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मैक्रोपोरस कण प्राप्त करने के लिए कुछ संशोधनों के साथ सोल-जेल विधि द्वारा छिद्रयुक्त सिलिका कण तैयार किए गए। इन कणों को एन-फेनिलमैलेमाइड-मिथाइलविनाइलिसोसायनेट (पीएमआई) और स्टाइरीन के साथ प्रतिवर्ती अतिरिक्त विखंडन श्रृंखला स्थानांतरण (आरएएफटी) पोलीमराइजेशन द्वारा व्युत्पन्न किया गया ताकि पॉलीस्टाइरीन (पीएमपी) स्थिर चरण का एन-फेनिलमैलेमाइड इंटरकैलेश् 280,000 प्लेट/m² तक। विकसित स्तंभ के पृथक्करण प्रदर्शन की तुलना वाणिज्यिक एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड स्तंभ के साथ करने पर, यह देखा गया कि पृथक्करण दक्षता और रिज़ॉल्यूशन के संदर्भ में पीएमपी स्तंभ का पृथक्करण प्रदर्शन वाणिज्यिक स्तंभ से बेहतर था।
हाल के वर्षों में, बायोफार्मास्युटिकल उद्योग बाजार हिस्सेदारी में पर्याप्त वृद्धि के साथ एक विस्तारित वैश्विक बाजार बन गया है। बायोफार्मास्युटिकल उद्योग1,2,3 के विस्फोटक विकास के साथ, पेप्टाइड्स और प्रोटीन का विश्लेषण अत्यधिक वांछित है। लक्ष्य पेप्टाइड के अलावा, पेप्टाइड संश्लेषण के दौरान कई अशुद्धियाँ उत्पन्न होती हैं, इस प्रकार वांछित शुद्धता के पेप्टाइड्स प्राप्त करने के लिए क्रोमैटोग्राफ़िक शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है। शरीर के तरल पदार्थ, ऊतकों और कोशिकाओं में प्रोटीन का विश्लेषण और लक्षण वर्णन एक बहुत ही चुनौतीपूर्ण कार्य है, क्योंकि एक ही नमूने में संभावित रूप से पता लगाने योग्य प्रजातियों की बड़ी संख्या होती है। हालाँकि मास स्पेक्ट्रोमेट्री पेप्टाइड और प्रोटीन अनुक्रमण के लिए एक प्रभावी उपकरण है, अगर ऐसे नमूनों को एक बार में मास स्पेक्ट्रोमीटर में इंजेक्ट किया जाता है, तो पृथक्करण आदर्श नहीं होगा। एमएस विश्लेषण से पहले लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एलसी) पृथक्करण को लागू करके इस समस्या को कम किया जा सकता है, जो एक निश्चित समय पर मास स्पेक्ट्रोमीटर में प्रवेश करने वाले विश्लेषकों की संख्या को कम कर देगा4,5,6। इसके अलावा, लिक्विड चरण पृथक्करण के दौरान, विश्लेषकों को संकीर्ण क्षेत्रों में केंद्रित किया जा सकता है, जिससे इन विश्लेषकों को केंद्रित करना और एमएस का पता लगाने की संवेदनशीलता में सुधार करना। तरल क्रोमैटोग्राफी (एलसी) पिछले दशक में काफी उन्नत हुई है और प्रोटिओमिक विश्लेषण में एक लोकप्रिय तकनीक बन गई है7,8,9,10।
रिवर्स-फेज लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (RP-LC) का व्यापक रूप से ऑक्टाडेसिल-संशोधित सिलिका (ODS) का उपयोग स्थिर चरण के रूप में पेप्टाइड मिश्रणों के शुद्धिकरण और पृथक्करण के लिए किया जाता है11,12,13. हालाँकि, RP स्थिर चरण अपनी जटिल संरचना और उभयचर प्रकृति के कारण पेप्टाइड्स और प्रोटीन का संतोषजनक पृथक्करण प्रदान नहीं करते हैं14,15. इसलिए, इन विश्लेषकों के साथ बातचीत करने और उन्हें बनाए रखने के लिए ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय भागों के साथ पेप्टाइड्स और प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए स्थिर चरणों की आवश्यकता होती है16. मिश्रित-मोड क्रोमैटोग्राफी, जो मल्टीमॉडल इंटरैक्शन प्रदान करती है, पेप्टाइड्स, प्रोटीन और अन्य जटिल मिश्रणों के पृथक्करण के लिए RP-LC का विकल्प हो सकती है। कई मिश्रित-मोड स्थिर चरण तैयार किए गए हैं, और इन चरणों से भरे स्तंभों का उपयोग पेप्टाइड और प्रोटीन पृथक्करण के लिए किया गया है17,18,19,20,21. मिश्रित-मोड स्थिर चरण (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, ध्रुवीय अंतर्संबंध/RPLC) ध्रुवीय और अध्रुवीय दोनों समूहों की उपस्थिति के कारण पेप्टाइड और प्रोटीन पृथक्करण के लिए उपयुक्त हैं22,23,24,25,26,27,28। इसी तरह, सहसंयोजक रूप से बंधित ध्रुवीय समूहों के साथ ध्रुवीय अंतर्संबंध स्थिर चरण ध्रुवीय और अध्रुवीय विश्लेषकों के लिए अच्छी पृथक्करण शक्ति और अद्वितीय चयनात्मकता दिखाते हैं, क्योंकि पृथक्करण विश्लेषक और स्थिर चरण के बीच की परस्पर क्रिया पर निर्भर करता है। मल्टीमॉडल अंतर्क्रियाएँ 29, 30, 31, 32. हाल ही में, झांग एट अल। 30 ने एक डोडेसिल-टर्मिनेटेड पॉलीमाइन स्थिर चरण तैयार किया और हाइड्रोकार्बन, एंटीडिप्रेसेंट्स, फ्लेवोनोइड्स, न्यूक्लियोसाइड्स, एस्ट्रोजेन और कई अन्य विश्लेषकों को सफलतापूर्वक अलग किया। ध्रुवीय इंटरकैलेटर में ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय दोनों समूह होते हैं, इसलिए इसका उपयोग पेप्टाइड्स और प्रोटीन को अलग करने के लिए किया जा सकता है, जिनमें हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोफिलिक दोनों प्रकार के भाग होते हैं। ध्रुवीय-एम्बेडेड कॉलम (जैसे, एमाइड-एम्बेडेड C18 कॉलम) व्यावसायिक रूप से एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम के नाम से उपलब्ध हैं, लेकिन इन कॉलम का उपयोग केवल अमीन 33 के विश्लेषण के लिए किया जाता है।
वर्तमान अध्ययन में, एक ध्रुवीय-अंतर्निहित स्थिर चरण (एन-फेनिलमैलेमाइड-एम्बेडेड पॉलीस्टाइरीन) तैयार किया गया और एचएसए के पेप्टाइड्स और ट्रिप्सिन डाइजेस्ट के पृथक्करण के लिए मूल्यांकन किया गया। निम्नलिखित रणनीति का उपयोग करके स्थिर चरण तैयार किया गया था। तैयारी प्रोटोकॉल में कुछ संशोधनों के साथ हमारे पिछले प्रकाशन में दी गई प्रक्रिया के अनुसार छिद्रपूर्ण सिलिका कण तैयार किए गए थे। बड़े छिद्र आकार वाले सिलिका कण तैयार करने के लिए यूरिया, पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल (पीईजी), टीएमओएस, पानी एसिटिक एसिड के अनुपात को समायोजित किया गया था। दूसरा, एक नया लिगैंड, फेनिलमैलेमाइड-मिथाइल विनाइल आइसोसाइनेट, संश्लेषित किया गया और एक ध्रुवीय एम्बेडेड स्थिर चरण तैयार करने के लिए सिलिका कणों को व्युत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया। परिणामी स्थिर चरण को अनुकूलित पैकिंग योजना का उपयोग करके स्टेनलेस स्टील कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) में पैक किया गया था। कॉलम पैकिंग को यांत्रिक कंपन के साथ सहायता प्रदान की जाती है ताकि यह सुनिश्चित हो सके कि कॉलम के भीतर एक सजातीय बिस्तर बन गया है। पेप्टाइड के पैक किए गए कॉलम पृथक्करण का मूल्यांकन करें पांच पेप्टाइड्स से युक्त मिश्रण; (ग्लाइ-टायर, ग्लाइ-ल्यू-टायर, ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग, टायर-आइल-ग्लाइ-सेर-आर्ग, ल्यूसीन एनकेफालिन) और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएएस) का ट्रिप्सिन डाइजेस्ट। पेप्टाइड मिश्रण और एचएसए का ट्रिप्सिन डाइजेस्ट अच्छे रिज़ॉल्यूशन और दक्षता के साथ अलग होते देखे गए। पीएमपी कॉलम के पृथक्करण प्रदर्शन की तुलना एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम के साथ की गई। पेप्टाइड्स और प्रोटीन दोनों को पीएमपी कॉलम पर अच्छी तरह से रिज़ॉल्यूशन और कुशल पाया गया, जो एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम की तुलना में अधिक कुशल था।
पीईजी (पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल), यूरिया, एसिटिक एसिड, ट्राइमेथॉक्सी ऑर्थोसिलिकेट (टीएमओएस), ट्राइमेथिल क्लोरोसिलेन (टीएमसीएस), ट्रिप्सिन, मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएसए), अमोनियम क्लोराइड, यूरिया, हेक्सेन मेथिलडिसिलाज़ेन (एचएमडीएस), मेथैक्रिलोयल क्लोराइड (एमसी), स्टाइरीन, 4-हाइड्रॉक्सी-टेम्पो, बेंज़ोयल पेरोक्साइड (बीपीओ), एचपीएलसी ग्रेड एसिटोनाइट्राइल (एसीएन), मेथनॉल, 2-प्रोपेनॉल और एसीटोन सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदा गया।
यूरिया (8 ग्राम), पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल (8 ग्राम) और 0.01 एन एसिटिक एसिड के 8 एमएल के मिश्रण को 10 मिनट तक हिलाया गया और फिर बर्फ-ठंडी परिस्थितियों में 24 एमएल टीएमओएस मिलाया गया। प्रतिक्रिया मिश्रण को स्टेनलेस स्टील आटोक्लेव में 40 डिग्री सेल्सियस पर 6 घंटे और फिर 120 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे तक गर्म किया गया। पानी को निकाल दिया गया और अवशिष्ट सामग्री को 70 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे तक सुखाया गया। सूखे नरम द्रव्यमान को एक ओवन में चिकना पीसा गया और 550 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे तक शांत किया गया। कण आकार, छिद्र आकार और सतह क्षेत्र में पुनरुत्पादकता की जांच करने के लिए तीन बैच तैयार किए गए और उनकी विशेषता निर्धारित की गई।
प्री-सिंथेसाइज्ड लिगैंड फेनिलमेलिमाइड-मेथिलविनाइलिसोसायनेट (पीसीएमपी) के साथ सिलिका कणों के सतह संशोधन द्वारा, उसके बाद स्टाइरीन के साथ रेडियल पॉलीमराइजेशन द्वारा, एक ध्रुवीय समूह युक्त यौगिक तैयार किया गया। समुच्चय और पॉलीस्टाइनिन श्रृंखलाओं के लिए स्थिर चरण। तैयारी प्रक्रिया नीचे वर्णित है।
एन-फेनिलमैलेमाइड (200 मिलीग्राम) और मिथाइल विनाइल आइसोसाइनेट (100 मिलीग्राम) को शुष्क टोल्यूनि में घोला गया, और फेनिलमैलेमाइड-मिथाइल विनाइल आइसोसाइनेट कॉपोलीमर (पीएमसीपी) तैयार करने के लिए प्रतिक्रिया फ्लास्क में 2,2'-एज़ोइसोब्यूटिरोनिट्राइल (एआईबीएन) के 0.1 एमएल को जोड़ा गया। मिश्रण को 3 घंटे के लिए 60 डिग्री सेल्सियस पर गर्म किया गया, फ़िल्टर किया गया और 3 घंटे के लिए 40 डिग्री सेल्सियस पर एक ओवन में सुखाया गया।
सूखे सिलिका कणों (2 ग्राम) को सूखे टोल्यूनि (100 एमएल) में फैलाया गया, 500 एमएल गोल तल वाले फ्लास्क में 10 मिनट के लिए हिलाया और ध्वनिकृत किया गया। पीएमसीपी (10 मिलीग्राम) को टोल्यूनि में घोला गया और ड्रॉपिंग फनल के माध्यम से प्रतिक्रिया फ्लास्क में बूंद-बूंद करके डाला गया। मिश्रण को 100 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए रिफ्लक्स किया गया, एसीटोन से छानकर धोया गया और 60 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए सुखाया गया। फिर, पीएमसीपी-बंधित सिलिका कणों (100 ग्राम) को टोल्यूनि (200 एमएल) में घोला गया और उत्प्रेरक के रूप में 100 µL डिब्यूटिलटिन डाइलॉरेट की उपस्थिति में 4-हाइड्रॉक्सी-टेम्पो (2 एमएल) मिलाया गया। मिश्रण को 50 डिग्री सेल्सियस पर 8 घंटे के लिए हिलाया गया, छानकर 50 डिग्री सेल्सियस पर 3 घंटे के लिए सुखाया गया।
स्टाइरीन (1 एमएल), बेंज़ॉयल पेरोक्साइड बीपीओ (0.5 एमएल), और टेम्पो-पीएमसीपी-संलग्न सिलिका कण (1.5 ग्राम) को टोल्यूनि में फैलाया गया और नाइट्रोजन से शुद्ध किया गया। स्टाइरीन का बहुलकीकरण 100 डिग्री सेल्सियस पर 12 घंटे के लिए किया गया। परिणामी उत्पाद को मेथनॉल से धोया गया और रात भर 60 डिग्री सेल्सियस पर सुखाया गया। समग्र प्रतिक्रिया योजना चित्र 1 में दिखाई गई है।
10-3 टोर से कम का अवशिष्ट दबाव प्राप्त करने के लिए नमूनों को 1 घंटे के लिए 393 K पर डीगैस किया गया। कुल छिद्र मात्रा निर्धारित करने के लिए P/P0 = 0.99 के सापेक्ष दबाव पर अवशोषित N2 की मात्रा का उपयोग किया गया था। स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (हिताची हाई टेक्नोलॉजीज, टोक्यो, जापान) के साथ नंगे और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों की आकृति विज्ञान की जांच की गई थी। सूखे नमूनों (नंगे सिलिका और लिगैंड-बंधित सिलिका कण) को चिपकने वाले कार्बन टेप का उपयोग करके एल्यूमीनियम कॉलम पर रखा गया था। Q150T स्पटर कोटर का उपयोग करके नमूनों पर सोना चढ़ाया गया था, और नमूनों पर 5 एनएम Au परत जमा की गई थी। यह कम वोल्टेज का उपयोग करके प्रक्रिया दक्षता में सुधार करता है और ठीक अनाज, ठंडा स्पटरिंग प्रदान करता है कण आकार वितरण प्राप्त करने के लिए आकार विश्लेषक का उपयोग किया गया था। नग्न सिलिका कण और लिगैंड-बंधित सिलिका कण (5 मिलीग्राम प्रत्येक) को 5 एमएल आइसोप्रोपेनॉल में फैलाया गया, 10 मिनट के लिए ध्वनिकृत किया गया, 5 मिनट के लिए भंवरित किया गया, और मास्टरसाइज़र के ऑप्टिकल बेंच पर रखा गया। थर्मोग्रैविमेट्रिक विश्लेषण 30 से 800 डिग्री सेल्सियस के तापमान रेंज में 5 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट की दर से किया गया था।
आयाम (100 × 1.8 मिमी आईडी) के ग्लास-लाइन वाले स्टेनलेस स्टील के संकीर्ण-बोर कॉलम को स्लरी पैकिंग विधि का उपयोग करके पैक किया गया था, संदर्भ में उपयोग की गई समान प्रक्रिया को लागू करते हुए। 31. एक स्टेनलेस स्टील कॉलम (ग्लास-लाइन, 100 × 1.8 मिमी आईडी) जिसमें 1 µm फ्रिट युक्त आउटलेट फिटिंग है, को एक स्लरी पैकर (ऑलटेक डीयरफील्ड, IL, USA) से जोड़ा गया था। 1.2 mL मेथनॉल में 150 mg स्थिर चरण को निलंबित करके एक स्थिर चरण घोल तैयार करें और इसे स्टोरेज कॉलम में भेजें। मेथनॉल का उपयोग स्लरी विलायक के साथ-साथ प्रणोदक विलायक के रूप में किया गया था। 100 MP का 10 मिनट, 80 MP का 15 मिनट और 60 MP का 30 मिनट के लिए दबाव लगाकर क्रमिक रूप से कॉलम भरें। पैकिंग के दौरान, कॉलम की एकसमान पैकिंग सुनिश्चित करने के लिए दो GC कॉलम शेकर्स (ऑलटेक, डीयरफील्ड, IL, USA) के साथ यांत्रिक कंपन लागू किया गया था। इनलेट और एलसी सिस्टम में एक और फिटिंग लगाकर इसकी कार्यक्षमता की जांच की जाती है।
एक LC पंप (10AD शिमादज़ु, जापान), इंजेक्टर (Valco (USA) C14 W.05) 50nL इंजेक्शन लूप के साथ, मेम्ब्रेन डिगैसर (शिमादज़ु DGU-14A), UV-VIS केशिका विंडो का निर्माण किया गया था विशेष µLC डिवाइस डिटेक्टर (UV-2075) और ग्लास-लाइन वाले माइक्रोकॉलम। अतिरिक्त कॉलम बैंड ब्रॉडनिंग के प्रभाव को कम करने के लिए बहुत संकीर्ण और छोटी कनेक्टिंग ट्यूबिंग का उपयोग करें। पैकेजिंग के बाद, केशिकाओं (50 µm id 365 और रिड्यूसिंग यूनियन केशिकाओं (50 µm) को रिड्यूसिंग यूनियन के 1/16″ आउटलेट पर स्थापित किया गया था। डेटा संग्रह और क्रोमैटोग्राफिक प्रसंस्करण मल्टीक्रो 2000 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके किया
मानव सीरम से एल्बुमिन, लाइओफिलाइज़्ड पाउडर, ≥ 96% (एगरोज़ जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस) 3 मिलीग्राम को ट्रिप्सिन (1.5 मिलीग्राम), 4.0 एम यूरिया (1 एमएल), और 0.2 एम अमोनियम बाइकार्बोनेट (1 एमएल) के साथ मिलाया गया। घोल को 10 मिनट तक हिलाया गया और 6 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर पानी के स्नान में रखा गया, फिर 0.1% टीएफए के 1 एमएल के साथ बुझाया गया। घोल को छान लें और 4 डिग्री सेल्सियस से नीचे स्टोर करें।
पेप्टाइड मिश्रण और HSA ट्रिप्सिन डाइजेस्ट के पृथक्करण का मूल्यांकन PMP स्तंभों पर अलग-अलग किया गया। PMP स्तंभ द्वारा HSA के पेप्टाइड मिश्रण और ट्रिप्सिन डाइजेस्ट के पृथक्करण की जाँच करें और परिणामों की तुलना एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड स्तंभ से करें। सैद्धांतिक प्लेट संख्या की गणना इस प्रकार की जाती है:
नंगे सिलिका कणों और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों की SEM छवियों को चित्र 2 में दिखाया गया है। नंगे सिलिका कणों (A, B) की SEM छवियों से पता चलता है कि, हमारे पिछले अध्ययनों के विपरीत, ये कण गोलाकार हैं जिसमें कण लम्बे होते हैं या अनियमित सममिति रखते हैं। लिगैंड-बंधित सिलिका कणों (C, D) की सतह नंगे सिलिका कणों की तुलना में चिकनी है, जो सिलिका कणों की सतह पर पॉलीस्टाइनिन श्रृंखलाओं की कोटिंग के कारण हो सकता है।
नंगे सिलिका कणों (ए, बी) और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों (सी, डी) की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियां।
नंगे सिलिका कणों और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों के कण आकार वितरण चित्र 3(ए) में दिखाए गए हैं। आयतन-आधारित कण आकार वितरण वक्रों से पता चला कि रासायनिक संशोधन के बाद सिलिका कणों का आकार बढ़ गया (चित्र 3ए)। वर्तमान अध्ययन और पिछले अध्ययन से सिलिका कणों के कण आकार वितरण डेटा की तुलना तालिका 1(ए) में की गई है। पीएमपी का आयतन-आधारित कण आकार, डी(0.5), 3.36 माइक्रोन है, जबकि हमारे पिछले अध्ययन में एडी(0.5) का मान 3.05 माइक्रोन (पॉलीस्टाइरीन-बाउंड सिलिका कण)34 था। प्रतिक्रिया मिश्रण में पीईजी, यूरिया, टीएमओएस और एसिटिक एसिड के अलग-अलग अनुपातों के कारण इस बैच में हमारे पिछले अध्ययन की तुलना में एक संकीर्ण कण आकार वितरण था। स्टाइरीन ने सिलिका सतह पर केवल एक पॉलीस्टाइरीन परत (0.97 µm) जमा की, जबकि PMP चरण में परत की मोटाई 1.38 µm थी।
नंगे सिलिका कणों और लिगैंड-बद्ध सिलिका कणों का कण आकार वितरण (ए) और छिद्र आकार वितरण (बी)।
वर्तमान अध्ययन के सिलिका कणों के छिद्र का आकार, छिद्र की मात्रा और सतह क्षेत्र तालिका 1(बी) में दिए गए हैं। नंगे सिलिका कणों और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों के PSD प्रोफाइल चित्र 3(बी) में दिखाए गए हैं। परिणाम हमारे पिछले अध्ययन से तुलनीय हैं। नंगे और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों के छिद्र के आकार क्रमशः 310 और 241 हैं, जो दर्शाता है कि रासायनिक संशोधन के बाद छिद्र का आकार 69 से कम हो जाता है, जैसा कि तालिका 1(बी) में दिखाया गया है, और वक्र का परिवर्तन चित्र 3(बी) में दिखाया गया है। इसी तरह, रासायनिक संशोधन के बाद सिलिका कणों का छिद्र आयतन 0.67 से घटकर 0.58 सेमी3/जी हो गया। वर्तमान में अध्ययन किए गए सिलिका कणों का विशिष्ट सतह क्षेत्र 116 एम2/जी है रासायनिक संशोधन के बाद भी यह 116 m2/g से घटकर 105 m2/g हो गया।
स्थिर चरण के तत्व विश्लेषण के परिणाम तालिका 2 में दिखाए गए हैं। वर्तमान स्थिर चरण का कार्बन लोडिंग 6.35% है, जो हमारे पिछले अध्ययन (पॉलीस्टाइरीन बंधित सिलिका कण, क्रमशः 7.93%35 और 10.21%) के कार्बन लोडिंग से कम है। 42. वर्तमान स्थिर चरण का कार्बन लोडिंग कम है, क्योंकि वर्तमान एसपी की तैयारी में, स्टाइरीन के अलावा, कुछ ध्रुवीय लिगैंड जैसे फेनिलमैलेमाइड-मिथाइलविनाइलिसोसायनेट (पीसीएमपी) और 4-हाइड्रॉक्सी-टेम्पो का उपयोग किया गया था। वर्तमान स्थिर चरण का नाइट्रोजन भार प्रतिशत 2.21% है, जबकि पिछले अध्ययनों में नाइट्रोजन का भार क्रमशः 0.1735 और 0.85% था। इसका मतलब यह है कि फेनिलमैलेमाइड के कारण वर्तमान स्थिर चरण में नाइट्रोजन का wt % अधिक है क्रमशः 2.7% और 2.9%, जबकि अंतिम उत्पाद (6) का कार्बन लोडिंग 6.35% था, जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है। वजन में कमी को PMP स्थिर चरण के साथ जांचा गया था, और TGA वक्र चित्र 4 में दिखाया गया है। TGA वक्र 8.6% की वजन कमी दिखाता है, जो कार्बन लोडिंग (6.35%) के साथ अच्छी तरह से मेल खाता है क्योंकि लिगैंड में न केवल C बल्कि N, O और H भी होते हैं।
फेनिलमैलेइमाइड-मिथाइलविनाइलिसोसायनेट लिगैंड को सिलिका कणों के सतह संशोधन के लिए चुना गया था क्योंकि इसमें ध्रुवीय फेनिलमैलेइमाइड समूह और विनाइल आइसोसाइनेट समूह हैं। विनाइल आइसोसाइनेट समूह जीवित मूलक पोलीमराइजेशन द्वारा स्टाइरीन के साथ आगे प्रतिक्रिया कर सकते हैं। दूसरा कारण एक ऐसे समूह को सम्मिलित करना है जिसमें विश्लेषक के साथ मध्यम अंतःक्रिया हो और विश्लेषक और स्थिर चरण के बीच कोई मजबूत इलेक्ट्रोस्टैटिक अंतःक्रिया न हो, क्योंकि फेनिलमैलेइमाइड भाग में सामान्य पीएच पर कोई आभासी आवेश नहीं होता है। स्थिर चरण की ध्रुवता को स्टाइरीन की इष्टतम मात्रा और मुक्त मूलक पोलीमराइजेशन के प्रतिक्रिया समय द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। प्रतिक्रिया का अंतिम चरण (मुक्त-मूलक पोलीमराइजेशन) महत्वपूर्ण है और स्थिर चरण की ध्रुवता को बदल सकता है स्टाइरीन में अलग-अलग कार्बन लोडिंग होती है। फिर से, इन स्थिर चरणों को स्टेनलेस स्टील के कॉलम में लोड करें और उनके क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन (चयनात्मकता, रिज़ॉल्यूशन, एन मूल्य, आदि) की जांच करें। इन प्रयोगों के आधार पर, नियंत्रित ध्रुवता और अच्छे विश्लेषक प्रतिधारण को सुनिश्चित करने के लिए पीएमपी स्थिर चरण तैयार करने के लिए एक अनुकूलित सूत्रीकरण का चयन किया गया था।
पांच पेप्टाइड मिश्रण (ग्लाइ-टायर, ग्लाइ-ल्यू-टायर, ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग, टायर-आइल-ग्लाइ-सेर-आर्ग, ल्यूसीन एनकेफैलिन) का भी एक मोबाइल चरण का उपयोग करके पीएमपी कॉलम का उपयोग करके मूल्यांकन किया गया; 80 μL/मिनट की प्रवाह दर पर 60/40 (v/v) एसिटोनिट्राइल/पानी (0.1% TFA)। इष्टतम निक्षालन स्थितियों के अंतर्गत, प्रति स्तंभ सैद्धांतिक प्लेट संख्या (N) (100 × 1.8 mm id) 20,000 ± 100 (200,000 प्लेट/m²) है। तालिका 3 में तीन PMP स्तंभों के लिए N मान दिए गए हैं और क्रोमैटोग्राम चित्र 5A में दिखाए गए हैं। उच्च प्रवाह दर (700 μL/min) पर PMP स्तंभ पर तेज़ विश्लेषण, एक मिनट के भीतर पाँच पेप्टाइड निक्षालन किए गए, N मान बहुत अच्छे थे, 13,500 ± 330 प्रति स्तंभ (100 × 1.8 mm id), 135,000 प्लेट/m के अनुरूप है (चित्र 5B)। × 1.8 मिमी आईडी) को पुनरुत्पादकता की जांच के लिए पीएमपी स्थिर चरण के तीन अलग-अलग लॉट्स के साथ पैक किया गया था। प्रत्येक कॉलम के लिए विश्लेषक सांद्रता को इष्टतम निक्षालन स्थितियों और सैद्धांतिक प्लेटों की संख्या एन और प्रत्येक कॉलम पर समान परीक्षण मिश्रण को अलग करने के लिए अवधारण समय का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया था। पीएमपी कॉलम के लिए पुनरुत्पादकता डेटा तालिका 4 में दिखाया गया है। पीएमपी कॉलम की पुनरुत्पादकता बहुत कम %आरएसडी मूल्यों के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित है, जैसा कि तालिका 3 में दिखाया गया है।
पीएमपी कॉलम (बी) और एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम (ए) पर पेप्टाइड मिश्रण का पृथक्करण; मोबाइल चरण 60/40 एसीएन/एच2ओ (टीएफए 0.1%), पीएमपी कॉलम आयाम (100 × 1.8 मिमी आईडी); विश्लेषणात्मक यौगिकों का निक्षालन क्रम: 1 (ग्लाइ-टायर), 2 (ग्लाइ-ल्यू-टायर), 3 (ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग), 4 (टायर-आइल-ग्लाइ-सेर-आर्ग) और 5 (ल्यूसीन) एसिड एनकेफैलिन))।
उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी में मानव सीरम एल्ब्यूमिन के ट्रिप्टिन डाइजेस्ट के पृथक्करण के लिए एक पीएमपी कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) का मूल्यांकन किया गया था। चित्रा 6 में क्रोमैटोग्राम दिखाता है कि नमूना अच्छी तरह से अलग हो गया है और रिज़ॉल्यूशन बहुत अच्छा है। एचएसए डाइजेस्ट का विश्लेषण 100 µL/मिनट की प्रवाह दर, मोबाइल चरण 70/30 एसिटोनिट्राइल/पानी और 0.1% टीएफए का उपयोग करके किया गया था। जैसा कि क्रोमैटोग्राम (चित्रा 6) में दिखाया गया है, एचएसए पाचन को 17 पेप्टाइड्स के अनुरूप 17 चोटियों में विभाजित किया गया है। एचएसए डाइजेस्ट में प्रत्येक चोटी की पृथक्करण दक्षता की गणना की गई
एचएसए (100 × 1.8 मिमी आईडी) का एक ट्रिप्टिन डाइजेस्ट पीएमपी कॉलम पर अलग किया गया; प्रवाह दर (100 µL/मिनट), मोबाइल चरण 60/40 एसिटोनिट्राइल/पानी 0.1% टीएफए के साथ।
जहाँ L स्तंभ की लंबाई है, η मोबाइल चरण की श्यानता है, ΔP स्तंभ का पृष्ठ दाब है, और u मोबाइल चरण का रैखिक वेग है। PMP स्तंभ की पारगम्यता 2.5 × 10-14 m2 थी, प्रवाह दर 25 μL/मिनट थी, और 60/40 v/v ACN/पानी का उपयोग किया गया था। PMP स्तंभ (100 × 1.8 मिमी आईडी) की पारगम्यता हमारे पिछले अध्ययन संदर्भ 34 के समान थी। सतही रूप से छिद्रपूर्ण कणों से भरे स्तंभ की पारगम्यता है: 1.3 μm कणों के लिए 1.7 × 10-15, 1.7 μm कणों के लिए 3.1 × 10-15, 2.6 μm कणों के लिए 5.2 × 10-15 और 2.5 × 10-14 m2 μm कण 43.इसलिए, PMP चरण की पारगम्यता 5 μm कोर-शेल कणों के समान है।
जहाँ Wx क्लोरोफॉर्म से भरे स्तंभ का भार है, Wy मेथनॉल से भरे स्तंभ का भार है, और ρ विलायक का घनत्व है। मेथनॉल (ρ = 0.7866) और क्लोरोफॉर्म (ρ = 1.484) के घनत्व। सिलिका कण-C18 स्तंभों (100 × 1.8 मिमी आईडी) 34 और C18-यूरिया स्तंभों 31 की कुल छिद्रता, जिनका हमने पहले अध्ययन किया था, क्रमशः 0.63 और 0.55 थीं। इसका अर्थ है कि यूरिया लिगैंड की उपस्थिति स्थिर चरण की पारगम्यता को कम करती है। दूसरी ओर, PMP स्तंभ (100 × 1.8 मिमी आईडी) की कुल छिद्रता 0.60 है। PMP स्तंभों की पारगम्यता C18-बंधित सिलिका कणों से भरे स्तंभों की तुलना में कम है क्योंकि C18-प्रकार के स्थिर चरणों में C18 लिगैंड सिलिका कणों से रैखिक श्रृंखलाओं के रूप में जुड़े होते हैं, जबकि पॉलीस्टाइरीन-प्रकार के स्थिर चरणों में, इसके चारों ओर एक अपेक्षाकृत मोटी बहुलक परत बनती है। एक विशिष्ट प्रयोग में, स्तंभ छिद्रता की गणना इस प्रकार की जाती है:
चित्र 7A,B वैन डीम्टर प्लॉट के PMP कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) और एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) को समान निक्षालन स्थितियों (यानी, 60/40 ACN/H2O और 0.1% TFA) का उपयोग करते हुए दिखाते हैं। चयनित पेप्टाइड मिश्रण (ग्लाइ-टायर, ग्लाइ-ल्यू-टायर, ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्ग, टायर-आइल-ग्लाइ-सेर-आर्ग, ल्यूसीन एनकेफालिन) 20 µL/ में तैयार किए गए थे। दोनों स्तंभों के लिए न्यूनतम प्रवाह दर 800 µL/मिनट है। PMP स्तंभ और एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड स्तंभ के लिए इष्टतम प्रवाह दर (80 µL/मिनट) पर न्यूनतम HETP मान क्रमशः 2.6 µm और 3.9 µm थे। HETP मान दर्शाते हैं कि PMP स्तंभ (100 × 1.8 mm id) की पृथक्करण दक्षता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड स्तंभ (100 × 1.8 mm id) से काफी बेहतर है। चित्र 7(A) में वैन डीम्टर प्लॉट दिखाता है कि बढ़ते प्रवाह के साथ N मान में कमी, हमारे पिछले अध्ययन में। एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम की तुलना में पीएमपी कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) की उच्च पृथक्करण दक्षता कण आकार, आकार और वर्तमान कार्य में उपयोग की जाने वाली जटिल कॉलम पैकिंग प्रक्रियाओं में सुधार पर आधारित है।
(ए) वैन डीम्टर प्लॉट (एचईटीपी बनाम मोबाइल चरण रैखिक वेग) 0.1% टीएफए के साथ 60/40 एसीएन/एच2ओ में एक पीएमपी कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) का उपयोग करके प्राप्त किया गया। (बी) वैन डीम्टर प्लॉट (एचईटीपी बनाम मोबाइल चरण रैखिक वेग) 0.1% टीएफए के साथ 60/40 एसीएन/एच2ओ में एक एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) का उपयोग करके प्राप्त किया गया।
उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी में सिंथेटिक पेप्टाइड मिश्रण और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएएस) के ट्रिप्सिन डाइजेस्ट के पृथक्करण के लिए एक ध्रुवीय-एम्बेडेड पॉलीस्टाइरीन स्थिर चरण तैयार और मूल्यांकन किया गया था। पेप्टाइड मिश्रणों के लिए पीएमपी स्तंभों का क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन पृथक्करण दक्षता और संकल्प में उत्कृष्ट है। पीएमपी स्तंभों का बेहतर पृथक्करण प्रदर्शन विभिन्न कारणों से होता है, जैसे कि सिलिका कणों के कण आकार और छिद्र आकार, स्थिर चरण का नियंत्रित संश्लेषण और जटिल स्तंभ पैकिंग। उच्च पृथक्करण दक्षता के अलावा, उच्च प्रवाह दरों पर कम कॉलम बैक प्रेशर इस स्थिर चरण का एक और लाभ है। पीएमपी स्तंभ अच्छी प्रजनन क्षमता प्रदर्शित करते हैं
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