Terima kasih kerana melayari Nature.com. Anda menggunakan versi pelayar dengan sokongan CSS yang terhad. Untuk pengalaman terbaik, kami mengesyorkan anda menggunakan pelayar yang dikemas kini (atau melumpuhkan Mod Keserasian dalam Internet Explorer). Di samping itu, untuk memastikan sokongan berterusan, kami memaparkan laman web tanpa gaya dan JavaScript.
Memaparkan karusel tiga slaid sekaligus. Gunakan butang Sebelumnya dan Seterusnya untuk bergerak melalui tiga slaid pada satu masa atau gunakan butang gelangsar di hujungnya untuk bergerak melalui tiga slaid pada satu masa.
Penghalang darah-otak dan penghalang darah-otak menghalang agen bioterapeutik daripada mencapai sasaran mereka dalam sistem saraf pusat, sekali gus menghalang rawatan penyakit neurologi yang berkesan. Untuk menemui pengangkut otak baharu secara in vivo, kami memperkenalkan pustaka peptida fag T7 dan mengumpul darah dan cecair serebrospinal (CSF) secara bersiri menggunakan model kolam besar tikus yang sedar yang dikanulasi. Klon fag tertentu diperkayakan dengan tinggi dalam CSF selepas empat pusingan pemilihan. Pengujian calon peptida individu mendedahkan lebih daripada 1000 kali ganda pengayaan dalam CSF. Bioaktiviti penghantaran yang dimediasi peptida ke otak disahkan oleh pengurangan 40% dalam tahap amiloid-β dalam cecair serebrospinal menggunakan perencat peptida BACE1 yang dikaitkan dengan peptida transit baharu yang dikenal pasti. Keputusan ini menunjukkan bahawa peptida yang dikenal pasti melalui kaedah pemilihan fag in vivo mungkin merupakan kenderaan yang berguna untuk penghantaran makromolekul sistemik ke otak dengan kesan terapeutik.
Penyelidikan terapi sasaran sistem saraf pusat (CNS) sebahagian besarnya tertumpu pada mengenal pasti ubat dan agen yang dioptimumkan yang mempamerkan sifat penargetan CNS, dengan usaha yang lebih sedikit untuk menemui mekanisme yang mendorong penghantaran ubat aktif ke otak. Ini mula berubah sekarang kerana penghantaran ubat, terutamanya molekul besar, merupakan bahagian penting dalam pembangunan ubat neurosains moden. Persekitaran sistem saraf pusat dilindungi dengan baik oleh sistem penghalang serebrovaskular, yang terdiri daripada penghalang darah-otak (BBB) ​​dan penghalang darah-otak (BCBB)1, menjadikannya sukar untuk menghantar ubat ke otak1,2. Dianggarkan bahawa hampir semua ubat molekul besar dan lebih daripada 98% ubat molekul kecil disingkirkan dari otak3. Itulah sebabnya sangat penting untuk mengenal pasti sistem pengangkutan otak baharu yang menyediakan penghantaran ubat terapeutik yang cekap dan spesifik ke CNS 4,5. Walau bagaimanapun, BBB dan BCSFB juga memberikan peluang yang sangat baik untuk penghantaran ubat kerana ia menembusi dan memasuki semua struktur otak melalui vaskularnya yang luas. Oleh itu, usaha semasa untuk menggunakan kaedah penghantaran bukan invasif ke otak sebahagian besarnya berdasarkan mekanisme pengangkutan yang dimediasi reseptor (PMT) menggunakan reseptor BBB6 endogen. Walaupun terdapat kemajuan penting baru-baru ini menggunakan laluan reseptor transferrin7,8, pembangunan selanjutnya sistem penghantaran baharu dengan ciri-ciri yang dipertingkatkan diperlukan. Untuk tujuan ini, matlamat kami adalah untuk mengenal pasti peptida yang mampu menjadi perantara pengangkutan CSF, kerana ia pada prinsipnya boleh digunakan untuk menghantar makromolekul ke SSP atau untuk membuka laluan reseptor baharu. Khususnya, reseptor dan pengangkut khusus sistem serebrovaskular (BBB dan BSCFB) boleh berfungsi sebagai sasaran yang berpotensi untuk penghantaran ubat bioterapeutik yang aktif dan spesifik. Cecair serebrospinal (CSF) ialah produk rembesan pleksus koroid (CS) dan bersentuhan langsung dengan cecair interstis otak melalui ruang subarachnoid dan ruang ventrikel4. Baru-baru ini telah ditunjukkan bahawa cecair serebrospinal subarachnoid meresap secara berlebihan ke dalam interstitium otak9. Kami berharap dapat mengakses ruang parenkim menggunakan saluran aliran masuk subarachnoid ini atau secara langsung melalui BBB. Untuk mencapai matlamat ini, kami melaksanakan strategi pemilihan faj in vivo yang mantap yang secara idealnya mengenal pasti peptida yang diangkut oleh salah satu daripada dua laluan berbeza ini.
Kami kini menerangkan kaedah saringan paparan fag in vivo berjujukan dengan persampelan CSF digandingkan dengan penjujukan daya pemprosesan tinggi (HTS) untuk memantau pusingan pemilihan awal dengan kepelbagaian perpustakaan tertinggi. Saringan telah dilakukan pada tikus sedar dengan kanula cisterna besar (CM) yang ditanam secara kekal untuk mengelakkan pencemaran darah. Yang penting, pendekatan ini memilih kedua-dua penargetan otak dan peptida dengan aktiviti pengangkutan merentasi penghalang serebrovaskular. Kami menggunakan fag T7 kerana saiznya yang kecil (~60 nm)10 dan mencadangkan bahawa ia sesuai untuk pengangkutan vesikel yang membolehkan lintasan transselular penghalang endotel dan/atau epitelium-medula. Selepas empat pusingan panning, populasi fag diasingkan menunjukkan pengayaan CSF in vivo yang kuat dan perkaitan mikrovaskular serebrum. Yang penting, kami dapat mengesahkan penemuan kami dengan menunjukkan bahawa peptida calon terbaik yang diutamakan dan disintesis secara kimia mampu mengangkut kargo protein ke dalam cecair serebrospinal. Pertama, kesan farmakodinamik SSP telah ditentukan dengan menggabungkan peptida transit utama dengan perencat peptida BACE1. Selain menunjukkan bahawa strategi saringan fungsian in vivo dapat mengenal pasti peptida pengangkutan otak baharu sebagai pembawa kargo protein yang berkesan, kami menjangkakan pendekatan pemilihan fungsian yang serupa juga menjadi penting dalam mengenal pasti laluan pengangkutan otak baharu.
Berdasarkan unit pembentuk plak (PFU), selepas langkah pembungkusan fag, sebuah perpustakaan peptida fag T7 linear 12-mer rawak dengan kepelbagaian kira-kira 109 telah direka bentuk dan dicipta (lihat Bahan dan Kaedah). Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa kami menganalisis perpustakaan ini dengan teliti sebelum panning in vivo. Penguatan PCR sampel perpustakaan fag menggunakan primer yang diubah suai menghasilkan amplikon yang boleh digunakan secara langsung pada HTS (Rajah Tambahan 1a). Disebabkan oleh a) ralat penjujukan HTS11, b) kesan pada kualiti primer (NNK)1-12, dan c) kehadiran fag jenis liar (wt) (sisipan rangka) dalam perpustakaan siap sedia, prosedur penapisan jujukan telah dilaksanakan untuk mengekstrak hanya maklumat jujukan yang disahkan (Rajah Tambahan 1b). Langkah penapis ini terpakai pada semua perpustakaan penjujukan HTS. Bagi perpustakaan standard, sejumlah 233,868 bacaan telah diperoleh, yang mana 39% lulus kriteria penapis dan digunakan untuk analisis perpustakaan dan pemilihan untuk pusingan berikutnya (Rajah Tambahan 1c–e). Bacaan tersebut kebanyakannya gandaan 3 pasangan bes panjangnya dengan puncak pada 36 nukleotida (Rajah Tambahan 1c), mengesahkan reka bentuk perpustakaan (NNK) 1-12. Terutamanya, kira-kira 11% daripada ahli perpustakaan mengandungi sisipan PAGISRELVDKL tulang belakang jenis liar (wt) 12 dimensi, dan hampir separuh daripada jujukan (49%) mengandungi sisipan atau penghapusan. HTS perpustakaan perpustakaan mengesahkan kepelbagaian peptida yang tinggi dalam perpustakaan: lebih daripada 81% jujukan peptida hanya ditemui sekali dan hanya 1.5% berlaku dalam ≥4 salinan (Rajah Tambahan 2a). Frekuensi asid amino (aa) pada semua 12 kedudukan dalam repertoir berkorelasi baik dengan frekuensi yang dijangkakan untuk bilangan kodon yang dihasilkan oleh repertoir NKK yang merosot (Rajah Tambahan 2b). Frekuensi residu aa yang diperhatikan yang dikodkan oleh sisipan ini berkorelasi baik dengan frekuensi yang dikira (r = 0.893) (Rajah Tambahan 2c). Penyediaan perpustakaan fag untuk suntikan merangkumi langkah-langkah amplifikasi dan penyingkiran endotoksin. Ini sebelum ini telah ditunjukkan berpotensi mengurangkan kepelbagaian perpustakaan fag12,13. Oleh itu, kami menjujukan perpustakaan fag yang diperkuat plat yang telah menjalani penyingkiran endotoksin dan membandingkannya dengan perpustakaan asal untuk menganggarkan frekuensi AA. Korelasi yang kuat (r = 0.995) diperhatikan antara kolam asal dan kolam yang diperkuat dan ditulenkan (Rajah Tambahan 2d), menunjukkan bahawa persaingan antara klon yang diperkuat pada plat menggunakan fag T7 tidak menyebabkan bias utama. Perbandingan ini adalah berdasarkan frekuensi motif tripeptida dalam setiap perpustakaan, kerana kepelbagaian perpustakaan (~109) tidak dapat ditangkap sepenuhnya walaupun dengan HTS. Analisis frekuensi aa pada setiap kedudukan mendedahkan bias bergantung kedudukan yang kecil dalam tiga kedudukan terakhir repertoir yang dimasukkan (Rajah Tambahan 2e). Kesimpulannya, kami menyimpulkan bahawa kualiti dan kepelbagaian perpustakaan boleh diterima dan hanya perubahan kecil dalam kepelbagaian diperhatikan disebabkan oleh amplifikasi dan penyediaan perpustakaan fag antara beberapa pusingan pemilihan.
Pensampelan cecair serebrospinal bersiri boleh dilakukan dengan menanamkan kanula secara pembedahan ke dalam CM tikus sedar untuk memudahkan pengenalpastian fag T7 yang disuntik secara intravena (iv) melalui BBB dan/atau BCSFB (Rajah 1a-b). Kami menggunakan dua lengan pemilihan bebas (lengan A dan B) dalam tiga pusingan pertama pemilihan in vivo (Rajah 1c). Kami secara beransur-ansur meningkatkan ketegasan pemilihan dengan mengurangkan jumlah keseluruhan fag yang diperkenalkan dalam tiga pusingan pertama pemilihan. Untuk pusingan keempat panning, kami menggabungkan sampel daripada cabang A dan B dan melakukan tiga pemilihan bebas tambahan. Untuk mengkaji sifat in vivo zarah fag T7 dalam model ini, fag jenis liar (sisipan induk PAGISRELVDKL) disuntik ke dalam tikus melalui vena ekor. Pemulihan fag daripada cecair serebrospinal dan darah pada titik masa yang berbeza menunjukkan bahawa fag ikosahedral T7 yang agak kecil mempunyai fasa pelepasan awal yang cepat daripada petak darah (Rajah Tambahan 3). Berdasarkan titer yang diberikan dan isipadu darah tikus, kami mengira bahawa hanya kira-kira 1% berat faj daripada dos yang diberikan dikesan dalam darah 10 minit selepas suntikan intravena. Selepas penurunan pesat awal ini, pelepasan primer yang lebih perlahan diukur dengan separuh hayat selama 27.7 minit. Yang penting, hanya sedikit faj yang diambil dari petak CSF, menunjukkan latar belakang yang rendah untuk penghijrahan faj jenis liar ke dalam petak CSF (Rajah Tambahan 3). Secara purata, hanya kira-kira 1 x 10-3% titer faj T7 dalam darah dan 4 x 10-8% faj yang diinfusikan pada mulanya dikesan dalam cecair serebrospinal sepanjang tempoh persampelan (0-250 min). Terutamanya, separuh hayat (25.7 min) faj jenis liar dalam cecair serebrospinal adalah serupa dengan yang diperhatikan dalam darah. Data ini menunjukkan bahawa penghalang yang memisahkan petak CSF daripada darah adalah utuh dalam tikus yang dikanulasi CM, membolehkan pemilihan perpustakaan phage secara in vivo untuk mengenal pasti klon yang mudah diangkut dari darah ke dalam petak CSF.
(a) Menyediakan kaedah untuk pensampelan semula cecair serebrospinal (CSF) daripada kolam yang besar. (b) Gambar rajah yang menunjukkan lokasi selular penghalang sistem saraf pusat (CNS) dan strategi pemilihan yang digunakan untuk mengenal pasti peptida yang melintasi penghalang darah-otak (BBB) ​​dan penghalang darah-otak. (c) Carta alir saringan paparan fag in vivo. Dalam setiap pusingan pemilihan, fag (pengecam haiwan di dalam anak panah) disuntik secara intravena. Dua cabang alternatif bebas (A, B) disimpan secara berasingan sehingga pusingan pemilihan ke-4. Untuk pusingan pemilihan 3 dan 4, setiap klon fag yang diekstrak daripada CSF telah dijujukan secara manual. (d) Kinetik fag yang diasingkan daripada darah (bulatan merah) dan cecair serebrospinal (segi tiga hijau) semasa pusingan pemilihan pertama dalam dua tikus yang dikanulasi selepas suntikan intravena perpustakaan peptida T7 (2 x 1012 fag/haiwan). Kuadrat biru menunjukkan purata kepekatan awal faj dalam darah, dikira daripada jumlah faj yang disuntik, dengan mengambil kira jumlah isipadu darah. Kuadrat hitam menunjukkan titik persilangan garis y yang diekstrapolasi daripada kepekatan faj darah. (e,f) Tunjukkan frekuensi relatif dan taburan semua motif tripeptida bertindih yang mungkin terdapat dalam peptida. Bilangan motif yang terdapat dalam 1000 bacaan ditunjukkan. Secara ketara (p < 0.001) motif yang diperkaya ditanda dengan titik merah. (e) Plot serakan korelasi yang membandingkan frekuensi relatif motif tripeptida perpustakaan yang disuntik dengan faj yang berasal dari darah daripada haiwan #1.1 dan #1.2. (f) Plot serakan korelasi yang membandingkan frekuensi relatif motif tripeptida faj haiwan #1.1 dan #1.2 yang diasingkan dalam darah dan cecair serebrospinal. (g, h) Perwakilan ID jujukan faj yang diperkaya dalam darah (g) berbanding perpustakaan yang disuntik dan faj yang diperkaya dalam CSF (h) berbanding darah selepas pusingan pemilihan in vivo dalam kedua-dua haiwan. Saiz kod satu huruf menunjukkan kekerapan asid amino tersebut berlaku pada kedudukan tersebut. Hijau = polar, ungu = neutral, biru = bes, merah = berasid dan hitam = asid amino hidrofobik. Rajah 1a, b direka bentuk dan dihasilkan oleh Eduard Urich.
Kami menyuntik pustaka peptida faj ke dalam dua tikus instrumen CM (klad A dan B) dan mengasingkan faj daripada cecair serebrospinal dan darah (Rajah 1d). Pelepasan pesat awal pustaka adalah kurang ketara berbanding faj jenis liar. Purata separuh hayat pustaka yang disuntik dalam kedua-dua haiwan adalah 24.8 minit dalam darah, sama dengan faj jenis liar, dan 38.5 minit dalam CSF. Sampel faj darah dan cecair serebrospinal daripada setiap haiwan telah menjalani HTS dan semua peptida yang dikenal pasti telah dianalisis untuk kehadiran motif tripeptida pendek. Motif tripeptida dipilih kerana ia menyediakan asas minimum untuk pembentukan struktur dan interaksi peptida-protein14,15. Kami mendapati korelasi yang baik dalam taburan motif antara pustaka faj yang disuntik dan klon yang diekstrak daripada darah kedua-dua haiwan (Rajah 1e). Data menunjukkan bahawa komposisi pustaka hanya sedikit diperkaya dalam petak darah. Frekuensi asid amino dan urutan konsensus telah dianalisis selanjutnya pada setiap kedudukan menggunakan adaptasi perisian Weblogo16. Menariknya, kami mendapati pengayaan yang kuat dalam residu glisin darah (Rajah 1g). Apabila darah dibandingkan dengan klon yang dipilih daripada CSF, pemilihan yang kuat dan beberapa penyahpemilihan motif diperhatikan (Rajah 1f), dan asid amino tertentu secara istimewa hadir pada kedudukan yang telah ditentukan dalam 12 anggota (Rajah 1h). Terutamanya, haiwan individu berbeza dengan ketara dalam cecair serebrospinal, manakala pengayaan glisin darah diperhatikan dalam kedua-dua haiwan (Rajah Tambahan 4a–j). Selepas penapisan data jujukan yang ketat dalam cecair serebrospinal haiwan #1.1 dan #1.2, sejumlah 964 dan 420 peptida 12-mer unik diperoleh (Rajah Tambahan 1d–e). Klon faj yang diasingkan telah dikuatkan dan tertakluk kepada pusingan kedua pemilihan in vivo. Faj yang diekstrak daripada pusingan kedua pemilihan telah tertakluk kepada HTS dalam setiap haiwan dan semua peptida yang dikenal pasti telah digunakan sebagai input kepada program pengecaman motif untuk menganalisis kejadian motif tripeptida (Rajah 2a, b, ef). Berbanding dengan kitaran pertama fag yang diperoleh daripada CSF, kami memerhatikan pemilihan dan penyahpemilihan selanjutnya bagi banyak motif dalam CSF dalam cabang A dan B (Rajah 2). Algoritma pengenalpastian rangkaian telah digunakan untuk menentukan sama ada ia mewakili corak jujukan yang konsisten. Persamaan yang jelas diperhatikan antara jujukan 12 dimensi yang diperoleh semula oleh CSF dalam klad alternatif A (Rajah 2c, d) dan klad B (Rajah 2g, h). Analisis terkumpul dalam setiap cabang mendedahkan profil pemilihan yang berbeza untuk peptida 12-mer (Rajah Tambahan 5c, d) dan peningkatan dalam nisbah titer CSF/darah dari semasa ke semasa untuk klon terkumpul selepas pusingan pemilihan kedua berbanding pusingan pemilihan pertama (Rajah Tambahan 5e).
Pengayaan motif dan peptida dalam cecair serebrospinal melalui dua pusingan berturut-turut pemilihan paparan phage berfungsi in vivo.
Semua fag cecair serebrospinal yang diperoleh daripada pusingan pertama setiap haiwan (haiwan #1.1 dan #1.2) telah dikumpulkan, dikuatkan, dijujukan HT dan disuntik semula bersama (2 x 1010 fag/haiwan) 2 tikus yang dikanulasi SM (#1.1 → #). 2.1 dan 2.2, 1.2 → 2.3 dan 2.4). (a,b,e,f) Plot serakan korelasi yang membandingkan frekuensi relatif motif tripeptida bagi semua fag yang diperoleh daripada CSF dalam pusingan pemilihan pertama dan kedua. Kekerapan relatif dan taburan motif yang mewakili semua tripeptida bertindih yang mungkin terdapat dalam peptida dalam kedua-dua orientasi. Bilangan motif yang terdapat dalam 1000 bacaan ditunjukkan. Motif yang dipilih atau dikecualikan secara signifikan (p < 0.001) dalam salah satu perpustakaan yang dibandingkan diserlahkan dengan titik merah. (c, d, g, h) Perwakilan logo jujukan bagi semua jujukan panjang 12 asid amino yang kaya dengan CSF berdasarkan pusingan 2 dan 1 pemilihan in vivo. Saiz kod satu huruf menunjukkan kekerapan asid amino tersebut berlaku pada kedudukan tersebut. Untuk mewakili logo, kekerapan jujukan CSF yang diekstrak daripada haiwan individu antara dua pusingan pemilihan dibandingkan dan jujukan yang diperkaya dalam pusingan kedua ditunjukkan: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 dan (h) #1.2–#2.4. Asid amino yang paling diperkaya pada kedudukan tertentu dalam (c, d) haiwan no. 2.1 dan no. 2.2 atau (g, h) dalam haiwan no. 2.3 dan no. 2.4 ditunjukkan dalam warna. Hijau = polar, ungu = neutral, biru = bes, merah = berasid dan hitam = asid amino hidrofobik.
Selepas pusingan pemilihan ketiga, kami mengenal pasti 124 jujukan peptida unik (#3.1 dan #3.2) daripada 332 klon fag yang dibentuk semula oleh CSF yang diasingkan daripada dua haiwan (Rajah Tambahan 6a). Jujukan LGSVS (18.7%) mempunyai perkadaran relatif tertinggi, diikuti oleh sisipan jenis liar PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), dan SARGSWREIVSLS (2.2%). Dalam pusingan keempat terakhir, kami mengumpulkan dua cabang yang dipilih secara bebas daripada tiga haiwan berasingan (Rajah 1c). Daripada 925 klon fag yang dijujukan yang diperoleh daripada CSF, dalam pusingan keempat kami menemui 64 jujukan peptida unik (Rajah Tambahan 6b), antaranya perkadaran relatif fag jenis liar menurun kepada 0.8%. Klon CSF yang paling biasa dalam pusingan keempat ialah LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) dan RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Julat panjang peptida yang dipilih adalah disebabkan oleh penyisipan/pemadaman nukleotida atau kodon henti pramatang dalam primer perpustakaan apabila menggunakan kodon degenerasi untuk reka bentuk perpustakaan NNK. Kodon henti pramatang menghasilkan peptida yang lebih pendek dan dipilih kerana ia mengandungi motif aa yang sesuai. Peptida yang lebih panjang mungkin terhasil daripada penyisipan/pemadaman dalam primer perpustakaan sintetik. Ini meletakkan kodon henti yang direka bentuk di luar bingkai dan membacanya sehingga kodon henti baharu muncul di hilir. Secara amnya, kami mengira faktor pengayaan untuk keempat-empat pusingan pemilihan dengan membandingkan data input dengan data output sampel. Untuk pusingan pertama penyaringan, kami menggunakan titer fag jenis liar sebagai rujukan latar belakang yang tidak spesifik. Menariknya, pemilihan fag negatif adalah sangat kuat dalam kitaran CSF pertama, tetapi tidak dalam darah (Rajah 3a), yang mungkin disebabkan oleh kebarangkalian rendah penyebaran pasif kebanyakan ahli perpustakaan peptida ke dalam petak CSF atau fag relatif cenderung dikekalkan atau dikeluarkan dari aliran darah dengan lebih cekap berbanding bakteriofag. Walau bagaimanapun, dalam pusingan kedua panning, pemilihan fag yang kuat dalam CSF diperhatikan dalam kedua-dua klad, menunjukkan bahawa pusingan sebelumnya diperkaya dalam fag yang memaparkan peptida yang menggalakkan pengambilan CSF (Rajah 3a). Sekali lagi, tanpa pengayaan darah yang ketara. Juga dalam pusingan ketiga dan keempat, klon fag diperkaya dengan ketara dalam CSF. Membandingkan frekuensi relatif setiap jujukan peptida unik antara dua pusingan pemilihan terakhir, kami mendapati bahawa jujukan lebih diperkaya dalam pusingan pemilihan keempat (Rajah 3b). Sebanyak 931 motif tripeptida diekstrak daripada semua 64 jujukan peptida unik menggunakan kedua-dua orientasi peptida. Motif yang paling diperkaya dalam pusingan keempat telah diperiksa dengan lebih teliti untuk profil pengayaannya merentasi semua pusingan berbanding dengan pustaka yang disuntik (potongan: pengayaan 10%) (Rajah Tambahan 6c). Corak pemilihan umum menunjukkan bahawa kebanyakan motif yang dikaji telah diperkaya dalam semua pusingan sebelumnya bagi kedua-dua cabang pemilihan. Walau bagaimanapun, beberapa motif (cth. SGL, VSG, LGS GSV) kebanyakannya daripada klad alternatif A, manakala yang lain (cth. FGW, RTN, WGF, NTR) telah diperkaya dalam klad alternatif B.
Pengesahan pengangkutan CSF bagi peptida yang dipamerkan oleh phage yang diperkaya CSF dan peptida pemimpin biotinilasi yang terkonjugasi dengan muatan streptavidin.
(a) Nisbah pengayaan yang dikira dalam keempat-empat pusingan (R1-R4) berdasarkan titer fag (PFU) yang disuntik (input = I) dan titer fag CSF yang ditentukan (output = O). Faktor pengayaan untuk tiga pusingan terakhir (R2-R4) dikira dengan perbandingan dengan pusingan sebelumnya dan pusingan pertama (R1) dengan data berat. Bar terbuka ialah cecair serebrospinal, bar berlorek ialah plasma. (***p<0.001, berdasarkan ujian-t Pelajar). (b) Senarai peptida fag yang paling banyak, disenaraikan mengikut perkadaran relatifnya kepada semua fag yang dikumpul dalam CSF selepas pusingan 4 pemilihan. Enam klon fag yang paling biasa diserlahkan dalam warna, dinomborkan dan faktor pengayaannya antara pusingan 3 dan 4 pemilihan (sisipan). (c,d) Enam klon fag yang paling diperkaya, perpustakaan peptida fag kosong dan fag induk daripada pusingan 4 dianalisis secara individu dalam model persampelan CSF. Sampel CSF dan darah dikumpulkan pada titik masa yang ditunjukkan. (c) Jumlah yang sama bagi 6 klon fag calon (2 x 1010 fag/haiwan), fag kosong (#1779) (2 x 1010 fag/haiwan) dan pustaka peptida fag stok (2 x 1012 fag/haiwan). Suntikan sekurang-kurangnya 3 CM diberikan kepada haiwan yang dikanulasi secara berasingan melalui vena ekor. Farmakokinetik CSF bagi setiap klon fag dan pustaka peptida fag yang disuntik dari semasa ke semasa ditunjukkan. (d) menunjukkan nisbah CSF/darah purata untuk semua fag/mL yang dipulihkan sepanjang masa pensampelan. (e) Empat peptida pemimpin sintetik dan satu kawalan teracak dikaitkan dengan biotin kepada streptavidin melalui N-terminus mereka (paparan tetramer) diikuti dengan suntikan (vein ekor iv, 10 mg streptavidin/kg). Sekurang-kurangnya tiga tikus yang diintubasi (N = 3). ). Sampel CSF dikumpulkan pada titik masa yang ditunjukkan dan kepekatan streptavidin diukur dengan CSF anti-streptavidin ELISA (nd = tidak dikesan). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, berdasarkan ujian ANOVA). (f) Perbandingan urutan asid amino klon peptida fag yang paling diperkaya #2002 (ungu) dengan klon peptida fag terpilih yang lain daripada pusingan pemilihan ke-4. Serpihan asid amino yang sama dan serupa dikodkan warna.
Daripada semua fag yang diperkaya dalam pusingan keempat (Rajah 3b), enam klon calon telah dipilih untuk analisis individu selanjutnya dalam model persampelan CSF. Jumlah yang sama bagi enam pustaka peptida fag, fag kosong (tiada sisipan) dan profag calon telah disuntik ke dalam tiga haiwan CM yang dikanulasi, dan farmakokinetik telah ditentukan dalam ujian CSF (Rajah 3c) dan darah (Rajah Tambahan 7). Semua klon fag yang diuji menyasarkan petak CSF pada tahap 10-1000 kali lebih tinggi daripada fag kawalan kosong (#1779). Contohnya, klon #2020 dan #2077 mempunyai titer CSF kira-kira 1000 kali lebih tinggi daripada fag kawalan. Profil farmakokinetik setiap peptida yang dipilih adalah berbeza, tetapi kesemuanya mempunyai keupayaan homing CSF yang tinggi. Kami memerhatikan penurunan yang berterusan dari semasa ke semasa untuk klon #1903 dan #2011, manakala untuk klon #2077, #2002 dan #2009, peningkatan semasa 10 minit pertama mungkin menunjukkan pengangkutan aktif tetapi perlu disahkan. Klon #2020, #2002, dan #2077 stabil pada tahap yang tinggi, manakala kepekatan CSF klon #2009 perlahan-lahan menurun selepas peningkatan awal. Kami kemudian membandingkan frekuensi relatif setiap calon CSF dengan kepekatan darahnya (Rajah 3d). Korelasi titer min setiap calon CSF dengan titer darahnya pada semua masa pensampelan menunjukkan bahawa tiga daripada enam calon diperkaya dengan ketara dalam CSF darah. Menariknya, klon #2077 menunjukkan kestabilan darah yang lebih tinggi (Rajah Tambahan 7). Untuk mengesahkan bahawa peptida itu sendiri mampu mengangkut kargo secara aktif selain zarah faj ke dalam petak CSF, kami mensintesis empat peptida pendahulu yang terbitan dengan biotin di N-terminus di mana peptida melekat pada zarah faj. Peptida biotinilasi (no. 2002, 2009, 2020 dan 2077) telah dikonjugasikan dengan streptavidin (SA) untuk mendapatkan bentuk multimerik yang agak meniru geometri fag. Format ini juga membolehkan kami mengukur pendedahan SA dalam darah dan cecair serebrospinal sebagai peptida protein pengangkut kargo. Yang penting, data fag selalunya boleh dihasilkan semula apabila peptida sintetik diberikan dalam format konjugasi SA ini (Rajah 3e). Peptida yang dihancurkan mempunyai pendedahan awal yang kurang dan pelepasan CSF yang lebih cepat dengan tahap yang tidak dapat dikesan dalam masa 48 jam. Untuk mendapatkan gambaran tentang laluan penghantaran klon fag peptida ini ke dalam ruang CSF, kami menganalisis penyetempatan hentaman peptida fag individu menggunakan imunohistokimia (IHC) untuk mengesan zarah fag secara langsung 1 jam selepas suntikan intravena secara in vivo. Terutamanya, klon #2002, #2077, dan #2009 dapat dikesan melalui pewarnaan yang kuat dalam kapilari otak, manakala faj kawalan (#1779) dan klon #2020 tidak dikesan (Rajah Tambahan 8). Ini menunjukkan bahawa peptida ini menyumbang kepada kesan pada otak dengan tepat melalui lintasan BBB. Analisis terperinci selanjutnya diperlukan untuk menguji hipotesis ini, kerana laluan BSCFB juga mungkin terlibat. Apabila membandingkan urutan asid amino klon yang paling diperkaya (#2002) dengan peptida terpilih yang lain, didapati bahawa sebahagian daripadanya mempunyai sambungan asid amino yang serupa, yang mungkin menunjukkan mekanisme pengangkutan yang serupa (Rajah 3f).
Disebabkan profil plasmanya yang unik dan peningkatan ketara dalam CSF dari semasa ke semasa, klon paparan phage #2077 telah diterokai dengan lebih lanjut dalam tempoh 48 jam yang lebih lama dan dapat menghasilkan semula peningkatan pesat dalam CSF yang diperhatikan berkaitan dengan tahap SA yang berterusan (Rajah 4a). Berkenaan dengan klon phage lain yang dikenal pasti, #2077 diwarnakan dengan kuat untuk kapilari otak dan menunjukkan kolokalisasi yang ketara dengan lektin penanda kapilari apabila dilihat pada resolusi yang lebih tinggi dan mungkin beberapa pewarnaan dalam ruang parenkim (Rajah 4b). Untuk menyiasat sama ada kesan farmakologi yang dimediasi peptida boleh diperolehi dalam SSP, kami menjalankan eksperimen di mana versi biotinilasi i) peptida transit #2077 dan ii) peptida perencat BACE1 dicampurkan dengan SA pada dua nisbah yang berbeza. Untuk satu kombinasi, kami hanya menggunakan perencat peptida BACE1 dan untuk yang satu lagi, kami menggunakan nisbah 1:3 perencat peptida BACE1 kepada peptida #2077. Kedua-dua sampel diberikan secara intravena dan tahap beta-amiloid peptida 40 (Abeta40) dalam darah dan cecair serebrospinal diukur dari semasa ke semasa. Abeta40 diukur dalam CSF kerana ia mencerminkan perencatan BACE1 dalam parenkim otak. Seperti yang dijangkakan, kedua-dua kompleks mengurangkan tahap darah Abeta40 dengan ketara (Rajah 4c, d). Walau bagaimanapun, hanya sampel yang mengandungi campuran peptida no. 2077 dan perencat peptida BACE1 yang terkonjugasi dengan SA menyebabkan penurunan ketara dalam Abeta40 dalam cecair serebrospinal (Rajah 4c). Data menunjukkan bahawa peptida no. 2077 mampu mengangkut protein SA 60 kDa ke dalam SSP dan juga mendorong kesan farmakologi dengan perencat terkonjugasi SA bagi peptida BACE1.
(a) Suntikan klonal (2 × 10 fag/haiwan) fag T7 menunjukkan profil farmakokinetik jangka panjang peptida CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) dan fag kawalan yang tidak disuntik (#1779) dalam sekurang-kurangnya tiga tikus yang diintubasi CM. (b) Imej mikroskopik konfokal bagi mikrovaskular kortikal yang mewakili dalam tikus yang disuntik fag (2 × 10 10 fag/haiwan) menunjukkan pewarnaan balas peptida #2077 dan saluran (lektin). Klon fag ini diberikan kepada 3 ekor tikus dan dibenarkan beredar selama 1 jam sebelum perfusi. Otak dipotong dan diwarnakan dengan antibodi berlabel FITC poliklonal terhadap kapsid fag T7. Sepuluh minit sebelum perfusi dan fiksasi berikutnya, lektin berlabel DyLight594 diberikan secara intravena. Imej pendarfluor menunjukkan pewarnaan lektin (merah) pada bahagian luminal mikrovaskular dan fag (hijau) dalam lumen kapilari dan tisu otak perivaskular. Bar skala sepadan dengan 10 µm. (c, d) Peptida perencatan BACE1 terbiotinilasi sahaja atau digabungkan dengan peptida transit terbiotinilasi #2077 telah digandingkan dengan streptavidin diikuti dengan suntikan intravena sekurang-kurangnya tiga tikus CM yang dikanulasi (10 mg streptavidin/kg). Pengurangan yang dimediasi oleh perencat peptida BACE1 dalam Aβ40 telah diukur oleh Aβ1-40 ELISA dalam darah (merah) dan cecair serebrospinal (oren) pada titik masa yang ditunjukkan. Untuk kejelasan yang lebih baik, garis putus-putus dilukis pada graf pada skala 100%. (c) Peratus pengurangan Aβ40 dalam darah (segi tiga merah) dan cecair serebrospinal (segi tiga oren) pada tikus yang dirawat dengan streptavidin yang terkonjugasi dengan peptida transit #2077 dan peptida perencatan BACE1 dalam nisbah 3:1. (d) Peratus pengurangan Aβ40 dalam darah (bulatan merah) dan cecair serebrospinal (bulatan oren) tikus yang dirawat dengan streptavidin yang digandingkan dengan peptida perencatan BACE1 sahaja. Kepekatan Aβ dalam kawalan ialah 420 pg/ml (sisihan piawai = 101 pg/ml).
Paparan fag telah berjaya digunakan dalam beberapa bidang penyelidikan bioperubatan17. Kaedah ini telah digunakan untuk kajian kepelbagaian vaskular in vivo18,19 serta kajian yang menyasarkan saluran serebrum20,21,22,23,24,25,26. Dalam kajian ini, kami memperluaskan aplikasi kaedah pemilihan ini bukan sahaja kepada pengenalpastian langsung peptida yang menyasarkan saluran serebrum, tetapi juga kepada penemuan calon dengan sifat pengangkutan aktif untuk melintasi penghalang darah-otak. Kami kini menerangkan perkembangan prosedur pemilihan in vivo dalam tikus yang diintubasi CM dan menunjukkan potensinya untuk mengenal pasti peptida dengan sifat homing CSF. Menggunakan fag T7 yang memaparkan perpustakaan peptida rawak 12-mer, kami dapat menunjukkan bahawa fag T7 cukup kecil (diameter kira-kira 60 nm)10 untuk disesuaikan dengan penghalang darah-otak, dengan itu melintasi penghalang darah-otak atau pleksus koroid secara langsung. Kami memerhatikan bahawa penuaian CSF daripada tikus CM yang dikanulasi merupakan kaedah saringan fungsian in vivo yang dikawal dengan baik, dan faj yang diekstrak bukan sahaja terikat pada vaskular tetapi juga berfungsi sebagai pengangkut merentasi penghalang darah-otak. Tambahan pula, dengan mengumpul darah dan menggunakan HTS secara serentak pada CSF dan faj yang berasal dari darah, kami mengesahkan bahawa pilihan CSF kami tidak dipengaruhi oleh pengayaan darah atau kesesuaian untuk pengembangan antara pusingan pemilihan. Walau bagaimanapun, petak darah adalah sebahagian daripada prosedur pemilihan, kerana faj yang mampu mencapai petak CSF mesti hidup dan beredar dalam aliran darah cukup lama untuk memperkayakan diri mereka di otak. Untuk mendapatkan maklumat urutan yang boleh dipercayai daripada data HTS mentah, kami melaksanakan penapis yang disesuaikan dengan ralat penjujukan khusus platform dalam aliran kerja analisis. Dengan memasukkan parameter kinetik ke dalam kaedah saringan, kami mengesahkan farmakokinetik pesat faj T7 jenis liar (t½ ~ 28 min) dalam darah24, 27, 28 dan juga menentukan separuh hayatnya dalam cecair serebrospinal (t½ ~ 26 min) seminit). Walaupun profil farmakokinetik yang serupa dalam darah dan CSF, hanya 0.001% kepekatan darah phage dapat dikesan dalam CSF, menunjukkan mobiliti latar belakang phage T7 jenis liar yang rendah merentasi penghalang darah-otak. Kerja ini mengetengahkan kepentingan pusingan pertama pemilihan apabila menggunakan strategi panning in vivo, terutamanya untuk sistem phage yang cepat dibersihkan daripada peredaran, kerana hanya sedikit klon yang dapat mencapai petak SSP. Oleh itu, dalam pusingan pertama, pengurangan kepelbagaian perpustakaan adalah sangat besar, kerana hanya bilangan klon yang terhad akhirnya dikumpulkan dalam model CSF yang sangat ketat ini. Strategi panning in vivo ini merangkumi beberapa langkah pemilihan seperti pengumpulan aktif dalam petak CSF, kemandirian klon dalam petak darah, dan penyingkiran klon phage T7 yang cepat daripada darah dalam tempoh 10 minit pertama (Rajah 1d dan Rajah Tambahan 4M). Oleh itu, selepas pusingan pertama, klon phage yang berbeza dikenal pasti dalam CSF, walaupun kumpulan awal yang sama digunakan untuk haiwan individu. Ini menunjukkan bahawa pelbagai langkah pemilihan ketat untuk perpustakaan sumber dengan bilangan ahli perpustakaan yang ramai mengakibatkan pengurangan kepelbagaian yang ketara. Oleh itu, peristiwa rawak akan menjadi bahagian penting dalam proses pemilihan awal, yang akan mempengaruhi keputusan dengan ketara. Kemungkinan besar banyak klon dalam perpustakaan asal mempunyai kecenderungan pengayaan CSF yang sangat serupa. Walau bagaimanapun, walaupun di bawah keadaan eksperimen yang sama, keputusan pemilihan mungkin berbeza disebabkan oleh bilangan kecil setiap klon tertentu dalam kumpulan awal.
Motif yang diperkaya dalam CSF berbeza daripada yang terdapat dalam darah. Menariknya, kami perhatikan perubahan pertama ke arah peptida kaya glisin dalam darah haiwan individu. (Rajah 1g, Rajah Tambahan 4e, 4f). Peptida glisin yang mengandungi faj mungkin lebih stabil dan kurang berkemungkinan dikeluarkan daripada peredaran. Walau bagaimanapun, peptida kaya glisin ini tidak dikesan dalam sampel cecair serebrospinal, menunjukkan bahawa perpustakaan yang dikurasi telah melalui dua langkah pemilihan yang berbeza: satu dalam darah dan satu lagi dibenarkan untuk terkumpul dalam cecair serebrospinal. Klon yang diperkaya CSF yang terhasil daripada pusingan pemilihan keempat telah diuji secara meluas. Hampir semua klon yang diuji secara individu disahkan diperkaya dalam CSF berbanding faj kawalan kosong. Satu hentaman peptida (#2077) telah diperiksa dengan lebih terperinci. Ia menunjukkan separuh hayat plasma yang lebih lama berbanding hentaman lain (Rajah 3d dan Rajah Tambahan 7), dan menariknya, peptida ini mengandungi residu sistein di C-terminus. Baru-baru ini telah ditunjukkan bahawa penambahan sistein kepada peptida boleh meningkatkan sifat farmakokinetiknya dengan mengikat albumin 29. Ini pada masa ini tidak diketahui untuk peptida #2077 dan memerlukan kajian lanjut. Sesetengah peptida menunjukkan kebergantungan valens dalam pengayaan CSF (data tidak ditunjukkan), yang mungkin berkaitan dengan geometri permukaan kapsid T7 yang dipaparkan. Sistem T7 yang kami gunakan menunjukkan 5-15 salinan setiap peptida bagi setiap zarah faj. IHC telah dilakukan pada klon faj utama calon yang disuntik secara intravena ke dalam korteks serebrum tikus (Rajah Tambahan 8). Data menunjukkan bahawa sekurang-kurangnya tiga klon (No. 2002, No. 2009 dan No. 2077) berinteraksi dengan BBB. Masih belum dapat ditentukan sama ada interaksi BBB ini mengakibatkan pengumpulan CSF atau pergerakan klon ini terus ke BCSFB. Yang penting, kami menunjukkan bahawa peptida yang dipilih mengekalkan kapasiti pengangkutan CSF mereka apabila disintesis dan terikat pada kargo protein. Pengikatan peptida biotinilasi N-terminal kepada SA pada asasnya mengulangi keputusan yang diperoleh dengan klon fag masing-masing dalam darah dan cecair serebrospinal (Rajah 3e). Akhir sekali, kami menunjukkan bahawa peptida plumbum #2077 mampu menggalakkan tindakan otak perencat peptida biotinilasi BACE1 yang terkonjugasi kepada SA, menyebabkan kesan farmakodinamik yang ketara dalam SSP dengan mengurangkan tahap Abeta40 dalam CSF dengan ketara (Rajah 4). Kami tidak dapat mengenal pasti sebarang homolog dalam pangkalan data dengan melakukan carian homologi jujukan peptida bagi semua kesan. Adalah penting untuk ambil perhatian bahawa saiz pustaka T7 adalah lebih kurang 109, manakala saiz pustaka teori untuk 12-mer ialah 4 x 1015. Oleh itu, kami hanya memilih sebahagian kecil daripada ruang kepelbagaian pustaka peptida 12-mer, yang mungkin bermakna peptida yang lebih dioptimumkan boleh dikenal pasti dengan menilai ruang jujukan bersebelahan bagi kesan yang dikenal pasti ini. Secara hipotesis, salah satu sebab mengapa kami tidak menemui sebarang homolog semula jadi peptida ini mungkin disebabkan oleh penyahpemilihan semasa evolusi untuk mengelakkan kemasukan motif peptida tertentu yang tidak terkawal ke dalam otak.
Secara keseluruhannya, keputusan kami menyediakan asas untuk kerja masa hadapan bagi mengenal pasti dan mencirikan sistem pengangkutan penghalang serebrovaskular secara in vivo dengan lebih terperinci. Persediaan asas kaedah ini adalah berdasarkan strategi pemilihan berfungsi yang bukan sahaja mengenal pasti klon dengan sifat pengikatan vaskular serebrum, tetapi juga merangkumi langkah kritikal di mana klon yang berjaya mempunyai aktiviti intrinsik untuk melintasi halangan biologi secara in vivo ke dalam petak SSP. Ini adalah untuk menjelaskan mekanisme pengangkutan peptida ini dan pilihan mereka untuk mengikat pada mikrovaskular khusus untuk kawasan otak. Ini boleh membawa kepada penemuan laluan baharu untuk pengangkutan BBB dan reseptor. Kami menjangkakan bahawa peptida yang dikenal pasti boleh mengikat secara langsung pada reseptor serebrovaskular atau pada ligan yang beredar yang diangkut melalui BBB atau BCSFB. Vektor peptida dengan aktiviti pengangkutan CSF yang ditemui dalam kajian ini akan disiasat lebih lanjut. Kami sedang menyiasat kekhususan otak peptida ini untuk keupayaan mereka melintasi BBB dan/atau BCSFB. Peptida baharu ini akan menjadi alat yang sangat berharga untuk penemuan berpotensi reseptor atau laluan baharu dan untuk pembangunan platform baharu yang sangat cekap untuk penghantaran makromolekul, seperti biologi, ke otak.
Kanulasi sisterna besar (CM) menggunakan pengubahsuaian kaedah yang diterangkan sebelum ini. Tikus Wistar yang dibius (200-350 g) dipasang pada alat stereotaksik dan hirisan median dibuat di atas kulit kepala yang telah dicukur dan disediakan secara aseptik untuk mendedahkan tengkorak. Gerudi dua lubang di kawasan selempang atas dan pasangkan skru penetap pada lubang tersebut. Lubang tambahan digerudi pada puncak oksipital lateral untuk panduan stereotaktik kanula keluli tahan karat ke dalam CM. Sapukan simen gigi di sekeliling kanula dan pasangkan dengan skru. Selepas pengawetan foto dan pengerasan simen, luka kulit ditutup dengan jahitan supramid 4/0. Penempatan kanula yang betul disahkan oleh kebocoran spontan cecair serebrospinal (CSF). Keluarkan tikus dari alat stereotaksik, terima penjagaan pasca operasi dan pengurusan kesakitan yang sesuai, dan biarkan ia pulih selama sekurang-kurangnya satu minggu sehingga tanda-tanda darah diperhatikan dalam cecair serebrospinal. Tikus Wistar (Crl:WI/Han) diperoleh dari Charles River (Perancis). Semua tikus telah dikekalkan di bawah keadaan bebas patogen tertentu. Semua eksperimen haiwan telah diluluskan oleh Pejabat Veterinar Bandar Basel, Switzerland, dan telah dijalankan mengikut Lesen Haiwan No. 2474 (Penilaian Pengangkutan Otak Aktif dengan Mengukur Tahap Calon Terapeutik dalam Cecair Serebrospinal dan Otak Tikus).
Pastikan tikus sedar dengan perlahan-lahan sambil memegang kanula CM. Keluarkan Datura dari kanula dan kumpulkan 10 µl cecair serebrospinal yang mengalir secara spontan. Memandangkan patensi kanula akhirnya terjejas, hanya sampel cecair serebrospinal yang jernih tanpa bukti pencemaran darah atau perubahan warna dimasukkan dalam kajian ini. Secara selari, kira-kira 10–20 μl darah diambil dari hirisan kecil di hujung ekor ke dalam tiub dengan heparin (Sigma-Aldrich). CSF dan darah dikumpulkan pada pelbagai titik masa selepas suntikan intravena fag T7. Kira-kira 5–10 μl cecair dibuang sebelum setiap sampel CSF dikumpulkan, yang sepadan dengan isipadu mati kateter.
Pustaka dijana menggunakan vektor T7Select 10-3b seperti yang diterangkan dalam manual sistem T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Secara ringkas, sisipan DNA 12-mer rawak telah disintesis dalam format berikut:
Kodon NNK digunakan untuk mengelakkan kodon hentian berganda dan ekspresi berlebihan asid amino dalam sisipan. N ialah nisbah ekuimolar campuran manual bagi setiap nukleotida, dan K ialah nisbah ekuimolar campuran manual bagi nukleotida adenina dan sitosin. Kawasan untai tunggal ditukar kepada DNA untai berganda melalui pengeraman selanjutnya dengan dNTP (Novagen) dan enzim Klenow (New England Biolabs) dalam penimbal Klenow (New England Biolabs) selama 3 jam pada suhu 37°C. Selepas tindak balas, DNA untai berganda diperoleh semula melalui pemendakan EtOH. DNA yang terhasil dicerna dengan enzim sekatan EcoRI dan HindIII (kedua-duanya dari Roche). Sisipan (QIAquick, Qiagen) yang dibelah dan ditulenkan (T4 ligase, New England Biolabs) kemudiannya diligasi dalam bingkai ke dalam vektor T7 yang telah dibelah selepas asid amino 348 daripada gen kapsid 10B. Tindak balas ligasi diinkubasi pada suhu 16°C selama 18 jam sebelum pembungkusan in vitro. Pembungkusan faj secara in vitro telah dilakukan mengikut arahan yang dibekalkan dengan kit pengklonan T7Select 10-3b (Novagen) dan larutan pembungkusan telah dikuatkan sekali untuk lisis menggunakan Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lisat telah disentrifugasi, dititrasi dan dibekukan pada suhu -80° C sebagai larutan stok gliserol.
Penguatan PCR langsung bagi kawasan pembolehubah faj yang dikuatkan dalam sup atau plat menggunakan primer gabungan 454/Roche-amplicon proprietari. Primer gabungan hadapan mengandungi jujukan yang mengapit kawasan pembolehubah (NNK) 12 (khusus templat), Penyesuai Titanium GS FLX A, dan jujukan kekunci pustaka empat asas (TCAG) (Rajah Tambahan 1a):
Primer gabungan terbalik juga mengandungi biotin yang dilekatkan pada manik penangkap dan Penyesuai Titanium GS FLX B yang diperlukan untuk amplifikasi klonal semasa PCR emulsi:
Amplikon kemudiannya menjalani penjujukan piro 454/Roche mengikut protokol Titanium 454 GS-FLX. Untuk penjujukan Sanger manual (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), DNA fag T7 telah diamplifikasi melalui PCR dan dijujukan dengan pasangan primer berikut:
Sisipan daripada plak individu telah menjalani amplifikasi PCR menggunakan Kit Polimerase DNA Permulaan Pantas Roche (mengikut arahan pengilang). Lakukan permulaan panas (10 minit pada 95 °C) dan 35 kitaran rangsangan (50 saat pada 95 °C, 1 minit pada 50 °C, dan 1 minit pada 72 °C).
Faj daripada perpustakaan, faj jenis liar, faj yang diselamatkan daripada CSF dan darah, atau klon individu telah diamplifikasikan dalam Escherichia coli BL5615 dalam sup TB (Sigma Aldrich) atau dalam piring 500 cm2 (Thermo Scientific) selama 4 jam pada suhu 37°C. Faj diekstrak daripada plat dengan membilas plat dengan penimbal Tris-EDTA (Fluka Analytical) atau dengan mengumpul plak dengan hujung pipet steril. Faj diasingkan daripada supernatan kultur atau penimbal pengekstrakan dengan satu pusingan pemendakan polietilena glikol (PEG 8000) (Promega) dan digantung semula dalam penimbal Tris-EDTA.
Faj yang diperkuat telah menjalani 2-3 pusingan penyingkiran endotoksin menggunakan manik penyingkiran endotoksin (Miltenyi Biotec) sebelum suntikan intravena (IV) (500 μl/haiwan). Dalam pusingan pertama, 2×1012 faj telah diperkenalkan; dalam pusingan kedua, 2×1010 faj; dalam pusingan pemilihan ketiga dan keempat, 2×109 faj setiap haiwan. Kandungan faj dalam sampel CSF dan darah yang dikumpul pada titik masa yang ditunjukkan telah ditentukan melalui pengiraan plak mengikut arahan pengilang (manual sistem T7Select). Pemilihan faj dilakukan melalui suntikan intravena pustaka yang telah ditulenkan ke dalam vena ekor atau melalui suntikan semula faj yang diekstrak daripada CSF daripada pusingan pemilihan sebelumnya, dan penuaian berikutnya dilakukan masing-masing pada 10 minit, 30 minit, 60 minit, 90 minit, 120 minit, 180 minit, dan 240 minit bagi sampel CSF dan darah. Sebanyak empat pusingan panning in vivo telah dijalankan di mana dua cabang yang dipilih disimpan dan dianalisis secara berasingan semasa tiga pusingan pertama pemilihan. Semua sisipan fag yang diekstrak daripada CSF daripada dua pusingan pertama pemilihan telah tertakluk kepada pirosequencing 454/Roche, manakala semua klon yang diekstrak daripada CSF daripada dua pusingan terakhir pemilihan telah dijujukan secara manual. Semua fag darah daripada pusingan pertama pemilihan juga tertakluk kepada pirosequencing 454/Roche. Untuk suntikan klon fag, fag yang dipilih telah diamplifikasi dalam E. coli (BL5615) pada plat 500 cm2 pada suhu 37°C selama 4 jam. Klon yang dipilih secara individu dan dijujukan secara manual telah dibiakkan dalam medium TB. Selepas pengekstrakan, penulenan dan penyingkiran endotoksin fag (seperti yang diterangkan di atas), 2×1010 fag/haiwan dalam 300 μl telah disuntik secara intravena ke dalam satu vena ekor.
Prapemprosesan dan penapisan kualitatif data jujukan. Data mentah 454/Roche telah ditukar daripada format peta aliran piawai binari (sff) kepada format boleh baca manusia Pearson (fasta) menggunakan perisian vendor. Pemprosesan selanjutnya jujukan nukleotida telah dilakukan menggunakan program dan skrip C proprietari (pakej perisian yang belum dikeluarkan) seperti yang diterangkan di bawah. Analisis data primer merangkumi prosedur penapisan berbilang peringkat yang ketat. Untuk menapis bacaan yang tidak mengandungi jujukan DNA sisipan 12mer yang sah, bacaan tersebut telah dijajarkan secara berjujukan kepada label permulaan (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), label hentian (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) dan sisipan latar belakang (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) menggunakan ujian Needleman-Wunsch global. penjajaran yang membenarkan sehingga 2 ketidakkonsistenan setiap penjajaran31. Oleh itu, bacaan tanpa tag mula dan henti serta bacaan yang mengandungi sisipan latar belakang, iaitu penjajaran yang melebihi bilangan ketidakpadanan yang dibenarkan, telah dialih keluar daripada pustaka. Bagi bacaan yang tinggal, jujukan DNA N-mer yang bermula dari tanda mula dan berakhir sebelum tanda henti dikeluarkan daripada jujukan bacaan asal dan diproses selanjutnya (selepas ini dirujuk sebagai "sisipan"). Selepas terjemahan sisipan, bahagian selepas kodon henti pertama di hujung 5′ primer dikeluarkan daripada sisipan. Di samping itu, nukleotida yang membawa kepada kodon tidak lengkap pada hujung 3′ primer juga dikeluarkan. Untuk mengecualikan sisipan yang hanya mengandungi jujukan latar belakang, sisipan yang diterjemahkan bermula dengan corak asid amino "PAG" juga dikeluarkan. Peptida dengan panjang pasca-translasi kurang daripada 3 asid amino dikeluarkan daripada pustaka. Akhir sekali, keluarkan lebihan dalam kolam sisipan dan tentukan frekuensi setiap sisipan unik. Keputusan analisis ini termasuk senarai jujukan nukleotida (sisipan) dan frekuensi (bacaan)nya (Rajah Tambahan 1c dan 2).
Sisipan DNA N-mer Kumpulan mengikut persamaan jujukan: Untuk menghapuskan ralat penjujukan khusus 454/Roche (seperti masalah dengan penjujukan sambungan homopolimer) dan mengalih keluar redundansi yang kurang penting, sisipan jujukan DNA N-mer yang ditapis sebelum ini (sisipan) disusun mengikut persamaan. sisipan (sehingga 2 asas tidak sepadan dibenarkan) menggunakan algoritma lelaran yang ditakrifkan seperti berikut: sisipan disusun dahulu mengikut frekuensinya (tertinggi ke terendah), dan jika ia sama, mengikut susunan sekundernya mengikut panjang (terpanjang ke terpendek)). Oleh itu, sisipan yang paling kerap dan terpanjang mentakrifkan "kumpulan" pertama. Frekuensi kumpulan ditetapkan kepada frekuensi utama. Kemudian, setiap sisipan yang tinggal dalam senarai disusun cuba ditambah kepada kumpulan melalui penjajaran Needleman-Wunsch berpasangan. Jika bilangan ketidakpadanan, sisipan atau pemadaman dalam penjajaran tidak melebihi ambang 2, sisipan ditambah kepada kumpulan dan kekerapan kumpulan keseluruhan ditingkatkan mengikut kekerapan sisipan ditambah. Sisipan yang ditambah kepada kumpulan ditanda sebagai digunakan dan dikecualikan daripada pemprosesan selanjutnya. Jika jujukan sisipan tidak dapat ditambah pada kumpulan yang sedia ada, jujukan sisipan digunakan untuk mencipta kumpulan baharu dengan frekuensi sisipan yang sesuai dan ditanda sebagai digunakan. Lelaran berakhir apabila setiap jujukan sisipan telah digunakan untuk membentuk kumpulan baharu atau boleh dimasukkan ke dalam kumpulan yang sedia ada. Lagipun, sisipan berkumpulan yang terdiri daripada nukleotida akhirnya diterjemahkan ke dalam jujukan peptida (perpustakaan peptida). Hasil analisis ini ialah satu set sisipan dan frekuensi sepadannya yang membentuk bilangan bacaan berturut-turut (Rajah Tambahan 2).
Penjanaan Motif: Berdasarkan senarai peptida unik, sebuah perpustakaan telah dicipta yang mengandungi semua corak asid amino yang mungkin (aa) seperti yang ditunjukkan di bawah. Setiap corak yang mungkin dengan panjang 3 telah diekstrak daripada peptida dan corak songsangnya telah ditambah bersama-sama dengan perpustakaan motif biasa yang mengandungi semua corak (tripeptida). Perpustakaan motif yang sangat berulang telah dijujukan dan redundansi dialih keluar. Kemudian, bagi setiap tripeptida dalam perpustakaan motif, kami menyemak kehadirannya dalam perpustakaan menggunakan alat pengiraan. Dalam kes ini, kekerapan peptida yang mengandungi tripeptida motif yang ditemui ditambah dan diberikan kepada motif dalam perpustakaan motif (“bilangan motif”). Hasil penjanaan motif ialah tatasusunan dua dimensi yang mengandungi semua kejadian tripeptida (motif) dan nilai masing-masing, iaitu bilangan bacaan penjujukan yang menghasilkan motif yang sepadan apabila bacaan ditapis, dikumpulkan dan diterjemahkan. Metrik seperti yang diterangkan secara terperinci di atas.
Normalisasi bilangan motif dan plot serakan yang sepadan: Bilangan motif untuk setiap sampel telah dinormalisasi menggunakan
di mana ni ialah bilangan bacaan yang mengandungi topik i. Oleh itu, vi mewakili peratusan kekerapan bacaan (atau peptida) yang mengandungi motif i dalam sampel. Nilai-P untuk bilangan motif yang tidak dinormalisasi dikira menggunakan ujian tepat Fisher. Mengenai korelogram bilangan motif, korelasi Spearman dikira menggunakan bilangan motif yang dinormalisasi dengan R.
Untuk menggambarkan kandungan asid amino pada setiap kedudukan dalam pustaka peptida, logogram web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) telah dicipta. Pertama, kandungan asid amino pada setiap kedudukan peptida 12-mer disimpan dalam matriks 20×12. Kemudian, satu set 1000 peptida yang mengandungi kandungan asid amino relatif yang sama pada setiap kedudukan dijana dalam format jujukan fasta dan disediakan sebagai input kepada logo-web 3, yang menghasilkan perwakilan grafik kandungan asid amino relatif pada setiap kedudukan. untuk pustaka peptida tertentu. Untuk menggambarkan set data berbilang dimensi, peta haba telah dicipta menggunakan alat yang dibangunkan secara dalaman dalam R (biosHeatmap, pakej R yang belum dikeluarkan). Dendrogram yang dibentangkan dalam peta haba dikira menggunakan kaedah pengelompokan hierarki Ward dengan metrik jarak Euclidean. Untuk analisis statistik data pemarkahan motif, nilai P untuk pemarkahan tidak ternormalisasi dikira menggunakan ujian tepat Fisher. Nilai-P untuk set data lain dikira dalam R menggunakan ujian-t Pelajar atau ANOVA.
Klon dan fag terpilih tanpa sisipan telah disuntik secara intravena melalui vena ekor (2×1010 fag/haiwan dalam 300 μl PBS). Sepuluh minit sebelum perfusi dan fiksasi berikutnya, haiwan yang sama telah disuntik secara intravena dengan 100 μl lektin berlabel DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minit selepas suntikan fag, tikus telah diperfusikan melalui jantung dengan 50 ml PBS diikuti oleh 50 ml 4% PFA/PBS. Sampel otak juga telah ditetapkan semalaman dalam 4% PFA/PBS dan direndam dalam 30% sukrosa semalaman pada suhu 4°C. Sampel dibekukan pantas dalam campuran OCT. Analisis imunohistokimia sampel beku telah dilakukan pada suhu bilik pada krioseksi 30 µm yang disekat dengan 1% BSA dan diinkubasi dengan antibodi berlabel FITC poliklonal terhadap faj T7 (Novus NB 600-376A) pada suhu 4 °C. Inkubasi semalaman. Akhir sekali, bahagian-bahagian tersebut dibasuh sebanyak 3 kali dengan PBS dan diperiksa dengan mikroskop laser konfokal (Leica TCS SP5).
Semua peptida dengan ketulenan minimum 98% telah disintesis oleh GenScript USA, dibiotinilasi dan diliofilisasi. Biotin terikat melalui spacer glisin tiga kali ganda tambahan di N-terminus. Periksa semua peptida menggunakan spektrometri jisim.
Streptavidin (Sigma S0677) telah dicampurkan dengan lebihan ekuimolar 5 kali ganda peptida biotinilasi, peptida perencatan BACE1 biotinilasi, atau gabungan (nisbah 3:1) peptida perencatan BACE1 biotinilasi dan peptida perencatan BACE1 dalam 5–10% DMSO/diinkubasi dalam PBS. 1 jam pada suhu bilik sebelum suntikan. Peptida konjugasi streptavidin telah disuntik secara intravena pada dos 10 mg/kg ke dalam salah satu vena ekor tikus dengan rongga serebrum.
Kepekatan kompleks streptavidin-peptida telah dinilai melalui ELISA. Plat mikrotiter Nunc Maxisorp (Sigma) disalut semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi anti-streptavidin tikus 1.5 μg/ml (Thermo, MA1-20011). Selepas menyekat (penimbal menyekat: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) pada suhu bilik selama 2 jam, basuh plat dengan 0.05% Tween-20/PBS (penimbal cuci) selama 3 Saat, sampel CSF dan plasma ditambah ke dalam telaga yang dicairkan dengan penimbal menyekat (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Plat kemudiannya diinkubasi semalaman pada suhu 4°C dengan antibodi pengesanan (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Selepas tiga langkah pencucian, streptavidin dikesan melalui pengeraman dalam larutan substrat TMB (Roche) sehingga 20 minit. Selepas menghentikan perkembangan warna dengan 1M H2SO4, ukur penyerapan pada 450 nm.
Fungsi kompleks perencat streptavidin-peptida-BACE1 telah dinilai oleh ELISA Aβ(1-40) mengikut protokol pengilang (Wako, 294-64701). Secara ringkas, sampel CSF telah dicairkan dalam pelarut piawai (1:23) dan diinkubasi semalaman pada suhu 4°C dalam plat 96-telaga yang disalut dengan antibodi penangkapan BNT77. Selepas lima langkah pencucian, antibodi BA27 terkonjugasi HRP telah ditambah dan diinkubasi selama 2 jam pada suhu 4°C, diikuti dengan lima langkah pencucian. Aβ(1–40) telah dikesan melalui pengeraman dalam larutan TMB selama 30 minit pada suhu bilik. Selepas perkembangan warna dihentikan dengan larutan henti, ukur penyerapan pada 450 nm. Sampel plasma telah menjalani pengekstrakan fasa pepejal sebelum ELISA Aβ(1–40). Plasma telah ditambah kepada 0.2% DEA (Sigma) dalam plat 96-telaga dan diinkubasi pada suhu bilik selama 30 minit. Selepas membasuh plat SPE (Oasis, 186000679) secara berturut-turut dengan air dan 100% metanol, sampel plasma ditambah ke dalam plat SPE dan semua cecair dikeluarkan. Sampel dibasuh (pertama dengan 5% metanol kemudian 30% metanol) dan dielusi dengan 2% NH4OH/90% metanol. Selepas mengeringkan eluat pada suhu 55°C selama 99 minit pada arus N2 malar, sampel dikurangkan dalam pengencer piawai dan Aβ(1–40) diukur seperti yang diterangkan di atas.
Cara memetik artikel ini: Urich, E. et al. Penghantaran kargo ke otak menggunakan peptida transit yang dikenal pasti secara in vivo. sains. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB dan Moos T. Penghantaran ubat makromolekul ke otak menggunakan terapi yang disasarkan. Jurnal Neurokimia 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., dan Martinez-Martinez, P. Penghantaran ubat peptida dan protein merentasi penghalang darah-otak. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Penghalang darah-otak: kesesakan dalam pembangunan ubat otak. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, dan Byrd, A. Prospek untuk penghantaran ubat yang lebih baik dan penargetan ke otak melalui laluan pleksus koroid-CSF. Penyelidikan Farmaseutikal 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Pemodenan biofarmaseutikal dengan kuda Trojan molekul untuk penghantaran otak. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, pengangkutan peptida yang dimediasi reseptor WM merentasi penghalang darah-otak. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Meningkatkan penembusan otak dan keberkesanan antibodi terapeutik menggunakan pengangkut molekul monovalen. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Pengangkutan reseptor transferrin (TfR) menentukan pengambilan varian afiniti antibodi TfR oleh otak. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).