Nature.com'u ziyaret ettiğiniz için teşekkür ederiz. Sınırlı CSS desteği olan bir tarayıcı sürümü kullanıyorsunuz. En iyi deneyim için güncellenmiş bir tarayıcı kullanmanızı (veya Internet Explorer'da Uyumluluk Modunu devre dışı bırakmanızı) öneririz. Ayrıca, sürekli desteği sağlamak için siteyi stiller ve JavaScript olmadan gösteriyoruz.
Aynı anda üç slayttan oluşan bir dönen görüntü görüntüler. Üç slaytta birer birer ilerlemek için Önceki ve Sonraki düğmelerini kullanın veya üç slaytta birer birer ilerlemek için sondaki kaydırıcı düğmelerini kullanın.
Kan-beyin bariyeri ve kan-beyin bariyeri, biyoterapötik ajanların merkezi sinir sistemindeki hedeflerine ulaşmasını engeller ve böylece nörolojik hastalıkların etkili tedavisini engeller. Canlı organizmada yeni beyin taşıyıcılarını keşfetmek için, bir T7 faj peptit kütüphanesi tanıttık ve sıçanların kanüllü bilinçli büyük havuz modeli kullanılarak seri olarak kan ve beyin-omurilik sıvısı (BOS) topladık. Belirli faj klonları, dört tur seçimden sonra BOS'ta oldukça zenginleşti. Bireysel aday peptitlerin test edilmesi, BOS'ta 1000 kattan fazla zenginleşme olduğunu ortaya koydu. Peptit aracılı beyne iletiminin biyoaktivitesi, tanımlanan yeni geçiş peptidine bağlı bir BACE1 peptit inhibitörü kullanılarak beyin-omurilik sıvısındaki amiloid-β seviyesinde %40'lık bir azalma ile doğrulandı. Bu sonuçlar, canlı organizmada faj seçim yöntemleriyle tanımlanan peptitlerin, terapötik bir etkiye sahip makromoleküllerin beyne sistemik iletimi için yararlı araçlar olabileceğini düşündürmektedir.
Merkezi sinir sistemi (MSS) hedefli tedavi araştırmaları, beyne aktif ilaç iletimini sağlayan mekanizmaları keşfetmeye daha az çaba harcayarak, büyük ölçüde MSS'yi hedefleme özellikleri gösteren optimize edilmiş ilaçları ve ajanları belirlemeye odaklanmıştır. Bu durum, özellikle büyük moleküller olmak üzere ilaç iletimi, modern sinir bilimi ilaç geliştirmenin ayrılmaz bir parçası olduğundan artık değişmeye başlıyor. Merkezi sinir sisteminin ortamı, kan-beyin bariyeri (BBB) ​​ve kan-beyin bariyeri (BCBB)1'den oluşan serebrovasküler bariyer sistemi tarafından iyi bir şekilde korunmaktadır ve bu da ilaçların beyne iletilmesini zorlaştırmaktadır1,2. Neredeyse tüm büyük moleküllü ilaçların ve küçük moleküllü ilaçların %98'inden fazlasının beyinden atıldığı tahmin edilmektedir3. Bu nedenle, terapötik ilaçların MSS'ye etkili ve spesifik iletimini sağlayan yeni beyin taşıma sistemlerini belirlemek çok önemlidir4,5. Bununla birlikte, BBB ve BCSFB, beynin geniş damar yapısı yoluyla beynin tüm yapılarına nüfuz edip girdikleri için ilaç iletimi için mükemmel bir fırsat da sunmaktadır. Bu nedenle, beyne invaziv olmayan iletim yöntemlerini kullanma yönündeki mevcut çabalar büyük ölçüde endojen BBB6 reseptörünü kullanan reseptör aracılı taşıma (PMT) mekanizmasına dayanmaktadır. Transferin reseptör yolunu kullanan son önemli gelişmelere rağmen7,8, iyileştirilmiş özelliklere sahip yeni iletim sistemlerinin daha fazla geliştirilmesi gerekmektedir. Bu amaçla, amacımız, prensipte makromolekülleri MSS'ye iletmek veya yeni reseptör yolları açmak için kullanılabilecekleri için, BOS iletimini aracılık edebilen peptitleri belirlemekti. Özellikle, serebrovasküler sistemin spesifik reseptörleri ve taşıyıcıları (BBB ve BSCFB), biyoterapötik ilaçların aktif ve spesifik iletimi için potansiyel hedefler olarak hizmet edebilir. Beyin omurilik sıvısı (BOS), koroid pleksusun (CS) salgı ürünüdür ve subaraknoid boşluk ve ventriküler boşluk yoluyla beynin interstisyel sıvısıyla doğrudan temas halindedir4. Son zamanlarda, subaraknoid beyin omurilik sıvısının beynin interstisyumuna aşırı yayıldığı gösterilmiştir9. Bu subaraknoid giriş yolunu veya doğrudan BBB'yi kullanarak parankimal boşluğa erişmeyi umuyoruz. Bunu başarmak için, bu iki farklı yoldan herhangi biriyle taşınan peptitleri ideal olarak tanımlayan sağlam bir in vivo faj seçimi stratejisi uyguladık.
Şimdi, en yüksek kütüphane çeşitliliğine sahip ilk seçim turlarını izlemek için yüksek verimli dizileme (HTS) ile birleştirilmiş BOS örneklemeli ardışık bir in vivo faj görüntüleme tarama yöntemini açıklıyoruz. Tarama, kan kontaminasyonunu önlemek için kalıcı olarak yerleştirilmiş büyük bir sarnıç (CM) kanülü ile bilinçli sıçanlarda gerçekleştirildi. Önemlisi, bu yaklaşım hem beyni hedef alan hem de serebrovasküler bariyer boyunca taşıma aktivitesi olan peptitleri seçer. Küçük boyutlarından (~60 nm)10 dolayı T7 fajlarını kullandık ve endotel ve/veya epitel-medulla bariyerini transselüler geçişine izin veren veziküllerin taşınması için uygun olduklarını öne sürdük. Dört tur taramadan sonra, faj popülasyonları izole edildi ve güçlü in vivo BOS zenginleştirmesi ve serebral mikro damar ilişkisi gösterildi. Önemlisi, tercih edilen ve kimyasal olarak sentezlenen en iyi aday peptitlerin protein yükünü beyin omurilik sıvısına taşıyabildiğini göstererek bulgularımızı doğrulayabildik. İlk olarak, önde gelen bir geçiş peptidini BACE1 peptidinin bir inhibitörüyle birleştirerek CNS'nin farmakodinamik etkileri belirlendi. İn vivo işlevsel tarama stratejilerinin yeni beyin taşıma peptidlerini etkili protein kargo taşıyıcıları olarak belirleyebileceğini göstermenin yanı sıra, benzer işlevsel seçilim yaklaşımlarının yeni beyin taşıma yollarını belirlemede de önemli hale gelmesini bekliyoruz.
Plak oluşturan birimlere (PFU) dayanarak, faj paketleme adımından sonra, yaklaşık 109 çeşitliliğe sahip rastgele 12-mer doğrusal T7 faj peptitlerinden oluşan bir kütüphane tasarlandı ve oluşturuldu (bkz. Malzemeler ve Yöntemler). Bu kütüphaneyi in vivo taramadan önce dikkatlice analiz ettiğimizi belirtmek önemlidir. Değiştirilmiş primerler kullanılarak faj kütüphanesi örneklerinin PCR amplifikasyonu, doğrudan HTS'ye uygulanabilir amplikonlar üretti (Ek Şekil 1a). a) HTS11 dizileme hataları, b) primerlerin (NNK)1-12 kalitesi üzerindeki etki ve c) bekleme kütüphanesinde vahşi tip (wt) fajın (iskelet ekleri) varlığı nedeniyle, yalnızca doğrulanmış dizi bilgilerini çıkarmak için bir dizi filtreleme prosedürü uygulandı (Ek Şekil 1b). Bu filtreleme adımları tüm HTS dizileme kütüphaneleri için geçerlidir. Standart kütüphane için, toplam 233.868 okuma elde edildi; bunların %39'u filtre kriterlerini geçti ve kütüphane analizi ve sonraki turlar için seçim için kullanıldı (Ek Şekil 1c–e). Okumalar, 36 nükleotidde bir tepe ile ağırlıklı olarak 3 baz çiftinin katları uzunluğundaydı (Ek Şekil 1c), bu da kütüphane tasarımını (NNK) 1-12 doğruladı. Dikkat çekici bir şekilde, kütüphane üyelerinin yaklaşık %11'i 12 boyutlu vahşi tip (wt) omurga PAGISRELVDKL eki içeriyordu ve dizilerin neredeyse yarısı (%49) eklemeler veya silmeler içeriyordu. Kütüphane kütüphanesinin HTS'si, kütüphanedeki peptitlerin yüksek çeşitliliğini doğruladı: peptit dizilerinin %81'inden fazlası yalnızca bir kez bulundu ve yalnızca %1,5'i ≥4 kopya halinde meydana geldi (Ek Şekil 2a). Repertuardaki 12 pozisyonun tamamındaki amino asitlerin (aa) frekansları, dejenere NKK repertuarı tarafından üretilen kodon sayısı için beklenen frekanslarla iyi bir korelasyon gösterdi (Ek Şekil 2b). Bu ekler tarafından kodlanan aa kalıntılarının gözlenen frekansı, hesaplanan frekansla (r = 0,893) iyi bir korelasyon gösterdi (Ek Şekil 2c). Enjeksiyon için faj kütüphanelerinin hazırlanması, endotoksinin çoğaltılması ve uzaklaştırılması adımlarını içerir. Bunun daha önce faj kütüphanelerinin çeşitliliğini potansiyel olarak azalttığı gösterilmiştir12,13. Bu nedenle, endotoksin uzaklaştırılmasından geçmiş bir plaka çoğaltılmış faj kütüphanesini diziledik ve AA frekansını tahmin etmek için orijinal kütüphaneyle karşılaştırdık. Orijinal havuz ile çoğaltılmış ve saflaştırılmış havuz arasında güçlü bir korelasyon (r = 0,995) gözlemlendi (Ek Şekil 2d), bu da T7 fajı kullanılarak plakalarda çoğaltılan klonlar arasındaki rekabetin büyük bir önyargıya neden olmadığını göstermektedir. Bu karşılaştırma, her kütüphanedeki tripeptit motiflerinin sıklığına dayanmaktadır, çünkü kütüphanelerin çeşitliliği (~109) HTS ile bile tam olarak yakalanamıyor. Her pozisyondaki aa'nın frekans analizi, girilen repertuarın son üç pozisyonunda küçük bir pozisyona bağlı önyargı ortaya koydu (Ek Şekil 2e). Sonuç olarak, kütüphanenin kalitesinin ve çeşitliliğinin kabul edilebilir olduğu ve faj kütüphanelerinin birkaç tur seçim arasında amplifikasyonu ve hazırlanması nedeniyle çeşitlilikte yalnızca küçük değişiklikler gözlemlendiği sonucuna vardık.
Seri serebrospinal sıvı örneklemesi, BBB ve/veya BCSFB yoluyla intravenöz (iv) olarak enjekte edilen T7 fajının tanımlanmasını kolaylaştırmak için bilinçli sıçanların CM'sine cerrahi olarak bir kanül yerleştirilerek gerçekleştirilebilir (Şekil 1a-b). İlk üç in vivo seleksiyon turunda iki bağımsız seleksiyon kolu (kollar A ve B) kullandık (Şekil 1c). İlk üç seleksiyon turunda tanıtılan toplam faj miktarını azaltarak seleksiyonun sıkılığını kademeli olarak artırdık. Dördüncü tarama turu için, A ve B dallarından örnekleri birleştirdik ve üç ek bağımsız seleksiyon gerçekleştirdik. Bu modelde T7 faj parçacıklarının in vivo özelliklerini incelemek için, kuyruk damarı yoluyla sıçanlara vahşi tip faj (PAGISRELVDKL ana ek parçası) enjekte edildi. Farklı zaman noktalarında serebrospinal sıvıdan ve kandan fajların geri kazanılması, nispeten küçük T7 ikosahedral fajlarının kan bölmesinden hızlı bir ilk temizleme fazına sahip olduğunu gösterdi (Ek Şekil 3). Uygulanan titrelere ve sıçanların kan hacmine dayanarak, uygulanan dozdan sadece yaklaşık %1 ağırlıktaki fajın intravenöz enjeksiyondan 10 dakika sonra kanda tespit edildiğini hesapladık. Bu ilk hızlı düşüşten sonra, 27,7 dakikalık bir yarı ömürle daha yavaş bir birincil klirens ölçüldü. Önemli olarak, BOS bölmesinden sadece çok az faj alındı ​​ve bu da BOS bölmesine vahşi tip faj göçü için düşük bir arka plan olduğunu gösteriyor (Ek Şekil 3). Ortalama olarak, kanda sadece yaklaşık %1 x %10-3 T7 faj titresi ve başlangıçta infüze edilen fajların %4 x %10-8'i tüm örnekleme süresi boyunca (0-250 dakika) serebrospinal sıvıda tespit edildi. Özellikle, serebrospinal sıvıdaki vahşi tip fajın yarı ömrü (25,7 dakika), kanda gözlemlenene benzerdi. Bu veriler, CM kanüllü sıçanlarda BOS bölmesini kandan ayıran bariyerin sağlam olduğunu ve kandan BOS bölmesine kolayca taşınan klonları belirlemek için faj kütüphanelerinin in vivo seçilmesine olanak sağladığını göstermektedir.
(a) Büyük bir havuzdan beyin omurilik sıvısı (BOS) yeniden örnekleme yönteminin kurulması. (b) Merkezi sinir sistemi (MSS) bariyerinin hücresel konumunu ve kan-beyin bariyerini (BBB) ​​ve kan-beyin bariyerini geçen peptitleri tanımlamak için kullanılan seçim stratejisini gösteren diyagram. (c) Canlı faj görüntüleme tarama akış şeması. Her seçim turunda, fajlar (okların içindeki hayvan tanımlayıcıları) intravenöz olarak enjekte edildi. İki bağımsız alternatif dal (A, B), 4. seçim turuna kadar ayrı ayrı tutuldu. Seçim turları 3 ve 4 için, BOS'tan çıkarılan her faj klonu manuel olarak dizilendi. (d) T7 peptit kütüphanesinin (hayvan başına 2 x 1012 faj) intravenöz enjeksiyonundan sonra iki kanüllü sıçanda ilk seçim turu sırasında kandan (kırmızı daireler) ve beyin omurilik sıvısından (yeşil üçgenler) izole edilen fajın kinetiği. Mavi kareler, toplam kan hacmini hesaba katarak, enjekte edilen faj miktarından hesaplanan, kandaki fajın ortalama başlangıç ​​konsantrasyonunu göstermektedir. Siyah kareler, kan fajı konsantrasyonlarından ekstrapole edilen y çizgisinin kesişme noktasını göstermektedir. (e,f) Peptitte bulunan tüm olası örtüşen tripeptit motiflerinin göreli sıklığını ve dağılımını sunun. 1000 okumada bulunan motif sayısı gösterilmiştir. Önemli ölçüde (p < 0,001) zenginleştirilmiş motifler kırmızı noktalarla işaretlenmiştir. (e) Enjekte edilen kütüphanenin tripeptit motifinin göreli sıklığını, #1.1 ve #1.2 numaralı hayvanlardan elde edilen kan türevi fajla karşılaştıran korelasyon saçılım grafiği. (f) Kanda ve beyin-omurilik sıvısında izole edilen hayvan fajı tripeptit motifleri #1.1 ve #1.2'nin göreli sıklıklarını karşılaştıran korelasyon saçılım grafiği. (g, h) Her iki hayvanda bir dizi in vivo seçilim sonrasında kanda zenginleştirilmiş fajın (g) enjekte edilmiş kütüphanelere ve CSF'de zenginleştirilmiş fajın (h) kana göre dizi kimliği gösterimi. Tek harfli kodun boyutu, o amino asidin o pozisyonda ne sıklıkta bulunduğunu gösterir. Yeşil = polar, mor = nötr, mavi = bazik, kırmızı = asidik ve siyah = hidrofobik amino asitler. Şekil 1a, b Eduard Urich tarafından tasarlanmış ve üretilmiştir.
İki CM enstrüman sıçanına (klad A ve B) bir faj peptit kütüphanesi enjekte ettik ve beyin omurilik sıvısı ve kandan faj izole ettik (Şekil 1d). Kütüphanenin başlangıçtaki hızlı temizlenmesi, vahşi tip faja kıyasla daha az belirgindi. Her iki hayvanda enjekte edilen kütüphanenin ortalama yarı ömrü, vahşi tip faja benzer şekilde kanda 24,8 dakika ve BOS'ta 38,5 dakikaydı. Her hayvandan alınan kan ve beyin omurilik sıvısı faj örnekleri HTS'ye tabi tutuldu ve tanımlanan tüm peptitler kısa bir tripeptit motifinin varlığı açısından analiz edildi. Tripeptit motifleri, yapı oluşumu ve peptit-protein etkileşimleri için minimum bir temel sağladıkları için seçildi14,15. Enjekte edilen faj kütüphanesi ile her iki hayvanın kanından çıkarılan klonlar arasındaki motif dağılımında iyi bir korelasyon bulduk (Şekil 1e). Veriler, kütüphanenin bileşiminin kan bölmesinde yalnızca marjinal olarak zenginleştiğini göstermektedir. Amino asit frekansları ve konsensüs dizileri, Weblogo16 yazılımının bir uyarlaması kullanılarak her pozisyonda daha fazla analiz edildi. İlginç bir şekilde, kan glisin kalıntılarında güçlü bir zenginleşme bulduk (Şekil 1g). Kan, BOS'tan seçilen klonlarla karşılaştırıldığında, güçlü bir seçilim ve bazı motiflerin seçilmemesi gözlemlendi (Şekil 1f) ve belirli amino asitler, 12 üyeli grupta önceden belirlenmiş pozisyonlarda tercihen mevcuttu (Şekil 1h). Özellikle, bireysel hayvanlar beyin omurilik sıvısında önemli ölçüde farklılık gösterirken, her iki hayvanda da kan glisin zenginleşmesi gözlemlendi (Ek Şekil 4a–j). #1.1 ve #1.2 numaralı hayvanların beyin omurilik sıvısındaki dizi verilerinin sıkı bir şekilde filtrelenmesinden sonra, toplamda 964 ve 420 benzersiz 12-mer peptid elde edildi (Ek Şekil 1d–e). İzole edilen faj klonları çoğaltıldı ve ikinci bir in vivo seçilim turuna tabi tutuldu. İkinci tur seçimden elde edilen fajlar her hayvanda HTS'ye tabi tutuldu ve tanımlanan tüm peptitler, tripeptit motiflerinin oluşumunu analiz etmek için bir motif tanıma programına girdi olarak kullanıldı (Şekil 2a, b, ef). CSF'den elde edilen fajın ilk döngüsüyle karşılaştırıldığında, A ve B dallarında CSF'deki birçok motifin daha fazla seçilim ve seçimden çıkarıldığını gözlemledik (Şekil 2). Farklı tutarlı dizi modellerini temsil edip etmediklerini belirlemek için bir ağ tanımlama algoritması uygulandı. Alternatif klad A'da (Şekil 2c, d) ve klad B'de (Şekil 2g, h) CSF tarafından elde edilen 12 boyutlu diziler arasında açık bir benzerlik gözlemlendi. Her daldaki birleştirilmiş analiz, 12-mer peptitler için farklı seçilim profilleri (Ek Şekil 5c, d) ve birleştirilmiş klonlar için ikinci tur seçimden sonra birinci tur seçime kıyasla zamanla CSF/kan titresi oranında bir artış ortaya koydu (Ek Şekil 5e). ).
Beyin omurilik sıvısındaki motif ve peptitlerin, iki ardışık tur in vivo fonksiyonel faj görüntüleme seçimi ile zenginleştirilmesi.
Her hayvanın ilk turundan elde edilen tüm beyin-omurilik sıvısı fajları (hayvanlar #1.1 ve #1.2) bir araya getirildi, çoğaltıldı, HT-dizilendi ve birlikte yeniden enjekte edildi (hayvan başına 2 x 1010 faj) 2 SM kanüllü sıçan (#1.1 → #). 2.1 ve 2.2, 1.2 → 2.3 ve 2.4). (a,b,e,f) Birinci ve ikinci seçim turlarında tüm BOS türevi fajların tripeptit motiflerinin göreceli frekansını karşılaştıran korelasyon saçılma grafikleri. Her iki yönelimdeki peptitlerde bulunan tüm olası örtüşen tripeptitleri temsil eden motiflerin göreceli frekansı ve dağılımı. 1000 okumada bulunan motif sayısı gösterilmektedir. Karşılaştırılan kütüphanelerden birinde önemli ölçüde (p < 0,001) seçilen veya hariç tutulan motifler kırmızı noktalarla vurgulanmıştır. (c, d, g, h) İn vivo seçilimin 2. ve 1. turlarına dayalı tüm BOS açısından zengin 12 amino asit uzunluğundaki dizilerin dizi logosu gösterimi. Tek harfli kodun boyutu, o amino asidin o pozisyonda ne sıklıkta bulunduğunu gösterir. Logoyu temsil etmek için, iki seçim turu arasında tek tek hayvanlardan çıkarılan BOS dizilerinin sıklığı karşılaştırılır ve ikinci turdaki zenginleştirilmiş diziler gösterilir: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ve (h) #1.2–#2.4. (c, d) 2.1 ve 2.2 numaralı hayvanlarda veya (g, h) 2.3 ve 2.4 numaralı hayvanlarda belirli bir pozisyondaki en zenginleştirilmiş amino asitler renkli olarak gösterilir. Yeşil = polar, mor = nötr, mavi = bazik, kırmızı = asidik ve siyah = hidrofobik amino asitler.
Üçüncü seçim turundan sonra, iki hayvandan izole edilen 332 BOS-yeniden oluşturulmuş faj klonundan 124 benzersiz peptit dizisi (#3.1 ve #3.2) tanımladık (Ek Şekil 6a). LGSVS dizisi (%18,7) en yüksek göreceli orana sahipti, bunu vahşi tip ekler PAGISRELVDKL (%8,2), MRWFFSHASQGR (%3), DVAKVS (%3), TWLFSLG (%2,2) ve SARGSWREIVSLS (%2,2) takip etti. Son dördüncü turda, üç ayrı hayvandan bağımsız olarak seçilen iki dalı bir araya getirdik (Şekil 1c). BOS'tan elde edilen 925 dizili faj klonundan, dördüncü turda 64 benzersiz peptit dizisi bulduk (Ek Şekil 6b), bunlar arasında vahşi tip fajın göreceli oranı %0,8'e düştü. Dördüncü turdaki en yaygın CSF klonları LYVLHSRGLWGFKLAAALE (%18), LGSVS (%17), GFVRFRLSNTR (%14), KVAWRVFSLFWK (%7), SVHGV (%5), GRPQKINGARVC (%3,6) ve RLSSVDSDLSGC (3, %2) idi. %)). Seçilen peptitlerin uzunluk aralığı, NNK kütüphane tasarımı için dejenere kodonlar kullanıldığında kütüphane primerlerindeki nükleotid eklemeleri/silmeleri veya erken durdurma kodonlarından kaynaklanmaktadır. Erken durdurma kodonları daha kısa peptitler üretir ve uygun aa motifini içerdikleri için seçilirler. Daha uzun peptitler, sentetik kütüphanelerin primerlerindeki eklemeler/silmelerden kaynaklanabilir. Bu, tasarlanan durdurma kodonunu çerçevenin dışına yerleştirir ve akış aşağısında yeni bir durdurma kodonu görünene kadar okur. Genel olarak, giriş verilerini örnek çıkış verileriyle karşılaştırarak dört seçim turu için zenginleştirme faktörlerini hesapladık. İlk tarama turu için, spesifik olmayan bir arka plan referansı olarak vahşi tip faj titrelerini kullandık. İlginç bir şekilde, negatif faj seçilimi ilk BOS döngüsünde çok güçlüydü, ancak kanda değildi (Şekil 3a), bu peptit kütüphanesinin üyelerinin çoğunun BOS bölmesine pasif difüzyon olasılığının düşük olmasından veya göreceli fajların bakteriyofajlardan daha verimli bir şekilde tutulma veya kan dolaşımından uzaklaştırılma eğiliminde olmasından kaynaklanıyor olabilir. Ancak, ikinci tarama turunda, her iki kladda da BOS'ta güçlü faj seçilimi gözlemlendi, bu da önceki turun BOS alımını teşvik eden peptitler gösteren fajlarla zenginleştirildiğini gösteriyor (Şekil 3a). Yine, önemli bir kan zenginleştirmesi olmadan. Ayrıca, üçüncü ve dördüncü turlarda, faj klonları BOS'ta önemli ölçüde zenginleştirildi. Son iki seçim turu arasındaki her benzersiz peptit dizisinin göreceli sıklığını karşılaştırdığımızda, dizilerin dördüncü seçim turunda daha da zenginleştiğini bulduk (Şekil 3b). Her iki peptit yönelimi kullanılarak 64 benzersiz peptit dizisinin tamamından toplam 931 tripeptit motifi çıkarıldı. Dördüncü turdaki en zengin motifler, enjekte edilen kütüphaneye kıyasla tüm turlardaki zenginleştirme profilleri açısından daha yakından incelendi (kesme: %10 zenginleştirme) (Ek Şekil 6c). Genel seçilim desenleri, incelenen motiflerin çoğunun her iki seçilim dalının önceki tüm turlarında zenginleştirildiğini gösterdi. Ancak bazı motifler (örneğin SGL, VSG, LGS GSV) ağırlıklı olarak alternatif klad A'dan gelirken diğerleri (örneğin FGW, RTN, WGF, NTR) alternatif klad B'de zenginleştirildi.
Streptavidin yüklerine konjuge edilmiş CSF ile zenginleştirilmiş faj görüntülemeli peptitlerin ve biyotinlenmiş lider peptitlerin CSF taşınmasının doğrulanması.
(a) Enjekte edilen (girdi = I) faj (PFU) titreleri ve belirlenen BOS faj titreleri (çıktı = O) temel alınarak dört turda (R1-R4) hesaplanan zenginleştirme oranları. Son üç tur için (R2-R4) zenginleştirme faktörleri, önceki tur ve ilk tur (R1) ile ağırlık verileriyle karşılaştırılarak hesaplandı. Açık çubuklar beyin omurilik sıvısı, gölgeli çubuklar plazmadır. (***p<0,001, Student's t-testi temelinde). (b) Seçimin 4. turundan sonra BOS'ta toplanan tüm fajlara göre göreceli oranlarına göre sıralanmış, en bol faj peptitlerinin listesi. En yaygın altı faj klonu renkle vurgulanmış, numaralandırılmış ve seçimin 3. ve 4. turları arasındaki zenginleştirme faktörleri (ekler) gösterilmiştir. (c,d) 4. turdaki en zenginleştirilmiş altı faj klonu, boş faj ve ebeveyn faj peptit kütüphaneleri, bir BOS örnekleme modelinde ayrı ayrı analiz edilmiştir. Belirtilen zaman noktalarında BOS ve kan örnekleri toplandı. (c) Eşit miktarda 6 aday faj klonu (2 x 1010 faj/hayvan), boş fajlar (#1779) (2 x 1010 faj/hayvan) ve stok faj peptit kütüphaneleri (2 x 1012 faj/hayvan) En az 3 CM, kanül takılmış hayvana kuyruk damarından ayrı ayrı enjekte edilir. Enjekte edilen her faj klonunun ve faj peptit kütüphanesinin zaman içindeki BOS farmakokinetiği gösterilir. (d) örnekleme süresi boyunca tüm geri kazanılan fajlar/mL için ortalama BOS/kan oranını gösterir. (e) Dört sentetik lider peptit ve bir karıştırılmış kontrol, N-terminusları (tetramer gösterimi) aracılığıyla biyotin ile streptavidine bağlandı ve ardından enjeksiyon yapıldı (kuyruk damarı iv, 10 mg streptavidin/kg). En az üç entübe edilmiş sıçan (N = 3). ). BOS örnekleri belirtilen zaman noktalarında toplandı ve streptavidin konsantrasyonları BOS anti-streptavidin ELISA ile ölçüldü (nd = tespit edilmedi). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, ANOVA testine göre). (f) En zenginleştirilmiş faj peptid klonu #2002'nin (mor) amino asit dizisinin, 4. seçim turundan seçilen diğer faj peptid klonlarıyla karşılaştırılması. Aynı ve benzer amino asit parçaları renk kodludur.
Dördüncü turdaki tüm zenginleştirilmiş fajlardan (Şekil 3b), altı aday klon, CSF örnekleme modelinde daha ileri bireysel analiz için seçildi. Altı aday faj, boş faj (ek yok) ve profaj peptit kütüphanelerinin eşit miktarları üç kanüllü CM hayvanına enjekte edildi ve farmakokinetikler CSF'de (Şekil 3c) ve kanda (Ek Şekil 7) belirlendi. Test edilen tüm faj klonları, CSF bölmesini boş kontrol fajından (#1779) 10-1000 kat daha yüksek bir seviyede hedefledi. Örneğin, #2020 ve #2077 klonları, kontrol fajından yaklaşık 1000 kat daha yüksek CSF titrelerine sahipti. Seçilen her peptidin farmakokinetik profili farklıdır, ancak hepsinin yüksek bir CSF homing yeteneği vardır. #1903 ve #2011 klonları için zamanla sabit bir azalma gözlemledik, #2077, #2002 ve #2009 klonları için ise ilk 10 dakika içerisinde görülen bir artış aktif taşımayı gösterebilir ancak bunun doğrulanması gerekir. #2020, #2002 ve #2077 klonları yüksek seviyelerde sabitlenirken, #2009 klonunun BOS konsantrasyonu ilk artıştan sonra yavaşça azaldı. Daha sonra her BOS adayının bağıl sıklığını kan konsantrasyonuyla karşılaştırdık (Şekil 3d). Her BOS adayının ortalama titresinin tüm örnekleme zamanlarındaki kan titresiyle korelasyonu, altı adaydan üçünün kan BOS'unda önemli ölçüde zengin olduğunu gösterdi. İlginç bir şekilde, #2077 klonu daha yüksek kan stabilitesi gösterdi (Ek Şekil 7). Peptitlerin kendilerinin faj parçacıkları dışındaki kargoları da BOS bölmesine aktif olarak taşıyabildiğini doğrulamak için, peptitlerin faj parçacığına bağlandığı N-terminusta biyotinle türevlendirilmiş dört lider peptid sentezledik. Biyotinlenmiş peptitler (no. 2002, 2009, 2020 ve 2077) faj geometrisini biraz taklit eden multimerik formlar elde etmek için streptavidin (SA) ile konjuge edildi. Bu format ayrıca, kan ve beyin omurilik sıvısında kargo taşıyan protein peptitleri olarak SA maruziyetini ölçmemize olanak sağladı. Önemlisi, sentetik peptitler bu SA-konjuge formatta uygulandığında faj verileri sıklıkla yeniden üretilebildi (Şekil 3e). Karıştırılmış peptitler daha az ilk maruziyete ve 48 saat içinde tespit edilemeyen seviyelerle daha hızlı BOS temizliğine sahipti. Bu peptit faj klonlarının BOS boşluğuna iletim yollarına dair fikir edinmek için, faj parçacıklarını doğrudan intravenöz enjeksiyondan 1 saat sonra tespit etmek için immünohistokimya (IHC) kullanarak bireysel faj peptit vuruşlarının lokalizasyonunu analiz ettik. Özellikle, #2002, #2077 ve #2009 klonları beyin kılcal damarlarında güçlü boyama ile tespit edilebilirken, kontrol fajı (#1779) ve klon #2020 tespit edilemedi (Ek Şekil 8). Bu, bu peptitlerin beyin üzerindeki etkiye tam olarak BBB'yi geçerek katkıda bulunduğunu göstermektedir. Bu hipotezi test etmek için daha ayrıntılı analizler gereklidir, çünkü BSCFB yolu da dahil olabilir. En zenginleştirilmiş klonun (#2002) amino asit dizisi diğer seçilmiş peptitlerle karşılaştırıldığında, bazılarının benzer amino asit uzantılarına sahip olduğu ve bunun benzer bir taşıma mekanizmasını gösterebileceği not edildi (Şekil 3f).
Benzersiz plazma profili ve zamanla BOS'ta belirgin artış nedeniyle, faj görüntüleme klonu #2077 daha uzun bir 48 saatlik süre boyunca araştırıldı ve sürekli SA seviyeleriyle ilişkili olarak gözlemlenen BOS'taki hızlı artışı yeniden üretebildi (Şekil 4a). Diğer tanımlanmış faj klonlarına gelince, #2077 beyin kılcal damarları için güçlü bir şekilde boyandı ve daha yüksek çözünürlükte görüntülendiğinde kılcal belirteç lektin ile belirgin bir kolokalizasyon ve muhtemelen parankimal boşlukta bir miktar boyama gösterdi (Şekil 4b). Peptit aracılı farmakolojik etkilerin CNS'de elde edilip edilemeyeceğini araştırmak için, i) #2077 transit peptidinin ve ii) BACE1 inhibitör peptidinin biyotinlenmiş versiyonlarının SA ile iki farklı oranda karıştırıldığı bir deney gerçekleştirdik. Bir kombinasyon için sadece BACE1 peptit inhibitörünü kullandık ve diğeri için BACE1 peptit inhibitörünün #2077 peptidine 1:3 oranını kullandık. Her iki örnek de intravenöz olarak uygulandı ve kan ve beyin omurilik sıvısı beta-amiloid peptid 40 (Abeta40) seviyeleri zaman içinde ölçüldü. Abeta40, beyin parankimasındaki BACE1 inhibisyonunu yansıttığı için BOS'ta ölçüldü. Beklendiği gibi, her iki kompleks de Abeta40'ın kan seviyelerini önemli ölçüde azalttı (Şekil 4c, d). Ancak, yalnızca peptid no. 2077 ve SA'ya konjuge BACE1 peptidinin bir inhibitörünün bir karışımını içeren örnekler beyin omurilik sıvısında Abeta40'ta önemli bir azalmaya neden oldu (Şekil 4c). Veriler, peptid no. 2077'nin 60 kDa SA proteinini CNS'ye taşıyabildiğini ve ayrıca BACE1 peptidinin SA-konjuge inhibitörleriyle farmakolojik etkilere neden olduğunu göstermektedir.
(a) En az üç CM entübe edilmiş sıçanda CSF peptidi #2077'nin (RLSSVDSDLSGC) ve enjekte edilmemiş kontrol fajının (#1779) uzun vadeli farmakokinetik profillerini gösteren T7 fajının klonal enjeksiyonu (hayvan başına 2 × 10 faj). (b) Faj enjekte edilmiş sıçanlarda (hayvan başına 2 × 10 10 faj) temsili kortikal mikro damarların konfokal mikroskobik görüntüsü, peptid #2077'nin ve damarların (lektin) karşıt boyanmasını göstermektedir. Bu faj klonları 3 sıçana uygulandı ve perfüzyondan önce 1 saat dolaşıma bırakıldı. Beyinler kesildi ve T7 faj kapsidine karşı poliklonal FITC etiketli antikorlarla boyandı. Perfüzyondan ve müteakip fiksasyondan on dakika önce, DyLight594 etiketli lektin intravenöz olarak uygulandı. Kılcal damarların ve perivasküler beyin dokusunun lümeninde mikrodamarların ve fajların (yeşil) lüminal tarafının lektin boyamasını (kırmızı) gösteren floresan görüntüler. Ölçek çubuğu 10 µm'ye karşılık gelir. (c, d) Tek başına veya biyotinlenmiş transit peptid #2077 ile kombinasyon halinde biyotinlenmiş BACE1 inhibitör peptidi, en az üç kanüllü CM sıçanının (10 mg streptavidin/kg) intravenöz enjeksiyonuyla takip edilen streptavidin ile birleştirildi. BACE1 peptid inhibitörü aracılı Aβ40 azalması, belirtilen zaman noktalarında kanda (kırmızı) ve beyin omurilik sıvısında (turuncu) Aβ1-40 ELISA ile ölçüldü. Daha iyi netlik için, grafiğe %100 ölçeğinde noktalı bir çizgi çizildi. (c) Streptavidin ile transit peptit #2077 ve BACE1 inhibitör peptidinin 3:1 oranında konjuge edilmesiyle tedavi edilen sıçanlarda kanda (kırmızı üçgenler) ve beyin omurilik sıvısında (turuncu üçgenler) Aβ40'taki yüzdelik azalma. (d) Sadece streptavidin ile birleştirilmiş BACE1 inhibitör peptidiyle tedavi edilen sıçanlarda kanda (kırmızı daireler) ve beyin omurilik sıvısında (turuncu daireler) Aβ40'taki yüzdelik azalma. Kontroldeki Aβ konsantrasyonu 420 pg/ml idi (standart sapma = 101 pg/ml).
Faj gösterimi biyomedikal araştırmanın çeşitli alanlarında başarıyla uygulanmıştır17. Bu yöntem in vivo vasküler çeşitlilik çalışmaları18,19 ve serebral damarları hedef alan çalışmalar20,21,22,23,24,25,26 için kullanılmıştır. Bu çalışmada, bu seçilim yönteminin uygulamasını sadece serebral damarları hedef alan peptitlerin doğrudan tanımlanmasına değil, aynı zamanda kan-beyin bariyerini geçmek için aktif taşıma özelliklerine sahip adayların keşfine de genişlettik. Şimdi CM entübe edilmiş sıçanlarda bir in vivo seçilim prosedürünün geliştirilmesini açıklıyoruz ve BOS homing özelliklerine sahip peptitleri tanımlama potansiyelini gösteriyoruz. 12-mer rastgele peptitlerden oluşan bir kütüphane gösteren T7 fajını kullanarak, T7 fajının kan-beyin bariyerine adapte olabilecek kadar küçük (yaklaşık 60 nm çapında)10 olduğunu ve böylece doğrudan kan-beyin bariyerini veya koroid pleksusu geçtiğini gösterebildik. Kanüllü CM sıçanlarından CSF hasadının iyi kontrol edilen bir in vivo fonksiyonel tarama yöntemi olduğunu ve çıkarılan fajın sadece damar sistemine bağlanmadığını, aynı zamanda kan-beyin bariyerini geçen bir taşıyıcı olarak da işlev gördüğünü gözlemledik. Dahası, aynı anda kan toplayarak ve CSF'ye ve kandan türetilen fajlara HTS uygulayarak, CSF seçimimizin kan zenginleştirme veya seçim turları arasındaki genişlemeye uygunluktan etkilenmediğini doğruladık. Ancak, kan bölmesi seçim prosedürünün bir parçasıdır, çünkü CSF bölmesine ulaşabilen fajlar beyinde kendilerini zenginleştirmek için yeterince uzun süre kan dolaşımında hayatta kalmalı ve dolaşmalıdır. Ham HTS verilerinden güvenilir dizi bilgisi çıkarmak için, analiz iş akışında platforma özgü dizileme hatalarına uyarlanmış filtreler uyguladık. Tarama yöntemine kinetik parametreleri dahil ederek, vahşi tip T7 fajlarının kandaki hızlı farmakokinetiğini (t½ ~ 28 dak) doğruladık24, 27, 28 ve ayrıca beyin omurilik sıvısındaki yarı ömürlerini (t½ ~ 26 dak) dakikada belirledik. Kan ve BOS'taki benzer farmakokinetik profillere rağmen, fajın kan konsantrasyonunun yalnızca %0,001'i BOS'ta tespit edilebildi ve bu, vahşi tip T7 fajının kan-beyin bariyerini geçerken düşük arka plan hareketliliğine işaret ediyor. Bu çalışma, özellikle dolaşımdan hızla temizlenen faj sistemleri için, in vivo tarama stratejileri kullanılırken ilk seçim turunun önemini vurgulamaktadır, çünkü az sayıda klon CNS bölmesine ulaşabilir. Bu nedenle, ilk turda, kütüphane çeşitliliğindeki azalma çok büyüktü, çünkü sonunda bu çok katı BOS modelinde yalnızca sınırlı sayıda klon toplandı. Bu in vivo tarama stratejisi, CSF bölmesinde aktif birikim, kan bölmesinde klon sağkalımı ve ilk 10 dakika içinde T7 faj klonlarının kandan hızla uzaklaştırılması gibi çeşitli seçilim adımlarını içeriyordu (Şekil 1d ve Ek Şekil 4M). ). Bu nedenle, ilk turdan sonra, aynı başlangıç ​​havuzu tek tek hayvanlar için kullanılmasına rağmen, CSF'de farklı faj klonları tanımlandı. Bu, çok sayıda kütüphane üyesine sahip kaynak kütüphaneleri için birden fazla sıkı seçilim adımının çeşitlilikte önemli bir azalmaya yol açtığını göstermektedir. Bu nedenle, rastgele olaylar ilk seçilim sürecinin ayrılmaz bir parçası haline gelecek ve sonucu büyük ölçüde etkileyecektir. Orijinal kütüphanedeki klonların çoğunun çok benzer bir CSF zenginleştirme eğilimine sahip olması muhtemeldir. Ancak, aynı deneysel koşullar altında bile, başlangıç ​​havuzundaki her bir belirli klonun az sayıda olması nedeniyle seçilim sonuçları farklılık gösterebilir.
BOS'ta zenginleştirilmiş motifler kandakilerden farklıdır. İlginç bir şekilde, bireysel hayvanların kanında glisin açısından zengin peptitlere doğru ilk kaymayı fark ettik. (Şekil 1g, Ek Şekiller 4e, 4f). Glisin peptitleri içeren fajlar daha kararlı olabilir ve dolaşımdan çıkarılma olasılıkları daha düşük olabilir. Ancak, bu glisin açısından zengin peptitler beyin omurilik sıvısı örneklerinde tespit edilmedi, bu da düzenlenmiş kütüphanelerin iki farklı seçilim adımından geçtiğini gösteriyor: biri kanda ve diğeri beyin omurilik sıvısında birikmesine izin verildi. Dördüncü seçim turundan elde edilen BOS ile zenginleştirilmiş klonlar kapsamlı bir şekilde test edildi. Tek tek test edilen klonların neredeyse tamamının boş kontrol fajına kıyasla BOS'ta zenginleştirildiği doğrulandı. Bir peptit vuruşu (#2077) daha ayrıntılı olarak incelendi. Diğer vuruşlara kıyasla daha uzun bir plazma yarı ömrü gösterdi (Şekil 3d ve Ek Şekil 7) ve ilginç bir şekilde, bu peptit C-terminusunda bir sistein kalıntısı içeriyordu. Son zamanlarda peptitlere sistein eklenmesinin albümin 29'a bağlanarak farmakokinetik özelliklerini iyileştirebileceği gösterildi. Bu şu anda peptit #2077 için bilinmiyor ve daha fazla çalışma gerektiriyor. Bazı peptitler BOS zenginleştirmesinde bir değer bağımlılığı gösterdi (veri gösterilmemiştir), bu T7 kapsidinin görüntülenen yüzey geometrisiyle ilişkili olabilir. Kullandığımız T7 sistemi faj partikülü başına her peptidin 5-15 kopyasını gösterdi. IHC, sıçanların serebral korteksine intravenöz olarak enjekte edilen aday öncü faj klonları üzerinde gerçekleştirildi (Ek Şekil 8). Veriler en az üç klonun (No. 2002, No. 2009 ve No. 2077) BBB ile etkileşime girdiğini gösterdi. Bu BBB etkileşiminin CSF birikimine mi yoksa bu klonların doğrudan BCSFB'ye hareketine mi yol açtığı henüz belirlenmemiştir. Önemlisi, seçilen peptitlerin sentezlendiğinde ve protein kargoya bağlandığında CSF taşıma kapasitelerini koruduğunu gösteriyoruz. N-terminal biyotinlenmiş peptitlerin SA'ya bağlanması, esasen kan ve beyin omurilik sıvısındaki ilgili faj klonlarıyla elde edilen sonuçları tekrarlar (Şekil 3e). Son olarak, öncü peptit #2077'nin SA'ya konjuge edilmiş bir BACE1 biyotinlenmiş peptit inhibitörünün beyindeki etkisini destekleyebildiğini ve CSF'deki Abeta40 seviyelerini önemli ölçüde azaltarak CNS'de belirgin farmakodinamik etkilere neden olduğunu gösteriyoruz (Şekil 4). Tüm isabetlerin peptit dizisi homolog aramasını yaparak veritabanında herhangi bir homolog belirleyemedik. T7 kütüphanesinin boyutunun yaklaşık 109 olduğunu, 12-mer'ler için teorik kütüphane boyutunun ise 4 x 1015 olduğunu belirtmek önemlidir. Bu nedenle, 12-mer peptit kütüphanesinin çeşitlilik alanının yalnızca küçük bir bölümünü seçtik; bu, bu belirlenen isabetlerin bitişik dizilim alanını değerlendirerek daha optimize edilmiş peptitlerin belirlenebileceği anlamına gelebilir. Hipotetik olarak, bu peptitlerin doğal homologlarını bulamamamızın nedenlerinden biri, belirli peptit motiflerinin beyne kontrolsüz girişini önlemek için evrim sırasında seçilim dışı bırakma olabilir.
Sonuçlarımız bir arada ele alındığında, serebrovasküler bariyerin in vivo taşıma sistemlerini daha ayrıntılı bir şekilde tanımlamak ve karakterize etmek için gelecekteki çalışmalar için bir temel sağlar. Bu yöntemin temel kurulumu, yalnızca serebral vasküler bağlanma özelliklerine sahip klonları tanımlamakla kalmayıp aynı zamanda başarılı klonların in vivo biyolojik bariyerleri CNS bölmesine geçmek için içsel aktiviteye sahip olduğu kritik bir adımı da içeren işlevsel bir seçim stratejisine dayanmaktadır. Bu peptitlerin taşınma mekanizmasını ve beyin bölgesine özgü mikro damar sistemine bağlanma tercihlerini açıklamaktır. Bu, BBB ve reseptörlerin taşınması için yeni yolların keşfedilmesine yol açabilir. Tanımlanan peptitlerin doğrudan serebrovasküler reseptörlere veya BBB veya BCSFB aracılığıyla taşınan dolaşımdaki ligandlara bağlanabileceğini umuyoruz. Bu çalışmada keşfedilen CSF taşıma aktivitesine sahip peptit vektörleri daha fazla araştırılacaktır. Şu anda bu peptitlerin BBB ve/veya BCSFB'yi geçme yetenekleri açısından beyin özgüllüğünü araştırıyoruz. Bu yeni peptitler, yeni reseptörlerin veya yolların keşfi ve biyolojikler gibi makromoleküllerin beyne iletilmesi için yeni ve yüksek verimli platformların geliştirilmesi için son derece değerli araçlar olacaktır.
Daha önce açıklanan yöntemin bir modifikasyonunu kullanarak büyük sarnıcı (CM) kanüle edin. Anestezi uygulanmış Wistar sıçanları (200-350 g) bir stereotaksik aparata yerleştirildi ve kafatasını açığa çıkarmak için tıraşlanmış ve aseptik olarak hazırlanmış kafa derisinin üzerinden medyan bir kesi yapıldı. Üst kanat alanına iki delik açın ve sabitleme vidalarını deliklere sabitleyin. Paslanmaz çelik bir kanülün CM'ye stereotaktik kılavuzluğu için lateral oksipital kretinde ek bir delik açıldı. Kanülün etrafına diş çimentosu uygulayın ve vidalarla sabitleyin. Fotokürleme ve çimento sertleşmesinden sonra, cilt yarası 4/0 supramid sütür ile kapatıldı. Kanülün doğru şekilde yerleştirildiği, beyin omurilik sıvısının (BOS) kendiliğinden sızmasıyla doğrulanır. Sıçanı stereotaksik aparattan çıkarın, uygun postoperatif bakım ve ağrı yönetimi alın ve beyin omurilik sıvısında kan belirtileri görülene kadar en az bir hafta iyileşmesini bekleyin. Wistar sıçanları (Crl:WI/Han) Charles River'dan (Fransa) elde edildi. Tüm sıçanlar belirli patojen içermeyen koşullar altında tutuldu. Tüm hayvan deneyleri İsviçre, Basel Şehri Veterinerlik Ofisi tarafından onaylandı ve Hayvan Lisansı No. 2474'e (Sıçan Beyin Omurilik Sıvısı ve Beynindeki Terapötik Adayların Düzeylerinin Ölçülmesiyle Aktif Beyin Taşımacılığının Değerlendirilmesi) uygun olarak gerçekleştirildi.
CM kanülünü elinizde tutarak sıçanı nazikçe bilinçli tutun. Datura'yı kanülden çıkarın ve kendiliğinden akan beyin omurilik sıvısından 10 µl toplayın. Kanülün açıklığı nihayetinde tehlikeye girdiğinden, bu çalışmaya yalnızca kan kontaminasyonu veya renk değişikliği kanıtı olmayan berrak beyin omurilik sıvısı örnekleri dahil edildi. Paralel olarak, kuyruğun ucundaki küçük bir kesiden heparin (Sigma-Aldrich) içeren tüplere yaklaşık 10-20 µl kan alındı. T7 fajının intravenöz enjeksiyonundan sonra çeşitli zaman noktalarında BOS ve kan toplandı. Her BOS örneği toplanmadan önce yaklaşık 5-10 µl sıvı atıldı; bu, kateterin ölü hacmine karşılık gelir.
Kütüphaneler, T7Select sistem kılavuzunda (Novagen, Rosenberg ve diğerleri, InNovations 6, 1-6, 1996) açıklandığı gibi T7Select 10-3b vektörü kullanılarak oluşturuldu. Kısaca, rastgele bir 12-mer DNA eki aşağıdaki formatta sentezlendi:
NNK kodonu, ek parçada çift durdurma kodonlarından ve amino asit aşırı ifadesinden kaçınmak için kullanıldı. N, her nükleotidin elle karıştırılmış bir ekimolar oranıdır ve K, adenin ve sitozin nükleotidlerinin elle karıştırılmış bir ekimolar oranıdır. Tek sarmallı bölgeler, 37°C'de 3 saat boyunca Klenow tamponunda (New England Biolabs) dNTP (Novagen) ve Klenow enzimi (New England Biolabs) ile daha fazla inkübasyon yapılarak çift sarmallı DNA'ya dönüştürüldü. Reaksiyondan sonra, çift sarmallı DNA EtOH çökeltmesi ile geri kazanıldı. Elde edilen DNA, restriksiyon enzimleri EcoRI ve HindIII (ikisi de Roche'dan) ile sindirildi. Kesilen ve saflaştırılan (QIAquick, Qiagen) ek parça (T4 ligaz, New England Biolabs) daha sonra 10B kapsid geninin 348. amino asidinden sonra önceden kesilmiş bir T7 vektörüne çerçeve içinde bağlandı. Ligasyon reaksiyonları in vitro paketlemeden önce 18 saat boyunca 16° C'de inkübe edildi. İn vitro faj paketleme, T7Select 10-3b klonlama kiti (Novagen) ile birlikte verilen talimatlara göre gerçekleştirildi ve paketleme solüsyonu Escherichia coli (BLT5615, Novagen) kullanılarak bir kez lizise kadar çoğaltıldı. Lizatlar santrifüj edildi, titre edildi ve gliserolün stok solüsyonu olarak -80° C'de donduruldu.
Broth veya plakada çoğaltılan faj değişken bölgelerinin doğrudan PCR çoğaltılması, tescilli 454/Roche-amplikon füzyon primerleri kullanılarak. İleri füzyon primeri, değişken bölgeyi çevreleyen dizileri (NNK) 12 (şablona özgü), GS FLX Titanyum Adaptörü A ve dört bazlı bir kütüphane anahtar dizisini (TCAG) içerir (Ek Şekil 1a):
Ters füzyon primeri ayrıca emülsiyon PCR sırasında klonal amplifikasyon için gerekli olan yakalama boncuklarına ve GS FLX Titanyum Adaptörü B'ye bağlı biyotin de içerir:
Amplikonlar daha sonra 454 GS-FLX Titanium protokolüne göre 454/Roche pirosekanslamasına tabi tutuldu. Manuel Sanger dizilemesi için (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analizörü), T7 faj DNA'sı PCR ile çoğaltıldı ve aşağıdaki primer çiftleriyle dizilendi:
Bireysel plaklardan alınan ekler, Roche Fast Start DNA Polimeraz Kiti kullanılarak PCR amplifikasyonuna tabi tutuldu (üreticinin talimatlarına göre). Sıcak bir başlangıç ​​(95 °C'de 10 dakika) ve 35 destek döngüsü (95 °C'de 50 saniye, 50 °C'de 1 dakika ve 72 °C'de 1 dakika) gerçekleştirin.
Kütüphanelerden alınan faj, vahşi tip faj, BOS ve kandan kurtarılan faj veya bireysel klonlar, Escherichia coli BL5615'te TB broth'ta (Sigma Aldrich) veya 500 cm2'lik kaplarda (Thermo Scientific) 37°C'de 4 saat boyunca çoğaltıldı. Fajlar, plakaları Tris-EDTA tamponuyla (Fluka Analytical) durulayarak veya plakları steril pipet uçlarıyla toplayarak plakalardan çıkarıldı. Fajlar, kültür süpernatantından veya bir tur polietilen glikol (PEG 8000) çökeltisi (Promega) içeren ekstraksiyon tamponundan izole edildi ve Tris-EDTA tamponunda yeniden süspanse edildi.
Amplifiye edilmiş faj, intravenöz (IV) enjeksiyondan (500 μl/hayvan) önce endotoksin giderme boncukları (Miltenyi Biotec) kullanılarak 2-3 tur endotoksin giderme işlemine tabi tutuldu. İlk turda, 2×1012 faj; ikinci turda, 2×1010 faj; üçüncü ve dördüncü seçim turlarında, hayvan başına 2×109 faj sokuldu. Belirtilen zaman noktalarında toplanan BOS ve kan örneklerindeki faj içeriği, üreticinin talimatlarına (T7Select sistem kılavuzu) göre plak sayımı ile belirlendi. Faj seçimi, saflaştırılmış kütüphanelerin kuyruk damarına intravenöz enjeksiyonu veya önceki seçim turundan BOS'tan ekstrakte edilen fajın yeniden enjeksiyonu ile gerçekleştirildi ve sonraki hasatlar sırasıyla BOS ve kan örneklerinde 10 dakika, 30 dakika, 60 dakika, 90 dakika, 120 dakika, 180 dakika ve 240 dakikalarda gerçekleştirildi. Toplam dört tur in vivo tarama yapıldı ve bu turlarda seçilen iki dal ayrı ayrı saklandı ve ilk üç tur seçim sırasında analiz edildi. İlk iki tur seçimden BOS'tan ekstrakte edilen tüm faj ekleri 454/Roche pirosekanslamasına tabi tutulurken, son iki tur seçimden BOS'tan ekstrakte edilen tüm klonlar manuel olarak dizilendi. İlk tur seçimden gelen tüm kan fajları da 454/Roche pirosekanslamasına tabi tutuldu. Faj klonlarının enjeksiyonu için seçilen fajlar 4 saat boyunca 37°C'de 500 cm2'lik plakalarda E. coli'de (BL5615) çoğaltıldı. Tek tek seçilen ve manuel olarak dizilenen klonlar TB besiyerinde çoğaltıldı. Faj ekstraksiyonu, saflaştırma ve endotoksinin uzaklaştırılmasından sonra (yukarıda açıklandığı gibi), 300 μl'de 2×1010 faj/hayvan bir kuyruk damarına intravenöz olarak enjekte edildi.
Dizi verilerinin ön işlenmesi ve nitel filtrelemesi. Ham 454/Roche verileri, satıcı yazılımı kullanılarak ikili standart akış haritası biçiminden (sff) Pearson insan tarafından okunabilir biçime (fasta) dönüştürüldü. Nükleotid dizisinin daha ileri işlenmesi, aşağıda açıklandığı gibi tescilli C programları ve betikleri (yayınlanmamış yazılım paketi) kullanılarak gerçekleştirildi. Birincil verilerin analizi, sıkı çok aşamalı filtreleme prosedürlerini içerir. Geçerli bir 12mer ek DNA dizisi içermeyen okumaları filtrelemek için, okumalar küresel Needleman-Wunsch testi kullanılarak başlangıç ​​etiketine (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), bitiş etiketine (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ve arka plan ekine (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) sırayla hizalandı. hizalama, hizalama başına 2 tutarsızlığa kadar izin verir31. Bu nedenle, başlatma ve durdurma etiketleri olmayan okumalar ve arka plan ekleri içeren okumalar, yani izin verilen uyumsuzluk sayısını aşan hizalamalar kütüphaneden kaldırıldı. Kalan okumalara gelince, başlangıç ​​işaretinden uzanan ve durdurma işaretinden önce biten N-mer DNA dizisi orijinal okuma dizisinden çıkarıldı ve daha fazla işlendi (bundan sonra "ek" olarak anılacaktır). Ekin tercümesinden sonra, primerin 5' ucundaki ilk durdurma kodonundan sonraki kısım ekten çıkarılır. Ek olarak, primerin 3' ucundaki eksik kodonlara yol açan nükleotidler de çıkarıldı. Yalnızca arka plan dizileri içeren ekleri hariç tutmak için, "PAG" amino asit örüntüsüyle başlayan tercüme edilmiş ekler de kaldırıldı. Çeviri sonrası uzunluğu 3 amino asitten az olan peptitler kütüphaneden çıkarıldı. Son olarak, ek havuzundaki fazlalığı kaldırın ve her benzersiz ekin sıklığını belirleyin. Bu analizin sonuçları nükleotid dizilerinin (ekler) ve bunların (okuma) frekanslarının bir listesini içeriyordu (Ek Şekiller 1c ve 2).
Dizi benzerliğine göre grup N-mer DNA ekleri: 454/Roche'a özgü dizileme hatalarını (homopolimer uzantılarının dizilenmesindeki sorunlar gibi) ortadan kaldırmak ve daha az önemli fazlalıkları kaldırmak için, daha önce filtrelenmiş N-mer DNA dizi ekleri (ekler) benzerliğe göre sıralanır. eklemeler (2'ye kadar eşleşmeyen baza izin verilir) aşağıdaki gibi tanımlanan yinelemeli bir algoritma kullanılarak sıralanır: eklemeler önce sıklıklarına göre (en yüksekten en düşüğe) ve aynıysalar, uzunluklarına göre (en uzundan en kısaya) sıralanır. Böylece, en sık ve en uzun eklemeler ilk "grubu" tanımlar. Grup frekansı anahtar frekansa ayarlanır. Daha sonra, sıralanmış listede kalan her ekleme, çiftler halinde Needleman-Wunsch hizalaması ile gruba eklenmeye çalışılır. Bir hizalamadaki uyumsuzluk, ekleme veya silme sayısı 2'lik bir eşiği aşmazsa, gruba bir ekleme eklenir ve genel grup frekansı, eklemenin eklendiği sıklığa göre artırılır. Bir gruba eklenen ekler kullanılmış olarak işaretlenir ve daha fazla işleme tabi tutulmaz. Ekleme dizisi halihazırda var olan bir gruba eklenemezse, ekleme dizisi uygun ekleme sıklığına sahip yeni bir grup oluşturmak ve kullanılmış olarak işaretlemek için kullanılır. Her ekleme dizisi yeni bir grup oluşturmak için kullanıldığında veya halihazırda var olan bir gruba dahil edilebildiğinde yineleme sona erer. Sonuçta, nükleotidlerden oluşan gruplanmış ekler sonunda peptit dizilerine (peptit kütüphaneleri) çevrilir. Bu analizin sonucu, ardışık okumaların sayısını oluşturan bir dizi ekleme ve bunlara karşılık gelen frekanslardır (Ek Şekil 2).
Motif Oluşturma: Benzersiz peptitlerin bir listesine dayanarak, aşağıda gösterildiği gibi tüm olası amino asit desenlerini (aa) içeren bir kütüphane oluşturuldu. Uzunluğu 3 olan her olası desen peptitten çıkarıldı ve ters deseni, tüm desenleri (tripeptitler) içeren ortak bir motif kütüphanesiyle birlikte eklendi. Çok tekrarlayan motiflerin kütüphaneleri sıralandı ve fazlalıklar giderildi. Daha sonra, motif kütüphanesindeki her tripeptit için, hesaplama araçlarını kullanarak kütüphanedeki varlığını kontrol ettik. Bu durumda, bulunan motif tripeptitini içeren peptidin frekansı eklenir ve motif kütüphanesindeki motife atanır ("motif sayısı"). Motif oluşturmanın sonucu, tripeptitlerin (motiflerin) tüm oluşumlarını ve bunların ilgili değerlerini içeren iki boyutlu bir dizidir; bunlar, okumalar filtrelendiğinde, gruplandığında ve çevrildiğinde karşılık gelen motifle sonuçlanan dizileme okumalarının sayısıdır. Yukarıda ayrıntılı olarak açıklandığı gibi metrikler.
Motif sayısının ve karşılık gelen saçılma grafiklerinin normalizasyonu: Her bir örnek için motif sayısı, aşağıdakiler kullanılarak normalleştirildi:
Burada ni, konu i'yi içeren okumaların sayısıdır. Bu nedenle, vi, örnekte motif i'yi içeren okumaların (veya peptitlerin) yüzdelik sıklığını temsil eder. Normalleştirilmemiş motif sayısı için p değerleri Fisher'ın kesin testi kullanılarak hesaplanmıştır. Motif sayısının korelogramları ile ilgili olarak, Spearman korelasyonları, R ile normalleştirilmiş motif sayısı kullanılarak hesaplanmıştır.
Peptit kütüphanesindeki her pozisyondaki amino asit içeriğini görselleştirmek için web logogramları 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) oluşturuldu. İlk olarak, 12-mer peptidin her pozisyonundaki amino asit içeriği 20x12 matriste saklanır. Daha sonra, her pozisyonda aynı bağıl amino asit içeriğini içeren 1000 peptitlik bir set fasta-sequence formatında oluşturulur ve web logosu 3'e girdi olarak sağlanır. Bu, belirli bir peptit kütüphanesi için her pozisyondaki bağıl amino asit içeriğinin grafiksel bir gösterimini oluşturur. Çok boyutlu veri kümelerini görselleştirmek için, R'de dahili olarak geliştirilen bir araç (henüz yayınlanmamış bir R paketi olan biosHeatmap) kullanılarak ısı haritaları oluşturuldu. Isı haritalarında sunulan dendrogramlar, Öklid uzaklık metriği ile Ward'ın hiyerarşik kümeleme yöntemi kullanılarak hesaplandı. Motif puanlama verilerinin istatistiksel analizi için, normalleştirilmemiş puanlama için P değerleri Fisher'ın kesin testi kullanılarak hesaplandı. Diğer veri kümeleri için P değerleri R'de Student'ın t-testi veya ANOVA kullanılarak hesaplandı.
Seçilmiş faj klonları ve ekleri olmayan fajlar kuyruk damarından intravenöz olarak enjekte edildi (300 μl PBS'de 2×1010 faj/hayvan). Perfüzyondan ve müteakip fiksasyondan on dakika önce, aynı hayvanlara intravenöz olarak 100 μl DyLight594 etiketli lektin (Vector Laboratories Inc., DL-1177) enjekte edildi. Faj enjeksiyonundan 60 dakika sonra, sıçanlara kalplerinden 50 ml PBS ve ardından 50 ml %4 PFA/PBS ile perfüze edildi. Beyin örnekleri ayrıca %4 PFA/PBS'de bir gece boyunca fiksasyona tabi tutuldu ve 4°C'de bir gece boyunca %30 sakaroza batırıldı. Örnekler OCT karışımında anında dondurulur. Dondurulmuş örneklerin immünohistokimyasal analizi, %1 BSA ile bloke edilmiş ve T7 fajına (Novus NB 600-376A) karşı poliklonal FITC etiketli antikorlarla 4 °C'de inkübe edilmiş 30 µm kriyoseksiyonlar üzerinde oda sıcaklığında gerçekleştirildi. Bir gece inkübe edin. Son olarak, kesitler 3 kez PBS ile yıkandı ve konfokal lazer mikroskobu (Leica TCS SP5) ile incelendi.
Minimum %98 saflıktaki tüm peptitler GenScript USA tarafından sentezlendi, biyotinlendi ve liyofilize edildi. Biyotin, N-terminusta ek bir üçlü glisin ara parçası aracılığıyla bağlanır. Tüm peptitleri kütle spektrometrisi kullanarak kontrol edin.
Streptavidin (Sigma S0677), 5 kat ekimolar fazlalıkta biyotinlenmiş peptit, biyotinlenmiş BACE1 inhibitör peptidi veya biyotinlenmiş BACE1 inhibitör peptidi ve BACE1 inhibitör peptidinin bir kombinasyonu (3:1 oranı) ile %5-10 DMSO'da karıştırıldı/PBS'de inkübe edildi. Enjeksiyondan önce oda sıcaklığında 1 saat bekletildi. Streptavidin-konjuge peptitler, beyin boşluğu olan sıçanların kuyruk damarlarından birine 10 mg/kg dozunda intravenöz olarak enjekte edildi.
Streptavidin-peptit komplekslerinin konsantrasyonu ELISA ile değerlendirildi. Nunc Maxisorp mikrotitre plakaları (Sigma) 4°C'de bir gece boyunca 1,5 μg/ml fare anti-streptavidin antikoru (Thermo, MA1-20011) ile kaplandı. Blokajdan sonra (blokaj tamponu: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, %0,05 NP40, %0,25 jelatin, %1 BSA) oda sıcaklığında 2 saat boyunca plakayı %0,05 Tween-20/PBS (yıkama tamponu) ile 3 saniye yıkayın, BOS ve plazma örnekleri blokaj tamponu (plazma 1:10.000, BOS 1:115) ile seyreltilmiş kuyulara eklendi. Plaka daha sonra 4°C'de tespit antikoru (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) ile bir gece inkübe edildi. Üç yıkama adımından sonra, streptavidin 20 dakikaya kadar TMB substrat solüsyonunda (Roche) inkübasyonla tespit edildi. 1M H2SO4 ile renk gelişimini durdurduktan sonra, 450 nm'de absorbansı ölçün.
Streptavidin-peptit-BACE1 inhibitör kompleksinin fonksiyonu, üreticinin protokolüne göre Aβ(1-40) ELISA ile değerlendirildi (Wako, 294-64701). Kısaca, BOS örnekleri standart seyreltici (1:23) ile seyreltildi ve BNT77 yakalama antikoru ile kaplanmış 96 kuyulu plakalarda 4 °C'de bir gece inkübe edildi. Beş yıkama adımından sonra, HRP-konjuge BA27 antikoru eklendi ve 4 °C'de 2 saat inkübe edildi, ardından beş yıkama adımı yapıldı. Aβ(1–40), oda sıcaklığında 30 dakika boyunca TMB çözeltisinde inkübasyonla tespit edildi. Renk gelişimi durdurma çözeltisi ile durdurulduktan sonra, 450 nm'de absorbansı ölçün. Plazma örnekleri, Aβ(1–40) ELISA'dan önce katı faz ekstraksiyonuna tabi tutuldu. Plazma, 96-kuyulu plakalarda %0,2 DEA'ya (Sigma) eklendi ve oda sıcaklığında 30 dakika inkübe edildi. SPE plakalarını (Oasis, 186000679) su ve %100 metanol ile ardışık olarak yıkadıktan sonra, plazma örnekleri SPE plakalarına eklendi ve tüm sıvı uzaklaştırıldı. Örnekler yıkandı (önce %5 metanol sonra %30 metanol ile) ve %2 NH4OH/%90 metanol ile elüe edildi. Elüat, sabit N2 akımında 55°C'de 99 dakika kurutulduktan sonra, örnekler standart seyrelticilerde indirgendi ve Aβ(1–40) yukarıda açıklandığı gibi ölçüldü.
Bu makaleye atıfta bulunma şekli: Urich, E. ve ark. Canlı organizmada tanımlanan transit peptitleri kullanarak beyne kargo taşınması. bilim. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ve Moos T. Hedefli terapi kullanılarak beyne makromoleküler ilaçların verilmesi. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. ve Martinez-Martinez, P. Peptit ve protein ilaçlarının kan-beyin bariyerini aşarak iletilmesi. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Kan-beyin bariyeri: beyin ilacı geliştirmede bir darboğaz. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG ve Byrd, A. Koroid pleksus-CSF yoluyla beyne ilaç iletimi ve hedeflemenin iyileştirilmesine yönelik beklentiler. İlaç Araştırması 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Beyin iletimi için moleküler Truva atları ile biyofarmasötiklerin modernizasyonu. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM reseptör aracılı peptit taşımacılığının kan-beyin bariyeri boyunca ilerlemesi. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. ve diğerleri. Monovalent moleküler mekikler kullanılarak beyin penetrasyonunu ve terapötik antikorların etkinliğini artırın. Nöron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. ve diğerleri. Transferin reseptörü (TfR) taşınması, TfR antikorlarının afinite varyantlarının beyin tarafından alınmasını belirler. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).