Tapadh leibh airson tadhal air Nature.com. Tha thu a’ cleachdadh dreach den bhrobhsair agad le taic CSS cuibhrichte. Airson an eòlas as fheàrr, tha sinn a’ moladh gun cleachd thu brabhsair ùraichte (no gun cuir thu dheth Modh Co-chòrdalachd ann an Internet Explorer). A bharrachd air an sin, gus dèanamh cinnteach à taic leantainneach, tha sinn a’ sealltainn an làraich gun stoidhlichean agus JavaScript.
A’ taisbeanadh carousel de thrì sleamhnagan aig an aon àm. Cleachd na putanan Roimhe agus Air adhart gus gluasad tro thrì sleamhnagan aig an aon àm, no cleachd na putanan sleamhnag aig a’ cheann thall gus gluasad tro thrì sleamhnagan aig an aon àm.
Tha am bacadh fala-eanchainn agus am bacadh fala-eanchainn a’ cur casg air riochdairean bith-leigheasach bho bhith a’ ruighinn an targaidean anns an t-siostam nearbhach meadhanach, agus mar sin a’ cur bacadh air làimhseachadh èifeachdach ghalaran neurolach. Gus luchd-giùlain eanchainn ùra a lorg in vivo, thug sinn a-steach leabharlann peptide phage T7 agus chruinnich sinn fuil agus lionn cerebrospinal (CSF) ann an sreath a’ cleachdadh modail amar mòr mothachail canàlaichte de radain. Bha clònan phage sònraichte air an neartachadh gu mòr ann an CSF às deidh ceithir cuairtean taghaidh. Nochd deuchainnean air peptides tagraiche fa leth barrachd air 1000-fhillte beairteachadh ann an CSF. Chaidh bith-ghnìomhachd an lìbhrigidh le meadhan peptide don eanchainn a dhearbhadh le lùghdachadh 40% ann an ìre amyloid-β anns an lionn cerebrospinal a’ cleachdadh casg peptide BACE1 ceangailte ris a’ peptide gluasaid ùr a chaidh a chomharrachadh. Tha na toraidhean seo a’ moladh gum faodadh na peptides a chaidh a chomharrachadh le dòighean taghaidh phage in vivo a bhith nan carbadan feumail airson lìbhrigeadh siostamach macromholaciulan don eanchainn le buaidh leigheasach.
Tha rannsachadh leigheas cuimsichte air an t-siostam nearbhach meadhanach (CNS) air a bhith ag amas sa mhòr-chuid air drogaichean agus riochdairean leasaichte a chomharrachadh a tha a’ nochdadh feartan cuimsichte air CNS, le nas lugha oidhirp air na dòighean a lorg a bhios a’ stiùireadh lìbhrigeadh dhrogaichean gnìomhach don eanchainn. Tha seo a’ tòiseachadh ag atharrachadh a-nis leis gu bheil lìbhrigeadh dhrogaichean, gu sònraichte moileciuilean mòra, na phàirt riatanach de leasachadh dhrogaichean neuro-saidheans an latha an-diugh. Tha àrainneachd an t-siostaim nearbhach mheadhanaich air a dhìon gu math leis an t-siostam bacadh cerebrovascular, anns a bheil am bacadh fala-eanchainn (BBB) ​​​​agus am bacadh fala-eanchainn (BCBB)1, ga dhèanamh dùbhlanach drogaichean a lìbhrigeadh don eanchainn1,2. Thathas a’ meas gu bheil cha mhòr a h-uile droga moileciuil mhòr agus còrr air 98% de dhrogaichean moileciuil bheaga air an cuir às don eanchainn3. Sin as coireach gu bheil e glè chudromach siostaman còmhdhail eanchainn ùra a chomharrachadh a bheir seachad lìbhrigeadh èifeachdach agus sònraichte de dhrogaichean leigheasach don CNS4,5. Ach, tha am BBB agus BCSFB cuideachd a’ toirt cothrom air leth airson lìbhrigeadh dhrogaichean leis gu bheil iad a’ dol a-steach do gach structar den eanchainn tro a vasculature farsaing. Mar sin, tha na h-oidhirpean a th’ ann an-dràsta gus dòighean lìbhrigidh neo-ionnsaigheach a chleachdadh don eanchainn stèidhichte sa mhòr-chuid air meacanaig còmhdhail le gabhadair (PMT) a’ cleachdadh an gabhadair BBB6 endogenous. A dh’ aindeoin adhartasan cudromach o chionn ghoirid a’ cleachdadh slighe gabhadair transferrin7,8, tha feum air tuilleadh leasachaidh air siostaman lìbhrigidh ùra le feartan nas fheàrr. Gus seo a dhèanamh, b’ e an t-amas againn peptides a chomharrachadh a bha comasach air còmhdhail CSF a mheadhanachadh, oir dh’ fhaodadh iad ann am prionnsabal a bhith air an cleachdadh gus macromholacilean a lìbhrigeadh don CNS no gus slighean gabhadair ùra fhosgladh. Gu sònraichte, faodaidh gabhadairean agus luchd-giùlain sònraichte an t-siostam cerebrovascular (BBB agus BSCFB) a bhith nan targaidean a dh’ fhaodadh a bhith ann airson lìbhrigeadh gnìomhach agus sònraichte dhrogaichean bith-leigheasach. Tha lionn cerebrospinal (CSF) na thoradh dìomhair den choroid plexus (CS) agus tha e ann an conaltradh dìreach ri lionn eadar-roinneil na h-eanchainn tron ​​​​​​àite subarachnoid agus an àite ventricular4. O chionn ghoirid chaidh a shealltainn gu bheil lionn cerebrospinal subarachnoid a’ sgaoileadh gu mòr a-steach do interstitium na h-eanchainn9. Tha sinn an dòchas faighinn chun àite parenchymal le bhith a’ cleachdadh an t-slighe-in-shruthadh subarachnoid seo no gu dìreach tron ​​​​BBB. Gus seo a choileanadh, chuir sinn an gnìomh ro-innleachd làidir airson taghadh phage in vivo a bhios, gu h-iomchaidh, a’ comharrachadh peptides a thèid a ghiùlan le aon seach aon de na dà shlighe eadar-dhealaichte seo.
Tha sinn a-nis a’ toirt cunntas air dòigh sgrìonaidh taisbeanaidh phage in vivo sreathmhor le samplachadh CSF còmhla ri sreathan àrd-toraidh (HTS) gus sùil a chumail air cuairtean taghaidh tùsail leis an iomadachd leabharlainn as àirde. Chaidh sgrìonadh a dhèanamh air radain mothachail le cannula cisterna mòr (CM) air a chuir a-steach gu maireannach gus truailleadh fala a sheachnadh. Gu cudromach, tha an dòigh-obrach seo a’ taghadh an dà chuid peptides a tha ag amas air an eanchainn agus peptides le gnìomhachd còmhdhail thairis air a’ bhacadh cerebrovascular. Chleachd sinn phages T7 air sgàth am meud beag (~ 60 nm)10 agus mhol sinn gu bheil iad freagarrach airson còmhdhail vesicles a leigeas le dol tarsainn thar-cheallach den bhacadh endothelial agus / no epithelial-medulla. Às deidh ceithir cuairtean de panning, chaidh sluagh phage a sgaradh a’ sealltainn beairteachadh CSF in vivo làidir agus ceangal microvessel cerebral. Gu cudromach, bha sinn comasach air na co-dhùnaidhean againn a dhearbhadh le bhith a’ sealltainn gu bheil na peptides tagraiche as fheàrr agus air an co-chur gu ceimigeach comasach air bathar pròtain a ghiùlan a-steach don lionn cerebrospinal. An toiseach, chaidh buaidhean pharmacodynamic an CNS a stèidheachadh le bhith a’ cothlamadh prìomh peptide gluasaid le bacadh air a’ peptide BACE1. A bharrachd air a bhith a’ sealltainn gum faod ro-innleachdan sgrìonaidh gnìomhach in vivo peptides còmhdhail eanchainn ùra a chomharrachadh mar luchd-giùlain pròtain èifeachdach, tha sinn an dùil gum bi dòighean taghaidh gnìomhach coltach ris cudromach cuideachd ann a bhith a’ comharrachadh slighean còmhdhail eanchainn ùra.
Stèidhichte air aonadan cruthachadh plaic (PFU), às dèidh ceum pacaidh a’ phàige, chaidh leabharlann de pheptidean phàige T7 loidhneach 12-mer air thuaiream le iomadachd de mu 109 a dhealbhadh agus a chruthachadh (faic Stuthan agus Modhan). Tha e cudromach a thoirt fa-near gun do rinn sinn mion-sgrùdadh faiceallach air an leabharlann seo mus deach panadh in vivo a dhèanamh. Chruthaich leudachadh PCR de shampaill leabharlann phàige a’ cleachdadh prìomhairean atharraichte amplicons a bha buntainneach gu dìreach ri HTS (Figear a bharrachd 1a). Air sgàth a) mearachdan sreath HTS11, b) buaidh air càileachd nam prìomhairean (NNK)1-12, agus c) làthaireachd phàige seòrsa fiadhaich (wt) (cuir a-steach cnàimhneach) anns an leabharlann cùl-taic, chaidh modh-obrach sìolaidh sreath a chuir an gnìomh gus dìreach fiosrachadh sreath dearbhte a thoirt a-mach (Figear a bharrachd 1b). Tha na ceumannan sìolaidh seo a’ buntainn ris a h-uile leabharlann sreath HTS. Airson an leabharlann àbhaisteach, fhuaireadh 233,868 leughaidhean gu h-iomlan, agus chaidh 39% dhiubh sin seachad air slatan-tomhais an t-sìolaidh agus chaidh an cleachdadh airson mion-sgrùdadh leabharlainn agus taghadh airson cuairtean às dèidh sin (Figear a bharrachd 1c–e). B’ e iomadan de 3 paidhrichean bonn a bh’ anns na leughaidhean sa mhòr-chuid le fad aig 36 niùclasaig (Figear a bharrachd 1c), a’ dearbhadh dealbhadh na leabharlainn (NNK) 1-12. Gu sònraichte, bha cuir-a-steach cnàimh-droma PAGISRELVDKL seòrsa fiadhaich 12-mheudach (wt) ann an timcheall air 11% de bhuill na leabharlainn, agus bha cuir-a-steach no sguabadh às ann an faisg air leth de na sreathan (49%). Dhearbh HTS leabharlann na leabharlainn an iomadachd àrd de pheaptaidean anns an leabharlann: chaidh còrr air 81% de shreathan peptide a lorg dìreach aon uair agus cha do thachair ach 1.5% ann an ≥4 leth-bhreacan (Figear a bharrachd 2a). Bha tricead amino-aigéid (aa) aig na 12 suidheachadh uile anns an repertoire a’ freagairt gu math ris na triceadan a thathar an dùil airson an àireamh de chòdan a chaidh a chruthachadh leis an repertoire NKK crìonaichte (Figear a bharrachd 2b). Bha tricead a chaidh fhaicinn de fhuigheallan aa air an còdachadh leis na cuir-a-steach sin a’ freagairt gu math ris an tricead obraichte (r = 0.893) (Figear a bharrachd 2c). Tha ullachadh leabharlannan phage airson in-stealladh a’ toirt a-steach ceumannan iomadachaidh agus toirt air falbh endotoxin. Chaidh a shealltainn roimhe seo gu bheil seo comasach air iomadachd leabharlannan phage a lughdachadh12,13. Mar sin, rinn sinn sreath de leabharlann phage air a meudachadh air truinnsear a chaidh endotoxin a thoirt air falbh agus rinn sinn coimeas eadar e agus an leabharlann thùsail gus tricead AA a thomhas. Chaidh co-dhàimh làidir (r = 0.995) fhaicinn eadar an amar tùsail agus an amar leasaichte agus glan (Figear a bharrachd 2d), a’ nochdadh nach do dh’ adhbhraich farpais eadar clònan air an meudachadh air truinnsearan a’ cleachdadh phage T7 claonadh mòr. Tha an coimeas seo stèidhichte air tricead motifan tripeptide anns gach leabharlann, leis nach gabh iomadachd nan leabharlannan (~ 109) a ghlacadh gu h-iomlan eadhon le HTS. Nochd mion-sgrùdadh tricead aa aig gach suidheachadh claonadh beag an urra ri suidheachadh anns na trì suidheachaidhean mu dheireadh den repertoire a chaidh a chuir a-steach (Figear a bharrachd 2e). Mar cho-dhùnadh, cho-dhùin sinn gu robh càileachd agus iomadachd na leabharlainn iomchaidh agus nach deach ach atharrachaidhean beaga ann an iomadachd fhaicinn mar thoradh air iomadachadh agus ullachadh leabharlannan phage eadar grunn chuairtean taghaidh.
Faodar samplachadh sreathach de lionn cerebrospinal a dhèanamh le bhith a’ cur cannula a-steach gu lannsaireachd a-steach do CM radain mothachail gus dèanamh cinnteach gu bheil phage T7 air a stealladh gu intravenous (iv) tron ​​BBB agus/no BCSFB air a chomharrachadh (Figear 1a-b). Chleachd sinn dà ghàirdean taghaidh neo-eisimeileach (gàirdeanan A agus B) anns a’ chiad trì cuairtean de thaghadh in vivo (Figear 1c). Mean air mhean mheudaich sinn dian an taghaidh le bhith a’ lughdachadh na tha de phage air a thoirt a-steach anns a’ chiad trì cuairtean de thaghadh. Airson a’ cheathramh cuairt de panning, chuir sinn sampallan bho mheuran A agus B còmhla agus rinn sinn trì taghaidhean neo-eisimeileach a bharrachd. Gus sgrùdadh a dhèanamh air feartan in vivo mìrean phage T7 san mhodail seo, chaidh phage fiadhaich (prìomh chur-a-steach PAGISRELVDKL) a stealladh a-steach do radain tron ​​vein earbaill. Sheall faighinn air ais phages bho lionn cerebrospinal agus fuil aig diofar amannan gu robh ìre fuasglaidh tùsail luath aig phages icosahedral T7 an ìre mhath beag bhon roinn fala (Figear a bharrachd 3). Stèidhichte air na titers a chaidh a thoirt seachad agus meud fala nan radain, thomhais sinn nach deach ach timcheall air 1% de phage wt. bhon dòs a chaidh a thoirt seachad a lorg san fhuil 10 mionaidean an dèidh in-stealladh intravenous. Às deidh a’ chrìonaidh luath tùsail seo, chaidh prìomh ghlanadh nas slaodaiche a thomhas le leth-bheatha de 27.7 mionaidean. Gu cudromach, cha deach ach glè bheag de phages fhaighinn air ais bhon roinn CSF, a’ nochdadh cùl-raon ìosal airson imrich phage seòrsa fiadhaich a-steach don roinn CSF (Figear a bharrachd 3). Air a’ chuibheasachd, cha deach ach mu 1 x 10-3% titers de phage T7 san fhuil agus 4 x 10-8% de phages a chaidh a thoirt a-steach an toiseach a lorg anns an lionn cerebrospinal thairis air an ùine samplachaidh gu lèir (0-250 min). Gu sònraichte, bha leth-bheatha (25.7 min) de phage seòrsa fiadhaich ann an lionn cerebrospinal coltach ris an fhear a chaidh fhaicinn ann am fuil. Tha an dàta seo a’ sealltainn gu bheil am bacadh a tha a’ sgaradh roinn an CSF bhon fhuil slàn ann an radain le canàlan CM, a’ leigeil le taghadh in vivo de leabharlannan phage gus clònan a chomharrachadh a tha air an giùlan gu furasta bhon fhuil a-steach don roinn CSF.
(a) A’ stèidheachadh dòigh airson ath-shamplachadh lionn cerebrospinal (CSF) bho amar mòr. (b) Diagram a’ sealltainn suidheachadh ceallach cnap-starra an t-siostam nearbhach meadhanach (CNS) agus an ro-innleachd taghaidh a chaidh a chleachdadh gus peptides a chomharrachadh a tha a’ dol tarsainn air a’ chnap-starra fala-eanchainn (BBB) ​​​​agus a’ chnap-starra fala-eanchainn. (c) Cairt-sruthadh sgrìonaidh taisbeanaidh phage in vivo. Anns gach cuairt taghaidh, chaidh phages (comharran-aithneachaidh bheathaichean taobh a-staigh nan saighdean) a stealladh gu intravenous. Tha dà mheur eile neo-eisimeileach (A, B) air an cumail air leth gus an 4mh cuairt taghaidh. Airson cuairtean taghaidh 3 agus 4, chaidh gach clòn phage a chaidh a thoirt a-mach à CSF a shreathachadh le làimh. (d) Cinn-eòlas phage air a sgaradh bho fhuil (cearcallan dearga) agus lionn cerebrospinal (triantan uaine) rè a’ chiad chuairt taghaidh ann an dà radain cannulated às deidh stealladh intravenous den leabharlann peptide T7 (2 x 1012 phages / beathach). Tha ceàrnagan gorma a’ comharrachadh dùmhlachd tùsail cuibheasach phage san fhuil, air a thomhas bhon mheud de phage a chaidh a stealladh, a’ toirt aire don mheud fala iomlan. Tha na ceàrnagan dubha a’ comharrachadh puing trasnaidh na loidhne-y air a ro-mheasadh bho dùmhlachdan phage san fhuil. (e,f) Seall tricead agus sgaoileadh coimeasach nan uile motif tripeptide a dh’ fhaodadh a bhith a’ dol thairis air a chèile a lorgar anns a’ pheptide. Tha an àireamh de motifan a lorgar ann an 1000 leughadh air a shealltainn. Gu cudromach (p < 0.001) tha motifan beairteach air an comharrachadh le dotagan dearga. (e) Plota sgapaidh co-dhàimh a’ dèanamh coimeas eadar tricead coimeasach motif tripeptide na leabharlainn a chaidh a stealladh le phage a chaidh a thoirt à fuil bho bheathaichean #1.1 agus #1.2. (f) Plota sgapaidh co-dhàimh a’ dèanamh coimeas eadar triceadan coimeasach motifan tripeptide phage bheathaichean #1.1 agus #1.2 air an sgaradh bho fhuil agus lionn cerebrospinal. (g, h) Riochdachadh ID Sreath de phage beairteach ann am fuil (g) an aghaidh leabharlannan a chaidh a stealladh agus phage beairteach ann an CSF (h) an aghaidh fuil às deidh cuairt de thaghadh in vivo anns an dà bheathach. Tha meud a’ chòd aon-litir a’ comharrachadh cho tric ‘s a tha an amino-aigéid sin a’ nochdadh aig an t-suidheachadh sin. Uaine = pòlar, purpaidh = neodrach, gorm = bunaiteach, dearg = searbhagach agus dubh = amino-aigéid uisge-phobach. Chaidh Figear 1a, b a dhealbhadh agus a thoirt gu buil le Eduard Urich.
Chuir sinn leabharlann peptide phage a-steach do dhà radain ionnstramaid CM (clades A agus B) agus sgar sinn phage bho lionn cerebrospinal agus fuil (Figear 1d). Bha an glanadh luath tùsail den leabharlann nas lugha follaiseach an taca ris a’ phage seòrsa fiadhaich. B’ e 24.8 mionaidean an leth-bheatha chuibheasach den leabharlann a chaidh a stealladh anns an dà bheathach ann am fuil, coltach ri phage seòrsa fiadhaich, agus 38.5 mionaidean ann an CSF. Chaidh sampallan phage fala agus lionn cerebrospinal bho gach beathach a chur fo HTS agus chaidh na peptides uile a chaidh an comharrachadh a sgrùdadh airson làthaireachd motif tripeptide goirid. Chaidh motifs tripeptide a thaghadh leis gu bheil iad a’ toirt seachad bunait as ìsle airson cruthachadh structar agus eadar-obrachadh peptide-pròtain14,15. Lorg sinn deagh cho-dhàimh ann an sgaoileadh motifs eadar leabharlann phage a chaidh a stealladh agus clònan a chaidh a thoirt a-mach à fuil an dà bheathach (Figear 1e). Tha an dàta a’ nochdadh nach eil ach glè bheag de bheairteas ann an co-dhèanamh na leabharlainn anns an roinn fala. Chaidh tricead amino-aigéid agus sreathan co-aontachd a sgrùdadh tuilleadh aig gach suidheachadh a’ cleachdadh atharrachadh den bhathar-bog Weblogo16. Gu inntinneach, fhuair sinn beairteachadh làidir ann an fuigheall glycine san fhuil (Figear 1g). Nuair a chaidh fuil a choimeas ri clònan a chaidh a thaghadh bho CSF, chaidh taghadh làidir agus beagan dì-thaghadh de mhotaibhean fhaicinn (Figear 1f), agus bha cuid de amino-aigéid an làthair gu roghnach aig suidheachaidhean ro-shuidhichte anns an 12-bhall (Figear 1h). Gu sònraichte, bha eadar-dhealachadh mòr eadar beathaichean fa leth ann an lionn cerebrospinal, ach chaidh beairteachadh glycine san fhuil fhaicinn anns an dà bheathach (Figear a bharrachd 4a–j). Às deidh sìoladh teann dàta sreath ann an lionn cerebrospinal bheathaichean #1.1 agus #1.2, fhuaireadh 964 agus 420 peptides 12-mer sònraichte san iomlan (Figear a bharrachd 1d–e). Chaidh na clònan phage iomallach a mheudachadh agus an cur fo dhàrna cuairt de thaghadh in vivo. Chaidh phage a chaidh a thoirt a-mach às an dàrna cuairt de thaghadh a chur fo HTS anns gach beathach agus chaidh na peptides uile a chaidh an comharrachadh a chleachdadh mar chur-a-steach do phrògram aithneachaidh motif gus sgrùdadh a dhèanamh air tachairt motifs tripeptide (Figear 2a, b, ef). An coimeas ris a’ chiad chearcall den phage a chaidh fhaighinn air ais bho CSF, chunnaic sinn tuilleadh taghaidh agus dì-thaghaidh de dh’ iomadh motif ann an CSF ann am meuran A agus B (Figear 2). Chaidh algairim aithneachaidh lìonra a chur an sàs gus faighinn a-mach an robh iad a’ riochdachadh diofar phàtranan de shreath cunbhalach. Chaidh coltas soilleir fhaicinn eadar na sreathan 12-mheudach a fhuair CSF air ais ann an clade eile A (Figear 2c, d) agus clade B (Figear 2g, h). Nochd an anailis cruinnichte anns gach meur diofar phròifilean taghaidh airson peptides 12-mer (Figear a bharrachd 5c, d) agus àrdachadh ann an co-mheas CSF / titer fala thar ùine airson clònan cruinnichte às deidh an dàrna cuairt de thaghadh an taca ris a’ chiad chuairt de thaghadh (Figear a bharrachd 5e).
Beairteachadh motifan agus peptidean ann an lionn cerebrospinal le dà chuairt leantainneach de thaghadh taisbeanaidh phage gnìomhach in vivo.
Chaidh a h-uile fage lionn cerebrospinal a chaidh fhaighinn air ais bhon chiad chuairt de gach beathach (beathaichean #1.1 agus #1.2) a chruinneachadh, a mheudachadh, an sreath HT a sgrùdadh agus an ath-stealladh còmhla (2 x 1010 fage / beathach) 2 radain le canàl SM (#1.1 → #). 2.1 agus 2.2, 1.2 → 2.3 agus 2.4). (a, b, e, f) Plotaichean sgapte co-dhàimh a’ dèanamh coimeas eadar tricead coimeasach motifan tripeptide de na fages uile a thàinig bho CSF ​​anns a’ chiad agus an dàrna cuairt taghaidh. Tricead coimeasach agus sgaoileadh motifan a’ riochdachadh a h-uile tripeptide a tha a’ dol thairis air a chèile a lorgar ann am peptides anns an dà stiùireadh. Tha an àireamh de motifan a lorgar ann an 1000 leughadh air a shealltainn. Tha motifan a chaidh a thaghadh no a dhùnadh a-mach gu mòr (p < 0.001) ann an aon de na leabharlannan a chaidh a choimeas air an comharrachadh le dotagan dearga. (c, d, g, h) Riochdachadh suaicheantas sreath de na sreathan uile le 12 amino-aigéid a dh'fhaid, beairteach ann an CSF, stèidhichte air cuairtean 2 agus 1 de thaghadh in vivo. Tha meud a’ chòd aon-litir a’ sealltainn dè cho tric ‘s a tha an amino-aigéad sin a’ nochdadh aig an t-suidheachadh sin. Gus an suaicheantas a riochdachadh, thathar a’ dèanamh coimeas eadar tricead sreathan CSF a chaidh a thoirt a-mach à beathaichean fa leth eadar dà chuairt taghaidh agus chithear na sreathan beairteach san dàrna cuairt: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 agus (h) #1.2–#2.4. Tha na amino-aigéid as beairtiche aig suidheachadh sònraichte ann an (c, d) beathaichean àireamh 2.1 agus àireamh 2.2 no (g, h) ann am beathaichean àireamh 2.3 agus àireamh 2.4 air an sealltainn ann an dath. Uaine = pòlar, purpaidh = neodrach, gorm = bunaiteach, dearg = searbhagach agus dubh = amino-aigéid hydrophobic.
Às dèidh an treas cuairt taghaidh, chomharraich sinn 124 sreath peptide sònraichte (#3.1 agus #3.2) bho 332 clòn phage ath-chruthaichte le CSF a chaidh a sgaradh bho dhà bheathach (Figear a bharrachd 6a). B’ e an sreath LGSVS (18.7%) a bha leis a’ chuibhreann coimeasach as àirde, agus an uairsin na cuir-a-steach seòrsa fiadhaich PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), agus SARGSWREIVSLS (2.2%). Anns a’ cheathramh cuairt mu dheireadh, chruinnich sinn dà mheur a chaidh a thaghadh gu neo-eisimeileach bho thrì beathaichean fa leth (Figear 1c). De na 925 clòn phage sreathichte a chaidh fhaighinn air ais bho CSF, anns a’ cheathramh cuairt lorg sinn 64 sreath peptide sònraichte (Figear a bharrachd 6b), agus nam measg thuit an co-roinn coimeasach de phage seòrsa fiadhaich gu 0.8%. B’ e LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) agus RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). Tha raon faid nam peptidean taghte mar thoradh air cuir a-steach/sguabadh às niùclasaid no codonan stad ro-luath ann am prìomaran na leabharlainn nuair a thathar a’ cleachdadh codonan crìonaichte airson dealbhadh leabharlainn NNK. Bidh codonan stad ro-luath a’ gineadh peptidean nas giorra agus tha iad air an taghadh leis gu bheil am motif aa fàbharach annta. Faodaidh peptidean nas fhaide tighinn bho chuir a-steach/sguabadh às ann am prìomaran nan leabharlannan synthetigeach. Bidh seo a’ suidheachadh an codon stad dealbhaichte taobh a-muigh a’ fhrèam agus ga leughadh gus an nochd codon stad ùr sìos an abhainn. San fharsaingeachd, rinn sinn obrachadh a-mach air factaran beairteachaidh airson nan ceithir cuairtean taghaidh le bhith a’ dèanamh coimeas eadar an dàta cuir a-steach agus dàta toraidh an t-sampall. Airson a’ chiad chuairt de sgrìonadh, chleachd sinn titers phage seòrsa fiadhaich mar iomradh cùl-fhiosrachaidh neo-shònraichte. Gu inntinneach, bha taghadh àicheil phage glè làidir anns a’ chiad chearcall CSF, ach chan ann san fhuil (Figear 3a), agus dh’ fhaodadh seo a bhith mar thoradh air cho coltach ‘s a tha e gun tèid a’ mhòr-chuid de bhuill leabharlann nam peptides a sgaoileadh a-steach don roinn CSF no gu bheil phages coimeasach buailteach a bhith air an cumail no air an toirt air falbh bhon t-sruth fala nas èifeachdaiche na bacteriophages. Ach, anns an dàrna cuairt de panning, chaidh taghadh làidir de phages ann an CSF fhaicinn anns an dà chlad, a’ moladh gun robh am cuairt roimhe air a bheairteachadh ann am phages a’ taisbeanadh peptides a bhrosnaicheas gabhail CSF (Figear 3a). A-rithist, gun bheairteachadh fala mòr. Cuideachd anns an treas agus an ceathramh cuairt, bha na clònan phage air an bheairteachadh gu mòr ann an CSF. A’ dèanamh coimeas eadar tricead coimeasach gach sreath peptide sònraichte eadar an dà chuairt mu dheireadh de thaghadh, fhuair sinn a-mach gun robh na sreathan eadhon nas beairtiche anns a’ cheathramh cuairt de thaghadh (Figear 3b). Chaidh 931 motif tripeptide gu h-iomlan a thoirt a-mach às na 64 sreathan peptide sònraichte uile a’ cleachdadh an dà stiùireadh peptide. Chaidh sgrùdadh nas mionaidiche a dhèanamh air na motifan a b’ fheàrr a neartachadh anns a’ cheathramh cuairt airson am pròifilean neartachaidh thar nan cuairtean uile an taca ris an leabharlann a chaidh a stealladh (gearradh dheth: neartachadh 10%) (Figear a bharrachd 6c). Sheall pàtrain taghaidh coitcheann gun deach a’ mhòr-chuid de na motifan a chaidh a sgrùdadh a neartachadh anns na cuairtean roimhe uile den dà mheur taghaidh. Ach, bha cuid de motifan (me SGL, VSG, LGS GSV) sa mhòr-chuid bho chlade eile A, agus bha cuid eile (me FGW, RTN, WGF, NTR) air an neartachadh ann an clade eile B.
Dearbhadh air còmhdhail CSF de pheptidean air an taisbeanadh le phage beairteach ann an CSF agus peptidean stiùiridh biotinylated ceangailte ri luchdan streptavidin.
(a) Co-mheasan beairteachaidh air an obrachadh a-mach anns na ceithir cuairtean (R1-R4) stèidhichte air teudan phage (PFU) a chaidh a stealladh (cuir a-steach = I) agus teudan phage CSF a chaidh a dhearbhadh (toradh = O). Chaidh factaran beairteachaidh airson nan trì cuairtean mu dheireadh (R2-R4) obrachadh a-mach le bhith gan coimeas ris a’ chuairt roimhe agus a’ chiad chuairt (R1) le dàta cuideam. Is e lionn cerebrospinal a th’ anns na bàraichean fosgailte, is e plasma a th’ anns na bàraichean sgàilte. (***p<0.001, stèidhichte air deuchainn-t an Oileanaich). (b) Liosta de na peptidean phage as pailte, air an rangachadh a rèir an co-rèir ris na phages uile a chaidh a chruinneachadh ann an CSF às deidh cuairt 4 de thaghadh. Tha na sia clònan phage as cumanta air an comharrachadh ann an dath, air an àireamhachadh agus na factaran beairteachaidh aca eadar cuairtean 3 agus 4 de thaghadh (insets). (c,d) Chaidh na sia clònan phage as beairtiche, phage falamh agus leabharlannan peptide phage phàrant bho chuairt 4 a sgrùdadh leotha fhèin ann am modail samplachaidh CSF. Chaidh sampallan CSF agus fala a chruinneachadh aig na puingean ùine ainmichte. (c) Meudan co-ionnan de 6 clònan phage tagraiche (2 x 1010 phages/beathaichean), phages falamh (#1779) (2 x 1010 phages/beathaichean) agus leabharlannan peptide phage stoc (2 x 1012 phages/beathaichean). Thèid co-dhiù 3 CM a stealladh air a rianachd don bheathach anns a bheil canàl air leth tron ​​vein earbaill. Tha cungaidh-leigheis CSF gach clòn phage agus leabharlann peptide phage a chaidh a stealladh thar ùine air a shealltainn. (d) a’ sealltainn a’ cho-mheas cuibheasach CSF/fala airson a h-uile phage/mL a chaidh fhaighinn air ais thar na h-ùine samplachaidh. (e) Chaidh ceithir peptides stiùiridh synthetigeach agus aon smachd sgrìobte a cheangal ri biotin ri streptavidin tron ​​N-terminus aca (taisbeanadh tetramer) agus an uairsin stealladh (vein earbaill iv, 10 mg streptavidin/kg). Co-dhiù trì radain air an intubachadh (N = 3). Chaidh sampallan CSF a chruinneachadh aig na puingean ùine ainmichte agus chaidh dùmhlachdan streptavidin a thomhas le ELISA CSF an-aghaidh streptavidin (nd = gun a bhith air a lorg). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, stèidhichte air deuchainn ANOVA). (f) Coimeas eadar sreath amino-aigéid clòn peptide phage #2002 (purpaidh) leis an ìre as àirde de bheairteas agus clònan peptide phage eile a chaidh a thaghadh bhon 4mh cuairt taghaidh. Tha bloighean amino-aigéid co-ionann agus coltach ri chèile air an còdachadh le dath.
De na fages beairteach uile san cheathramh cuairt (Figear 3b), chaidh sia clònan tagraiche a thaghadh airson tuilleadh mion-sgrùdaidh fa leth ann am modail samplachaidh CSF. Chaidh meudan co-ionnan de shia leabharlannan peptide fage tagraiche, fage falamh (gun cuir a-steach) agus prophage a stealladh a-steach do thrì beathaichean CM le canàlan, agus chaidh cungaidh-leigheis a dhearbhadh ann an deuchainnean CSF (Figear 3c) agus fala (Figear a bharrachd 7). Bha a h-uile clòn fage a chaidh a dhearbhadh ag amas air roinn CSF aig ìre 10-1000 uair nas àirde na ìre a’ fage smachd falamh (# 1779). Mar eisimpleir, bha timcheall air 1000 uair nas àirde de thiotalan CSF aig clònan # 2020 agus # 2077 na bha aig fage smachd. Tha pròifil cungaidh-leigheis gach peptide taghte eadar-dhealaichte, ach tha comas àrd dachaigh CSF aig gach aon dhiubh. Chunnaic sinn lùghdachadh cunbhalach thar ùine airson clònaichean #1903 agus #2011, agus airson clònaichean #2077, #2002 agus #2009 dh’ fhaodadh àrdachadh rè a’ chiad 10 mionaidean a bhith a’ nochdadh còmhdhail gnìomhach ach feumar a dhearbhadh. Sheas clònaichean #2020, #2002, agus #2077 aig ìrean àrda, agus lùghdaich dùmhlachd CSF clòn #2009 mean air mhean às deidh a’ chiad àrdachaidh. An uairsin rinn sinn coimeas eadar tricead coimeasach gach tagraiche CSF agus an dùmhlachd fala aige (Figear 3d). Sheall an co-dhàimh eadar an titer cuibheasach de gach tagraiche CSF agus an titer fala aige aig a h-uile àm samplachaidh gu robh trì de na sia tagraichean air an neartachadh gu mòr ann an CSF fala. Gu inntinneach, sheall clòn #2077 seasmhachd fala nas àirde (Figear a bharrachd 7). Gus dearbhadh gu bheil na peptides fhèin comasach air bathar a bharrachd air mìrean phage a ghiùlan gu gnìomhach a-steach don roinn CSF, rinn sinn ceithir peptides stiùiridh a cho-chur air an dèanamh le biotin aig an N-terminus far a bheil na peptides a’ ceangal ris a’ mhìrean phage. Chaidh peptides biotinylated (àireamhan 2002, 2009, 2020 agus 2077) a cheangal ri streptavidin (SA) gus cruthan ioma-mheireach fhaighinn a bha rudeigin coltach ri geoimeatraidh phage. Leig an cruth seo leinn cuideachd foillseachadh SA a thomhas ann am fuil agus lionn cerebrospinal mar peptides pròtain giùlain bathar. Gu cudromach, b’ urrainnear dàta phage ath-riochdachadh gu tric nuair a chaidh peptides synthetigeach a rianachd san chruth SA-cheangailte seo (Figear 3e). Bha nas lugha de nochdadh tùsail aig na peptides sgrìobte agus glanadh CSF nas luaithe le ìrean do-lorg taobh a-staigh 48 uairean. Gus tuigse fhaighinn air slighean lìbhrigidh nan clònan phage peptide seo a-steach don àite CSF, rinn sinn mion-sgrùdadh air suidheachadh bhuillean peptide phage fa leth a’ cleachdadh immunohistochemistry (IHC) gus mìrean phage a lorg gu dìreach 1 uair an dèidh stealladh intravenous in vivo. Gu sònraichte, b’ urrainnear clònan #2002, #2077, agus #2009 a lorg le bhith a’ dathadh gu làidir ann an capillaries na h-eanchainn, agus cha deach am phage smachd (#1779) agus clòn #2020 a lorg (Figear Taiceil 8). Tha seo a’ moladh gu bheil na peptides seo a’ cur ris a’ bhuaidh air an eanchainn dìreach le bhith a’ dol tarsainn air a’ BBB. Feumar tuilleadh mion-sgrùdaidh gus an teòiridh seo a dhearbhadh, oir dh’ fhaodadh an t-slighe BSCFB a bhith an sàs cuideachd. Nuair a thathar a’ dèanamh coimeas eadar sreath amino-aigéid a’ chlòn as beairtiche (#2002) le peptides taghte eile, chaidh a thoirt fa-near gu bheil leudachadh amino-aigéid coltach ri cuid dhiubh, a dh’ fhaodadh a bhith a’ nochdadh dòigh còmhdhail coltach ris (Figear 3f).
Air sgàth a phròifil plasma sònraichte agus àrdachadh mòr ann an CSF thar ùine, chaidh sgrùdadh nas mionaidiche a dhèanamh air clòn taisbeanaidh phage #2077 thar ùine nas fhaide de 48 uair a thìde agus bha e comasach dha an àrdachadh luath ann an CSF a chaidh fhaicinn ann an co-bhonn ri ìrean SA seasmhach ath-riochdachadh (Figear 4a). A thaobh clònaichean phage eile a chaidh a chomharrachadh, dh’ fhàs #2077 gu làidir airson capillaries na h-eanchainn agus sheall e co-àiteachadh mòr le lectin comharra capillary nuair a chaidh fhaicinn aig rùn nas àirde agus is dòcha beagan dathaidh anns an àite parenchymal (Figear 4b). Gus sgrùdadh a dhèanamh an gabhadh buaidhean cungaidh-leigheis meadhanaichte le peptide fhaighinn anns an CNS, rinn sinn deuchainn anns an deach dreachan biotinylated de i) am peptide transit #2077 agus ii) am peptide bacaidh BACE1 a mheasgachadh le SA aig dà cho-mheas eadar-dhealaichte. Airson aon mheasgachadh chleachd sinn dìreach am bacaidh peptide BACE1 agus airson an fhear eile chleachd sinn co-mheas 1:3 de bhacadh peptide BACE1 gu peptide #2077. Chaidh an dà shampall a thoirt seachad gu intravenous agus chaidh ìrean beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) san fhuil agus san lionn cerebrospinal a thomhas thar ùine. Chaidh Abeta40 a thomhas ann an CSF oir tha e a’ nochdadh casg BACE1 ann am parenchyma na h-eanchainn. Mar a bha dùil, lughdaich an dà cho-thàthadh ìrean Abeta40 san fhuil gu mòr (Figear 4c, d). Ach, cha do dh’ adhbhraich ach sampallan anns an robh measgachadh de peptide àireamh 2077 agus bacadh den peptide BACE1 ceangailte ri SA lùghdachadh mòr ann an Abeta40 anns an lionn cerebrospinal (Figear 4c). Tha an dàta a’ sealltainn gu bheil peptide àireamh 2077 comasach air am pròtain SA 60 kDa a ghiùlan a-steach don CNS agus cuideachd ag adhbhrachadh buaidhean cungaidh-leigheis le bacadh SA-cheangailte den peptide BACE1.
(a) In-stealladh clonal (2 × 10 phages/ainmhidh) de phage T7 a’ sealltainn phròifilean pharmacokinetic fad-ùine de peptide CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) agus phage smachd gun stealladh (#1779) ann an co-dhiù trì radain air an deach CM a thoirt a-steach. (b) Ìomhaigh mhicreascopach confocal de mhicro-shoithichean cortical riochdachail ann an radain air an deach stealladh le phage (2 × 10 10 phages/ainmhidh) a’ sealltainn contra-dhath peptide #2077 agus soithichean (lectin). Chaidh na clonaichean phage seo a thoirt do 3 radain agus leig iad leotha cuairteachadh airson 1 uair a thìde mus deach an lionadh tron ​​chraiceann. Chaidh na h-eanchainnean a ghearradh agus an dath le antibodies polyclonal le bileagan FITC an aghaidh capsid phage T7. Deich mionaidean mus deach an lionadh tron ​​chraiceann agus an daingneachadh às dèidh sin, chaidh lectin le bileagan DyLight594 a thoirt seachad gu intravenous. Ìomhaighean fluorescent a’ sealltainn dath lectin (dearg) air taobh luminal nam micro-shoithichean agus nam phages (uaine) ann an lumen nan capillaries agus clò eanchainn perivascular. Tha am bàr sgèile a’ freagairt ri 10 µm. (c, d) Chaidh peptide bacaidh BACE1 biotinylated leis fhèin no ann an co-bhonn ri peptide transit biotinylated #2077 a cheangal ri streptavidin agus an uair sin chaidh co-dhiù trì radain CM le canàlan a thoirt a-steach do na cuislean (10 mg streptavidin/kg). Chaidh lùghdachadh ann an Aβ40, air a bhrosnachadh le bacaidh peptide BACE1, a thomhas le Aβ1-40 ELISA ann am fuil (dearg) agus lionn cerebrospinal (orains) aig na h-amannan a chaidh a chomharrachadh. Airson soilleireachd nas fheàrr, tha loidhne dhotagach air a tarraing air a’ ghraf aig sgèile de 100%. (c) Lùghdachadh sa cheud ann an Aβ40 ann am fuil (triantan dearga) agus lionn cerebrospinal (triantan orains) ann an radain air an làimhseachadh le streptavidin ceangailte ri peptide transit #2077 agus peptide bacaidh BACE1 ann an co-mheas 3:1. (d) Lùghdachadh sa cheud ann an Aβ40 san fhuil (cearcallan dearga) agus lionn cerebrospinal (cearcallan orains) ann an radain a chaidh a làimhseachadh le streptavidin ceangailte ri peptide bacaidh BACE1 a-mhàin. B’ e 420 pg/ml dùmhlachd Aβ anns a’ bhuidheann smachd (claonadh àbhaisteach = 101 pg/ml).
Chaidh taisbeanadh phage a chur an sàs gu soirbheachail ann an grunn raointean de rannsachadh bith-mheidigeach17. Chaidh an dòigh seo a chleachdadh airson sgrùdaidhean iomadachd shoithichean fala in vivo18,19 a bharrachd air sgrùdaidhean a tha ag amas air soithichean cerebral20,21,22,23,24,25,26. Anns an sgrùdadh seo, leudaich sinn cleachdadh na dòigh taghaidh seo chan ann a-mhàin gu bhith a’ comharrachadh peptides a tha ag amas air soithichean cerebral gu dìreach, ach cuideachd gu bhith a’ lorg thagraichean le feartan còmhdhail gnìomhach gus a dhol tarsainn air a’ bhacadh fala-eanchainn. Tha sinn a-nis a’ toirt cunntas air leasachadh modh-obrach taghaidh in vivo ann an radain air an intubachadh le CM agus a’ sealltainn a chomas peptides le feartan homing CSF a chomharrachadh. A’ cleachdadh am phage T7 a’ taisbeanadh leabharlann de peptides air thuaiream 12-mer, bha sinn comasach air sealltainn gu bheil am phage T7 beag gu leòr (timcheall air 60 nm ann an trast-thomhas)10 gus a bhith air atharrachadh chun bhacadh fala-eanchainn, agus mar sin a’ dol tarsainn gu dìreach air a’ bhacadh fala-eanchainn no plexus choroid. Chunnaic sinn gur e dòigh sgrìonaidh gnìomhach in vivo a bha fo smachd math a bh’ ann a bhith a’ buain CSF bho radain CM le canàlan, agus nach robh am phage a chaidh a thoirt a-mach dìreach a’ ceangal ris an t-siostam shoithichean fala ach cuideachd ag obair mar ghiùladair thairis air a’ bhacadh fala-eanchainn. A bharrachd air an sin, le bhith a’ tional fala agus a’ cur HTS an sàs ann an CSF agus phages a thàinig à fuil aig an aon àm, dhearbh sinn nach robh buaidh aig beairteachadh fala no freagarrachd airson leudachadh eadar cuairtean taghaidh air an roghainn againn de CSF. Ach, tha an roinn fala nam pàirt den phròiseas taghaidh, leis gu bheil phages comasach air ruighinn air roinn CSF a’ mairsinn agus a’ cuairteachadh san t-sruth fala fada gu leòr gus iad fhèin a bheairteachadh san eanchainn. Gus fiosrachadh sreath earbsach a thoirt a-mach à dàta HTS amh, chuir sinn sìoltachain an gnìomh a bha air an atharrachadh gu mearachdan sreath sònraichte don àrd-ùrlar anns an t-sruth-obrach anailis. Le bhith a’ toirt a-steach paramadairean cineatach don dòigh sgrìonaidh, dhearbh sinn cungaidh-leigheis luath phages T7 seòrsa fiadhaich (t½ ~ 28 min) ann am fuil24, 27, 28 agus cho-dhùin sinn cuideachd an leth-bheatha ann an lionn cerebrospinal (t½ ~ 26 min) gach mionaid). A dh’aindeoin pròifilean cungaidh-leigheis coltach ri chèile ann am fuil agus CSF, cha b’ urrainnear ach 0.001% de dùmhlachd fala de phage a lorg ann an CSF, a’ nochdadh gluasad cùl-fhiosrachaidh ìosal de phage T7 seòrsa fiadhaich thairis air a’ bhacadh fala-eanchainn. Tha an obair seo a’ cur cuideam air cho cudromach sa tha a’ chiad chuairt taghaidh nuair a thathar a’ cleachdadh ro-innleachdan panning in vivo, gu sònraichte airson siostaman phage a thèid a ghlanadh gu luath bhon chuairteachadh, leis nach eil mòran chlònan comasach air roinn an CNS a ruighinn. Mar sin, anns a’ chiad chuairt, bha an lùghdachadh ann an iomadachd leabharlainn glè mhòr, leis nach deach ach àireamh chuingealaichte de chlònan a chruinneachadh mu dheireadh anns a’ mhodail CSF glè theann seo. Bha grunn cheumannan taghaidh san ro-innleachd panning in vivo seo leithid cruinneachadh gnìomhach ann an roinn CSF, mairsinneachd clòna ann an roinn na fala, agus toirt air falbh luath clòna phage T7 bhon fhuil taobh a-staigh a’ chiad 10 mionaidean (Figear 1d agus Figear a bharrachd 4M). Mar sin, às deidh a’ chiad chuairt, chaidh diofar chlònan phage a chomharrachadh ann an CSF, ged a chaidh an aon amar tùsail a chleachdadh airson beathaichean fa leth. Tha seo a’ moladh gum bi iomadh ceum taghaidh teann airson leabharlannan tùsail le àireamh mhòr de bhuill leabharlainn a’ leantainn gu lùghdachadh mòr ann an iomadachd. Mar sin, bidh tachartasan air thuaiream nam pàirt riatanach den phròiseas taghaidh tùsail, a’ toirt buaidh mhòr air an toradh. Tha e coltach gun robh claonadh beairteachaidh CSF glè choltach aig mòran de na clònan anns an leabharlann thùsail. Ach, eadhon fo na h-aon chumhachan deuchainneach, faodaidh toraidhean taghaidh a bhith eadar-dhealaichte air sgàth an àireamh bhig de gach clòn sònraichte anns a’ chiad amar.
Tha na motifan a tha beairteach ann an CSF eadar-dhealaichte bho na motifan san fhuil. Gu inntinneach, mhothaich sinn a’ chiad ghluasad a dh’ionnsaigh peptides beairteach ann an glycine ann am fuil bheathaichean fa leth. (Figear 1g, Figearan a bharrachd. 4e, 4f). Is dòcha gu bheil fage anns a bheil peptides glycine nas seasmhaiche agus nas lugha de chothrom ann gun tèid an toirt a-mach à cuairteachadh. Ach, cha deach na peptides beairteach ann an glycine seo a lorg anns na sampallan lionn cerebrospinal, a’ moladh gun deach na leabharlannan curaichte tro dhà cheum taghaidh eadar-dhealaichte: aon san fhuil agus fear eile air a leigeil a’ cruinneachadh anns an lionn cerebrospinal. Chaidh clònan beairteach ann an CSF a thàinig bhon cheathramh cuairt taghaidh a dhearbhadh gu farsaing. Chaidh dearbhadh gu robh cha mhòr a h-uile clòn a chaidh a dhearbhadh leotha fhèin beairteach ann an CSF an taca ri fage smachd bàn. Chaidh aon bhuille peptide (# 2077) a sgrùdadh nas mionaidiche. Sheall e leth-bheatha plasma nas fhaide an taca ri buillean eile (Figear 3d agus Figear a bharrachd 7), agus gu inntinneach, bha fuigheall cysteine ​​​​san peptide seo aig an C-terminus. O chionn ghoirid, chaidh a shealltainn gum faod cur cysteine ​​ri peptides na feartan cungaidh-leigheis aca a leasachadh le bhith a’ ceangal ri albumin 29. Chan eil seo aithnichte an-dràsta airson peptide #2077 agus feumar tuilleadh sgrùdaidh. Sheall cuid de peptides eisimeileachd air vaileins ann an beairteachadh CSF (dàta gun a shealltainn), a dh’ fhaodadh a bhith co-cheangailte ri geoimeatraidh uachdar taisbeanaichte an T7 capsid. Sheall an siostam T7 a chleachd sinn 5-15 leth-bhreac de gach peptide gach gràin phage. Chaidh IHC a dhèanamh air clònan phage luaidhe tagraiche a chaidh a stealladh gu intravenous a-steach do cortex cerebral radain (Figear a bharrachd 8). Sheall an dàta gun robh co-dhiù trì clònan (Àir. 2002, Àir. 2009 agus Àir. 2077) ag eadar-obrachadh leis a’ BBB. Tha e fhathast ri dhearbhadh an e cruinneachadh CSF no gluasad nan clònan sin gu dìreach chun BCSFB a tha mar thoradh air an eadar-obrachadh BBB seo. Gu cudromach, tha sinn a’ sealltainn gu bheil na peptides taghte a’ cumail an comas còmhdhail CSF nuair a thèid an co-chur agus an ceangal ris a’ chargo pròtain. Tha ceangal peptides biotinylated N-terminal ri SA gu ìre mhòr ag ath-aithris nan toraidhean a fhuaireadh leis na clònan phage fa leth aca ann am fuil agus lionn cerebrospinal (Figear 3e). Mu dheireadh, tha sinn a’ sealltainn gu bheil am prìomh peptide #2077 comasach air gnìomhachd eanchainn bacadair peptide biotinylated de BACE1 ceangailte ri SA adhartachadh, ag adhbhrachadh buaidhean pharmacodynamic follaiseach anns an CNS le bhith a’ lughdachadh ìrean Abeta40 ann an CSF gu mòr (Figear 4). Cha b’ urrainn dhuinn homologues sam bith a chomharrachadh anns an stòr-dàta le bhith a’ dèanamh sgrùdadh homologuy sreath peptide de na buillean uile. Tha e cudromach a thoirt fa-near gu bheil meud leabharlann T7 timcheall air 109, agus meud teòiridheach na leabharlainn airson 12-mers 4 x 1015. Mar sin, cha do thagh sinn ach bloigh bheag den àite iomadachd den leabharlann peptide 12-mer, a dh’ fhaodadh a bhith a’ ciallachadh gum faodar peptides nas leasaichte a chomharrachadh le bhith a’ measadh an àite sreath faisg air làimh de na buillean a chaidh a chomharrachadh. Gu teòiridheach, is dòcha gur e aon de na h-adhbharan nach d’ fhuair sinn co-chosmhailean nàdarra sam bith de na peptidean sin dì-thaghadh rè mean-fhàs gus casg a chuir air cuid de mhotaibhean peptide bho bhith a’ dol a-steach don eanchainn gun smachd.
Còmhla, tha na toraidhean againn a’ toirt bunait airson obair san àm ri teachd gus siostaman còmhdhail a’ bhacadh cerebrovascular in vivo a chomharrachadh agus a chomharrachadh nas mionaidiche. Tha bun-stèidh na modh-obrach seo stèidhichte air ro-innleachd taghaidh gnìomh nach eil a’ comharrachadh clònan le feartan ceangail vascular cerebral a-mhàin, ach a tha cuideachd a’ toirt a-steach ceum deatamach anns a bheil gnìomhachd nàdarrach aig clònan soirbheachail gus cnapan-starra bith-eòlasach a thrasg in vivo a-steach don roinn CNS. Is e seo dòigh-obrach còmhdhail nam peptides sin agus an roghainn airson ceangal ris a’ mhicrovasculature a tha sònraichte do roinn na h-eanchainn a shoilleireachadh. Dh’ fhaodadh seo leantainn gu lorg shlighean ùra airson còmhdhail a’ BBB agus gabhadan. Tha sinn an dùil gun urrainn dha na peptides a chaidh a chomharrachadh ceangal gu dìreach ri gabhadan cerebrovascular no ri ligands cuairteachaidh a tha air an giùlan tron ​​BBB no BCSFB. Thèid na vectaran peptide le gnìomhachd còmhdhail CSF a chaidh a lorg san obair seo a sgrùdadh tuilleadh. Tha sinn an-dràsta a’ sgrùdadh sònrachas eanchainn nam peptides sin airson an comas a dhol tarsainn air a’ BBB agus/no BCSFB. Bidh na peptidean ùra seo nan innealan air leth luachmhor airson gabhadan no slighean ùra a lorg agus airson àrd-ùrlaran ùra, èifeachdach a leasachadh airson macramholaciulan, leithid stuthan bith-eòlasach, a lìbhrigeadh don eanchainn.
Cuir cannula anns a’ chisterna mhòr (CM) le bhith a’ cleachdadh atharrachadh air an dòigh a chaidh a mhìneachadh roimhe. Chaidh radain Wistar fo anesthetis (200-350 g) a chuir air inneal stereotaxic agus chaidh gearradh meadhanach a dhèanamh thairis air a’ chraiceann-cinn a chaidh a bhearradh agus ullachadh gu aseptic gus an claigeann fhoillseachadh. Drile dà tholl ann an sgìre an t-sash àrd agus daingnich na sgriothan daingneachaidh anns na tuill. Chaidh toll a bharrachd a dhrileadh anns a’ chnoc occipital lateral airson stiùireadh stereotactic cannula stàilinn gun staoin a-steach don CM. Cuir saimeant fiaclaireachd timcheall air a’ channula agus daingnich le sgriothan. Às deidh photo-curing agus cruadhachadh saimeant, chaidh an lot craiceann a dhùnadh le suture supramid 4/0. Tha suidheachadh ceart a’ channula air a dhearbhadh le aodion spontaneous de lionn cerebrospinal (CSF). Thoir an radan a-mach às an inneal stereotaxic, faigh cùram iar-obrachaidh iomchaidh agus riaghladh pian, agus leig leis faighinn seachad air airson co-dhiù aon seachdain gus am faicear comharran fala anns an lionn cerebrospinal. Fhuaireadh radain Wistar (Crl:WI/Han) bho Charles River (An Fhraing). Chaidh na radain uile a chumail fo chumhachan sònraichte saor bho phataigin. Chaidh na deuchainnean beathach uile aontachadh le Oifis Tréidheil Baile Basel, an Eilbheis, agus chaidh an dèanamh a rèir Cead Ainmhidhean Àir. 2474 (Measadh air Còmhdhail Eanchainn Gnìomhach le bhith a’ Tomhas Ìrean de Thagraichean Leigheasach ann an Lionn Cerebrospinal agus Eanchainn Radain).
Cùm an radan mothachail gu socair leis a’ chanula CM nad làimh. Thoir an Datura a-mach às a’ chanula agus cruinnich 10 µl de lionn cerebrospinal a’ sruthadh gu fèin-ghluasadach. Leis gun deach permeability a’ chanula a chuir an cunnart mu dheireadh, cha deach ach sampallan soilleir de lionn cerebrospinal gun fhianais air truailleadh fala no dath mì-chothromachaidh a ghabhail a-steach don sgrùdadh seo. Aig an aon àm, chaidh timcheall air 10–20 μl de fhuil a thoirt bho ghearradh beag aig bàrr an earbaill a-steach do phìoban le heparin (Sigma-Aldrich). Chaidh CSF agus fuil a chruinneachadh aig diofar amannan às deidh stealladh intravenous de phage T7. Chaidh timcheall air 5–10 μl de lionn a thilgeil air falbh mus deach gach sampall CSF a chruinneachadh, a tha a’ freagairt ri meud marbh a’ chatheter.
Chaidh leabharlannan a chruthachadh a’ cleachdadh an vectar T7Select 10-3b mar a chaidh a mhìneachadh ann an leabhar-làimhe siostam T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Gu h-aithghearr, chaidh cuir-a-steach DNA 12-mer air thuaiream a cho-chur ri chèile san riochd a leanas:
Chaidh an codon NNK a chleachdadh gus casg a chur air codons stad dùbailte agus cus-chur amino-aigéid anns an cuir-a-steach. 'S e N co-mheas co-mholar measgaichte le làimh de gach nucleotide, agus 's e K co-mheas co-mholar measgaichte le làimh de nucleotides adenine agus cytosine. Chaidh roinnean aon-shreathach a thionndadh gu DNA dà-shreathach le bhith gan goil tuilleadh le dNTP (Novagen) agus enzyme Klenow (New England Biolabs) ann am bufair Klenow (New England Biolabs) airson 3 uairean a thìde aig 37°C. Às dèidh an ath-bhualadh, chaidh DNA dà-shreathach fhaighinn air ais le sileadh EtOH. Chaidh an DNA a thig às a sin a chnàmh leis na h-einnseanan cuibhreachaidh EcoRI agus HindIII (an dà chuid bho Roche). Chaidh an cuir-a-steach sgoltadh agus glan (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) an uairsin a cheangal in-frame a-steach do vectar T7 ro-sgoltadh às dèidh amino-aigéad 348 den ghine capsid 10B. Chaidh ath-bheachdan ceangail a ghoir aig 16° C. airson 18 uairean a thìde mus deach am pacaigeadh in vitro. Rinneadh pacadh phage in vitro a rèir an stiùiridh a chaidh a thoirt seachad leis a’ phasgan clònaidh T7Select 10-3b (Novagen) agus chaidh am fuasgladh pacaidh a mheudachadh aon uair gu lysis a’ cleachdadh Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Chaidh na lysates a chuir ann an centrifuge, a thitreachadh agus a reothadh aig -80° C. mar fhuasgladh stoc de glycerol.
Leudachadh PCR dìreach air roinnean caochlaideach phage air an leudachadh ann am broth no truinnsear a’ cleachdadh prìomhairean co-thàthaidh 454/Roche-amplicon seilbhe. Tha sreathan anns a’ phrìomhair co-thàthaidh air adhart a tha ri taobh na roinne caochlaideach (NNK) 12 (sònraichte don teamplaid), GS FLX Titanium Adapter A, agus sreath iuchair leabharlainn ceithir-bhunait (TCAG) (Figear a bharrachd 1a):
Tha biotin anns a’ phrìomhair fusion cùil cuideachd a tha ceangailte ri grìogagan glacaidh agus an GS FLX Titanium Adapter B a tha a dhìth airson iomadachadh clonal rè PCR emulsion:
Chaidh na h-amplicons an uair sin a chur fo pyro-sheicheamh 454/Roche a rèir protocol Titanium 454 GS-FLX. Airson sreath-sheicheamh Sanger làimhe (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), chaidh DNA phage T7 a mheudachadh le PCR agus a sheicheamh leis na paidhrichean prìmear ​​a leanas:
Chaidh cuir-a-steach bho phlàighean fa leth a chur fo iomadachadh PCR a’ cleachdadh Pasgan Roche Fast Start DNA Polymerase (a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh). Dèan tòiseachadh teth (10 mionaidean aig 95 °C) agus 35 cearcall àrdachadh (50 diogan aig 95 °C, 1 mionaid aig 50 °C, agus 1 mionaid aig 72 °C).
Chaidh fage bho leabharlannan, fage fiadhaich, fage a chaidh a shàbhaladh bho CSF ​​agus fuil, no clònan fa leth a mheudachadh ann an Escherichia coli BL5615 ann am broth TB (Sigma Aldrich) no ann an soithichean 500 cm2 (Thermo Scientific) airson 4 uairean a thìde aig 37°C. Chaidh fage a thoirt a-mach às na truinnsearan le bhith gan sruthladh le bufair Tris-EDTA (Fluka Analytical) no le bhith a’ cruinneachadh nam plaicean le bàrr pipette sterile. Chaidh fage a sgaradh bho supernatant cultar no bufair às-tharraing le aon chuairt de shìoladh polyethylene glycol (PEG 8000) (Promega) agus ath-fhuadachadh ann am bufair Tris-EDTA.
Chaidh am phage leasaichte a chur fo 2-3 chuairtean de thoirt air falbh endotoxin le bhith a’ cleachdadh grìogagan toirt air falbh endotoxin (Miltenyi Biotec) mus deach a stealladh intravenous (IV) (500 μl / beathach). Anns a’ chiad chuairt, chaidh 2 × 1012 phage a thoirt a-steach; san dàrna fear, 2 × 1010 phage; anns an treas agus an ceathramh cuairtean taghaidh, 2 × 109 phage gach beathach. Chaidh susbaint phage ann an CSF agus sampallan fala a chaidh a chruinneachadh aig na puingean ùine ainmichte a dhearbhadh le cunntadh plaic a rèir stiùiridhean an neach-dèanamh (leabhar-làimhe siostam T7Select). Chaidh taghadh phage a dhèanamh le stealladh intravenous de leabharlannan glan a-steach don vein earbaill no le ath-stealladh phage a chaidh a thoirt a-mach à CSF bhon chuairt taghaidh roimhe, agus chaidh buain às deidh sin a dhèanamh aig 10 mion, 30 mion, 60 mion, 90 mion, 120 mion, 180 mion, agus 240 mion fa leth de shampaill CSF agus fala. Chaidh ceithir cuairtean de phannadh in vivo a dhèanamh gu h-iomlan agus chaidh an dà mheur taghte a stòradh agus a sgrùdadh air leth rè a’ chiad trì chuairtean taghaidh. Chaidh a h-uile cuir-a-steach phage a chaidh a thoirt a-mach à CSF bhon chiad dà chuairt taghaidh a chur fo pyrosequencing 454/Roche, agus chaidh a h-uile clòn a chaidh a thoirt a-mach à CSF bhon dà chuairt mu dheireadh de thaghadh a sheicheamhachadh le làimh. Chaidh a h-uile phage fala bhon chiad chuairt taghaidh a chur fo pyrosequencing 454/Roche cuideachd. Airson stealladh clònan phage, chaidh phages taghte a mheudachadh ann an E. coli (BL5615) air truinnsearan 500 cm2 aig 37°C airson 4 uairean a thìde. Chaidh clònan a chaidh a thaghadh leotha fhèin agus a sheicheamhachadh le làimh a iomadachadh ann am meadhan TB. Às deidh às-tharraing phage, glanadh agus toirt air falbh endotoxin (mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd), chaidh 2 × 1010 phages / beathach ann an 300 μl a stealladh gu intravenous a-steach do aon vein earbaill.
Ro-phròiseasadh agus sìoladh càileachdail dàta sreath. Chaidh dàta amh 454/Roche a thionndadh bho chruth mapa sruth àbhaisteach dà-chànanach (sff) gu cruth a ghabhas leughadh le daoine Pearson (fasta) a’ cleachdadh bathar-bog reiceadair. Chaidh tuilleadh giollachd den t-sreath niùclasaid a dhèanamh a’ cleachdadh phrògraman C agus sgriobtaichean seilbhe (pasgan bathar-bog gun fhoillseachadh) mar a tha air a mhìneachadh gu h-ìosal. Tha modhan sìolaidh ioma-ìre teann anns a’ mhion-sgrùdadh air dàta bun-sgoile. Gus leughaidhean a shìoladh a-mach nach robh sreath DNA cuir-a-steach 12mer dligheach annta, chaidh na leughaidhean a cho-thaobhadh gu sreathmhor ri leubail tòiseachaidh (GTGATGTCGGGGATCCGAATTC), leubail stad (TAAGCTTGGGCCGCACTCGAGTA) agus cuir-a-steach cùl-fhiosrachaidh (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) a’ cleachdadh deuchainn Needleman-Wunsch cruinneil. Le co-thaobhadh a’ leigeil le suas ri 2 neo-chunbhalachd gach co-thaobhadh31. Mar sin, chaidh leughaidhean às aonais tagaichean tòiseachaidh is stad agus leughaidhean anns a bheil cuir-a-steach cùl-fhiosrachaidh, ie, co-thaobhadh a tha a’ dol thairis air an àireamh cheadaichte de neo-cho-fhreagarrachd, a thoirt air falbh bhon leabharlann. A thaobh nan leughaidhean a bha air fhàgail, chaidh an sreath DNA N-mer a bha a’ sìneadh bhon chomharra tòiseachaidh agus a’ crìochnachadh ron chomharra stad a thoirt a-mach às an t-sreath leughaidh tùsail agus a phròiseasadh tuilleadh (ris an canar “cuir a-steach” an-seo às dèidh seo). Às dèidh eadar-theangachadh an cuir a-steach, thèid am pàirt às dèidh a’ chiad chodon stad aig ceann 5′ a’ phrìomar a thoirt air falbh bhon cuir a-steach. A bharrachd air an sin, chaidh niùclasaid a’ leantainn gu codons neo-choileanta aig ceann 3′ a’ phrìomar a thoirt air falbh cuideachd. Gus cuir a-steach anns nach eil ach sreathan cùl-fhiosrachaidh, chaidh cuir a-steach eadar-theangaichte a’ tòiseachadh leis a’ phàtran amino-aigéid “PAG” a thoirt air falbh cuideachd. Chaidh peptides le fad iar-eadar-theangachaidh nas lugha na 3 amino-aigéid a thoirt air falbh bhon leabharlann. Mu dheireadh, thoir air falbh cus stuthan anns a’ chruinneachadh cuir a-steach agus dearbhaich tricead gach cuir a-steach sònraichte. Bha liosta de shreathan niùclasaid (cuir a-steach) agus na triceadan (leughaidh) aca nam measg toraidhean na mion-sgrùdaidh seo (Figearan Taiceil 1c agus 2).
Cuir-a-steach DNA N-mer buidhne a rèir coltas sreath: Gus mearachdan sreathachaidh sònraichte do 454/Roche a thoirt air falbh (leithid duilgheadasan le leudachadh homopolymer sreathachaidh) agus gus cus rudan nach eil cho cudromach a thoirt air falbh, tha cuir-a-steach sreath DNA N-mer (cuir-a-steach) a chaidh a shìoladh roimhe air an seòrsachadh a rèir coltas. cuir-a-steach (suas ri 2 bhunait neo-fhreagarrach ceadaichte) a’ cleachdadh algairim ath-aithriseach air a mhìneachadh mar a leanas: tha cuir-a-steach air an seòrsachadh an toiseach a rèir an tricead (as àirde chun as ìsle), agus ma tha iad mar an ceudna, leis an dàrna seòrsachadh a rèir faid (as fhaide chun as giorra). Mar sin, tha na cuir-a-steach as trice agus as fhaide a’ mìneachadh a’ chiad “bhuidheann”. Tha tricead na buidhne air a shuidheachadh chun tricead iuchair. An uairsin, chaidh feuchainn ri gach cuir-a-steach a tha air fhàgail san liosta sheòrsachaidh a chur ris a’ bhuidheann le co-thaobhadh Needleman-Wunsch paidhir. Mura h-eil an àireamh de mhì-cho-fhreagarrachdan, cuir-a-steach no sguabadh às ann an co-thaobhadh nas àirde na stairsneach de 2, tha cuir-a-steach air a chur ris a’ bhuidheann, agus tha tricead iomlan na buidhne air a mheudachadh a rèir cho tric ‘s a chaidh an cuir-a-steach a chur ris. Tha cuir-a-steach a chaidh a chur ri buidheann air an comharrachadh mar air an cleachdadh agus air an dùnadh a-mach à giullachd a bharrachd. Mura h-urrainnear an sreath cuir-a-steach a chur ri buidheann a tha ann mu thràth, thèid an sreath cuir-a-steach a chleachdadh gus buidheann ùr a chruthachadh leis an tricead cuir-a-steach iomchaidh agus thèid a chomharrachadh mar air a chleachdadh. Thig an ath-aithris gu crìch nuair a bhios gach sreath cuir-a-steach air a chleachdadh gus buidheann ùr a chruthachadh no faodar a thoirt a-steach do bhuidheann a tha ann mu thràth. Às dèidh a h-uile càil, thèid cuir-a-steach buidhneichte anns a bheil niùclasaidean eadar-theangachadh mu dheireadh gu sreathan peptide (leabharlannan peptide). Is e toradh na mion-sgrùdaidh seo seata de chuir-a-steach agus na triceadan co-fhreagarrach aca a tha a’ dèanamh suas an àireamh de leughaidhean leantainneach (Figear a bharrachd 2).
Gineadh Motaif: Stèidhichte air liosta de pheptidean gun samhail, chaidh leabharlann a chruthachadh anns an robh a h-uile pàtran amino-aigéid (aa) a dh’ fhaodadh a bhith ann mar a chithear gu h-ìosal. Chaidh gach pàtran a dh’ fhaodadh a bhith ann de dh’fhaid 3 a thoirt a-mach às a’ pheptide agus chaidh a phàtran neo-dhìreach a chur ris còmhla ri leabharlann motif cumanta anns an robh a h-uile pàtran (tripeptides). Chaidh leabharlannan de motifan ath-aithriseach a sheicheamh agus chaidh cus cuideim a thoirt air falbh. An uairsin, airson gach tripeptide anns an leabharlann motif, rinn sinn sgrùdadh airson a làthaireachd anns an leabharlann a’ cleachdadh innealan coimpiutaireachd. Anns a’ chùis seo, thèid tricead a’ pheptide anns a bheil an tripeptide motif a chaidh a lorg a chur ris agus a shònrachadh don motif anns an leabharlann motif (“àireamh de motifan”). Is e toradh gineadh motif sreath dà-thaobhach anns a bheil a h-uile tachartas de thripeptides (motifan) agus na luachan fa leth aca, is iad sin an àireamh de leughaidhean sreath a thig bhon motif co-fhreagarrach nuair a thèid na leughaidhean a shìoladh, a chruinneachadh agus eadar-theangachadh. Meatrach mar a chaidh a mhìneachadh gu mionaideach gu h-àrd.
Gnàthachadh àireamh nam motifan agus na sgap-phlotaichean co-fhreagarrach: Chaidh àireamh nam motifan airson gach sampall a ghnàthachadh a’ cleachdadh
far a bheil ni an àireamh de leughaidhean anns a bheil cuspair i. Mar sin, tha vi a’ riochdachadh tricead sa cheud de leughaidhean (no peptidean) anns a bheil motif i san sampall. Chaidh luachan-P airson an àireamh neo-àbhaisteach de motifan obrachadh a-mach a’ cleachdadh deuchainn mionaideach Fisher. A thaobh co-dhàimhean den àireamh de mhotaibhean, chaidh co-dhàimhean Spearman obrachadh a-mach a’ cleachdadh an àireamh àbhaisteach de mhotaibhean le R.
Gus susbaint nan amino-aigéid aig gach suidheachadh anns an leabharlann peptide a dhèanamh follaiseach, chaidh logograman lìn 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) a chruthachadh. An toiseach, tha susbaint nan amino-aigéid aig gach suidheachadh den peptide 12-mer air a stòradh ann am maitrís 20 × 12. An uairsin, thèid seata de 1000 peptides anns a bheil an aon susbaint amino-aigéid coimeasach aig gach suidheachadh a chruthachadh ann an cruth fasta-sequence agus a thoirt seachad mar chur-a-steach do web-logo 3, a bhios a’ gineadh riochdachadh grafaigeach den t-susbaint amino-aigéid coimeasach aig gach suidheachadh airson leabharlann peptide sònraichte. Gus seataichean dàta ioma-thaobhach a dhèanamh follaiseach, chaidh mapaichean teas a chruthachadh a’ cleachdadh inneal a chaidh a leasachadh gu h-inntinneach ann an R (biosHeatmap, pasgan R nach deach fhoillseachadh fhathast). Chaidh na dendrograman a chaidh a thaisbeanadh anns na mapaichean teas obrachadh a-mach a’ cleachdadh dòigh cruinneachaidh ìreachail Ward leis a’ mheatrach astar Euclidean. Airson mion-sgrùdadh staitistigeil air dàta sgòraidh motif, chaidh luachan P airson sgòradh neo-àbhaisteach obrachadh a-mach a’ cleachdadh deuchainn mionaideach Fisher. Chaidh luachan-P airson seataichean dàta eile obrachadh a-mach ann an R a’ cleachdadh deuchainn-t an Oileanaich no ANOVA.
Chaidh clònan agus fagaichean taghte às aonais cuir-a-steach a stealladh gu intravenous tron ​​vein earbaill (2 × 1010 fagaichean / beathach ann an 300 μl PBS). Deich mionaidean mus deach an lionadh agus an daingneachadh às deidh sin, chaidh 100 μl de lectin le bileag DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177) a stealladh gu intravenous dha na h-aon bheathaichean. 60 mionaid an dèidh stealladh fagaichean, chaidh radain a lionadh tron ​​chridhe le 50 ml PBS agus an uairsin 50 ml 4% PFA / PBS. A bharrachd air an sin, chaidh sampallan eanchainn a dhaingneachadh thar oidhche ann an 4% PFA / PBS agus am bogadh ann an 30% sucrose thar oidhche aig 4 ° C. Tha sampallan air an reothadh gu sgiobalta anns a ’mheasgachadh OCT. Chaidh mion-sgrùdadh immunohistochemical de shamhlaichean reòta a dhèanamh aig teòthachd an t-seòmair air crio-earrannan 30 µm air am bacadh le 1% BSA agus air an goradh le antibodies polyclonal le bileag FITC an aghaidh fagaichean T7 (Novus NB 600-376A) aig 4 ° C. Goradh thar oidhche. Mu dheireadh, chaidh na h-earrannan a nighe 3 tursan le PBS agus an sgrùdadh le miocroscop laser confocal (Leica TCS SP5).
Chaidh na peptidean uile le purrachd as ìsle de 98% a cho-chur ri chèile le GenScript USA, gan biotinylachadh agus gan liofileachadh. Tha biotin ceangailte tro spacer trì-ghlicin a bharrachd aig an N-terminus. Thoir sùil air na peptidean uile a’ cleachdadh speactramaitreachd mais.
Chaidh Streptavidin (Sigma S0677) a mheasgachadh le cus co-mholar 5-fhillte de pheaptaid biotinylated, peptide bacaidh BACE1 biotinylated, no measgachadh (co-mheas 3:1) de pheaptaid bacaidh BACE1 biotinylated agus peptide bacaidh BACE1 ann an 5–10% DMSO/air a ghoir ann am PBS. 1 uair a thìde aig teòthachd an t-seòmair mus deach a stealladh. Chaidh peptides ceangailte ri streptavidin a stealladh gu intravenous aig dòs de 10 mg/kg a-steach do aon de na cuislean earbaill aig radain le cuas cerebral.
Chaidh dùmhlachd nan co-thàthaidhean streptavidin-peptide a mheasadh le ELISA. Chaidh pleitean microtiter Nunc Maxisorp (Sigma) a chòmhdach thar oidhche aig 4°C le 1.5 μg/ml antibody luchaige an-aghaidh streptavidin (Thermo, MA1-20011). Às dèidh bacadh (bufair bacadh: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) aig teòthachd an t-seòmair airson 2 uair a thìde, nigh am pleit le 0.05% Tween-20/PBS (bufair nighe) airson 3 diogan, chaidh sampallan CSF agus plasma a chur ri tobraichean air an caolachadh le bufair bacadh (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Chaidh am pleit an uairsin a ghoir thar oidhche aig 4°C le antibody lorg (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Às dèidh trì ceumannan nighe, chaidh streptavidin a lorg le bhith ga ghoir ann am fuasgladh fo-strat TMB (Roche) airson suas ri 20 mionaid. Às dèidh stad a chur air leasachadh dath le 1M H2SO4, tomhais an absorbance aig 450 nm.
Chaidh gnìomh an iom-fhillte bacaidh streptavidin-peptide-BACE1 a mheasadh le Aβ(1-40) ELISA a rèir protocol an neach-dèanamh (Wako, 294-64701). Gu h-aithghearr, chaidh sampallan CSF a lagachadh ann an lagaiche àbhaisteach (1:23) agus a ghoir thar oidhche aig 4°C ann am pleitean 96-tobar còmhdaichte le antibody glacaidh BNT77. Às dèidh còig ceumannan nighe, chaidh antibody BA27 ceangailte ri HRP a chur ris agus a ghoir airson 2 uair a thìde aig 4° C., agus an uairsin còig ceumannan nighe. Chaidh Aβ(1–40) a lorg le bhith ga ghoir ann am fuasgladh TMB airson 30 mionaid aig teòthachd an t-seòmair. Às dèidh leasachadh dath a bhith air a stad le fuasgladh stad, tomhais an absorbance aig 450 nm. Chaidh sampallan plasma a chur fo às-tharraing ìre chruaidh mus deach Aβ(1–40) ELISA a dhèanamh. Chaidh plasma a chur ri 0.2% DEA (Sigma) ann am pleitean 96-tobar agus a ghoir aig teòthachd an t-seòmair airson 30 mionaid. Às dèidh dhaibh na truinnsearan SPE (Oasis, 186000679) a nighe le uisge agus 100% methanol, chaidh sampallan plasma a chur ris na truinnsearan SPE agus chaidh an leaghan gu lèir a thoirt air falbh. Chaidh na sampallan a nighe (an toiseach le 5% methanol agus an uairsin 30% methanol) agus an cur às le 2% NH4OH/90% methanol. Às dèidh dhaibh an t-eluate a thiormachadh aig 55°C airson 99 mionaid aig sruth N2 seasmhach, chaidh na sampallan a lughdachadh ann an caolaichean àbhaisteach agus chaidh Aβ(1–40) a thomhas mar a chaidh a mhìneachadh gu h-àrd.
Mar a bheir thu luaidh air an artaigil seo: Urich, E. et al. Lìbhrigeadh bathair don eanchainn a’ cleachdadh peptidean gluasaid a chaidh an comharrachadh in vivo. an saidheans. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB agus Moos T. Lìbhrigeadh dhrogaichean macromholaciulach don eanchainn a’ cleachdadh leigheas cuimsichte. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., agus Martinez-Martinez, P. Lìbhrigeadh dhrogaichean peptide agus pròtain thairis air a’ bhacadh fala-eanchainn. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Am bacadh fala-eanchainn: bacadh ann an leasachadh dhrogaichean eanchainn. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, agus Byrd, A. Cothroman airson lìbhrigeadh dhrogaichean nas fheàrr agus targaideadh don eanchainn tro shlighe choroid plexus-CSF. Rannsachadh Cungaidh-leigheis 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Nuadh-leasachadh bith-chungaidhean le eich Trojan moileciuil airson lìbhrigeadh don eanchainn. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, còmhdhail peptide air a mheadhanachadh le gabhadair WM thairis air a’ bhacadh fala-eanchainn. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Meudaich treàdh eanchainn agus èifeachdas antibodies leigheasach le bhith a’ cleachdadh shuttles moileciuil monovalent. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Bidh còmhdhail gabhadair transferrin (TfR) a’ dearbhadh gabhail a-steach atharrachaidhean càirdeas de antibodies TfR san eanchainn. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).