א דאנק פארן באזוכן Nature.com. איר ניצט א בראַוזער ווערסיע מיט באגרענעצטע CSS שטיצע. פאר דער בעסטער דערפאַרונג, רעקאָמענדירן מיר אז איר זאָלט ניצן אן אפדעיטירטן בראַוזער (אָדער אויסלעשן קאָמפּאַטיביליטי מאָדע אין אינטערנעט עקספּלאָרער). דערצו, צו זיכער מאַכן אָנגייענדיקע שטיצע, ווייַזן מיר דעם וועבזייטל אָן סטילן און דזשאַוואַסקריפּט.
ווײַזט אַ קאַרוסעל פֿון דרײַ סליידס אויף איין מאָל. ניצט די "פֿריִערדיקע" און "ווײַטער" קנעפּלעך צו גיין דורך דרײַ סליידס אויף איין מאָל, אָדער ניצט די "סליידער" קנעפּלעך אין סוף צו גיין דורך דרײַ סליידס אויף איין מאָל.
די בלוט-מוח באַריערע און די בלוט-מוח באַריערע פאַרהיטן ביאָטהעראַפּעווטישע אגענטן פון דערגרייכן זייערע צילן אין דעם צענטראלן נערווען סיסטעם, דערמיט שטערט עפעקטיווע באַהאַנדלונג פון נעוראָלאָגישע קראַנקייטן. כּדי צו אַנטדעקן נייע מוח טראַנספּאָרטערס אין וויוואָ, האָבן מיר איינגעפירט אַ T7 פאַגע פּעפּטיד ביבליאָטעק און סעריעל געזאַמלט בלוט און סערעבראָספּינאַל פליסיקייט (CSF) ניצנדיק אַ קאַנולירט באַוואוסטזיניק גרויס פּול מאָדעל פון ראַץ. ספּעציפֿישע פאַגע קלאָונז זענען העכסט ענריטשט אין CSF נאָך פיר ראָונדס פון סעלעקציע. טעסטינג פון יחיד קאַנדידאַט פּעפּטיידז האט גילוי מער ווי 1000-פאַך ענריטשמענט אין CSF. די ביאָאַקטיוויטי פון די פּעפּטייד-מעדיאַטעד עקספּרעס צו דעם מוח איז באַשטעטיקט דורך אַ 40% רעדוקציע אין דעם מדרגה פון אַמילאָיד-β אין דער סערעבראָספּינאַל פליסיקייט ניצנדיק אַ BACE1 פּעפּטייד ינכיבאַטאָר לינגקט צו דעם אידענטיפיצירטן נייעם טראַנזיט פּעפּטייד. די רעזולטאַטן פֿאָרשלאָגן אַז די פּעפּטיידז אידענטיפיצירט דורך אין וויוואָ פאַגע סעלעקציע מעטהאָדס קען זיין נוציק וועהיקלעס פֿאַר סיסטעמישע עקספּרעס פון מאַקראָמאָלעקולעס צו דעם מוח מיט אַ טעראַפּעווטיש ווירקונג.
צענטראל נערווען סיסטעם (CNS) צילגעריכטע טעראַפּיע פאָרשונג האט לאַרגעלי פאָוקיסט אויף ידענטיפיצירן אָפּטימיזעד דרוגס און אגענטן וואָס ווייַזן CNS-טאַרגעטינג פּראָפּערטיעס, מיט ווייניקער מי אויף אַנטדעקן די מעקאַניזאַמז וואָס פירן אַקטיוו מעדיצין עקספּרעס צו די מאַרך. דאָס הייבט זיך אָן צו טוישן איצט ווי מעדיצין עקספּרעס, ספּעציעל גרויסע מאָלעקולן, איז אַן ינטאַגראַל טייל פון מאָדערן נעוראָוויסנשאַפט מעדיצין אַנטוויקלונג. די סביבה פון די צענטראל נערווען סיסטעם איז גוט פּראָטעקטעד דורך די סערעבראָוואַסקולאַר באַריער סיסטעם, באַשטייענדיק פון די בלוט-מאַרך באַריער (BBB) ​​​​און די בלוט-מאַרך באַריער (BCBB)1, מאכן עס טשאַלאַנדזשינג צו צושטעלן דרוגס צו די מאַרך1,2. עס איז עסטימאַטעד אַז כּמעט אַלע גרויס מאָלעקול דרוגס און מער ווי 98% פון קליין מאָלעקול דרוגס זענען ילימאַנייטאַד פון די מאַרך3. דעריבער איז עס זייער וויכטיק צו ידענטיפיצירן נייַע מאַרך טראַנספּאָרט סיסטעמען וואָס צושטעלן עפעקטיוו און ספּעציפיש עקספּרעס פון טעראַפּיוטיק דרוגס צו די CNS 4,5. אָבער, די BBB און BCSFB אויך פאָרשטעלן אַ ויסגעצייכנט געלעגנהייט פֿאַר מעדיצין עקספּרעס ווי זיי דורכנעמען און אַרייַן אַלע סטרוקטורן פון די מאַרך דורך זייַן ברייט וואַסקולאַטור. אזוי, די איצטיקע אנשטרענגונגען צו נוצן נישט-אינוואזיווע מעטאדן פון צושטעלן צום מוח זענען מערסטנס באזירט אויף דעם מעכאניזם פון רעצעפטאר-מעדיאַטעד טראנספארט (PMT) ניצנדיק דעם ענדאָגענאָוס BBB6 רעצעפטאר. טראָץ די לעצטע שליסל אַדוואַנסאַז ניצנדיק דעם טראַנספעררין רעצעפטאר פּאַטוויי7,8, איז ווייטערדיקע אַנטוויקלונג פון נייע צושטעלן סיסטעמען מיט פֿאַרבעסערטע אייגנשאַפטן נויטיק. צו דעם צוועק, איז אונדזער ציל געווען צו ידענטיפיצירן פּעפּטיידן וואָס זענען טויגעוודיק צו מעדיאַטירן CSF טראַנספּאָרט, ווייל זיי קענען אין פּרינציפּ ווערן גענוצט צו צושטעלן מאַקראָמאָלעקולן צום CNS אָדער צו עפֿענען נייע רעצעפטאר פּאַטווייז. אין באַזונדער, קענען ספּעציפֿישע רעצעפּטאָרס און טראַנספּאָרטערס פון דעם סערעבראָוואַסקולאַר סיסטעם (BBB און BSCFB) דינען ווי פּאָטענציעלע צילן פֿאַר דער אַקטיווער און ספּעציפֿישער צושטעלן פון ביאָטהעראַפּעווטישע דרוגס. סערעבראָספּינאַל פליסיקייט (CSF) איז אַ סעקרעטאָריש פּראָדוקט פון דעם כאָראָיד פּלעקסוס (CS) און איז אין דירעקטן קאָנטאַקט מיט דער אינטערסטיטיאַל פליסיקייט פון מוח דורך דעם סובאַראַכנאָיד פּלאַץ און ווענטריקולאַר פּלאַץ4. לעצטנס איז געוויזן געוואָרן אַז סובאַראַכנאָיד סערעבראָספּינאַל פליסיקייט דיפיוזיז יקסעסיוולי אין דעם אינטערסטיטיום פון מוח9. מיר האָפן צו צוקומען צום פּאַרענטשימאַלן פּלאַץ ניצנדיק דעם סובאַראַכנאָידן איינפלוס טראַקט אָדער גלייך דורך די BBB. כּדי דאָס צו דערגרייכן, האָבן מיר ימפּלעמענטירט אַ שטאַרקע אין וויוואָ פאַגע סעלעקציע סטראַטעגיע וואָס ידעאַל אידענטיפיצירט פּעפּטיידן טראַנספּאָרטירט דורך איינעם פון די צוויי באַזונדערע פּאַטווייז.
מיר באַשרײַבן איצט אַ סיקווענטשאַל אין וויוואָ פאַגע דיספּליי סקרינינג מעטאָד מיט CSF סאַמפּלינג קאַפּאַלד מיט הויך טרופּוט סיקוואַנסינג (HTS) צו מאָניטאָרירן ערשט סעלעקציע ראָונדס מיט די העכסטן ביבליאָטעק דייווערסיטי. סקרינינג איז דורכגעפירט געוואָרן אויף באַוואוסטזיניקע ראַץ מיט אַ שטענדיק ימפּלאַנטיד גרויס סיסטערנאַ (CM) קאַנולאַ צו ויסמיידן בלוט קאַנטאַמאַניישאַן. וויכטיק, דעם צוגאַנג סעלעקטירט ביידע מאַרך-טאַרגעטינג און פּעפּטיידז מיט טראַנספּאָרט טעטיקייט אַריבער די סערעבראָוואַסקולאַר באַריער. מיר האָבן געניצט T7 פאַגעס רעכט צו זייער קליין גרייס (~60 נם)10 און סאַגדזשעסטיד אַז זיי זענען פּאַסיק פֿאַר די טראַנספּאָרט פון וועסיקלעס וואָס לאָזן טראַנססעלולאַר קרייַז פון די ענדאָטעליאַל און/אָדער עפּיטעליאַל-מעדולאַ באַריער. נאָך פיר ראָונדס פון פּאַנינג, פאַגע פּאָפּולאַציעס זענען אפגעזונדערט ווייַזונג שטאַרק אין וויוואָ CSF ​​ענריטשמענט און סערעבראַל מיקראָוועססעל אַסאָוסייישאַן. וויכטיק, מיר זענען געווען ביכולת צו באַשטעטיקן אונדזער פיינדינגז דורך דעמאַנסטרייטינג אַז די בילכער און כעמיש סינטעזייזד בעסטער קאַנדידאַט פּעפּטיידז זענען ביכולת צו טראַנספּאָרט פּראָטעין לאַסט אין די סערעבראָספּינאַל פליסיק. ערשטנס, די פארמאקאדינאמישע ווירקונגען פון די צענטראל-סיסטעם (CNS) זענען געגרינדעט געווארן דורך קאמבינירן א פירנדיקן טראנזיט פּעפּטייד מיט אן אינהיביטאָר פון די BACE1 פּעפּטייד. אין צוגאב צו דעמאנסטרירן אז אין וויוואָ פונקציאָנעלע סקרינינג סטראַטעגיעס קענען אידענטיפיצירן נייע מוח-טראנספארט פּעפּטיידן ווי עפעקטיווע פּראָטעין לאַסט טרעגער, מיר ערוואַרטן אז ענלעכע פונקציאָנעלע סעלעקציע צוגאַנגען וועלן אויך ווערן וויכטיק אין אידענטיפיצירן נייע מוח-טראנספארט וועגן.
באַזירט אויף פּלאַק-פאָרמינג יוניץ (PFU), נאָך דעם פאַגע פּאַקאַדזשינג שריט, איז אַ ביבליאָטעק פון ראַנדאָם 12-מער לינעאַר T7 פאַגע פּעפּטיידן מיט אַ דייווערסיטי פון בעערעך 109 דיזיינד און באשאפן געוואָרן (זען מאַטעריאַלן און מעטאָדן). עס איז וויכטיק צו באַמערקן אַז מיר האָבן קערפול אַנאַליזירט די ביבליאָטעק איידער אין וויוואָ פּאַנינג. PCR אַמפּליפיקאַציע פון ​​פאַגע ביבליאָטעק סאַמפּאַלז ניצן מאָדיפיצירטע פּריימערס האט דזשענערייטאַד אַמפּליקאָנס וואָס זענען געווען גלייך אַפּליקאַבאַל צו HTS (סאַפּלעמענטאַרי פיג. 1a). רעכט צו a) HTS11 סיקוואַנסינג ערראָרס, b) פּראַל אויף די קוואַליטעט פון פּריימערס (NNK) 1-12, און c) די בייַזייַן פון ווילד-טיפּ (wt) פאַגע (סקעלעט ינסערץ) אין די סטאַנדביי ביבליאָטעק, איז אַ סיקוואַנס פילטערינג פּראָצעדור ימפּלאַמענטאַד צו עקסטראַקט בלויז וועראַפייד סיקוואַנס אינפֿאָרמאַציע (סאַפּלעמענטאַרי פיג. 1b). די פילטער טריט אַפּלייז צו אַלע HTS סיקוואַנסינג ביבליאָטעקן. פֿאַר די סטאַנדאַרט ביבליאָטעק, אַ גאַנץ פון 233,868 רידז זענען באקומען, פון וועלכע 39% האָבן דורכגעגאנגען די פילטער קרייטיריאַ און זענען געניצט פֿאַר ביבליאָטעק אַנאַליסיס און סעלעקציע פֿאַר סאַבסאַקוואַנט ראָונדס (סאַפּלעמענטאַרי פיגור 1c-e). די לייענונגען זענען געווען איבערהויפט קייפל פון 3 באַזע פּאָרן אין לענג מיט אַ שפּיץ ביי 36 נוקלעאָטידן (צוגאב בילד 1c), באַשטעטיקנדיק דעם ביבליאָטעק פּלאַן (NNK) 1-12. באַמערקענסווערט, אַפּראָקסימאַטלי 11% פון די ביבליאָטעק מיטגלידער האָבן אַנטהאַלטן אַ 12-דימענסיאָנאַלן ווילד-טיפּ (wt) באַקבאָון PAGISRELVDKL ינסערט, און כּמעט העלפט פון די סיקוואַנסן (49%) האָבן אַנטהאַלטן ינסערשאַנז אָדער דילעשאַנז. די HTS פון דער ביבליאָטעק ביבליאָטעק האָט באַשטעטיקט די הויך דייווערסיטי פון פּעפּטיידן אין דער ביבליאָטעק: מער ווי 81% פון פּעפּטיד סיקוואַנסן זענען געפֿונען געוואָרן בלויז איין מאָל און בלויז 1.5% זענען פארגעקומען אין ≥4 קאָפּיעס (צוגאב בילד 2a). די פרעקווענצן פון אַמינאָ זויערן (aa) ביי אַלע 12 פּאָזיציעס אין דעם רעפּערטואַר האָבן גוט קאָרעלירט מיט די פרעקווענצן ערוואַרטעט פֿאַר די נומער פון קאָדאָנס דזשענערייטאַד דורך דעם דעגענערירטן NKK רעפּערטואַר (צוגאב בילד 2b). די באמערקטע פרעקווענץ פון aa רעזאַדוז קאָדירט דורך די ינסערץ האָט גוט קאָרעלירט מיט דער קאַלקיאַלייטיד פרעקווענץ (r = 0.893) (צוגאב בילד 2c). די צוגרייטונג פון פאַג ביבליאָטעקן פֿאַר ינדזשעקשאַן כולל די טריט פון אַמפּליפיקאַציע און באַזייַטיקונג פון ענדאָטאָקסין. דאָס איז פריער געוויזן צו פּאָטענציעל רעדוצירן די דייווערסיטי פון פאַג ביבליאָטעקן12,13. דעריבער, מיר סיקוואַנסט אַ פּלאַטע-אַמפּליפייד פאַג ביבליאָטעק וואָס האט אַנדערגאָן ענדאָטאָקסין באַזייַטיקונג און קאַמפּערד עס מיט די אָריגינעל ביבליאָטעק צו אָפּשאַצן די אָפטקייַט פון AA. א שטאַרק קאָרעלאַציע (r = 0.995) איז באמערקט צווישן די אָריגינעל פּול און די אַמפּליפייד און פּיוראַפייד פּול (סאַפּלעמענטאַרי פיג. 2ד), ינדיקייטינג אַז קאַמפּאַטישאַן צווישן קלאָונז אַמפּליפייד אויף פּלאַטעס ניצן T7 פאַג האט נישט געפֿירט הויפּט בייאַס. דעם פאַרגלייַך איז באזירט אויף די אָפטקייַט פון טריפּעפּטייד מאָטיווז אין יעדער ביבליאָטעק, ווייַל די דייווערסיטי פון ביבליאָטעקן (~109) קענען נישט זיין גאָר קאַפּטשערד אפילו מיט HTS. אָפטקייַט אַנאַליסיס פון aa אין יעדער שטעלע גילוי אַ קליין שטעלע-אָפענגיק בייאַס אין די לעצטע דרייַ שטעלעס פון די אריין רעפּערטואַר (סאַפּלעמענטאַרי פיג. 2e). אין מסקנא, מיר געפונען אַז די קוואַליטעט און דייווערסיטי פון די ביבליאָטעק זענען געווען פּאַסיק און בלויז מינערווערטיק ענדערונגען אין דייווערסיטי זענען באמערקט רעכט צו אַמפּליפיקאַציע און צוגרייטונג פון פאַג ביבליאָטעקן צווישן עטלעכע ראָונדס פון סעלעקציע.
סעריעלע צערעבראָספּינאַל פליסיק סאַמפּלינג קען דורכגעפירט ווערן דורך כירורגיש ימפּלאַנטינג אַ קאַנולאַ אין די CM פון באַוואוסטזיניקע ראַץ צו פאַסילאַטייט אידענטיפיקאַציע פון ​​T7 פאַגע ינדזשעקטעד ינטראַווענאָוסלי (iv) דורך די BBB און/אָדער BCSFB (פיגור 1a-b). מיר האָבן גענוצט צוויי אומאָפּהענגיקע סעלעקציע אָרעמס (אָרעמס A און B) אין די ערשטע דריי ראָונדס פון אין וויוואָ סעלעקציע (פיגור 1c). מיר האָבן ביסלעכווייַז געוואקסן די סטרינדזשענסי פון די סעלעקציע דורך דיקריסינג די גאַנץ סומע פון ​​פאַגע ינטראָודוסט אין די ערשטע דריי ראָונדס פון סעלעקציע. פֿאַר די פערט קייַלעכיק פון פּאַנינג, מיר קאַמביינד סאַמפּאַלז פון צווייגן A און B און דורכגעפירט דרייַ נאָך אומאָפּהענגיקע סעלעקשאַנז. צו שטודירן די אין וויוואָ פּראָפּערטיעס פון T7 פאַגע פּאַרטיקאַלז אין דעם מאָדעל, ווילד-טיפּ פאַגע (PAGISRELVDKL בעל ינסערט) איז ינדזשעקטעד אין ראַץ דורך די עק ווענע. אָפּזוך פון פאַגעס פון צערעבראָספּינאַל פליסיק און בלוט אין פאַרשידענע צייט פונקטן האט געוויזן אַז לעפיערעך קליין T7 יקאָסאַהעדראַל פאַגעס האָבן אַ שנעל ערשט קלעאַראַנס פאַסע פון ​​די בלוט אָפּטייל (סאַפּלעמענטאַרי פיגור 3). באַזירט אויף די טיטערס וואָס זענען אַדמיניסטרירט געוואָרן און דעם בלוט וואָלומען פון די ראַץ, האָבן מיר אויסגערעכנט אַז בלויז אַרום 1% וואָג פאַגע פון ​​דער אַדמיניסטרירטער דאָזע איז דעטעקטירט געוואָרן אין בלוט 10 מינוט נאָך דער אינטראַווענאָזער אינדזשעקציע. נאָך דעם ערשטן שנעלן אַראָפּגאַנג, איז אַ שטייטערע ערשטיקע קלעאַראַנס געמאָסטן געוואָרן מיט אַ האַלב-לעבן פון 27.7 מינוט. וויכטיק, בלויז זייער ווייניק פאַגעס זענען אַרויסגענומען געוואָרן פון דעם CSF אָפּטייל, וואָס ווײַזט אויף אַ נידעריקן הינטערגרונט פֿאַר ווילד-טיפּ פאַגע מיגראַציע אין דעם CSF אָפּטייל (צוגאב בילד 3). אין דורכשניט, בלויז אַרום 1 x 10-3% טיטערס פון T7 פאַגע אין בלוט און 4 x 10-8% פון ערשט אינפיוזד פאַגעס זענען דעטעקטירט געוואָרן אין דער סערעבראָספּינאַלער פליסיקייט איבער דער גאַנצער סאַמפּלינג פּעריאָדע (0-250 מינוט). באַמערקענסווערט, די האַלב-לעבן (25.7 מינוט) פון ווילד-טיפּ פאַגע אין סערעבראָספּינאַלער פליסיקייט איז געווען ענלעך צו דעם וואָס איז באמערקט געוואָרן אין בלוט. די דאַטן ווײַזן אַז די באַריערע וואָס טיילט אָפּ דעם CSF אָפּטייל פֿון דעם בלוט איז גאַנץ אין CM-קאַנולירטע ראַץ, וואָס ערמעגליכט אין וויוואָ סעלעקציע פֿון פֿאַגע ביבליאָטעקן צו ידענטיפֿיצירן קלאָנען וואָס ווערן גרינג טראַנספּאָרטירט פֿון דעם בלוט אין דעם CSF אָפּטייל.
(א) אויפשטעלן א מעטאד פאר איבערנעמען מוסטערונגען פון צערעבראספינאלע פליסיקייט (CSF) פון א גרויסן בעקן. (ב) דיאגראם וואס ווייזט די צעלולארע לאקאציע פון ​​דער צענטראלער נערווען סיסטעם (CNS) באריערע און די סעלעקציע סטראטעגיע גענוצט צו אידענטיפיצירן פעפטיידן וואס גייען אריבער די בלוט-מוח באריערע (BBB) ​​און די בלוט-מוח באריערע. (ג) אין וויווא פאג דיספלעי סקרינינג פלוס-טשארט. אין יעדן אויסוואל-רונדע, זענען פאגעס (חיות-אידענטיפיצירער אינעווייניק די פיילן) אינדזשעקטירט געווארן אינטראווענעז. צוויי אומאפהענגיקע אלטערנאטיווע צווייגן (A, B) ווערן געהאלטן באזונדער ביזן פערטן רונדע פון ​​סעלעקציע. פאר סעלעקציע רונדעס 3 און 4, איז יעדער פאג קלאן עקסטראקטירט פון CSF מאנועל סיקווענסט געווארן. (ד) קינעטיק פון פאג אפגעזונדערט פון בלוט (רויטע קרייזן) און צערעבראספינאלע פליסיקייט (גרינע דרייעקן) בעת דעם ערשטן רונדע פון ​​סעלעקציע אין צוויי קאנולירטע ראצן נאך אינטראווענעזער אינדזשעקציע פון ​​דער T7 פעפטיד ביבליאטעק (2 x 1012 פאגעס/חיות). בלויע קוואדראטן ווייזן די דורכשניטליכע ערשטע קאנצענטראציע פון ​​פאג אין בלוט, בארעכנט פון דער צאל אינדזשעקטירטע פאג, נעמענדיג אין באטראכט דעם גאנצן בלוט וואליום. די שוואַרצע קוואַדראַטן ווײַזן דעם פונקט פון ינטערסעקשאַן פון דער y ליניע עקסטראַפּאָלירט פון בלוט פאַגע קאָנצענטראַציעס. (e,f) פּרעזענטירט די רעלאַטיווע אָפטקייט און פאַרשפּרייטונג פון אַלע מעגלעכע אָוווערלאַפּינג טריפּעפּטיד מאָטיוון געפֿונען אין דעם פּעפּטיד. די צאָל מאָטיוון געפֿונען אין 1000 לייענונגען ווערט געוויזן. באַדײַטנדיק (p < 0.001) ענריטשט מאָטיוון זענען געמאַרקט מיט רויטע פּונקטן. (e) קאָרעלאַציע סקאַטערפּלאָט וואָס פאַרגלײַכט די רעלאַטיווע אָפטקייט פון דעם טריפּעפּטיד מאָטיוו פון דער ינדזשעקטעד ביבליאָטעק מיט בלוט-דערייווד פאַגע פון ​​חיות #1.1 און #1.2. (f) קאָרעלאַציע סקאַטערפּלאָט וואָס פאַרגלײַכט די רעלאַטיווע אָפטקייטן פון כייַע פאַגע טריפּעפּטיד מאָטיוון #1.1 און #1.2 אפגעזונדערט אין בלוט און סערעבראָספּינאַל פליסיק. (g, h) סיקוואַנס ID רעפּרעזענטאַציע פון ​​פאַגע ענריטשט אין בלוט (g) קעגן ינדזשעקטעד ביבליאָטעקן און פאַגע ענריטשט אין CSF (h) קעגן בלוט נאָך אַ קייַלעכיק פון אין וויוואָ סעלעקציע אין ביידע חיות. די גרייס פון דעם איין-בוך קאָד ווײַזט ווי אָפט יענע אַמינאָ זויער קומט פֿאָר אין יענער פּאָזיציע. גרין = פּאָלאַר, לילאַ = נייטראַל, בלוי = באַזיש, רויט = זויער און שוואַרץ = הידראָפאָבישע אַמינאָ זויערן. פיגור 1אַ, ב איז דיזיינט און פּראָדוצירט געוואָרן דורך עדואַרד אוריטש.
מיר האָבן אינדזשעקטירט אַ פאַג פּעפּטיד ביבליאָטעק אין צוויי CM אינסטרומענט ראַץ (קלאַדעס A און B) און אפגעזונדערט פאַג פון סערעבראָספּינאַל פליסיקייט און בלוט (פיגור 1ד). די ערשטע שנעלע קלעאַראַנס פון דער ביבליאָטעק איז געווען ווייניקער אויסגעשפּראָכן קאַמפּערד צו די ווילד-טיפּ פאַג. די דורכשניטלעך האַלב-לעבן פון דער אינדזשעקטירטער ביבליאָטעק אין ביידע חיות איז געווען 24.8 מינוט אין בלוט, ענלעך צו ווילד-טיפּ פאַג, און 38.5 מינוט אין CSF. בלוט און סערעבראָספּינאַל פליסיקייט פאַג סאַמפּאַלז פון יעדער חיה זענען אונטערטעניק צו HTS און אַלע אידענטיפיצירטע פּעפּטיידן זענען אַנאַלייזד פֿאַר די בייַזייַן פון אַ קורץ טריפּעפּטייד מאָטיוו. טריפּעפּטייד מאָטיוון זענען אויסדערוויילט ווייַל זיי צושטעלן אַ מינימאַל באַזע פֿאַר סטרוקטור פאָרמירונג און פּעפּטייד-פּראָטעין ינטעראַקשאַנז14,15. מיר געפֿונען אַ גוטע קאָרעלאַציע אין די פאַרשפּרייטונג פון מאָטיוון צווישן די אינדזשעקטירטע פאַג ביבליאָטעק און קלאָונז עקסטראַקטעד פון די בלוט פון ביידע חיות (פיגור 1e). די דאַטן ווייַזן אַז די זאַץ פון דער ביבליאָטעק איז בלויז מאַרדזשינאַלי ענריטשט אין די בלוט אָפּטייל. אַמינאָ זויער פרעקווענצן און קאָנסענסוס סיקוואַנסיז זענען ווייטער אַנאַלייזד אין יעדער פּאָזיציע ניצן אַן אַדאַפּטיישאַן פון די וועבלאָגאָ16 ווייכווארג. אינטערעסאנט, מיר האבן געפונען א שטארקע אנרייכערונג אין בלוט גליצין רעזידוען (פיגור 1ג). ווען בלוט איז געווארן פארגליכן מיט קלאָנען אויסגעקליבן פון CSF, שטארקע סעלעקציע און עטוואס דעסעלעקציע פון ​​מאָטיוון זענען באמערקט געווארן (פיגור 1ו), און געוויסע אַמינאָ זויערן זענען געווען פּרעפֿערענציעל פאָרשטעלן אין פאָרבעשטימטע פּאָזיציעס אין די 12-מיטגליד (פיגור 1ח). באַמערקענסווערט, יחיד חיות האָבן זיך באַדייטנד אַנדערש אין סערעבראָספּינאַל פליסיק, כוועראַז בלוט גליצין אנרייכערונג איז באמערקט געווארן אין ביידע חיות (צוגאב פיגור 4אַ-דזש). נאָך שטרענג פילטערינג פון סיקוואַנס דאַטן אין די סערעבראָספּינאַל פליסיק פון חיות #1.1 און #1.2, אַ גאַנץ פון 964 און 420 יינציק 12-מער פּעפּטיידז זענען באקומען (צוגאב פיגור 1ד-ע). די אפגעזונדערטע פאַג קלאָנען זענען אַמפּליפיצירט און אונטערטעניק צו אַ צווייטע קייַלעכיק פון אין וויוואָ סעלעקציע. פאַג עקסטראַקטעד פון די צווייטע קייַלעכיק פון סעלעקציע זענען אונטערטעניק צו HTS אין יעדער חיה און אַלע יידענטאַפייד פּעפּטיידז זענען געניצט ווי ינפּוט צו אַ מאָטיוו דערקענונג פּראָגראַם צו אַנאַליזירן די פּאַסירונג פון טריפּעפּטייד מאָטיוון (פיגור 2אַ, ב, עף). קאַמפּערד צו דעם ערשטן ציקל פון די פאַגע ריקאַווערד פון CSF, האָבן מיר באמערקט ווייטערדיקע סעלעקציע און דעסעלעקציע פון ​​פילע מאָטיוון אין CSF אין צווייגן A און B (פיגור 2). א נעץ אידענטיפיקאציע אַלגערידאַם איז געווען געווענדט צו באַשטימען אויב זיי רעפּרעזענטירן פאַרשידענע פּאַטערנז פון קאָנסיסטענט סיקוואַנס. א קלאָרע ענלעכקייט איז באמערקט צווישן די 12-דימענסיאָנאַלע סיקוואַנסן ריקאַווערד דורך CSF אין אַלטערנאַטיוו קלאַד A (פיגור 2c, d) און קלאַד B (פיגור 2g, h). די פּולד אַנאַליסיס אין יעדער צווייַג האט גילוי פאַרשידענע סעלעקציע פּראָופיילז פֿאַר 12-מער פּעפּטיידז (צוגאב פיגור 5c,d) און אַ פאַרגרעסערונג אין די CSF/בלוט טיטער פאַרהעלטעניש איבער צייט פֿאַר פּולד קלאָונז נאָך די צווייטע קייַלעכיק פון סעלעקציע קאַמפּערד צו די ערשטע קייַלעכיק פון סעלעקציע (צוגאב פיגור 5e).
באַרייַכערונג פון מאָטיוון און פּעפּטיידן אין סערעבראָספּינאַל פליסיק דורך צוויי סאַקסעשאַנאַל ראָונדס פון אין וויוואָ פאַנגקשאַנאַל פאַגע דיספּליי סעלעקציע.
אלע צערעבראספינאלע פליסיקייט פאגעס וואס זענען ארויסגעקומען פון דער ערשטער רונדע פון ​​יעדן חיה (חיות #1.1 און #1.2) זענען צוזאמענגעשטעלט געווארן, פארגרעסערט, HT-סיקווענסט און ווידער-אינדזשעקטירט געווארן צוזאמען (2 x 1010 פאגעס/חיה) 2 SM קאנולירטע ראצן (#1.1 → #). 2.1 און 2.2, 1.2 → 2.3 און 2.4). (א,ב,ה,ו) קארעלאציע סקאַטערפּלאַץ וואס פארגלייכן די רעלאטיווע פרעקווענץ פון טריפּעפּטייד מאָטיוון פון אלע CSF-דערייווד פאגעס אין דער ערשטער און צווייטער סעלעקציע רונדעס. רעלאטיווע פרעקווענץ און פארשפרייטונג פון מאָטיוון וואס רעפּרעזענטירן אלע מעגלעכע איבערלאַפּנדיקע טריפּעפּטיידס געפונען אין פּעפּטיידס אין ביידע אָריענטאַציעס. די צאָל מאָטיוון געפונען אין 1000 לייענונגען ווערט געוויזן. מאָטיוון וואס זענען באַדייטנד (p < 0.001) אויסגעקליבן אדער אויסגעשלאָסן געווארן אין איינער פון די פארגלייכטע לייברעריז זענען כיילייטיד מיט רויטע פונקטן. (c, d, g, h) סיקווענס לאגא רעפרעזענטאציע פון ​​אלע CSF-רייכע 12 אמינא זויער לאנגע סיקווענצן באזירט אויף רונדעס 2 און 1 פון אין וויווא סעלעקציע. די גרייס פון דעם איין-בוך קאד ווייזט ווי אפט יענע אמינא זויער קומט פאר אין יענער פאזיציע. צו רעפרעזענטירן דעם לאגא, ווערט די פרעקווענץ פון CSF סיקווענצן עקסטראקטירט פון יחידישע בעלי חיים צווישן צוויי סעלעקציע רונדעס פארגליכן און די ענריטשט סיקווענצן אין די צווייטע רונדע ווערן געוויזן: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 און (h) #1.2–#2.4. די מערסט ענריטשט אמינא זויערן אין א געגעבענער פאזיציע אין (c, d) בעלי חיים נומ. 2.1 און נומ. 2.2 אדער (g, h) אין בעלי חיים נומ. 2.3 און נומ. 2.4 ווערן געוויזן אין קאליר. גרין = פאלאר, לילא = נייטראל, בלוי = באזיק, רויט = זויער און שווארץ = הידראפאבישע אמינא זויערן.
נאך דער דריטער רונדע פון ​​סעלעקציע, האבן מיר אידענטיפיצירט 124 אייגנארטיגע פּעפּטיד סיקווענצן (#3.1 און #3.2) פון 332 CSF-ריקאנסטיטואירטע פאַג קלאָונז אפגעזונדערט פון צוויי חיות (צוגאב בילד 6a). די סיקוואַנס LGSVS (18.7%) האט געהאט די העכסטע רעלאַטיווע פּראָפּאָרציע, נאכגעפאלגט דורך די ווילד-טיפּ ינסערץ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), און SARGSWREIVSLS (2.2%). אין דער לעצטער פערטער רונדע, האבן מיר צוזאמענגעשטעלט צוויי אומאפהענגיק אויסגעקליבענע צווייגן פון דריי באַזונדערע חיות (פיגור 1c). פון די 925 סיקווענצירטע פאַג קלאָונז צוריקגעכאפט פון CSF, אין דער פערטער רונדע האבן מיר געפונען 64 אייגנארטיגע פּעפּטיד סיקווענצן (צוגאב בילד 6b), צווישן וועלכע די רעלאַטיווע פּראָפּאָרציע פון ​​ווילד-טיפּ פאַג איז געפאלן צו 0.8%. די מערסטע געוויינטלעכע CSF קלאָנען אין דער פערטער רונדע זענען געווען LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) און RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). די לענג קייט פון די אויסגעקליבענע פּעפּטיידן איז רעכט צו נוקלעאָטיד ינסערשאַנז/דעלעשאַנז אָדער פרימאַטי סטאָפּ קאָדאָנס אין די ביבליאָטעק פּריימערס ווען מען ניצט דעגענערירטע קאָדאָנס פֿאַר NNK ביבליאָטעק פּלאַן. פרימאַטיגע סטאָפּ קאָדאָנס דזשענערירן קירצערע פּעפּטיידן און ווערן אויסגעקליבן ווייל זיי אַנטהאַלטן דעם גינסטיקן aa מאָטיוו. לענגערע פּעפּטיידן קענען רעזולטירן פון ינסערשאַנז/דעלעשאַנז אין די פּריימערס פון די סינטעטישע ביבליאָטעקן. דאָס שטעלט דעם דיזיינד סטאָפּ קאָדאָן אַרויס דעם ראַם און לייענט עס ביז אַ נייַ סטאָפּ קאָדאָן דערשיינט דאַונסטרים. אין אַלגעמיין, מיר האָבן קאַלקיאַלייטיד ענריטשמענט פאַקטאָרן פֿאַר אַלע פיר סעלעקציע רונדעס דורך פאַרגלייַכן די אַרייַנשרייַב דאַטן מיט די מוסטער אַוטפּוט דאַטן. פֿאַר דער ערשטער רונדע פון ​​סקרינינג, מיר האָבן געניצט ווילד-טיפּ פאַגע טיטערס ווי אַ ניט-ספּעציפֿיש הינטערגרונט רעפֿערענץ. אינטערעסאנט, נעגאַטיווע פאַגע סעלעקציע איז געווען זייער שטאַרק אין דעם ערשטן CSF ציקל, אָבער נישט אין בלוט (פיגור 3a), וואָס קען זיין רעכט צו דער נידעריקער וואַרשיינלעכקייט פון פּאַסיווער דיפוזיע פון ​​רובֿ מיטגלידער פון דער פּעפּטיד ביבליאָטעק אין דעם CSF אָפּטייל אָדער רעלאַטיווע פאַגעס טענד צו זיין מער עפֿעקטיוו ריטיינד אָדער אַוועקגענומען פון דעם בלוטשטראָם ווי באַקטעריאָפאַגעס. אָבער, אין דער צווייטער רונדע פון ​​פּאַנינג, איז שטאַרקע סעלעקציע פון ​​פאַגעס אין CSF באמערקט געוואָרן אין ביידע קלאַדעס, וואָס סאַגדזשעסט אַז דער פריערדיקער רונדע איז געווען ענריטשט אין פאַגעס וואָס ווייַזן פּעפּטיידן וואָס העכערן CSF אַפּטייק (פיגור 3a). ווידער, אָן באַדייטנדיק בלוט ענריטשמענט. אויך אין די דריטע און פערטע רונדעס, זענען די פאַגע קלאָונז באַדייטנדיק ענריטשט אין CSF. פאַרגלייַכנדיק די רעלאַטיווע אָפטקייט פון יעדער יינציק פּעפּטיד סיקוואַנס צווישן די לעצטע צוויי רונדעס פון סעלעקציע, האָבן מיר געפֿונען אַז די סיקוואַנסן זענען נאָך מער ענריטשט אין דער פערטער רונדע פון ​​סעלעקציע (פיגור 3b). אַ גאַנץ פון 931 טריפּעפּטיד מאָטיוון זענען עקסטראַקטעד פון אַלע 64 יינציק פּעפּטיד סיקוואַנסן ניצן ביידע פּעפּטיד אָריענטיישאַנז. די מערסט באַרייכערטע מאָטיוון אין דער פערטער רונדע זענען מער גענוי אויסגעפאָרשט געוואָרן פֿאַר זייערע באַרייכערונג פּראָפֿילן איבער אַלע רונדעס קאַמפּערד צו דער אינדזשעקטירטער ביבליאָטעק (אָפּשניט: 10% באַרייכערונג) (צוגאב בילד 6c). אַלגעמיינע סעלעקציע מוסטערן האָבן געוויזן אַז רובֿ פון די שטודירטע מאָטיוון זענען באַרייכערט געוואָרן אין אַלע פריערדיקע רונדעס פון ביידע סעלעקציע צווייגן. אָבער, עטלעכע מאָטיוון (למשל SGL, VSG, LGS GSV) זענען געווען פּרעדאָמינאַנטלי פון אַלטערנאַטיווער קלאַד A, בשעת אַנדערע (למשל FGW, RTN, WGF, NTR) זענען געווען באַרייכערט אין אַלטערנאַטיווער קלאַד B.
וואַלידאַציע פון ​​CSF טראַנספּאָרט פון CSF-ענריטשט פאַגע-דאַווייזד פּעפּטיידז און ביאָטינילייטיד פירער פּעפּטיידז קאָנדזשוגייטאַד צו סטרעפּטאַווידין פּיילאָודז.
(א) אנרייכערונג פאַרהעלטענישן קאַלקולירט אין אַלע פיר רונדעס (R1-R4) באַזירט אויף ינדזשעקטעד (אינפּוט = I) פאַג (PFU) טיטערס און באַשטימטע CSF פאַג טיטערס (אויסגאַנג = O). אנרייכערונג פאַקטאָרן פֿאַר די לעצטע דריי רונדעס (R2-R4) זענען קאַלקולירט דורך פאַרגלייַך מיט די פריערדיקע רונדע און די ערשטע רונדע (R1) מיט וואָג דאַטן. אָפן באַרס זענען סערעבראָספּינאַל פליסיק, שאַטיד באַרס זענען פּלאַזמע. (***p<0.001, באַזירט אויף סטודענט ס ט-טעסט). (ב) רשימה פון די מערסט שעפעדיק פאַג פּעפּטיידז, ראַנגקט לויט זייער רעלאַטיוו פּראָפּאָרציע צו אַלע פאַגעס געזאמלט אין CSF נאָך רונדע 4 פון סעלעקציע. די זעקס מערסט פּראָסט פאַג קלאָונז זענען כיילייטיד אין קאָליר, נומערירט און זייער אנרייכערונג פאַקטאָרן צווישן רונדעס 3 און 4 פון סעלעקציע (ינסעץ). (c,d) די זעקס מערסט ענריטשט פאַג קלאָונז, ליידיק פאַג און פּאַרענטאַל פאַג פּעפּטייד ביבליאָטעקן פון רונדע 4 זענען אַנאַלייזד ינדיווידואַללי אין אַ CSF סאַמפּלינג מאָדעל. CSF און בלוט סאַמפּאַלז זענען געזאמלט אין די אנגעוויזן צייט פונקטן. (c) גלייכע מאָסן פון 6 קאַנדידאַט פאַג קלאָונז (2 x 1010 פאַגעס/חיות), ליידיקע פאַגעס (#1779) (2 x 1010 פאַגעס/חיות) און סטאַק פאַג פּעפּטיד ביבליאָטעקן (2 x 1012 פאַגעס/חיות). אינדזשעקטירן לפּחות 3 סענטימעטער ווערט אַדמיניסטרירט צו די קאַנולירטע חיה באַזונדער דורך די עק אָדער. די CSF פאַרמאַקאָקינעטיק פון יעדן אינדזשעקטירטן פאַג קלאָן און פאַג פּעפּטיד ביבליאָטעק איבער צייט ווערט געוויזן. (d) ווייזט די דורכשניטלעך CSF/בלוט פאַרהעלטעניש פֿאַר אַלע ריקאַווערד פאַגעס/מל איבער די סאַמפּלינג צייט. (e) פיר סינטעטישע פירער פּעפּטיידן און איין סקראַמבאַלד קאָנטראָל זענען פארבונדן מיט ביאָטין צו סטרעפּטאַווידין דורך זייער N-טערמינוס (טעטראַמער דיספּליי) נאכגעגאנגען דורך אינדזשעקשאַן (עק אָדער iv, 10 מג סטרעפּטאַווידין/קג). לפּחות דריי אינטובירטע ראַץ (N = 3). CSF סאַמפּאַלז זענען געזאמלט אין די אנגעגעבענע צייט פונקטן און סטרעפּטאַווידין קאַנסאַנטריישאַנז זענען געמאסטן דורך CSF אַנטי-סטרעפּטאַווידין ELISA (nd = נישט דעטעקטעד). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, באזירט אויף ANOVA טעסט). (f) פארגלייך פון דער אמינא זויער סיקווענס פון דעם מערסטן אנרייכערטן פאג פּעפּטיד קלאן #2002 (לילא) מיט אנדערע אויסגעקליבענע פאג פּעפּטיד קלאָנען פון דער 4טער רונדע פון ​​סעלעקציע. אידענטישע און ענלעכע אמינא זויער פראגמענטן זענען קאליר-קאדירט.
פֿון אַלע באַרײַכערטע פֿאַגעס אין דער פֿערטער רונדע (פֿיגור 3ב), זענען זעקס קאַנדידאַט קלאָנען אויסגעקליבן געוואָרן פֿאַר ווײַטערדיקע יחידישע אַנאַליז אין דעם CSF מוסטערונג מאָדעל. גלייכע מאָסן פֿון זעקס קאַנדידאַט פֿאַגע, ליידיקע פֿאַגע (אָן אַרײַנגעלייגט) און פּראָפֿאַגע פּעפּטיד ביבליאָטעקן זענען אינדזשעקטירט געוואָרן אין דרײַ קאַנולירטע CM חיות, און פֿאַרמאַקאָקינעטיק איז באַשטימט געוואָרן אין CSF (פֿיגור 3ג) און בלוט (צוגאב פֿיגור 7) פּרובירן. אַלע געטעסטע פֿאַגע קלאָנען האָבן געצילט דעם CSF אָפּטייל אויף אַ לעוועל 10-1000 מאָל העכער ווי יענער פֿון דעם ליידיקן קאָנטראָל פֿאַגע (#1779). למשל, קלאָנען #2020 און #2077 האָבן געהאַט אַרום 1000 מאָל העכערע CSF טיטערס ווי קאָנטראָל פֿאַגע. דער פֿאַרמאַקאָקינעטיק פּראָפֿיל פֿון יעדן אויסגעקליבענעם פּעפּטיד איז אַנדערש, אָבער אַלע פֿון זיי האָבן אַ הויכע CSF היים פֿעיִקייט. מיר האָבן באמערקט אַ קאָנסטאַנטע אַראָפּגאַנג איבער צייט פֿאַר קלאָנען #1903 און #2011, בשעת פֿאַר קלאָנען #2077, #2002 און #2009 קען אַ פאַרגרעסערונג בעת די ערשטע 10 מינוט אָנווייַזן אַקטיוון טראַנספּאָרט אָבער דאַרף וועריפיצירט ווערן. קלאָנען #2020, #2002, און #2077 האָבן זיך סטאַביליזירט אויף הויכע לעוועלס, בשעת די CSF קאָנצענטראַציע פון ​​קלאָן #2009 איז פּאַמעלעך אַראָפּגעגאַנגען נאָך דער ערשטער פאַרגרעסערונג. מיר האָבן דאַן פאַרגליכן די רעלאַטיווע אָפטקייט פון יעדן CSF קאַנדידאַט מיט זיין בלוט קאָנצענטראַציע (פיגור 3ד). די קאָרעלאַציע פון ​​​​די דורכשניטלעך טיטער פון יעדן CSF קאַנדידאַט מיט זיין בלוט טיטער אין אַלע סאַמפּלינג צייטן האט געוויזן אַז דריי פון די זעקס קאַנדידאַטן זענען באַדייטנד ענריטשט אין בלוט CSF. אינטערעסאַנטלי, קלאָן #2077 האט געוויזן העכער בלוט סטאַביליטעט (צוגאב פיגור 7). צו באַשטעטיקן אַז די פּעפּטיידן זיך זענען טויגעוודיק פון אַקטיוו טראַנספּאָרטירן לאַסט אַנדערש ווי פאַג פּאַרטיקאַלז אין די CSF אָפּטייל, מיר סינטעזירט פיר פירער פּעפּטיידן דעריוואַטיזירט מיט ביאָטין ביי די N-טערמינוס ווו די פּעפּטיידן אַטאַטש זיך צו די פאַג פּאַרטיקל. ביאָטינילירטע פּעפּטיידן (נומ. 2002, 2009, 2020 און 2077) זענען קאָניוגירט געוואָרן מיט סטרעפּטאַווידין (SA) צו באַקומען מולטימערישע פֿאָרמען וואָס עפּעס נאָכמאַכן פאַג געאָמעטריע. דעם פֿאָרמאַט האָט אונדז אויך דערלויבט צו מעסטן SA ויסשטעל אין בלוט און סערעבראָספּינאַל פליסיקייט ווי לאַסט-טראַנספּאָרטירנדיק פּראָטעין פּעפּטיידן. וויכטיק, פאַג דאַטן קען אָפט זיין רעפּראָדוצירט ווען סינטעטישע פּעפּטיידן זענען אַדמיניסטרירט אין דעם SA-קאָניוגירטן פֿאָרמאַט (פיגור 3e). די סקראַמבאַלד פּעפּטיידן האָבן געהאַט ווייניקער ערשט ויסשטעל און שנעלער CSF קלעאַראַנס מיט אַנדעטעקטאַבאַל לעוועלס אין 48 שעה. צו באַקומען ינסייט אין די עקספּרעס פּאַטווייז פון די פּעפּטייד פאַג קלאָונז אין די CSF פּלאַץ, מיר אַנאַלייזד די לאָקאַליזאַציע פון ​​יחיד פאַג פּעפּטייד שלאָגן ניצן ימיונאָכיסטאָכעמיע (IHC) צו גלייַך דעטעקט פאַג פּאַרטיקאַלז 1 שעה נאָך ינטראַווענאָוס ינדזשעקשאַן אין וויוואָ. באַמערקענסווערט, קלאָנען #2002, #2077, און #2009 האָבן געקענט דעטעקטירט ווערן דורך שטאַרקע פֿאַרבונג אין מוח קאַפּילאַרן, בשעת קאָנטראָל פאַגע (#1779) און קלאָן #2020 זענען נישט דעטעקטירט געוואָרן (צוגאב בילד 8). דאָס סאַגדזשעסטירט אַז די פּעפּטיידן ביישטייערן צו דער ווירקונג אויף דעם מוח פּונקט דורך אַריבערגיין די BBB. ווייטערדיקע דעטאַלירטע אַנאַליז איז נויטיק צו פּרובירן די היפּאָטעזע, ווייל דער BSCFB וועג קען אויך זיין ינוואַלווד. ווען מען פאַרגלייכט די אַמינאָ זויער סיקוואַנס פון דעם מערסט ענריטשט קלאָן (#2002) מיט אַנדערע אויסגעקליבענע פּעפּטיידן, איז באַמערקט געוואָרן אַז עטלעכע פון ​​זיי האָבן ענלעכע אַמינאָ זויער עקסטענשאַנז, וואָס קען אָנווייַזן אַ ענלעכן טראַנספּאָרט מעקאַניזאַם (פיגור 3f).
צוליב זיין אייגנארטיגן פלאזמע פראפיל און באדייטנדיקן פארגרעסערונג אין CSF איבער צייט, איז פאג דיספלעי קלאן #2077 ווייטער אויסגעפארשט געווארן איבער א לענגערן 48-שעה פעריאד און איז געווען ביכולת צו רעפראדוצירן די שנעלע פארגרעסערונג אין CSF באמערקט אין פארבינדונג מיט אנגעהאלטענע SA לעוועלס (פיגור 4א). בנוגע אנדערע אידענטיפיצירטע פאג קלאנן, האט #2077 שטארק געפארבט פאר מוח קאפילארן און געוויזן באדייטנדיקע קאלאקאליזאציע מיט קאפילאר מארקער לעקטין ווען געזען ביי העכערער רעזאלוציע און מעגליך עטוואס פארבונג אין די פארענטשימאלע פלאץ (פיגור 4ב). צו אויספארשן צי פעפטיד-פארמיטלד פארמאקאלאגישע עפעקטן קענען באקומען ווערן אין די CNS, האבן מיר דורכגעפירט אן עקספערימענט אין וועלכן ביאטינילירטע ווערסיעס פון i) די #2077 טראנזיט פעפטיד און ii) די BACE1 אינהיביטאר פעפטיד זענען געמישט געווארן מיט SA אין צוויי פארשידענע פראפארציעס. פאר איין קאמבינאציע האבן מיר גענוצט נאר די BACE1 פעפטיד אינהיביטאר און פאר די אנדערע האבן מיר גענוצט א 1:3 פראפארציע פון ​​BACE1 פעפטיד אינהיביטאר צו #2077 פעפטיד. ביידע מוסטערן זענען אדמיניסטרירט געווארן אינטראַווענאָז און בלוט און צערעבראָספּינאַל פליסיק לעוועלס פון ביתא-אַמילאָיד פּעפּטייד 40 (Abeta40) זענען געמאָסטן געוואָרן איבער צייט. Abeta40 איז געמאָסטן געוואָרן אין CSF ווייל עס שפּיגלט אָפּ BACE1 אינהיביציע אין די מוח פּאַרענכימאַ. ווי ערוואַרטעט, ביידע קאָמפּלעקסן האָבן באַדייטנד רעדוצירט בלוט לעוועלס פון Abeta40 (פיגור 4c, d). אָבער, נאָר מוסטערן וואָס אַנטהאַלטן אַ געמיש פון פּעפּטייד נומ. 2077 און אַן אינהיביטאָר פון די BACE1 פּעפּטייד קאָניוגירט צו SA האָבן געפֿירט צו אַ באַדייטנדיק פאַרקלענערונג אין Abeta40 אין די צערעבראָספּינאַל פליסיק (פיגור 4c). די דאַטן ווייַזן אַז פּעפּטייד נומ. 2077 איז ביכולת צו טראַנספּאָרטירן די 60 kDa SA פּראָטעין אין די CNS און אויך אינדוצירט פאַרמאַקאַלאַדזשיקאַל יפעקס מיט SA-קאָניוגייטאַד אינהיביטאָרן פון די BACE1 פּעפּטייד.
(א) קלאָנאַל אינדזשעקשאַן (2 × 10 פאַגעס/חיה) פון T7 פאַגע וואָס ווייַזט לאַנג-טערמין פאַרמאַקאָקינעטיק פּראָופיילז פון CSF פּעפּטייד #2077 (RLSSVDSDLSGC) און נישט-אינדזשעקטעד קאָנטראָל פאַגע (#1779) אין לפּחות דרייַ CM-אינטובאַטיד ראַץ. (ב) קאָנפאָקאַל מיקראָסקאָפּיש בילד פון רעפּרעזענטאַטיוו קאָרטיקאַל מיקראָוועסאַלז אין פאַגע-אינדזשעקטעד ראַץ (2 × 10 10 פאַגעס/חיה) וואָס ווייַזט קאַונטערסטיינינג פון פּעפּטייד #2077 און כלים (לעקטין). די פאַגע קלאָונז זענען אַדמיניסטרירט צו 3 ראַץ און ערלויבט צו צירקולירן פֿאַר 1 שעה איידער פּערפוסיאָן. מוחות זענען סעקשאַנאַלי געווען סעקשאַנאַלי און געפאַרבט מיט פּאָליקלאָנאַל FITC-מאַרקעד אַנטיבאָדיעס קעגן די T7 פאַגע קאַפּסיד. צען מינוט איידער פּערפוסיאָן און סאַבסאַקוואַנט פיקסיישאַן, DyLight594-מאַרקעד לעקטין איז אַדמיניסטרירט ינטראַווענאָוסלי. פלאָרעסצענט בילדער וואָס ווייַזן לעקטין פאַרבונג (רויט) פון די לומינאַל זייַט פון מיקראָוועסאַלז און פאַגעס (גרין) אין די לומען פון קאַפּילאַריז און פּעריוואַסקולאַר מאַרך געוועב. די סקאַלע באַר קאָרעספּאָנדירט צו 10 µm. (c, d) ביאָטינילאַטעד BACE1 אינהיביטאָריש פּעפּטייד אַליין אָדער אין קאָמבינאַציע מיט ביאָטינילאַטעד טראַנזיט פּעפּטייד #2077 איז געווען קאַפּאַלד צו סטרעפּטאַווידין נאכגעגאנגען דורך ינטראַווענאָוס ינדזשעקשאַן פון לפּחות דרייַ קאַניאַלייטיד CM ראַץ (10 מג סטרעפּטאַווידין/קג). BACE1 פּעפּטייד אינהיביטאָר-מעדיאַטעד רעדוקציע אין Aβ40 איז געמאסטן דורך Aβ1-40 ELISA אין בלוט (רויט) און סערעבראָספּינאַל פליסיק (אָראַנדזש) אין די אנגעגעבענע צייט פונקטן. פֿאַר בעסער קלעריטי, אַ פּונקטירטע ליניע איז געצייכנט אויף די גראַפיק אין אַ סקאַלע פון ​​100%. (c) פּראָצענט רעדוקציע אין Aβ40 אין בלוט (רויט דרייַעקן) און סערעבראָספּינאַל פליסיק (אָראַנדזש דרייַעקן) אין ראַץ באהאנדלט מיט סטרעפּטאַווידין קאָנדזשוגייטאַד צו טראַנזיט פּעפּטייד #2077 און BACE1 אינהיביטאָריש פּעפּטייד אין אַ 3:1 פאַרהעלטעניש. (ד) פּראָצענט רעדוקציע אין בלוט Aβ40 (רויטע קרייזן) און סערעבראָספּינאַל פליסיק (מאַראַנץ קרייזן) פון ראַץ באַהאַנדלט מיט סטרעפּטאַווידין קאַפּאַלד צו אַ BACE1 ינכיבאַטאָרי פּעפּטייד בלויז. די Aβ קאַנסאַנטריישאַן אין די קאָנטראָל איז געווען 420 פּג/מל (סטאַנדאַרד דיווייישאַן = 101 פּג/מל).
פאַגע דיספּליי איז געראָטן גענוצט געוואָרן אין עטלעכע געביטן פון ביאָמעדיצינישער פאָרשונג17. די מעטאָדע איז גענוצט געוואָרן פֿאַר אין וויוואָ וואַסקולאַרע דייווערסיטי שטודיעס18,19 ווי אויך שטודיעס וואָס צילן סערעבראַלע כלים20,21,22,23,24,25,26. אין דער דאָזיקער שטודיע, האָבן מיר אויסגעברייטערט די אַפּליקאַציע פון ​​דער סעלעקציע מעטאָדע ניט נאָר צו דער דירעקטער אידענטיפֿיקאַציע פון ​​פּעפּטיידן וואָס צילן סערעבראַלע כלים, נאָר אויך צו דער ענטדעקונג פון קאַנדידאַטן מיט אַקטיווע טראַנספּאָרט אייגנשאַפטן צו קרייַזן די בלוט-מוח באַריערע. מיר באַשרייבן איצט די אַנטוויקלונג פון אַן אין וויוואָ סעלעקציע פּראָצעדור אין CM אינטובירטע ראַץ און דעמאָנסטרירן איר פּאָטענציעל צו אידענטיפֿיצירן פּעפּטיידן מיט CSF כאָומינג אייגנשאַפטן. ניצנדיק דעם T7 פאַגע וואָס ווייַזט אַ ביבליאָטעק פון 12-מער ראַנדאָם פּעפּטיידן, זענען מיר געווען ביכולת צו דעמאָנסטרירן אַז דער T7 פאַגע איז קליין גענוג (בעערעך 60 נם אין דיאַמעטער)10 צו זיין אַדאַפּטירט צו דער בלוט-מוח באַריערע, דערמיט גלייך קרייַזנדיק די בלוט-מוח באַריערע אָדער כאָראָיד פּלעקסוס. מיר האָבן באמערקט אַז CSF האַרוועסטינג פון קאַנולירטע CM ראַץ איז געווען אַ גוט-קאָנטראָלירטע אין וויוואָ פאַנגקשאַנאַל סקרינינג מעטאָדע, און אַז דער עקסטראַקטעד פאַגע ניט בלויז געבונדן צו די וואַסקולאַטור אָבער אויך פאַנגקשאַנירט ווי אַ טראַנספּאָרטער אַריבער די בלוט-געהירן באַריערע. דערצו, דורך סיימאַלטייניאַסלי זאַמלען בלוט און אַפּלייינג HTS צו CSF און בלוט-דערייווד פאַגעס, מיר באַשטעטיקט אַז אונדזער ברירה פון CSF איז נישט געווען ינפלוענסט דורך בלוט ענריטשמענט אָדער טויגיקייט פֿאַר יקספּאַנשאַן צווישן ראָונדס פון סעלעקציע. אָבער, די בלוט אָפּטייל איז טייל פון די סעלעקציע פּראָצעדור, ווייַל פאַגעס פיייק צו דערגרייכן די CSF אָפּטייל מוזן בלייבן לעבן און סערקולירן אין די בלוטשטראָם לאַנג גענוג צו ענריטש זיך אין די געהירן. כּדי צו עקסטראַקט פאַרלאָזלעך סיקוואַנס אינפֿאָרמאַציע פון ​​​​רוי HTS דאַטן, מיר ימפּלאַמענטאַד פילטערס אַדאַפּטיד צו פּלאַטפאָרמע-ספּעציפיש סיקוואַנסינג ערראָרס אין די אַנאַליסיס וואָרקפלאָו. דורך ינקאָרפּערייטינג קינעטישע פּאַראַמעטערס אין די סקרינינג מעטאָדע, מיר באַשטעטיקט די שנעל פאַרמאַקאָקינעטיק פון ווילד-טיפּ T7 פאַגעס (t½ ~ 28 מינוט) אין בלוט24, 27, 28 און אויך באשלאסן זייער האַלב-לעבן אין סערעבראָספּינאַל פליסיק (t½ ~ 26 מינוט) פּער מינוט). טראָץ ענלעכע פאַרמאַקאָקינעטיק פּראָופיילן אין בלוט און CSF, קען מען נאָר דעטעקטירן 0.001% פון דער בלוט קאָנצענטראַציע פון ​​פאַג אין CSF, וואָס ווײַזט אויף אַ נידעריקע הינטערגרונט מאָביליטעט פון ווילד-טיפּ T7 פאַג אַריבער די בלוט-מוח באַריערע. די אַרבעט אונטערשטרייכט די וויכטיקייט פון דער ערשטער רונדע פון ​​סעלעקציע ווען מען ניצט אין וויוואָ פּאַנינג סטראַטעגיעס, ספּעציעל פֿאַר פאַג סיסטעמען וואָס ווערן שנעל אויסגערייניקט פון דער צירקולאַציע, ווײַל ווייניק קלאָונז קענען דערגרייכן דעם CNS אָפּטייל. אַזוי, אין דער ערשטער רונדע, איז די רעדוקציע אין ביבליאָטעק דייווערסיטי געווען זייער גרויס, ווײַל נאָר אַ באַגרענעצטע צאָל קלאָונז זענען עווענטועל געזאַמלט געוואָרן אין דעם זייער שטרענגן CSF מאָדעל. די אין וויוואָ פּאַנינג סטראַטעגיע האָט אַרייַנגענומען עטלעכע סעלעקציע טריט ווי אַקטיווע אַקיומיאַליישאַן אין דעם CSF אָפּטייל, קלאָון ניצל אין דעם בלוט אָפּטייל, און שנעלע באַזײַטיקונג פון T7 פאַג קלאָונז פון דעם בלוט אין די ערשטע 10 מינוט (פיגור 1ד און סאַפּלעמענטאַרי פיגור 4M). אַזוי, נאָך דער ערשטער רונדע, זענען פאַרשידענע פאַג קלאָונז אידענטיפיצירט געוואָרן אין CSF, כאָטש דער זעלביקער ערשט פּול איז געניצט געוואָרן פֿאַר יחיד חיות. דאָס פֿאָרשלאָגט אַז קייפל שטרענגע סעלעקציע טריט פֿאַר קוואַל ביבליאָטעקן מיט גרויסע צאָלן ביבליאָטעק מיטגלידער רעזולטירן אין אַ באַטייטיק רעדוקציע אין דייווערסיטי. דעריבער, ראַנדאָם געשעענישן וועלן ווערן אַן אינטעגראַלער טייל פֿון דעם ערשטן סעלעקציע פּראָצעס, וואָס וועט שטאַרק השפּעה האָבן אויף דעם רעזולטאַט. עס איז מסתּמא אַז פילע פֿון די קלאָנען אין דער אָריגינעלער ביבליאָטעק האָבן געהאַט אַ זייער ענלעכע CSF ענריטשמענט פּראָפּענסיטי. אָבער, אפילו אונטער די זעלבע עקספּערימענטאַלע באַדינגונגען, קענען סעלעקציע רעזולטאַטן אַנדערש זיין צוליב דער קליינער צאָל פֿון יעדן באַזונדערן קלאָן אין דעם ערשטן פּול.
די מאָטיוון וואָס זענען באַרייכערט אין CSF זענען אַנדערש פון די אין בלוט. אינטערעסאַנט, מיר האָבן באַמערקט דעם ערשטן פֿאַרשיב צו גליצין-רייכע פּעפּטיידן אין בלוט פֿון יחידישע חיות. (פֿיגור 1ג, צוגאב פֿיגורן 4ע, 4פֿ). פֿאַגעס וואָס אַנטהאַלטן גליצין פּעפּטיידן זענען מעגלעך מער סטאַביל און ווייניקער מסתּמא אַרויסגענומען צו ווערן פֿון צירקולאַציע. אָבער, די גליצין-רייכע פּעפּטיידן זענען נישט דעטעקטירט געוואָרן אין די סערעבראָספּינאַל פֿליסיקייט מוסטערן, וואָס סאַגדזשעסטירט אַז די קוראַטירטע ביבליאָטעקן זענען דורכגעגאַנגען צוויי פֿאַרשידענע סעלעקציע טריט: איינער אין בלוט און אַן אַנדערער ערלויבט צו אָנקלייַבן אין סערעבראָספּינאַל פֿליסיקייט. CSF-באַרייכערטע קלאָנען וואָס זענען געקומען פֿון דער פֿערטער סעלעקציע-רונדע זענען ברייט געטעסט געוואָרן. כּמעט אַלע פֿון די יחיד געטעסטעטע קלאָנען זענען באַשטעטיקט געוואָרן צו זיין באַרייכערט אין CSF קאַמפּערד צו ליידיק קאָנטראָל פֿאַגעס. איין פּעפּטייד-היט (#2077) איז געפּrüפֿט געוואָרן אין מער דעטאַל. עס האָט געוויזן אַ לענגערע פּלאַזמע האַלב-לעבן קאַמפּערד צו אַנדערע היטס (פֿיגור 3ד און צוגאב פֿיגור 7), און אינטערעסאַנט, דער פּעפּטייד האָט אַנטהאַלטן אַ ציסטאין רעזאַדו ביים C-טערמינוס. עס איז לעצטנס געוויזן געוואָרן אַז די צוגאב פון ציסטאין צו פּעפּטיידן קען פֿאַרבעסערן זייערע פאַרמאַקאָקינעטיק אייגנשאַפטן דורך בינדן צו אַלבומין 29. דאָס איז דערווייל אומבאַקאַנט פֿאַר פּעפּטייד #2077 און דאַרף ווייטערדיקע שטודיע. עטלעכע פּעפּטיידן האָבן געוויזן אַ וואַלענץ-אָפּהענגיקייט אין CSF ענריטשמענט (דאַטן נישט געוויזן), וואָס קען זיין פֿאַרבונדן מיט די געוויזן ייבערפלאַך געאָמעטריע פון ​​די T7 קאַפּסיד. די T7 סיסטעם וואָס מיר האָבן גענוצט האָט געוויזן 5-15 קאָפּיעס פון יעדן פּעפּטייד פּער פאַג פּאַרטיקל. IHC איז דורכגעפירט געוואָרן אויף קאַנדידאַט ליד פאַג קלאָונז ינדזשעקטעד ינטראַווענאָוסלי אין די סערעבראַל קאָרטעקס פון ראַץ (סאַפּלעמענטאַרי פיג. 8). די דאַטן האָבן געוויזן אַז לפּחות דרייַ קלאָונז (נומער 2002, נומ. 2009 און נומ. 2077) האָבן ינטעראַקטיד מיט די BBB. עס בלייבט צו באַשטימען צי דעם BBB ינטעראַקשאַן רעזולטאַטן אין די אַקיומיאַליישאַן פון CSF אָדער די באַוועגונג פון די קלאָונז גלייַך צו די BCSFB. וויכטיק, מיר ווייַזן אַז די אויסגעקליבענע פּעפּטיידן האַלטן זייער CSF טראַנספּאָרט קאַפּאַציטעט ווען סינטעזירט און געבונדן צו די פּראָטעין לאַסט. בינדונג פון N-טערמינאל ביאָטינילאַטעד פּעפּטיידז צו SA איבערחזרט אין עסענץ די רעזולטאַטן באַקומען מיט זייערע ריספּעקטיוו פאַגע קלאָונז אין בלוט און סערעבראָספּינאַל פליסיק (פיגור 3e). צום סוף, מיר ווייַזן אַז ליד פּעפּטייד #2077 איז ביכולת צו העכערן די מאַרך קאַמף פון אַ ביאָטינילאַטעד פּעפּטייד ינכיבאַטאָר פון BACE1 קאָנדזשוגייטאַד צו SA, וואָס פירט צו אויסגעשפראכן פאַרמאַקאָדינאַמיש יפעקס אין די CNS דורך באַדייטנד רעדוצירן Abeta40 לעוועלס אין CSF (פיגור 4). מיר זענען נישט געווען ביכולת צו ידענטיפיצירן קיין כאָומאַלאַדזשיז אין די דאַטאַבייס דורך דורכפירן אַ פּעפּטייד סיקוואַנס כאָומאַלאַדזשי זוכן פון אַלע היטס. עס איז וויכטיק צו באַמערקן אַז די גרייס פון די T7 ביבליאָטעק איז בעערעך 109, בשעת די טעאָרעטישע ביבליאָטעק גרייס פֿאַר 12-מערס איז 4 x 1015. דעריבער, מיר האָבן בלויז אויסגעקליבן אַ קליין בראָכצאָל פון די דייווערסיטי פּלאַץ פון די 12-מער פּעפּטייד ביבליאָטעק, וואָס קען מיינען אַז מער אָפּטימיזעד פּעפּטיידז קענען זיין יידענטאַפייד דורך עוואַלואַטינג די שכייניש סיקוואַנס פּלאַץ פון די יידענטאַפייד היטס. היפּאָטעטיש, איינע פון ​​די סיבות פארוואס מיר האבן נישט געפונען קיין נאטירלעכע האמאלאגן פון די פּעפּטיידן קען זיין די דעסעלעקציע בעת עוואָלוציע צו פאַרהיטן דעם אומקאנטראלירטן אריינגאנג פון געוויסע פּעפּטיד מאָטיוון אין מוח.
צוזאַמען גענומען, אונדזערע רעזולטאַטן צושטעלן אַ באַזע פֿאַר צוקונפֿטיקע אַרבעט צו ידענטיפיצירן און כאַראַקטעריזירן די טראַנספּאָרט סיסטעמען פון די צערעבראָוואַסקולאַר באַריערע אין וויוואָ אין מער דעטאַל. די גרונטלעכע סעטאַפּ פון דעם מעטאָד איז באַזירט אויף אַ פאַנגקשאַנאַל סעלעקציע סטראַטעגיע וואָס ניט בלויז ידענטיפיצירט קלאָונז מיט צערעבראַל וואַסקולאַר ביינדינג פּראָפּערטיעס, אָבער אויך כולל אַ קריטיש שריט אין וואָס מצליח קלאָונז האָבן ינטרינסיק טעטיקייט צו קרייַז ביאַלאַדזשיקאַל באַריערז אין וויוואָ אין די CNS אָפּטייל. איז צו עלוסידירן דעם מעכאַניזאַם פון טראַנספּאָרט פון די פּעפּטיידז און זייער פּרעפֿערענץ פֿאַר ביינדינג צו די מיקראָוואַסקולאַטור ספּעציפיש צו די מאַרך געגנט. דאָס קען פירן צו דער ופדעקונג פון נייַע פּאַטווייז פֿאַר די טראַנספּאָרט פון די BBB און רעצעפּטאָרן. מיר דערוואַרטן אַז די יידענטאַפייד פּעפּטיידז קענען גלייַך בינדן צו צערעבראָוואַסקולאַר רעצעפּטאָרן אָדער צו סערקיאַלייטינג ליגאַנדז טראַנספּאָרטעד דורך די BBB אָדער BCSFB. די פּעפּטייד וועקטאָרן מיט CSF טראַנספּאָרט טעטיקייט דיסקאַווערד אין דעם אַרבעט וועלן זיין ווייַטער אויסגעפאָרשט. מיר זענען דערווייַל אויספאָרשן די מאַרך ספּעסיפיסיטי פון די פּעפּטיידז פֿאַר זייער פיייקייט צו קרייַז די BBB און / אָדער BCSFB. די נייע פּעפּטיידן וועלן זיין גאָר ווערטפולע מכשירים פֿאַר דער מעגלעכער ענטדעקונג פֿון נייע רעצעפּטאָרן אָדער וועגן און פֿאַר דער אַנטוויקלונג פֿון נייע העכסט עפֿעקטיווע פּלאַטפאָרמעס פֿאַר דער צושטעל פֿון מאַקראָמאָלעקולן, ווי למשל ביאָלאָגישע מעדיצינען, צום מוח.
קאַנולירן די גרויסע ציסטערנע (CM) מיט אַ מאָדיפיקאַציע פון ​​דער פריער באַשריבענער מעטאָדע. אַנעסטעזירטע וויסטאַר ראַץ (200-350 ג) זענען געשטעלט געוואָרן אויף אַ סטערעאָטאַקסישן אַפּאַראַט און אַ מיטלערע שניט איז געמאַכט געוואָרן איבער דער געשעווענער און אַסעפּטיש צוגעגרייטער קאָפּ-הויט צו אַנטפּלעקן דעם שאַרבן. בויערט צוויי לעכער אין דער געגנט פון דער אויבערשטער ראַם און באַפעסטיקט די פיקסיר-שרויפן אין די לעכער. אַן נאָך לאָך איז געבאָרט געוואָרן אין דער זייטיקער אָקסיפּיטאַלער קאַם פֿאַר סטערעאָטאַקטישער גיידאַנס פון אַ נישט-ראַסטיקער שטאָל קאַנולאַ אין דער CM. צולייגן דענטאַל צעמענט אַרום דער קאַנולאַ און באַפעסטיקט מיט שרויפן. נאָך פאָטאָ-קיורינג און צעמענט-האַרטענינג, איז די הויט-וואונד פֿאַרמאַכט געוואָרן מיט 4/0 סופּראַמיד-נעץ. ריכטיקע פּלאַצירונג פון דער קאַנולאַ איז באַשטעטיקט דורך ספּאָנטאַנע ליקאַדזש פון סערעבראָספּינאַלער פליסיקייט (CSF). אַרויסנעמען די ראַץ פון דעם סטערעאָטאַקסישן אַפּאַראַט, באַקומען פּאַסיקע נאָך-אָפּעראַטיווע זאָרג און ווייטיק-באַהאַנדלונג, און לאָזן עס זיך אויסהיילן פֿאַר לפּחות איין וואָך ביז סימנים פון בלוט ווערן באמערקט אין דער סערעבראָספּינאַלער פליסיקייט. וויסטאַר ראַץ (Crl:WI/Han) זענען באַקומען געוואָרן פון טשאַרלס ריווער (פֿראַנקרײַך). אַלע ראַץ זענען געהאַלטן געוואָרן אונטער ספּעציפֿישע פּאַטאַגען-פֿרייע באַדינגונגען. אַלע כייַע עקספּערימענטן זענען באַשטעטיקט געוואָרן דורך דעם וועטערינאַרישן אָפֿיס פֿון דער שטאָט באַזעל, שווייץ, און זענען דורכגעפֿירט געוואָרן לויט כייַע ליצענץ נומער 2474 (אַסעסמענט פֿון אַקטיוון מוח טראַנספּאָרט דורך מעסטן לעוועלס פֿון טעראַפּעווטישע קאַנדידאַטן אין דער סערעבראָספּינאַל פֿליסיקייט און מוח פֿון ראַץ).
האַלט די ראַץ פֿאָרזיכטיק מיטן CM קאַנולאַ אין האַנט. נעמט אַראָפּ די דאַטוראַ פֿון דער קאַנולאַ און זאַמלט 10 µl פֿון ספּאָנטאַן פֿליסנדיקער צערעבראָספּינאַלער פֿליסיקייט. ווײַל די דורכדרינגלעכקייט פֿון דער קאַנולאַ איז לעצטנס קאָמפּראָמיטירט געוואָרן, זענען נאָר קלאָרע צערעבראָספּינאַלער פֿליסיקייט מוסטערן אָן קיין באַווײַז פֿון בלוט קאָנטאַמינאַציע אָדער פֿאַרפֿאַרבונג אַרײַנגענומען געוואָרן אין דער שטודיע. פּאַראַלעל, איז גענומען געוואָרן אַרום 10–20 µl בלוט פֿון אַ קליינעם שניט בײַם שפּיץ פֿונעם עק אין רערן מיט העפּאַרין (Sigma-Aldrich). CSF און בלוט זענען געזאַמלט געוואָרן אין פֿאַרשידענע צײַטפּונקטן נאָך דער אינטראַווענאָזער אינדזשעקציע פֿון T7 פֿאַגע. אַרום 5–10 µl פֿליסיקייט איז אַוועקגעוואָרפֿן געוואָרן איידער יעדער CSF מוסטער איז געזאַמלט געוואָרן, וואָס קאָרעספּאָנדירט צום טויטן וואָלומען פֿונעם קאַטעטער.
ביבליאָטעקן זענען גענערירט געוואָרן מיטן T7Select 10-3b וועקטאָר ווי באַשריבן אין דעם T7Select סיסטעם מאַנואַל (נאָוואַגען, ראָזענבערג עט אַל., InNovations 6, 1-6, 1996). אין קורצן, אַ ראַנדאָם 12-מער דנאַ ינסערט איז סינטעזירט געוואָרן אין דעם פאלגנדן פֿאָרמאַט:
דער NNK קאדאן איז גענוצט געווארן צו פארמיידן דאבל-סטאָפּ קאדאָנס און אַמינאָ זויער איבער-עקספּרעסיע אין דעם אינסערט. N איז א מאַנועל געמישטע עקווימאָלאַרע פאַרהעלטעניש פון יעדן נוקלעאָטיד, און K איז א מאַנועל געמישטע עקווימאָלאַרע פאַרהעלטעניש פון אַדענין און ציטאָסין נוקלעאָטידן. איינצעלנע שטראַנדיקע געגנטן זענען קאָנווערטירט געוואָרן צו דאבל-שטראַנדיקע DNA דורך ווייטערדיקע אינקובאַציע מיט dNTP (נאָוואַגען) און קלעןאָו ענזיים (ניו ענגלאַנד ביאָלאַבס) אין קלעןאָו באַפער (ניו ענגלאַנד ביאָלאַבס) פֿאַר 3 שעה ביי 37°C. נאָך דער רעאַקציע, איז דאבל-שטראַנדיקע DNA צוריקגעכאפט געוואָרן דורך EtOH אָפּזאַץ. די רעזולטאַט DNA איז דיידזשעסטיד געוואָרן מיט רעסטריקציע ענזימען EcoRI און HindIII (ביידע פון ​​ראָוש). דער צעשפּאָלטענער און פּיוראַפייד (QIAquick, Qiagen) אינסערט (T4 ליגאַסע, ניו ענגלאַנד ביאָלאַבס) איז דעמאָלט ליגירט געוואָרן אין-פֿרэйם אין אַ פאַר-געשפּאָלטענעם T7 וועקטאָר נאָך אַמינאָ זויער 348 פון דעם 10B קאַפּסיד גען. ליגאַציע רעאַקציעס זענען אינקובירט געוואָרן ביי 16°C פֿאַר 18 שעה איידער אין וויטראָ פּאַקאַדזשינג. פאַגע פּאַקאַדזשינג אין וויטראָ איז דורכגעפירט געוואָרן לויט די אינסטרוקציעס וואָס זענען געקומען מיטן T7Select 10-3b קלאָנינג קיט (נאָוואַגען) און די פּאַקאַדזשינג לייזונג איז געוואָרן אַמפליפיצירט איין מאָל צו ליזיס ניצנדיק Escherichia coli (BLT5615, נאָוואַגען). די ליזאַטן זענען סענטריפוגירט געוואָרן, טיטרירט און איינגעפֿרוירן ביי -80°C ווי אַ סטאַק לייזונג פון גליסערין.
דירעקטע PCR אמפליפיקאציע פון ​​פאג וועריאַבלע געגנטן אמפליפיקירט אין בראָט אדער טעלער ניצנדיק אייגענע 454/ראָשע-אמפליקאן פיוזשאַן פּריימערס. דער פאָרווערטס פיוזשאַן פּריימער אנטהאלט סיקוואַנסן וואָס אַרומנעמען די וועריאַבלע געגנט (NNK) 12 (טעמפּלאַט-ספּעציפֿיש), GS FLX טיטאַניום אַדאַפּטער A, און אַ פיר-באַזע ביבליאָטעק שליסל סיקוואַנס (TCAG) (צוגאב פיגור 1a):
דער ריווערס פיוזשאַן פּריימער כּולל אויך ביאָטין אַטאַטשט צו קאַפּטשער קרעלן און די GS FLX טיטאַניום אַדאַפּטער B וואָס איז נויטיק פֿאַר קלאָנאַל אַמפּליפיקאַציע בעת עמולסיע PCR:
די אַמפּליקאָנס זענען דעמאָלט אונטערגעוואָרפן געוואָרן צו 454/ראָשע פּיראָסיקווענסינג לויטן 454 GS-FLX טיטאַניום פּראָטאָקאָל. פֿאַר מאַנועלער סאַנגער סיקווענסינג (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), איז T7 פאַגע DNA אַמפּליפיצירט געוואָרן דורך PCR און סיקווענסט מיט די פאלגענדע פּריימער פּאָרן:
איינזעצונגען פון יחידישע פלאקן זענען אונטערגעוואָרפן געוואָרן צו PCR אַמפּליפיקאַציע ניצנדיק די Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (לויט די אינסטרוקציעס פונעם פאַבריקאַנט). דורכפירט אַ הייסן אָנהייב (10 מינוט ביי 95 °C) און 35 בוסט ציקלען (50 סעקונדעס ביי 95 °C, 1 מינוט ביי 50 °C, און 1 מינוט ביי 72 °C).
פאגעס פון ביבליאטעקן, ווילד-טיפ פאגעס, פאגעס געראַטעוועט פון CSF און בלוט, אדער יחידישע קלאָנען זענען אַמפּליפיצירט געוואָרן אין Escherichia coli BL5615 אין TB בראָט (Sigma Aldrich) אדער אין 500 קוביק סענטימעטער שיסלען (Thermo Scientific) פאר 4 שעה ביי 37°C. פאגעס זענען עקסטראַקטירט געוואָרן פון די פּלאַטעס דורך שווענקען די פּלאַטעס מיט Tris-EDTA באַפער (Fluka Analytical) אדער דורך זאַמלען די פּלאַקס מיט סטערילע פּיפּעטע שפּיץ. פאגעס זענען אפגעזונדערט געוואָרן פון קולטור סופּערנאַטאַנט אדער עקסטראַקציע באַפער מיט איין רונדע פון ​​פּאָליעטילען גליקאָל (PEG 8000) פּרעציפּיציט (Promega) און ווידער סוספּענדירט אין Tris-EDTA באַפער.
דער פארשטארקערטער פאג איז אונטערגעווארפן געווארן צו 2-3 רונדעס פון ענדאטאקסין באזייטיגונג ניצנדיק ענדאטאקסין באזייטיגונג קרעלן (מילטעני ביאטעק) פארן אינטראווענעזן (IV) אינדזשעקציע (500 μl/חיה). אין דער ערשטער רונדע, זענען 2×1012 פאגעס אריינגעפירט געווארן; אין דער צווייטער, 2×1010 פאגעס; אין די דריטע און פערטע סעלעקציע רונדעס, 2×109 פאגעס פער חיה. פאג אינהאלט אין CSF און בלוט מוסטערן געזאמלט אין די אנגעגעבענע צייט פונקטן איז באשטימט געווארן דורך פלאק ציילן לויט די פאבריקאנט'ס אינסטרוקציעס (T7Select סיסטעם מאנואל). פאג סעלעקציע איז דורכגעפירט געווארן דורך אינטראווענעזן אינדזשעקציע פון ​​גערייניקטע ביבליאטעקן אין די עק אדער אדער דורך ווידער-אינדזשעקציע פון ​​פאג עקסטראקטירט פון CSF פון די פריערדיגע סעלעקציע רונדע, און נאכפאלגנדע הארוועסטס זענען דורכגעפירט געווארן ביי 10 מינוט, 30 מינוט, 60 מינוט, 90 מינוט, 120 מינוט, 180 מינוט, און 240 מינוט ריספּעקטיוולי CSF און בלוט מוסטערן. א סך הכל פון פיר רונדעס פון אין וויוואָ פּאַנינג זענען דורכגעפירט געוואָרן, אין וועלכע די צוויי אויסגעקליבענע צווייגן זענען באַזונדער געהיט און אַנאַליזירט געוואָרן בעת ​​די ערשטע דריי רונדעס פון סעלעקציע. אַלע פאַגע ינסערץ עקסטראַקטעד פון CSF פון די ערשטע צוויי רונדעס פון סעלעקציע זענען אונטערגעוואָרפן געוואָרן צו 454/ראָשע פּיראָסיקווענסינג, בשעת אַלע קלאָונז עקסטראַקטעד פון CSF פון די לעצטע צוויי רונדעס פון סעלעקציע זענען מאַנועל סיקווענסט געוואָרן. אַלע בלוט פאַגעס פון דער ערשטער רונדע פון ​​סעלעקציע זענען אויך אונטערגעוואָרפן געוואָרן צו 454/ראָשע פּיראָסיקווענסינג. פֿאַר די ינדזשעקשאַן פון פאַגע קלאָונז, זענען אויסגעקליבענע פאַגעס אַמפּליפיצירט געוואָרן אין E. coli (BL5615) אויף 500 קוביק סענטימעטער פּלאַטעס ביי 37°C פֿאַר 4 שעה. אינדיווידועל אויסגעקליבענע און מאַנועל סיקווענסט קלאָונז זענען פּראָפּאַגירט געוואָרן אין TB מעדיום. נאָך פאַגע עקסטראַקציע, רייניקונג און באַזייַטיקונג פון ענדאָטאָקסין (ווי באַשריבן אויבן), זענען 2×1010 פאַגעס/חיה אין 300 μl ינדזשעקטעד געוואָרן ינטראַווענאָוסלי אין איין עק אָדער.
פאָר-פּראָצעסירונג און קוואַליטאַטיווע פֿילטערינג פון סיקוואַנס דאַטן. רויע 454/ראָשע דאַטן איז קאָנווערטירט געוואָרן פֿון אַ בינאַרישן סטאַנדאַרט סטרים מאַפּע פֿאָרמאַט (sff) צו אַ פּירסאָן מענטשלעך ליינעוודיק פֿאָרמאַט (fasta) ניצנדיק ווענדאָר ווייכווארג. ווייטערדיקע פּראַסעסינג פֿון דער נוקלעאָטיד סיקוואַנס איז דורכגעפֿירט געוואָרן ניצנדיק פּראַפּרייאַטערי C פּראָגראַמען און סקריפּטן (נישט-פֿאַרעפֿנטלעכטער ווייכווארג פּעקל) ווי באַשריבן אונטן. די אַנאַליז פֿון ערשטיקע דאַטן כולל שטרענגע מולטי-סטאַגע פֿילטערינג פּראָצעדורן. כּדי אויסצופֿילטערן רידס וואָס האָבן נישט אַנטהאַלטן אַ גילטיקע 12מער ינסערט דנאַ סיקוואַנס, זענען די רידס סיקווענשעל אַליינד געוואָרן צו אָנהייב לייבל (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), סטאָפּ לייבל (TAAGCTTTGCGGCCGCACTCGAGTA) און הינטערגרונט ינסערט (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ניצנדיק דעם גלאָבאַלן Needleman-Wunsch טעסט. אַליינמענט וואָס ערלויבט ביז 2 אינקאָנסיסטענסיעס פּער אַליינמענט31. דעריבער, רידס אָן אָנהייב און סטאָפּ טאַגס און רידס וואָס אַנטהאַלטן הינטערגרונט ינסערץ, ד.ה. אַליינמאַנץ וואָס איבערשטייגן די ערלויבטע צאָל פֿון מיסמאַטטשעס, זענען אַוועקגענומען געוואָרן פֿון דער ביבליאָטעק. וואָס שייך די איבעריקע לייענונגען, איז די N-מער דנאַ סיקוואַנס וואָס ציט זיך פֿון דעם אָנהייב־צייכן און ענדיקט זיך פֿאַר דעם סטאָפּ־צייכן אַרויסגענומען געוואָרן פֿון דער אָריגינעלער לייענונג־סיקוואַנס און ווייטער פֿאַראַרבעט (ווייטער באַצייכנט ווי "אינסערט"). נאָך דער טראַנסלאַציע פֿון דער אינסערץ, איז דער טייל נאָך דעם ערשטן סטאָפּ־קאָדאָן ביים 5′־עק פֿון דעם פּריימער אַרויסגענומען געוואָרן פֿון דער אינסערץ. דערצו זענען אויך אַרויסגענומען געוואָרן נוקלעאָטידן וואָס פֿירן צו אומפֿולשטענדיקע קאָדאָנס ביים 3′־עק פֿון דעם פּריימער. כּדי אויסצושליסן אינסערץ וואָס אַנטהאַלטן בלויז הינטערגרונט־סיקוואַנסן, זענען אויך אַרויסגענומען געוואָרן איבערגעזעצטע אינסערץ וואָס אָנהייבן מיטן אַמינאָ־זויער־מוסטער "PAG". פּעפּטידן מיט אַ פּאָסט־טראַנסלאַציאָנעלער לענג פֿון ווייניקער ווי 3 אַמינאָ־זויערן זענען אַרויסגענומען געוואָרן פֿון דער ביבליאָטעק. צום סוף, אַראָפּנעמען רעדונדאַנס אין דער אינסערץ־פּול און באַשטימען די אָפֿטקייט פֿון יעדן איינציקאַרטיקן אינסערץ. די רעזולטאַטן פֿון דער אַנאַליז האָבן אַרייַנגענומען אַ רשימה פֿון נוקלעאָטיד־סיקוואַנסן (אינסערץ) און זייערע (לייענונג־) אָפֿטקייטן (צוגאב־פֿיגורן 1c און 2).
גרופע N-מער DNA אינסערטס לויט סיקווענס ענלעכקייט: כדי צו עלימינירן 454/Roche-ספעציפישע סיקווענסינג ערראָרס (אַזאַ ווי פּראָבלעמען מיט סיקווענסינג האָמאָפּאָלימער עקסטענשאַנז) און באַזייַטיקן ווייניקער וויכטיקע רעדאַנדאַנסיעס, פריער געפילטערטע N-מער DNA סיקווענס אינסערטס (אינסערטס) זענען סאָרטירט לויט ענלעכקייט. אינסערטס (ביז 2 נישט-פּאַטשינג באַזעס ערלויבט) ניצן אַן איטעראַטיוו אַלגערידאַם דעפינירט ווי גייט: אינסערטס זענען סאָרטירט ערשטער לויט זייער אָפטקייט (העכסטע צו נידעריקסטע), און אויב זיי זענען די זעלבע, לויט זייער צווייטיק סאָרט לויט לענג (לענגסטע צו קירצסטע). אזוי, די מערסט אָפט און לענגסטע אינסערטס דעפינירן די ערשטע "גרופע". די גרופע אָפטקייט איז באַשטימט צו די שליסל אָפטקייט. דערנאָך, יעדער אינסערט וואָס בלייבט אין דער סאָרטירטער רשימה איז געווען פּרובירט צו זיין צוגעגעבן צו דער גרופע דורך פּאָרווייז Needleman-Wunsch אַליינמאַנט. אויב די נומער פון מיסמאַטשעס, אינסערטס, אָדער דילישאַנז אין אַן אַליינמאַנט טוט נישט יקסיד אַ שוועל פון 2, אַן אינסערט איז צוגעגעבן צו דער גרופע, און די קוילעלדיק גרופע אָפטקייט איז געוואקסן דורך ווי אָפט די אינסערט איז צוגעגעבן. אינסערטס צוגעגעבן צו אַ גרופע זענען מאַרקירט ווי געניצט און יקסקלודיד פון ווייטערדיק פּראַסעסינג. אויב די אייַנפֿיר סיקוואַנס קען נישט צוגעגעבן ווערן צו אַ שוין עקזיסטירנדיקער גרופּע, ווערט די אייַנפֿיר סיקוואַנס גענוצט צו שאַפֿן אַ נײַע גרופּע מיט דער פּאַסיקער אייַנפֿיר פֿרעקווענץ און געמאַרקט ווי גענוצט. די איטעראַציע ענדיקט זיך ווען יעדע אייַנפֿיר סיקוואַנס איז אָדער גענוצט געוואָרן צו פֿאָרמירן אַ נײַע גרופּע אָדער קען אַרײַנגענומען ווערן אין אַ שוין עקזיסטירנדיקער גרופּע. סוף־כּל־סוף, גרופּירטע אייַנפֿירונגען וואָס באַשטייען פֿון נוקלעאָטידן ווערן בסוף איבערגעזעצט אין פּעפּטיד סיקוואַנסן (פּעפּטיד ביבליאָטעקן). דער רעזולטאַט פֿון דעם אַנאַליז איז אַ סכום אייַנפֿירונגען און זייערע קאָרעספּאָנדירנדיקע פֿרעקווענציעס וואָס מאַכן אויס די צאָל קאָנסעקוטיווע לייענונגען (צוגאב בילד 2).
מאָטיוו דזשענעריישאַן: באַזירט אויף אַ רשימה פון יינציקע פּעפּטיידן, איז אַ ביבליאָטעק באשאפן געוואָרן מיט אַלע מעגלעכע אַמינאָ זויער פּאַטערנז (aa) ווי געוויזן אונטן. יעדער מעגלעכער מוסטער פון לענג 3 איז עקסטראַקטעד פון דעם פּעפּטייד און זיין ינווערס מוסטער איז צוגעגעבן צוזאַמען מיט אַ געמיינזאַמע מאָטיוו ביבליאָטעק מיט אַלע פּאַטערנז (טריפּעפּטיידן). ביבליאָטעקן פון העכסט ריפּעטיטיוו מאָטיוון זענען סיקווענסט און רעדאַנדאַנסי אַוועקגענומען. דערנאָך, פֿאַר יעדן טריפּעפּטייד אין דער מאָטיוו ביבליאָטעק, האָבן מיר געקוקט אויף זיין בייַזייַן אין דער ביבליאָטעק מיט קאָמפּיוטיישאַנאַל מכשירים. אין דעם פאַל, די אָפטקייט פון דעם פּעפּטייד מיט דעם געפונענעם מאָטיוו טריפּעפּטייד איז צוגעגעבן און אַסיינד צו דעם מאָטיוו אין דער מאָטיוו ביבליאָטעק ("נומער פון מאָטיוון"). דער רעזולטאַט פון מאָטיוו דזשענעריישאַן איז אַ צוויי-דימענסיאָנאַלער אַרעי מיט אַלע פֿאָרקומען פון טריפּעפּטיידן (מאָטיוון) און זייערע ריספּעקטיוו ווערטן, וואָס זענען די נומער פון סיקווענסינג רידז וואָס רעזולטאַט אין דעם קאָרעספּאָנדינג מאָטיוו ווען די רידז זענען געפילטערט, גרופּירט און איבערגעזעצט. מעטריקס ווי דיסקרייבד אין דעטאַל אויבן.
נאָרמאַליזאַציע פון ​​דער צאָל מאָטיוון און קאָרעספּאָנדירנדיקע סקאַטערפּלאָטס: די צאָל מאָטיוון פֿאַר יעדן מוסטער איז נאָרמאַליזירט געוואָרן ניצנדיק
וואו ni איז די צאָל רידס וואָס אַנטהאַלטן טעמע i. אַזוי, vi רעפּרעזענטירט די פּראָצענט אָפטקייט פון רידס (אָדער פּעפּטיידן) וואָס אַנטהאַלטן מאָטיוו i אין דעם מוסטער. P-ווערטן פֿאַר די נישט-נאָרמאַליזירטע צאָל מאָטיוון זענען קאַלקיאַלייטיד מיט פישער'ס עקזאַקטער טעסט. וועגן קאָרעלאָגראַמען פון דער צאָל מאָטיוון, ספּירמאַן'ס קאָרעלאַציעס זענען קאַלקיאַלייטיד מיט די נאָרמאַליזירטע צאָל מאָטיוון מיט R.
כדי צו וויזואַליזירן דעם אינהאַלט פון אַמינאָ זויערן אין יעדער פּאָזיציע אין דער פּעפּטיד ביבליאָטעק, זענען וועב לאָגאָגראַפיעס 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) באשאפן געוואָרן. ערשטנס, ווערט דער אינהאַלט פון אַמינאָ זויערן אין יעדער פּאָזיציע פון ​​דעם 12-מער פּעפּטיד געהיט אין אַ 20×12 מאַטריץ. דערנאָך, ווערט אַ סכום פון 1000 פּעפּטיידן מיט דעם זעלבן רעלאַטיוון אַמינאָ זויער אינהאַלט אין יעדער פּאָזיציע גענערירט אין פאַסטאַ-סיקוואַנס פֿאָרמאַט און צוגעשטעלט ווי אינפוט צו וועב-לאָגאָ 3, וואָס גענערירט אַ גראַפֿישע רעפּרעזענטאַציע פון ​​דעם רעלאַטיוון אַמינאָ זויער אינהאַלט אין יעדער פּאָזיציע פֿאַר אַ געגעבענער פּעפּטיד ביבליאָטעק. כדי צו וויזואַליזירן מולטידימענסיאָנעלע דאַטאַסעץ, זענען היץ מאַפּס באשאפן געוואָרן מיט אַן אינטערנאַל אַנטוויקלטן געצייַג אין R (biosHeatmap, אַ נאָך-צו-זיין-פרייַגעלאָזט R פּעקל). די דענדראָגראַמען וואָס זענען פּרעזענטירט געוואָרן אין די היץ מאַפּס זענען קאַלקולירט געוואָרן מיט וואַרד'ס כייעראַרקישער קלאַסטערינג מעטאָד מיט דער עוקלידישער דיסטאַנס מעטריק. פֿאַר סטאַטיסטישער אַנאַליז פון מאָטיוו סקאָרינג דאַטן, זענען P ווערטן פֿאַר אַננאָרמאַליזירט סקאָרינג קאַלקולירט געוואָרן מיט פישער'ס עקזאַקטער טעסט. פּ-ווערטן פֿאַר אַנדערע דאַטאַסעץ זענען קאַלקיאַלייטיד געוואָרן אין R ניצנדיק סטודענט'ס ט-טעסט אָדער ANOVA.
אויסגעקליבענע פאַג קלאָונז און פאַגעס אָן ינסערץ זענען ינדזשעקטעד ינטראַווענאָוסלי דורך די עק אָדער (2×1010 פאַגעס/חיה אין 300 μl PBS). צען מינוט איידער פּערפוסיאָן און דערנאָך פיקסיישאַן, די זעלבע חיות זענען ינטראַווענאָוסלי ינדזשעקטעד מיט 100 μl פון DyLight594-מאַרקעד לעקטין (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 מינוט נאָך פאַג ינדזשעקשאַן, ראַץ זענען פּערפיוזד דורך די האַרץ מיט 50 מל PBS נאכגעגאנגען דורך 50 מל 4% PFA/PBS. מוח סאַמפּאַלז זענען נאָך פיקסעד איבערנאַכט אין 4% PFA/PBS און סאָוקט אין 30% סוכראָז איבערנאַכט ביי 4°C. סאַמפּאַלז זענען בליץ געפרוירן אין די OCT געמיש. יממונאָכיסטאָכעמיש אַנאַליז פון געפרוירן סאַמפּאַלז איז דורכגעפירט ביי צימער טעמפּעראַטור אויף 30 μm קריאָסעקשאַנז בלאַקט מיט 1% BSA און ינקובייטיד מיט פּאָליקלאָנאַל FITC-מאַרקעד אַנטיבאָדיעס קעגן T7 פאַג (Novus NB 600-376A) ביי 4 °C. ינקובייט איבערנאַכט. צום סוף, די סעקשאַנז זענען געוואַשן געוואָרן 3 מאָל מיט PBS און אונטערזוכט מיט אַ קאָנפאָקאַל לאַזער מיקראָסקאָפּ (Leica TCS SP5).
אַלע פּעפּטיידן מיט אַ מינימום ריינקייט פון 98% זענען סינטעזירט געוואָרן דורך GenScript USA, ביאָטינילירט און ליאָפיליזירט. ביאָטין איז געבונדן דורך אַן נאָך טריפּל גליצין ספּייסער ביים N-טערמינוס. קאָנטראָלירט אַלע פּעפּטיידן מיט מאַסע ספּעקטראָמעטריע.
סטרעפּטאַווידין (סיגמאַ S0677) איז געמישט געוואָרן מיט אַ 5-פאַכיגן עקווימאָלערן איבערפלוס פון ביאָטינילירטן פּעפּטיד, ביאָטינילירטן BACE1 אינהיביטאָרישן פּעפּטיד, אָדער אַ קאָמבינאַציע (3:1 פאַרהעלטעניש) פון ביאָטינילירטן BACE1 אינהיביטאָרישן פּעפּטיד און BACE1 אינהיביטאָרישן פּעפּטיד אין 5–10% DMSO/אינקובירט אין PBS. 1 שעה ביי צימער טעמפּעראַטור איידער די אינדזשעקציע. סטרעפּטאַווידין-קאָנדזשוגירטע פּעפּטיידן זענען אינדזשעקטירט געוואָרן ינטראַווענאָז אין אַ דאָזע פון ​​10 מג/קג אין איינעם פון די עק אָדערן פון ראַץ מיט אַ סערעבראַלער קאַוואַטי.
די קאנצענטראציע פון ​​סטרעפּטאַווידין-פּעפּטיד קאָמפּלעקסן איז געוואָרן אָפּגעשאַצט דורך ELISA. Nunc Maxisorp מיקראָטיטער פּלאַטעס (Sigma) זענען באַדעקט געוואָרן איבער נאַכט ביי 4°C מיט 1.5 μg/ml מויז אַנטי-סטרעפּטאַווידין אַנטיבאָדי (Thermo, MA1-20011). נאָך בלאָקירן (בלאָקירן באַפער: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% דזשעלאַטין, 1% BSA) ביי צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 2 שעה, וואַשן די פּלאַטע מיט 0.05% Tween-20/PBS (וואַש באַפער) פֿאַר 3 סעקונדעס, CSF און פּלאַזמע מוסטערן זענען צוגעגעבן געוואָרן צו וועללז דיילוטאַד מיט בלאָקירן באַפער (פּלאַזמע 1:10,000, CSF 1:115). די פּלאַטע איז דערנאָך אינקובירט געוואָרן איבער נאַכט ביי 4°C מיט דעטעקציע אַנטיבאָדי (1 μg/ml, אַנטי-סטרעפּטאַווידין-HRP, Novus NB120-7239). נאך דריי וואש טריט, איז סטרעפטאווידין דעטעקטירט געווארן דורך אינקובאציע אין TMB סובסטראט לייזונג (Roche) פאר ביז 20 מינוט. נאכדעם וואס מען האט אפגעשטעלט די קאליר אנטוויקלונג מיט 1M H2SO4, מעסט מען די אבסארבאנס ביי 450 נ"מ.
די פונקציע פון ​​דעם סטרעפּטאַווידין-פּעפּטיד-BACE1 אינהיביטאָר קאָמפּלעקס איז געוואָרן אָפּגעשאַצט דורך Aβ(1-40) ELISA לויטן פּראָטאָקאָל פֿונעם פאַבריקאַנט (Wako, 294-64701). אין קורצן, CSF מוסטערן זענען געוואָרן פֿאַרדיןנט אין אַ סטאַנדאַרט פֿאַרדיןער (1:23) און אינקובירט איבער נאַכט ביי 4°C אין 96-וועל פּלאַטעס באַדעקט מיט BNT77 קאַפּטשער אַנטיבאָדי. נאָך פֿינף וואַשינג טריט, איז צוגעגעבן געוואָרן HRP-קאָניוגירטן BA27 אַנטיבאָדי און אינקובירט פֿאַר 2 שעה ביי 4°C., און דערנאָך פֿינף וואַשינג טריט. Aβ(1–40) איז געוואָרן דעטעקטירט דורך אינקובאַציע אין TMB לייזונג פֿאַר 30 מינוט ביי צימער טעמפּעראַטור. נאָכדעם וואָס די קאָליר אַנטוויקלונג איז געוואָרן אָפּגעשטעלט מיט דער אָפּשטעל לייזונג, מעסטן די אַבסאָרבאַנס ביי 450 נם. פּלאַזמע מוסטערן זענען געוואָרן אונטערגעוואָרפֿן צו אַ סאָליד פֿאַזע עקסטראַקציע איידער Aβ(1–40) ELISA. פּלאַזמע איז צוגעגעבן געוואָרן צו 0.2% DEA (Sigma) אין 96-וועל פּלאַטעס און אינקובירט ביי צימער טעמפּעראַטור פֿאַר 30 מינוט. נאכדעם וואס מען האט נאכאנאנד געוואשן די SPE פלאטעס (Oasis, 186000679) מיט וואסער און 100% מעטאנאל, זענען פלאזמע מוסטערן צוגעגעבן געווארן צו די SPE פלאטעס און אלע פליסיקייט איז אוועקגענומען געווארן. די מוסטערן זענען געוואשן געווארן (ערשט מיט 5% מעטאנאל און דערנאך 30% מעטאנאל) און ארויסגעלאזט מיט 2% NH4OH/90% מעטאנאל. נאכדעם וואס מען האט געטריקנט דעם ארויסלאז ביי 55°C פאר 99 מינוט ביי א קאנסטאנטן N2 שטראם, זענען די מוסטערן רעדוצירט געווארן אין סטאנדארט פארדילערער און Aβ(1–40) איז געמאסטן געווארן ווי אויבן באשריבן.
ווי אזוי צו ציטירן דעם ארטיקל: אוריטש, ע. און אנדערע. לאסט-ליפערונג צום מוח ניצנדיק טראנזיט פּעפּטיידן אידענטיפיצירט אין וויוואָ. די וויסנשאַפט. 5, 14104; דוי:10.1038/srep14104 (2015).
ליכאָטאַ דזש., סקיאָרינגע ט., טאָמסען ל.ב. און מוס ט. צושטעל פון מאַקראָמאָלעקולאַרע מעדיקאַמענטן צום מוח מיט צילגעריכטע טעראַפּיע. זשורנאַל פון נעוראָכעמיסטרי 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
בראַסניעוויטש, י., שטיינבוש, ה.וו., שמיץ, ק., און מאַרטינעז-מאַרטינעז, פּ. ליפערונג פון פּעפּטיד און פּראָטעין דרוגס אַריבער די בלוט-געהירן באַריערע. פּראָג נעוראָביאָל 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
פּאַרדרידזש, וו.מ. די בלוט-געהירן באַריערע: אַ פלאַשנעק אין געהירן מעדיצין אַנטוויקלונג. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
דזשאָהאַנסאָן, קע, דאַנקאַן, דזשאַ, סטאָפּאַ, עדזשי, און בירד, אַ. פּראָספּעקטן פֿאַר פֿאַרבעסערטע מעדיקאַמענטן צושטעל און צילן צום מוח דורך די כאָראָיד פּלעקסוס-CSF פּאַטוויי. פֿאַרמאַסוטיקאַל ריסערטש 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
פּאַרדרידזש, וו.מ. מאָדערניזאַציע פון ​​ביאָפאַרמאַסוטיקאַלז מיט מאָלעקולאַרע טראָדזשאַן פערד פֿאַר מוח ליפערונג. ביאָקאָנדזשוג כעם 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
פּאַרדרידזש, WM רעצעפּטאָר-מעדיאַטעד פּעפּטיד טראַנספּאָרט אַריבער די בלוט-געהירן באַריערע. ענדאָקר רעוו. 7, 314–330 (1986).
ניעוועהנער, דזש. און אנדערע. פארגרעסערן מוח דורכדרינגונג און עפעקטיווקייט פון טעראפויטישע אנטיקערפערס ניצנדיק מאָנאָוואַלענטע מאָלעקולארע שאַטאַלז. נעוראָן 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
ביען-לי, נ. און אנדערע. טראַנספעררין רעסעפּטאָר (TfR) טראַנספּאָרט באַשטימט די אויפנאַם פון אַפיניטי וואַריאַנטן פון TfR אַנטיקערפּערס אין מוח. דזש עקספּ מעד 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).