نشكركم على زيارة موقع Nature.com. يُعاني متصفحكم من محدودية دعم CSS. للحصول على أفضل تجربة، نوصي باستخدام متصفح مُحدّث (أو تعطيل وضع التوافق في Internet Explorer). في هذه الأثناء، ولضمان استمرار الدعم، سنعرض الموقع بدون أنماط CSS وجافا سكريبت.
تم تحضير جزيئات السيليكا المسامية باستخدام طريقة سول-جل مع بعض التعديلات للحصول على جزيئات ذات مسام كبيرة. تم اشتقاق هذه الجزيئات بواسطة بلمرة نقل السلسلة بالإضافة والتجزئة العكسية (RAFT) باستخدام N-فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات (PMI) والستايرين لتحضير الطور الثابت N-فينيل ماليميد المتداخل مع البوليسترين (PMP). تم تعبئة أعمدة الفولاذ المقاوم للصدأ ذات التجويف الضيق (100 × 1.8 مم) باستخدام التعبئة المعلقة. تم تقييم فصل عمود PMP لمزيج ببتيدي مكون من خمسة ببتيدات (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، ليوسين إنكيفالين) (الأداء الكروماتوغرافي) وهضم التربسين لألبومين مصل الدم البشري (HAS). في ظل ظروف الإذابة المثلى، يكون العدد النظري للصفائح لمزيج الببتيد مرتفعًا للغاية. 280,000 صفيحة/م². عند مقارنة أداء الفصل للعمود المطور مع عمود Ascentis Express RP-Amide التجاري، لوحظ أن أداء الفصل لعمود PMP كان متفوقًا على العمود التجاري من حيث كفاءة الفصل والدقة.
في السنوات الأخيرة، أصبح قطاع الصناعات الدوائية الحيوية سوقًا عالميًا متناميًا مع زيادة كبيرة في حصته السوقية. ومع النمو الهائل لهذا القطاع، تزداد الحاجة إلى تحليل الببتيدات والبروتينات. فبالإضافة إلى الببتيد المستهدف، تتولد العديد من الشوائب أثناء عملية تصنيع الببتيدات، مما يستدعي تنقية كروماتوغرافية للحصول على ببتيدات بالنقاء المطلوب. ويُعد تحليل وتوصيف البروتينات في سوائل الجسم والأنسجة والخلايا مهمة بالغة الصعوبة نظرًا للعدد الكبير من الأنواع التي يُحتمل الكشف عنها في عينة واحدة. وعلى الرغم من أن مطياف الكتلة أداة فعالة لتسلسل الببتيدات والبروتينات، إلا أن حقن هذه العينات في مطياف الكتلة دفعة واحدة لن يُحقق الفصل الأمثل. ويمكن التخفيف من هذه المشكلة بتطبيق فصل كروماتوغرافي سائل (LC) قبل تحليل مطياف الكتلة، مما يُقلل من عدد المواد المراد تحليلها التي تدخل مطياف الكتلة في وقت محدد. علاوة على ذلك، يُمكن أثناء الفصل في الطور السائل تركيز المواد المراد تحليلها في مناطق ضيقة، وبالتالي زيادة تركيزها. هذه المواد التحليلية وتحسين حساسية الكشف باستخدام مطياف الكتلة. لقد تطورت تقنية كروماتوغرافيا السائل (LC) بشكل كبير على مدى العقد الماضي وأصبحت تقنية شائعة في تحليل البروتينات 7،8،9،10.
تُستخدم كروماتوغرافيا السائل ذي الطور المعكوس (RP-LC) على نطاق واسع لتنقية وفصل مخاليط الببتيدات باستخدام السيليكا المعدلة بالأوكتاديسيل (ODS) كطور ثابت^11،12،13. ومع ذلك، لا توفر الأطوار الثابتة في كروماتوغرافيا السائل ذي الطور المعكوس فصلًا مُرضيًا للببتيدات والبروتينات نظرًا لبنيتها المعقدة وطبيعتها الأمفيبية^14،15. لذلك، يلزم استخدام أطوار ثابتة مصممة خصيصًا لتحليل الببتيدات والبروتينات ذات الأجزاء القطبية وغير القطبية للتفاعل مع هذه المواد التحليلية والاحتفاظ بها¹⁶. يمكن أن تكون كروماتوغرافيا الوضع المختلط، التي توفر تفاعلات متعددة الأنماط، بديلاً عن كروماتوغرافيا السائل ذي الطور المعكوس لفصل الببتيدات والبروتينات والمخاليط المعقدة الأخرى. وقد تم تحضير العديد من الأطوار الثابتة للوضع المختلط، واستُخدمت أعمدة معبأة بهذه الأطوار لفصل الببتيدات والبروتينات^{17،18،19،20،21}. تُعدّ الأطوار الثابتة (WAX/RPLC، HILIC/RPLC، التداخل القطبي/RPLC) مناسبة لفصل الببتيدات والبروتينات نظرًا لوجود مجموعات قطبية وغير قطبية فيها^{22،23،24،25،26،27،28}. وبالمثل، تُظهر الأطوار الثابتة المتداخلة القطبية، ذات المجموعات القطبية المرتبطة تساهميًا، قدرة فصل جيدة وانتقائية فريدة للمواد التحليلية القطبية وغير القطبية، إذ يعتمد الفصل على التفاعل بين المادة التحليلية والطور الثابت.^{29،30،31،32} وقد قام تشانغ وآخرون مؤخرًا... قام الباحثون في الدراسة رقم 30 بتحضير طور ثابت من البولي أمينات المنتهية بمجموعة دوديسيل، ونجحوا في فصل الهيدروكربونات، ومضادات الاكتئاب، والفلافونويدات، والنيوكليوسيدات، والإستروجينات، والعديد من المواد التحليلية الأخرى. يحتوي المُقحم القطبي على مجموعات قطبية وغير قطبية، مما يسمح باستخدامه لفصل الببتيدات والبروتينات التي تحتوي على أجزاء كارهة للماء ومحبة للماء. تتوفر الأعمدة المُدمجة قطبيًا (مثل أعمدة C18 المُدمجة بالأميد) تجاريًا تحت الاسم التجاري Ascentis Express RP-Amide columns، ولكن هذه الأعمدة تُستخدم لتحليل الأمين 33 فقط.
في هذه الدراسة، تم تحضير طور ثابت قطبي (بوليسترين مُدمج بـ N-فينيل ماليميد) وتقييمه لفصل الببتيدات ونواتج هضم التربسين لبروتين مصل الألبومين البشري (HSA). تم تحضير الطور الثابت باستخدام الاستراتيجية التالية: أولاً، تم تحضير جزيئات السيليكا المسامية وفقًا للإجراء المذكور في منشورنا السابق مع بعض التعديلات على بروتوكول التحضير. تم ضبط نسبة اليوريا، والبولي إيثيلين جليكول (PEG)، وTMOS، والماء، وحمض الخليك لتحضير جزيئات سيليكا ذات حجم مسام كبير. ثانيًا، تم تصنيع رابطة جديدة، فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات، واستُخدمت لاشتقاق جزيئات السيليكا لتحضير طور ثابت قطبي. تم تعبئة الطور الثابت الناتج في عمود من الفولاذ المقاوم للصدأ (100 × 1.8 مم قطر داخلي) باستخدام مخطط التعبئة الأمثل. تم دعم تعبئة العمود بالاهتزاز الميكانيكي لضمان تكوين طبقة متجانسة داخل العمود. تم تقييم فصل مخاليط الببتيدات المكونة من خمسة أنواع باستخدام عمود معبأ. تم فصل الببتيدات (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، Leucine Enkephalin) وهضم التربسين لألبومين مصل الدم البشري (HSA). لوحظ فصل خليط الببتيدات وهضم التربسين لألبومين مصل الدم البشري بدقة وكفاءة عاليتين. تمت مقارنة أداء الفصل لعمود PMP مع أداء عمود Ascentis Express RP-Amide. لوحظ فصل كل من الببتيدات والبروتينات بشكل جيد وفعال على عمود PMP، الذي كان أكثر كفاءة من عمود Ascentis Express RP-Amide.
تم شراء PEG (بولي إيثيلين جلايكول)، واليوريا، وحمض الأسيتيك، وثلاثي ميثوكسي أورثوسيليكات (TMOS)، وثلاثي ميثيل كلوروسيلان (TMCS)، والتريبسين، وألبومين مصل الإنسان (HSA)، وكلوريد الأمونيوم، واليوريا، وهيكسان ميثيل ثنائي سيلازان (HMDS)، وكلوريد ميثاكريلويل (MC)، والستايرين، و4-هيدروكسي-TEMPO، وبنزويل بيروكسيد (BPO)، وأسيتونيتريل من درجة HPLC (ACN)، والميثانول، و2-بروبانول، والأسيتون من شركة Sigma-Aldrich (سانت لويس، ميزوري، الولايات المتحدة الأمريكية).
تم تقليب مزيج من اليوريا (8 غ)، والبولي إيثيلين جليكول (8 غ)، و8 مل من حمض الأسيتيك بتركيز 0.01 مولار لمدة 10 دقائق، ثم أضيف إليه 24 مل من رباعي ميثوكسي سيلان (TMOS) في ظروف باردة جداً. سُخّن مزيج التفاعل عند 40 درجة مئوية لمدة 6 ساعات، ثم عند 120 درجة مئوية لمدة 8 ساعات في جهاز تعقيم من الفولاذ المقاوم للصدأ. صُب الماء، وجُفّفت المادة المتبقية عند 70 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. طُحنت الكتلة اللينة المجففة طحناً ناعماً في فرن، ثم كُلّست عند 550 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. جُهّزت ثلاث دفعات، وخضعت للتحليل والدراسة لفحص قابلية التكرار في حجم الجسيمات، وحجم المسام، ومساحة السطح.
تم تحضير مركب يحتوي على مجموعة قطبية عن طريق تعديل سطح جزيئات السيليكا باستخدام الليجاند المُصنّع مسبقًا فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات (PCMP)، متبوعًا بالبلمرة الشعاعية مع الستايرين. المرحلة الثابتة للتجمعات وسلاسل البوليسترين. وصف عملية التحضير موضح أدناه.
تم إذابة 200 ملغ من N-فينيل ماليميد و100 ملغ من ميثيل فينيل إيزوسيانات في التولوين الجاف، وأضيف 0.1 مل من 2،2′-أزوأيزوبوتيرونيتريل (AIBN) إلى قارورة التفاعل لتحضير بوليمر فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات (PMCP). تم تسخين الخليط عند 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات، ثم تم ترشيحه وتجفيفه في فرن عند 40 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
تم تشتيت جزيئات السيليكا المجففة (2 غرام) في التولوين الجاف (100 مل)، ثم تم تحريكها ومعالجتها بالموجات فوق الصوتية في قارورة ذات قاع مستدير سعة 500 مل لمدة 10 دقائق. تم إذابة PMCP (10 ملغ) في التولوين وإضافته قطرة قطرة إلى قارورة التفاعل باستخدام قمع التنقيط. تم تسخين المزيج تحت الارتداد عند 100 درجة مئوية لمدة 8 ساعات، ثم تم ترشيحه وغسله بالأسيتون وتجفيفه عند 60 درجة مئوية لمدة 3 ساعات. بعد ذلك، تم إذابة جزيئات السيليكا المرتبطة بـ PMCP (100 غرام) في التولوين (200 مل) وأضيف 4-هيدروكسي-TEMPO (2 مل) بوجود 100 ميكرولتر من ثنائي بيوتيل القصدير ثنائي اللورات كمحفز. تم تحريك المزيج عند 50 درجة مئوية لمدة 8 ساعات، ثم تم ترشيحه وتجفيفه عند 50 درجة مئوية لمدة 3 ساعات.
تم تشتيت الستايرين (1 مل)، وبنزويل بيروكسيد (0.5 مل)، وجزيئات السيليكا المرتبطة بـ TEMPO-PMCP (1.5 غ) في التولوين، ثم تم تمرير غاز النيتروجين في الوسط. أُجريت عملية بلمرة الستايرين عند درجة حرارة 100 درجة مئوية لمدة 12 ساعة. غُسل الناتج بالميثانول وجُفف عند درجة حرارة 60 درجة مئوية طوال الليل. يوضح الشكل 1 مخطط التفاعل العام.
أُزيلت الغازات من العينات عند درجة حرارة 393 كلفن لمدة ساعة واحدة للحصول على ضغط متبقٍ أقل من 10⁻³ تور. استُخدمت كمية النيتروجين الممتص عند ضغط نسبي P/P₀ = 0.99 لتحديد الحجم الكلي للمسام. فُحص شكل جزيئات السيليكا المجردة والمرتبطة بروابط ليجاندية باستخدام المجهر الإلكتروني الماسح (هيتاشي هاي تكنولوجيز، طوكيو، اليابان). وُضعت العينات المجففة (جزيئات السيليكا المجردة والمرتبطة بروابط ليجاندية) على عمود من الألومنيوم باستخدام شريط لاصق من الكربون. طُلي الذهب على العينات باستخدام جهاز طلاء بالترذيذ Q150T، ورُسبت طبقة من الذهب بسمك 5 نانومتر على العينات. يُحسّن هذا من كفاءة العملية باستخدام فولتيات منخفضة ويوفر ترذيذًا باردًا دقيق الحبيبات. استُخدم محلل العناصر Flash EA1112 من شركة Thermo Electron (والثام، ماساتشوستس، الولايات المتحدة الأمريكية) للتحليل العنصري. كما استُخدم جهاز قياس حجم الجسيمات Mastersizer 2000 من شركة Malvern (وسترشاير، المملكة المتحدة). استُخدم جهاز تحليل الحجم للحصول على توزيع حجم الجسيمات. تم تشتيت جزيئات السيليكا العارية وجزيئات السيليكا المرتبطة بالليجاند (5 ملغ لكل منهما) في 5 مل من الإيزوبروبانول، وخضعت للمعالجة بالموجات فوق الصوتية لمدة 10 دقائق، ثم خُضّت لمدة 5 دقائق، ووُضعت على المنصة البصرية لجهاز Mastersizer. أُجري التحليل الحراري الوزني بمعدل 5 درجات مئوية في الدقيقة على مدى درجة حرارة من 30 إلى 800 درجة مئوية.
تم تعبئة أعمدة الفولاذ المقاوم للصدأ ذات التجويف الضيق والمبطنة بالزجاج بأبعاد (100 × 1.8 مم id) باستخدام طريقة التعبئة بالملاط، مع تطبيق نفس الإجراء المستخدم في المرجع. 31. تم توصيل عمود من الفولاذ المقاوم للصدأ (مبطن بالزجاج، 100 × 1.8 مم قطر داخلي) مزود بوصلة مخرج تحتوي على مرشح مسامي 1 ميكرومتر، بجهاز تعبئة معلق (Alltech، ديرفيلد، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية). يتم تحضير معلق الطور الثابت بتعليق 150 ملغ من الطور الثابت في 1.2 مل من الميثانول، ثم يُرسل إلى عمود التخزين. استُخدم الميثانول كمذيب للمعلق ومذيب دافع. يُملأ العمود بالتتابع بتطبيق ضغوط 100 ميجا باسكال لمدة 10 دقائق، و80 ميجا باسكال لمدة 15 دقيقة، و60 ميجا باسكال لمدة 30 دقيقة. أثناء التعبئة، تم تطبيق اهتزاز ميكانيكي باستخدام جهازي اهتزاز لعمود كروماتوغرافيا الغاز (Alltech، ديرفيلد، إلينوي، الولايات المتحدة الأمريكية) لضمان تعبئة متجانسة للعمود. يُغلق جهاز التعبئة المعلق ويُحرر الضغط ببطء لمنع أي تلف داخل العمود. يُفصل العمود عن وحدة التعبئة المعلقة ويُوصل بعمود آخر. تركيبها على المدخل وعلى نظام LC للتحقق من أدائها.
تم تركيب مضخة كروماتوغرافيا سائلة (10AD Shimadzu، اليابان)، وحاقن (Valco (الولايات المتحدة الأمريكية) C14 W.05) بحلقة حقن سعتها 50 نانولتر، وجهاز إزالة الغازات من الغشاء (Shimadzu DGU-14A)، ونافذة شعرية للأشعة فوق البنفسجية والمرئية، وكاشف خاص لجهاز كروماتوغرافيا سائلة دقيقة (UV-2075)، وأعمدة دقيقة مبطنة بالزجاج. استُخدمت أنابيب توصيل قصيرة وضيقة جدًا لتقليل تأثير اتساع نطاق العمود الإضافي. بعد التغليف، تم تركيب شعيرات دموية (قطر داخلي 50 ميكرومتر) وشعيرات وصلة مخفضة (50 ميكرومتر) عند مخرج وصلة التخفيض (1/16 بوصة). تم جمع البيانات ومعالجتها كروماتوغرافيًا باستخدام برنامج Multichro 2000. تم رصد الامتصاص عند 254 نانومتر، واختُبرت المواد المراد تحليلها باستخدام امتصاص الأشعة فوق البنفسجية. تم تحليل البيانات الكروماتوغرافية بواسطة برنامج OriginPro8 (نورثامبتون، ماساتشوستس).
يُخلط 3 ملغ من الألبومين المستخلص من مصل الدم البشري، مسحوق مجفف بالتجميد، ≥ 96% (حسب نتائج الفصل الكهربائي على هلام الأغاروز)، مع 1.5 ملغ من التربسين، و1 مل من اليوريا بتركيز 4.0 مولار، و1 مل من بيكربونات الأمونيوم بتركيز 0.2 مولار. يُحرّك المحلول لمدة 10 دقائق ويُحفظ في حمام مائي عند درجة حرارة 37 درجة مئوية لمدة 6 ساعات، ثم يُوقف التفاعل بإضافة 1 مل من حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك بتركيز 0.1%. يُرشّح المحلول ويُحفظ في درجة حرارة أقل من 4 درجات مئوية.
تم تقييم فصل مخاليط الببتيدات وهضم التربسين لبروتين مصل الألبومين البشري (HSA) بشكل منفصل على أعمدة PMP. تحقق من فصل خليط الببتيدات وهضم التربسين لبروتين مصل الألبومين البشري (HSA) بواسطة عمود PMP وقارن النتائج بعمود Ascentis Express RP-Amide. يتم حساب عدد الصفائح النظري كما يلي:
تُظهر الصورة 2 صورًا مجهرية إلكترونية ماسحة لجزيئات السيليكا المجردة وجزيئات السيليكا المرتبطة بروابط ليجاندية. تُظهر صور جزيئات السيليكا المجردة (أ، ب) أنها، على عكس دراساتنا السابقة، كروية الشكل، بينما تكون جزيئات السيليكا المرتبطة بروابط ليجاندية (ج، د) مستطيلة أو ذات تناظر غير منتظم. سطح جزيئات السيليكا المرتبطة بروابط ليجاندية أكثر نعومة من سطح جزيئات السيليكا المجردة، وهو ما قد يُعزى إلى تغطية سلاسل البوليسترين لسطح جزيئات السيليكا.
صور مجهر المسح الإلكتروني لجزيئات السيليكا المجردة (A، B) وجزيئات السيليكا المرتبطة بالليجاند (C، D).
يوضح الشكل 3 (أ) توزيع أحجام جسيمات السيليكا المجردة وجسيمات السيليكا المرتبطة بالليجاند. وأظهرت منحنيات توزيع حجم الجسيمات، المحسوبة بناءً على الحجم، زيادة في حجم جسيمات السيليكا بعد التعديل الكيميائي (الشكل 3 أ). ويقارن الجدول 1 (أ) بيانات توزيع حجم جسيمات السيليكا من هذه الدراسة مع الدراسة السابقة. يبلغ حجم الجسيمات المحسوب بناءً على الحجم، d(0.5)، لـ PMP 3.36 ميكرومتر، مقارنةً بدراستنا السابقة التي بلغت فيها قيمة ad(0.5) 3.05 ميكرومتر (جسيمات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين)³⁴. تميزت هذه الدفعة بتوزيع أضيق لحجم الجسيمات مقارنةً بدراستنا السابقة، وذلك بسبب اختلاف نسب PEG واليوريا وTMOS وحمض الأسيتيك في خليط التفاعل. حجم جسيمات طور PMP أكبر قليلاً من حجم جسيمات طور جسيمات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين التي درسناها سابقًا. وهذا يعني أن المعالجة السطحية للسيليكا الجسيمات التي تحتوي على الستايرين فقط ترسب طبقة من البوليسترين (0.97 ميكرومتر) على سطح السيليكا، بينما في طور PMP كان سمك الطبقة 1.38 ميكرومتر.
توزيع حجم الجسيمات (أ) وتوزيع حجم المسام (ب) لجسيمات السيليكا المجردة وجسيمات السيليكا المرتبطة بالليجاند.
يُبيّن الجدول 1 (ب) حجم المسام، وحجم المسام الكلي، ومساحة سطح جزيئات السيليكا في هذه الدراسة. ويُظهر الشكل 3 (ب) منحنيات توزيع حجم المسام لجزيئات السيليكا غير المُعدّلة وجزيئات السيليكا المرتبطة بروابط كيميائية. وتُقارن هذه النتائج بدراستنا السابقة. يبلغ حجم المسام لجزيئات السيليكا غير المُعدّلة 310، بينما يبلغ حجم المسام لجزيئات السيليكا المرتبطة بروابط كيميائية 241، مما يُشير إلى انخفاض حجم المسام بمقدار 69 بعد التعديل الكيميائي، كما هو موضح في الجدول 1 (ب)، ويُبيّن الشكل 3 (ب) تغير المنحنى. وبالمثل، انخفض حجم المسام لجزيئات السيليكا من 0.67 إلى 0.58 سم³/غ بعد التعديل الكيميائي. تبلغ مساحة السطح النوعية لجزيئات السيليكا المدروسة حاليًا 116 م²/غ، وهي قيمة مُقاربة لدراستنا السابقة (124 م²/غ). كما هو موضح في الجدول 1 (ب)، تبلغ مساحة سطح جزيئات السيليكا (م²/غ) كما انخفضت من 116 م2/غ إلى 105 م2/غ بعد التعديل الكيميائي.
تُظهر نتائج التحليل العنصري للطور الثابت في الجدول 2. تبلغ نسبة الكربون في الطور الثابت الحالي 6.35%، وهي أقل من نسبة الكربون في دراستنا السابقة (جسيمات السيليكا المرتبطة بالبوليسترين، 7.93% و10.21% على التوالي).⁴² ويعود انخفاض نسبة الكربون في الطور الثابت الحالي إلى استخدام بعض الروابط القطبية، مثل فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات (PCMP) و4-هيدروكسي-TEMPO، بالإضافة إلى الستايرين في تحضيره. تبلغ النسبة المئوية الوزنية للنيتروجين في الطور الثابت الحالي 2.21%، مقارنةً بـ 0.1735% و0.85% وزناً في الدراسات السابقة على التوالي. وهذا يعني أن النسبة المئوية الوزنية للنيتروجين أعلى في الطور الثابت الحالي بسبب استخدام فينيل ماليميد. وبالمثل، بلغت نسب الكربون في المنتجين (4) و(5) 2.7% و 2.9% على التوالي، بينما كانت نسبة الكربون في المنتج النهائي (6) 6.35%، كما هو موضح في الجدول 2. تم التحقق من فقدان الوزن باستخدام الطور الثابت PMP، ويظهر منحنى TGA في الشكل 4. يُظهر منحنى TGA فقدانًا في الوزن بنسبة 8.6%، وهو ما يتوافق بشكل جيد مع نسبة الكربون (6.35%) لأن الروابط لا تحتوي على الكربون فقط ولكن أيضًا على النيتروجين والأكسجين والهيدروجين.
تم اختيار رابطة فينيل ماليميد-ميثيل فينيل إيزوسيانات لتعديل سطح جزيئات السيليكا لاحتوائها على مجموعات فينيل ماليميد وفينيل إيزوسيانات قطبية. تتفاعل مجموعات فينيل إيزوسيانات مع الستايرين عبر بلمرة الجذور الحرة الحية. والسبب الثاني هو إدخال مجموعة ذات تفاعل معتدل مع المادة المراد تحليلها، مع عدم وجود تفاعل كهروستاتيكي قوي بينها وبين الطور الثابت، نظرًا لأن جزء فينيل ماليميد لا يحمل شحنة افتراضية عند درجة الحموضة الطبيعية. يمكن التحكم في قطبية الطور الثابت من خلال الكمية المثلى من الستايرين وزمن تفاعل بلمرة الجذور الحرة. تُعد الخطوة الأخيرة من التفاعل (بلمرة الجذور الحرة) حاسمة، إذ يمكنها تغيير قطبية الطور الثابت. أُجري تحليل عنصري للتحقق من محتوى الكربون في هذه الأطوار الثابتة. لوحظ أن زيادة كمية الستايرين وزمن التفاعل تزيد من محتوى الكربون في الطور الثابت، والعكس صحيح. تحتوي الأطوار الثابتة المُحضّرة بتراكيز مختلفة من الستايرين على محتوى كربوني مختلف. التحميلات. مرة أخرى، قم بتحميل هذه الأطوار الثابتة في أعمدة من الفولاذ المقاوم للصدأ وتحقق من أدائها الكروماتوغرافي (الانتقائية، الفصل، قيمة N، إلخ). بناءً على هذه التجارب، تم اختيار تركيبة محسّنة لإعداد الطور الثابت PMP لضمان التحكم في القطبية والاحتفاظ الجيد بالمادة المراد تحليلها.
كما تم تقييم خمسة مخاليط من الببتيدات (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، leucine enkephalin) باستخدام عمود PMP باستخدام طور متحرك؛ تم استخدام مزيج من الأسيتونيتريل والماء بنسبة 60/40 (حجم/حجم) مع إضافة 0.1% من حمض ثلاثي فلورو الأسيتيك (TFA) بمعدل تدفق 80 ميكرولتر/دقيقة. في ظل ظروف الإذابة المثلى، يبلغ عدد الصفائح النظري (N) لكل عمود (قطر داخلي 1.8 مم × 100 مم) 20,000 ± 100 (200,000 صفيحة/م²). يوضح الجدول 3 قيم N لأعمدة PMP الثلاثة، وتظهر مخططات الكروماتوغرافيا في الشكل 5A. عند إجراء تحليل سريع على عمود PMP بمعدل تدفق عالٍ (700 ميكرولتر/دقيقة)، تم فصل خمسة ببتيدات خلال دقيقة واحدة، وكانت قيم N جيدة جدًا، حيث بلغت 13,500 ± 330 لكل عمود (قطر داخلي 1.8 مم × 100 مم)، وهو ما يعادل 135,000 صفيحة/م² (الشكل 5B). ثلاثة أعمدة متطابقة الحجم (قطر داخلي 1.8 مم × 100 مم). تم تعبئة الأعمدة بثلاث دفعات مختلفة من الطور الثابت PMP للتحقق من قابلية التكرار. سُجّل تركيز المادة المُحللة لكل عمود باستخدام ظروف الإذابة المثلى وعدد الصفائح النظرية N ووقت الاحتفاظ لفصل نفس خليط الاختبار على كل عمود. تُظهر بيانات قابلية التكرار لأعمدة PMP في الجدول 4. تتوافق قابلية تكرار عمود PMP بشكل جيد مع قيم انحراف معياري نسبي منخفضة جدًا، كما هو موضح في الجدول 3.
فصل خليط الببتيد على عمود PMP (B) وعمود Ascentis Express RP-Amide (A)؛ الطور المتحرك 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1٪)، أبعاد عمود PMP (100 × 1.8 مم id)؛ ترتيب فصل المركبات: 1 (Gly-Tyr)، 2 (Gly-Leu-Tyr)، 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg)، 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) و 5 (حمض الليوسين) إنكيفالين)).
تم تقييم عمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي) لفصل نواتج الهضم التربسيني لألبومين مصل الدم البشري باستخدام كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء. يوضح مخطط الكروماتوغرافيا في الشكل 6 أن العينة مفصولة جيدًا وأن الدقة عالية جدًا. تم تحليل نواتج هضم ألبومين مصل الدم البشري باستخدام معدل تدفق 100 ميكرولتر/دقيقة، وطور متحرك مكون من 70/30 أسيتونيتريل/ماء و0.1% حمض ثلاثي فلورو أسيتيك. كما هو موضح في مخطط الكروماتوغرافيا (الشكل 6)، تم تقسيم ناتج هضم ألبومين مصل الدم البشري إلى 17 قمة، كل منها يمثل 17 ببتيدًا. تم حساب كفاءة فصل كل قمة في ناتج هضم ألبومين مصل الدم البشري، والنتائج موضحة في الجدول 5.
تم فصل هضم التربسين لـ HSA (100 × 1.8 مم id) على عمود PMP؛ معدل التدفق (100 ميكرولتر/دقيقة)، الطور المتحرك 60/40 أسيتونيتريل/ماء مع 0.1% TFA.
حيث L هو طول العمود، وη هي لزوجة الطور المتحرك، وΔP هو ضغط العمود الخلفي، وu هي السرعة الخطية للطور المتحرك. بلغت نفاذية عمود PMP 2.5 × 10⁻¹⁴ م²، ومعدل التدفق 25 ميكرولتر/دقيقة، واستُخدم مزيج من الأسيتونيتريل والماء بنسبة 60/40 حجم/حجم. كانت نفاذية عمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي) مماثلة لتلك المذكورة في دراستنا السابقة (المرجع 34). أما نفاذية العمود المعبأ بجزيئات مسامية سطحية فهي: 1.7 × 10⁻¹⁵ لجزيئات قطرها 1.3 ميكرومتر، و3.1 × 10⁻¹⁵ لجزيئات قطرها 1.7 ميكرومتر، و5.2 × 10⁻¹⁵ و2.5 × 10⁻¹⁴ م² لجزيئات قطرها 2.6 ميكرومتر. بالنسبة لجزيئات قطرها 5 ميكرومتر 43. لذلك، فإن نفاذية طور PMP مماثلة لنفاذية جسيمات الغلاف واللب بحجم 5 ميكرومتر.
حيث Wx هو وزن العمود المعبأ بالكلوروفورم، وWy هو وزن العمود المعبأ بالميثانول، وρ هي كثافة المذيب. تبلغ كثافة الميثانول (ρ = 0.7866) وكثافة الكلوروفورم (ρ = 1.484). كانت المسامية الكلية لأعمدة جزيئات السيليكا-C18 (100 × 1.8 مم قطر داخلي) 34 وأعمدة C18-يوريا 31 التي درسناها سابقًا 0.63 و0.55 على التوالي. هذا يعني أن وجود روابط اليوريا يقلل من نفاذية الطور الثابت. من ناحية أخرى، تبلغ المسامية الكلية لعمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي) 0.60. نفاذية أعمدة PMP أقل من نفاذية الأعمدة المعبأة بجزيئات السيليكا المرتبطة بـ C18 لأن الأطوار الثابتة من نوع C18 ترتبط روابط C18 بجزيئات السيليكا على شكل سلاسل خطية، بينما في الأطوار الثابتة من نوع البوليسترين، تتشكل طبقة بوليمرية سميكة نسبيًا حولها. في تجربة نموذجية، تُحسب مسامية العمود على النحو التالي:
يوضح الشكلان 7أ و7ب عمود PMP (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) وعمود Ascentis Express RP-Amide (قطر داخلي 100 × 1.8 مم) باستخدام نفس ظروف الإذابة (أي 60/40 أسيتونيتريل/ماء و0.1% حمض ثلاثي فلورو أسيتيك) في مخطط فان ديمتر. تم تحضير مخاليط ببتيدية مختارة (Gly-Tyr، Gly-Leu-Tyr، Gly-Gly-Tyr-Arg، Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg، Leucine Enkephalin) بحجم 20 ميكرولتر/دقيقة. الحد الأدنى لمعدل التدفق لكلا العمودين هو 800 ميكرولتر/دقيقة. كانت قيم HETP الدنيا عند معدل التدفق الأمثل (80 ميكرولتر/دقيقة) لعمود PMP وعمود Ascentis Express RP-Amide هي 2.6 ميكرومتر و3.9 ميكرومتر على التوالي. تشير قيم HETP إلى أن كفاءة فصل عمود PMP (100 × 1.8 مم قطر داخلي) أفضل بكثير من عمود Ascentis Express RP-Amide المتوفر تجاريًا (100 × 1.8 مم قطر داخلي). يوضح مخطط فان ديمتر في الشكل 7 (أ) أن الانخفاض في قيمة N مع زيادة التدفق ليس كبيرًا مقارنةً بنتائجنا السابقة. تستند كفاءة الفصل الأعلى لعمود PMP (100 × 1.8 مم id) مقارنة بعمود Ascentis Express RP-Amide إلى التحسينات في شكل الجسيمات وحجمها وإجراءات تعبئة الأعمدة المعقدة المستخدمة في العمل الحالي34.
(أ) مخطط فان ديمتر (HETP مقابل السرعة الخطية للطور المتحرك) تم الحصول عليه باستخدام عمود PMP (100 × 1.8 مم id) في 60/40 ACN/H2O مع 0.1% TFA. (ب) مخطط فان ديمتر (HETP مقابل السرعة الخطية للطور المتحرك) تم الحصول عليه باستخدام عمود Ascentis Express RP-Amide (100 × 1.8 مم id) في 60/40 ACN/H2O مع 0.1% TFA.
تم تحضير طور ثابت من البوليسترين المطعّم بقطبية وتقييمه لفصل مخاليط الببتيدات الاصطناعية وهضم التربسين لألبومين مصل الدم البشري (HAS) في كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء. يتميز أداء أعمدة PMP الكروماتوغرافي لمخاليط الببتيدات بكفاءة فصل ودقة عاليتين. ويعود تحسن أداء الفصل لأعمدة PMP إلى عدة أسباب، منها حجم جسيمات السيليكا وحجم مسامها، والتحكم في تصنيع الطور الثابت، والتعبئة المعقدة للعمود. إضافةً إلى كفاءة الفصل العالية، يُعد انخفاض ضغط العمود الخلفي عند معدلات التدفق العالية ميزة أخرى لهذا الطور الثابت. تُظهر أعمدة PMP قابلية جيدة للتكرار، ويمكن استخدامها لتحليل مخاليط الببتيدات وهضم التربسين لمختلف البروتينات. نعتزم استخدام هذا العمود لفصل المنتجات الطبيعية والمركبات النشطة بيولوجيًا من النباتات الطبية والمستخلصات الفطرية في كروماتوغرافيا السائل. في المستقبل، سيتم أيضًا تقييم أعمدة PMP لفصل البروتينات والأجسام المضادة وحيدة النسيلة.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. بحث حول أنظمة فصل الببتيد بواسطة كروماتوغرافيا الطور المعكوس الجزء الأول: تطوير بروتوكول توصيف العمود. مجلة الكروماتوغرافيا. 1603، 113-129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
غوميز، ب. وآخرون. ببتيدات نشطة محسنة مصممة لعلاج الأمراض المعدية. التكنولوجيا الحيوية المتقدمة. 36 (2)، 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. الببتيدات العلاجية الاصطناعية: العلم والسوق. اكتشاف الأدوية. 15 (1-2) اليوم، 40-56. https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Advanced Proteomic Liquid Chromatography.J. Chromatography.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al.Advanced liquid chromatography-mass specmetry enable the integration of broadly target metabolomics and proteomics.anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
تشيسنات، إس إم وسالزبوري، جيه جيه دور UHPLC في تطوير الأدوية. مجلة علوم الفصل 30 (8)، 1183-1190 (2007).
وو، ن. وكلاوسن، أ.م. الجوانب الأساسية والعملية للكروماتوغرافيا السائلة ذات الضغط العالي للغاية للفصل السريع. مجلة علوم الفصل 30 (8)، 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. تطبيق كروماتوغرافيا السائل عالي الأداء في تطوير الأدوية. مجلة الكروماتوغرافيا. 1119(1-2)، 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al.Monolithic macroporous hydrogels prepared from oil-in-water high internal phase emulsions for efficient purification of enteroviruses.Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA دور الكروماتوغرافيا السائلة في علم البروتينات. مجلة الكروماتوغرافيا. أ 1053 (1-2)، 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L.& Guillarme, D. الاتجاهات الناشئة في فصل الببتيدات والبروتينات العلاجية باستخدام كروماتوغرافيا السائل ذات الطور العكسي: النظرية والتطبيقات. مجلة الصيدلة والعلوم الطبية الحيوية. العدد 69، 9-27 (2012).
جيلار، م.، أوليفوفا، ب.، دالي، أ.إ. وجيبلر، ج.س. الفصل ثنائي الأبعاد للببتيدات باستخدام نظام RP-RP-HPLC باستخدام قيم pH مختلفة في بُعدي الفصل الأول والثاني. مجلة علوم الفصل 28 (14)، 1694-1703 (2005).
تم التحقيق في خصائص نقل الكتلة والأداء الحركي لأعمدة الكروماتوغرافيا عالية الكفاءة المعبأة بجزيئات C18 ذات حجم أقل من 2 ميكرومتر، سواء كانت مسامية كليًا أو سطحيًا. مجلة علوم الفصل 43 (9-10)، 1737-1745 (2020).
بيوفيسانا، إس. وآخرون. الاتجاهات الحديثة والتحديات التحليلية في عزل وتحديد والتحقق من صحة الببتيدات النشطة بيولوجيًا في النباتات. anus.biological anus.Chemical.410(15)، 3425-3444. https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
مولر، جيه بي وآخرون. المشهد البروتيني لمملكة الحياة. الطبيعة 582 (7813)، 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. المعالجة اللاحقة للببتيدات العلاجية بواسطة كروماتوغرافيا السائل التحضيرية. Molecule (Basel, Switzerland) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Mixed-mode chromatography and its application to biopolymers.J. Chromatography.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y.& Sun, Y. Ligands for mixed-mode protein chromatography: principle, characterization, and design.J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).