Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Kullandığınız tarayıcı sürümünün CSS desteği sınırlıdır. En iyi deneyim için, güncel bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Ayrıca, sürekli destek sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Aynı anda üç slayttan oluşan bir slayt gösterisi sunar. Önceki ve Sonraki düğmelerini kullanarak üç slayt arasında geçiş yapabilir veya sondaki kaydırma düğmelerini kullanarak üç slayt arasında geçiş yapabilirsiniz.
Kan-beyin bariyeri ve beyin-beyin bariyeri, biyoterapötik ajanların merkezi sinir sistemindeki hedeflerine ulaşmasını engelleyerek nörolojik hastalıkların etkili tedavisini zorlaştırmaktadır. İn vivo olarak yeni beyin taşıyıcılarını keşfetmek için, bir T7 faj peptit kütüphanesi oluşturduk ve kanüllü, bilinçli büyük havuz sıçan modeli kullanarak seri olarak kan ve beyin omurilik sıvısı (BOS) topladık. Dört tur seçimden sonra, spesifik faj klonları BOS'ta yüksek oranda zenginleştirildi. Bireysel aday peptitlerin test edilmesi, BOS'ta 1000 kattan fazla zenginleşme olduğunu ortaya koydu. Peptit aracılı beyne iletimin biyolojik aktivitesi, tanımlanan yeni geçiş peptidine bağlı bir BACE1 peptit inhibitörü kullanılarak beyin omurilik sıvısındaki amiloid-β seviyesinde %40'lık bir azalma ile doğrulandı. Bu sonuçlar, in vivo faj seçimi yöntemleriyle tanımlanan peptitlerin, terapötik etkiyle makromoleküllerin beyne sistemik olarak iletilmesi için yararlı taşıyıcılar olabileceğini düşündürmektedir.
Merkezi sinir sistemi (MSS) hedefli tedavi araştırmaları büyük ölçüde MSS'yi hedefleme özelliklerine sahip optimize edilmiş ilaç ve ajanların belirlenmesine odaklanmış, aktif ilaç iletimini beyne yönlendiren mekanizmaların keşfedilmesine ise daha az önem verilmiştir. Ancak, özellikle büyük moleküllü ilaçların iletimi, modern nörobilim ilaç geliştirmenin ayrılmaz bir parçası haline geldiğinden, bu durum değişmeye başlamıştır. Merkezi sinir sisteminin ortamı, kan-beyin bariyeri (BBB) ​​ve kan-beyin bariyeri (BCBB)1'den oluşan serebrovasküler bariyer sistemi tarafından iyi korunmaktadır; bu da ilaçların beyne iletilmesini zorlaştırmaktadır1,2. Büyük moleküllü ilaçların neredeyse tamamının ve küçük moleküllü ilaçların %98'inden fazlasının beyinden atıldığı tahmin edilmektedir3. Bu nedenle, MSS'ye terapötik ilaçların verimli ve spesifik bir şekilde iletilmesini sağlayan yeni beyin taşıma sistemlerinin belirlenmesi çok önemlidir4,5. Bununla birlikte, BBB ve BCBB, geniş damar ağı aracılığıyla beynin tüm yapılarına nüfuz ettikleri ve girdikleri için ilaç iletimi için mükemmel bir fırsat da sunmaktadır. Bu nedenle, beyne invaziv olmayan yöntemlerle ilaç iletimine yönelik mevcut çabalar büyük ölçüde endojen BBB6 reseptörünü kullanan reseptör aracılı taşıma (PMT) mekanizmasına dayanmaktadır. Transferrin reseptör yolu kullanılarak elde edilen son önemli ilerlemelere rağmen7,8, geliştirilmiş özelliklere sahip yeni iletim sistemlerinin daha da geliştirilmesi gerekmektedir. Bu amaçla, amacımız, prensipte makromolekülleri merkezi sinir sistemine iletmek veya yeni reseptör yollarını açmak için kullanılabilecekleri için BOS taşınmasına aracılık edebilen peptitleri belirlemekti. Özellikle, serebrovasküler sistemin (BBB ve BSCFB) spesifik reseptörleri ve taşıyıcıları, biyoterapötik ilaçların aktif ve spesifik iletimi için potansiyel hedefler olarak hizmet edebilir. Beyin omurilik sıvısı (BOS), koroid pleksusun (CS) salgı ürünüdür ve subaraknoid boşluk ve ventriküler boşluk yoluyla beynin interstisyel sıvısıyla doğrudan temas halindedir4. Son zamanlarda, subaraknoid beyin omurilik sıvısının beynin interstisyumuna aşırı derecede yayıldığı gösterilmiştir9. Subaraknoid giriş yolu veya doğrudan kan-beyin bariyeri yoluyla parankimal boşluğa erişmeyi umuyoruz. Bunu başarmak için, bu iki farklı yoldan biriyle taşınan peptitleri ideal olarak tanımlayan sağlam bir in vivo faj seçimi stratejisi uyguladık.
Şimdi, en yüksek kütüphane çeşitliliğine sahip ilk seçim turlarını izlemek için yüksek verimli dizileme (HTS) ile birleştirilmiş BOS örneklemesi ile ardışık bir in vivo faj gösterim tarama yöntemini tanımlıyoruz. Tarama, kan kontaminasyonunu önlemek için kalıcı olarak yerleştirilmiş büyük bir sisterna (CM) kanülü bulunan bilinçli sıçanlar üzerinde gerçekleştirildi. Önemli olarak, bu yaklaşım hem beyne yönelik hem de serebrovasküler bariyer boyunca taşıma aktivitesine sahip peptitleri seçmektedir. Küçük boyutları (~60 nm) nedeniyle T7 fajlarını kullandık ve bunların endotel ve/veya epitel-medulla bariyerinin transselüler geçişine izin veren veziküllerin taşınması için uygun olduğunu öne sürdük. Dört tur taramadan sonra, güçlü in vivo BOS zenginleşmesi ve serebral mikrovasküler ilişki gösteren faj popülasyonları izole edildi. Önemli olarak, tercih edilen ve kimyasal olarak sentezlenen en iyi aday peptitlerin protein yükünü beyin omurilik sıvısına taşıyabildiğini göstererek bulgularımızı doğrulayabildik. İlk olarak, önde gelen bir geçiş peptidi ile BACE1 peptidinin bir inhibitörünün birleştirilmesiyle CNS'nin farmakodinamik etkileri belirlendi. İn vivo fonksiyonel tarama stratejilerinin, etkili protein kargo taşıyıcıları olarak yeni beyin taşıma peptidlerini tanımlayabileceğini göstermenin yanı sıra, benzer fonksiyonel seçim yaklaşımlarının yeni beyin taşıma yollarının belirlenmesinde de önemli hale geleceğini bekliyoruz.
Faj paketleme adımından sonra, plak oluşturan birimlere (PFU) dayanarak, yaklaşık 109 çeşitliliğe sahip rastgele 12-mer doğrusal T7 faj peptitlerinden oluşan bir kütüphane tasarlandı ve oluşturuldu (bkz. Malzeme ve Yöntemler). Bu kütüphaneyi in vivo taramadan önce dikkatlice analiz ettiğimizi belirtmek önemlidir. Modifiye edilmiş primerler kullanılarak faj kütüphanesi örneklerinin PCR amplifikasyonu, doğrudan HTS'ye uygulanabilir amplikonlar üretti (Ek Şekil 1a). a) HTS11 sekanslama hataları, b) (NNK)1-12 primerlerinin kalitesine etkisi ve c) bekleme kütüphanesinde vahşi tip (wt) fajın (iskelet ekleri) bulunması nedeniyle, yalnızca doğrulanmış sekans bilgilerini çıkarmak için bir sekans filtreleme prosedürü uygulandı (Ek Şekil 1b). Bu filtreleme adımları tüm HTS sekanslama kütüphaneleri için geçerlidir. Standart kütüphane için toplam 233.868 okuma elde edildi ve bunların %39'u filtre kriterlerini geçti ve kütüphane analizi ve sonraki turlar için seçimde kullanıldı (Ek Şekil 1c–e). Okumalar ağırlıklı olarak 3 baz çiftinin katları uzunluğundaydı ve 36 nükleotitte bir zirve gözlendi (Ek Şekil 1c), bu da kütüphane tasarımını (NNK) 1-12 doğruladı. Özellikle, kütüphane üyelerinin yaklaşık %11'i 12 boyutlu vahşi tip (wt) omurga PAGISRELVDKL eklentisi içeriyordu ve dizilerin neredeyse yarısı (%49) ekleme veya silme içeriyordu. Kütüphanenin HTS'si, kütüphanedeki peptitlerin yüksek çeşitliliğini doğruladı: peptit dizilerinin %81'inden fazlası yalnızca bir kez bulundu ve yalnızca %1,5'i ≥4 kopyada meydana geldi (Ek Şekil 2a). Repertuardaki 12 pozisyonun tamamındaki amino asit (aa) frekansları, dejenere NKK repertuarı tarafından üretilen kodon sayısı için beklenen frekanslarla iyi bir korelasyon gösterdi (Ek Şekil 2b). Bu eklemeler tarafından kodlanan aa kalıntılarının gözlemlenen frekansı, hesaplanan frekansla iyi bir korelasyon gösterdi (r = 0,893) (Ek Şekil 2c). Enjeksiyon için faj kütüphanelerinin hazırlanması, amplifikasyon ve endotoksinin uzaklaştırılması adımlarını içerir. Bunun daha önce faj kütüphanelerinin çeşitliliğini potansiyel olarak azalttığı gösterilmiştir12,13. Bu nedenle, endotoksin uzaklaştırma işlemine tabi tutulmuş bir plaka üzerinde amplifiye edilmiş faj kütüphanesini sıraladık ve AA frekansını tahmin etmek için orijinal kütüphane ile karşılaştırdık. Orijinal havuz ile amplifiye edilmiş ve saflaştırılmış havuz arasında güçlü bir korelasyon (r = 0,995) gözlemlendi (Ek Şekil 2d), bu da T7 fajı kullanılarak plakalar üzerinde amplifiye edilen klonlar arasındaki rekabetin büyük bir sapmaya neden olmadığını gösteriyor. Bu karşılaştırma, her kütüphanedeki tripeptit motiflerinin sıklığına dayanmaktadır, çünkü kütüphanelerin çeşitliliği (~109) HTS ile bile tam olarak yakalanamaz. Her pozisyondaki amino asitlerin sıklık analizi, girilen repertuarın son üç pozisyonunda küçük bir pozisyona bağlı sapma ortaya koymuştur (Ek Şekil 2e). Sonuç olarak, kütüphanenin kalitesinin ve çeşitliliğinin kabul edilebilir olduğu ve birkaç seçim turu arasında faj kütüphanelerinin çoğaltılması ve hazırlanması nedeniyle çeşitlilikte yalnızca küçük değişiklikler gözlemlendiği sonucuna vardık.
Bilinçli sıçanların beyin omurilik sıvısına cerrahi olarak bir kanül yerleştirilerek seri beyin omurilik sıvısı örneklemesi yapılabilir; bu, intravenöz (iv) olarak kan-beyin bariyeri (BBB) ​​ve/veya kan-beyin omurilik sıvısı bariyeri (BCSFB) yoluyla enjekte edilen T7 fajlarının tanımlanmasını kolaylaştırır (Şekil 1a-b). İn vivo seçimin ilk üç turunda iki bağımsız seçim kolu (A ve B kolları) kullandık (Şekil 1c). İlk üç seçim turunda enjekte edilen toplam faj miktarını azaltarak seçimin sıkılığını kademeli olarak artırdık. Dördüncü eleme turu için, A ve B kollarından alınan örnekleri birleştirdik ve üç ek bağımsız seçim gerçekleştirdik. Bu modelde T7 faj partiküllerinin in vivo özelliklerini incelemek için, vahşi tip faj (PAGISRELVDKL ana inserti) sıçanlara kuyruk damarı yoluyla enjekte edildi. Farklı zaman noktalarında beyin omurilik sıvısından ve kandan fajların geri kazanımı, nispeten küçük T7 ikosahedral fajların kan bölmesinden hızlı bir ilk temizleme aşamasına sahip olduğunu gösterdi (Ek Şekil 3). Uygulanan titrasyon değerlerine ve sıçanların kan hacmine dayanarak, intravenöz enjeksiyondan 10 dakika sonra kanda uygulanan dozun yaklaşık %1'inin (ağırlıkça) faj tespit edildiğini hesapladık. Bu ilk hızlı düşüşten sonra, 27,7 dakikalık bir yarı ömürle daha yavaş bir birincil temizlenme ölçüldü. Önemli olarak, BOS bölmesinden çok az sayıda faj geri kazanıldı; bu da vahşi tip fajın BOS bölmesine göçü için düşük bir arka plan olduğunu gösteriyor (Ek Şekil 3). Ortalama olarak, tüm örnekleme süresi boyunca (0-250 dk) kanda yaklaşık 1 x 10-3% T7 faj titrasyon değeri ve beyin omurilik sıvısında başlangıçta infüze edilen fajların 4 x 10-8%'i tespit edildi. Dikkat çekici olarak, beyin omurilik sıvısındaki vahşi tip fajın yarı ömrü (25,7 dk), kanda gözlemlenenle benzerdi. Bu veriler, CM kanüllü sıçanlarda beyin omurilik sıvısı bölmesini kandan ayıran bariyerin sağlam olduğunu ve bu sayede kandan beyin omurilik sıvısı bölmesine kolayca taşınan klonları belirlemek için faj kütüphanelerinin in vivo olarak seçilebildiğini göstermektedir.
(a) Büyük bir havuzdan beyin omurilik sıvısının (BOS) yeniden örneklenmesi için bir yöntem oluşturulması. (b) Merkezi sinir sistemi (MSS) bariyerinin hücresel konumunu ve kan-beyin bariyerini (BBB) ​​ve kan-beyin bariyerini geçen peptitleri tanımlamak için kullanılan seçim stratejisini gösteren şema. (c) İn vivo faj gösterimi tarama akış şeması. Her seçim turunda, fajlar (okların içindeki hayvan tanımlayıcıları) intravenöz olarak enjekte edildi. İki bağımsız alternatif dal (A, B), 4. seçim turuna kadar ayrı ayrı tutuldu. 3. ve 4. seçim turları için, BOS'tan çıkarılan her faj klonu manuel olarak dizilendi. (d) T7 peptit kütüphanesinin (2 x 10¹² faj/hayvan) intravenöz enjeksiyonundan sonra iki kanüllü sıçanda ilk seçim turu sırasında kandan (kırmızı daireler) ve beyin omurilik sıvısından (yeşil üçgenler) izole edilen fajların kinetiği. Mavi kareler, enjekte edilen faj miktarı dikkate alınarak ve toplam kan hacmi hesaba katılarak hesaplanan, kandaki ortalama başlangıç ​​faj konsantrasyonunu göstermektedir. Siyah kareler, kan faj konsantrasyonlarından ekstrapole edilen y çizgisinin kesişme noktasını göstermektedir. (e,f) Peptitte bulunan tüm olası örtüşen tripeptit motiflerinin göreceli sıklığını ve dağılımını göstermektedir. 1000 okumada bulunan motif sayısı gösterilmiştir. Anlamlı derecede (p < 0,001) zenginleştirilmiş motifler kırmızı noktalarla işaretlenmiştir. (e) Enjekte edilen kütüphanenin tripeptit motifinin göreceli sıklığını, 1.1 ve 1.2 numaralı hayvanlardan elde edilen kan kaynaklı fajlarla karşılaştıran korelasyon saçılım grafiği. (f) Kan ve beyin omurilik sıvısında izole edilen 1.1 ve 1.2 numaralı hayvan faj tripeptit motiflerinin göreceli sıklıklarını karşılaştıran korelasyon saçılım grafiği. (g, h) Her iki hayvanda da in vivo seçim turundan sonra kanda zenginleştirilmiş fajların (g) enjekte edilen kütüphanelere ve BOS'ta zenginleştirilmiş fajların (h) kana kıyasla dizi kimliği gösterimi. Tek harfli kodun boyutu, o amino asidin o pozisyonda ne sıklıkla bulunduğunu gösterir. Yeşil = polar, mor = nötr, mavi = bazik, kırmızı = asidik ve siyah = hidrofobik amino asitler. Şekil 1a, b, Eduard Urich tarafından tasarlanmış ve üretilmiştir.
İki CM enstrüman sıçanına (A ve B kladları) bir faj peptit kütüphanesi enjekte ettik ve beyin omurilik sıvısından ve kandan faj izole ettik (Şekil 1d). Kütüphanenin başlangıçtaki hızlı temizlenmesi, vahşi tip faja kıyasla daha az belirgindi. Her iki hayvanda da enjekte edilen kütüphanenin ortalama yarı ömrü, kanda vahşi tip faja benzer şekilde 24,8 dakika ve beyin omurilik sıvısında 38,5 dakikaydı. Her hayvandan alınan kan ve beyin omurilik sıvısı faj örnekleri HTS'ye tabi tutuldu ve tanımlanan tüm peptitler, kısa bir tripeptit motifinin varlığı açısından analiz edildi. Tripeptit motifleri, yapı oluşumu ve peptit-protein etkileşimleri için minimum bir temel sağladıkları için seçildi14,15. Enjekte edilen faj kütüphanesi ile her iki hayvanın kanından çıkarılan klonlar arasında motiflerin dağılımında iyi bir korelasyon bulduk (Şekil 1e). Veriler, kütüphanenin bileşiminin kan bölmesinde yalnızca marjinal olarak zenginleştirildiğini göstermektedir. Amino asit frekansları ve konsensus dizileri, Weblogo16 yazılımının bir uyarlaması kullanılarak her pozisyonda daha ayrıntılı olarak analiz edildi. İlginç bir şekilde, kanda glisin kalıntılarında güçlü bir zenginleşme bulduk (Şekil 1g). Kan, BOS'tan seçilen klonlarla karşılaştırıldığında, motiflerin güçlü bir şekilde seçilimi ve bazılarının seçilimden çıkarılması gözlemlendi (Şekil 1f) ve belirli amino asitler, 12 üyeli dizide önceden belirlenmiş pozisyonlarda tercihli olarak mevcuttu (Şekil 1h). Dikkat çekici bir şekilde, bireysel hayvanlar beyin omurilik sıvısında önemli ölçüde farklılık gösterirken, kanda glisin zenginleşmesi her iki hayvanda da gözlemlendi (Ek Şekil 4a–j). 1.1 ve 1.2 numaralı hayvanların beyin omurilik sıvısındaki dizi verilerinin sıkı bir şekilde filtrelenmesinden sonra, toplam 964 ve 420 benzersiz 12-mer peptit elde edildi (Ek Şekil 1d–e). İzole edilen faj klonları çoğaltıldı ve ikinci bir in vivo seçim turuna tabi tutuldu. İkinci seçim turundan elde edilen fajlar, her hayvanda HTS'ye tabi tutuldu ve tanımlanan tüm peptitler, tripeptit motiflerinin oluşumunu analiz etmek için bir motif tanıma programına girdi olarak kullanıldı (Şekil 2a, b, ef). BOS'tan elde edilen fajların ilk döngüsüyle karşılaştırıldığında, A ve B dallarında BOS'ta birçok motifin daha fazla seçilim ve seçilim dışı bırakılması gözlemlendi (Şekil 2). Bunların tutarlı dizilerin farklı kalıplarını temsil edip etmediklerini belirlemek için bir ağ tanımlama algoritması uygulandı. Alternatif A kladesinde (Şekil 2c, d) ve B kladesinde (Şekil 2g, h) BOS tarafından elde edilen 12 boyutlu diziler arasında açık bir benzerlik gözlemlendi. Her daldaki havuzlanmış analiz, 12-mer peptitler için farklı seçilim profilleri (Ek Şekil 5c,d) ve ikinci seçim turundan sonra havuzlanmış klonlar için zaman içinde BOS/kan titre oranında bir artış ortaya koydu (Ek Şekil 5e).
İn vivo fonksiyonel faj gösterimi seçiminin iki ardışık turuyla beyin omurilik sıvısındaki motiflerin ve peptitlerin zenginleştirilmesi.
Her hayvanın (1.1 ve 1.2 numaralı hayvanlar) ilk turundan elde edilen tüm beyin omurilik sıvısı fajları bir araya getirildi, çoğaltıldı, HT dizilemesi yapıldı ve birlikte tekrar enjekte edildi (2 x 10¹⁰ faj/hayvan) 2 SM kanüllü sıçana (#1.1 → #2.1 ve 2.2, 1.2 → 2.3 ve 2.4). (a,b,e,f) Birinci ve ikinci seçim turlarında tüm BOS kaynaklı fajların tripeptit motiflerinin göreceli sıklığını karşılaştıran korelasyon saçılım grafikleri. Her iki yöndeki peptitlerde bulunan tüm olası örtüşen tripeptitleri temsil eden motiflerin göreceli sıklığı ve dağılımı. 1000 okumada bulunan motif sayısı gösterilmiştir. Karşılaştırılan kütüphanelerden birinde anlamlı (p < 0.001) olarak seçilen veya dışlanan motifler kırmızı noktalarla vurgulanmıştır. (c, d, g, h) İn vivo seçimin 2. ve 1. turlarına dayalı olarak tüm BOS açısından zengin 12 amino asit uzunluğundaki dizilerin dizi logosu gösterimi. Tek harfli kodun boyutu, o amino asidin o pozisyonda ne sıklıkla bulunduğunu gösterir. Logoyu temsil etmek için, iki seçim turu arasında bireysel hayvanlardan çıkarılan BOS dizilerinin sıklığı karşılaştırılır ve ikinci turda zenginleştirilmiş diziler gösterilir: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ve (h) #1.2–#2.4. (c, d) 2.1 ve 2.2 numaralı hayvanlarda veya (g, h) 2.3 ve 2.4 numaralı hayvanlarda belirli bir pozisyonda en çok zenginleştirilmiş amino asitler renklendirilerek gösterilir. Yeşil = polar, mor = nötr, mavi = bazik, kırmızı = asidik ve siyah = hidrofobik amino asitler.
Üçüncü seçim turundan sonra, iki hayvandan izole edilen 332 BOS yeniden oluşturulmuş faj klonundan 124 benzersiz peptit dizisi (#3.1 ve #3.2) belirledik (Ek Şekil 6a). LGSVS dizisi (%18,7) en yüksek nispi orana sahipti, bunu sırasıyla vahşi tip eklemeler PAGISRELVDKL (%8,2), MRWFFSHASQGR (%3), DVAKVS (%3), TWLFSLG (%2,2) ve SARGSWREIVSLS (%2,2) izledi. Son dördüncü turda, üç ayrı hayvandan bağımsız olarak seçilen iki dalı birleştirdik (Şekil 1c). BOS'tan elde edilen 925 dizilenmiş faj klonundan, dördüncü turda 64 benzersiz peptit dizisi bulduk (Ek Şekil 6b), bunlar arasında vahşi tip fajın nispi oranı %0,8'e düştü. Dördüncü turda en yaygın CSF klonları LYVLHSRGLWGFKLAAALE (%18), LGSVS (%17), GFVRFRLSNTR (%14), KVAWRVFSLFWK (%7), SVHGV (%5), GRPQKINGARVC (%3,6) ve RLSSVDSDLSGC (%3,2) idi. Seçilen peptitlerin uzunluk aralığı, NNK kütüphane tasarımı için dejenere kodonlar kullanıldığında kütüphane primerlerindeki nükleotid eklemeleri/silmeleri veya erken durdurma kodonlarından kaynaklanmaktadır. Erken durdurma kodonları daha kısa peptitler üretir ve uygun amino asit motifini içerdikleri için seçilirler. Daha uzun peptitler, sentetik kütüphanelerin primerlerindeki eklemeler/silmelerden kaynaklanabilir. Bu, tasarlanan durdurma kodonunu çerçevenin dışına yerleştirir ve aşağıda yeni bir durdurma kodonu görünene kadar okur. Genel olarak, girdi verilerini örnek çıktı verileriyle karşılaştırarak dört seçim turunun tümü için zenginleştirme faktörlerini hesapladık. İlk tarama turunda, spesifik olmayan bir arka plan referansı olarak vahşi tip faj titrelerini kullandık. İlginç bir şekilde, ilk BOS döngüsünde negatif faj seçimi çok güçlüydü, ancak kanda değildi (Şekil 3a). Bu durum, peptit kütüphanesinin çoğu üyesinin BOS bölmesine pasif difüzyon olasılığının düşük olmasından veya ilgili fajların bakteriyofajlara göre kan dolaşımından daha verimli bir şekilde tutulmasından veya uzaklaştırılmasından kaynaklanıyor olabilir. Bununla birlikte, ikinci tarama turunda, her iki kladta da BOS'ta fajların güçlü bir şekilde seçildiği gözlemlendi; bu da önceki turun BOS alımını teşvik eden peptitleri sergileyen fajlar açısından zenginleştirildiğini düşündürmektedir (Şekil 3a). Yine, önemli bir kan zenginleşmesi olmadan. Ayrıca üçüncü ve dördüncü turlarda da faj klonları BOS'ta önemli ölçüde zenginleştirildi. Son iki seçim turu arasındaki her benzersiz peptit dizisinin göreceli sıklığını karşılaştırdığımızda, dizilerin dördüncü seçim turunda daha da zenginleştirildiğini bulduk (Şekil 3b). Her iki peptit yönelimini kullanarak, 64 benzersiz peptit dizisinin tamamından toplam 931 tripeptit motifi çıkarıldı. Dördüncü turda en çok zenginleştirilen motifler, enjekte edilen kütüphaneye kıyasla tüm turlardaki zenginleştirme profilleri açısından daha yakından incelendi (kesme noktası: %10 zenginleştirme) (Ek Şekil 6c). Genel seçim kalıpları, incelenen motiflerin çoğunun her iki seçim dalının önceki tüm turlarında zenginleştirildiğini gösterdi. Bununla birlikte, bazı motifler (örneğin SGL, VSG, LGS GSV) ağırlıklı olarak alternatif A kladından gelirken, diğerleri (örneğin FGW, RTN, WGF, NTR) alternatif B kladında zenginleştirildi.
BOS ile zenginleştirilmiş faj gösterimli peptitlerin ve streptavidin yüklerine bağlanmış biyotinlenmiş öncü peptitlerin BOS'a taşınmasının doğrulanması.
(a) Enjekte edilen (giriş = I) faj (PFU) titreleri ve belirlenen BOS faj titrelerine (çıkış = O) dayalı olarak dört turda (R1-R4) hesaplanan zenginleştirme oranları. Son üç tur (R2-R4) için zenginleştirme faktörleri, önceki tur ve ilk tur (R1) ile ağırlık verileri karşılaştırılarak hesaplanmıştır. Açık çubuklar beyin omurilik sıvısını, gölgeli çubuklar plazmayı temsil eder. (***p<0,001, Student's t-testine dayanmaktadır). (b) Seçimin 4. turundan sonra BOS'ta toplanan tüm fajlara göre nispi oranlarına göre sıralanmış en bol faj peptitlerinin listesi. En yaygın altı faj klonu renklendirilmiş, numaralandırılmış ve seçimin 3. ve 4. turları arasındaki zenginleştirme faktörleri (ekler) gösterilmiştir. (c,d) 4. turdan elde edilen en zenginleştirilmiş altı faj klonu, boş faj ve ana faj peptit kütüphaneleri, bir BOS örnekleme modelinde ayrı ayrı analiz edilmiştir. Belirtilen zaman noktalarında BOS ve kan örnekleri toplandı. (c) Eşit miktarlarda 6 aday faj klonu (2 x 10¹⁰ faj/hayvan), boş fajlar (#1779) (2 x 10¹⁰ faj/hayvan) ve stok faj peptit kütüphaneleri (2 x 10¹² faj/hayvan) kanüle edilmiş hayvana kuyruk damarı yoluyla ayrı ayrı uygulandı. Enjekte edilen her faj klonunun ve faj peptit kütüphanesinin BOS farmakokinetiği zaman içinde gösterilmiştir. (d) Örnekleme süresi boyunca tüm geri kazanılan fajlar/mL için ortalama BOS/kan oranını göstermektedir. (e) Dört sentetik lider peptit ve bir karıştırılmış kontrol, N-terminalleri yoluyla streptavidin'e biyotin ile bağlandı (tetramer gösterimi) ve ardından enjeksiyon yapıldı (kuyruk damarı iv, 10 mg streptavidin/kg). En az üç entübe edilmiş sıçan (N = 3). Belirtilen zaman noktalarında BOS örnekleri toplandı ve streptavidin konsantrasyonları BOS anti-streptavidin ELISA ile ölçüldü (nd = tespit edilmedi). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA testine dayanmaktadır). (f) En zenginleştirilmiş faj peptit klonu #2002'nin (mor) amino asit dizisinin, 4. seçim turundan seçilen diğer faj peptit klonlarıyla karşılaştırılması. Özdeş ve benzer amino asit parçaları renk kodludur.
Dördüncü turda zenginleştirilmiş tüm fajlardan (Şekil 3b), BOS örnekleme modelinde daha ayrıntılı bireysel analiz için altı aday klon seçildi. Altı aday faj, boş faj (eklenmemiş) ve profaj peptit kütüphanelerinin eşit miktarları üç kanüllü CM hayvanına enjekte edildi ve farmakokinetik BOS (Şekil 3c) ve kan (Ek Şekil 7) testlerinde belirlendi. Test edilen tüm faj klonları, boş kontrol fajına (#1779) göre 10-1000 kat daha yüksek bir seviyede BOS bölmesini hedefledi. Örneğin, #2020 ve #2077 klonlarının BOS titreleri kontrol fajına göre yaklaşık 1000 kat daha yüksekti. Seçilen her peptidin farmakokinetik profili farklıdır, ancak hepsinin yüksek bir BOS hedefleme yeteneği vardır. 1903 ve 2011 numaralı klonlarda zaman içinde sürekli bir azalma gözlemledik, oysa 2077, 2002 ve 2009 numaralı klonlarda ilk 10 dakika boyunca bir artış aktif taşımayı gösterebilir ancak doğrulanması gerekir. 2020, 2002 ve 2077 numaralı klonlar yüksek seviyelerde stabilize olurken, 2009 numaralı klonun BOS konsantrasyonu ilk artıştan sonra yavaşça azaldı. Daha sonra her bir BOS adayının göreceli sıklığını kan konsantrasyonuyla karşılaştırdık (Şekil 3d). Her bir BOS adayının ortalama titresi ile tüm örnekleme zamanlarındaki kan titresi arasındaki korelasyon, altı adaydan üçünün kan BOS'unda önemli ölçüde zenginleştiğini gösterdi. İlginç bir şekilde, 2077 numaralı klon daha yüksek kan stabilitesi gösterdi (Ek Şekil 7). Peptitlerin kendilerinin faj partikülleri dışında kargoyu BOS bölmesine aktif olarak taşıyabildiğini doğrulamak için, peptitlerin faj partikülüne bağlandığı N-terminalde biyotin ile türevlendirilmiş dört lider peptit sentezledik. Biotinlenmiş peptitler (2002, 2009, 2020 ve 2077 numaralı peptitler), faj geometrisini bir nebze taklit eden çoklu formlar elde etmek için streptavidin (SA) ile konjuge edildi. Bu format ayrıca, kargo taşıyan protein peptitleri olarak kan ve beyin omurilik sıvısındaki SA maruziyetini ölçmemizi sağladı. Önemli olarak, sentetik peptitler bu SA konjugeli formatta uygulandığında faj verileri sıklıkla yeniden üretilebiliyordu (Şekil 3e). Karıştırılmış peptitler daha az başlangıç ​​maruziyetine ve 48 saat içinde saptanamayan seviyelere kadar daha hızlı BOS temizlenmesine sahipti. Bu peptit faj klonlarının BOS boşluğuna iletim yollarına dair bilgi edinmek için, intravenöz enjeksiyondan 1 saat sonra faj partiküllerini doğrudan tespit etmek amacıyla immünohistokimya (IHC) kullanarak bireysel faj peptitlerinin lokalizasyonunu analiz ettik. Özellikle, #2002, #2077 ve #2009 klonları beyin kılcal damarlarında güçlü boyama ile tespit edilebildi, kontrol fajı (#1779) ve #2020 klonu ise tespit edilemedi (Ek Şekil 8). Bu, bu peptitlerin beyin üzerindeki etkiye tam olarak kan-beyin bariyerini geçerek katkıda bulunduğunu düşündürmektedir. BSCFB yolu da dahil olabileceğinden, bu hipotezi test etmek için daha ayrıntılı analiz gereklidir. En zenginleştirilmiş klonun (#2002) amino asit dizisi diğer seçilmiş peptitlerle karşılaştırıldığında, bazılarının benzer amino asit uzantılarına sahip olduğu ve bunun da benzer bir taşıma mekanizmasına işaret edebileceği gözlemlenmiştir (Şekil 3f).
Eşsiz plazma profili ve zaman içinde BOS'ta önemli bir artış göstermesi nedeniyle, faj gösterim klonu #2077, 48 saatlik daha uzun bir süre boyunca daha ayrıntılı olarak incelendi ve sürekli SA seviyeleriyle ilişkili olarak gözlemlenen BOS'taki hızlı artışı yeniden üretebildi (Şekil 4a). Tanımlanan diğer faj klonlarına gelince, #2077 beyin kılcal damarları için güçlü bir şekilde boyandı ve daha yüksek çözünürlükte incelendiğinde kılcal damar belirteci lektin ile önemli bir ortak lokalizasyon ve muhtemelen parankimal alanda da bir miktar boyanma gösterdi (Şekil 4b). Peptit aracılı farmakolojik etkilerin CNS'de elde edilip edilemeyeceğini araştırmak için, i) #2077 geçiş peptidi ve ii) BACE1 inhibitör peptidi'nin biyotinlenmiş versiyonlarının iki farklı oranda SA ile karıştırıldığı bir deney gerçekleştirdik. Bir kombinasyon için sadece BACE1 peptid inhibitörünü, diğer kombinasyon için ise BACE1 peptid inhibitörü ile #2077 peptidi arasında 1:3 oranında bir karışım kullandık. Her iki örnek de intravenöz olarak uygulandı ve zaman içinde kan ve beyin omurilik sıvısındaki beta-amiloid peptit 40 (Abeta40) düzeyleri ölçüldü. Abeta40, beyin parankimindeki BACE1 inhibisyonunu yansıttığı için beyin omurilik sıvısında ölçüldü. Beklendiği gibi, her iki kompleks de kandaki Abeta40 düzeylerini önemli ölçüde azalttı (Şekil 4c, d). Bununla birlikte, yalnızca 2077 numaralı peptit ve SA'ya bağlı bir BACE1 peptit inhibitörü karışımını içeren örnekler, beyin omurilik sıvısındaki Abeta40'ta önemli bir azalmaya neden oldu (Şekil 4c). Veriler, 2077 numaralı peptitin 60 kDa'lık SA proteinini merkezi sinir sistemine taşıyabildiğini ve ayrıca SA'ya bağlı BACE1 peptit inhibitörleri ile farmakolojik etkiler oluşturduğunu göstermektedir.
(a) En az üç CM entübe edilmiş sıçanda BOS peptidi #2077'nin (RLSSVDSDLSGC) ve enjekte edilmemiş kontrol fajının (#1779) uzun süreli farmakokinetik profillerini gösteren T7 fajının klonal enjeksiyonu (2 × 10 faj/hayvan). (b) Faj enjekte edilmiş sıçanlarda (2 × 10 10 faj/hayvan) temsili kortikal mikrovasküllerin konfokal mikroskopik görüntüsü, peptid #2077 ve damarların (lektin) karşı boyanmasını göstermektedir. Bu faj klonları 3 sıçana uygulandı ve perfüzyondan önce 1 saat dolaşmasına izin verildi. Beyinler kesitlendi ve T7 faj kapsidine karşı poliklonal FITC etiketli antikorlarla boyandı. Perfüzyondan ve ardından fiksasyondan on dakika önce, DyLight594 etiketli lektin intravenöz olarak uygulandı. Mikrovasküllerin lümen tarafındaki lektin boyamasını (kırmızı) ve kılcal damarların lümenindeki ve perivasküler beyin dokusundaki fajları (yeşil) gösteren floresan görüntüler. Ölçek çubuğu 10 µm'ye karşılık gelir. (c, d) Biyotinlenmiş BACE1 inhibitör peptidi tek başına veya biyotinlenmiş transit peptidi #2077 ile kombinasyon halinde streptavidin ile birleştirildi ve ardından en az üç kanüllü CM sıçanına intravenöz enjeksiyon yapıldı (10 mg streptavidin/kg). BACE1 peptid inhibitörü aracılı Aβ40 azalması, belirtilen zaman noktalarında kanda (kırmızı) ve beyin omurilik sıvısında (turuncu) Aβ1-40 ELISA ile ölçüldü. Daha iyi anlaşılabilirlik için, grafikte %100 ölçekte noktalı bir çizgi çizilmiştir. (c) Transit peptidi #2077 ve BACE1 inhibitör peptidi ile 3:1 oranında konjuge edilmiş streptavidin ile tedavi edilen sıçanlarda kanda (kırmızı üçgenler) ve beyin omurilik sıvısında (turuncu üçgenler) Aβ40'taki yüzde azalma. (d) Sadece BACE1 inhibitör peptidi ile bağlanmış streptavidin ile tedavi edilen sıçanlarda kanda (kırmızı daireler) ve beyin omurilik sıvısında (turuncu daireler) Aβ40'taki yüzde azalma. Kontrol grubundaki Aβ konsantrasyonu 420 pg/ml idi (standart sapma = 101 pg/ml).
Faj gösterimi, biyomedikal araştırmaların çeşitli alanlarında başarıyla uygulanmıştır17. Bu yöntem, in vivo vasküler çeşitlilik çalışmaları18,19'un yanı sıra serebral damarları hedefleyen çalışmalarda20,21,22,23,24,25,26 kullanılmıştır. Bu çalışmada, bu seçim yönteminin uygulamasını sadece serebral damarları hedefleyen peptitlerin doğrudan tanımlanmasına değil, aynı zamanda kan-beyin bariyerini geçmek için aktif taşıma özelliklerine sahip adayların keşfine de genişlettik. Şimdi, CM entübe edilmiş sıçanlarda in vivo bir seçim prosedürünün geliştirilmesini tanımlıyoruz ve bunun BOS'a yönelme özelliklerine sahip peptitleri tanımlama potansiyelini gösteriyoruz. 12-mer rastgele peptitlerden oluşan bir kütüphaneyi sergileyen T7 fajını kullanarak, T7 fajının kan-beyin bariyerine uyum sağlayacak kadar küçük (yaklaşık 60 nm çapında)10 olduğunu ve böylece kan-beyin bariyerini veya koroid pleksusu doğrudan geçebildiğini gösterebildik. Kanüllü CM sıçanlarından beyin omurilik sıvısı (BOS) hasadının, iyi kontrol edilmiş bir in vivo fonksiyonel tarama yöntemi olduğunu ve ekstrakte edilen fajın sadece damarlara bağlanmakla kalmayıp aynı zamanda kan-beyin bariyeri boyunca bir taşıyıcı görevi gördüğünü gözlemledik. Dahası, eş zamanlı olarak kan toplayıp BOS ve kandan elde edilen fajlara yüksek verimli dizileme (HTS) uygulayarak, BOS seçimimizin kan zenginleştirmesinden veya seçim turları arasında genişleme uygunluğundan etkilenmediğini doğruladık. Bununla birlikte, kan bölmesi seçim prosedürünün bir parçasıdır, çünkü BOS bölmesine ulaşabilen fajların beyinde zenginleşmek için yeterince uzun süre kan dolaşımında hayatta kalması ve dolaşması gerekir. Ham HTS verilerinden güvenilir dizi bilgisi elde etmek için, analiz iş akışında platforma özgü dizileme hatalarına uyarlanmış filtreler uyguladık. Kinetik parametreleri tarama yöntemine dahil ederek, vahşi tip T7 fajlarının kandaki hızlı farmakokinetiğini (t½ ~ 28 dk) doğruladık24, 27, 28 ve ayrıca beyin omurilik sıvısındaki yarı ömürlerini (t½ ~ 26 dk) belirledik. Kan ve BOS'taki benzer farmakokinetik profillere rağmen, fajın kandaki konsantrasyonunun yalnızca %0,001'i BOS'ta tespit edilebildi; bu da vahşi tip T7 fajının kan-beyin bariyeri boyunca düşük arka plan hareketliliğini göstermektedir. Bu çalışma, özellikle dolaşımdan hızla temizlenen faj sistemleri için, in vivo tarama stratejileri kullanılırken ilk seçim turunun önemini vurgulamaktadır, çünkü az sayıda klon merkezi sinir sistemi bölmesine ulaşabilmektedir. Bu nedenle, ilk turda, kütüphane çeşitliliğindeki azalma çok büyüktü, çünkü bu çok sıkı BOS modelinde nihayetinde yalnızca sınırlı sayıda klon toplandı. Bu in vivo tarama stratejisi, BOS bölmesinde aktif birikim, kan bölmesinde klon hayatta kalması ve ilk 10 dakika içinde kandan T7 faj klonlarının hızlı bir şekilde uzaklaştırılması gibi çeşitli seçim adımlarını içeriyordu (Şekil 1d ve Ek Şekil 4M). Bu nedenle, ilk turdan sonra, her bir hayvan için aynı başlangıç ​​havuzu kullanılmış olmasına rağmen, BOS'ta farklı faj klonları tanımlandı. Bu, çok sayıda kütüphane üyesine sahip kaynak kütüphaneleri için birden fazla sıkı seçim adımının çeşitlilikte önemli bir azalmaya yol açtığını göstermektedir. Bu nedenle, rastgele olaylar, ilk seçim sürecinin ayrılmaz bir parçası haline gelecek ve sonucu büyük ölçüde etkileyecektir. Orijinal kütüphanedeki birçok klonun çok benzer bir BOS zenginleştirme eğilimine sahip olması muhtemeldir. Bununla birlikte, aynı deneysel koşullar altında bile, başlangıç ​​havuzundaki her bir klonun az sayıda olması nedeniyle seçim sonuçları farklılık gösterebilir.
Beyin omurilik sıvısında zenginleştirilmiş motifler, kandaki motiflerden farklıdır. İlginç bir şekilde, bireysel hayvanların kanında glisin açısından zengin peptitlere doğru ilk kaymayı gözlemledik (Şekil 1g, Ek Şekiller 4e, 4f). Glisin peptitleri içeren fajlar daha kararlı olabilir ve dolaşımdan çıkarılma olasılıkları daha düşük olabilir. Bununla birlikte, bu glisin açısından zengin peptitler beyin omurilik sıvısı örneklerinde tespit edilmedi; bu da derlenmiş kütüphanelerin iki farklı seçim aşamasından geçtiğini düşündürmektedir: biri kanda, diğeri ise beyin omurilik sıvısında birikmesine izin verilerek. Dördüncü seçim turundan elde edilen beyin omurilik sıvısı açısından zenginleştirilmiş klonlar kapsamlı bir şekilde test edilmiştir. Bireysel olarak test edilen klonların neredeyse tamamının, boş kontrol fajına kıyasla beyin omurilik sıvısında zenginleştirildiği doğrulanmıştır. Bir peptit bulgusu (#2077) daha ayrıntılı olarak incelenmiştir. Diğer adaylara kıyasla daha uzun bir plazma yarı ömrü gösterdi (Şekil 3d ve Ek Şekil 7) ve ilginç bir şekilde, bu peptit C-terminalinde bir sistein kalıntısı içeriyordu. Son zamanlarda, peptitlere sistein eklenmesinin, albümine bağlanarak farmakokinetik özelliklerini iyileştirebileceği gösterilmiştir 29. Bu, şu anda 2077 numaralı peptit için bilinmemektedir ve daha fazla çalışma gerektirmektedir. Bazı peptitler, BOS zenginleşmesinde valans bağımlılığı gösterdi (veriler gösterilmemiştir), bu da T7 kapsidinin sergilenen yüzey geometrisiyle ilgili olabilir. Kullandığımız T7 sistemi, her bir peptitin faj partikülü başına 5-15 kopyasını gösterdi. Aday öncü faj klonları, sıçanların serebral korteksine intravenöz olarak enjekte edilerek IHC gerçekleştirildi (Ek Şekil 8). Veriler, en az üç klonun (No. 2002, No. 2009 ve No. 2077) kan-beyin bariyeri ile etkileşime girdiğini gösterdi. Bu kan-beyin bariyeri etkileşiminin beyin omurilik sıvısının birikmesine mi yoksa bu klonların doğrudan kan-beyin omurilik sıvısı bariyerine (BCSFB) hareket etmesine mi yol açtığı henüz belirlenmemiştir. Önemli olarak, seçilen peptitlerin sentezlendikten ve protein yüküne bağlandıktan sonra beyin omurilik sıvısı taşıma kapasitelerini koruduklarını gösteriyoruz. N-terminal biyotinlenmiş peptitlerin SA'ya bağlanması, kan ve beyin omurilik sıvısında ilgili faj klonlarıyla elde edilen sonuçları esasen tekrarlamaktadır (Şekil 3e). Son olarak, öncü peptit #2077'nin, SA'ya bağlı bir BACE1 biyotinlenmiş peptit inhibitörünün beyin etkisini destekleyebildiğini ve beyin omurilik sıvısındaki Abeta40 seviyelerini önemli ölçüde azaltarak merkezi sinir sisteminde belirgin farmakodinamik etkiler yarattığını gösteriyoruz (Şekil 4). Tüm eşleşmelerin peptit sekans homoloji araması yapılarak veritabanında herhangi bir homolog tanımlayamadık. T7 kütüphanesinin boyutunun yaklaşık 10⁹ olduğunu, 12-merler için teorik kütüphane boyutunun ise 4 x 10¹⁵ olduğunu belirtmek önemlidir. Bu nedenle, 12-mer peptit kütüphanesinin çeşitlilik alanının yalnızca küçük bir bölümünü seçtik; bu da, tanımlanan bu peptitlerin bitişik dizi uzayını değerlendirerek daha optimize edilmiş peptitlerin belirlenebileceği anlamına gelebilir. Varsayımsal olarak, bu peptitlerin doğal homologlarını bulamamamızın nedenlerinden biri, evrim sırasında belirli peptit motiflerinin beyne kontrolsüz girişini önlemek için yapılan seçilim dışı bırakma olabilir.
Sonuçlarımız, beyin damar bariyerinin taşıma sistemlerini in vivo olarak daha ayrıntılı bir şekilde tanımlamak ve karakterize etmek için gelecekteki çalışmalara temel oluşturmaktadır. Bu yöntemin temel yapısı, yalnızca beyin damar bağlanma özelliklerine sahip klonları tanımlamakla kalmayıp, aynı zamanda başarılı klonların in vivo olarak biyolojik bariyerleri geçerek merkezi sinir sistemi (CNS) bölmesine ulaşma konusunda içsel aktiviteye sahip olduğu kritik bir adımı da içeren fonksiyonel bir seçim stratejisine dayanmaktadır. Amaç, bu peptitlerin taşıma mekanizmasını ve beyin bölgesine özgü mikro damarlara bağlanma tercihlerini aydınlatmaktır. Bu, kan-beyin bariyeri (BBB) ​​ve reseptörlerin taşınması için yeni yolların keşfedilmesine yol açabilir. Tanımlanan peptitlerin doğrudan beyin damar reseptörlerine veya BBB veya beyin-omurilik sıvısı bariyeri (BCSFB) yoluyla taşınan dolaşımdaki ligandlara bağlanabileceğini bekliyoruz. Bu çalışmada keşfedilen BOS taşıma aktivitesine sahip peptit vektörleri daha ayrıntılı olarak incelenecektir. Şu anda bu peptitlerin BBB ve/veya BCSFB'yi geçme yetenekleri açısından beyin özgüllüğünü araştırıyoruz. Bu yeni peptitler, yeni reseptörlerin veya yolların potansiyel keşfi ve biyolojik ilaçlar gibi makromoleküllerin beyne iletilmesi için yeni, son derece verimli platformların geliştirilmesi açısından son derece değerli araçlar olacaktır.
Daha önce açıklanan yöntemin bir modifikasyonu kullanılarak büyük sisterna (CM) kanüle edilir. Anestezi uygulanmış Wistar sıçanları (200-350 g) stereotaksik bir cihaza yerleştirilir ve kafatasını ortaya çıkarmak için tıraşlanmış ve aseptik olarak hazırlanmış kafa derisi üzerinde orta bir kesi yapılır. Üst kuşak bölgesine iki delik açılır ve sabitleme vidaları deliklere takılır. Paslanmaz çelik bir kanülün CM'ye stereotaktik olarak yönlendirilmesi için lateral oksipital krestte ek bir delik açılır. Kanülün etrafına diş çimentosu uygulanır ve vidalarla sabitlenir. Fotokürleme ve çimento sertleşmesinden sonra, deri yarası 4/0 supramid dikişle kapatılır. Kanülün doğru yerleştirilmesi, beyin omurilik sıvısının (BOS) kendiliğinden sızmasıyla doğrulanır. Sıçan stereotaksik cihazdan çıkarılır, uygun ameliyat sonrası bakım ve ağrı yönetimi uygulanır ve beyin omurilik sıvısında kan belirtileri görülene kadar en az bir hafta iyileşmesine izin verilir. Wistar sıçanları (Crl:WI/Han), Charles River'dan (Fransa) temin edildi. Tüm sıçanlar, spesifik patojen içermeyen koşullar altında tutuldu. Tüm hayvan deneyleri, İsviçre'nin Basel Şehri Veterinerlik Ofisi tarafından onaylandı ve 2474 numaralı Hayvan Lisansı'na (Sıçanların Beyin Omurilik Sıvısı ve Beynindeki Terapötik Aday Seviyelerinin Ölçülmesiyle Aktif Beyin Taşımasının Değerlendirilmesi) uygun olarak gerçekleştirildi.
CM kanülünü elinizde tutarak sıçanı nazikçe bilinçli tutun. Datura'yı kanülden çıkarın ve kendiliğinden akan beyin omurilik sıvısından 10 µl toplayın. Kanülün açıklığı nihayetinde tehlikeye girdiğinden, bu çalışmaya yalnızca kan kontaminasyonu veya renk değişikliği belirtisi olmayan berrak beyin omurilik sıvısı örnekleri dahil edilmiştir. Paralel olarak, kuyruk ucundaki küçük bir kesiden heparinli (Sigma-Aldrich) tüplere yaklaşık 10-20 µl kan alındı. T7 fajının intravenöz enjeksiyonundan sonra çeşitli zaman noktalarında beyin omurilik sıvısı ve kan toplandı. Her beyin omurilik sıvısı örneği alınmadan önce, kateterin ölü hacmine karşılık gelen yaklaşık 5-10 µl sıvı atıldı.
Kütüphaneler, T7Select sistem kılavuzunda (Novagen, Rosenberg vd., InNovations 6, 1-6, 1996) açıklandığı gibi T7Select 10-3b vektörü kullanılarak oluşturuldu. Kısaca, rastgele 12-mer DNA parçası aşağıdaki formatta sentezlendi:
NNK kodonu, ekteki çift durdurma kodonlarını ve amino asit aşırı ekspresyonunu önlemek için kullanıldı. N, her bir nükleotidin elle karıştırılmış eşit molar oranıdır ve K, adenin ve sitozin nükleotitlerinin elle karıştırılmış eşit molar oranıdır. Tek sarmallı bölgeler, 37°C'de 3 saat boyunca Klenow tamponunda (New England Biolabs) dNTP (Novagen) ve Klenow enzimi (New England Biolabs) ile daha fazla inkübe edilerek çift sarmallı DNA'ya dönüştürüldü. Reaksiyondan sonra, çift sarmallı DNA, EtOH çöktürmesiyle geri kazanıldı. Elde edilen DNA, EcoRI ve HindIII (her ikisi de Roche'dan) kısıtlama enzimleri ile sindirildi. Kesilmiş ve saflaştırılmış (QIAquick, Qiagen) ek (T4 ligaz, New England Biolabs), daha sonra 10B kapsid geninin 348. amino asidinden sonra önceden kesilmiş bir T7 vektörüne çerçeve içi olarak ligasyon edildi. Ligasyon reaksiyonları, in vitro paketlemeden önce 18 saat boyunca 16°C'de inkübe edildi. Fajların in vitro paketlenmesi, T7Select 10-3b klonlama kiti (Novagen) ile birlikte verilen talimatlara göre gerçekleştirildi ve paketleme çözeltisi, Escherichia coli (BLT5615, Novagen) kullanılarak bir kez lizise kadar çoğaltıldı. Lizatlar santrifüjlendi, titre edildi ve gliserol stok çözeltisi olarak -80°C'de donduruldu.
Özel 454/Roche-amplikon füzyon primerleri kullanılarak sıvı kültürde veya plak üzerinde çoğaltılan faj değişken bölgelerinin doğrudan PCR ile çoğaltılması. İleri füzyon primeri, değişken bölgeyi çevreleyen dizileri (NNK) 12 (şablona özgü), GS FLX Titanyum Adaptör A ve dört bazlı bir kütüphane anahtar dizisini (TCAG) içerir (Ek Şekil 1a):
Ters füzyon primeri ayrıca yakalama boncuklarına bağlı biyotin ve emülsiyon PCR sırasında klonal amplifikasyon için gerekli olan GS FLX Titanyum Adaptör B'yi de içerir:
Amplikonlar daha sonra 454 GS-FLX Titanium protokolüne göre 454/Roche pirosekanslama işlemine tabi tutuldu. Manuel Sanger sekanslaması için (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analizörü), T7 faj DNA'sı PCR ile çoğaltıldı ve aşağıdaki primer çiftleri kullanılarak sekanslandı:
Bireysel plaklardan alınan insertler, Roche Fast Start DNA Polimeraz Kiti kullanılarak (üreticinin talimatlarına göre) PCR amplifikasyonuna tabi tutuldu. Bir sıcak başlangıç ​​(95 °C'de 10 dakika) ve 35 destek döngüsü (95 °C'de 50 saniye, 50 °C'de 1 dakika ve 72 °C'de 1 dakika) gerçekleştirildi.
Kütüphanelerden elde edilen fajlar, yabani tip fajlar, BOS ve kandan kurtarılan fajlar veya bireysel klonlar, 37°C'de 4 saat boyunca TB broth (Sigma Aldrich) veya 500 cm2'lik petri kaplarında (Thermo Scientific) Escherichia coli BL5615'te çoğaltıldı. Fajlar, plakların Tris-EDTA tamponu (Fluka Analytical) ile yıkanması veya plakların steril pipet uçlarıyla toplanması yoluyla plaklardan ekstrakte edildi. Fajlar, kültür süpernatantından veya ekstraksiyon tamponundan bir tur polietilen glikol (PEG 8000) çöktürme (Promega) ile izole edildi ve Tris-EDTA tamponunda yeniden süspansiyon haline getirildi.
Çoğaltılan faj, intravenöz (IV) enjeksiyondan (500 μl/hayvan) önce endotoksin giderme boncukları (Miltenyi Biotec) kullanılarak 2-3 tur endotoksin giderme işlemine tabi tutuldu. Birinci turda 2×10¹² faj; ikinci turda 2×10¹⁰ faj; üçüncü ve dördüncü seçim turlarında ise hayvan başına 2×10⁹ faj enjekte edildi. Belirtilen zaman noktalarında toplanan BOS ve kan örneklerindeki faj içeriği, üreticinin talimatlarına göre (T7Select sistem kılavuzu) plak sayımı ile belirlendi. Faj seçimi, saflaştırılmış kütüphanelerin kuyruk venine intravenöz enjeksiyonu veya önceki seçim turundan BOS'tan ekstrakte edilen fajın yeniden enjeksiyonu ile gerçekleştirildi ve sonraki hasatlar sırasıyla 10 dk, 30 dk, 60 dk, 90 dk, 120 dk, 180 dk ve 240 dk'da BOS ve kan örneklerinde yapıldı. Toplam dört tur in vivo tarama gerçekleştirildi; bu taramalarda seçilen iki dal, ilk üç seçim turunda ayrı ayrı saklandı ve analiz edildi. İlk iki seçim turundan elde edilen BOS'tan çıkarılan tüm faj insertleri 454/Roche pirosekanslamaya tabi tutulurken, son iki seçim turundan elde edilen BOS'tan çıkarılan tüm klonlar manuel olarak sekanslandı. İlk seçim turundan elde edilen tüm kan fajları da 454/Roche pirosekanslamaya tabi tutuldu. Faj klonlarının enjeksiyonu için, seçilen fajlar 500 cm2'lik plaklarda 37°C'de 4 saat boyunca E. coli (BL5615) içinde çoğaltıldı. Bireysel olarak seçilen ve manuel olarak sekanslanan klonlar TB ortamında çoğaltıldı. Faj ekstraksiyonu, saflaştırılması ve endotoksinin uzaklaştırılmasından sonra (yukarıda açıklandığı gibi), 300 μl içinde 2×10¹⁰ faj/hayvan, bir kuyruk damarına intravenöz olarak enjekte edildi.
Dizi verilerinin ön işlenmesi ve niteliksel filtrelenmesi. Ham 454/Roche verileri, satıcı yazılımı kullanılarak ikili standart akış haritası formatından (sff) Pearson insan tarafından okunabilir formatına (fasta) dönüştürüldü. Nükleotid dizisinin daha fazla işlenmesi, aşağıda açıklandığı gibi, tescilli C programları ve komut dosyaları (yayınlanmamış yazılım paketi) kullanılarak gerçekleştirildi. Birincil verilerin analizi, sıkı çok aşamalı filtreleme prosedürlerini içerir. Geçerli bir 12mer ekleme DNA dizisi içermeyen okumaları filtrelemek için, okumalar sırasıyla başlangıç ​​etiketi (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), durdurma etiketi (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ve arka plan eklemesi (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ile küresel Needleman-Wunsch testi kullanılarak hizalandı. Hizalama başına en fazla 2 tutarsızlığa izin verildi31. Bu nedenle, başlangıç ​​ve bitiş etiketleri olmayan okumalar ve arka plan eklemeleri içeren okumalar, yani izin verilen uyumsuzluk sayısını aşan hizalamalar, kütüphaneden çıkarıldı. Geriye kalan okumalar için, başlangıç ​​işaretinden başlayıp bitiş işaretinden önce biten N-mer DNA dizisi orijinal okuma dizisinden kesilerek çıkarıldı ve daha fazla işlendi (bundan sonra "ekleme" olarak anılacaktır). Eklemenin çevrilmesinden sonra, primerin 5' ucundaki ilk durdurma kodonundan sonraki kısım eklemeden çıkarıldı. Ayrıca, primerin 3' ucunda eksik kodonlara yol açan nükleotidler de çıkarıldı. Sadece arka plan dizileri içeren eklemeleri dışlamak için, "PAG" amino asit deseniyle başlayan çevrilmiş eklemeler de çıkarıldı. Posttranslasyonel uzunluğu 3 amino asitten az olan peptitler kütüphaneden çıkarıldı. Son olarak, ekleme havuzundaki fazlalıklar giderildi ve her benzersiz eklemenin sıklığı belirlendi. Bu analizin sonuçları, nükleotid dizilerinin (eklemelerin) ve bunların (okuma) frekanslarının bir listesini içeriyordu (Ek Şekiller 1c ve 2).
N-mer DNA eklemelerinin dizi benzerliğine göre gruplandırılması: 454/Roche'a özgü dizileme hatalarını (homopolimer uzantılarının dizilenmesiyle ilgili sorunlar gibi) ortadan kaldırmak ve daha az önemli tekrarları gidermek için, önceden filtrelenmiş N-mer DNA dizi eklemeleri (eklemeler), aşağıdaki gibi tanımlanan yinelemeli bir algoritma kullanılarak benzerliklerine göre sıralanır (en fazla 2 eşleşmeyen baza izin verilir): eklemeler önce sıklıklarına göre (en yüksekten en düşüğe) ve aynıysalar, ikincil olarak uzunluklarına göre (en uzundan en kısaya) sıralanır. Böylece, en sık ve en uzun eklemeler ilk "grubu" tanımlar. Grup sıklığı, anahtar sıklığına ayarlanır. Daha sonra, sıralanmış listede kalan her ekleme, ikili Needleman-Wunsch hizalaması ile gruba eklenmeye çalışılır. Bir hizalamadaki uyumsuzluk, ekleme veya silme sayısı 2 eşiğini aşmazsa, bir ekleme gruba eklenir ve genel grup sıklığı, eklemenin ne sıklıkla eklendiği kadar artırılır. Bir gruba eklenen eklemeler kullanılmış olarak işaretlenir ve daha fazla işlemden çıkarılır. Ekleme dizisi zaten mevcut bir gruba eklenemezse, ekleme dizisi uygun ekleme sıklığına sahip yeni bir grup oluşturmak için kullanılır ve kullanılmış olarak işaretlenir. Her ekleme dizisi ya yeni bir grup oluşturmak için kullanıldığında ya da zaten mevcut bir gruba dahil edilebildiğinde yineleme sona erer. Sonuçta, nükleotidlerden oluşan gruplandırılmış eklemeler nihayetinde peptit dizilerine (peptit kütüphaneleri) çevrilir. Bu analizin sonucu, ardışık okuma sayısını oluşturan bir dizi ekleme ve bunlara karşılık gelen sıklıklardır (Ek Şekil 2).
Motif Oluşturma: Benzersiz peptitlerin bir listesine dayanarak, aşağıda gösterildiği gibi tüm olası amino asit kalıplarını (aa) içeren bir kütüphane oluşturuldu. Her olası 3 uzunluğundaki kalıp peptitten çıkarıldı ve ters kalıbı, tüm kalıpları (tripeptitler) içeren ortak bir motif kütüphanesiyle birlikte eklendi. Yüksek oranda tekrarlayan motif kütüphaneleri dizilendi ve fazlalıklar giderildi. Daha sonra, motif kütüphanesindeki her tripeptit için, hesaplama araçları kullanılarak kütüphanede varlığı kontrol edildi. Bu durumda, bulunan motif tripeptidini içeren peptidin sıklığı eklenir ve motif kütüphanesindeki motife atanır ("motif sayısı"). Motif oluşturmanın sonucu, tüm tripeptitlerin (motiflerin) oluşumlarını ve ilgili değerlerini içeren iki boyutlu bir dizidir; bu değerler, okumalar filtrelendiğinde, gruplandırıldığında ve çevrildiğinde karşılık gelen motifi oluşturan dizileme okumalarının sayısıdır. Metrikler yukarıda ayrıntılı olarak açıklanmıştır.
Motif sayısının ve karşılık gelen saçılım grafiklerinin normalizasyonu: Her örnek için motif sayısı aşağıdaki yöntem kullanılarak normalize edildi.
Burada ni, i konusunu içeren okuma sayısıdır. Dolayısıyla vi, örneklemde i motifini içeren okumaların (veya peptitlerin) yüzde sıklığını temsil eder. Normalleştirilmemiş motif sayısı için P değerleri Fisher'ın kesin testi kullanılarak hesaplanmıştır. Motif sayısının korelogramlarına ilişkin olarak, Spearman korelasyonları R ile normalleştirilmiş motif sayısı kullanılarak hesaplanmıştır.
Peptit kütüphanesindeki her pozisyondaki amino asit içeriğini görselleştirmek için web logogramları 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) oluşturuldu. İlk olarak, 12-mer peptidin her pozisyonundaki amino asit içeriği 20×12'lik bir matriste saklanır. Daha sonra, her pozisyonda aynı göreceli amino asit içeriğine sahip 1000 peptitten oluşan bir küme fasta-sequence formatında oluşturulur ve web-logo 3'e girdi olarak verilir; bu da belirli bir peptit kütüphanesi için her pozisyondaki göreceli amino asit içeriğinin grafiksel bir gösterimini oluşturur. Çok boyutlu veri kümelerini görselleştirmek için, R'de dahili olarak geliştirilen bir araç (biosHeatmap, henüz yayınlanmamış bir R paketi) kullanılarak ısı haritaları oluşturuldu. Isı haritalarında sunulan dendrogramlar, Öklid mesafesi metriği ile Ward'ın hiyerarşik kümeleme yöntemi kullanılarak hesaplandı. Motif puanlama verilerinin istatistiksel analizi için, normalleştirilmemiş puanlama için P değerleri Fisher'ın kesin testi kullanılarak hesaplandı. Diğer veri kümeleri için P değerleri ise R'de Student's t-testi veya ANOVA kullanılarak hesaplandı.
Seçilen faj klonları ve insert içermeyen fajlar, kuyruk veni yoluyla intravenöz olarak enjekte edildi (300 μl PBS içinde hayvan başına 2×10¹⁰ faj). Perfüzyon ve ardından fiksasyondan on dakika önce, aynı hayvanlara intravenöz olarak 100 μl DyLight594 etiketli lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177) enjekte edildi. Faj enjeksiyonundan 60 dakika sonra, sıçanlar kalp yoluyla 50 ml PBS ve ardından 50 ml %4 PFA/PBS ile perfüze edildi. Beyin örnekleri ayrıca %4 PFA/PBS'de bir gece boyunca fikse edildi ve 4°C'de bir gece boyunca %30 sukrozda bekletildi. Örnekler OCT karışımında hızla donduruldu. Dondurulmuş örneklerin immünohistokimyasal analizi, oda sıcaklığında, %1 BSA ile bloke edilmiş 30 µm'lik kriyoseksiyonlar üzerinde gerçekleştirildi ve 4 °C'de T7 fajına karşı poliklonal FITC etiketli antikorlarla (Novus NB 600-376A) inkübe edildi. Bir gece boyunca inkübe edildi. Son olarak, kesitler PBS ile 3 kez yıkandı ve konfokal lazer mikroskop (Leica TCS SP5) ile incelendi.
En az %98 saflıkta olan tüm peptitler GenScript USA tarafından sentezlendi, biyotinlendi ve liyofilize edildi. Biyotin, N-terminalde ilave bir üçlü glisin ara parçası aracılığıyla bağlanmıştır. Tüm peptitler kütle spektrometresi kullanılarak kontrol edildi.
Streptavidin (Sigma S0677), biyotinlenmiş peptit, biyotinlenmiş BACE1 inhibitör peptidi veya biyotinlenmiş BACE1 inhibitör peptidi ve BACE1 inhibitör peptidinin bir kombinasyonu (3:1 oranında) ile 5 kat eşit molar fazlalıkta karıştırıldı ve %5-10 DMSO içinde PBS'de inkübe edildi. Enjeksiyondan önce oda sıcaklığında 1 saat bekletildi. Streptavidin konjugeli peptitler, beyin boşluğu olan sıçanların kuyruk damarlarından birine 10 mg/kg dozunda intravenöz olarak enjekte edildi.
Streptavidin-peptit komplekslerinin konsantrasyonu ELISA yöntemiyle değerlendirildi. Nunc Maxisorp mikrotiter plakaları (Sigma), 4°C'de bir gece boyunca 1,5 μg/ml fare anti-streptavidin antikoru (Thermo, MA1-20011) ile kaplandı. Oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloke edildikten sonra (bloklama tamponu: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, %0,05 NP40, %0,25 jelatin, %1 BSA), plaka 3 saniye boyunca %0,05 Tween-20/PBS (yıkama tamponu) ile yıkandı ve bloke edici tampon ile seyreltilmiş BOS ve plazma örnekleri kuyucuklara eklendi (plazma 1:10.000, BOS 1:115). Plaka daha sonra 4°C'de gece boyunca tespit antikoru (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) ile inkübe edildi. Üç yıkama adımından sonra, streptavidin, 20 dakikaya kadar TMB substrat çözeltisinde (Roche) inkübe edilerek tespit edildi. Renk gelişimini 1M H2SO4 ile durdurduktan sonra, absorbans 450 nm'de ölçüldü.
Streptavidin-peptid-BACE1 inhibitör kompleksinin işlevi, üreticinin protokolüne göre (Wako, 294-64701) Aβ(1-40) ELISA ile değerlendirildi. Kısaca, BOS örnekleri standart seyreltici içinde (1:23) seyreltildi ve BNT77 yakalama antikoru ile kaplanmış 96 kuyucuklu plakalarda 4°C'de bir gece boyunca inkübe edildi. Beş yıkama adımından sonra, HRP konjugeli BA27 antikoru eklendi ve 4°C'de 2 saat inkübe edildi, ardından beş yıkama adımı uygulandı. Aβ(1-40), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca TMB çözeltisinde inkübe edilerek tespit edildi. Renk gelişimi durdurma çözeltisi ile durdurulduktan sonra, absorbans 450 nm'de ölçüldü. Plazma örnekleri, Aβ(1-40) ELISA'dan önce katı faz ekstraksiyonuna tabi tutuldu. Plazma, 96 kuyucuklu plakalara %0,2 DEA (Sigma) ilave edilerek oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi. SPE plakaları (Oasis, 186000679) sırasıyla su ve %100 metanol ile yıkandıktan sonra, plazma örnekleri SPE plakalarına eklendi ve tüm sıvı uzaklaştırıldı. Örnekler yıkandı (önce %5 metanol, ardından %30 metanol ile) ve %2 NH4OH/%90 metanol ile elüe edildi. Elüat, sabit N2 akımı altında 55°C'de 99 dakika kurutulduktan sonra, örnekler standart seyrelticilerde indirgendi ve Aβ(1–40) yukarıda açıklandığı gibi ölçüldü.
Bu makaleye nasıl atıfta bulunulur: Urich, E. ve diğerleri. Canlıda tanımlanan geçiş peptitleri kullanılarak beyne kargo teslimatı. Bilim. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ve Moos T. Hedefli tedavi kullanılarak makromoleküler ilaçların beyne iletilmesi. Nörokimya Dergisi 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. ve Martinez-Martinez, P. Peptit ve protein ilaçlarının kan-beyin bariyeri üzerinden iletilmesi. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Kan-beyin bariyeri: beyin ilaç geliştirme sürecinde bir darboğaz. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG ve Byrd, A. Koroid pleksus-beyin omurilik sıvısı yoluyla beyne ilaç iletiminin ve hedeflemesinin iyileştirilmesine yönelik beklentiler. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Biyofarmasötiklerin beyne iletim için moleküler Truva atlarıyla modernizasyonu. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM reseptör aracılı peptit taşınması kan-beyin bariyeri boyunca. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. ve diğerleri. Monovalent moleküler taşıyıcılar kullanarak terapötik antikorların beyin penetrasyonunu ve etkinliğini artırma. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. ve diğerleri. Transferrin reseptörü (TfR) taşınması, TfR antikorlarının afinite varyantlarının beyin tarafından alınmasını belirler. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).