Nature.com تي اچڻ لاءِ مهرباني. توهان محدود CSS سپورٽ سان برائوزر ورزن استعمال ڪري رهيا آهيو. بهترين تجربي لاءِ، اسان سفارش ڪريون ٿا ته توهان هڪ اپڊيٽ ٿيل برائوزر استعمال ڪريو (يا انٽرنيٽ ايڪسپلورر ۾ مطابقت واري موڊ کي غير فعال ڪريو). ان کان علاوه، جاري سپورٽ کي يقيني بڻائڻ لاءِ، اسان سائيٽ کي اسٽائل ۽ جاوا اسڪرپٽ کان سواءِ ڏيکاريون ٿا.
هڪ ئي وقت ٽن سلائڊن جو ڪاروسيل ڏيکاري ٿو. هڪ ئي وقت ٽن سلائڊن مان گذرڻ لاءِ پوئين ۽ اڳيون بٽڻ استعمال ڪريو، يا هڪ ئي وقت ٽن سلائڊن مان گذرڻ لاءِ آخر ۾ سلائڊر بٽڻ استعمال ڪريو.
رت-دماغ جي رڪاوٽ ۽ رت-دماغ جي رڪاوٽ بايوٿراپيوٽڪس ايجنٽن کي مرڪزي اعصابي نظام ۾ پنهنجن هدفن تائين پهچڻ کان روڪي ٿي، جنهن ڪري اعصابي بيمارين جي اثرائتي علاج ۾ رڪاوٽ پيدا ٿئي ٿي. وييو ۾ ناول دماغي ٽرانسپورٽرز کي دريافت ڪرڻ لاءِ، اسان هڪ T7 فيج پيپٽائيڊ لائبريري متعارف ڪرائي ۽ رت ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ (CSF) کي چوٿين جي ڪينيوليڊ شعوري وڏي پول ماڊل استعمال ڪندي سي ايس ايف ۾ سي ايس ايف ۾ سي ايس ايف ۾ سي ايس ايف ۾ تمام گهڻو افزوده ڪيو ويو. انفرادي اميدوار پيپٽائيڊس جي جاچ CSF ۾ 1000 گنا کان وڌيڪ افزودگي ظاهر ڪئي. دماغ ۾ پيپٽائيڊ-ثالثي پهچائڻ جي بايو ايڪٽيويٽي جي تصديق ڪئي وئي دماغي اسپائنل فلوئڊ ۾ ايميلائيڊ-β جي سطح ۾ 40٪ گهٽتائي سان سڃاڻپ ٿيل ناول ٽرانزٽ پيپٽائيڊ سان ڳنڍيل BACE1 پيپٽائيڊ انبيٽر استعمال ڪندي. اهي نتيجا ظاهر ڪن ٿا ته ان وييو فيج چونڊ طريقن ذريعي سڃاڻپ ڪيل پيپٽائيڊس شايد علاج جي اثر سان دماغ ۾ ميڪرو ماليڪيولز جي سسٽماتي ترسيل لاءِ ڪارآمد گاڏيون هجن.
مرڪزي اعصابي نظام (سي اين ايس) جي ٽارگيٽيڊ ٿراپي ريسرچ وڏي حد تائين بهتر ڪيل دوائن ۽ ايجنٽن جي سڃاڻپ تي ڌيان ڏنو آهي جيڪي سي اين ايس کي نشانو بڻائڻ واري خاصيتن کي ظاهر ڪن ٿا، انهن ميڪانيزم کي ڳولڻ تي گهٽ ڪوشش سان جيڪي دماغ تائين فعال دوا پهچائڻ کي هلائين ٿا. اهو هاڻي تبديل ٿيڻ شروع ٿي رهيو آهي ڇاڪاڻ ته دوا پهچائڻ، خاص طور تي وڏا ماليڪيول، جديد نيورو سائنس دوا جي ترقي جو هڪ لازمي حصو آهن. مرڪزي اعصابي نظام جو ماحول دماغي دماغي رڪاوٽ سسٽم پاران چڱي طرح محفوظ آهي، جنهن ۾ رت-دماغي رڪاوٽ (بي بي بي) ۽ رت-دماغي رڪاوٽ (بي سي بي بي) 1 شامل آهن، دماغ تائين دوائن پهچائڻ کي چئلينج بڻائي ٿو 1,2. اهو اندازو لڳايو ويو آهي ته تقريبن سڀئي وڏيون ماليڪيول دوائون ۽ 98٪ کان وڌيڪ ننڍيون ماليڪيول دوائون دماغ مان ختم ٿي وينديون آهن 3. اهو ئي سبب آهي ته نئين دماغي ٽرانسپورٽ سسٽم کي سڃاڻڻ تمام ضروري آهي جيڪي سي اين ايس 4,5 کي علاج واري دوائن جي موثر ۽ مخصوص ترسيل فراهم ڪن ٿا. بهرحال، بي بي بي ۽ بي سي ايس ايف بي پڻ دوا جي ترسيل لاءِ هڪ بهترين موقعو پيش ڪن ٿا ڇاڪاڻ ته اهي دماغ جي سڀني ڍانچي ۾ داخل ٿين ٿا ۽ ان جي وسيع ويسڪوليچر ذريعي داخل ٿين ٿا. اهڙيءَ طرح، دماغ تائين پهچائڻ جي غير ناگوار طريقن کي استعمال ڪرڻ جون موجوده ڪوششون گهڻو ڪري اينڊوجينس BBB6 ريڪٽر استعمال ڪندي ريڪٽر-ميڊيئيٽيڊ ٽرانسپورٽ (PMT) جي ميڪانيزم تي ٻڌل آهن. ٽرانسفرين ريڪٽر رستو 7،8 استعمال ڪندي تازين اهم ترقي جي باوجود، بهتر ملڪيتن سان نئين ترسيل سسٽم جي وڌيڪ ترقي جي ضرورت آهي. ان مقصد لاءِ، اسان جو مقصد پيپٽائڊس جي سڃاڻپ ڪرڻ هو جيڪي CSF ٽرانسپورٽ جي وچولي ڪرڻ جي قابل آهن، ڇاڪاڻ ته اهي اصولي طور تي CNS ڏانهن ميڪرو ماليڪيول پهچائڻ يا نوان ريڪٽر رستا کولڻ لاءِ استعمال ٿي سگهن ٿا. خاص طور تي، دماغي اسپائنل سسٽم (BBB ۽ BSCFB) جا مخصوص ريڪٽر ۽ ٽرانسپورٽر بايوٿراپيٽڪ دوائن جي فعال ۽ مخصوص ترسيل لاءِ امڪاني هدف طور ڪم ڪري سگهن ٿا. دماغي اسپائنل فلوئڊ (CSF) ڪورائيڊ پلڪسس (CS) جو هڪ خفيه پيداوار آهي ۽ دماغ جي انٽرسٽيشل فلوئڊ سان سڌو سنئون رابطي ۾ آهي subarachnoid space ۽ ventricular space4 ذريعي. تازو اهو ڏيکاريو ويو آهي ته subarachnoid cerebrospinal fluid دماغ جي انٽرسٽيٽيم ۾ تمام گهڻو ڦهلجي ٿو. اسان اميد ٿا ڪريون ته هن سبارچنائيڊ انفلو ٽريڪٽ استعمال ڪندي يا سڌو سنئون بي بي بي ذريعي پيرينچيمل اسپيس تائين رسائي حاصل ڪنداسين. هن کي حاصل ڪرڻ لاءِ، اسان هڪ مضبوط ان ويوو فيج چونڊ حڪمت عملي لاڳو ڪئي جيڪا مثالي طور تي انهن ٻن مختلف رستن مان ڪنهن به ذريعي منتقل ٿيندڙ پيپٽائڊس جي سڃاڻپ ڪري ٿي.
هاڻي اسان هڪ ترتيب وار ان ويوو فيج ڊسپلي اسڪريننگ طريقو بيان ڪريون ٿا جنهن ۾ CSF نموني سان گڏ اعليٰ ٿرو پُٽ سيڪوئنسنگ (HTS) شامل آهي ته جيئن ابتدائي چونڊ رائونڊن کي اعليٰ لائبريري تنوع سان مانيٽر ڪري سگهجي. رت جي آلودگي کان بچڻ لاءِ مستقل طور تي امپلانٽ ٿيل وڏي سسٽرنا (CM) ڪينولا سان شعوري چوٿن تي اسڪريننگ ڪئي وئي. اهم طور تي، هي طريقو دماغ جي نشانو بڻائڻ ۽ پيپٽائڊس ٻنهي کي چونڊيندو آهي جن ۾ دماغي رڪاوٽ پار ٽرانسپورٽ سرگرمي هوندي آهي. اسان T7 فيجز کي انهن جي ننڍڙي سائيز (~60 nm)10 جي ڪري استعمال ڪيو ۽ تجويز ڪيو ته اهي ويسڪلز جي ٽرانسپورٽ لاءِ موزون آهن جيڪي اينڊوٿيليل ۽/يا ايپيٿيليل-ميڊولا رڪاوٽ جي ٽرانس سيلولر ڪراسنگ جي اجازت ڏين ٿا. پيننگ جي چئن رائونڊن کان پوءِ، فيج آبادي کي الڳ ڪيو ويو جيڪو مضبوط ان ويوو CSF افزودگي ۽ دماغي مائڪرو ويسل ايسوسيئيشن ڏيکاري ٿو. اهم طور تي، اسان پنهنجي نتيجن جي تصديق ڪرڻ جي قابل هئاسين اهو ظاهر ڪندي ته ترجيحي ۽ ڪيميائي طور تي ٺهيل بهترين اميدوار پيپٽائڊس پروٽين ڪارگو کي دماغي اسپائنل فلوئڊ ۾ منتقل ڪرڻ جي قابل آهن. پهرين، سي اين ايس جا فارماڪوڊائنامڪ اثرات هڪ ليڊنگ ٽرانزٽ پيپٽائيڊ کي BACE1 پيپٽائيڊ جي انابيٽر سان گڏ ڪرڻ سان قائم ڪيا ويا. ان کان علاوه اهو ظاهر ڪرڻ ته ان ويوو فنڪشنل اسڪريننگ حڪمت عمليون ناول دماغي ٽرانسپورٽ پيپٽائيڊس کي مؤثر پروٽين ڪارگو ڪيريئر جي طور تي سڃاڻي سگهن ٿيون، اسان اميد ڪريون ٿا ته ساڳيا فنڪشنل چونڊ طريقا پڻ ناول دماغي ٽرانسپورٽ رستن جي سڃاڻپ ۾ اهم بڻجي ويندا.
پليڪ فارمنگ يونٽس (PFU) جي بنياد تي، فيج پيڪنگنگ جي مرحلي کان پوءِ، تقريبن 109 جي تنوع سان بي ترتيب 12-mer لڪير T7 فيج پيپٽائڊس جي هڪ لائبريري ٺاهي ۽ ٺاهي وئي (مواد ۽ طريقا ڏسو). اهو نوٽ ڪرڻ ضروري آهي ته اسان ان ويوو پيننگ کان اڳ هن لائبريري جو احتياط سان تجزيو ڪيو. تبديل ٿيل پرائمرز استعمال ڪندي فيج لائبريري جي نمونن جي پي سي آر امپليفڪيشن ايمپليڪون پيدا ڪيون جيڪي سڌو سنئون HTS تي لاڳو ٿين ٿيون (ضمني شڪل 1a). الف) HTS11 سيڪوئنسنگ غلطين جي ڪري، ب) پرائمرز جي معيار تي اثر (NNK)1-12، ۽ ج) اسٽينڊ بائي لائبريري ۾ وائلڊ-ٽائپ (wt) فيج (اسڪيليٽن انسرٽس) جي موجودگي جي ڪري، صرف تصديق ٿيل سيڪوئنس معلومات ڪڍڻ لاءِ هڪ سيڪوئنس فلٽرنگ جو طريقو لاڳو ڪيو ويو (ضمني شڪل 1b). اهي فلٽر مرحلا سڀني HTS سيڪوئنسنگ لائبريرين تي لاڳو ٿين ٿا. معياري لائبريري لاءِ، ڪل 233,868 ريڊز حاصل ڪيا ويا، جن مان 39٪ فلٽر معيار کي پاس ڪيو ۽ لائبريري تجزيو ۽ ايندڙ رائونڊ لاءِ چونڊ لاءِ استعمال ڪيا ويا (ضمني شڪل 1c–e). ريڊز بنيادي طور تي 3 بنيادي جوڙن جي ڊيگهه جا ضرب هئا جن جي چوٽي 36 نيوڪليوٽائڊس هئي (ضمني شڪل 1c)، لائبريري ڊيزائن (NNK) 1-12 جي تصديق ڪندي. خاص طور تي، لائبريري جي ميمبرن مان تقريبن 11٪ ۾ 12-dimensional وائلڊ-ٽائيپ (wt) بيڪ بون PAGISRELVDKL انسرٽ شامل هو، ۽ تقريبن اڌ تسلسل (49٪) ۾ داخل ٿيڻ يا حذف ٿيڻ شامل هئا. لائبريري لائبريري جي HTS لائبريري ۾ پيپٽائڊس جي اعلي تنوع جي تصديق ڪئي: 81٪ کان وڌيڪ پيپٽائڊس سيڪوئنس صرف هڪ ڀيرو مليا ۽ صرف 1.5٪ ≥4 ڪاپين ۾ واقع ٿيا (ضمني شڪل 2a). ريپرٽوائر ۾ سڀني 12 پوزيشن تي امينو ايسڊ (aa) جي فريڪوئنسي خراب ٿيل NKK ريپرٽوائر (ضمني شڪل 2b) پاران پيدا ٿيندڙ ڪوڊون جي تعداد لاءِ متوقع فريڪوئنسي سان چڱي طرح لاڳاپو رکي ٿي. انهن انسرٽس پاران انڪوڊ ٿيل aa باقيات جي مشاهدي ڪيل فريڪوئنسي حساب ڪيل فريڪوئنسي (r = 0.893) (ضمني شڪل 2c) سان چڱي طرح سان لاڳاپو رکي ٿي. انجڪشن لاءِ فيج لائبريرين جي تياري ۾ اينڊوٽوڪسن جي واڌ ۽ ختم ڪرڻ جا مرحلا شامل آهن. اهو اڳ ۾ فيج لائبريرين جي تنوع کي گهٽائڻ لاءِ ممڪن طور تي ڏيکاريو ويو آهي 12,13. تنهن ڪري، اسان هڪ پليٽ-ايمپليفائيڊ فيج لائبريري کي ترتيب ڏنو جيڪو اينڊوٽوڪسن هٽائڻ کان گذري چڪو هو ۽ ان جو مقابلو اصل لائبريري سان ڪيو ته جيئن AA جي فريڪوئنسي جو اندازو لڳائي سگهجي. اصل پول ۽ ايمپليفائيڊ ۽ پاڪ ٿيل پول (ضمني شڪل 2d) جي وچ ۾ هڪ مضبوط لاڳاپو (r = 0.995) ڏٺو ويو، جيڪو ظاهر ڪري ٿو ته T7 فيج استعمال ڪندي پليٽن تي ايمپليفائيڊ ڪلون جي وچ ۾ مقابلو وڏي تعصب جو سبب نه بڻيو. هي مقابلو هر لائبريري ۾ ٽرائپٽائڊ موٽف جي فريڪوئنسي تي ٻڌل آهي، ڇاڪاڻ ته لائبريرين جي تنوع (~109) کي HTS سان به مڪمل طور تي قبضو نه ٿو ڪري سگهجي. هر پوزيشن تي AA جي فريڪوئنسي تجزيي داخل ٿيل ريپرٽوائر جي آخري ٽن پوزيشنن ۾ هڪ ننڍڙي پوزيشن تي منحصر تعصب ظاهر ڪيو (ضمني شڪل 2e). نتيجي ۾، اسان اهو نتيجو ڪڍيو ته لائبريري جي معيار ۽ تنوع قابل قبول هئا ۽ چونڊ جي ڪيترن ئي دورن جي وچ ۾ فيج لائبريرين جي واڌ ۽ تياري جي ڪري تنوع ۾ صرف معمولي تبديليون ڏٺيون ويون.
سيريل سيريبروسپينل فلوئڊ سيمپلنگ کي سرجري طور تي شعوري چوهڙن جي سي ايم ۾ ڪينولا امپلانٽ ڪري سگهجي ٿو ته جيئن BBB ۽/يا BCSFB ذريعي نس ۾ داخل ڪيل T7 فيج (iv) جي سڃاڻپ کي آسان بڻائي سگهجي (شڪل 1a-b). اسان ان ويوو سليڪشن (شڪل 1c) جي پهرين ٽن رائونڊ ۾ ٻه آزاد چونڊ هٿيار (بازو A ۽ B) استعمال ڪيا. اسان چونڊ جي پهرين ٽن رائونڊ ۾ متعارف ڪرايل فيج جي ڪل مقدار کي گهٽائي چونڊ جي سختي کي بتدريج وڌايو. پيننگ جي چوٿين رائونڊ لاءِ، اسان شاخن A ۽ B مان نمونن کي گڏ ڪيو ۽ ٽي اضافي آزاد چونڊون ڪيون. هن ماڊل ۾ T7 فيج پارٽيڪلز جي ان ويوو خاصيتن جو مطالعو ڪرڻ لاءِ، جهنگلي قسم جي فيج (PAGISRELVDKL ماسٽر انسرٽ) کي دم جي رڳ ذريعي چوهڙن ۾ داخل ڪيو ويو. مختلف وقتن تي سيريبروسپينل فلوئڊ ۽ رت مان فيجز جي بحالي ڏيکاري ٿي ته نسبتا ننڍا T7 آئيڪوساهڊرل فيجز رت جي ڪمپارٽمينٽ مان تيز شروعاتي ڪليئرنس مرحلو هئا (ضمني شڪل 3). چوٿين جي ڏنل ٽائيٽرز ۽ رت جي مقدار جي بنياد تي، اسان حساب ڪيو ته صرف تقريبن 1٪ wt. انتظام ٿيل دوز مان فيج رت ۾ نس ۾ داخل ٿيڻ کان 10 منٽن بعد رت ۾ دريافت ڪيو ويو. هن شروعاتي تيز گهٽتائي کان پوءِ، هڪ سست پرائمري ڪليئرنس 27.7 منٽن جي اڌ زندگي سان ماپيو ويو. اهم طور تي، CSF ڪمپارٽمينٽ مان صرف تمام گهٽ فيج حاصل ڪيا ويا، جيڪو CSF ڪمپارٽمينٽ ۾ جهنگلي قسم جي فيج جي منتقلي لاءِ گهٽ پس منظر کي ظاهر ڪري ٿو (ضمني شڪل 3). سراسري طور تي، رت ۾ T7 فيج جي صرف 1 x 10-3٪ ٽائيٽر ۽ شروعاتي طور تي شامل ٿيل فيج جي 4 x 10-8٪ پوري نموني جي مدت (0-250 منٽ) دوران دماغي اسپائنل فلوئڊ ۾ ڳوليا ويا. خاص طور تي، دماغي اسپائنل فلوئڊ ۾ جهنگلي قسم جي فيج جي اڌ زندگي (25.7 منٽ) رت ۾ مشاهدو ڪيل ساڳئي هئي. اهي ڊيٽا ظاهر ڪن ٿا ته سي ايم-ڪينوليڊ ٿيل چوٿن ۾ سي ايس ايف ڪمپارٽمينٽ کي رت کان الڳ ڪرڻ واري رڪاوٽ برقرار آهي، جيڪا فيج لائبريرين جي ان ويو چونڊ کي ڪلون جي سڃاڻپ ڪرڻ جي اجازت ڏئي ٿي جيڪي رت مان سي ايس ايف ڪمپارٽمينٽ ۾ آساني سان منتقل ڪيا وڃن ٿا.
(الف) هڪ وڏي تلاءَ مان دماغي اسپائنل فلوئڊ (سي ايس ايف) جي ٻيهر نموني لاءِ هڪ طريقو قائم ڪرڻ. (ب) مرڪزي اعصابي نظام (سي اين ايس) جي رڪاوٽ جي سيلولر مقام ۽ رت جي دماغ جي رڪاوٽ (بي بي بي) ۽ رت جي دماغ جي رڪاوٽ کي پار ڪندڙ پيپٽائڊس جي سڃاڻپ لاءِ استعمال ٿيندڙ چونڊ حڪمت عملي ڏيکاريندڙ ڊاگرام. (ج) ان ويوو فيج ڊسپلي اسڪريننگ فلو چارٽ. چونڊ جي هر دور ۾، فيجز (تيرن جي اندر جانورن جي سڃاڻپ ڪندڙ) کي نس ۾ داخل ڪيو ويو. چونڊ جي چوٿين دور تائين ٻه آزاد متبادل شاخون (اي، بي) الڳ الڳ رکيون ويون آهن. چونڊ جي 3 ۽ 4 رائونڊ لاءِ، سي ايس ايف مان ڪڍيل هر فيج ڪلون کي دستي طور تي ترتيب ڏنو ويو. (د) T7 پيپٽائڊ لائبريري (2 x 1012 فيجز/جانور) جي نس ۾ داخل ٿيڻ کان پوءِ ٻن ڪينيول ٿيل چوٿن ۾ چونڊ جي پهرين دور دوران رت (ڳاڙهي دائرن) ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ (سائي ٽڪنڊي) کان الڳ ٿيل فيج جي حرڪيات. نيرو چورس رت ۾ فيج جي سراسري شروعاتي ڪنسنٽريشن کي ظاهر ڪن ٿا، جيڪو انجيڪٽ ٿيل فيج جي مقدار مان ڳڻيو ويندو آهي، ڪل رت جي مقدار کي حساب ۾ رکندي. ڪارا چورس رت جي فيج ڪنسنٽريشن مان نڪتل y لائن جي چوراهي جي نقطي کي ظاهر ڪن ٿا. (e,f) پيپٽائيڊ ۾ مليل سڀني ممڪن اوورليپنگ ٽرائپٽائڊ موٽفس جي لاڳاپي فريڪوئنسي ۽ ورڇ پيش ڪريو. 1000 ريڊنگز ۾ مليل موٽفس جو تعداد ڏيکاريو ويو آهي. خاص طور تي (p < 0.001) افزوده موٽفس ڳاڙهي نقطن سان نشان لڳل آهن. (e) جانورن جي #1.1 ۽ #1.2 مان رت مان نڪتل فيج سان انجيڪٽ ٿيل لائبريري جي ٽرائپٽائڊ موٽفس جي لاڳاپي فريڪوئنسي جي مقابلي ۾ ڪوريليشن اسڪٽرپلٽ. (f) رت ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ ۾ الڳ ٿيل جانورن جي فيج ٽرائپٽائڊ موٽفس #1.1 ۽ #1.2 جي لاڳاپي فريڪوئنسي جي مقابلي ۾ ڪوريليشن اسڪٽرپلٽ. (g، h) ٻنهي جانورن ۾ ان ويوو چونڊ جي هڪ دور کان پوءِ رت ۾ افزوده فيج (g) بمقابله انجيڪٽ ٿيل لائبريريون ۽ CSF (h) ۾ افزوده فيج جي تسلسل ID نمائندگي. هڪ اکر ڪوڊ جي سائيز ظاهر ڪري ٿي ته اهو امينو ايسڊ ڪيتري ڀيرا ان پوزيشن تي ٿئي ٿو. سائو = پولر، جامني = غير جانبدار، نيرو = بنيادي، ڳاڙهو = تيزابي ۽ ڪارو = هائيڊروفوبڪ امينو ايسڊ. شڪل 1a، b ايڊورڊ يوريچ پاران ڊزائين ۽ تيار ڪئي وئي هئي.
اسان ٻن سي ايم انسٽرومينٽ ريٽس (ڪليڊ اي ۽ بي) ۾ فيج پيپٽائيڊ لائبريري داخل ڪئي ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ ۽ رت مان فيج کي الڳ ڪيو (شڪل 1d). لائبريري جي شروعاتي تيز صفائي جهنگلي قسم جي فيج جي مقابلي ۾ گهٽ واضح هئي. ٻنهي جانورن ۾ انجيڪٽ ٿيل لائبريري جي سراسري اڌ زندگي رت ۾ 24.8 منٽ هئي، جهنگلي قسم جي فيج وانگر، ۽ CSF ۾ 38.5 منٽ. هر جانور مان رت ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ فيج جا نمونا HTS جي تابع ڪيا ويا ۽ سڀني سڃاڻپ ٿيل پيپٽائيڊس کي هڪ مختصر ٽرائپٽائيڊ موٽف جي موجودگي لاءِ تجزيو ڪيو ويو. ٽرائپٽائيڊ موٽف چونڊيو ويو ڇاڪاڻ ته اهي ساخت جي ٺهڻ ۽ پيپٽائيڊ-پروٽين جي رابطي لاءِ گهٽ ۾ گهٽ بنياد فراهم ڪن ٿا 14,15. اسان انجيڪٽ ٿيل فيج لائبريري ۽ ٻنهي جانورن جي رت مان نڪتل ڪلون جي وچ ۾ موٽف جي ورڇ ۾ هڪ سٺو تعلق ڳولي لڌو (شڪل 1e). ڊيٽا ظاهر ڪري ٿو ته لائبريري جي جوڙجڪ رت جي ڪمپارٽمينٽ ۾ صرف معمولي طور تي افزوده آهي. ويب لوگو 16 سافٽ ويئر جي موافقت استعمال ڪندي هر پوزيشن تي امينو ايسڊ فريڪوئنسي ۽ اتفاق راءِ جو وڌيڪ تجزيو ڪيو ويو. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، اسان رت جي گلائسين جي باقيات ۾ هڪ مضبوط افزودگي ڏٺي (شڪل 1g). جڏهن رت جو مقابلو CSF مان چونڊيل ڪلون سان ڪيو ويو، مضبوط چونڊ ۽ ڪجهه نقشن جي چونڊ کي ڏٺو ويو (شڪل 1f)، ۽ ڪجهه امينو ايسڊ ترجيحي طور تي 12 ميمبرن (شڪل 1h) ۾ اڳواٽ مقرر ڪيل پوزيشن تي موجود هئا. خاص طور تي، انفرادي جانورن ۾ دماغي اسپائنل فلوئڊ ۾ خاص طور تي فرق هو، جڏهن ته ٻنهي جانورن ۾ رت جي گلائسين افزودگي ڏٺي وئي (ضمني شڪل 4a-j). جانورن #1.1 ۽ #1.2 جي دماغي اسپائنل فلوئڊ ۾ تسلسل ڊيٽا جي سخت فلٽرنگ کان پوءِ، ڪل 964 ۽ 420 منفرد 12-مير پيپٽائڊس حاصل ڪيا ويا (ضمني شڪل 1d-e). الڳ ٿيل فيج ڪلون کي وڌايو ويو ۽ ان ويوو چونڊ جي ٻئي دور جي تابع ڪيو ويو. چونڊ جي ٻئي دور مان نڪتل فيج کي هر جانور ۾ HTS جي تابع ڪيو ويو ۽ سڀني سڃاڻپ ٿيل پيپٽائڊس کي ٽرائيپيپٽائڊ موٽيف جي موجودگي جو تجزيو ڪرڻ لاءِ هڪ موٽف سڃاڻپ پروگرام ۾ ان پٽ طور استعمال ڪيو ويو (شڪل 2a، b، ef). CSF مان حاصل ڪيل فيج جي پهرين چڪر جي مقابلي ۾، اسان شاخن A ۽ B ۾ CSF ۾ ڪيترن ئي موٽف جي وڌيڪ چونڊ ۽ غير چونڊ جو مشاهدو ڪيو (شڪل 2). هڪ نيٽ ورڪ سڃاڻپ الگورتھم لاڳو ڪيو ويو ته اهو طئي ڪيو وڃي ته ڇا اهي مسلسل تسلسل جي مختلف نمونن جي نمائندگي ڪن ٿا. متبادل ڪليڊ A (شڪل 2c، d) ۽ ڪليڊ B (شڪل 2g، h) ۾ CSF پاران حاصل ڪيل 12-dimensional sequences جي وچ ۾ هڪ واضح مماثلت ڏٺي وئي. هر شاخ ۾ جمع ٿيل تجزيي 12-mer پيپٽائڊس لاءِ مختلف چونڊ پروفائلز (ضمني شڪل 5c، d) ۽ چونڊ جي پهرين دور جي مقابلي ۾ چونڊ جي ٻئي دور کان پوءِ جمع ٿيل ڪلونز لاءِ وقت سان گڏ CSF/رت جي ٽائيٽر تناسب ۾ اضافو ظاهر ڪيو (ضمني شڪل 5e).
ان ويوو فنڪشنل فيج ڊسپلي سليڪشن جي ٻن لڳاتار دورن ذريعي دماغي اسپائنل فلوئڊ ۾ نقشن ۽ پيپٽائڊس جي افزودگي.
هر جانور (جانور #1.1 ۽ #1.2) جي پهرين دور مان حاصل ڪيل سڀني دماغي اسپائنل فلوئڊ فيجز کي گڏ ڪيو ويو، وڌايو ويو، HT-سيڪونس ڪيو ويو ۽ گڏجي ٻيهر انجيڪٽ ڪيو ويو (2 x 1010 فيجز/جانور) 2 SM ڪينول ٿيل چوٿون (#1.1 → #). 2.1 ۽ 2.2، 1.2 → 2.3 ۽ 2.4). (a,b,e,f) پهرين ۽ ٻئي چونڊ دور ۾ سڀني CSF-نڪتل فيجز جي ٽرائپيپٽائيڊ موٽفز جي نسبتي تعدد جو مقابلو ڪندڙ ڪوريليشن اسڪيٽرلاٽ. ٻنهي رخن ۾ پيپٽائيڊس ۾ مليل سڀني ممڪن اوورليپنگ ٽرائپيپٽائيڊس جي نمائندگي ڪندڙ موٽفز جي نسبتي تعدد ۽ ورڇ. 1000 ريڊنگز ۾ مليل موٽفز جو تعداد ڏيکاريو ويو آهي. موٽفز جيڪي خاص طور تي (p < 0.001) چونڊيل هئا يا مقابلي واري لائبريرين مان هڪ ۾ خارج ڪيا ويا هئا انهن کي ڳاڙهي نقطن سان نمايان ڪيو ويو آهي. (c، d، g، h) ان ويوو چونڊ جي رائونڊ 2 ۽ 1 جي بنياد تي سڀني CSF سان مالا مال 12 امينو ايسڊ ڊگھي تسلسلن جي تسلسل لوگو نمائندگي. هڪ اکر ڪوڊ جي سائيز ظاهر ڪري ٿي ته اهو امينو ايسڊ ڪيتري ڀيرا ان پوزيشن تي ٿئي ٿو. لوگو جي نمائندگي ڪرڻ لاءِ، ٻن چونڊ رائونڊن جي وچ ۾ انفرادي جانورن مان نڪتل CSF تسلسلن جي فريڪوئنسي جو مقابلو ڪيو ويندو آهي ۽ ٻئي رائونڊ ۾ افزوده تسلسل ڏيکاريا ويندا آهن: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ۽ (h) #1.2–#2.4. (c، d) جانورن نمبر 2.1 ۽ نمبر 2.2 يا (g، h) جانورن نمبر 2.3 ۽ نمبر 2.4 ۾ ڏنل پوزيشن تي سڀ کان وڌيڪ افزوده امينو ايسڊ رنگ ۾ ڏيکاريا ويا آهن. سائو = قطبي، جامني = غير جانبدار، نيرو = بنيادي، ڳاڙهو = تيزابي ۽ ڪارو = هائيڊروفوبڪ امينو ايسڊ.
چونڊ جي ٽئين دور کان پوءِ، اسان ٻن جانورن کان الڳ ٿيل 332 CSF-reconstituted phage ڪلون مان 124 منفرد پيپٽائيڊ تسلسل (#3.1 ۽ #3.2) جي سڃاڻپ ڪئي (ضمني شڪل 6a). تسلسل LGSVS (18.7%) ۾ سڀ کان وڌيڪ نسبتي تناسب هو، ان کان پوءِ جهنگلي قسم جا داخل PAGISRELVDKL (8.2%)، MRWFFSHASQGR (3%)، DVAKVS (3%)، TWLFSLG (2.2%)، ۽ SARGSWREIVSLS (2.2%). آخري چوٿين دور ۾، اسان ٽن الڳ جانورن مان ٻه آزاد طور تي چونڊيل شاخون گڏ ڪيون (شڪل 1c). CSF مان حاصل ڪيل 925 ترتيب واري فيج ڪلون مان، چوٿين دور ۾ اسان 64 منفرد پيپٽائيڊ تسلسل (ضمني شڪل 6b) ڏٺا، جن مان جهنگلي قسم جي فيج جو نسبتي تناسب 0.8% تائين گهٽجي ويو. چوٿين دور ۾ سڀ کان وڌيڪ عام CSF ڪلون LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18٪)، LGSVS (17٪)، GFVRFRLSNTR (14٪)، KVAWRVFSLFWK (7٪)، SVHGV (5٪)، GRPQKINGARVC (3.6٪) ۽ RLSSVDSDLSGC (3، 2٪) هئا. %). چونڊيل پيپٽائڊس جي ڊيگهه جي حد لائبريري پرائمرز ۾ نيوڪليوٽائيڊ داخل ڪرڻ/حذف ڪرڻ يا وقت کان اڳ اسٽاپ ڪوڊن جي ڪري آهي جڏهن NNK لائبريري ڊيزائن لاءِ ڊيجنريٽ ڪوڊن استعمال ڪندا آهن. وقت کان اڳ اسٽاپ ڪوڊن ننڍا پيپٽائڊس پيدا ڪن ٿا ۽ چونڊيا ويندا آهن ڇاڪاڻ ته انهن ۾ سازگار aa موٽف شامل آهن. ڊگھا پيپٽائڊس مصنوعي لائبريرين جي پرائمرز ۾ داخل ڪرڻ/حذف ڪرڻ جي نتيجي ۾ ٿي سگهن ٿا. اهو فريم کان ٻاهر ٺهيل اسٽاپ ڪوڊن کي پوزيشن ڪري ٿو ۽ ان کي پڙهي ٿو جيستائين هڪ نئون اسٽاپ ڪوڊن هيٺئين طرف ظاهر نه ٿئي. عام طور تي، اسان نموني آئوٽ پٽ ڊيٽا سان ان پٽ ڊيٽا جو مقابلو ڪندي سڀني چئن چونڊ رائونڊ لاءِ افزودگي عنصرن جو حساب لڳايو. اسڪريننگ جي پهرين دور لاءِ، اسان جهنگلي قسم جي فيج ٽائيٽرز کي غير مخصوص پس منظر جي حوالي طور استعمال ڪيو. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته، پهرين CSF چڪر ۾ منفي فيج چونڊ تمام مضبوط هئي، پر رت ۾ نه (شڪل 3a)، جيڪا شايد پيپٽائڊ لائبريري جي گهڻن ميمبرن جي CSF ڪمپارٽمينٽ ۾ غير فعال ڦهلاءَ جي گهٽ امڪان جي ڪري هجي يا لاڳاپيل فيجز رت جي وهڪري مان بيڪٽيريوفيجز جي ڀيٽ ۾ وڌيڪ موثر طريقي سان برقرار رکڻ يا هٽائڻ جو رجحان رکن ٿا. بهرحال، پيننگ جي ٻئي دور ۾، CSF ۾ فيجز جي مضبوط چونڊ ٻنهي ڪليڊز ۾ ڏٺي وئي، جنهن مان اهو ظاهر ٿئي ٿو ته پوئين دور پيپٽائڊس ڏيکاريندڙ فيجز ۾ افزوده ڪيو ويو هو جيڪي CSF اپٽيڪ کي فروغ ڏين ٿا (شڪل 3a). ٻيهر، اهم رت جي افزودگي کان سواءِ. ٽئين ۽ چوٿين دور ۾ پڻ، فيج ڪلونز CSF ۾ خاص طور تي افزوده ڪيا ويا هئا. چونڊ جي آخري ٻن دورن جي وچ ۾ هر منفرد پيپٽائڊ تسلسل جي نسبتي تعدد جي مقابلي ۾، اسان ڏٺو ته چونڊ جي چوٿين دور ۾ تسلسل اڃا به وڌيڪ افزوده هئا (شڪل 3b). ٻنهي پيپٽائيڊ اورينٽيشن استعمال ڪندي سڀني 64 منفرد پيپٽائيڊ تسلسل مان ڪل 931 ٽرائيپيپٽائيڊ نقش ڪڍيا ويا. چوٿين دور ۾ سڀ کان وڌيڪ افزوده نقشن کي انجيڪٽ ٿيل لائبريري (ڪٽ آف: 10٪ افزودگي) جي مقابلي ۾ سڀني دورن ۾ انهن جي افزودگي پروفائلز لاءِ وڌيڪ ويجهي کان جانچيو ويو (ضمني شڪل 6c). چونڊ جي عام نمونن مان ظاهر ٿيو ته گهڻو ڪري مطالعي ڪيل نقش ٻنهي چونڊ شاخن جي سڀني پوئين دورن ۾ افزوده ڪيا ويا. تاهم، ڪجهه نقش (مثال طور SGL، VSG، LGS GSV) بنيادي طور تي متبادل ڪليڊ A مان هئا، جڏهن ته ٻيا (مثال طور FGW، RTN، WGF، NTR) متبادل ڪليڊ B ۾ افزوده ڪيا ويا.
سي ايس ايف سان افزوده فيج-ڊسپلي ٿيل پيپٽائڊس ۽ بايوٽينيلٽيڊ ليڊر پيپٽائڊس جي سي ايس ايف ٽرانسپورٽ جي تصديق جيڪي اسٽريپٽاوڊين پيل لوڊ سان ڳنڍيل آهن.
(a) سڀني چئن رائونڊن (R1-R4) ۾ انجيڪشن ٿيل (ان پٽ = I) فيج (PFU) ٽائيٽرز ۽ طئي ٿيل CSF فيج ٽائيٽرز (آئوٽ پُٽ = O) جي بنياد تي ڳڻپيل افزودگي تناسب. آخري ٽن رائونڊن (R2-R4) لاءِ افزودگي عنصرن کي وزن جي ڊيٽا سان پوئين رائونڊ ۽ پهرين رائونڊ (R1) جي مقابلي ۾ ڳڻيو ويو. کليل بار دماغي اسپائنل فلوئڊ آهن، ڇانوَ وارا بار پلازما آهن. (***p<0.001، شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ جي بنياد تي). (b) سڀ کان وڌيڪ گهڻائي فيج پيپٽائڊس جي فهرست، چونڊ جي رائونڊ 4 کان پوءِ CSF ۾ گڏ ڪيل سڀني فيجز جي انهن جي نسبتي تناسب جي مطابق درجه بندي ڪئي وئي آهي. ڇهه سڀ کان وڌيڪ عام فيج ڪلون رنگ ۾ نمايان ڪيا ويا آهن، نمبر ۽ انهن جي افزودگي عنصرن کي چونڊ جي رائونڊ 3 ۽ 4 جي وچ ۾ (ان سيٽس). (c,d) ڇهن سڀ کان وڌيڪ افزودگي فيج ڪلون، خالي فيج ۽ والدين فيج پيپٽائڊ لائبريريون راؤنڊ 4 مان انفرادي طور تي CSF نموني ماڊل ۾ تجزيو ڪيون ويون. CSF ۽ رت جا نمونا ڏنل وقت جي پوائنٽن تي گڏ ڪيا ويا. (c) 6 اميدوار فيج ڪلون (2 x 1010 فيج/جانور)، خالي فيج (#1779) (2 x 1010 فيج/جانور) ۽ اسٽاڪ فيج پيپٽائڊ لائبريريون (2 x 1012 فيج/جانور) جي برابر مقدار ۾ گهٽ ۾ گهٽ 3 سي ايم انجيڪٽ ڪريو ڪينول ٿيل جانور کي الڳ الڳ دم جي رڳ ذريعي ڏنو ويندو آهي. هر انجيڪٽ ٿيل فيج ڪلون ۽ فيج پيپٽائڊ لائبريري جي CSF فارماڪوڪائنيٽڪس وقت سان ڏيکاريل آهي. (d) نموني جي وقت دوران سڀني بحال ٿيل فيج/mL لاءِ سراسري CSF/رت جو تناسب ڏيکاري ٿو. (e) چار مصنوعي ليڊر پيپٽائڊس ۽ هڪ اسڪرمبلڈ ڪنٽرول بايوٽين سان اسٽريپٽاوڊين سان انهن جي N-ٽرمينس (ٽيٽرمر ڊسپلي) ذريعي ڳنڍيل هئا جنهن کان پوءِ انجڪشن (ٽيل وين iv، 10 ملي گرام اسٽريپٽاوڊين/ڪلوگرام). گهٽ ۾ گهٽ ٽي انٽيوبيٽڊ چوٿا (N = 3). CSF جا نمونا ڏنل وقت جي پوائنٽن تي گڏ ڪيا ويا ۽ CSF اينٽي اسٽريپٽويڊن ELISA (nd = نه مليو) ذريعي اسٽريپٽويڊن جي ڪنسنٽريشن جي ماپ ڪئي وئي. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA ٽيسٽ جي بنياد تي). (f) چونڊ جي چوٿين دور مان ٻين چونڊيل فيج پيپٽويڊ ڪلون سان سڀ کان وڌيڪ افزوده فيج پيپٽويڊن ڪلون #2002 (جامني) جي امينو ايسڊ جي ترتيب جو مقابلو. هڪجهڙا ۽ ساڳيا امينو ايسڊ جا ٽڪرا رنگ-ڪوڊ ٿيل آهن.
چوٿين رائونڊ (شڪل 3b) ۾ سڀني افزوده فيجز مان، CSF نموني ماڊل ۾ وڌيڪ انفرادي تجزيي لاءِ ڇهه اميدوار ڪلون چونڊيا ويا. ڇهه اميدوار فيج، خالي فيج (ڪوبه داخل نه ڪيو ويو) ۽ پروفيج پيپٽائڊ لائبريرين جي برابر مقدار ٽن ڪينيوليڊ CM جانورن ۾ داخل ڪئي وئي، ۽ فارماڪوڪائنيٽڪس CSF (شڪل 3c) ۽ رت (ضمني شڪل 7) جي اسيس ۾ طئي ڪيا ويا. آزمائش ڪيل سڀني فيج ڪلونز CSF ڪمپارٽمينٽ کي خالي ڪنٽرول فيج (#1779) کان 10-1000 ڀيرا وڌيڪ سطح تي نشانو بڻايو. مثال طور، ڪلون #2020 ۽ #2077 ۾ ڪنٽرول فيج کان تقريباً 1000 ڀيرا وڌيڪ CSF ٽائيٽر هئا. هر چونڊيل پيپٽائڊ جو فارماڪوڪائنيٽڪ پروفائل مختلف آهي، پر انهن سڀني ۾ CSF هومنگ جي اعلي صلاحيت آهي. اسان ڪلون #1903 ۽ #2011 لاءِ وقت سان گڏ مسلسل گهٽتائي ڏٺي، جڏهن ته ڪلون #2077، #2002 ۽ #2009 لاءِ پهرين 10 منٽن دوران واڌ فعال ٽرانسپورٽ جي نشاندهي ڪري سگهي ٿي پر ان جي تصديق ڪرڻ جي ضرورت آهي. ڪلون #2020، #2002، ۽ #2077 اعليٰ سطحن تي مستحڪم ٿيا، جڏهن ته ڪلون #2009 جي CSF ڪنسنٽريشن شروعاتي واڌ کان پوءِ آهستي آهستي گهٽجي وئي. پوءِ اسان هر CSF اميدوار جي نسبتي تعدد جو مقابلو ان جي رت جي ڪنسنٽريشن سان ڪيو (شڪل 3d). هر نموني جي وقت تي هر CSF اميدوار جي اوسط ٽائيٽر جو ان جي رت جي ٽائيٽر سان لاڳاپو ڏيکاريو ته ڇهن اميدوارن مان ٽي رت جي CSF ۾ خاص طور تي افزوده هئا. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته ڪلون #2077 وڌيڪ رت جي استحڪام ڏيکاريو (ضمني شڪل 7). تصديق ڪرڻ لاءِ ته پيپٽائڊس پاڻ فيج ذرڙن کان سواءِ ڪارگو کي CSF ڪمپارٽمينٽ ۾ فعال طور تي منتقل ڪرڻ جي قابل آهن، اسان اين ٽرمينس تي بايوٽين سان نڪتل چار ليڊر پيپٽائڊس کي گڏ ڪيو جتي پيپٽائڊس فيج ذرڙن سان ڳنڍيل آهن. بايوٽينيلٽيڊ پيپٽائڊس (نمبر 2002، 2009، 2020 ۽ 2077) کي اسٽريپٽاوڊين (SA) سان ملائيو ويو ته جيئن فيج جيوميٽري جي ڪجهه حد تائين نقل ڪندڙ ملٽيميرڪ شڪلون حاصل ڪري سگهجن. هن فارميٽ اسان کي رت ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ ۾ ايس اي جي نمائش کي ڪارگو-ٽرانسپورٽنگ پروٽين پيپٽائڊس جي طور تي ماپڻ جي اجازت پڻ ڏني. اهم طور تي، فيج ڊيٽا اڪثر ڪري ٻيهر پيدا ڪري سگهجي ٿو جڏهن مصنوعي پيپٽائڊس کي هن ايس اي-ڪنجوگيٽڊ فارميٽ ۾ ڏنو ويو (شڪل 3e). اسڪرمبلڈ پيپٽائڊس ۾ گهٽ شروعاتي نمائش ۽ تيز CSF ڪليئرنس هئي 48 ڪلاڪن اندر اڻ ڏٺل سطحن سان. CSF اسپيس ۾ انهن پيپٽائڊ فيج ڪلونز جي ترسيل رستن ۾ بصيرت حاصل ڪرڻ لاءِ، اسان انفرادي فيج پيپٽائڊ هٽس جي مقامي ڪرڻ جو تجزيو ڪيو ته جيئن وييو ۾ انٽروينس انجيڪشن کان 1 ڪلاڪ بعد فيج ذرات کي سڌو سنئون ڳولي سگهجي. خاص طور تي، ڪلون #2002، #2077، ۽ #2009 کي دماغ جي ڪيپيلريز ۾ مضبوط داغ ذريعي ڳولي سگهجي ٿو، جڏهن ته ڪنٽرول فيج (#1779) ۽ ڪلون #2020 نه ڳوليا ويا (ضمني شڪل 8). اهو مشورو ڏئي ٿو ته اهي پيپٽائڊس BBB کي پار ڪندي دماغ تي اثر ۾ حصو وٺندا آهن. هن مفروضي کي جانچڻ لاءِ وڌيڪ تفصيلي تجزيو جي ضرورت آهي، ڇاڪاڻ ته BSCFB رستو پڻ شامل ٿي سگهي ٿو. جڏهن سڀ کان وڌيڪ افزوده ڪلون (#2002) جي امينو ايسڊ ترتيب کي ٻين چونڊيل پيپٽائڊس سان مقابلو ڪيو ويو، اهو نوٽ ڪيو ويو ته انهن مان ڪجهه ۾ ساڳيا امينو ايسڊ ايڪسٽينشن آهن، جيڪي شايد هڪجهڙا ٽرانسپورٽ ميڪانيزم ظاهر ڪن ٿا (شڪل 3f).
ان جي منفرد پلازما پروفائل ۽ وقت سان گڏ CSF ۾ اهم واڌ جي ڪري، فيج ڊسپلي ڪلون #2077 کي 48 ڪلاڪن جي ڊگهي عرصي دوران وڌيڪ ڳولهيو ويو ۽ مسلسل SA ليولز (شڪل 4a) سان لاڳاپيل CSF ۾ تيز واڌ کي ٻيهر پيدا ڪرڻ جي قابل هو. ٻين سڃاڻپ ٿيل فيج ڪلونز جي حوالي سان، #2077 دماغ جي ڪيپيلريز لاءِ مضبوط طور تي داغدار ٿيو ۽ ڪيپيلري مارڪر ليڪٽين سان اهم ڪولوڪلائيزيشن ڏيکاريو جڏهن وڌيڪ ريزوليوشن تي ڏٺو ويو ۽ ممڪن طور تي پيرينچيمل اسپيس ۾ ڪجهه داغدار ٿيو (شڪل 4b). اهو جانچڻ لاءِ ته ڇا پيپٽائيڊ-ثالث فارماسولوجيڪل اثرات CNS ۾ حاصل ڪري سگهجن ٿا، اسان هڪ تجربو ڪيو جنهن ۾ i) #2077 ٽرانزٽ پيپٽائيڊ ۽ ii) BACE1 انبيٽر پيپٽائيڊ جا بايوٽينيلڊ ورجن SA سان ٻن مختلف تناسب تي ملايا ويا. هڪ ميلاپ لاءِ اسان صرف BACE1 پيپٽائيڊ انبيٽر استعمال ڪيو ۽ ٻئي لاءِ اسان BACE1 پيپٽائيڊ انبيٽر جو 1:3 تناسب #2077 پيپٽائيڊ سان استعمال ڪيو. ٻنهي نمونن کي نس ذريعي داخل ڪيو ويو ۽ وقت سان گڏ بيٽا-امائلائيڊ پيپٽائيڊ 40 (Abeta40) جي رت ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ جي سطح کي ماپيو ويو. Abeta40 کي CSF ۾ ماپيو ويو ڇاڪاڻ ته اهو دماغ جي پيرينچيما ۾ BACE1 جي روڪٿام کي ظاهر ڪري ٿو. جيئن توقع ڪئي وئي، ٻنهي ڪمپليڪس Abeta40 جي رت جي سطح کي خاص طور تي گهٽائي ڇڏيو (شڪل 4c، d). بهرحال، صرف پيپٽائيڊ نمبر 2077 جي مرکب ۽ SA سان ملائي BACE1 پيپٽائيڊ جي هڪ روڪٿام تي مشتمل نمونن دماغي اسپائنل فلوئڊ (شڪل 4c) ۾ Abeta40 ۾ اهم گهٽتائي جو سبب بڻيا. ڊيٽا ڏيکاري ٿو ته پيپٽائيڊ نمبر 2077 60 kDa SA پروٽين کي CNS ۾ منتقل ڪرڻ جي قابل آهي ۽ BACE1 پيپٽائيڊ جي SA- ڪنجوگيٽڊ انابيٽرز سان فارماسولوجيڪل اثرات پڻ پيدا ڪري ٿو.
(a) گهٽ ۾ گهٽ ٽن CM-انٽيوبيٽڊ چوٽن ۾ CSF پيپٽائيڊ #2077 (RLSSVDSDLSGC) ۽ غير انجيڪٽڊ ڪنٽرول فيج (#1779) جي ڊگهي مدت جي فارماڪوڪائنيٽڪ پروفائلز ڏيکاريندڙ T7 فيج جو ڪلونل انجيڪشن (2 × 10 فيج/جانور). (b) فيج-انجيڪٽڊ چوٽن ۾ نمائندي ڪارٽيڪل مائڪرو ويسلز جي ڪنفوڪل خوردبيني تصوير (2 × 10 10 فيج/جانور) پيپٽائيڊ #2077 ۽ ويسلز (ليڪٽين) جي ڪائونٽر اسٽيننگ ڏيکاريندي. اهي فيج ڪلون 3 چوٽن کي ڏنا ويا ۽ پرفيوژن کان اڳ 1 ڪلاڪ لاءِ گردش ڪرڻ جي اجازت ڏني وئي. دماغ کي سيڪشن ڪيو ويو ۽ T7 فيج ڪيپسڊ جي خلاف پولي ڪلونل FITC-ليبل ٿيل اينٽي باڊيز سان داغ ڏنو ويو. پرفيوژن ۽ بعد ۾ فڪسيشن کان ڏهه منٽ اڳ، DyLight594-ليبل ٿيل ليڪٽين نس ذريعي ڏنو ويو. فلورسنٽ تصويرون جيڪي ڪيپليئرز ۽ پيريو ويسڪولر دماغي ٽشو جي لومين ۾ مائڪرو ويسلز ۽ فيجز (سائي) جي لومينل پاسي جي ليڪٽين اسٽيننگ (ڳاڙهو) ڏيکارين ٿيون. اسڪيل بار 10 µm سان ملندڙ جلندڙ آهي. (c, d) بايوٽينيلٽيڊ BACE1 انحيبيٽري پيپٽائيڊ کي اڪيلو يا بايوٽينيلٽيڊ ٽرانزٽ پيپٽائيڊ #2077 سان ميلاپ ۾ اسٽريپٽاوڊين سان جوڙيو ويو جنهن کان پوءِ گهٽ ۾ گهٽ ٽي ڪينيوليڊ CM چوٿون (10 mg اسٽريپٽاوڊين/ڪلوگرام) جي نس ۾ انجيڪشن ڏني وئي. Aβ40 ۾ BACE1 پيپٽائيڊ انحيبيٽر-ثالثي گهٽتائي کي Aβ1-40 ELISA ذريعي رت (ڳاڙهو) ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ (نارنگي) ۾ ڏيکاريل وقت جي پوائنٽن تي ماپيو ويو. بهتر وضاحت لاءِ، گراف تي 100٪ جي پيماني تي هڪ ڊاٽ ٿيل لڪير ٺاهي وئي آهي. (c) رت ۾ Aβ40 ۾ سيڪڙو گهٽتائي (ڳاڙهو ٽڪنڊو) ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ (نارنگي ٽڪنڊو) ۾ چوٿون جيڪي اسٽريپٽاوڊين سان علاج ڪيا ويا هئا ۽ ٽرانزٽ پيپٽائيڊ #2077 ۽ BACE1 انحيبيٽري پيپٽائيڊ سان 3:1 تناسب ۾. (d) صرف BACE1 انحيبيٽري پيپٽائيڊ سان اسٽريپٽاوڊين سان علاج ڪيل چوٿون جي رت ۾ Aβ40 (ڳاڙهو دائرو) ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ (نارنگي دائرو) ۾ سيڪڙو گهٽتائي. ڪنٽرول ۾ Aβ ڪنسنٽريشن 420 pg/ml (معياري انحراف = 101 pg/ml) هو.
فيج ڊسپلي کي بايو ميڊيڪل ريسرچ جي ڪيترن ئي شعبن ۾ ڪاميابي سان لاڳو ڪيو ويو آهي 17. هي طريقو ان ويوو ويسڪولر ڊائيوورسٽي اسٽڊيز 18,19 ۽ دماغي رڳن کي نشانو بڻائڻ واري مطالعي لاءِ استعمال ڪيو ويو آهي 20,21,22,23,24,25,26. هن مطالعي ۾، اسان هن چونڊ جي طريقي جي استعمال کي نه رڳو دماغي رڳن کي نشانو بڻائڻ واري پيپٽائڊس جي سڌي سڃاڻپ تائين وڌايو، پر رت جي دماغ جي رڪاوٽ کي پار ڪرڻ لاءِ فعال ٽرانسپورٽ ملڪيتن سان اميدوارن جي ڳولا تائين پڻ. اسان هاڻي CM انٽيوبيٽڊ چوٿن ۾ هڪ ان ويوو چونڊ جي طريقيڪار جي ترقي کي بيان ڪريون ٿا ۽ CSF هومنگ خاصيتن سان پيپٽائڊس جي سڃاڻپ ڪرڻ جي صلاحيت جو مظاهرو ڪريون ٿا. 12-mer بي ترتيب پيپٽائڊس جي لائبريري کي ڏيکاريندڙ T7 فيج استعمال ڪندي، اسان اهو ظاهر ڪرڻ جي قابل هئاسين ته T7 فيج ڪافي ننڍو آهي (تقريبن 60 nm قطر ۾) 10 رت جي دماغ جي رڪاوٽ سان مطابقت پيدا ڪرڻ لاءِ، انهي ڪري سڌو سنئون رت جي دماغ جي رڪاوٽ يا ڪورائيڊ پلڪسس کي پار ڪري ٿو. اسان ڏٺو ته ڪينيولڊ سي ايم چوٿن مان سي ايس ايف جي حاصلات هڪ چڱي طرح ڪنٽرول ٿيل ان ويوو فنڪشنل اسڪريننگ طريقو هو، ۽ اهو ڪڍيل فيج نه رڳو ويسڪوليچر سان ڳنڍيل هو پر رت جي دماغ جي رڪاوٽ جي پار هڪ ٽرانسپورٽر طور پڻ ڪم ڪندو هو. وڌيڪ، رت گڏ ڪرڻ ۽ سي ايس ايف ۽ رت مان نڪتل فيجز تي ايڇ ٽي ايس لاڳو ڪرڻ سان، اسان تصديق ڪئي ته اسان جي سي ايس ايف جي چونڊ رت جي افزودگي يا چونڊ جي دورن جي وچ ۾ واڌ لاءِ فٽنيس کان متاثر نه هئي. بهرحال، رت جو ڪمپارٽمينٽ چونڊ جي طريقيڪار جو حصو آهي، ڇاڪاڻ ته سي ايس ايف ڪمپارٽمينٽ تائين پهچڻ جي قابل فيجز کي رت جي وهڪري ۾ ايتري عرصي تائين زنده رهڻ ۽ گردش ڪرڻ گهرجي جو دماغ ۾ پاڻ کي افزوده ڪري سگهي. خام ايڇ ٽي ايس ڊيٽا مان قابل اعتماد ترتيب جي معلومات ڪڍڻ لاءِ، اسان تجزيو ورڪ فلو ۾ پليٽ فارم جي مخصوص ترتيب جي غلطين سان مطابقت رکندڙ فلٽر لاڳو ڪيا. اسڪريننگ جي طريقي ۾ ڪائنيٽڪ پيرا ميٽرز کي شامل ڪندي، اسان رت ۾ جهنگلي قسم جي T7 فيجز (t½ ~ 28 منٽ) جي تيز فارماڪوڪائنيٽڪس جي تصديق ڪئي 24، 27، 28 ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ (t½ ~ 26 منٽ) في منٽ ۾ انهن جي اڌ زندگي پڻ طئي ڪئي. رت ۽ CSF ۾ ساڳين فارماڪوڪائنيٽڪ پروفائلز جي باوجود، CSF ۾ فيج جي رت جي ڪنسنٽريشن جو صرف 0.001٪ معلوم ٿي سگهيو، جيڪو رت جي دماغ جي رڪاوٽ جي پار جهنگلي قسم جي T7 فيج جي گهٽ پس منظر جي حرڪت کي ظاهر ڪري ٿو. هي ڪم ان ويوو پيننگ حڪمت عملين کي استعمال ڪندي چونڊ جي پهرين دور جي اهميت کي اجاگر ڪري ٿو، خاص طور تي فيج سسٽم لاءِ جيڪي گردش کان تيزيءَ سان صاف ٿين ٿا، ڇاڪاڻ ته ڪجھ ڪلون CNS ڪمپارٽمينٽ تائين پهچڻ جي قابل آهن. اهڙيءَ طرح، پهرين دور ۾، لائبريري تنوع ۾ گهٽتائي تمام وڏي هئي، ڇاڪاڻ ته هن تمام سخت CSF ماڊل ۾ آخرڪار صرف محدود تعداد ۾ ڪلون گڏ ڪيا ويا. هن ان ويوو پيننگ حڪمت عملي ۾ ڪيترائي چونڊ مرحلا شامل هئا جهڙوڪ CSF ڪمپارٽمينٽ ۾ فعال جمع، رت جي ڪمپارٽمينٽ ۾ ڪلون جي بقا، ۽ پهرين 10 منٽن اندر رت مان T7 فيج ڪلون کي تيزيءَ سان هٽائڻ (شڪل 1d ۽ ضمني شڪل 4M). اهڙيءَ طرح، پهرين دور کان پوءِ، CSF ۾ مختلف فيج ڪلون جي سڃاڻپ ڪئي وئي، جيتوڻيڪ ساڳيو ابتدائي پول انفرادي جانورن لاءِ استعمال ڪيو ويو. ان مان ظاهر ٿئي ٿو ته وڏي تعداد ۾ لائبريري ميمبرن سان گڏ سورس لائبريرين لاءِ ڪيترائي سخت چونڊ مرحلا تنوع ۾ اهم گهٽتائي جو سبب بڻجن ٿا. تنهن ڪري، بي ترتيب واقعا ابتدائي چونڊ عمل جو هڪ لازمي حصو بڻجي ويندا، نتيجي تي تمام گهڻو اثر انداز ٿيندا. اهو ممڪن آهي ته اصل لائبريري ۾ ڪيترن ئي ڪلونز ۾ CSF جي افزودگي جو رجحان تمام گهڻو ساڳيو هو. جڏهن ته، ساڳئي تجرباتي حالتن ۾ به، چونڊ جا نتيجا ابتدائي پول ۾ هر خاص ڪلون جي ننڍي تعداد جي ڪري مختلف ٿي سگهن ٿا.
CSF ۾ افزوده ڪيل نقش رت ۾ موجود نقشن کان مختلف آهن. دلچسپ ڳالهه اها آهي ته اسان انفرادي جانورن جي رت ۾ گلائسين سان مالا مال پيپٽائڊس ڏانهن پهرين شفٽ کي نوٽ ڪيو. (شڪل 1g، ضمني شڪل 4e، 4f). گلائسين پيپٽائڊس تي مشتمل فيج وڌيڪ مستحڪم ٿي سگهي ٿو ۽ گردش کان ٻاهر ڪڍڻ جو امڪان گهٽ هوندو. بهرحال، اهي گلائسين سان مالا مال پيپٽائڊس دماغي اسپائنل فلوئڊ جي نمونن ۾ نه مليا، جنهن مان ظاهر ٿئي ٿو ته ڪيوريٽ ٿيل لائبريريون ٻن مختلف چونڊ مرحلن مان گذريون: هڪ رت ۾ ۽ ٻيو دماغي اسپائنل فلوئڊ ۾ جمع ٿيڻ جي اجازت ڏني وئي. چونڊ جي چوٿين دور جي نتيجي ۾ CSF سان مالا مال ڪلون وڏي پيماني تي آزمايا ويا آهن. تقريبن سڀني انفرادي طور تي آزمايل ڪلون کي خالي ڪنٽرول فيج جي مقابلي ۾ CSF ۾ افزوده ٿيڻ جي تصديق ڪئي وئي. هڪ پيپٽائڊ هٽ (#2077) کي وڌيڪ تفصيل سان جانچيو ويو. ان ٻين هٽن جي مقابلي ۾ هڪ ڊگهي پلازما اڌ زندگي ڏيکاري (شڪل 3d ۽ ضمني شڪل 7)، ۽ دلچسپ ڳالهه اها آهي ته هن پيپٽائڊ ۾ C-ٽرمينس تي هڪ سيسٽين جي باقيات شامل هئي. تازو ئي اهو ڏيکاريو ويو آهي ته پيپٽائڊس ۾ سيسٽين جو اضافو البومين 29 سان ڳنڍيل هجڻ سان انهن جي فارماڪوڪائنيٽڪ خاصيتن کي بهتر بڻائي سگهي ٿو. اهو في الحال پيپٽائڊس #2077 لاءِ نامعلوم آهي ۽ وڌيڪ مطالعي جي ضرورت آهي. ڪجهه پيپٽائڊس CSF جي افزودگي ۾ ويلنس-انحصار ڏيکاريو (ڊيٽا نه ڏيکاريو ويو آهي)، جيڪو شايد T7 ڪيپسڊ جي ڏيکاريل مٿاڇري جي جاميٽري سان لاڳاپيل هجي. اسان جيڪو T7 سسٽم استعمال ڪيو اهو هر پيپٽائڊس في فيج پارٽيڪل جون 5-15 ڪاپيون ڏيکاريون. IHC اميدوار ليڊ فيج ڪلونز تي ڪيو ويو جيڪي چوٿن جي دماغي ڪارٽيڪس ۾ نس ۾ داخل ڪيا ويا هئا (ضمني شڪل 8). ڊيٽا ڏيکاريو ته گهٽ ۾ گهٽ ٽي ڪلون (نمبر 2002، نمبر 2009 ۽ نمبر 2077) BBB سان رابطو ڪيو. اهو طئي ڪرڻ باقي آهي ته ڇا هي BBB رابطي CSF جي جمع ٿيڻ يا انهن ڪلونز جي حرڪت ۾ سڌو سنئون BCSFB ڏانهن منتقل ٿيڻ جو نتيجو آهي. اهم طور تي، اسان ڏيکاريون ٿا ته چونڊيل پيپٽائڊس پنهنجي CSF ٽرانسپورٽ جي صلاحيت کي برقرار رکندا آهن جڏهن پروٽين ڪارگو سان ٺهيل ۽ پابند ڪيو ويندو آهي. اين-ٽرمينل بايوٽينيلٽيڊ پيپٽائڊس جو SA سان ڳنڍڻ بنيادي طور تي رت ۽ دماغي اسپائنل فلوئڊ ۾ انهن جي لاڳاپيل فيج ڪلون سان حاصل ڪيل نتيجن کي ورجائي ٿو (شڪل 3e). آخرڪار، اسان ڏيکاريون ٿا ته ليڊ پيپٽائڊ #2077 SA سان ملائي BACE1 جي بايوٽينيلٽيڊ پيپٽائڊ انبيٽر جي دماغي عمل کي فروغ ڏيڻ جي قابل آهي، جيڪو CSF ۾ Abeta40 جي سطح کي گهٽائي CNS ۾ واضح فارماڪوڊائنامڪ اثرات پيدا ڪري ٿو (شڪل 4). اسان سڀني هٽس جي پيپٽائڊ سيڪوئنس هومولوجي ڳولا ڪندي ڊيٽابيس ۾ ڪنهن به هومولوگس کي سڃاڻڻ جي قابل نه هئاسين. اهو نوٽ ڪرڻ ضروري آهي ته T7 لائبريري جي سائيز تقريبن 109 آهي، جڏهن ته 12-مرز لاءِ نظرياتي لائبريري سائيز 4 x 1015 آهي. تنهن ڪري، اسان صرف 12-مرز پيپٽائڊ لائبريري جي تنوع واري جڳهه جو هڪ ننڍڙو حصو چونڊيو آهي، جنهن جو مطلب اهو ٿي سگهي ٿو ته انهن سڃاڻپ ٿيل هٽس جي ڀرسان سيڪوئنس اسپيس جو جائزو وٺڻ سان وڌيڪ بهتر پيپٽائڊس جي سڃاڻپ ڪري سگهجي ٿي. فرضي طور تي، هڪ سبب اهو آهي ته اسان کي انهن پيپٽائڊس جا ڪو به قدرتي هم جنس نه مليا آهن، اهو ارتقا دوران دماغ ۾ ڪجهه پيپٽائڊس جي بي قابو داخلا کي روڪڻ لاءِ غير چونڊ ٿي سگهي ٿو.
گڏ ڪري، اسان جا نتيجا مستقبل جي ڪم لاءِ هڪ بنياد فراهم ڪن ٿا ته جيئن دماغي ويسڪولر رڪاوٽ جي ٽرانسپورٽ سسٽم کي وڌيڪ تفصيل سان سڃاڻي ۽ انهن جي خاصيت ڪري سگهجي. هن طريقي جو بنيادي سيٽ اپ هڪ فنڪشنل چونڊ حڪمت عملي تي ٻڌل آهي جيڪو نه رڳو دماغي ويسڪولر پابند خاصيتن سان ڪلون جي سڃاڻپ ڪري ٿو، پر هڪ اهم قدم پڻ شامل آهي جنهن ۾ ڪامياب ڪلون اندروني سرگرمي رکن ٿا ته جيئن سي اين ايس ڪمپارٽمينٽ ۾ حياتياتي رڪاوٽن کي پار ڪري سگهن. انهن پيپٽائڊس جي ٽرانسپورٽ جي ميڪانيزم ۽ دماغي علائقي لاءِ مخصوص مائڪروواسڪيوليچر سان پابند ٿيڻ لاءِ انهن جي ترجيح کي واضح ڪرڻ آهي. اهو BBB ۽ ريڪٽرز جي ٽرانسپورٽ لاءِ نئين رستن جي دريافت جو سبب بڻجي سگهي ٿو. اسان اميد ڪريون ٿا ته سڃاڻپ ٿيل پيپٽائڊس سڌو سنئون دماغي ويسڪولر ريڪٽرز يا BBB يا BCSFB ذريعي منتقل ٿيندڙ گردش ڪندڙ ليگنڊز سان ڳنڍيل هوندا. هن ڪم ۾ دريافت ڪيل CSF ٽرانسپورٽ سرگرمي سان پيپٽائڊ ویکٹرز جي وڌيڪ جاچ ڪئي ويندي. اسان هن وقت انهن پيپٽائڊس جي دماغي خاصيت جي جاچ ڪري رهيا آهيون ته جيئن انهن جي BBB ۽/يا BCSFB کي پار ڪرڻ جي صلاحيت هجي. اهي نوان پيپٽائڊس نون ريڪٽرز يا رستن جي امڪاني دريافت ۽ دماغ تائين ميڪرو ماليڪيولز، جهڙوڪ بايولوجيڪس، جي پهچائڻ لاءِ نئين انتهائي ڪارآمد پليٽ فارمن جي ترقي لاءِ انتهائي قيمتي اوزار هوندا.
اڳ ۾ بيان ڪيل طريقي جي ترميم استعمال ڪندي وڏي سسٽرنا (سي ايم) کي ڪينوليٽ ڪريو. بي هوشي واري وِسٽار چوٿون (200-350 گرام) هڪ اسٽيريوٽيڪسڪ اپريٽس تي لڳل هيون ۽ هڪ وچين چيرا ڪٽيل ۽ ايسپٽيڪلي تيار ڪيل سر جي مٿي تي ٺاهيو ويو ته جيئن کوپڙي کي ظاهر ڪري سگهجي. مٿئين سيش جي علائقي ۾ ٻه سوراخ ڪريو ۽ سوراخن ۾ فڪسنگ اسڪرو کي مضبوط ڪريو. سي ايم ۾ اسٽينلیس اسٽيل ڪينولا جي اسٽيريوٽيڪٽڪ هدايت لاءِ ليٽرل اوسيپيٽل ڪرسٽ ۾ هڪ اضافي سوراخ ڪيو ويو. ڪينولا جي چوڌاري ڏندن جو سيمينٽ لڳايو ۽ اسڪرو سان محفوظ ڪريو. فوٽو ڪيورنگ ۽ سيمينٽ سخت ٿيڻ کان پوءِ، چمڙي جي زخم کي 4/0 سپرامڊ سيون سان بند ڪيو ويو. ڪينولا جي صحيح جڳهه جي تصديق دماغي اسپائنل فلوئڊ (سي ايس ايف) جي خود بخود رساو سان ٿيندي آهي. اسٽيريوٽيڪسڪ اپريٽس مان چوٿون هٽايو، مناسب پوسٽ آپريٽو سنڀال ۽ درد جو انتظام حاصل ڪريو، ۽ ان کي گهٽ ۾ گهٽ هڪ هفتي تائين بحال ٿيڻ ڏيو جيستائين دماغي اسپائنل فلوئڊ ۾ رت جا نشان نظر نه اچن. وِسٽار چوها (Crl:WI/Han) چارلس درياءَ (فرانس) مان حاصل ڪيا ويا هئا. سڀني چوهن کي مخصوص پيٿوجن کان پاڪ حالتن ۾ رکيو ويو هو. سڀني جانورن جي تجربن کي سوئٽزرلينڊ جي شهر باسل جي ويٽرنري آفيس پاران منظور ڪيو ويو هو، ۽ جانورن جي لائسنس نمبر 2474 (چوهيءَ جي دماغي اسپائنل فلوئڊ ۽ دماغ ۾ علاج جي اميدوارن جي سطحن کي ماپڻ سان فعال دماغي ٽرانسپورٽ جو جائزو) جي مطابق ڪيو ويو.
CM ڪينولا هٿ ۾ کڻي چوهيءَ کي هوش ۾ رکو. ڪينولا مان داتورا کي ڪڍو ۽ 10 μl خود بخود وهندڙ دماغي اسپائنل فلوئڊ گڏ ڪريو. جيئن ته ڪينولا جي پيٽنسي آخرڪار خراب ٿي وئي هئي، هن مطالعي ۾ صرف صاف دماغي اسپائنل فلوئڊ جا نمونا شامل ڪيا ويا جن ۾ رت جي آلودگي يا رنگت جو ڪو ثبوت نه هو. متوازي طور تي، تقريبن 10-20 μl رت کي دم جي چوٽي تي هڪ ننڍڙي چيرا مان هيپرين (سگما-الڊرچ) سان ٽيوب ۾ ورتو ويو. T7 فيج جي نس ۾ انجيڪشن کان پوءِ مختلف وقتن تي CSF ۽ رت گڏ ڪيو ويو. هر CSF نموني گڏ ڪرڻ کان اڳ تقريبن 5-10 μl سيال رد ڪيو ويو، جيڪو ڪيٿيٽر جي مئل مقدار سان مطابقت رکي ٿو.
لائبريريون T7Select 10-3b ویکٹر استعمال ڪندي ٺاهيون ويون جيئن T7Select سسٽم مينوئل ۾ بيان ڪيو ويو آهي (نوواگن، روزنبرگ ۽ ٻيا، ان نوويشنز 6، 1-6، 1996). مختصر طور تي، هڪ بي ترتيب 12-مير ڊي اين اي داخل ڪيو ويو هيٺ ڏنل فارميٽ ۾ ٺهيل:
اين اين ڪي ڪوڊون کي انسرٽ ۾ ڊبل اسٽاپ ڪوڊون ۽ امينو ايسڊ اوور ايڪسپريشن کان بچڻ لاءِ استعمال ڪيو ويو. اين هر نيوڪليوٽائيڊ جو دستي طور تي ملايو ويو برابري وارو تناسب آهي، ۽ ڪي ايڊينائن ۽ سائيٽوسائن نيوڪليوٽائيڊس جو دستي طور تي ملايو ويو برابري وارو تناسب آهي. سنگل اسٽرينڊڊ علائقن کي ڊي اين ٽي پي (نوواجن) ۽ ڪلينو اينزائم (نيو انگلينڊ بايولابس) سان ڪلينو بفر (نيو انگلينڊ بايولابس) ۾ 3 ڪلاڪن لاءِ 37 ° C تي وڌيڪ انڪيوبيشن ذريعي ڊبل اسٽرينڊڊ ڊي اين اي ۾ تبديل ڪيو ويو. رد عمل کان پوءِ، ڊبل اسٽرينڊڊ ڊي اين اي EtOH ورڇ ذريعي بحال ڪيو ويو. نتيجي ۾ ڊي اين اي کي پابندي اينزائمز EcoRI ۽ HindIII (ٻئي روش مان) سان هضم ڪيو ويو. ڪليوڊ ۽ پاڪ ٿيل (QIAquick، Qiagen) انسرٽ (T4 ligase، New England Biolabs) کي پوءِ 10B ڪيپسڊ جين جي امينو ايسڊ 348 کان پوءِ فريم ۾ اڳ-ڪليو ٿيل T7 ویکٹر ۾ بند ڪيو ويو. ان ويٽرو پيڪنگنگ کان اڳ 18 ڪلاڪن لاءِ ليگيشن ري ايڪشن کي 16°C تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو. ان ويٽرو ۾ فيج پيڪنگنگ T7Select 10-3b ڪلوننگ ڪٽ (نوواجن) سان فراهم ڪيل هدايتن مطابق ڪئي وئي ۽ پيڪنگنگ حل کي هڪ ڀيرو ايسچريچيا ڪولي (BLT5615، نوواجن) استعمال ڪندي ليسس تائين وڌايو ويو. لائسيٽس کي گليسرول جي اسٽاڪ محلول جي طور تي -80°C تي سينٽرفيوج، ٽائيٽريٽ ۽ منجمد ڪيو ويو.
پروپرائيٽري 454/روش-امپليڪون فيوزن پرائمر استعمال ڪندي برٿ يا پليٽ ۾ فيج متغير علائقن جي سڌي پي سي آر امپليفڪيشن. فارورڊ فيوزن پرائمر ۾ متغير علائقي (NNK) 12 (ٽيمپليٽ-مخصوص)، GS FLX ٽائيٽينيم اڊاپٽر A، ۽ چار-بنيادي لائبريري ڪي سيڪوئنس (TCAG) (ضمني شڪل 1a) جي فلانڪنگ تسلسل شامل آهن:
ريورس فيوزن پرائمر ۾ ڪيپچر بيڊز سان ڳنڍيل بايوٽين ۽ ايمولشن پي سي آر دوران ڪلونل ايمپليفڪيشن لاءِ گهربل GS FLX ٽائيٽينيم اڊاپٽر B پڻ شامل آهي:
پوءِ ايمپليڪون کي 454 GS-FLX ٽائيٽينيم پروٽوڪول جي مطابق 454/Roche pyrosequencing جي تابع ڪيو ويو. دستي سينجر سيڪوئنسنگ (اپلائيڊ بايو سسٽم هٽاچي 3730 xl ڊي اين اي اينالائيزر) لاءِ، T7 فيج ڊي اين اي کي پي سي آر ذريعي وڌايو ويو ۽ هيٺين پرائمر جوڙن سان ترتيب ڏنو ويو:
انفرادي تختين مان داخل ڪيل مواد کي روش فاسٽ اسٽارٽ ڊي اين اي پوليمريز ڪٽ استعمال ڪندي پي سي آر امپليفڪيشن جي تابع ڪيو ويو (ٺاهيندڙ جي هدايتن مطابق). هڪ گرم شروعات (95 °C تي 10 منٽ) ۽ 35 بوسٽ سائيڪلون (95 °C تي 50 سيڪنڊ، 50 °C تي 1 منٽ، ۽ 72 °C تي 1 منٽ) انجام ڏيو.
لائبريرين مان فيج، جهنگلي قسم جي فيج، CSF ۽ رت مان بچيل فيج، يا انفرادي ڪلون کي Escherichia coli BL5615 ۾ ٽي بي برٿ (سگما الڊرچ) ۾ يا 500 cm2 ڊشز (ٿرمو سائنٽيفڪ) ۾ 37°C تي 4 ڪلاڪن لاءِ وڌايو ويو. پليٽن کي ٽريس-اي ڊي ٽي اي بفر (فلوڪا ايناليٽيڪل) سان ڌوئڻ يا جراثيم کان پاڪ پائيپٽ ٽِپس سان تختيون گڏ ڪرڻ سان پليٽن مان فيج ڪڍيا ويا. فيج کي پوليٿيلين گلائڪول (PEG 8000) پرسيپيشن (پروميگا) جي هڪ گول سان ڪلچر سپرنيٽينٽ يا ايڪسٽريشن بفر کان الڳ ڪيو ويو ۽ ٽريس-اي ڊي ٽي اي بفر ۾ ٻيهر معطل ڪيو ويو.
ايمپليفائيڊ فيج کي انٽراوينوس (IV) انجيڪشن (500 μl/جانور) کان اڳ اينڊوٽوڪسن ريموول بيڊز (Miltenyi Biotec) استعمال ڪندي اينڊوٽوڪسن هٽائڻ جا 2-3 رائونڊ ڪيا ويا. پهرين رائونڊ ۾، 2×1012 فيج متعارف ڪرايا ويا؛ ٻئي ۾، 2×1010 فيج؛ ٽئين ۽ چوٿين چونڊ رائونڊ ۾، هر جانور لاءِ 2×109 فيج. CSF ۾ فيج جي مواد ۽ رت جي نمونن کي اشارو ڪيل وقت جي پوائنٽن تي گڏ ڪيل تختي جي ڳڻپ ذريعي ٺاهيندڙ جي هدايتن (T7Select سسٽم مينوئل) مطابق طئي ڪيو ويو. فيج جي چونڊ ٽيل رگ ۾ صاف ٿيل لائبريرين جي انٽراوينوس انجيڪشن ذريعي يا پوئين چونڊ رائونڊ مان CSF مان ڪڍيل فيج جي ٻيهر انجيڪشن ذريعي ڪئي وئي، ۽ بعد ۾ فصل 10 منٽ، 30 منٽ، 60 منٽ، 90 منٽ، 120 منٽ، 180 منٽ، ۽ 240 منٽ تي ترتيب وار CSF ۽ رت جا نمونا ڪيا ويا. ان ويوو پيننگ جا ڪل چار رائونڊ ڪيا ويا جنهن ۾ ٻن چونڊيل شاخن کي الڳ الڳ ذخيرو ڪيو ويو ۽ چونڊ جي پهرين ٽن رائونڊ دوران تجزيو ڪيو ويو. چونڊ جي پهرين ٻن رائونڊ مان CSF مان نڪتل سڀئي فيج انسرٽس 454/Roche pyrosequencing جي تابع ڪيا ويا، جڏهن ته چونڊ جي آخري ٻن رائونڊ مان CSF مان نڪتل سڀئي ڪلون دستي طور تي ترتيب ڏنل هئا. چونڊ جي پهرين رائونڊ مان سڀني رت جي فيجز کي پڻ 454/Roche pyrosequencing جي تابع ڪيو ويو. فيج ڪلونز جي انجيڪشن لاءِ، چونڊيل فيجز کي E. coli (BL5615) ۾ 500 cm2 پليٽن تي 37°C تي 4 ڪلاڪن لاءِ وڌايو ويو. انفرادي طور تي چونڊيل ۽ دستي طور تي ترتيب ڏنل ڪلونز کي ٽي بي ميڊيم ۾ پروپيگنڊه ڪيو ويو. فيج ڪڍڻ، صاف ڪرڻ ۽ اينڊوٽوڪسين کي هٽائڻ کان پوءِ (جيئن مٿي بيان ڪيو ويو آهي)، 300 μl ۾ 2×1010 فيجز/جانور کي هڪ دم جي رڳ ۾ نس ذريعي داخل ڪيو ويو.
ترتيب ڊيٽا جي پري پروسيسنگ ۽ قابليت واري فلٽرنگ. را 454/روچ ڊيٽا کي وينڊر سافٽ ويئر استعمال ڪندي بائنري معياري اسٽريم ميپ فارميٽ (sff) کان پيئرسن انساني پڙهڻ جي قابل فارميٽ (fasta) ۾ تبديل ڪيو ويو. نيوڪليوٽائيڊ ترتيب جي وڌيڪ پروسيسنگ ملڪيت سي پروگرامن ۽ اسڪرپٽ (غير جاري ٿيل سافٽ ويئر پيڪيج) استعمال ڪندي ڪئي وئي جيئن هيٺ بيان ڪيو ويو آهي. پرائمري ڊيٽا جي تجزيي ۾ سخت ملٽي اسٽيج فلٽرنگ طريقا شامل آهن. ريڊز کي فلٽر ڪرڻ لاءِ جن ۾ صحيح 12mer انسرٽ ڊي اين اي سيڪوئنس شامل نه هو، ريڊز کي گلوبل نيڊل مين-ونش ٽيسٽ استعمال ڪندي اسٽارٽ ليبل (GTGATGTCGGGATCCGAATTCT)، اسٽاپ ليبل (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ۽ بيڪ گرائونڊ انسرٽ (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGTCGTCGTCG) سان ترتيب ڏني وئي. ترتيب هر الائنمينٽ 31 تائين 2 غير مطابقتن جي اجازت ڏئي ٿي. تنهن ڪري، بغير شروعاتي ۽ اسٽاپ ٽيگ جي پڙهڻ ۽ پس منظر جي داخلن تي مشتمل پڙهڻ، يعني، ترتيبون جيڪي بي ترتيب جي اجازت ڏنل تعداد کان وڌيڪ آهن، لائبريري مان هٽايو ويو. باقي پڙهڻ جي حوالي سان، N-mer DNA تسلسل جيڪو شروعاتي نشان کان وٺي ختم ٿئي ٿو ۽ اسٽاپ نشان کان اڳ ختم ٿئي ٿو اصل پڙهڻ جي ترتيب مان ڪڍيو ويو ۽ وڌيڪ پروسيس ڪيو ويو (هتي "داخل ڪريو" جي طور تي حوالو ڏنو ويو). داخل ڪرڻ کان پوءِ، پرائمر جي 5′ آخر ۾ پهرين اسٽاپ ڪوڊون کان پوءِ وارو حصو داخل ڪرڻ کان هٽايو ويندو آهي. ان کان علاوه، پرائمر جي 3′ آخر ۾ نامڪمل ڪوڊون ڏانهن ويندڙ نيوڪليوٽائڊ پڻ هٽايو ويو. صرف پس منظر جي ترتيبن تي مشتمل داخلن کي خارج ڪرڻ لاءِ، امينو ايسڊ پيٽرن "PAG" سان شروع ٿيندڙ ترجمو ٿيل داخلن کي پڻ هٽايو ويو. لائبريري مان 3 امينو ايسڊ کان گهٽ جي پوسٽ-ٽرانسليشنل ڊيگهه سان پيپٽائڊس کي هٽايو ويو. آخرڪار، داخل ڪرڻ واري تلاءَ ۾ ريڊنڊنسي کي هٽايو ۽ هر منفرد داخل ڪرڻ جي تعدد جو تعين ڪريو. هن تجزيي جي نتيجن ۾ نيوڪليوٽائيڊ تسلسل (داخل) ۽ انهن جي (پڙهڻ) تعدد جي هڪ فهرست شامل هئي (اضافي شڪلون 1c ۽ 2).
گروپ N-mer DNA تسلسل جي مماثلت جي لحاظ کان داخل ٿئي ٿو: 454/Roche-مخصوص تسلسل جي غلطين کي ختم ڪرڻ لاءِ (جهڙوڪ تسلسل هوموپوليمر ايڪسٽينشن سان مسئلا) ۽ گهٽ اهم بيڪار شين کي ختم ڪرڻ لاءِ، اڳ ۾ فلٽر ٿيل N-mer DNA تسلسل جي داخل (داخل) کي هڪجهڙائي سان ترتيب ڏنو ويو آهي. داخل ڪرڻ (2 غير ملندڙ بنيادن تائين اجازت ڏني وئي) هڪ تکراري الگورتھم استعمال ڪندي جيڪو هيٺ ڏنل طور تي بيان ڪيو ويو آهي: داخل ڪرڻ پهرين انهن جي فريڪوئنسي (سڀ کان گهٽ کان گهٽ) جي لحاظ کان ترتيب ڏنل آهن، ۽ جيڪڏهن اهي ساڳيا آهن، انهن جي ثانوي ترتيب جي لحاظ کان ڊيگهه (ڊگهي کان ننڍو) جي لحاظ کان. اهڙيءَ طرح، سڀ کان وڌيڪ بار بار ۽ ڊگهيون داخل ڪرڻ پهرين "گروپ" جي وضاحت ڪن ٿيون. گروپ فريڪوئنسي کي اهم فريڪوئنسي تي سيٽ ڪيو ويو آهي. پوءِ، ترتيب ڏنل فهرست ۾ باقي هر داخل ڪرڻ کي جوڙو وار Needleman-Wunsch ترتيب ذريعي گروپ ۾ شامل ڪرڻ جي ڪوشش ڪئي وئي. جيڪڏهن هڪ ترتيب ۾ بي ترتيبي، داخل ڪرڻ، يا حذف ڪرڻ جو تعداد 2 جي حد کان وڌيڪ نه آهي، ته گروپ ۾ هڪ داخل ڪرڻ شامل ڪيو ويندو آهي، ۽ مجموعي طور تي گروپ فريڪوئنسي ان جي حساب سان وڌي ويندي آهي ته داخل ڪرڻ ڪيتري ڀيرا شامل ڪيو ويو. گروپ ۾ شامل ڪيل داخلن کي استعمال ٿيل طور نشان لڳايو ويو آهي ۽ وڌيڪ پروسيسنگ کان خارج ڪيو ويو آهي. جيڪڏهن داخل ڪرڻ واري ترتيب کي اڳ ۾ ئي موجود گروپ ۾ شامل نه ٿو ڪري سگهجي، ته داخل ڪرڻ واري ترتيب کي مناسب داخل ڪرڻ واري فريڪوئنسي سان هڪ نئون گروپ ٺاهڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي ۽ استعمال ٿيل طور تي نشان لڳايو ويندو آهي. ورهاڱي ختم ٿئي ٿي جڏهن هر داخل ڪرڻ واري ترتيب کي يا ته هڪ نئون گروپ ٺاهڻ لاءِ استعمال ڪيو ويندو آهي يا اڳ ۾ ئي موجود گروپ ۾ شامل ڪري سگهجي ٿو. آخرڪار، نيوڪليوٽائڊس تي مشتمل گروپ ٿيل داخل ڪرڻ کي آخرڪار پيپٽائڊ تسلسل (پيپٽائڊ لائبريريون) ۾ ترجمو ڪيو ويندو آهي. هن تجزيي جو نتيجو داخل ڪرڻ جو هڪ سيٽ ۽ انهن جي لاڳاپيل تعدد آهي جيڪي مسلسل پڙهڻ جو تعداد ٺاهيندا آهن (ضمني شڪل 2).
موٽف جنريشن: منفرد پيپٽائڊس جي هڪ فهرست جي بنياد تي، هڪ لائبريري ٺاهي وئي جنهن ۾ سڀ ممڪن امينو ايسڊ نمونا (aa) شامل هئا جيئن هيٺ ڏيکاريل آهي. ڊيگهه 3 جي هر ممڪن نموني کي پيپٽائڊ مان ڪڍيو ويو ۽ ان جي الٽي نموني کي هڪ عام موٽف لائبريري سان گڏ شامل ڪيو ويو جنهن ۾ سڀئي نمونا (ٽرائپيپٽائڊس) شامل هئا. انتهائي ورجائيندڙ نقشن جي لائبريرين کي ترتيب ڏني وئي ۽ ريڊنڊنسي کي هٽايو ويو. پوءِ، موٽف لائبريري ۾ هر ٽرائپيپٽائڊ لاءِ، اسان ڪمپيوٽيشنل اوزار استعمال ڪندي لائبريري ۾ ان جي موجودگي جي جانچ ڪئي. هن صورت ۾، مليل موٽف ٽرائپيپٽائڊ تي مشتمل پيپٽائڊ جي فريڪوئنسي شامل ڪئي وئي آهي ۽ موٽف لائبريري ۾ موٽف کي تفويض ڪئي وئي آهي ("موٽيف جو تعداد"). موٽف جنريشن جو نتيجو هڪ ٻه-dimensional صف آهي جنهن ۾ ٽرائپيپٽائڊس (موٽيف) جا سڀئي واقعا ۽ انهن جا لاڳاپيل قدر شامل آهن، جيڪي تسلسل پڙهڻ جو تعداد آهن جيڪي لاڳاپيل موٽف ۾ نتيجو ڏين ٿا جڏهن پڙهڻ کي فلٽر ڪيو ويندو آهي، گروپ ڪيو ويندو آهي، ۽ ترجمو ڪيو ويندو آهي. ميٽرڪس جيئن مٿي تفصيل سان بيان ڪيو ويو آهي.
نقشن ۽ لاڳاپيل اسڪيٽر پلاٽن جي تعداد کي عام ڪرڻ: هر نموني لاءِ نقشن جو تعداد استعمال ڪندي عام ڪيو ويو
جتي ni موضوع i تي مشتمل پڙهڻ جو تعداد آهي. تنهن ڪري، vi نموني ۾ موٽف i تي مشتمل پڙهڻ (يا پيپٽائڊس) جي فيصد فريڪوئنسي جي نمائندگي ڪري ٿو. موٽف جي غير نارملائيز ٿيل تعداد لاءِ P-ويليوز فشر جي صحيح ٽيسٽ استعمال ڪندي ڳڻيا ويا. موٽف جي تعداد جي ڪورليگرام جي حوالي سان، اسپيئرمين جي رابطي کي R سان موٽف جي نارملائيز ٿيل تعداد استعمال ڪندي ڳڻيو ويو.
پيپٽائيڊ لائبريري ۾ هر پوزيشن تي امينو ايسڊ جي مواد کي ڏسڻ لاءِ، ويب لوگوگرام 32، 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ٺاهيا ويا. پهرين، 12-mer پيپٽائيڊ جي هر پوزيشن تي امينو ايسڊ جو مواد 20×12 ميٽرڪس ۾ محفوظ ڪيو ويندو آهي. پوءِ، 1000 پيپٽائيڊس جو هڪ سيٽ جنهن ۾ هر پوزيشن تي ساڳيو لاڳاپو امينو ايسڊ مواد هوندو آهي، فاسٽا-سيڪونس فارميٽ ۾ پيدا ڪيو ويندو آهي ۽ ويب-لوگو 3 ۾ ان پٽ جي طور تي مهيا ڪيو ويندو آهي، جيڪو هر پوزيشن تي لاڳاپو امينو ايسڊ مواد جي گرافيڪل نمائندگي پيدا ڪري ٿو. ڏنل پيپٽائيڊ لائبريري لاءِ. ملٽي ڊائمينشنل ڊيٽاسيٽس کي ڏسڻ لاءِ، آر ۾ اندروني طور تي ترقي يافته اوزار استعمال ڪندي گرمي جا نقشا ٺاهيا ويا (بائيوس هيٽ ميپ، هڪ اڃا تائين جاري نه ٿيل آر پيڪيج). گرمي جي نقشن ۾ پيش ڪيل ڊينڊروگرام يوڪلائيڊين فاصلي ميٽرڪ سان وارڊ جي هيئرارڪيڪل ڪلسٽرنگ طريقي سان حساب ڪيا ويا. موٽيف اسڪورنگ ڊيٽا جي شمارياتي تجزيي لاءِ، غير معمولي اسڪورنگ لاءِ پي ويلز فشر جي صحيح ٽيسٽ استعمال ڪندي حساب ڪيا ويا. ٻين ڊيٽاسيٽس لاءِ P-قدر شاگردن جي ٽي-ٽيسٽ يا ANOVA استعمال ڪندي R ۾ ڳڻيا ويا.
چونڊيل فيج ڪلون ۽ فيجز بغير انسرٽس جي ٽيل وين ذريعي نس ۾ داخل ڪيا ويا (2×1010 فيجز/جانور 300 μl PBS ۾). پرفيوژن ۽ بعد ۾ فڪسيشن کان ڏهه منٽ اڳ، ساڳين جانورن کي DyLight594-ليبل ٿيل ليڪٽين جي 100 μl سان نس ۾ داخل ڪيو ويو (ویکٹر ليبارٽريز انڪارپوريٽيڊ، DL-1177). فيج انجيڪشن کان 60 منٽ پوءِ، چوهڙن کي دل ذريعي 50 ml PBS سان پرفيوز ڪيو ويو ۽ ان کان پوءِ 50 ml 4% PFA/PBS. دماغ جا نمونا اضافي طور تي رات جو 4% PFA/PBS ۾ مقرر ڪيا ويا ۽ رات جو 4°C تي 30% سوڪروز ۾ ٻوڙي ڇڏيا ويا. نمونا OCT مرکب ۾ فليش منجمد ڪيا ويا آهن. منجمد نمونن جو اميونهسٽو ڪيميڪل تجزيو ڪمري جي حرارت تي 1٪ BSA سان بلاڪ ٿيل 30 µm ڪرائوسيڪشن تي ڪيو ويو ۽ 4 °C تي T7 فيج (نووس NB 600-376A) جي خلاف پولي ڪلونل FITC-ليبل ٿيل اينٽي باڊيز سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو. رات جو انڪيوبيٽ ڪيو ويو. آخرڪار، حصن کي PBS سان 3 ڀيرا ڌويو ويو ۽ هڪ ڪنفوڪل ليزر مائڪروسڪوپ (ليڪا TCS SP5) سان جانچيو ويو.
سڀ پيپٽائڊس جن جي گھٽ ۾ گھٽ 98٪ پاڪائي هئي، انهن کي GenScript USA پاران سنٿيسائز ڪيو ويو، بايوٽينيلٽڊ ۽ لائوفيلائيز ڪيو ويو. بايوٽين اين-ٽرمينس تي هڪ اضافي ٽرپل گلائسين اسپيسر ذريعي پابند آهي. ماس اسپيڪٽروميٽري استعمال ڪندي سڀني پيپٽائڊس کي چيڪ ڪريو.
اسٽريپٽاويڊن (سگما S0677) کي بايوٽينيلٽيڊ پيپٽائيڊ، بايوٽينيلٽيڊ BACE1 انحيبيٽري پيپٽائيڊ، يا بايوٽينيلٽيڊ BACE1 انحيبيٽري پيپٽائيڊ ۽ BACE1 انحيبيٽري پيپٽائيڊ جي ميلاپ (3:1 تناسب) جي 5-گنا برابر اضافي سان ملايو ويو 5-10٪ DMSO/PBS ۾ انڪيوبيٽ ڪيو ويو. انجيڪشن کان اڳ ڪمري جي حرارت تي 1 ڪلاڪ. اسٽريپٽاويڊن-ڪنجوگيٽڊ پيپٽائيڊس کي دماغي گفا سان چوهڙن جي پڇ جي رڳن مان هڪ ۾ 10 ملي گرام/ڪلوگرام جي دوز تي نس ذريعي انجيڪٽ ڪيو ويو.
اسٽريپٽاوڊين-پيپٽائيڊ ڪمپليڪس جي ڪنسنٽريشن جو جائزو ELISA پاران ورتو ويو. Nunc Maxisorp مائڪروٽائٽر پليٽس (سگما) کي رات جو 4°C تي 1.5 μg/ml ماؤس اينٽي اسٽريپٽاوڊين اينٽي باڊي (Thermo, MA1-20011) سان ڪوٽ ڪيو ويو. بلاڪ ڪرڻ کان پوءِ (بلاڪنگ بفر: 140 nM NaCL، 5 mM EDTA، 0.05% NP40، 0.25% جليٽين، 1% BSA) ڪمري جي حرارت تي 2 ڪلاڪن لاءِ، پليٽ کي 0.05% Tween-20/PBS (واش بفر) سان 3 سيڪنڊن لاءِ ڌوئو، CSF ۽ پلازما جا نمونا بلاڪنگ بفر (پلازما 1:10,000، CSF 1:115) سان ملائي ويلن ۾ شامل ڪيا ويا. پوءِ پليٽ کي رات جو 4°C تي ڊيٽيڪشن اينٽي باڊي (1 μg/ml، اينٽي اسٽريپٽاوڊين-HRP، Novus NB120-7239) سان انڪيوبيٽ ڪيو ويو. ٽن ڌوئڻ جي مرحلن کان پوءِ، TMB سبسٽريٽ محلول (روشي) ۾ 20 منٽن تائين انڪيوبيشن ذريعي اسٽريپٽاوڊين جو پتو لڳايو ويو. 1M H2SO4 سان رنگ جي ترقي کي روڪڻ کان پوءِ، جذب کي 450 nm تي ماپيو.
اسٽريپٽاوڊين-پيپٽائيڊ-بي اي سي اي 1 انابيٽر ڪمپليڪس جي ڪم جو جائزو Aβ(1-40) ELISA پاران ٺاهيندڙ جي پروٽوڪول (واڪو، 294-64701) جي مطابق ڪيو ويو. مختصر طور تي، CSF نمونن کي معياري ڊائيلوئنٽ (1:23) ۾ ملايو ويو ۽ BNT77 ڪيپچر اينٽي باڊي سان ڍڪيل 96 ويل پليٽن ۾ رات جو 4 ° C تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو. پنجن ڌوئڻ جي مرحلن کان پوءِ، HRP-ڪنجوگيٽڊ BA27 اينٽي باڊي شامل ڪئي وئي ۽ 4 ° C تي 2 ڪلاڪن لاءِ انڪيوبيٽ ڪيو ويو، ان کان پوءِ پنج ڌوئڻ جا مرحلا. Aβ(1–40) کي ڪمري جي حرارت تي 30 منٽن لاءِ TMB محلول ۾ انڪيوبيشن ذريعي معلوم ڪيو ويو. اسٽاپ محلول سان رنگ جي ترقي کي روڪڻ کان پوءِ، 450 nm تي جذب کي ماپيو. پلازما جي نمونن کي Aβ(1–40) ELISA کان اڳ سولڊ فيز ڪڍڻ جي تابع ڪيو ويو. پلازما کي 96 ويل پليٽن ۾ 0.2% DEA (سگما) ۾ شامل ڪيو ويو ۽ 30 منٽن لاءِ ڪمري جي حرارت تي انڪيوبيٽ ڪيو ويو. SPE پليٽن (Oasis, 186000679) کي پاڻي ۽ 100٪ ميٿانول سان مسلسل ڌوئڻ کان پوءِ، پلازما جا نمونا SPE پليٽن ۾ شامل ڪيا ويا ۽ سڀ مائع ڪڍيا ويا. نمونن کي ڌوتو ويو (پهرين 5٪ ميٿانول سان پوءِ 30٪ ميٿانول سان) ۽ 2٪ NH4OH/90٪ ميٿانول سان ايليوٽ ڪيو ويو. مسلسل N2 ڪرنٽ تي 99 منٽن لاءِ 55 ° C تي ايليوٽ کي خشڪ ڪرڻ کان پوءِ، نمونن کي معياري ڊائيلوئنٽ ۾ گھٽايو ويو ۽ Aβ(1–40) کي مٿي بيان ڪيل طور تي ماپيو ويو.
هن مضمون جو حوالو ڪيئن ڏجي: يورچ، اي. وغيره. دماغ تائين ڪارگو پهچائڻ ٽرانزٽ پيپٽائڊس استعمال ڪندي جن جي سڃاڻپ ويوو ۾ ڪئي وئي آهي. سائنس. 5، 14104؛ doi:10.1038/srep14104 (2015).
لکوٽا جي.، اسڪجورنگ ٽي.، ٿامسن ايل بي ۽ موس ٽي. ٽارگيٽيڊ ٿراپي استعمال ڪندي دماغ تائين ميڪرو ماليڪيولر دوائن جي پهچائڻ. جرنل آف نيورو ڪيمسٽري 113، 1–13، 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
براسنجيوڪ، آءِ.، اسٽينبش، ايڇ ڊبليو، شمٽز، سي.، ۽ مارٽينز-مارٽينز، پي. رت جي دماغ جي رڪاوٽ جي پار پيپٽائيڊ ۽ پروٽين جي دوائن جي ترسيل. پروگ نيوروبيول 87، 212-251، 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
پارڊريج، ڊبليو ايم رت-دماغ جي رڪاوٽ: دماغي دوا جي ترقي ۾ هڪ رڪاوٽ. نيورو آر ايڪس 2، 3-14، 10.1602/نيورڪس.2.1.3 (2005).
جوهانسن، ڪي اي، ڊنڪن، جي اي، اسٽوپا، اي جي، ۽ برڊ، اي. ڪوروائيڊ پلڪسس-سي ايس ايف رستي ذريعي دماغ تائين دوا جي بهتر پهچائڻ ۽ نشانو بڻائڻ جا امڪان. دواسازي جي تحقيق 22، 1011-1037، 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
پارڊريج، ڊبليو ايم دماغ جي ترسيل لاءِ ماليڪيولر ٽروجن هارس سان بايو فارماسوٽيڪل جي جديديت. بايوڪنجگ ڪيم 19، 1327–1338، 10.1021/bc800148t (2008).
پارڊريج، ڊبليو ايم ريڪٽر-ثالثي پيپٽائيڊ ٽرانسپورٽ رت-دماغ جي رڪاوٽ پار. اينڊوڪر ريو. 7، 314-330 (1986).
نيووهنر، جي. وغيره. مونوويلنٽ ماليڪيولر شٽل استعمال ڪندي دماغ جي دخول ۽ علاج واري اينٽي باڊيز جي اثرائتي کي وڌايو. نيورون 81، 49-60، 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
بين-لي، اين. وغيره. ٽرانسفرين ريڪٽر (ٽي ايف آر) ٽرانسپورٽ دماغ ۾ ٽي ايف آر اينٽي باڊيز جي لاڳاپي جي مختلف قسمن جي جذب کي طئي ڪري ٿو. جي ايڪسپ ميڊ 211، 233–244، 10.1084/jem.20131660 (2014).