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Des particules de silice poreuses ont été préparées par une méthode sol-gel modifiée afin d'obtenir des particules macroporeuses. Ces particules ont ensuite été fonctionnalisées par polymérisation RAFT (transfert de chaîne par addition-fragmentation réversible) avec du N-phénylmaléimide-méthylvinylisocyanate (PMI) et du styrène pour préparer une phase stationnaire de polystyrène intercalé avec du N-phénylmaléimide (PMP). Des colonnes en acier inoxydable à faible diamètre interne (100 × 1,8 mm) ont été remplies par la méthode du barbotage. La séparation sur colonne PMP d'un mélange peptidique composé de cinq peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine-enképhaline) a été évaluée (performances chromatographiques) ainsi que la digestion trypsique de l'albumine sérique humaine (HAS). Dans des conditions d'élution optimales, le nombre de plateaux théoriques du mélange peptidique atteint 280 000 plateaux/m². La comparaison des performances de séparation a été effectuée avec celles de la colonne PMP. Lors de la comparaison des performances de la colonne développée avec la colonne commerciale Ascentis Express RP-Amide, il a été observé que les performances de séparation de la colonne PMP étaient supérieures à celles de la colonne commerciale en termes d'efficacité de séparation et de résolution.
Ces dernières années, l'industrie biopharmaceutique est devenue un marché mondial en pleine expansion, avec une augmentation substantielle de sa part de marché. Face à cette croissance fulgurante^1,2,3, l'analyse des peptides et des protéines est devenue essentielle. Outre le peptide cible, plusieurs impuretés sont générées lors de la synthèse peptidique, nécessitant une purification chromatographique pour obtenir des peptides de la pureté souhaitée. L'analyse et la caractérisation des protéines dans les fluides corporels, les tissus et les cellules représentent un défi de taille en raison du grand nombre d'espèces potentiellement détectables dans un seul échantillon. Bien que la spectrométrie de masse soit un outil efficace pour le séquençage des peptides et des protéines, l'injection de ces échantillons en une seule passe ne permet pas une séparation optimale. Ce problème peut être atténué par la mise en œuvre de séparations par chromatographie liquide (CL) avant l'analyse par spectrométrie de masse (SM), ce qui réduit le nombre d'analytes entrant simultanément dans le spectromètre de masse^4,5,6. De plus, la séparation en phase liquide permet de concentrer les analytes dans des zones étroites, améliorant ainsi la sensibilité de détection de la SM. La chromatographie (LC) a considérablement progressé au cours de la dernière décennie et est devenue une technique populaire dans l'analyse protéomique7,8,9,10.
La chromatographie liquide en phase inverse (RP-LC) est largement utilisée pour la purification et la séparation de mélanges peptidiques, la silice modifiée par l'octadécyle (ODS) servant de phase stationnaire^11,12,13. Cependant, les phases stationnaires RP ne permettent pas une séparation satisfaisante des peptides et des protéines en raison de leur structure complexe et de leur nature amphiphile^14,15. Par conséquent, des phases stationnaires spécialement conçues sont nécessaires pour analyser les peptides et les protéines possédant des groupements polaires et non polaires, afin d'interagir avec ces analytes et de les retenir¹⁶. La chromatographie en mode mixte, qui offre des interactions multimodales, peut constituer une alternative à la RP-LC pour la séparation des peptides, des protéines et d'autres mélanges complexes. Plusieurs phases stationnaires en mode mixte ont été préparées et des colonnes garnies de ces phases ont été utilisées pour la séparation des peptides et des protéines^{17,18,19,20,21}. Les phases stationnaires en mode mixte (WAX/RPLC, HILIC/RPLC, intercalation polaire/RPLC) conviennent à La séparation des peptides et des protéines est due à la présence de groupes polaires et non polaires^{22,23,24,25,26,27,28}. De même, les phases stationnaires intercalantes polaires, comportant des groupes polaires liés de manière covalente, présentent un bon pouvoir de séparation et une sélectivité unique pour les analytes polaires et non polaires, la séparation dépendant de l'interaction entre l'analyte et la phase stationnaire. Interactions multimodales^29,30,31,32. Récemment, Zhang et al. 30 ont préparé une phase stationnaire de polyamine à terminaison dodécyle et ont réussi à séparer des hydrocarbures, des antidépresseurs, des flavonoïdes, des nucléosides, des œstrogènes et plusieurs autres analytes. L'intercalant polaire possède des groupes polaires et non polaires, ce qui permet de séparer des peptides et des protéines présentant des groupements hydrophobes et hydrophiles. Des colonnes à incorporation polaire (par exemple, des colonnes C18 à incorporation d'amide) sont disponibles dans le commerce sous le nom de colonnes Ascentis Express RP-Amide, mais ces colonnes ne sont utilisées que pour l'analyse de l'amine 33.
Dans cette étude, une phase stationnaire à base de ligand polaire (polystyrène chargé de N-phénylmaléimide) a été préparée et évaluée pour la séparation de peptides et de digestats trypsiques d'HSA. La phase stationnaire a été préparée selon la stratégie suivante : des particules de silice poreuses ont été préparées selon le protocole décrit dans notre publication précédente, avec quelques modifications. Le rapport urée/polyéthylène glycol (PEG)/TMOS/eau/acide acétique a été ajusté afin d'obtenir des particules de silice à porosité élevée. Ensuite, un nouveau ligand, le phénylmaléimide-isocyanate de méthyle et de vinyle, a été synthétisé et utilisé pour fonctionnaliser les particules de silice et préparer la phase stationnaire à base de ligand polaire. Cette phase stationnaire a été conditionnée dans une colonne en acier inoxydable (100 × 1,8 mm de diamètre interne) selon un schéma de remplissage optimisé. Le remplissage de la colonne a été facilité par des vibrations mécaniques afin d'assurer la formation d'un lit homogène. La séparation de mélanges peptidiques composés de cinq peptides a été évaluée sur cette colonne. (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, Leucine Enképhaline) et le digest trypsique d'albumine sérique humaine (HSA). Le mélange peptidique et le digest trypsique de HSA ont été séparés avec une bonne résolution et une bonne efficacité. Les performances de séparation de la colonne PMP ont été comparées à celles de la colonne Ascentis Express RP-Amide. Les peptides et les protéines ont été bien séparés sur la colonne PMP, qui s'est avérée plus performante que la colonne Ascentis Express RP-Amide.
PEG (polyéthylène glycol), urée, acide acétique, orthosilicate de triméthoxy (TMOS), chlorosilane de triméthyle (TMCS), trypsine, albumine sérique humaine (HSA), chlorure d'ammonium, urée, hexane méthyldisilazane (HMDS), chlorure de méthacryloyle (MC), styrène, 4-hydroxy-TEMPO, peroxyde de benzoyle (BPO), acétonitrile de qualité HPLC (ACN), méthanol, 2-propanol et acétone achetés chez Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, États-Unis).
Un mélange d'urée (8 g), de polyéthylène glycol (8 g) et de 8 mL d'acide acétique 0,01 N a été agité pendant 10 minutes, puis 24 mL de TMOS ont été ajoutés sous atmosphère glacée. Le mélange réactionnel a été chauffé à 40 °C pendant 6 heures, puis à 120 °C pendant 8 heures dans un autoclave en acier inoxydable. L'eau a été éliminée et le résidu a été séché à 70 °C pendant 12 heures. La masse molle séchée a été broyée finement à l'étuve et calcinée à 550 °C pendant 12 heures. Trois lots ont été préparés et caractérisés afin d'évaluer la reproductibilité de la taille des particules, de la porosité et de la surface spécifique.
Un composé contenant des groupements polaires a été préparé par modification de surface de particules de silice à l'aide du ligand pré-synthétisé phénylmaléimide-méthylvinylisocyanate (PCMP), suivie d'une polymérisation radiale avec du styrène. Ce composé sert de phase stationnaire pour les agrégats et les chaînes de polystyrène. Le procédé de préparation est décrit ci-dessous.
Le N-phénylmaléimide (200 mg) et l'isocyanate de méthyle et de vinyle (100 mg) ont été dissous dans du toluène anhydre, et 0,1 mL de 2,2′-azobisisobutyronitrile (AIBN) a été ajouté au ballon réactionnel pour préparer le copolymère phénylmaléimide-isocyanate de méthyle et de vinyle (PMCP). Le mélange a été chauffé à 60 °C pendant 3 heures, filtré et séché à l'étuve à 40 °C pendant 3 heures.
Deux grammes de particules de silice séchées ont été dispersés dans 100 mL de toluène anhydre, agités et soumis à une sonication dans un ballon à fond rond de 500 mL pendant 10 minutes. Dix milligrammes de PMCP ont été dissous dans du toluène et ajoutés goutte à goutte au ballon réactionnel à l'aide d'une ampoule de coulée. Le mélange a été porté à reflux à 100 °C pendant 8 heures, filtré, lavé à l'acétone et séché à 60 °C pendant 3 heures. Ensuite, 100 g de particules de silice greffées au PMCP ont été dissous dans 200 mL de toluène et 2 mL de 4-hydroxy-TEMPO ont été ajoutés en présence de 100 µL de dilaurate de dibutylétain comme catalyseur. Le mélange a été agité à 50 °C pendant 8 heures, filtré et séché à 50 °C pendant 3 heures.
Le styrène (1 mL), le peroxyde de benzoyle (BPO) (0,5 mL) et des particules de silice fonctionnalisées par TEMPO-PMCP (1,5 g) ont été dispersés dans du toluène et purgés à l'azote. La polymérisation du styrène a été réalisée à 100 °C pendant 12 heures. Le produit obtenu a été lavé au méthanol et séché à 60 °C pendant une nuit. Le schéma réactionnel global est présenté sur la figure 1.
Les échantillons ont été dégazés à 393 K pendant 1 heure afin d'obtenir une pression résiduelle inférieure à 10⁻³ Torr. La quantité de N₂ adsorbée à une pression relative P/P₀ = 0,99 a permis de déterminer le volume poreux total. La morphologie des particules de silice nues et greffées par ligand a été examinée par microscopie électronique à balayage (Hitachi High Technologies, Tokyo, Japon). Les échantillons séchés (particules de silice nues et greffées par ligand) ont été fixés sur une colonne en aluminium à l'aide d'un ruban adhésif en carbone. Une couche d'or de 5 nm a été déposée sur les échantillons par pulvérisation cathodique (Q150T). Ce procédé améliore l'efficacité en utilisant de basses tensions et permet une pulvérisation cathodique à froid et à grains fins. Un analyseur élémentaire Flash EA1112 (Thermo Electron, Waltham, MA, États-Unis) a été utilisé pour l'analyse élémentaire. La distribution granulométrique a été déterminée à l'aide d'un granulomètre Mastersizer 2000 (Malvern, Worcestershire, Royaume-Uni). et des particules de silice liées par ligand (5 mg chacune) ont été dispersées dans 5 mL d'isopropanol, soniquées pendant 10 min, vortexées pendant 5 min et placées sur le banc optique du Mastersizer. L'analyse thermogravimétrique a été réalisée à une vitesse de 5 °C par minute sur une plage de température de 30 à 800 °C.
Des colonnes à alésage étroit en acier inoxydable revêtues de verre de dimensions (100 × 1,8 mm id) ont été remplies en utilisant la méthode de remplissage par suspension, en appliquant la même procédure que celle utilisée dans la réf. 31. Une colonne en acier inoxydable (revêtue de verre, 100 × 1,8 mm de diamètre intérieur) munie d'un raccord de sortie contenant une fritte de 1 µm a été connectée à un remplisseur de colonne (Alltech, Deerfield, IL, États-Unis). Préparer une suspension de phase stationnaire en mettant en suspension 150 mg de phase stationnaire dans 1,2 mL de méthanol et l'envoyer dans la colonne de stockage. Le méthanol a été utilisé comme solvant de la suspension et comme solvant de propulsion. Remplir la colonne séquentiellement en appliquant des pressions de 100 MPa pendant 10 minutes, 80 MPa pendant 15 minutes et 60 MPa pendant 30 minutes. Pendant le remplissage, une vibration mécanique a été appliquée à l'aide de deux agitateurs de colonne GC (Alltech, Deerfield, IL, États-Unis) afin d'assurer un remplissage uniforme de la colonne. Fermer le remplisseur de colonne et relâcher la pression lentement pour éviter tout dommage à l'intérieur de la colonne. Déconnecter la colonne du remplisseur de colonne et connecter un autre raccord à la colonne. l'entrée et au système LC pour vérifier ses performances.
Une pompe LC (10AD Shimadzu, Japon), un injecteur (Valco (USA) C14 W.05) avec une boucle d'injection de 50 nL, un dégazeur à membrane (Shimadzu DGU-14A), une fenêtre capillaire UV-VIS ont été utilisés. Un détecteur µLC spécifique (UV-2075) et des microcolonnes à revêtement de verre ont également été construits. Des tubes de connexion très étroits et courts ont été utilisés afin de minimiser l'effet d'élargissement de bande dû à la colonne. Après conditionnement, des capillaires (50 μm de diamètre interne 365) et des capillaires de réduction (50 μm) ont été installés à la sortie 1/16″ du raccord réducteur. L'acquisition et le traitement des données chromatographiques ont été réalisés à l'aide du logiciel Multichro 2000. La détection a été effectuée à 254 nm. Les analytes ont été testés pour leur absorbance UV. Les données chromatographiques ont été analysées avec OriginPro8 (Northampton, MA).
Albumine de sérum humain, poudre lyophilisée, pureté ≥ 96 % (électrophorèse sur gel d'agarose) : 3 mg mélangés à de la trypsine (1,5 mg), de l'urée 4,0 M (1 mL) et du bicarbonate d'ammonium 0,2 M (1 mL). La solution est agitée pendant 10 minutes et incubée au bain-marie à 37 °C pendant 6 heures, puis la réaction est stoppée par addition de 1 mL de TFA à 0,1 %. La solution est filtrée et conservée à une température inférieure à 4 °C.
La séparation des mélanges peptidiques et des digestats trypsiques d'HSA a été évaluée séparément sur colonnes PMP. Vérifiez la séparation du mélange peptidique et du digestat trypsique d'HSA par la colonne PMP et comparez les résultats à ceux obtenus avec la colonne Ascentis Express RP-Amide. Le nombre de plateaux théoriques est calculé comme suit :
Les images MEB de particules de silice nues et de particules de silice greffées par ligand sont présentées sur la figure 2. Les images MEB des particules de silice nues (A, B) montrent que, contrairement à nos études précédentes, ces particules sont sphériques, tandis que les particules greffées par ligand (C, D) présentent une symétrie irrégulière. La surface des particules de silice greffées par ligand (C, D) est plus lisse que celle des particules de silice nues, ce qui pourrait être dû au revêtement de chaînes de polystyrène à la surface des particules de silice.
Images au microscope électronique à balayage de particules de silice nues (A, B) et de particules de silice liées par un ligand (C, D).
La distribution granulométrique des particules de silice nues et des particules de silice fonctionnalisées par des ligands est présentée sur la figure 3(A). Les courbes de distribution granulométrique en volume montrent que la taille des particules de silice augmente après modification chimique (Fig. 3A). Les données de distribution granulométrique des particules de silice de la présente étude et d'une étude précédente sont comparées dans le tableau 1(A). La taille volumique des particules, d(0,5), du PMP est de 3,36 µm, à comparer à une valeur de d(0,5) de 3,05 µm obtenue dans notre étude précédente (particules de silice liées au polystyrène)³⁴. Ce lot présente une distribution granulométrique plus étroite que celle de notre étude précédente en raison des proportions variables de PEG, d'urée, de TMOS et d'acide acétique dans le mélange réactionnel. La taille des particules de la phase PMP est légèrement supérieure à celle de la phase de particules de silice liées au polystyrène que nous avons étudiée précédemment. Cela signifie que la fonctionnalisation de surface des particules de silice avec du styrène a uniquement déposé une couche de polystyrène (0,97 µm) à la surface de la silice, tandis que dans le cas des particules de silice liées au polystyrène, une couche plus épaisse a été déposée. En phase PMP, l'épaisseur de la couche était de 1,38 µm.
Distribution de la taille des particules (A) et distribution de la taille des pores (B) des particules de silice nues et des particules de silice liées à un ligand.
La taille des pores, le volume poreux et la surface spécifique des particules de silice de cette étude sont présentés dans le Tableau 1(B). Les profils de distribution granulométrique (PSD) des particules de silice nues et des particules de silice liées par ligand sont illustrés dans la Figure 3(B). Les résultats sont comparables à ceux de notre étude précédente. Les tailles de pores des particules de silice nues et liées par ligand sont respectivement de 310 et 241 Å, ce qui indique une diminution de 69 Å après modification chimique, comme indiqué dans le Tableau 1(B), et l'évolution de la courbe est illustrée dans la Figure 3(B). De même, le volume poreux des particules de silice a diminué de 0,67 à 0,58 cm³/g après modification chimique. La surface spécifique des particules de silice étudiées est de 116 m²/g, comparable à celle de notre étude précédente (124 m²/g). Comme indiqué dans le Tableau 1(B), la surface spécifique (m²/g) des particules de silice a également diminué, passant de 116 m²/g à 105 m²/g. m2/g après modification chimique.
Les résultats de l'analyse élémentaire de la phase stationnaire sont présentés dans le tableau 2. La teneur en carbone de cette phase stationnaire est de 6,35 %, inférieure à celle obtenue dans notre étude précédente (particules de silice liées au polystyrène, respectivement 7,93 %³⁵ et 10,21 %)⁴². Cette faible teneur en carbone s'explique par l'utilisation, lors de la préparation de la phase stationnaire actuelle, de ligands polaires tels que le phénylmaléimide-méthylvinylisocyanate (PCMP) et le 4-hydroxy-TEMPO, en plus du styrène. La teneur en azote de cette phase stationnaire est de 2,21 % en poids, contre 0,17³⁵ et 0,85 % en poids dans les études précédentes. Ceci indique que la teneur en azote est plus élevée dans la phase stationnaire actuelle en raison de la présence de phénylmaléimide. De même, les teneurs en carbone des produits (4) et (5) étaient respectivement de 2,7 % et 2,9 %, tandis que celle du produit final était de 2,21 %. Le produit (6) était de 6,35 %, comme indiqué dans le tableau 2. La perte de poids a été vérifiée avec une phase stationnaire PMP, et la courbe TGA est présentée dans la figure 4. La courbe TGA montre une perte de poids de 8,6 %, ce qui est en bon accord avec la charge en carbone (6,35 %) car les ligands contiennent non seulement du C mais aussi du N, du O et du H.
Le ligand phénylmaléimide-méthylvinylisocyanate a été choisi pour la modification de surface des particules de silice en raison de la présence de groupes phénylmaléimide et vinylisocyanate polaires. Ces derniers peuvent réagir avec le styrène par polymérisation radicalaire vivante. L'insertion d'un groupe présentant une interaction modérée avec l'analyte et une faible interaction électrostatique entre ce dernier et la phase stationnaire, le groupement phénylmaléimide étant neutre à pH normal, permet également ce choix. La polarité de la phase stationnaire peut être contrôlée par la quantité optimale de styrène et la durée de la polymérisation radicalaire. Cette dernière étape, la polymérisation radicalaire, est cruciale car elle peut modifier la polarité de la phase stationnaire. Une analyse élémentaire a été réalisée pour déterminer la teneur en carbone de ces phases stationnaires. Il a été observé que l'augmentation de la quantité de styrène et de la durée de la réaction accroît la teneur en carbone de la phase stationnaire, et inversement. Les phases stationnaires préparées avec différentes concentrations de styrène présentent des teneurs en carbone différentes. Ces phases stationnaires ont ensuite été chargées dans des colonnes en acier inoxydable afin d'évaluer leurs performances chromatographiques. (sélectivité, résolution, valeur N, etc.). Sur la base de ces expériences, une formulation optimisée a été sélectionnée pour préparer la phase stationnaire PMP afin d'assurer une polarité contrôlée et une bonne rétention de l'analyte.
Cinq mélanges de peptides (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, leucine enképhaline) ont également été évalués à l'aide d'une colonne PMP utilisant une phase mobile ; Un mélange acétonitrile/eau (60/40 v/v, 0,1 % TFA) a été utilisé à un débit de 80 μL/min. Dans des conditions d'élution optimales, le nombre de plateaux théoriques (N) par colonne (100 × 1,8 mm de diamètre interne) est de 20 000 ± 100 (200 000 plateaux/m²). Le tableau 3 présente les valeurs de N pour les trois colonnes PMP et les chromatogrammes sont illustrés dans la figure 5A. Lors d'une analyse rapide sur une colonne PMP à débit élevé (700 μL/min), cinq peptides ont été élués en une minute, avec des valeurs de N très satisfaisantes : 13 500 ± 330 par colonne (100 × 1,8 mm de diamètre interne), soit 135 000 plateaux/m² (figure 5B). Trois colonnes de dimensions identiques (100 × 1,8 mm de diamètre interne) ont été utilisées. Des colonnes (id) ont été remplies avec trois lots différents de phase stationnaire PMP afin de vérifier la reproductibilité. La concentration de l'analyte pour chaque colonne a été enregistrée en utilisant les conditions d'élution optimales, le nombre de plateaux théoriques (N) et le temps de rétention permettant de séparer le même mélange test sur chaque colonne. Les données de reproductibilité des colonnes PMP sont présentées dans le tableau 4. La reproductibilité de la colonne PMP est excellente, avec des valeurs de %RSD très faibles, comme indiqué dans le tableau 3.
Séparation du mélange de peptides sur colonne PMP (B) et colonne Ascentis Express RP-Amide (A) ; phase mobile 60/40 ACN/H2O (TFA 0,1 %), dimensions de la colonne PMP (100 × 1,8 mm id) ; ordre d'élution des composés : 1 (Gly-Tyr), 2 (Gly-Leu-Tyr), 3 (Gly-Gly-Tyr-Arg), 4 (Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg) et 5 (leucine) acide enképhaline).
Une colonne PMP (100 × 1,8 mm de diamètre interne) a été évaluée pour la séparation des digestats trypsiques d'albumine sérique humaine par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Le chromatogramme de la figure 6 montre une bonne séparation des peptides et une excellente résolution. Les digestats d'HSA ont été analysés avec un débit de 100 µL/min, une phase mobile composée de 70/30 d'acétonitrile/eau et de 0,1 % de TFA. Comme le montre le chromatogramme (figure 6), la digestion de l'HSA a permis d'identifier 17 pics correspondant à 17 peptides. L'efficacité de séparation de chaque pic a été calculée et les valeurs sont présentées dans le tableau 5.
Un digest trypsique de HSA (100 × 1,8 mm id) a été séparé sur une colonne PMP ; débit (100 µL/min), phase mobile 60/40 acétonitrile/eau avec 0,1 % TFA.
où L représente la longueur de la colonne, η la viscosité de la phase mobile, ΔP la contre-pression de la colonne et u la vitesse linéaire de la phase mobile. La perméabilité de la colonne PMP était de 2,5 × 10⁻¹⁴ m², le débit de 25 μL/min et un mélange ACN/eau (60/40 v/v) a été utilisé. La perméabilité de la colonne PMP (100 × 1,8 mm de diamètre interne) était similaire à celle de notre étude précédente (réf. 34). La perméabilité de la colonne garnie de particules superficiellement poreuses est la suivante : 1,7 × 10⁻¹⁵ m² pour des particules de 1,3 μm, 3,1 × 10⁻¹⁵ m² pour des particules de 1,7 μm, 5,2 × 10⁻¹⁵ m² et 2,5 × 10⁻¹⁴ m² pour des particules de 2,6 μm. Pour des particules de 5 μm, les valeurs sont les suivantes : 43. Par conséquent, la perméabilité de la phase PMP est similaire à celle des particules cœur-coquille de 5 μm.
où Wx représente la masse de la colonne remplie de chloroforme, Wy la masse de la colonne remplie de méthanol et ρ la masse volumique du solvant. Les masses volumiques du méthanol (ρ = 0,7866) et du chloroforme (ρ = 1,484) sont respectivement de 0,63 et 0,55. La porosité totale des colonnes de particules de silice C18 (100 × 1,8 mm de diamètre interne) et des colonnes C18-urée que nous avons étudiées précédemment est donc de 0,63 et 0,55. Cela signifie que la présence de ligands urée réduit la perméabilité de la phase stationnaire. Par ailleurs, la porosité totale de la colonne PMP (100 × 1,8 mm de diamètre interne) est de 0,60. La perméabilité des colonnes PMP est inférieure à celle des colonnes remplies de particules de silice greffées C18 car, dans les phases stationnaires de type C18, les ligands C18 sont fixés aux particules de silice sous forme de chaînes linéaires. Dans les phases stationnaires de type polystyrène, une couche de polymère relativement épaisse se forme autour de la colonne. Dans une expérience typique, la porosité de la colonne est calculée comme suit :
Les figures 7A et 7B montrent la colonne PMP (100 × 1,8 mm id) et la colonne Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) en utilisant les mêmes conditions d'élution (c.-à-d. 60/40 ACN/H2O et 0,1 % TFA). ) du graphique de van Deemter. Des mélanges peptidiques sélectionnés (Gly-Tyr, Gly-Leu-Tyr, Gly-Gly-Tyr-Arg, Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg, enképhaline de leucine) ont été préparés à un débit de 20 µL/min. Le débit minimal pour les deux colonnes est de 800 µL/min. Les valeurs minimales de HETP au débit optimal (80 µL/min) pour la colonne PMP et la colonne Ascentis Express RP-Amide étaient respectivement de 2,6 µm et 3,9 µm. Les valeurs de HETP indiquent que l'efficacité de séparation de la colonne PMP (100 × 1,8 mm de diamètre interne) est nettement supérieure à celle de la colonne Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm de diamètre interne) disponible dans le commerce. Le diagramme de van Deemter (Fig. 7A) montre que la diminution de la valeur N avec l'augmentation du débit n'est pas significative par rapport à notre étude précédente. L'efficacité de séparation est donc plus élevée. de la colonne PMP (100 × 1,8 mm id) par rapport à la colonne Ascentis Express RP-Amide est basée sur des améliorations dans la forme des particules, la taille et les procédures complexes de remplissage de la colonne utilisées dans le présent travail34.
(A) Diagramme de van Deemter (HETP en fonction de la vitesse linéaire de la phase mobile) obtenu en utilisant une colonne PMP (100 × 1,8 mm id) dans 60/40 ACN/H2O avec 0,1 % TFA. (B) Diagramme de van Deemter (HETP en fonction de la vitesse linéaire de la phase mobile) obtenu en utilisant une colonne Ascentis Express RP-Amide (100 × 1,8 mm id) dans 60/40 ACN/H2O avec 0,1 % TFA.
Une phase stationnaire en polystyrène à incorporation polaire (PMP) a été préparée et évaluée pour la séparation de mélanges de peptides synthétiques et de digestats trypsiques d'albumine sérique humaine (HAS) par chromatographie liquide à haute performance (CLHP). Les performances chromatographiques des colonnes PMP pour les mélanges peptidiques sont excellentes en termes d'efficacité de séparation et de résolution. Cette performance accrue est due à plusieurs facteurs, tels que la taille des particules et des pores des particules de silice, la synthèse contrôlée de la phase stationnaire et le garnissage complexe de la colonne. Outre une efficacité de séparation élevée, la faible contre-pression de la colonne à des débits élevés constitue un autre avantage de cette phase stationnaire. Les colonnes PMP présentent une bonne reproductibilité et peuvent être utilisées pour l'analyse de mélanges peptidiques et de digestions trypsiques de diverses protéines. Nous envisageons d'utiliser cette colonne pour la séparation de produits naturels, de composés bioactifs issus de plantes médicinales et d'extraits fongiques par chromatographie liquide. À l'avenir, les colonnes PMP seront également évaluées pour la séparation de protéines et d'anticorps monoclonaux.
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