها وإجراءات تعبئة العمود المعقدة المستخدمة في العمل الحالي34.
(أ) رسم فان ديمتر (HETP مقابل السرعة الخطية للطور المتحرك) تم الحصول عليه باستخدام عمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي) في 60/40 ACN/H2O مع 0.1% TFA. (ب) رسم فان ديمتر (HETP مقابل السرعة الخطية للطور المتحرك) تم الحصول عليه باستخدام عمود Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 مم قطر داخلي) في 60/40 ACN/H2O مع 0.1% TFA.
تم تحضير طور ثابت من البوليسترين المضمن القطبي وتقييمه لفصل مخاليط الببتيد الاصطناعية وهضم التربسين لألبومين المصل البشري (HAS) في كروماتوغرافيا سائلة عالية الأداء. يتميز الأداء الكروماتوغرافي لأعمدة PMP لمخاليط الببتيد بكفاءة الفصل والدقة الممتازة. ويرجع تحسين أداء الفصل لأعمدة PMP إلى مجموعة متنوعة من الأسباب، مثل حجم الجسيمات وحجم المسام لجزيئات السيليكا، والتخليق المتحكم فيه للطور الثابت، وتعبئة العمود المعقدة. بالإضافة إلى كفاءة الفصل العالية، فإن الضغط الخلفي المنخفض للعمود عند معدلات التدفق العالية هو ميزة أخرى لهذه المرحلة الثابتة. تتميز أعمدة PMP بإمكانية إعادة إنتاج جيدة ويمكن استخدامها لتحليل مخاليط الببتيد وهضم التربسين لمختلف البروتينات. نعتزم استخدام هذا العمود لفصل المنتجات الطبيعية والمركبات النشطة بيولوجيًا من النباتات الطبية والمستخلصات الفطرية في الكروماتوغرافيا السائلة. في المستقبل، سيتم أيضًا تقييم أعمدة PMP لفصل البروتينات والأجسام المضادة وحيدة النسيلة.
فيلد، ج.ك، يويربي، م.ر، لاو، ج.، ثوجرسن، هـ. وبيترسون، ب. البحث في أنظمة فصل الببتيد باستخدام كروماتوغرافيا الطور العكسي الجزء الأول: تطوير بروتوكول لتوصيف العمود. مجلة الكروماتوغرافيا. 1603، 113-129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
جوميز، ب. وآخرون. الببتيدات النشطة المحسنة المصممة لعلاج الأمراض المعدية. التكنولوجيا الحيوية المتقدمة. 36 (2)، 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
فليغي، ب.، ليسوفسكي، ف.، مارتينيز، ج. وخريستشاتيسكي، م. الببتيدات العلاجية الاصطناعية: العلم والسوق. اكتشاف الأدوية. 15 (1-2) اليوم، 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
شي، ف.، سميث، ر. د. وشين، ي. الكروماتوغرافيا السائلة البروتينية المتقدمة. مجلة الكروماتوغرافيا. أ 1261، 78-90 (2012).
Liu, W. et al. تمكن تقنية الكروماتوغرافيا السائلة المتقدمة-مطيافية الكتلة من دمج التحليلات الأيضية والبروتينية المستهدفة على نطاق واسع. anus.Chim.Acta 1069، 89-97 (2019).
تشيسنات، إس إم وسالزبوري، جيه جيه دور UHPLC في تطوير الأدوية. مجلة العلوم سبتمبر 30 (8)، 1183-1190 (2007).
وو، ن. وكلاوسن، أ.م. الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوغرافيا السائلة تحت الضغط العالي للغاية للفصل السريع. مجلة العلوم سبتمبر 30 (8)، 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
رين، س.أ. وتشيليتشيف، ب. تطبيق كروماتوغرافيا السائل فائقة الأداء في تطوير الأدوية. مجلة الكروماتوغرافيا. 1119(1-2)، 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
جو، هـ. وآخرون. هلاميات مائية متجانسة كبيرة المسام مُحضرة من مستحلبات عالية الطور الداخلي من الزيت في الماء لتنقية الفيروسات المعوية بكفاءة. المجلة الكيميائية البريطانية. 401، 126051 (2020).
شي، ي.، شيانغ، ر.، هورفاث، س. وويلكينز، ج. أ. دور الكروماتوغرافيا السائلة في تحليل البروتينات. مجلة الكروماتوغرافيا. أ 1053(1-2)، 27-36 (2004).
فيكيتي، س.، فيوتي، ج.-ل.، وجيلارمي، د. الاتجاهات الناشئة في فصل الببتيدات والبروتينات العلاجية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة في الطور العكسي: النظرية والتطبيقات. مجلة الصيدلة. العلوم الطبية الحيوية. anus.69، 9-27 (2012).
جيلار، م.، أوليفوفا، ب.، دالي، أ. إي. وجيبلر، ج. سي. الفصل ثنائي الأبعاد للببتيدات باستخدام نظام RP-RP-HPLC باستخدام قيم pH مختلفة في أبعاد الفصل الأول والثاني. مجلة العلوم سبتمبر 28 (14)، 1694-1703 (2005).
فيليتي، س. وآخرون. تم التحقيق في خصائص نقل الكتلة والأداء الحركي لأعمدة الكروماتوغرافيا عالية الكفاءة المعبأة بجسيمات مسامية بالكامل وسطحية من الكربون 18 يقل حجمها عن 2 ميكرومتر. مجلة العلوم سبتمبر 43 (9-10)، 1737-1745 (2020).
بيوفيسانا، س. وآخرون. الاتجاهات الحديثة والتحديات التحليلية في عزل وتحديد والتحقق من صحة الببتيدات النشطة بيولوجيًا في النبات. anus.biological anus.Chemical.410(15)، 3425-3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
مولر، جيه بي وآخرون. المشهد البروتيني لمملكة الحياة. الطبيعة 582 (7813)، 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
دي لوكا، سي وآخرون. المعالجة اللاحقة للببتيدات العلاجية باستخدام الكروماتوغرافيا السائلة التحضيرية. جزيء (بازل، سويسرا) 26 (15)، 4688 (2021).
يانغ، واي. وجينغ، إكس. الكروماتوغرافيا ذات الوضع المختلط وتطبيقاتها على البوليمرات الحيوية. مجلة الكروماتوغرافيا. أ 1218(49)، 8813-8825 (2011).
تشاو، جي، دونج، إكس-واي، وسون، واي. ربيطات لكروماتوغرافيا البروتين ذات الوضع المختلط: المبدأ، والوصف، والتصميم. مجلة التكنولوجيا الحيوية. 144(1)، 3-11 (2009).