Hatur nuhun parantos nganjang ka Nature.com. Versi browser anu anjeun anggo gaduh dukungan CSS anu terbatas. Pikeun pangalaman anu pangsaéna, kami nyarankeun anjeun nganggo browser anu diénggalan (atanapi mareuman modeu kompatibilitas dina Internet Explorer). Samentawis waktos, pikeun mastikeun dukungan anu terus-terusan, kami bakal nampilkeun situs tanpa gaya sareng JavaScript.
Partikel silika berpori disiapkeun ku metode sol-gel kalayan sababaraha modifikasi pikeun kéngingkeun partikel makropori. Partikel-partikel ieu diderivatisasi ku polimérisasi transfer ranté fragmentasi tambahan anu tiasa dibalikkeun (RAFT) sareng N-fenilmaleimida-metilvinilisosianat (PMI) sareng stiréna pikeun nyiapkeun interkalasi N-fenilmaleimida tina fase stasioner polistirena (PMP). Kolom stainless steel sempit (100 × 1,8 mm id) dipak ku packing slurry. Pamisahan kolom PMP anu dievaluasi tina campuran péptida anu diwangun ku lima péptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusin enkephalin) kinerja kromatografi) sareng pencernaan tripsin tina albumin sérum manusa (HAS). Dina kaayaan élusi optimal, jumlah pelat téoritis tina campuran péptida dugi ka 280.000 pelat/m². Ngabandingkeun kinerja pamisahan kolom anu dimekarkeun sareng Ascentis komérsial Kolom RP-Amida Ekspres, katitén yén kinerja pamisahan kolom PMP langkung unggul tibatan kolom komérsial dina hal efisiensi sareng résolusi pamisahan.
Dina sababaraha taun ka pengker, industri biofarmasi parantos janten pasar global anu ngembang kalayan paningkatan anu substansial dina pangsa pasar. Kalayan kamekaran industri biofarmasi anu ngabeledug1,2,3, analisis péptida sareng protéin dipikahoyong pisan. Salian ti péptida target, sababaraha pangotor dihasilkeun nalika sintésis péptida, sahingga meryogikeun purifikasi kromatografi pikeun kéngingkeun péptida kalayan kamurnian anu dipikahoyong. Analisis sareng karakterisasi protéin dina cairan awak, jaringan sareng sél mangrupikeun tugas anu nangtang pisan kusabab seueurna spésiés anu berpotensi dideteksi dina hiji sampel. Sanaos spéktrométri massa mangrupikeun alat anu efektif pikeun sekuensing péptida sareng protéin, upami sampel sapertos kitu disuntikkeun kana spéktrométer massa dina hiji pass, pamisahan moal idéal. Masalah ieu tiasa dikirangan ku ngalaksanakeun pamisahan kromatografi cair (LC) sateuacan analisis MS, anu bakal ngirangan jumlah analit anu lebet kana spéktrométer massa dina waktos anu ditangtukeun4,5,6. Salaku tambahan, salami pamisahan fase cair, analit tiasa difokuskeun di daérah anu sempit, ku kituna konsentrasi analit ieu sareng ningkatkeun sensitivitas deteksi MS. Kromatografi cair (LC) parantos kamajuan anu signifikan salami dasawarsa ka pengker sareng parantos janten téknik anu populér dina analisis protéomik7,8,9,10.
Kromatografi cair fase tibalik (RP-LC) seueur dianggo pikeun purifikasi sareng pamisahan campuran péptida nganggo silika anu dimodifikasi oktadesil (ODS) salaku fase stasioner11,12,13. Nanging, fase stasioner RP henteu nyayogikeun pamisahan péptida sareng protéin anu nyugemakeun kusabab struktur anu rumit sareng sipat amfifilikna 14,15. Ku alatan éta, fase stasioner anu dirancang khusus diperyogikeun pikeun nganalisis péptida sareng protéin kalayan gugus polar sareng non-polar pikeun berinteraksi sareng nahan analit ieu16. Kromatografi mode campuran, anu nyayogikeun interaksi multimodal, tiasa janten alternatif pikeun RP-LC pikeun pamisahan péptida, protéin, sareng campuran kompléks anu sanés. Sababaraha fase stasioner mode campuran parantos disiapkeun, sareng kolom anu dieusi ku fase ieu parantos dianggo pikeun pamisahan péptida sareng protéin17,18,19,20,21. Fase stasioner mode campuran (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, interkalasi polar/RPLC) cocog pikeun pamisahan péptida sareng protéin kusabab ayana duanana polar sareng Gugus non-polar22,23,24,25,26,27,28. Nya kitu deui, fase stasioner interkalasi polar kalayan gugus polar anu kabeungkeut sacara kovalén nunjukkeun kakuatan pamisahan anu saé sareng selektivitas anu unik pikeun analit polar sareng non-polar, sabab pamisahan gumantung kana interaksi antara analit sareng fase stasioner. Interaksi multimodal 29, 30, 31, 32. Nembe waé, Zhang et al. 30 nyiapkeun fase stasioner poliamina anu diakhiri dodesil sareng suksés misahkeun hidrokarbon, antidepresan, flavonoid, nukléosida, éstrogén, sareng sababaraha analit sanésna. Interkalator polar ngagaduhan gugus polar sareng non-polar, janten tiasa dianggo pikeun misahkeun péptida sareng protéin anu ngagaduhan gugus hidrofobik sareng hidrofilik. Kolom anu dipasang polar (contona, kolom C18 anu dipasang amida) sayogi sacara komersil kalayan nami dagang kolom Ascentis Express RP-Amide, tapi kolom ieu dianggo pikeun analisis amina 33 hungkul.
Dina panilitian ayeuna, fase stasioner anu dipasang dina polar (polistirena anu dipasang dina N-fenilmaleimida) disiapkeun sareng dievaluasi pikeun misahkeun péptida sareng dicerna tripsin tina HSA. Fase stasioner disiapkeun nganggo strategi ieu di handap. Partikel silika pori disiapkeun numutkeun prosedur anu dipasihkeun dina publikasi kami sateuacana kalayan sababaraha modifikasi kana protokol persiapan. Babandingan uréa, polietilen glikol (PEG), TMOS, asam asetat cai disaluyukeun pikeun nyiapkeun partikel silika kalayan ukuran pori anu ageung. Kadua, ligan énggal, fenilmaleimida-metil vinil isosianat, disintésis sareng dianggo pikeun ngadérivatisasi partikel silika pikeun nyiapkeun fase stasioner anu dipasang dina polar. Fase stasioner anu dihasilkeun dipak kana kolom stainless steel (100 × 1,8 mm id) nganggo skéma pengepakan anu dioptimalkeun. Pengepakan kolom dibantuan ku geteran mékanis pikeun mastikeun ranjang homogen kabentuk dina kolom. Évaluasi pamisahan kolom anu dipak tina campuran péptida anu diwangun ku lima péptida; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leusin Enkephalin) sareng digest Tripsin tina albumin sérum manusa (HAS). Campuran péptida sareng digest tripsin tina HSA katingali misah kalayan résolusi sareng efisiensi anu saé. Kinerja pamisahan kolom PMP dibandingkeun sareng kolom Ascentis Express RP-Amide. Duanana péptida sareng protéin katingali leyur kalayan saé sareng efisien dina kolom PMP, anu langkung efisien tibatan kolom Ascentis Express RP-Amide.
PEG (Polyethylene Glycol), Urea, Asam Asetat, Trimethoxy Orthosilicate (TMOS), Trimethyl Chlorosilane (TMCS), Tripsin, Human Serum Albumin (HSA), Amonium Klorida, Urea, Hexane Methyldisilazane (HMDS), Methacryloyl Chloride (MC), Stirene, 4-Hydroxy-TEMPO, Benzoyl Peroxide (BPO), HPLC Grade Acetonitrile (ACN), Metanol, 2-Propanol, sareng Acetone Dibeli ti Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA).
Campuran uréa (8 g), polietilen glikol (8 g), sareng 8 mL asam asetat 0,01 N diaduk salami 10 menit, teras 24 mL TMOS ditambahkeun kana éta dina kaayaan tiis sapertos és. Campuran réaksi dipanaskeun dina suhu 40°C salami 6 jam teras dina suhu 120°C salami 8 jam dina autoklaf stainless steel. Cai dikucurkeun sareng bahan sésa dikeringkeun dina suhu 70°C salami 12 jam. Massa lemes anu garing digiling lemes dina oven sareng dikalsinasi dina suhu 550°C salami 12 jam. Tilu angkatan disiapkeun sareng dicirikeun pikeun nalungtik réproduksibilitas dina ukuran partikel, ukuran pori sareng luas permukaan.
Ku cara modifikasi permukaan partikel silika nganggo ligan fenilmaleimida-metilvinilisosianat (PCMP) anu tos disintésis sateuacanna dituturkeun ku polimérisasi radial nganggo stiréna, sanyawa anu ngandung gugus polar disiapkeun. Fase stasioner pikeun agregat sareng ranté polistirena. Prosés persiapan dijelaskeun di handap.
N-fenilmaleimida (200 mg) sareng metil vinil isosianat (100 mg) dileyurkeun dina toluéna garing, teras 0,1 mL 2,2′-azoisobutironitril (AIBN) ditambahkeun kana labu réaksi pikeun nyiapkeun kopolimer fenilmaleimida-metil vinil isosianat (PMCP). Campuran ieu dipanaskeun dina suhu 60°C salami 3 jam, disaring sareng dikeringkeun dina oven dina suhu 40°C salami 3 jam.
Partikel silika garing (2 g) didisperkeun dina toluéna garing (100 mL), diaduk sareng disonikasi dina labu dasar buleud 500 mL salami 10 menit. PMCP (10 mg) dilarutkeun dina toluéna sareng ditambihkeun tetes demi tetes kana labu réaksi ngalangkungan corong tetes. Campuran ieu diréflukskeun dina suhu 100°C salami 8 jam, disaring sareng dikumbah ku aseton sareng dikeringkeun dina suhu 60°C salami 3 jam. Teras, partikel silika anu kabeungkeut ku PMCP (100 g) dilarutkeun dina toluéna (200 ml) sareng 4-hidroksi-TEMPO (2 mL) ditambihkeun kalayan ayana 100 µL dibutiltin dilaurat salaku katalis. Campuran ieu diaduk dina suhu 50°C salami 8 jam, disaring sareng dikeringkeun dina suhu 50°C salami 3 jam.
Stiréna (1 mL), benzoil péroksida BPO (0,5 mL), sareng partikel silika anu napel TEMPO-PMCP (1,5 g) didisperkeun dina toluéna sareng dimurnikeun ku nitrogén. Polimérisasi stiréna dilaksanakeun dina suhu 100°C salami 12 jam. Produk anu dihasilkeun dikumbah ku metanol sareng dikeringkeun dina suhu 60°C sapeuting. Skéma réaksi sakabéhna dipidangkeun dina Gambar 1.
Sampel-sampel éta didegaskeun dina suhu 393 K salami 1 jam pikeun kéngingkeun tekanan sésa kirang ti 10-3 Torr. Jumlah N2 anu diserep dina tekanan relatif P/P0 = 0,99 dianggo pikeun nangtukeun total volume pori. Morfologi partikel silika polos sareng anu kaiket ku ligan dipariksa nganggo mikroskop éléktron scanning (Hitachi High Technologies, Tokyo, Jepang). Sampel anu garing (silika polos sareng partikel silika anu kaiket ku ligan) disimpen dina kolom aluminium nganggo pita karbon perekat. Emas dilapis dina sampel nganggo coater sputter Q150T, sareng lapisan Au 5 nm diendapkeun dina sampel. Ieu ningkatkeun efisiensi prosés nganggo tegangan rendah sareng nyayogikeun butiran anu saé, sputtering tiis. Penganalisis unsur Thermo Electron (Waltham, MA, AS) Flash EA1112 dianggo pikeun analisis unsur. Penganalisis ukuran partikel Malvern (Worcestershire, Inggris) Mastersizer 2000 dianggo pikeun kéngingkeun distribusi ukuran partikel. Partikel silika polos sareng silika anu kaiket ku ligan Partikel (masing-masing 5 mg) disebarkeun dina 5 mL isopropanol, disonikasi salami 10 menit, divortex salami 5 menit, teras disimpen dina méja optik Mastersizer. Analisis termogravimetri dilaksanakeun dina laju 5 °C per menit dina kisaran suhu 30 dugi ka 800 °C.
Kolom bor sempit baja tahan karat anu dilapis kaca kalayan dimensi (100 × 1,8 mm id) dipak nganggo metode pengepakan bubur, nerapkeun prosedur anu sami anu dianggo dina Ref. 31. Kolom stainless steel (dilapis kaca, 100 × 1,8 mm id) kalayan pas outlet anu ngandung frit 1 µm disambungkeun ka slurry packer (Alltech Deerfield, IL, USA). Nyiapkeun slurry fase stasioner ku cara ngagantungkeun 150 mg fase stasioner dina 1,2 mL metanol sareng kirimkeun ka kolom panyimpenan. Metanol dianggo salaku pangleyur slurry ogé pangleyur propelling. Eusian kolom sacara berurutan ku cara nerapkeun tekanan 100 MP salami 10 menit, 80 MP salami 15 menit, sareng 60 MP salami 30 menit. Salila pengepakan, geteran mékanis diterapkeun ku dua shaker kolom GC (Alltech, Deerfield, IL, USA) pikeun mastikeun pengepakan kolom anu seragam. Tutup slurry packer sareng leupaskeun tekanan lalaunan pikeun nyegah karusakan dina kolom. Pegatkeun kolom tina unit pengepakan slurry sareng sambungkeun pas anu sanés ka inlet sareng ka sistem LC pikeun mariksa kinerjana.
Pompa LC (10AD Shimadzu, Jepang), injektor (Valco (AS) C14 W.05) kalayan loop injeksi 50nL, degasser mémbran (Shimadzu DGU-14A), jandela kapiler UV-VIS diwangun. Detektor alat µLC khusus (UV-2075) sareng mikrokolom anu dilapis kaca. Anggo tabung panyambung anu sempit pisan sareng pondok pikeun ngaminimalkeun pangaruh pelebaran pita kolom tambahan. Saatos dibungkus, kapiler (50 μm id 365 sareng kapiler union pangurangan (50 μm) dipasang dina outlet 1/16″ tina union pangurangan. Pangumpulan data sareng pamrosésan kromatografi dilakukeun nganggo parangkat lunak Multichro 2000. Pemantauan dina 254 nm Analit diuji pikeun absorbansi UV. Data kromatografi dianalisis ku OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumin tina sérum manusa, bubuk liofilisasi, ≥ 96% (éléktroforésis gél agarosa) 3 mg dicampur sareng tripsin (1,5 mg), 4,0 M uréa (1 mL), sareng 0,2 M amonium bikarbonat (1 mL). Larutan ieu diaduk salami 10 menit sareng disimpen dina bak cai dina suhu 37°C salami 6 jam, teras didinginkan ku 1 mL 0,1% TFA. Saring larutan sareng simpen di handap 4 °C.
Pamisahan campuran péptida sareng digest tripsin HSA dievaluasi sacara misah dina kolom PMP. Pariksa pamisahan campuran péptida sareng digest tripsin HSA ku kolom PMP sareng bandingkeun hasilna sareng kolom Ascentis Express RP-Amide. Nomer pelat téoritis diitung sapertos kieu:
Gambar SEM partikel silika bulistir sareng partikel silika anu kabeungkeut ku ligan dipidangkeun dina Gambar 2. Gambar SEM partikel silika bulistir (A, B) nunjukkeun yén, béda sareng panilitian kami sateuacanna, partikel-partikel ieu buleud dimana partikelna manjang atanapi gaduh simétri anu henteu teratur. Beungeut partikel silika anu kabeungkeut ku ligan (C, D) langkung lemes tibatan partikel silika bulistir, anu tiasa disababkeun ku lapisan ranté polistirena dina beungeut partikel silika.
Gambar mikroskop éléktron scanning partikel silika bulistir (A, B) sareng partikel silika anu kabeungkeut ku ligan (C, D).
Distribusi ukuran partikel partikel silika polos sareng partikel silika anu kaiket ligan dipidangkeun dina Gambar 3(A). Kurva distribusi ukuran partikel dumasar volume nunjukkeun yén ukuran partikel silika ningkat saatos modifikasi kimia (Gambar 3A). Data distribusi ukuran partikel partikel silika tina panilitian ayeuna sareng panilitian sateuacana dibandingkeun dina Tabel 1(A). Ukuran partikel dumasar volume, d(0.5), tina PMP nyaéta 3.36 μm, dibandingkeun sareng panilitian sateuacana kalayan nilai ad(0.5) 3.05 μm (partikel silika anu kaiket polistirena)34. Angkatan ieu ngagaduhan distribusi ukuran partikel anu langkung sempit dibandingkeun sareng panilitian sateuacana kusabab babandingan PEG, uréa, TMOS, sareng asam asetat anu béda-béda dina campuran réaksi. Ukuran partikel fase PMP rada langkung ageung tibatan fase partikel silika anu kaiket polistirena anu urang pelajari sateuacanna. Ieu ngandung harti yén fungsionalisasi permukaan partikel silika kalayan stirena ngan ukur neundeun lapisan polistirena (0.97 µm) dina permukaan silika, sedengkeun dina fase PMP ketebalan lapisan éta 1,38 µm.
Sebaran ukuran partikel (A) sareng distribusi ukuran pori (B) partikel silika polos sareng partikel silika anu kaiket ku ligan.
Ukuran pori, volume pori, sareng luas permukaan partikel silika dina panilitian ayeuna dibéré dina Tabel 1(B). Profil PSD partikel silika polos sareng partikel silika anu kaiket ligan dipidangkeun dina Gambar 3(B). Hasilna tiasa dibandingkeun sareng panilitian kami sateuacanna. Ukuran pori partikel silika polos sareng kaiket ligan masing-masing nyaéta 310 sareng 241, anu nunjukkeun yén ukuran pori turun 69 saatos modifikasi kimia, sapertos anu dipidangkeun dina Tabel 1(B), sareng parobahan kurva dipidangkeun dina Gambar 3(B). Nya kitu, volume pori partikel silika turun tina 0,67 janten 0,58 cm3/g saatos modifikasi kimia. Luas permukaan spésifik partikel silika anu ayeuna ditalungtik nyaéta 116 m2/g, anu tiasa dibandingkeun sareng panilitian kami sateuacanna (124 m2/g). Sakumaha anu dipidangkeun dina Tabel 1(B), luas permukaan (m2/g) partikel silika ogé turun tina 116 m2/g janten 105 m2/g saatos kimia. modifikasi.
Hasil analisis unsur fase stasioner dipidangkeun dina Tabel 2. Beban karbon tina fase stasioner ayeuna nyaéta 6,35%, anu langkung handap tibatan beban karbon dina panilitian kami sateuacanna (partikel silika anu kabeungkeut polistirena, masing-masing 7,93% sareng 10,21%). Beban karbon tina fase stasioner ayeuna rendah, Kusabab dina persiapan SP ayeuna, salian ti stirena, sababaraha ligan polar sapertos fenilmaleimida-metilvinilisosianat (PCMP) sareng 4-hidroksi-TEMPO dianggo. Persen beurat nitrogén tina fase stasioner ayeuna nyaéta 2,21%, dibandingkeun sareng 0,1735 sareng 0,85% beurat nitrogén dina panilitian sateuacana. Ieu ngandung harti yén wt % nitrogén langkung luhur dina fase stasioner ayeuna kusabab fenilmaleimida. Nya kitu, beban karbon produk (4) sareng (5) masing-masing 2,7% sareng 2,9%, sedengkeun beban karbon tina final Produk (6) nyaéta 6,35%, sakumaha anu dipidangkeun dina Tabel 2. Leungitna beurat dipariksa nganggo fase stasioner PMP, sareng kurva TGA dipidangkeun dina Gambar 4. Kurva TGA nunjukkeun leungitna beurat 8,6%, anu saluyu sareng beban karbon (6,35%) sabab ligan henteu ngan ukur ngandung C tapi ogé N, O, sareng H.
Ligan fenilmaleimida-metilvinilisosianat dipilih pikeun modifikasi permukaan partikel silika sabab mibanda gugus fenilmaleimida polar sareng gugus vinilisosianat. Gugus vinil isosianat salajengna tiasa réaksi sareng stiréna ku cara polimérisasi radikal hirup. Alesan kadua nyaéta pikeun nyelapkeun gugus anu mibanda interaksi sedeng sareng analit sareng teu aya interaksi éléktrostatik anu kuat antara analit sareng fase stasioner, kumargi gugus fenilmaleimida teu gaduh muatan virtual dina pH normal. Polaritas fase stasioner tiasa dikontrol ku jumlah stiréna anu optimal sareng waktos réaksi polimérisasi radikal bébas. Léngkah terakhir réaksi (polimérisasi radikal bébas) penting pisan sareng tiasa ngarobih polaritas fase stasioner. Analisis unsur dilakukeun pikeun mariksa beban karbon tina fase stasioner ieu. Dititénan yén ningkatkeun jumlah stiréna sareng waktos réaksi ningkatkeun beban karbon tina fase stasioner sareng sabalikna. SP anu disiapkeun kalayan konsentrasi stiréna anu béda-béda ngagaduhan beban karbon anu béda-béda. Sakali deui, muat fase stasioner ieu kana kolom stainless steel sareng pariksa kinerja kromatografi na. (selektifitas, résolusi, nilai N, jsb.). Dumasar kana ékspérimén ieu, formulasi anu dioptimalkeun dipilih pikeun nyiapkeun fase stasioner PMP pikeun mastikeun polaritas anu dikontrol sareng ingetan analit anu saé.
Lima campuran péptida (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leusin enkephalin) ogé dievaluasi nganggo kolom PMP nganggo fase gerak; 60/40 (v/v) asetonitril/cai (0,1% TFA) dina laju aliran 80 μL/mnt. Dina kaayaan élusi optimal, jumlah pelat téoritis (N) per kolom (100 × 1,8 mm id) nyaéta 20.000 ± 100 (200.000 pelat/m²). Tabel 3 masihan nilai N pikeun tilu kolom PMP sareng kromatogram dipidangkeun dina Gambar 5A. Analisis gancang dina kolom PMP dina laju aliran anu luhur (700 μL/mnt), lima péptida diélusi dina hiji menit, nilai N saé pisan, 13.500 ± 330 per kolom (100 × 1,8 mm id), Cocog sareng 135.000 pelat/m (Gambar 5B). Tilu kolom anu ukuranana sami (100 × 1,8 mm id) dipak ku tilu lot fase stasioner PMP anu béda pikeun mariksa réproduksibilitas. Konsentrasi analit pikeun unggal kolom dirékam nganggo kaayaan élusi optimal sareng jumlah pelat téoritis N sareng waktos ingetan pikeun misahkeun campuran tés anu sami dina unggal kolom. Data réproduktibilitas pikeun kolom PMP dipidangkeun dina Tabel 4. Réproduktibilitas kolom PMP berkorelasi saé sareng nilai %RSD anu handap pisan, sapertos anu dipidangkeun dina Tabel 3.
Pamisahan campuran péptida dina kolom PMP (B) sareng kolom Ascentis Express RP-Amida (A); fase gerak 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1%), diménsi kolom PMP (100 × 1,8 mm id); analitis Urutan élusi sanyawa: 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) sareng 5 (leusin) asam enkephalin)).
Kolom PMP (100 × 1,8 mm id) dievaluasi pikeun misahkeun digest triptik tina albumin sérum manusa dina kromatografi cair kinerja tinggi. Kromatogram dina Gambar 6 nunjukkeun yén sampel dipisahkeun kalayan saé sareng résolusi na saé pisan. Digest HSA dianalisis nganggo laju aliran 100 µL/mnt, fase gerak 70/30 asetonitril/cai sareng 0,1% TFA. Sakumaha anu dipidangkeun dina kromatogram (Gambar 6), digest HSA parantos dibagi kana 17 puncak anu saluyu sareng 17 péptida. Efisiensi pamisahan unggal puncak dina digest HSA diitung sareng nilaina dipasihkeun dina Tabel 5.
Digest triptik HSA (100 × 1,8 mm id) dipisahkeun dina kolom PMP; laju aliran (100 µL/mnt), fase gerak 60/40 asetonitril/cai kalayan 0,1% TFA.
dimana L nyaéta panjang kolom, η nyaéta viskositas fase gerak, ΔP nyaéta tekanan balik kolom, sareng u nyaéta kecepatan linier fase gerak. Permeabilitas kolom PMP nyaéta 2,5 × 10-14 m2, laju aliran nyaéta 25 μL/mnt, sareng 60/40 v/v ACN/cai dianggo. Permeabilitas kolom PMP (100 × 1,8 mm id) sami sareng panilitian kami sateuacanna Ref.34. Permeabilitas kolom anu dieusi ku partikel porous superfisial nyaéta: 1,7 × 10-15 pikeun partikel 1,3 μm, 3,1 × 10-15 pikeun partikel 1,7 μm, 5,2 × 10-15 sareng 2,5 × 10-14 m2 pikeun partikel 2,6 μm Pikeun partikel 5 μm 43. Ku alatan éta, permeabilitas fase PMP sami sareng partikel inti-cangkang 5 μm.
dimana Wx nyaéta beurat kolom anu dieusi ku kloroform, Wy nyaéta beurat kolom anu dieusi ku metanol, sareng ρ nyaéta kapadetan pangleyur. Kapadetan metanol (ρ = 0,7866) sareng kloroform (ρ = 1,484). Total porositas kolom SILIKA PARTIKEL-C18 (100 × 1,8 mm id) 34 sareng kolom C18-Urea 31 anu urang pelajari sateuacanna nyaéta 0,63 sareng 0,55, masing-masing. Ieu ngandung harti yén ayana ligan uréa ngirangan perméabilitas fase stasioner. Di sisi séjén, total porositas kolom PMP (100 × 1,8 mm id) nyaéta 0,60. Perméabilitas kolom PMP langkung handap tibatan kolom anu dieusi ku partikel silika anu kabeungkeut C18 sabab dina fase stasioner tipe C18, ligan C18 napel kana partikel silika salaku ranté linier, sedengkeun dina fase stasioner tipe polistirena, lapisan polimér anu relatif kandel kabentuk di sakitar Dina ékspérimén has, porositas kolom diitung sapertos kieu:
Gambar 7A, B nunjukkeun kolom PMP (100 × 1,8 mm id) sareng kolom Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) nganggo kaayaan élusi anu sami (nyaéta, 60/40 ACN/H2O sareng 0,1% TFA). ) tina plot van Deemter. Campuran péptida anu dipilih (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enkephalin) disiapkeun dina 20 µL/ Laju aliran minimum pikeun kadua kolom nyaéta 800 µL/mnt. Nilai HETP minimum dina laju aliran optimal (80 µL/mnt) pikeun kolom PMP sareng kolom Ascentis Express RP-Amide masing-masing nyaéta 2,6 µm sareng 3,9 µm. Nilai HETP nunjukkeun yén efisiensi pamisahan kolom PMP (100 × 1,8 mm id) jauh langkung saé tibatan kolom Ascentis Express RP-Amide anu sayogi sacara komersil (100 × 1,8 mm id). Plot van Deemter dina Gambar 7(A) nunjukkeun yén panurunan nilai N kalayan ningkatna aliran henteu signifikan dibandingkeun sareng panilitian kami sateuacana. Efisiensi pamisahan kolom PMP anu langkung luhur (100 × 1,8 mm id) dibandingkeun sareng kolom Ascentis Express RP-Amide dumasar kana paningkatan dina bentuk partikel, ukuran, sareng prosedur pengepakan kolom kompléks anu dianggo dina karya ayeuna34.
(A) plot van Deemter (HETP versus kecepatan linier fase gerak) anu diala nganggo kolom PMP (100 × 1,8 mm id) dina 60/40 ACN/H2O kalayan 0,1% TFA. (B) plot van Deemter (HETP versus kecepatan linier fase gerak) anu diala nganggo kolom Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) dina 60/40 ACN/H2O kalayan 0,1% TFA.
Fase stasioner polistirena anu dipasang dina polar disiapkeun sareng dievaluasi pikeun misahkeun campuran péptida sintétis sareng dicerna tripsin tina albumin sérum manusa (HAS) dina kromatografi cair kinerja tinggi. Kinerja kromatografi kolom PMP pikeun campuran péptida saé pisan dina efisiensi sareng résolusi pamisahan. Kinerja pamisahan kolom PMP anu ningkat disababkeun ku rupa-rupa alesan, sapertos ukuran partikel sareng ukuran pori partikel silika, sintésis fase stasioner anu dikontrol, sareng pengepakan kolom anu kompleks. Salian ti efisiensi pamisahan anu luhur, tekanan balik kolom anu handap dina laju aliran anu luhur mangrupikeun kaunggulan sanés tina fase stasioner ieu. Kolom PMP nunjukkeun réproduksibilitas anu saé sareng tiasa dianggo pikeun analisis campuran péptida sareng pencernaan tripsin tina rupa-rupa protéin. Kami badé nganggo kolom ieu pikeun misahkeun produk alami, sanyawa bioaktif tina pepelakan ubar sareng ekstrak jamur dina kromatografi cair. Ka hareupna, kolom PMP ogé bakal dievaluasi pikeun misahkeun protéin sareng antibodi monoklonal.
Field, JK, Euerby, MR, Lau, J., Thøgersen, H. & Petersson, P. Panalungtikan ngeunaan Sistem Pamisahan Péptida ku Kromatografi Fase Tibalik Bagian I: Pangwangunan Protokol Karakterisasi Kolom. J. Kromatografi.1603, 113–129. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2019.05.038 (2019).
Gomez, B. et al. Péptida aktif anu ditingkatkeun dirancang pikeun pengobatan panyakit tepa. Biotechnology.Advanced.36(2), 415-429. https://doi.org/10.1016/j.biotechadv.2018.01.004 (2018).
Vlieghe, P., Lisowski, V., Martinez, J. & Khrestchatisky, M. Péptida terapi sintétis: élmu sareng pasar. panemuan ubar.15 (1-2) ayeuna, 40-56.https://doi.org/10.1016/j.drudis.2009.10.009 (2010).
Xie, F., Smith, RD & Shen, Y. Kromatografi Cair Protéomik Lanjutan.J. Kromatografi.A 1261, 78–90 (2012).
Liu, W. et al. Kromatografi cair canggih-spektrometri massa ngamungkinkeun ngahijikeun metabolomik sareng protéomik anu ditujukeun sacara lega. anus.Chim.Acta 1069, 89–97 (2019).
Chesnut, SM & Salisbury, JJ Peran UHPLC dina pamekaran ubar.J. Sep. Sci.30(8), 1183-1190 (2007).
Wu, N. & Clausen, AM Aspék dasar sareng praktis kromatografi cair tekanan ultra luhur pikeun pamisahan gancang. J. Sep. Sci.30(8), 1167-1182. https://doi.org/10.1002/jssc.200700026 (2007).
Wren, SA & Tchelitcheff, P. Aplikasi kromatografi cair kinerja ultra-luhur dina pamekaran ubar. J. Kromatografi.1119(1-2), 140-146. https://doi.org/10.1016/j.chroma.2006.02.052 (2006).
Gu, H. et al. Hidrogel makropori monolitik anu disiapkeun tina émulsi fase internal anu luhur dina minyak-dina-cai pikeun purifikasi enterovirus anu efisien. Chemical.Britain.J. 401, 126051 (2020).
Shi, Y., Xiang, R., Horváth, C. & Wilkins, JA Peran kromatografi cair dina protéomik.J. Kromatografi.A 1053(1-2), 27-36 (2004).
Fekete, S., Veuthey, J.-L. & Guillarme, D. Tren anu muncul dina pamisahan kromatografi cair fase tibalik tina péptida sareng protéin terapi: téori sareng aplikasi. J. Pharmacy.Biomedical Science.anus.69, 9-27 (2012).
Gilar, M., Olivova, P., Daly, AE & Gebler, JC Pamisahan péptida dua diménsi nganggo sistem RP-RP-HPLC nganggo nilai pH anu béda dina diménsi pamisahan kahiji sareng kadua. J. Sep. Sci.28(14), 1694-1703 (2005).
Feletti, S. et al. Karakteristik transfer massa sareng kinerja kinétik kolom kromatografi efisiensi tinggi anu dipak ku partikel C18 sub-2 μm anu pinuh sareng superfisial berpori parantos ditalungtik. J. Sep. Sci.43 (9-10), 1737-1745 (2020).
Piovesana, S. et al.Trén panganyarna sareng tantangan analitis dina isolasi, idéntifikasi sareng validasi peptida bioaktif pepelakan.anus.biological anus.Chemical.410(15), 3425–3444.https://doi.org/10.1007/s00216-018-0852-x (2018).
Mueller, JB et al. Bentang alam protéomik karajaan kahirupan. Alam 582(7813), 592-596. https://doi.org/10.1038/s41586-020-2402-x (2020).
DeLuca, C. et al. Pamrosésan hilir péptida terapi ku kromatografi cair preparatif. Molekul (Basel, Swiss) 26(15), 4688(2021).
Yang, Y. & Geng, X. Kromatografi modeu campuran sareng aplikasina kana biopolimer.J. Kromatografi.A 1218(49), 8813–8825 (2011).
Zhao, G., Dong, X.-Y. & Sun, Y. Ligand pikeun kromatografi protéin mode campuran: prinsip, karakterisasi, sareng desain. J. Biotechnology.144(1), 3-11 (2009).