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छिद्रयुक्त सिलिका कणों को कुछ संशोधनों के साथ सोल-जेल विधि द्वारा तैयार किया गया ताकि वृहद छिद्रयुक्त कण प्राप्त हो सकें। इन कणों को एन-फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइलआइसोसाइनेट (पीएमआई) और स्टाइरीन के साथ प्रतिवर्ती योग विखंडन श्रृंखला स्थानांतरण (आरएएफटी) बहुलकीकरण द्वारा व्युत्पन्न किया गया ताकि एन-फेनिलमेलिमाइड इंटरकैलेशन ऑफ पॉलीस्टाइरीन (पीएमपी) स्थिर चरण तैयार किया जा सके। संकीर्ण-बोर स्टेनलेस स्टील कॉलम (100 × 1.8 मिमी आंतरिक भाग) को स्लरी पैकिंग द्वारा भरा गया। पांच पेप्टाइड (ग्लाइ-टाइरीन, ग्लाइ-ल्यू-टाइरीन, ग्लाइ-ग्लाइ-टाइरीन-आर्जिनिन, टाइरीन-आइलीन-ग्लाइ-सेरीन-आर्जिनिन, ल्यूसीन एनकेफेलिन) से युक्त पेप्टाइड मिश्रण के पीएमपी कॉलम पृथक्करण (क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन) और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (एचएएस) के ट्रिप्सिन पाचन का मूल्यांकन किया गया। इष्टतम इल्यूशन स्थितियों के तहत, पेप्टाइड मिश्रण की सैद्धांतिक प्लेट गणना उच्च स्तर तक होती है। 280,000 प्लेटें/मीटर²। विकसित कॉलम के पृथक्करण प्रदर्शन की तुलना वाणिज्यिक एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम से करने पर यह पाया गया कि पृथक्करण दक्षता और रिज़ॉल्यूशन के मामले में पीएमपी कॉलम का पृथक्करण प्रदर्शन वाणिज्यिक कॉलम से बेहतर था।
हाल के वर्षों में, जैव-औषधीय उद्योग एक विस्तारित वैश्विक बाजार बन गया है, जिसकी बाजार हिस्सेदारी में उल्लेखनीय वृद्धि हुई है। जैव-औषधीय उद्योग की तीव्र वृद्धि1,2,3 के साथ, पेप्टाइड और प्रोटीन के विश्लेषण की अत्यधिक आवश्यकता है। लक्षित पेप्टाइड के अलावा, पेप्टाइड संश्लेषण के दौरान कई अशुद्धियाँ उत्पन्न होती हैं, इसलिए वांछित शुद्धता वाले पेप्टाइड प्राप्त करने के लिए क्रोमैटोग्राफिक शुद्धिकरण की आवश्यकता होती है। शरीर के तरल पदार्थों, ऊतकों और कोशिकाओं में प्रोटीन का विश्लेषण और लक्षण वर्णन एक अत्यंत चुनौतीपूर्ण कार्य है, क्योंकि एक ही नमूने में संभावित रूप से पता लगाने योग्य प्रजातियों की संख्या बहुत अधिक होती है। यद्यपि मास स्पेक्ट्रोमेट्री पेप्टाइड और प्रोटीन अनुक्रमण के लिए एक प्रभावी उपकरण है, यदि ऐसे नमूनों को एक ही बार में मास स्पेक्ट्रोमीटर में इंजेक्ट किया जाता है, तो पृथक्करण आदर्श नहीं होगा। इस समस्या को एमएस विश्लेषण से पहले लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (एलसी) पृथक्करण को लागू करके कम किया जा सकता है, जिससे एक समय में मास स्पेक्ट्रोमीटर में प्रवेश करने वाले विश्लेषकों की संख्या कम हो जाएगी4,5,6। इसके अलावा, तरल चरण पृथक्करण के दौरान, विश्लेषकों को संकीर्ण क्षेत्रों में केंद्रित किया जा सकता है, जिससे उनकी सांद्रता बढ़ जाती है। विश्लेषक और एमएस पहचान संवेदनशीलता में सुधार। तरल क्रोमेटोग्राफी (एलसी) पिछले दशक में काफी आगे बढ़ गई है और प्रोटिओमिक विश्लेषण में एक लोकप्रिय तकनीक बन गई है7,8,9,10।
रिवर्स-फेज़ लिक्विड क्रोमैटोग्राफी (आरपी-एलसी) का उपयोग ऑक्टाडेसिल-मॉडिफाइड सिलिका (ओडीएस) को स्थिर चरण के रूप में उपयोग करके पेप्टाइड मिश्रणों के शुद्धिकरण और पृथक्करण के लिए व्यापक रूप से किया जाता है11,12,13। हालांकि, आरपी स्थिर चरण पेप्टाइड और प्रोटीन की जटिल संरचना और उभय-प्रेमी प्रकृति के कारण उनका संतोषजनक पृथक्करण प्रदान नहीं करते हैं14,15। इसलिए, ध्रुवीय और गैर-ध्रुवीय घटकों वाले पेप्टाइड और प्रोटीन का विश्लेषण करने के लिए विशेष रूप से डिज़ाइन किए गए स्थिर चरणों की आवश्यकता होती है ताकि इन विश्लेषकों के साथ परस्पर क्रिया की जा सके16। मिश्रित-मोड क्रोमैटोग्राफी, जो बहुआयामी अंतःक्रियाएं प्रदान करती है, पेप्टाइड, प्रोटीन और अन्य जटिल मिश्रणों के पृथक्करण के लिए आरपी-एलसी का एक विकल्प हो सकती है। कई मिश्रित-मोड स्थिर चरण तैयार किए गए हैं, और इन चरणों से भरे स्तंभों का उपयोग पेप्टाइड और प्रोटीन पृथक्करण के लिए किया गया है17,18,19,20,21। मिश्रित-मोड स्थिर चरण (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, पोलर इंटरकैलेशन/RPLC) पेप्टाइड और प्रोटीन पृथक्करण के लिए उपयुक्त हैं क्योंकि इनमें पोलर और नॉन-पोलर दोनों समूह मौजूद होते हैं22,23,24,25,26,27,28। इसी तरह, सहसंयोजक रूप से बंधे पोलर समूहों वाले पोलर इंटरकैलेटिंग स्टेशनरी चरण पोलर और नॉन-पोलर एनालाइट्स के लिए अच्छी पृथक्करण क्षमता और अद्वितीय चयनात्मकता दिखाते हैं, क्योंकि पृथक्करण एनालाइट और स्टेशनरी चरण के बीच की परस्पर क्रिया पर निर्भर करता है। मल्टीमॉडल इंटरैक्शन 29, 30, 31, 32। हाल ही में, झांग एट अल. 30 ने डोडेसिल-टर्मिनेटेड पॉलीएमीन स्टेशनरी फेज तैयार किया और हाइड्रोकार्बन, एंटीडिप्रेसेंट, फ्लेवोनोइड, न्यूक्लियोसाइड, एस्ट्रोजेन और कई अन्य विश्लेषकों को सफलतापूर्वक अलग किया। पोलर इंटरकैलेटर में पोलर और नॉन-पोलर दोनों समूह होते हैं, इसलिए इसका उपयोग पेप्टाइड और प्रोटीन को अलग करने के लिए किया जा सकता है जिनमें हाइड्रोफोबिक और हाइड्रोफिलिक दोनों भाग होते हैं। पोलर-एम्बेडेड कॉलम (जैसे, एमाइड-एम्बेडेड C18 कॉलम) एसेन्टिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम के व्यापार नाम से व्यावसायिक रूप से उपलब्ध हैं, लेकिन इन कॉलमों का उपयोग केवल एमीन 33 के विश्लेषण के लिए किया जाता है।
वर्तमान अध्ययन में, एक ध्रुवीय-अंतर्निहित स्थिर चरण (एन-फेनिलमेलिमाइड-अंतर्निहित पॉलीस्टाइरीन) तैयार किया गया और एचएसए के पेप्टाइड और ट्रिप्सिन डाइजेस्ट के पृथक्करण के लिए इसका मूल्यांकन किया गया। स्थिर चरण को निम्नलिखित रणनीति का उपयोग करके तैयार किया गया था। छिद्रित सिलिका कणों को हमारे पिछले प्रकाशन में दी गई प्रक्रिया के अनुसार, तैयारी प्रोटोकॉल में कुछ संशोधनों के साथ तैयार किया गया था। यूरिया, पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल (पीईजी), टीएमओएस, पानी और एसिटिक एसिड के अनुपात को बड़े छिद्र आकार वाले सिलिका कणों को तैयार करने के लिए समायोजित किया गया था। दूसरे, एक नए लिगैंड, फेनिलमेलिमाइड-मिथाइल विनाइल आइसोसाइनेट को संश्लेषित किया गया और ध्रुवीय अंतर्निहित स्थिर चरण तैयार करने के लिए सिलिका कणों को व्युत्पन्न करने के लिए उपयोग किया गया। परिणामी स्थिर चरण को अनुकूलित पैकिंग योजना का उपयोग करके एक स्टेनलेस स्टील कॉलम (100 × 1.8 मिमी आंतरिक व्यास) में पैक किया गया था। कॉलम पैकिंग में यांत्रिक कंपन की सहायता ली गई ताकि कॉलम के भीतर एक सजातीय परत बन सके। पेप्टाइड मिश्रणों के पैक्ड कॉलम पृथक्करण का मूल्यांकन करें। पांच पेप्टाइड (ग्लाइ-टाइर, ग्लाइ-ल्यू-टाइर, ग्लाइ-ग्लाइ-टाइर-आर्जिनिन, टाइर-आइल-ग्लाइ-सेरम-आर्जिनिन, ल्यूसीन एनकेफेलिन) और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (HAS) के ट्रिप्सिन डाइजेस्ट का अध्ययन किया गया। पेप्टाइड मिश्रण और HSA के ट्रिप्सिन डाइजेस्ट को अच्छे रिज़ॉल्यूशन और दक्षता के साथ अलग होते देखा गया। PMP कॉलम के पृथक्करण प्रदर्शन की तुलना एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम से की गई। PMP कॉलम पर पेप्टाइड और प्रोटीन दोनों अच्छी तरह से अलग और कुशल पाए गए, जो एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम की तुलना में अधिक कुशल था।
PEG (पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल), यूरिया, एसिटिक एसिड, ट्राइमेथॉक्सी ऑर्थोसिलिकेट (TMOS), ट्राइमिथाइल क्लोरोसिलैन (TMCS), ट्रिप्सिन, ह्यूमन सीरम एल्ब्यूमिन (HSA), अमोनियम क्लोराइड, यूरिया, हेक्सेन मेथिल्डिसिलाज़ेन (HMDS), मेथैक्रिलोइल क्लोराइड (MC), स्टाइरीन, 4-हाइड्रॉक्सी-TEMPO, बेंज़ॉयल पेरोक्साइड (BPO), HPLC ग्रेड एसीटोनाइट्राइल (ACN), मेथनॉल, 2-प्रोपेनॉल और एसीटोन सिग्मा-एल्ड्रिच (सेंट लुइस, एमओ, यूएसए) से खरीदे गए।
यूरिया (8 ग्राम), पॉलीइथिलीन ग्लाइकॉल (8 ग्राम) और 0.01 एन एसिटिक एसिड के 8 मिलीलीटर के मिश्रण को 10 मिनट तक हिलाया गया, और फिर बर्फ की ठंडी अवस्था में इसमें 24 मिलीलीटर टीएमओएस मिलाया गया। अभिक्रिया मिश्रण को स्टेनलेस स्टील ऑटोक्लेव में 40°C पर 6 घंटे और फिर 120°C पर 8 घंटे तक गर्म किया गया। पानी को निकाल दिया गया और अवशिष्ट पदार्थ को 70°C पर 12 घंटे तक सुखाया गया। सूखे हुए नरम द्रव्यमान को ओवन में बारीक पीसा गया और 550°C पर 12 घंटे तक कैल्सीनेशन किया गया। कण आकार, छिद्र आकार और सतह क्षेत्र में पुनरुत्पादकता की जांच करने के लिए तीन बैच तैयार किए गए और उनका विश्लेषण किया गया।
पूर्व-संश्लेषित लिगैंड फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइलिसोसाइनेट (PCMP) के साथ सिलिका कणों के सतह संशोधन और उसके बाद स्टाइरीन के साथ रेडियल पॉलीमराइजेशन द्वारा, एक ध्रुवीय समूह युक्त यौगिक तैयार किया गया। समुच्चय और पॉलीस्टाइरीन श्रृंखलाओं के लिए स्थिर अवस्था। तैयारी प्रक्रिया का वर्णन नीचे किया गया है।
एन-फेनिलमेलिमाइड (200 मिलीग्राम) और मेथिल विनाइल आइसोसाइनेट (100 मिलीग्राम) को शुष्क टोल्यून में घोला गया, और फेनिलमेलिमाइड-मेथिल विनाइल आइसोसाइनेट कॉपोलिमर (पीएमसीपी) तैयार करने के लिए अभिक्रिया फ्लास्क में 0.1 मिलीलीटर 2,2′-एज़ोइसोब्यूटीरोनिट्राइल (एआईबीएन) मिलाया गया। मिश्रण को 60°C पर 3 घंटे तक गर्म किया गया, छान लिया गया और 40°C पर 3 घंटे के लिए ओवन में सुखाया गया।
शुष्क सिलिका कणों (2 ग्राम) को शुष्क टोल्यून (100 मिलीलीटर) में फैलाया गया, 500 मिलीलीटर के गोल पेंदे वाले फ्लास्क में 10 मिनट तक हिलाया और ध्वनि उत्पन्न की गई। पीएमसीपी (10 मिलीग्राम) को टोल्यून में घोला गया और एक ड्रॉपिंग फ़नल के माध्यम से बूंद-बूंद करके अभिक्रिया फ्लास्क में डाला गया। मिश्रण को 100°C पर 8 घंटे तक रिफ्लक्स किया गया, फ़िल्टर किया गया और एसीटोन से धोया गया तथा 60°C पर 3 घंटे तक सुखाया गया। फिर, पीएमसीपी-बंधित सिलिका कणों (100 ग्राम) को टोल्यून (200 मिलीलीटर) में घोला गया और उत्प्रेरक के रूप में 100 माइक्रोलीटर डाइब्यूटिलटिन डिलाउरेट की उपस्थिति में 4-हाइड्रॉक्सी-टेम्पो (2 मिलीलीटर) मिलाया गया। मिश्रण को 50°C पर 8 घंटे तक हिलाया गया, फ़िल्टर किया गया और 50°C पर 3 घंटे तक सुखाया गया।
स्टाइरीन (1 मिलीलीटर), बेंज़ॉयल पेरोक्साइड बीपीओ (0.5 मिलीलीटर), और टेम्पो-पीएमसीपी से जुड़े सिलिका कण (1.5 ग्राम) को टोल्यून में फैलाया गया और नाइट्रोजन से शुद्ध किया गया। स्टाइरीन का बहुलकीकरण 100°C पर 12 घंटे तक किया गया। परिणामी उत्पाद को मेथनॉल से धोया गया और 60°C पर रात भर सुखाया गया। संपूर्ण अभिक्रिया योजना चित्र 1 में दर्शाई गई है।
नमूनों को 393 K पर 1 घंटे के लिए डीगैस किया गया ताकि अवशिष्ट दबाव 10-3 टॉर से कम हो जाए। P/P0 = 0.99 के सापेक्ष दबाव पर अवशोषित N2 की मात्रा का उपयोग कुल छिद्र आयतन निर्धारित करने के लिए किया गया था। नंगे और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों की आकृति विज्ञान की जांच स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी (हिताची हाई टेक्नोलॉजीज, टोक्यो, जापान) द्वारा की गई थी। सूखे नमूनों (नंगे सिलिका और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों) को चिपकने वाली कार्बन टेप का उपयोग करके एक एल्यूमीनियम कॉलम पर रखा गया था। Q150T स्पटर कोटर का उपयोग करके नमूनों पर सोने की परत चढ़ाई गई, और नमूनों पर 5 nm Au परत जमा की गई। यह कम वोल्टेज का उपयोग करके प्रक्रिया दक्षता में सुधार करता है और महीन दाने, कोल्ड स्पटरिंग प्रदान करता है। मौलिक विश्लेषण के लिए थर्मो इलेक्ट्रॉन (वाल्थम, एमए, यूएसए) फ्लैश EA1112 मौलिक विश्लेषक का उपयोग किया गया था। मालवर्न (वॉर्सेस्टरशायर, यूके) मास्टरसाइज़र 2000 कण आकार विश्लेषक का उपयोग किया गया था। कण आकार वितरण प्राप्त करने के लिए इसका उपयोग किया गया था। बिना किसी आवरण वाले सिलिका कणों और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों (प्रत्येक 5 मिलीग्राम) को 5 मिलीलीटर आइसोप्रोपेनॉल में फैलाया गया, 10 मिनट के लिए सोनिकेट किया गया, 5 मिनट के लिए वर्टेक्स किया गया और मास्टरसाइज़र के ऑप्टिकल बेंच पर रखा गया। थर्मोग्रैविमेट्रिक विश्लेषण 30 से 800 डिग्री सेल्सियस के तापमान सीमा में 5 डिग्री सेल्सियस प्रति मिनट की दर से किया गया।
ग्लास-लाइन वाले स्टेनलेस स्टील के संकीर्ण-बोर कॉलम, जिनका आयाम (100 × 1.8 मिमी आंतरिक भाग) था, को स्लरी पैकिंग विधि का उपयोग करके पैक किया गया, जिसमें संदर्भ में प्रयुक्त समान प्रक्रिया का प्रयोग किया गया। 31. एक स्टेनलेस स्टील कॉलम (कांच-लेपित, 100 × 1.8 मिमी आंतरिक व्यास) जिसमें 1 µm फ्रिट युक्त आउटलेट फिटिंग थी, को एक स्लरी पैकर (ऑलटेक डियरफील्ड, आईएल, यूएसए) से जोड़ा गया। 1.2 मिलीलीटर मेथनॉल में 150 मिलीग्राम स्थिर चरण को निलंबित करके एक स्थिर चरण स्लरी तैयार करें और इसे भंडारण कॉलम में भेजें। मेथनॉल का उपयोग स्लरी विलायक और प्रणोदक विलायक दोनों के रूप में किया गया था। कॉलम को क्रमिक रूप से 10 मिनट के लिए 100 एमपी, 15 मिनट के लिए 80 एमपी और 30 मिनट के लिए 60 एमपी के दबाव लगाकर भरें। पैकिंग के दौरान, कॉलम की एकसमान पैकिंग सुनिश्चित करने के लिए दो जीसी कॉलम शेकर (ऑलटेक, डियरफील्ड, आईएल, यूएसए) के साथ यांत्रिक कंपन लगाया गया था। स्लरी पैकर को बंद करें और कॉलम के भीतर किसी भी क्षति को रोकने के लिए दबाव को धीरे-धीरे छोड़ें। कॉलम को स्लरी पैकिंग इकाई से डिस्कनेक्ट करें और एक अन्य फिटिंग को कनेक्ट करें। इसके प्रदर्शन की जांच करने के लिए इनलेट और एलसी सिस्टम दोनों की जांच की जाती है।
एक एलसी पंप (10AD शिमाद्ज़ू, जापान), 50nL इंजेक्शन लूप वाला इंजेक्टर (वाल्को (यूएसए) C14 W.05), मेम्ब्रेन डिगैसर (शिमाद्ज़ू DGU-14A), यूवी-विज़ कैपिलरी विंडो, विशेष µLC डिवाइस डिटेक्टर (UV-2075) और ग्लास-लाइन्ड माइक्रो कॉलम का उपयोग करके एक विशेष µLC डिवाइस बनाया गया। अतिरिक्त कॉलम बैंड ब्रॉडनिंग के प्रभाव को कम करने के लिए बहुत पतली और छोटी कनेक्टिंग ट्यूबिंग का उपयोग किया गया। पैकेजिंग के बाद, कैपिलरी (50 μm id 365) और रिड्यूसिंग यूनियन कैपिलरी (50 μm) को रिड्यूसिंग यूनियन के 1/16″ आउटलेट पर स्थापित किया गया। डेटा संग्रह और क्रोमैटोग्राफिक प्रोसेसिंग मल्टीक्रो 2000 सॉफ्टवेयर का उपयोग करके की गई। 254 nm पर निगरानी की गई। विश्लेषकों का यूवी अवशोषण के लिए परीक्षण किया गया। क्रोमैटोग्राफिक डेटा का विश्लेषण ओरिजिनप्रो8 (नॉर्थम्प्टन, एमए) द्वारा किया गया।
मानव सीरम से प्राप्त एल्ब्यूमिन, लाइयोफिलाइज्ड पाउडर, ≥ 96% (एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस) 3 मिलीग्राम को ट्रिप्सिन (1.5 मिलीग्राम), 4.0 एम यूरिया (1 मिलीलीटर) और 0.2 एम अमोनियम बाइकार्बोनेट (1 मिलीलीटर) के साथ मिलाया गया। घोल को 10 मिनट तक हिलाया गया और 37°C पर 6 घंटे के लिए जल स्नान में रखा गया, फिर 0.1% टीएफए के 1 मिलीलीटर से अभिक्रिया को रोक दिया गया। घोल को छान लें और 4°C से नीचे संग्रहित करें।
पेप्टाइड मिश्रण और एचएसए ट्रिप्सिन डाइजेस्ट के पृथक्करण का मूल्यांकन पीएमपी कॉलम पर अलग-अलग किया गया। पीएमपी कॉलम द्वारा एचएसए के पेप्टाइड मिश्रण और ट्रिप्सिन डाइजेस्ट के पृथक्करण की जाँच करें और परिणामों की तुलना एसेंटिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम से करें। सैद्धांतिक प्लेट संख्या की गणना निम्न प्रकार से की जाती है:
चित्र 2 में बिना किसी आवरण वाले सिलिका कणों और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों की SEM छवियां दिखाई गई हैं। बिना किसी आवरण वाले सिलिका कणों (A, B) की SEM छवियों से पता चलता है कि हमारे पिछले अध्ययनों के विपरीत, ये कण गोलाकार हैं जिनमें कण लंबे या अनियमित समरूपता वाले हैं। लिगैंड-बंधित सिलिका कणों (C, D) की सतह बिना किसी आवरण वाले सिलिका कणों की तुलना में अधिक चिकनी है, जिसका कारण सिलिका कणों की सतह पर पॉलीस्टायरीन श्रृंखलाओं की परत चढ़ना हो सकता है।
बिना किसी बंधन वाले सिलिका कणों (A, B) और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों (C, D) की स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोप छवियां।
चित्र 3(A) में बिना किसी संशोधन वाले सिलिका कणों और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों के कण आकार वितरण को दर्शाया गया है। आयतन-आधारित कण आकार वितरण वक्रों से पता चलता है कि रासायनिक संशोधन के बाद सिलिका कणों का आकार बढ़ गया (चित्र 3A)। वर्तमान अध्ययन और पिछले अध्ययन से प्राप्त सिलिका कणों के कण आकार वितरण डेटा की तुलना तालिका 1(A) में की गई है। PMP का आयतन-आधारित कण आकार, d(0.5), 3.36 μm है, जबकि हमारे पिछले अध्ययन में ad(0.5) का मान 3.05 μm (पॉलीस्टाइरीन-बद्ध सिलिका कण) था।34 इस बैच में पिछले अध्ययन की तुलना में कण आकार वितरण संकरा था, जिसका कारण अभिक्रिया मिश्रण में PEG, यूरिया, TMOS और एसिटिक अम्ल के भिन्न अनुपात थे। PMP चरण का कण आकार हमारे पिछले अध्ययन में अध्ययन किए गए पॉलीस्टाइरीन-बद्ध सिलिका कण चरण की तुलना में थोड़ा बड़ा है। इसका अर्थ है कि स्टाइरीन के साथ सिलिका कणों का सतही कार्यात्मककरण सिलिका की सतह पर केवल पॉलीस्टाइरीन की एक परत (0.97 µm) जमा हुई, जबकि PMP चरण में परत की मोटाई 1.38 µm थी।
बिना किसी आवरण वाले सिलिका कणों और लिगैंड-युक्त सिलिका कणों का कण आकार वितरण (A) और छिद्र आकार वितरण (B)।
वर्तमान अध्ययन में शामिल सिलिका कणों के छिद्र आकार, छिद्र आयतन और सतह क्षेत्र को तालिका 1(B) में दर्शाया गया है। बिना किसी संशोधन वाले सिलिका कणों और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों के PSD प्रोफाइल चित्र 3(B) में दिखाए गए हैं। परिणाम हमारे पिछले अध्ययन के समान हैं। बिना किसी संशोधन वाले और लिगैंड-बंधित सिलिका कणों के छिद्र आकार क्रमशः 310 और 241 हैं, जो दर्शाता है कि रासायनिक संशोधन के बाद छिद्र आकार में 69 की कमी आई है, जैसा कि तालिका 1(B) में दिखाया गया है, और वक्र में परिवर्तन चित्र 3(B) में दर्शाया गया है। इसी प्रकार, रासायनिक संशोधन के बाद सिलिका कणों का छिद्र आयतन 0.67 से घटकर 0.58 cm³/g हो गया। वर्तमान में अध्ययन किए गए सिलिका कणों का विशिष्ट सतह क्षेत्र 116 m²/g है, जो हमारे पिछले अध्ययन (124 m²/g) के समान है। तालिका 1(B) में दिखाए अनुसार, सिलिका कणों का सतह क्षेत्र (m²/g) भी कम हो गया है। रासायनिक संशोधन के बाद 116 m2/g से 105 m2/g तक।
स्थिर अवस्था के मौलिक विश्लेषण के परिणाम तालिका 2 में दर्शाए गए हैं। वर्तमान स्थिर अवस्था का कार्बन भार 6.35% है, जो हमारे पिछले अध्ययन (पॉलीस्टाइरीन बंधित सिलिका कण, क्रमशः 7.93%35 और 10.21%)42 के कार्बन भार से कम है। वर्तमान स्थिर अवस्था का कार्बन भार कम है, क्योंकि वर्तमान एसपी के निर्माण में, स्टाइरीन के अलावा, कुछ ध्रुवीय लिगेंड जैसे कि फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइलिसोसाइनेट (पीसीएमपी) और 4-हाइड्रॉक्सी-टीईएमपीओ का उपयोग किया गया था। वर्तमान स्थिर अवस्था का नाइट्रोजन भार प्रतिशत 2.21% है, जबकि पिछले अध्ययनों में नाइट्रोजन का भार प्रतिशत क्रमशः 0.1735 और 0.85% था। इसका अर्थ है कि फेनिलमेलिमाइड के कारण वर्तमान स्थिर अवस्था में नाइट्रोजन का भार प्रतिशत अधिक है। इसी प्रकार, उत्पाद (4) और (5) के कार्बन भार भी इसी प्रकार थे। क्रमशः 2.7% और 2.9%, जबकि अंतिम उत्पाद (6) का कार्बन लोडिंग 6.35% था, जैसा कि तालिका 2 में दिखाया गया है। PMP स्थिर चरण के साथ वजन घटाने की जाँच की गई, और TGA वक्र चित्र 4 में दिखाया गया है। TGA वक्र 8.6% का वजन घटाना दर्शाता है, जो कार्बन लोडिंग (6.35%) के साथ अच्छी तरह से मेल खाता है क्योंकि लिगेंड में न केवल C बल्कि N, O और H भी होते हैं।
सिलिका कणों के सतह संशोधन के लिए फेनिलमेलिमाइड-मिथाइलविनाइलआइसोसाइनेट लिगैंड का चयन किया गया क्योंकि इसमें ध्रुवीय फेनिलमेलिमाइड समूह और विनाइलआइसोसाइनेट समूह होते हैं। विनाइलआइसोसाइनेट समूह जीवित मूलक बहुलकीकरण द्वारा स्टाइरीन के साथ आगे प्रतिक्रिया कर सकते हैं। दूसरा कारण यह है कि एक ऐसे समूह को शामिल किया जाए जिसका विश्लेष्य के साथ मध्यम अंतःक्रिया हो और विश्लेष्य तथा स्थिर अवस्था के बीच कोई प्रबल विद्युतस्थैतिक अंतःक्रिया न हो, क्योंकि सामान्य pH पर फेनिलमेलिमाइड अंश पर कोई आभासी आवेश नहीं होता है। स्थिर अवस्था की ध्रुवीयता को स्टाइरीन की इष्टतम मात्रा और मुक्त मूलक बहुलकीकरण के प्रतिक्रिया समय द्वारा नियंत्रित किया जा सकता है। प्रतिक्रिया का अंतिम चरण (मुक्त मूलक बहुलकीकरण) महत्वपूर्ण है और स्थिर अवस्था की ध्रुवीयता को बदल सकता है। इन स्थिर अवस्थाओं के कार्बन भार की जाँच के लिए मौलिक विश्लेषण किया गया। यह देखा गया कि स्टाइरीन की मात्रा और प्रतिक्रिया समय बढ़ाने से स्थिर अवस्था का कार्बन भार बढ़ जाता है और इसके विपरीत भी। स्टाइरीन की विभिन्न सांद्रताओं के साथ तैयार किए गए एसपी में अलग-अलग गुण होते हैं। कार्बन लोडिंग। फिर से, इन स्थिर चरणों को स्टेनलेस स्टील कॉलम में लोड करें और उनके क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन (चयनात्मकता, रिज़ॉल्यूशन, एन मान, आदि) की जाँच करें। इन प्रयोगों के आधार पर, नियंत्रित ध्रुवीयता और अच्छे विश्लेषक प्रतिधारण को सुनिश्चित करने के लिए पीएमपी स्थिर चरण तैयार करने के लिए एक अनुकूलित फॉर्मूलेशन का चयन किया गया।
मोबाइल फेज का उपयोग करके पीएमपी कॉलम का उपयोग करते हुए पांच पेप्टाइड मिश्रणों (ग्लाइ-टायर, ग्लाइ-ल्यू-टायर, ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्जिनिन, टायरिन-आइल-ग्लाइ-सेरीन-आर्जिनिन, ल्यूसीन एनकेफेलिन) का भी मूल्यांकन किया गया; 60/40 (v/v) एसीटोनिट्राइल/जल (0.1% TFA) 80 μL/min की प्रवाह दर पर। इष्टतम इल्यूशन स्थितियों के तहत, प्रति कॉलम (100 × 1.8 mm id) सैद्धांतिक प्लेट संख्या (N) 20,000 ± 100 (200,000 प्लेट/m²) है। तालिका 3 में तीन PMP कॉलम के लिए N मान दिए गए हैं और क्रोमैटोग्राम चित्र 5A में दिखाए गए हैं। उच्च प्रवाह दर (700 μL/min) पर PMP कॉलम पर तीव्र विश्लेषण में, पाँच पेप्टाइड एक मिनट के भीतर इल्यूट हो गए, N मान बहुत अच्छे थे, 13,500 ± 330 प्रति कॉलम (100 × 1.8 mm id), जो 135,000 प्लेट/m² के बराबर है (चित्र 5B)। तीन समान आकार के कॉलम (100 × पुनरुत्पादकता की जाँच करने के लिए तीन अलग-अलग मात्रा में PMP स्थिर चरण से भरे तीन कॉलम (1.8 मिमी आंतरिक व्यास वाले) तैयार किए गए। प्रत्येक कॉलम के लिए विश्लेष्य सांद्रता को इष्टतम इल्यूशन स्थितियों, सैद्धांतिक प्लेटों की संख्या (N) और प्रत्येक कॉलम पर समान परीक्षण मिश्रण को अलग करने के लिए प्रतिधारण समय का उपयोग करके रिकॉर्ड किया गया। PMP कॉलम के लिए पुनरुत्पादकता डेटा तालिका 4 में दिखाया गया है। PMP कॉलम की पुनरुत्पादकता बहुत कम %RSD मानों के साथ अच्छी तरह से सहसंबंधित है, जैसा कि तालिका 3 में दिखाया गया है।
PMP कॉलम (B) ​​और एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम (A) पर पेप्टाइड मिश्रण का पृथक्करण; मोबाइल चरण 60/40 ACN/H2O (TFA 0.1%), PMP कॉलम आयाम (100 × 1.8 मिमी आंतरिक भाग); यौगिकों का विश्लेषणात्मक इल्यूशन क्रम: 1 (ग्लाइसिन-टायरिन), 2 (ग्लाइसिन-ल्यूसिन-टायरिन), 3 (ग्लाइसिन-ग्लाइसिन-टायरिन-आर्जिनिन), 4 (टायरिन-आइसिन-ग्लाइसिन-सेरीन-आर्जिनिन) और 5 (ल्यूसिन एसिड एनकेफेलिन)।
उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी में मानव सीरम एल्ब्यूमिन के ट्रिप्टिक डाइजेस्ट के पृथक्करण के लिए एक पीएमपी कॉलम (100 × 1.8 मिमी आंतरिक व्यास) का मूल्यांकन किया गया। चित्र 6 में क्रोमैटोग्राम दर्शाता है कि नमूना अच्छी तरह से पृथक हो गया है और रिज़ॉल्यूशन बहुत अच्छा है। एचएसए डाइजेस्ट का विश्लेषण 100 µL/मिनट की प्रवाह दर, 70/30 एसीटोनिट्राइल/जल के मोबाइल चरण और 0.1% टीएफए का उपयोग करके किया गया। जैसा कि क्रोमैटोग्राम (चित्र 6) में दिखाया गया है, एचएसए पाचन को 17 पेप्टाइड के अनुरूप 17 चोटियों में विभाजित किया गया है। एचएसए डाइजेस्ट में प्रत्येक चोटी की पृथक्करण दक्षता की गणना की गई और मान तालिका 5 में दिए गए हैं।
एचएसए (100 × 1.8 मिमी आईडी) के ट्रिप्टिक डाइजेस्ट को पीएमपी कॉलम पर अलग किया गया; प्रवाह दर (100 µL/मिनट), मोबाइल चरण 60/40 एसीटोनिट्राइल/पानी जिसमें 0.1% टीएफए था।
जहां L स्तंभ की लंबाई है, η गतिशील चरण की श्यानता है, ΔP स्तंभ का पश्च दाब है, और u गतिशील चरण का रेखीय वेग है। PMP स्तंभ की पारगम्यता 2.5 × 10⁻¹⁴ m² थी, प्रवाह दर 25 μL/min थी, और 60/40 v/v ACN/जल का उपयोग किया गया था। PMP स्तंभ (100 × 1.8 mm आंतरिक व्यास) की पारगम्यता हमारे पिछले अध्ययन (संदर्भ 34) के समान थी। सतही छिद्रयुक्त कणों से भरे स्तंभ की पारगम्यता इस प्रकार है: 1.3 μm कणों के लिए 1.7 × 10⁻¹⁵, 1.7 μm कणों के लिए 3.1 × 10⁻¹⁵, 2.6 μm कणों के लिए 5.2 × 10⁻¹⁵ और 5 μm कणों के लिए 2.5 × 10⁻¹⁴ m²। 43.इसलिए, पीएमपी चरण की पारगम्यता 5 μm कोर-शेल कणों के समान है।
जहां Wx क्लोरोफॉर्म से भरे कॉलम का भार है, Wy मेथनॉल से भरे कॉलम का भार है, और ρ विलायक का घनत्व है। मेथनॉल (ρ = 0.7866) और क्लोरोफॉर्म (ρ = 1.484) के घनत्व क्रमशः 0.63 और 0.55 हैं। हमने पहले जिन सिलिका कण-C18 कॉलम (100 × 1.8 मिमी आंतरिक व्यास) 34 और C18-यूरिया कॉलम 31 का अध्ययन किया था, उनकी कुल सरंध्रता क्रमशः 0.63 और 0.55 थी। इसका अर्थ है कि यूरिया लिगेंड की उपस्थिति स्थिर चरण की पारगम्यता को कम करती है। दूसरी ओर, PMP कॉलम (100 × 1.8 मिमी आंतरिक व्यास) की कुल सरंध्रता 0.60 है। PMP कॉलम की पारगम्यता C18-बंधित सिलिका कणों से भरे कॉलम की तुलना में कम होती है क्योंकि C18-प्रकार के स्थिर चरणों में C18 सिलिका कणों से लिगेंड रैखिक श्रृंखलाओं के रूप में जुड़े होते हैं, जबकि पॉलीस्टाइरीन-प्रकार के स्थिर चरणों में, इसके चारों ओर एक अपेक्षाकृत मोटी बहुलक परत बनती है। एक विशिष्ट प्रयोग में, स्तंभ की सरंध्रता की गणना इस प्रकार की जाती है:
चित्र 7A,B में PMP कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) और एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) को समान इल्यूशन स्थितियों (अर्थात, 60/40 ACN/H2O और 0.1% TFA) का उपयोग करके दिखाया गया है। वैन डीम्टर प्लॉट का। चयनित पेप्टाइड मिश्रण (ग्लाइ-टायर, ग्लाइ-ल्यू-टायर, ग्लाइ-ग्लाइ-टायर-आर्जिनिन, टायर-आइल-ग्लाइ-सेरीन-आर्जिनिन, ल्यूसीन एनकेफेलिन) को 20 µL/मिनट की सांद्रता में तैयार किया गया। दोनों कॉलम के लिए न्यूनतम प्रवाह दर 800 µL/मिनट है। इष्टतम प्रवाह दर (80 µL/मिनट) पर PMP कॉलम और एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम के लिए न्यूनतम HETP मान क्रमशः 2.6 µm और 3.9 µm थे। HETP मान दर्शाते हैं कि PMP कॉलम (100 × 1.8 mm id) की पृथक्करण दक्षता व्यावसायिक रूप से उपलब्ध एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम (100 × 1.8 mm id) की तुलना में कहीं बेहतर है। चित्र 7(A) में वैन डीमटर प्लॉट दर्शाता है कि प्रवाह बढ़ने के साथ N मान में कमी हमारे पिछले अध्ययन की तुलना में महत्वपूर्ण नहीं है। अध्ययन। एसेन्टिस एक्सप्रेस आरपी-एमाइड कॉलम की तुलना में पीएमपी कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) की उच्च पृथक्करण दक्षता वर्तमान कार्य में उपयोग किए गए कण आकार, आकार और जटिल कॉलम पैकिंग प्रक्रियाओं में सुधार पर आधारित है34।
(A) 0.1% TFA के साथ 60/40 ACN/H2O में PMP कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) का उपयोग करके प्राप्त वैन डीमटर प्लॉट (HETP बनाम मोबाइल चरण रैखिक वेग)। (B) 0.1% TFA के साथ 60/40 ACN/H2O में एसेंटिस एक्सप्रेस RP-एमाइड कॉलम (100 × 1.8 मिमी आईडी) का उपयोग करके प्राप्त वैन डीमटर प्लॉट (HETP बनाम मोबाइल चरण रैखिक वेग)।
उच्च प्रदर्शन तरल क्रोमैटोग्राफी (PMP) में सिंथेटिक पेप्टाइड मिश्रणों और मानव सीरम एल्ब्यूमिन (HAS) के ट्रिप्सिन पाचन के पृथक्करण के लिए एक ध्रुवीय-अंतर्निहित पॉलीस्टाइरीन स्थिर चरण तैयार किया गया और उसका मूल्यांकन किया गया। पेप्टाइड मिश्रणों के लिए PMP स्तंभों का क्रोमैटोग्राफिक प्रदर्शन पृथक्करण दक्षता और विभेदन में उत्कृष्ट है। PMP स्तंभों के बेहतर पृथक्करण प्रदर्शन के कई कारण हैं, जैसे कि सिलिका कणों का कण आकार और छिद्र आकार, स्थिर चरण का नियंत्रित संश्लेषण और जटिल स्तंभ पैकिंग। उच्च पृथक्करण दक्षता के अलावा, उच्च प्रवाह दरों पर कम स्तंभ बैक प्रेशर इस स्थिर चरण का एक और लाभ है। PMP स्तंभ अच्छी पुनरुत्पादकता प्रदर्शित करते हैं और इनका उपयोग पेप्टाइड मिश्रणों और विभिन्न प्रोटीनों के ट्रिप्सिन पाचन के विश्लेषण के लिए किया जा सकता है। हम तरल क्रोमैटोग्राफी में प्राकृतिक उत्पादों, औषधीय पौधों से जैवसक्रिय यौगिकों और कवक अर्क के पृथक्करण के लिए इस स्तंभ का उपयोग करने का इरादा रखते हैं। भविष्य में, प्रोटीनों और मोनोक्लोनल एंटीबॉडी के पृथक्करण के लिए भी PMP स्तंभों का मूल्यांकन किया जाएगा।
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