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Des particules de silice poreuses ont été préparées par une méthode sol-gel avec quelques modifications pour obtenir des particules macroporeuses. Ces particules ont été dérivées par polymérisation par transfert de chaîne par addition-fragmentation réversible (RAFT) avec du N-phénylmaléimide-méthylvinylisocyanate (PMI) et du styrène pour préparer une phase stationnaire d'intercalation de N-phénylmaléimide de polystyrène (PMP). Des colonnes en acier inoxydable à alésage étroit (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) ont été remplies par un garnissage en suspension. La séparation sur colonne PMP d'un mélange de peptides composé de cinq peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enképhaline) a été évaluée (performance chromatographique) et la digestion par la trypsine de l'albumine sérique humaine (HAS). Dans des conditions d'élution optimales, le nombre théorique de plaques du mélange de peptides peut atteindre 280 000. plaques/m².En comparant les performances de séparation de la colonne développée avec la colonne commerciale Ascentis Express RP-Amide, il a été observé que les performances de séparation de la colonne PMP étaient supérieures à celles de la colonne commerciale en termes d'efficacité de séparation et de résolution.
Ces dernières années, l'industrie biopharmaceutique est devenue un marché mondial en pleine expansion, avec une augmentation substantielle de sa part de marché. Avec la croissance explosive de l'industrie biopharmaceutique1,2,3, l'analyse des peptides et des protéines est devenue très demandée. Outre le peptide cible, plusieurs impuretés sont générées lors de la synthèse peptidique, nécessitant une purification chromatographique pour obtenir des peptides de la pureté souhaitée. L'analyse et la caractérisation des protéines dans les fluides corporels, les tissus et les cellules constituent une tâche extrêmement difficile en raison du grand nombre d'espèces potentiellement détectables dans un seul échantillon. Bien que la spectrométrie de masse soit un outil efficace pour le séquençage des peptides et des protéines, si ces échantillons sont injectés dans le spectromètre de masse en un seul passage, la séparation ne sera pas optimale. Ce problème peut être atténué en mettant en œuvre des séparations par chromatographie liquide (LC) avant l'analyse par spectrométrie de masse, ce qui réduira le nombre d'analytes entrant dans le spectromètre de masse à un instant donné4,5,6. De plus, lors de la séparation en phase liquide, les analytes peuvent être focalisés dans des zones étroites, ce qui permet de les concentrer et d'améliorer la détection par spectrométrie de masse. sensibilité.La chromatographie liquide (LC) a considérablement progressé au cours de la dernière décennie et est devenue une technique populaire dans l'analyse protéomique7,8,9,10.
Français La chromatographie liquide en phase inverse (RP-LC) est largement utilisée pour la purification et la séparation de mélanges de peptides en utilisant de la silice modifiée par octadécyle (ODS) comme phase stationnaire11,12,13. Cependant, les phases stationnaires RP ne permettent pas une séparation satisfaisante des peptides et des protéines en raison de leur structure complexe et de leur nature amphiphile14,15. Par conséquent, des phases stationnaires spécialement conçues sont nécessaires pour analyser les peptides et les protéines avec des fractions polaires et non polaires pour interagir avec ces analytes et les retenir16. La chromatographie en mode mixte, qui fournit des interactions multimodales, peut être une alternative à la RP-LC pour la séparation des peptides, des protéines et d'autres mélanges complexes. Plusieurs phases stationnaires en mode mixte ont été préparées, et des colonnes remplies de ces phases ont été utilisées pour les séparations de peptides et de protéines17,18,19,20,21. Les phases stationnaires en mode mixte (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalation polaire/RPLC) sont adapté aux séparations de peptides et de protéines en raison de la présence de groupes polaires et non polaires22,23,24,25,26,27,28. De même, les phases stationnaires intercalaires polaires avec des groupes polaires liés de manière covalente présentent un bon pouvoir de séparation et une sélectivité unique pour les analytes polaires et non polaires, car la séparation dépend de l'interaction entre l'analyte et la phase stationnaire. Interactions multimodales29, 30, 31, 32.Récemment, Zhang et al. 30 a préparé une phase stationnaire de polyamine à terminaison dodécyle et a séparé avec succès des hydrocarbures, des antidépresseurs, des flavonoïdes, des nucléosides, des œstrogènes et plusieurs autres analytes. L'intercalateur polaire possède des groupes polaires et non polaires, il peut donc être utilisé pour séparer des peptides et des protéines qui ont des fractions hydrophobes et hydrophiles. Les colonnes polaires intégrées (par exemple, les colonnes C18 intégrées à l'amide) sont disponibles dans le commerce sous le nom commercial de colonnes Ascentis Express RP-Amide, mais ces colonnes sont utilisées uniquement pour l'analyse de l'amine 33.
Français Dans l'étude actuelle, une phase stationnaire polaire intégrée (polystyrène N-phénylmaléimide intégré) a été préparée et évaluée pour la séparation des peptides et des digestions trypsiques de HSA. La phase stationnaire a été préparée en utilisant la stratégie suivante. Des particules de silice poreuses ont été préparées selon la procédure donnée dans notre publication précédente avec quelques modifications au protocole de préparation. Le rapport urée, polyéthylène glycol (PEG), TMOS, eau et acide acétique a été ajusté pour préparer des particules de silice avec une grande taille de pores. Deuxièmement, un nouveau ligand, le phénylmaléimide-méthyl vinyl isocyanate, a été synthétisé et utilisé pour dériver les particules de silice afin de préparer une phase stationnaire polaire intégrée. La phase stationnaire résultante a été conditionnée dans une colonne en acier inoxydable (100 × 1,8 mm id) en utilisant le schéma de conditionnement optimisé. Le conditionnement de la colonne est assisté par des vibrations mécaniques pour garantir la formation d'un lit homogène dans la colonne. Évaluer la séparation sur colonne garnie de mélanges de peptides constitués de cinq peptides ; (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enképhaline) et digestion de trypsine de l'albumine sérique humaine (HAS). Le mélange de peptides et la digestion de trypsine de HSA se sont avérés se séparer avec une bonne résolution et une bonne efficacité. Les performances de séparation de la colonne PMP ont été comparées à celles de la colonne Ascentis Express RP-Amide. Les peptides et les protéines se sont avérés bien résolus et efficaces sur la colonne PMP, qui était plus efficace que la colonne Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyéthylène glycol), urée, acide acétique, triméthoxy orthosilicate (TMOS), triméthyl chlorosilane (TMCS), trypsine, albumine sérique humaine (HSA), chlorure d'ammonium, urée, hexane méthyldisilazane (HMDS), chlorure de méthacryloyle (MC), styrène, 4-hydroxy-TEMPO, peroxyde de benzoyle (BPO), acétonitrile de qualité HPLC (ACN), méthanol, 2-propanol et acétone. Acheté auprès de Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis).
Un mélange d'urée (8 g), de polyéthylène glycol (8 g) et de 8 ml d'acide acétique 0,01 N a été agité pendant 10 minutes, puis 24 ml de TMOS y ont été ajoutés dans des conditions glacées. Le mélange réactionnel a été chauffé à 40 °C pendant 6 heures, puis à 120 °C pendant 8 heures dans un autoclave en acier inoxydable. L'eau a été versée et le matériau résiduel a été séché à 70 °C pendant 12 heures. La masse molle séchée a été broyée en douceur dans un four et calcinée à 550 °C pendant 12 heures. Trois lots ont été préparés et caractérisés pour examiner la reproductibilité de la taille des particules, de la taille des pores et de la surface.
Par modification de surface de particules de silice avec un ligand présynthétisé, le phénylmaléimide-méthylvinylisocyanate (PCMP), puis par polymérisation radiale avec du styrène, un composé contenant un groupe polaire a été préparé. Phase stationnaire pour agrégats et chaînes de polystyrène. Le procédé de préparation est décrit ci-dessous.
Le N-phénylmaléimide (200 mg) et l'isocyanate de méthyle et de vinyle (100 mg) ont été dissous dans du toluène sec, et 0,1 mL de 2,2'-azoisobutyronitrile (AIBN) a été ajouté au ballon de réaction pour préparer le copolymère phénylmaléimide-isocyanate de méthyle et de vinyle (PMCP). Le mélange a été chauffé à 60°C pendant 3 heures, filtré et séché dans une étuve à 40°C pendant 3 heures.
Français Les particules de silice séchées (2 g) ont été dispersées dans du toluène sec (100 ml), agitées et soniquées dans un ballon à fond rond de 500 ml pendant 10 min. Le PMCP (10 mg) a été dissous dans du toluène et ajouté goutte à goutte au ballon de réaction via un entonnoir à gouttes. Le mélange a été chauffé à reflux à 100 °C pendant 8 heures, filtré et lavé à l'acétone et séché à 60 °C pendant 3 heures. Ensuite, les particules de silice liées au PMCP (100 g) ont été dissoutes dans du toluène (200 ml) et du 4-hydroxy-TEMPO (2 ml) a été ajouté en présence de 100 µL de dilaurate de dibutylétain comme catalyseur. Le mélange a été agité à 50 °C pendant 8 heures, filtré et séché à 50 °C pendant 3 heures.
Le styrène (1 mL), le peroxyde de benzoyle BPO (0,5 mL) et les particules de silice attachées au TEMPO-PMCP (1,5 g) ont été dispersés dans du toluène et purgés à l'azote. La polymérisation du styrène a été réalisée à 100 °C pendant 12 heures. Le produit résultant a été lavé au méthanol et séché à 60 °C pendant la nuit. Le schéma réactionnel global est présenté dans la figure 1.
Les échantillons ont été dégazés à 393 K pendant 1 heure pour obtenir une pression résiduelle inférieure à 10-3 Torr. La quantité de N2 adsorbée à une pression relative de P/P0 = 0,99 a été utilisée pour déterminer le volume total des pores. La morphologie des particules de silice nues et liées par ligand a été examinée par microscopie électronique à balayage (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japon). Les échantillons séchés (silice nue et particules de silice liées par ligand) ont été placés sur une colonne d'aluminium à l'aide d'un ruban adhésif en carbone. De l'or a été plaqué sur les échantillons à l'aide d'un pulvérisateur Q150T, et une couche d'or de 5 nm a été déposée sur les échantillons. Cela améliore l'efficacité du processus en utilisant de faibles tensions et permet une pulvérisation à froid à grain fin. Un analyseur élémentaire Thermo Electron (Waltham, MA, États-Unis) Flash EA1112 a été utilisé pour l'analyse élémentaire. Un granulomètre Malvern (Worcestershire, Royaume-Uni) Mastersizer 2000 a été utilisé pour obtenir la taille des particules. Les particules de silice nues et les particules de silice liées à un ligand (5 mg chacune) ont été dispersées dans 5 ml d'isopropanol, soniquées pendant 10 min, vortexées pendant 5 min et placées sur le banc optique du Mastersizer. L'analyse thermogravimétrique a été réalisée à une vitesse de 5 °C par minute sur une plage de températures de 30 à 800 °C.
Des colonnes à alésage étroit en acier inoxydable revêtues de verre de dimensions (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) ont été remplies à l'aide de la méthode de remplissage en suspension, en appliquant la même procédure que celle utilisée dans la réf. 31. Une colonne en acier inoxydable (vitrifiée, 100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) avec un raccord de sortie contenant un fritté de 1 µm a été connectée à un packer de suspension (Alltech Deerfield, IL, États-Unis). Préparer une suspension de phase stationnaire en suspendant 150 mg de phase stationnaire dans 1,2 ml de méthanol et l'envoyer à la colonne de stockage. Le méthanol a été utilisé comme solvant de suspension et comme solvant propulseur. Remplir la colonne séquentiellement en appliquant des pressions de 100 MP pendant 10 minutes, 80 MP pendant 15 minutes et 60 MP pendant 30 minutes. Pendant le remplissage, des vibrations mécaniques ont été appliquées avec deux agitateurs de colonne GC (Alltech, Deerfield, IL, États-Unis) pour assurer un remplissage uniforme de la colonne. Fermer le packer de suspension et relâcher lentement la pression pour éviter tout dommage à l'intérieur de la colonne. Déconnecter la colonne de l'unité de remplissage de suspension et connecter un autre raccord. à l'entrée et au système LC pour vérifier ses performances.
Français Une pompe LC (10AD Shimadzu, Japon), un injecteur (Valco (USA) C14 W.05) avec une boucle d'injection de 50 nL, un dégazeur à membrane (Shimadzu DGU-14A), une fenêtre capillaire UV-VIS ont été construits. Un détecteur spécial µLC (UV-2075) et des microcolonnes revêtues de verre ont été construits. Utilisez des tubes de connexion très étroits et courts pour minimiser l'effet de l'élargissement supplémentaire de la bande de colonne. Après l'emballage, des capillaires (50 μm id 365 et des capillaires de jonction réductrice (50 μm) ont été installés à la sortie 1/16″ de la jonction réductrice. La collecte des données et le traitement chromatographique ont été effectués à l'aide du logiciel Multichro 2000. Surveillance à 254 nm Les analytes ont été testés pour l'absorbance UV. Les données chromatographiques ont été analysées par OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumine de sérum humain, poudre lyophilisée, ≥ 96 % (électrophorèse sur gel d'agarose) 3 mg mélangée à de la trypsine (1,5 mg), 4,0 M d'urée (1 mL) et 0,2 M de bicarbonate d'ammonium (1 mL). La solution a été agitée pendant 10 minutes et conservée dans un bain-marie à 37 °C pendant 6 heures, puis trempée avec 1 mL de TFA à 0,1 %. Filtrer la solution et conserver à une température inférieure à 4 °C.
La séparation des mélanges de peptides et des digestions trypsine HSA a été évaluée séparément sur des colonnes PMP. Vérifiez la séparation du mélange de peptides et de la digestion trypsine HSA par la colonne PMP et comparez les résultats à la colonne Ascentis Express RP-Amide. Le nombre de plateaux théoriques est calculé comme suit :
Les images SEM de particules de silice nues et de particules de silice liées par ligand sont présentées dans la FIG. 2. Les images SEM de particules de silice nues (A, B) montrent que, contrairement à nos études précédentes, ces particules sont sphériques dans lesquelles les particules sont allongées ou ont une symétrie irrégulière. La surface des particules de silice liées par ligand (C, D) est plus lisse que celle des particules de silice nues, ce qui peut être dû au revêtement de chaînes de polystyrène sur la surface des particules de silice.
Images au microscope électronique à balayage de particules de silice nues (A, B) et de particules de silice liées à un ligand (C, D).
Français Les distributions granulométriques des particules de silice nue et des particules de silice liées par ligand sont présentées dans la Figure 3(A). Les courbes de distribution granulométrique en fonction du volume ont montré que la taille des particules de silice a augmenté après modification chimique (Fig. 3A). Les données de distribution granulométrique des particules de silice de l'étude actuelle et de l'étude précédente sont comparées dans le Tableau 1(A). La taille des particules en fonction du volume, d(0,5), de PMP est de 3,36 µm, comparée à notre étude précédente avec une valeur d(0,5) de 3,05 µm (particules de silice liées au polystyrène)34. Ce lot avait une distribution granulométrique plus étroite par rapport à notre étude précédente en raison des rapports variables de PEG, d'urée, de TMOS et d'acide acétique dans le mélange réactionnel. La taille des particules de la phase PMP est légèrement supérieure à celle de la phase de particules de silice liées au polystyrène que nous avons étudiée précédemment. Cela signifie que la fonctionnalisation de surface des particules de silice avec du styrène n'a déposé qu'une couche de polystyrène (0,97 µm) sur la surface de la silice, alors que dans la phase PMP, l'épaisseur de la couche était de 1,38 µm.
Distribution de la taille des particules (A) et distribution de la taille des pores (B) des particules de silice nues et des particules de silice liées à un ligand.
La taille des pores, le volume des pores et la surface spécifique des particules de silice de l'étude actuelle sont donnés dans le tableau 1(B). Les profils PSD des particules de silice nues et des particules de silice liées par ligand sont présentés dans la figure 3(B). Les résultats sont comparables à notre étude précédente. Les tailles des pores des particules de silice nues et liées par ligand sont respectivement de 310 et 241, ce qui indique que la taille des pores diminue de 69 après modification chimique, comme indiqué dans le tableau 1(B), et le changement de la courbe est montré dans la figure 3(B). De même, le volume des pores des particules de silice a diminué de 0,67 à 0,58 cm3/g après modification chimique. La surface spécifique des particules de silice actuellement étudiées est de 116 m2/g, ce qui est comparable à notre étude précédente (124 m2/g). Comme indiqué dans le tableau 1(B), la surface spécifique (m2/g) des particules de silice a également diminué de 116 m2/g à 105 m2/g après modification chimique.
Français Les résultats de l'analyse élémentaire de la phase stationnaire sont présentés dans le tableau 2. La charge en carbone de la phase stationnaire actuelle est de 6,35 %, ce qui est inférieur à la charge en carbone de notre étude précédente (particules de silice liées au polystyrène, 7,93 %35 et 10,21 %, respectivement) 42. La charge en carbone de la phase stationnaire actuelle est faible, car dans la préparation du SP actuel, en plus du styrène, certains ligands polaires tels que le phénylmaléimide-méthylvinylisocyanate (PCMP) et le 4-hydroxy-TEMPO ont été utilisés. Le pourcentage en poids d'azote de la phase stationnaire actuelle est de 2,21 %, contre 0,1735 et 0,85 % en poids d'azote dans les études précédentes, respectivement. Cela signifie que le pourcentage en poids d'azote est plus élevé dans la phase stationnaire actuelle en raison du phénylmaléimide. De même, les charges en carbone des produits (4) et (5) étaient respectivement de 2,7 % et 2,9 %, tandis que la charge en carbone du produit final (6) était de 6,35 %, comme indiqué dans le tableau 2. La perte de poids a été vérifiée avec la phase stationnaire PMP, et la courbe TGA est présentée dans la figure 4. La courbe TGA montre une perte de poids de 8,6 %, ce qui est en bon accord avec la charge en carbone (6,35 %) car les ligands contiennent non seulement C mais aussi N, O et H.
Le ligand phénylmaléimide-méthylvinylisocyanate a été choisi pour la modification de surface des particules de silice car il possède des groupes phénylmaléimide polaires et des groupes vinylisocyanate. Les groupes vinylisocyanate peuvent réagir avec le styrène par polymérisation radicalaire vivante. La deuxième raison est d'insérer un groupe ayant une interaction modérée avec l'analyte et aucune interaction électrostatique forte entre l'analyte et la phase stationnaire, puisque la fraction phénylmaléimide n'a pas de charge virtuelle à pH normal. La polarité de la phase stationnaire peut être contrôlée par la quantité optimale de styrène et le temps de réaction de la polymérisation radicalaire. La dernière étape de la réaction (polymérisation radicalaire) est critique et peut modifier la polarité de la phase stationnaire. Une analyse élémentaire a été réalisée pour vérifier la charge en carbone de ces phases stationnaires. Il a été observé qu'une augmentation de la quantité de styrène et du temps de réaction augmentait la charge en carbone de la phase stationnaire et vice versa. Les SP préparés avec différentes concentrations de styrène ont des charges en carbone différentes. De nouveau, chargez ces phases stationnaires dans des colonnes en acier inoxydable et vérifiez leur performances chromatographiques (sélectivité, résolution, valeur N, etc.). Sur la base de ces expériences, une formulation optimisée a été sélectionnée pour préparer la phase stationnaire PMP afin d'assurer une polarité contrôlée et une bonne rétention de l'analyte.
Cinq mélanges de peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enképhaline) ont également été évalués à l'aide d'une colonne PMP utilisant une phase mobile ; 60/40 (v/v) acétonitrile/eau (0,1 % TFA) à un débit de 80 μL/min.Dans des conditions d'élution optimales, le nombre théorique de plateaux (N) par colonne (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) est de 20 000 ± 100 (200 000 plateaux/m²).Le tableau 3 donne les valeurs de N pour les trois colonnes PMP et les chromatogrammes sont présentés dans la figure 5A.Analyse rapide sur une colonne PMP à haut débit (700 μL/min), cinq peptides ont été élués en une minute, les valeurs de N étaient très bonnes, 13 500 ± 330 par colonne (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur), correspondant à 135 000 plateaux/m² (figure 5B).Trois colonnes de taille identique (100 × 1,8 mm id) ont été remplis avec trois lots différents de phase stationnaire PMP pour vérifier la reproductibilité. La concentration d'analyte pour chaque colonne a été enregistrée en utilisant les conditions d'élution optimales et le nombre de plaques théoriques N et le temps de rétention pour séparer le même mélange d'essai sur chaque colonne. Les données de reproductibilité pour les colonnes PMP sont présentées dans le tableau 4. La reproductibilité de la colonne PMP est bien corrélée avec des valeurs %RSD très faibles, comme indiqué dans le tableau 3.
Séparation du mélange de peptides sur colonne PMP (B) et colonne Ascentis Express RP-Amide (A) ; phase mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), dimensions de la colonne PMP (100 × 1,8 mm id) ; analytique L'ordre d'élution des composés : 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) et 5 (leucine) acide enképhaline)).
Une colonne PMP (100 × 1,8 mm id) a été évaluée pour la séparation des digestions tryptiques de l'albumine sérique humaine en chromatographie liquide haute performance. Le chromatogramme de la figure 6 montre que l'échantillon est bien séparé et que la résolution est très bonne. Les digestions HSA ont été analysées à l'aide d'un débit de 100 µL/min, d'une phase mobile 70/30 acétonitrile/eau et 0,1 % de TFA. Comme le montre le chromatogramme (figure 6), la digestion HSA a été divisée en 17 pics correspondant à 17 peptides. L'efficacité de séparation de chaque pic dans la digestion HSA a été calculée et les valeurs sont données dans le tableau 5.
Une digestion tryptique de HSA (100 × 1,8 mm id) a été séparée sur une colonne PMP ; débit (100 µL/min), phase mobile 60/40 acétonitrile/eau avec 0,1 % de TFA.
où L est la longueur de la colonne, η est la viscosité de la phase mobile, ΔP est la contre-pression de la colonne et u est la vitesse linéaire de la phase mobile. La perméabilité de la colonne PMP était de 2,5 × 10-14 m2, le débit était de 25 μL/min et un mélange ACN/eau de 60/40 v/v a été utilisé. La perméabilité de la colonne PMP (100 × 1,8 mm id) était similaire à celle de notre étude précédente Réf. 34. La perméabilité de la colonne remplie de particules superficiellement poreuses est de : 1,7 × 10-15 pour les particules de 1,3 μm, 3,1 × 10-15 pour les particules de 1,7 μm, 5,2 × 10-15 et 2,5 × 10-14 m2 pour les particules de 2,6 μm. Pour 5 Particules μm 43. Par conséquent, la perméabilité de la phase PMP est similaire à celle des particules cœur-coquille de 5 μm.
Où Wx est le poids de la colonne remplie de chloroforme, Wy est le poids de la colonne remplie de méthanol et ρ est la masse volumique du solvant. Densités du méthanol (ρ = 0,7866) et du chloroforme (ρ = 1,484). La porosité totale des colonnes SILICA PARTICLES-C18 (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) 34 et C18-Urée 31 que nous avons étudiées précédemment était respectivement de 0,63 et 0,55. Cela signifie que la présence de ligands urée réduit la perméabilité de la phase stationnaire. D'autre part, la porosité totale de la colonne PMP (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) est de 0,60. La perméabilité des colonnes PMP est inférieure à celle des colonnes remplies de particules de silice liées C18, car dans les phases stationnaires de type C18, les ligands C18 sont liés aux particules de silice de manière linéaire. chaînes, tandis que dans les phases stationnaires de type polystyrène, une couche de polymère relativement épaisse se forme autour d'elle. Dans une expérience typique, la porosité de la colonne est calculée comme suit :
Les figures 7A et B montrent la colonne PMP (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) et la colonne Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) utilisant les mêmes conditions d'élution (c'est-à-dire 60/40 ACN/H2O et 0,1 % TFA). ) du tracé de van Deemter. Des mélanges de peptides sélectionnés (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enképhaline) ont été préparés dans 20 µL/ Le débit minimum pour les deux colonnes est de 800 µL/min. Les valeurs HETP minimales au débit optimal (80 µL/min) pour la colonne PMP et la colonne Ascentis Express RP-Amide étaient respectivement de 2,6 µm et 3,9 µm. Les valeurs HETP indiquent que l'efficacité de séparation de la colonne PMP (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) est bien meilleure que celle de la colonne Ascentis Express RP-Amide disponible dans le commerce (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur). Le graphique de van Deemter de la Fig. 7(A) montre que la diminution de la valeur N avec l'augmentation du débit n'est pas significative par rapport à notre étude précédente. L'efficacité de séparation supérieure de la colonne PMP (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) par rapport à la colonne Ascentis Express RP-Amide est basée sur des améliorations de la forme des particules, de la taille et des procédures complexes de remplissage de colonne utilisées dans le travail actuel34.
(A) Graphique de van Deemter (HETP versus vitesse linéaire de la phase mobile) obtenu à l'aide d'une colonne PMP (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) dans 60/40 ACN/H2O avec 0,1 % de TFA. (B) Graphique de van Deemter (HETP versus vitesse linéaire de la phase mobile) obtenu à l'aide d'une colonne Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) dans 60/40 ACN/H2O avec 0,1 % de TFA.
Français Une phase stationnaire en polystyrène polaire incorporé a été préparée et évaluée pour la séparation de mélanges de peptides synthétiques et de digestions de trypsine d'albumine sérique humaine (HAS) en chromatographie liquide haute performance. Les performances chromatographiques des colonnes PMP pour les mélanges de peptides sont excellentes en termes d'efficacité de séparation et de résolution. L'amélioration des performances de séparation des colonnes PMP est due à diverses raisons, telles que la taille des particules et la taille des pores des particules de silice, la synthèse contrôlée de la phase stationnaire et le remplissage complexe de la colonne. En plus d'une efficacité de séparation élevée, une faible contre-pression de la colonne à des débits élevés est un autre avantage de cette phase stationnaire. Les colonnes PMP présentent une bonne reproductibilité et peuvent être utilisées pour l'analyse de mélanges de peptides et la digestion à la trypsine de diverses protéines. Nous avons l'intention d'utiliser cette colonne pour la séparation de produits naturels, de composés bioactifs de plantes médicinales et d'extraits fongiques en chromatographie liquide. À l'avenir, les colonnes PMP seront également évaluées pour la séparation de protéines et d'anticorps monoclonaux.
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