Ẹ ṣeun fún ṣíbẹ̀wò sí Nature.com. Ẹ̀yà aṣàwákiri tí ó ní àtìlẹ́yìn CSS díẹ̀ ni o ń lò. Fún ìrírí tí ó dára jùlọ, a gbà ọ́ nímọ̀ràn pé kí o lo ẹ̀rọ aṣàwákiri tí a ti mú gbóná (tàbí kí o má ṣe pa Ìgbésẹ̀ Ìbáramu nínú Internet Explorer). Ní ​​àfikún, láti rí i dájú pé àtìlẹ́yìn ń lọ lọ́wọ́, a ń fi ojú-ọ̀nà náà hàn láìsí àwọn àṣà àti JavaScript.
Ó ń fi ìṣàfihàn àwọn ìṣàfihàn mẹ́ta hàn lẹ́ẹ̀kan náà. Lo àwọn bọ́tìnì Ìṣáájú àti Ìtẹ̀lé láti gbé àwọn ìṣàfihàn mẹ́ta jáde ní àkókò kan, tàbí lo àwọn bọ́tìnì ìṣàfihàn ní ìparí láti gbé àwọn ìṣàfihàn mẹ́ta jáde ní àkókò kan náà.
Ìdènà ẹ̀jẹ̀-ọpọlọ àti ìdènà ẹ̀jẹ̀-ọpọlọ ń dènà àwọn ohun èlò ìtọ́jú ara láti dé ibi tí wọ́n ń fojú sí nínú ètò iṣan ara, èyí sì ń dí ìtọ́jú tó munadoko lọ́wọ́ àwọn àrùn ọpọlọ. Láti ṣàwárí àwọn ohun èlò ìtọ́jú ọpọlọ tuntun ní vivo, a ṣe àgbékalẹ̀ ìkàwé peptide phage T7 àti ìtọ́jú ẹ̀jẹ̀ àti omi cerebrospinal (CSF) ní ṣísẹ̀-n-tẹ̀lé nípa lílo àwòṣe ńlá pool ti àwọn eku. Àwọn clone phage pàtó ni a fi kún CSF lẹ́yìn ìgbà mẹ́rin tí a yàn. Ìdánwò àwọn peptide olùdíje kọ̀ọ̀kan fi hàn pé ó ju ìdàgbàsókè ìṣiṣẹ́ peptide lọ sí ọpọlọ ni a fi ìdí rẹ̀ múlẹ̀ nípa ìdínkù 40% nínú ipele amyloid-β nínú omi cerebrospinal nípa lílo inhibitor peptide BACE1 tí ó so mọ́ peptide transit tuntun tí a ti dámọ̀. Àwọn èsì wọ̀nyí fihàn pé àwọn peptide tí a dámọ̀ràn nípasẹ̀ àwọn ọ̀nà yíyan in vivo phage lè jẹ́ àwọn ohun èlò tí ó wúlò fún ìfijiṣẹ́ macromolecules sí ọpọlọ pẹ̀lú ipa ìtọ́jú.
Ìwádìí ìtọ́jú tí a fojú sí lórí ètò iṣan ara (CNS) ti dojúkọ jùlọ lórí dídá àwọn oògùn àti àwọn ohun èlò tí a ṣe àtúnṣe tí ó ń fi àwọn ohun ìní ìfojúsùn CNS hàn, pẹ̀lú ìsapá díẹ̀ láti ṣàwárí àwọn ọ̀nà tí ó ń mú kí ìfijiṣẹ́ oògùn ṣiṣẹ́ lọ sí ọpọlọ. Èyí ti ń bẹ̀rẹ̀ sí í yípadà nísinsìnyí bí ìfijiṣẹ́ oògùn, pàápàá jùlọ àwọn ohun èlò ńláńlá, ṣe jẹ́ apá pàtàkì nínú ìdàgbàsókè oògùn ọpọlọ òde òní. Ayíká ètò iṣan ara àárín ni a dáàbò bò dáadáa nípasẹ̀ ètò ìdènà cerebrovascular, tí ó ní ìdènà ẹ̀jẹ̀-ọpọlọ (BBB) ​​​​àti ìdènà ẹ̀jẹ̀-ọpọlọ (BCBB)1, èyí tí ó mú kí ó ṣòro láti fi àwọn oògùn ránṣẹ́ sí ọpọlọ1,2. A ṣírò pé ó fẹ́rẹ̀ẹ́ jẹ́ pé gbogbo àwọn oògùn ohun èlò ńláńlá àti ju 98% àwọn oògùn ohun èlò kékeré lọ ni a yọ kúrò nínú ọpọlọ3. Ìdí nìyí tí ó fi ṣe pàtàkì láti dá àwọn ètò ìrìnnà ọpọlọ tuntun mọ̀ tí ó ń pèsè ìfijiṣẹ́ oògùn ìtọ́jú tí ó munadoko àti pàtó sí CNS 4,5. Síbẹ̀síbẹ̀, BBB àti BCSFB tún ń fúnni ní àǹfààní tí ó tayọ fún ìfijiṣẹ́ oògùn bí wọ́n ṣe ń wọ inú àti wọ inú gbogbo àwọn ètò ọpọlọ nípasẹ̀ ìṣàn ẹ̀jẹ̀ rẹ̀ tí ó gbòòrò. Nítorí náà, àwọn ìsapá lọ́wọ́lọ́wọ́ láti lo àwọn ọ̀nà ìfijiṣẹ́ tí kìí ṣe ìpalára sí ọpọlọ dá lórí ìlànà ìfijiṣẹ́ tí a fi ń gba ìtọ́jú (PMT) nípa lílo ohun tí a fi ń gba ìtọ́jú BBB6. Láìka àwọn ìlọsíwájú pàtàkì tí a ṣẹ̀ṣẹ̀ ṣe nípa lílo ọ̀nà ìfijiṣẹ́ transferrin 7,8 síi, a nílò ìdàgbàsókè síwájú síi ti àwọn ètò ìfijiṣẹ́ tuntun pẹ̀lú àwọn ànímọ́ tí ó dára síi. Láti ṣe èyí, ète wa ni láti dá àwọn peptide tí ó lè ṣe àtúnṣe ìrìnnà CSF mọ̀, nítorí pé a lè lò wọ́n ní ìlànà láti fi àwọn macromolecules ránṣẹ́ sí CNS tàbí láti ṣí àwọn ọ̀nà ìfijiṣẹ́ tuntun. Ní pàtàkì, àwọn ohun tí a fi ń gba ìtọ́jú pàtó àti àwọn ohun tí ń gbé ètò cerebrovascular (BBB àti BSCFB) lè ṣiṣẹ́ gẹ́gẹ́ bí àwọn ibi tí ó ṣeé ṣe fún ìfijiṣẹ́ tí ń ṣiṣẹ́ àti pàtó ti àwọn oògùn biotherapeutic. Omi Cerebrospinal (CSF) jẹ́ ọjà ìkọ̀kọ̀ ti choroid plexus (CS) ó sì wà ní ìfọwọ́sowọ́pọ̀ taara pẹ̀lú omi interstitial ti ọpọlọ nípasẹ̀ space subarachnoid àti ventricular space4. Láìpẹ́ yìí, a ti fihàn pé omi cerebrospinal subarachnoid ń tàn káàkiri púpọ̀ sí interstitium ti ọpọlọ9. A nireti lati wọle si aaye parenchymal nipa lilo ọna gbigbe subarachnoid yii tabi taara nipasẹ BBB. Lati ṣaṣeyọri eyi, a ṣe agbekalẹ ọgbọn yiyan phage in vivo ti o dara julọ ti o ṣe idanimọ awọn peptides ti a gbe nipasẹ eyikeyi ninu awọn ọna oriṣiriṣi meji wọnyi.
A ṣe àpèjúwe ọ̀nà ìṣàyẹ̀wò ìfihàn in vivo phage lẹ́sẹẹsẹ pẹ̀lú ìṣàyẹ̀wò CSF pẹ̀lú ìtẹ̀léra ìlọ́sókè gíga (HTS) láti ṣe àkíyèsí àwọn ìyípo yíyàn àkọ́kọ́ pẹ̀lú onírúurú ìkàwé tó ga jùlọ. A ṣe ìṣàyẹ̀wò lórí àwọn eku onímọ̀ pẹ̀lú cannula cisterna ńlá tí a fi sínú rẹ̀ títí láé láti yẹra fún ìbàjẹ́ ẹ̀jẹ̀. Lóòótọ́, ọ̀nà yìí yan àwọn peptides àti àwọn ìgbòkègbodò ìfọkànsí ọpọlọ kọjá ìdènà cerebrovascular. A lo àwọn phages T7 nítorí ìwọ̀n kékeré wọn (~60 nm)10 a sì dámọ̀ràn pé wọ́n yẹ fún gbigbe àwọn vesicles tí ó gba transcellular láyè láti kọjá ìdènà endothelial àti/tàbí epithelial-medulla. Lẹ́yìn ìyípo mẹ́rin ti panning, a ya àwọn phage olugbe sọ́tọ̀ tí wọ́n fi agbára ìdàgbàsókè CSF àti àjọṣepọ̀ microvessel ọpọlọ hàn. Lóòótọ́, a lè fìdí àwọn àwárí wa múlẹ̀ nípa fífihàn pé àwọn peptides tí a fẹ́ràn àti tí a ṣe àgbékalẹ̀ rẹ̀ pẹ̀lú kẹ́míkà lè gbé ẹrù amuaradagba sínú omi cerebrospinal. Àkọ́kọ́, a gbé àwọn ipa oníṣègùn ti CNS kalẹ̀ nípa sísopọ̀ peptide transit olórí pẹ̀lú olùdínà peptide BACE1. Ní àfikún sí fífihàn pé àwọn ọgbọ́n ìṣàyẹ̀wò iṣẹ́-ṣíṣe in vivo le dá àwọn peptide transport ọpọlọ tuntun mọ̀ gẹ́gẹ́ bí àwọn olùgbé ẹrù amuaradagba tó munadoko, a retí pé àwọn ọ̀nà yíyàn iṣẹ́-ṣíṣe kan náà yóò tún di pàtàkì ní dídá àwọn ipa ọ̀nà ìrìnnà ọpọlọ tuntun mọ̀.
Láti orí àwọn ohun èlò tí a fi ń ṣe àkójọpọ̀ phage (PFU), lẹ́yìn ìgbésẹ̀ ìdìpọ̀ phage, a ṣe àgbékalẹ̀ àti ṣẹ̀dá ìkàwé ti àwọn peptides phage T7 linear 12-mer linear pẹ̀lú onírúurú nǹkan bíi 109 (wo Àwọn Ohun Èlò àti Ọ̀nà). Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé a ṣe àgbéyẹ̀wò ìkàwé yìí dáadáa kí a tó bẹ̀rẹ̀ sí í ṣe panning in vivo. Ìmúdàgba PCR ti àwọn àpẹẹrẹ ìkàwé phage nípa lílo àwọn primers tí a ṣe àtúnṣe ti ṣẹ̀dá àwọn amplicon tí ó wúlò taara sí HTS (Àfikún Àwòrán 1a). Nítorí a) àwọn àṣìṣe ìtẹ̀lé HTS11, b) ipa lórí dídára àwọn primers (NNK)1-12, àti c) wíwà wild-type (wt) phage (àwọn ìfikún egungun) nínú ìkàwé ìdádúró, a ṣe ìlànà ìṣàlẹ̀ ìtẹ̀lé láti fa ìwífún ìtẹ̀lé tí a fìdí múlẹ̀ nìkan jáde (Àfikún Àwòrán 1b). Àwọn ìgbésẹ̀ àlò wọ̀nyí kan gbogbo àwọn ìkàwé ìtẹ̀lé HTS. Fún ìkàwé boṣewa, àpapọ̀ àwọn ìwé kíkà 233,868 ni a gba, nínú èyí tí 39% kọjá àwọn ìlànà àlẹ̀mọ́ tí a sì lò fún ìṣàyẹ̀wò ìkàwé àti yíyàn fún àwọn ìyípo tó tẹ̀lé e (Àwòrán Àfikún 1c–e). Àwọn ìwé kíkà náà jẹ́ ọ̀pọ̀lọpọ̀ iye àwọn méjì ìpìlẹ̀ mẹ́ta ní gígùn pẹ̀lú òkè tó wà ní 36 nucleotides (Àwòrán Àfikún 1c), èyí tó ń jẹ́rìí sí ìṣètò ìkàwé (NNK) 1-12. Àfikún, tó 11% àwọn ọmọ ẹgbẹ́ ìkàwé ní ​​ìfikún PAGISRELVDKL onípele 12, àti pé ó fẹ́rẹ̀ẹ́ tó ìdajì àwọn ìwé kíkà (49%) ní àwọn ìfikún tàbí ìparẹ́. HTS ti ìkàwé ìkàwé jẹ́rìí sí onírúurú peptides nínú ìkàwé: ó ju 81% àwọn ìwé kíkà peptide lọ ni a rí lẹ́ẹ̀kan ṣoṣo àti pé 1.5% nìkan ló ṣẹlẹ̀ nínú ≥4 àwọn ìwé (Àwòrán Àfikún 2a). Àwọn ìgbà tí amino acids (aa) wà ní gbogbo ipò 12 nínú àkójọpọ̀ náà bá àwọn ìgbà tí a retí fún iye codon tí àkójọpọ̀ NKK tí ó ti bàjẹ́ mu jáde (Àfikún À ... Ìfiwéra yìí dá lórí bí àwọn àwòrán tripeptide ṣe ń lọ nínú ìkàwé kọ̀ọ̀kan, nítorí pé onírúurú àwọn ìkàwé (~109) kò ṣeé rí ní kíkún pẹ̀lú HTS. Ìṣàyẹ̀wò ìgbàkúgbà ti aa ní ipò kọ̀ọ̀kan fi hàn pé ìfàsẹ́yìn kékeré kan wà lórí ipò mẹ́ta tó kẹ́yìn nínú ìṣètò tí a ti fi sínú rẹ̀ (Àfikún Àwòrán 2e). Ní ​​ìparí, a parí èrò sí pé dídára àti onírúurú ìkàwé náà jẹ́ ìtẹ́wọ́gbà àti pé àwọn ìyípadà díẹ̀ ni a rí nínú onírúurú nítorí ìdàgbàsókè àti ìmúrasílẹ̀ àwọn ìkàwé phage láàárín ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìyípo yíyàn.
A le ṣe ayẹwo omi cerebrospinal serial nipa fifi cannula sinu CM ti awọn eku ti o ni imọ lati ṣe iranlọwọ lati ṣe idanimọ T7 phage ti a fi sinu iṣan (iv) nipasẹ BBB ati/tabi BCSFB (Fig. 1a-b). A lo awọn apa yiyan ominira meji (apa A ati B) ni awọn iyipo mẹta akọkọ ti yiyan in vivo (Fig. 1c). A mu okun yiyan pọ si diẹdiẹ nipa idinku iye apapọ phage ti a ṣe ni awọn iyipo mẹta akọkọ ti yiyan. Fun iyipo kẹrin ti panning, a ṣe akojọpọ awọn ayẹwo lati awọn ẹka A ati B ati ṣe awọn yiyan ominira mẹta afikun. Lati ṣe iwadi awọn ohun-ini in vivo ti awọn patikulu phage T7 ninu awoṣe yii, a fi phage iru-ara wild-type (PAGISRELVDKL master insert) sinu awọn eku nipasẹ iṣan iru. Gbigba awọn phages pada lati inu omi cerebrospinal ati ẹjẹ ni awọn aaye akoko oriṣiriṣi fihan pe awọn phages T7 icosahedral kekere ni ipele ibẹrẹ iyara lati apakan ẹjẹ (Fig. Afikun 3). Ní ìbámu pẹ̀lú àwọn titers tí a fún àti ìwọ̀n ẹ̀jẹ̀ àwọn eku, a ṣírò pé nǹkan bí 1% wt. phage láti inú ìwọ̀n tí a fún ni a rí nínú ẹ̀jẹ̀ ní ìṣẹ́jú mẹ́wàá lẹ́yìn abẹ́rẹ́ inú iṣan. Lẹ́yìn ìdínkù kíákíá yìí, a wọn ìparẹ́ àkọ́kọ́ díẹ̀ pẹ̀lú ìdajì-ìgbésí ayé ìṣẹ́jú 27.7. Pàtàkì, àwọn phage díẹ̀ ni a rí láti inú yàrá CSF, èyí tí ó fi hàn pé ìṣíkiri irú phage onírun sínú yàrá CSF kéré sí i (Àfikún Àwòrán 3). Ní ​​àròpín, nǹkan bí 1 x 10-3% ti phage T7 nínú ẹ̀jẹ̀ àti 4 x 10-8% ti phage onírun tí a fún ní àkọ́kọ́ ni a rí nínú omi cerebrospinal ní gbogbo àkókò ìṣàyẹ̀wò (0-250 min). Pàtàkì, ìdajì-ìgbésí ayé (25.7 min) ti phage onírun nínú omi cerebrospinal jọ èyí tí a rí nínú ẹ̀jẹ̀. Àwọn ìwádìí wọ̀nyí fihàn pé ìdènà tí ó ya ìpín CSF kúrò nínú ẹ̀jẹ̀ wà ní ìbámu pẹ̀lú àwọn eku tí a fi cannulated CM ṣe, èyí tí ó fún ni láàyè láti yan àwọn ibi ìkàwé phage láti mọ àwọn clone tí a gbé láti inú ẹ̀jẹ̀ sínú ìpín CSF ní ìrọ̀rùn.
(a) Ṣíṣe àgbékalẹ̀ ọ̀nà kan fún àtúnyẹ̀wò omi cerebrospinal (CSF) láti inú adágún ńlá kan. (b) Àwòrán tí ó ń fi ibi tí ìdènà sọ́ọ̀lù ti ààrin ara (CNS) wà hàn àti ọgbọ́n yíyàn tí a lò láti dá àwọn peptide tí ó kọjá ìdènà sọ́ọ̀lù-ọpọlọ (BBB) ​​​​àti ìdènà sọ́ọ̀lù-ọpọlọ. (c) Àwòrán ìṣàfihàn ìfihàn phage In vivo. Nínú gbogbo ìyípo yíyàn, a fún àwọn phages (àwọn ìdámọ̀ ẹranko nínú àwọn ọfà) ní abẹ́rẹ́ inú iṣan. A pa àwọn ẹ̀ka méjì mìíràn tí ó yàtọ̀ síra (A, B) mọ́ sí ara wọn títí di ìyípo kẹrin yíyàn. Fún àwọn ìyípo yíyàn 3 àti 4, a fi ọwọ́ ṣe ìtẹ̀léra ìpele phage kọ̀ọ̀kan tí a yọ kúrò nínú CSF. (d) Àwọn kinetics ti phage tí a yà sọ́tọ̀ kúrò nínú ẹ̀jẹ̀ (àwọn iyika pupa) àti omi cerebrospinal (àwọn onígun mẹ́ta aláwọ̀ ewé) nígbà ìyípo àkọ́kọ́ yíyàn nínú àwọn eku méjì tí a ti yọ lẹ́ẹ̀kan sí lẹ́yìn abẹ́rẹ́ inú iṣan ti ìkàwé peptide T7 (2 x 1012 phages/ẹranko). Àwọn onígun dúdú fi àpapọ̀ ìṣọ̀kan àkọ́kọ́ ti phage nínú ẹ̀jẹ̀ hàn, tí a ṣírò láti iye phage tí a fún ní abẹ́rẹ́, ní gbígbé àròpọ̀ ìwọ̀n ẹ̀jẹ̀ yẹ̀wò. Àwọn onígun dúdú fi ojú ibi tí ìlà y tí a yọ jáde láti inú ìṣọ̀kan phage nínú ẹ̀jẹ̀ hàn. (e,f) Fi ìṣọ̀kan àti ìpínkiri gbogbo àwọn àwòrán tripeptide tí ó ṣeé ṣe kí ó wà nínú peptide hàn. Iye àwòrán tí a rí nínú àwọn ìkà 1000 hàn. Ní pàtàkì (p < 0.001) àwọn àwòrán tí a fún ní abẹ́rẹ́ ni a fi àmì pupa sàmì sí. (e) Ìṣọ̀kan phage tí a fi ìṣọ̀kan sàmì wéra pẹ̀lú ìṣọ̀kan phage tí a mú jáde láti inú ẹ̀jẹ̀ láti ọ̀dọ̀ àwọn ẹranko #1.1 àti #1.2. (f) Ìṣọ̀kan phage tí a fi wéra pẹ̀lú ìṣọ̀kan phage tí ẹranko #1.1 àti #1.2 tí a yà sọ́tọ̀ nínú ẹ̀jẹ̀ àti omi cerebrospinal. (g, h) Ìfihàn ìpele ti phage tí a fún ní abẹ́rẹ́ nínú ẹ̀jẹ̀ (g) pẹ̀lú àwọn ilé ìkàwé tí a fún ní abẹ́rẹ́ àti phage tí a fún ní abẹ́rẹ́ nínú CSF (h) pẹ̀lú ẹ̀jẹ̀ lẹ́yìn yíyan in vivo nínú àwọn ẹranko méjèèjì. Ìtóbi kódì lẹ́tà kan náà fi bí amino acid náà ṣe máa ń wáyé ní ipò yẹn hàn. Àwọ̀ ewé = polar, elése àlùkò = neutral, bulu = basic, pupa = acidic àti dúdú = hydrophobic amino acids. Àwòrán 1a, b ni Eduard Urich ṣe àgbékalẹ̀ rẹ̀ tí ó sì ṣe é.
A fi abẹ́rẹ́ peptide phage sinu awọn eku ohun elo CM meji (clades A ati B) ati phage ti a ya sọtọ lati inu omi cerebrospinal ati ẹjẹ (Àwòrán 1d). Iyẹ̀fun iyara akọkọ ti ile-ikawe ko han gbangba ni akawe pẹlu phage iru wild-type. Idaji idaji igbesi aye ti ile-ikawe ti a fi abẹ́rẹ́ ninu awọn ẹranko mejeeji jẹ iṣẹju 24.8 ninu ẹjẹ, ti o jọra si phage iru wild-type, ati iṣẹju 38.5 ninu CSF. A fi awọn ayẹwo phage ẹjẹ ati omi cerebrospinal lati ọdọ ẹranko kọọkan sinu HTS ati gbogbo awọn peptide ti a mọ ni a ṣe itupalẹ fun wiwa ti motif tripeptide kukuru kan. A yan awọn motif tripeptide nitori pe wọn pese ipilẹ kekere fun dida eto ati awọn ibaraenisepo peptide-protein14,15. A rii ibatan ti o dara ninu pinpin awọn motifs laarin ile-ikawe phage ti a fi abẹ́rẹ́ ati awọn clones ti a fa jade lati inu ẹjẹ awọn ẹranko mejeeji (Àwòrán 1e). Awọn data fihan pe akojọpọ ile-ikawe naa jẹ ọlọrọ diẹ ni apakan ẹjẹ. A ṣe itupalẹ awọn igbohunsafẹfẹ amino acid ati awọn atẹle iṣọkan ni ipo kọọkan nipa lilo iyipada ti sọfitiwia Weblogo16. Lọ́nà tó yani lẹ́nu, a rí ìdàgbàsókè tó lágbára nínú àwọn ìyókù glycine nínú ẹ̀jẹ̀ (Àwòrán 1g). Nígbà tí a fi ẹ̀jẹ̀ wé àwọn clone tí a yàn láti inú CSF, a rí yíyàn tó lágbára àti yíyọ àwọn motif díẹ̀ kúrò (Àwòrán 1f), àti pé àwọn amino acid kan wà ní ipò tí a ti pinnu tẹ́lẹ̀ nínú àwọn mẹ́jìlá (Àwòrán 1h). Lóòótọ́, àwọn ẹranko kọ̀ọ̀kan yàtọ̀ síra gidigidi nínú omi cerebrospinal, nígbà tí a rí ìdàgbàsókè glycine nínú ẹ̀jẹ̀ nínú àwọn ẹranko méjèèjì (Àwòrán Àfikún 4a–j). Lẹ́yìn yíyọ data ìtẹ̀léra tó lágbára nínú omi cerebrospinal ti àwọn ẹranko #1.1 àti #1.2, a gba àpapọ̀ peptides 12-mer àrà ọ̀tọ̀ 964 àti 420 (Àwòrán Àfikún 1d–e). A mú àwọn clone phage tí a yà sọ́tọ̀ pọ̀, a sì fi wọ́n sí ìpele kejì ti yíyàn in vivo. A fi HTS lé HTS lọ́wọ́ ẹranko kọ̀ọ̀kan, a sì lo gbogbo àwọn peptide tí a dá mọ̀ gẹ́gẹ́ bí ìfàmọ́ sí ètò ìdámọ̀ motif láti ṣàyẹ̀wò ìṣẹ̀lẹ̀ àwọn motif tripeptide (Àwòrán 2a, b, ef). Ní ​​ìfiwéra pẹ̀lú ìyípo àkọ́kọ́ ti phage tí a gbà láti inú CSF, a ṣe àkíyèsí yíyàn síwájú àti yíyọ ọ̀pọ̀ motif kúrò nínú CSF nínú àwọn ẹ̀ka A àti B (Àwòrán 2). A lo alugoridimu ìdámọ̀ nẹ́tíwọ́ọ̀kì láti mọ̀ bóyá wọ́n dúró fún àwọn àpẹẹrẹ onírúurú ti ìtẹ̀léra déédé. A ṣe àkíyèsí ìbáradọ́gba tí ó ṣe kedere láàrín àwọn ìtẹ̀léra oníwọ̀n 12 tí CSF gbà padà nínú ìpele A mìíràn (Àwòrán 2c, d) àti ìpele B (Àwòrán 2g, h). Ìwádìí àpapọ̀ ní ẹ̀ka kọ̀ọ̀kan fi àwọn ìpele yíyàn tí ó yàtọ̀ hàn fún àwọn peptide 12-mer (Àwòrán Àfikún 5c, d) àti ìbísí nínú ìpíndọ́gba titer CSF/ẹ̀jẹ̀ lórí àkókò fún àwọn clone tí a kó jọ lẹ́yìn ìpele kejì ti yíyàn ní ìfiwéra pẹ̀lú ìpele àkọ́kọ́ ti yíyàn (Àwòrán Àfikún 5e). ).
Ìmúdàgba àwọn èròjà àti peptides nínú omi cerebrospinal nípasẹ̀ ìyípo méjì tí ó tẹ̀lé ara wọn ti yíyan ìfihàn phage iṣẹ́-ṣíṣe in vivo.
Gbogbo àwọn phage omi cerebrospinal tí a rí gbà láti ìpele àkọ́kọ́ ti ẹranko kọ̀ọ̀kan (ẹranko #1.1 àti #1.2) ni a kó jọ, tí a mú pọ̀ sí i, tí a tẹ̀ léraléra HT, tí a sì tún abẹ́rẹ́ papọ̀ (2 x 1010 phages/ẹranko) 2 eku tí a fi SM ṣe (#1.1 → #). 2.1 àti 2.2, 1.2 → 2.3 àti 2.4). (a,b,e,f) Àwọn ìfọ́tò ìṣọ̀kan tí a fi wé ìfọ́tò ìṣọ̀kan ti àwọn phage tripeptide ti gbogbo àwọn phage tí a ti CSF jáde nínú àwọn ìpele àkọ́kọ́ àti ìkejì. Ìfọ́tò ìṣọ̀kan àti ìpínkiri àwọn motif tí ó dúró fún gbogbo àwọn tripeptide tí ó ṣeé ṣe tí a rí nínú àwọn peptides ní àwọn ìtọ́sọ́nà méjèèjì. Iye àwọn motif tí a rí nínú àwọn ìkà 1000 ni a fi hàn. Àwọn motif tí a yàn tàbí tí a yọ kúrò ní ọ̀kan lára ​​àwọn ìkàwé tí a fiwé ni a fi àwọn àmì pupa hàn. (c, d, g, h) Àfihàn àmì ìtẹ̀léra ti gbogbo àwọn ìtẹ̀léra amino acid 12 ọlọ́rọ̀ CSF tí ó dá lórí àwọn ìtẹ̀léra 2 àti 1 ti yíyàn in vivo. Ìwọ̀n kódù lẹ́tà kan fihàn bí amino acid náà ṣe máa ń wáyé ní ipò yẹn nígbàkúgbà. Láti dúró fún àmì náà, a fi ìtẹ̀léra àwọn ìtẹ̀léra CSF tí a yọ jáde láti inú àwọn ẹranko kọ̀ọ̀kan láàárín àwọn ìyípo yíyàn méjì wéra, a sì fi àwọn ìtẹ̀léra tí a ti sọ di ọlọ́rọ̀ ní ìyíléra kejì hàn: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 àti (h) #1.2–#2.4. Àwọn amino acid tí ó ní ọrọ̀ jùlọ ní ipò tí a fúnni nínú (c, d) àwọn ẹranko nọ́mbà 2.1 àti nọ́mbà 2.2 tàbí (g, h) nínú àwọn ẹranko nọ́mbà 2.3 àti nọ́mbà 2.4 hàn ní àwọ̀. Àwọ̀ ewé = polar, elése àlùkò = neutral, blue = basic, pupa = acidic àti dúdú = hydrophobic amino acids.
Lẹ́yìn ìpele kẹta ti yíyàn, a ṣàwárí àwọn ìpele peptide aláìlẹ́gbẹ́ 124 (#3.1 àti #3.2) láti inú àwọn ìpele phage 332 tí a tún ṣe àtúnṣe sí CSF tí a yà sọ́tọ̀ láti inú àwọn ẹranko méjì (Àfikún Àwòrán 6a). Ìpele LGSVS (18.7%) ni ó ní ìwọ̀n ìbáramu tí ó ga jùlọ, lẹ́yìn náà ni àwọn ìfikún irú wild-type PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), àti SARGSWREIVSLS (2.2%). Ní ​​ìpele kẹrin ìkẹyìn, a kó àwọn ẹ̀ka méjì tí a yàn lọ́tọ̀ láti inú àwọn ẹranko mẹ́ta ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀ jọ (Àwòrán 1c). Nínú àwọn ìpele phage 925 tí a rí gbà láti inú CSF, ní ìpele kẹrin a rí àwọn ìpele peptide aláìlẹ́gbẹ́ 64 (Àfikún Àwòrán 6b), lára ​​èyí tí ìpín ìbáramu ti ìpele irú wild-type phage ti lọ sílẹ̀ sí 0.8%. Àwọn ìṣẹ̀dá CSF tí ó wọ́pọ̀ jùlọ ní ìpele kẹrin ni LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) àti RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). Ìwọ̀n gígùn àwọn peptide tí a yàn jẹ́ nítorí àwọn ìfisí/ìparẹ́ nucleotide tàbí àwọn codon ìparẹ́ tí kò tí ì pé nínú àwọn primer ìkàwé nígbà tí a bá ń lo àwọn codon tí ó ti bàjẹ́ fún àpẹẹrẹ ìkàwé NNK. Àwọn codon ìparẹ́ tí kò tí ì pé máa ń mú àwọn peptide kúkúrú jáde, a sì yàn wọ́n nítorí pé wọ́n ní èrò aa tí ó dára nínú wọn. Àwọn peptide tí ó gùn lè jẹ́yọ láti inú àwọn ìfisí/ìparẹ́ nínú àwọn primer ti àwọn ìkàwé oníṣẹ́dá. Èyí gbé codon ìparẹ́ tí a ṣe síta frame náà, ó sì kà á títí tí codon ìparẹ́ tuntun yóò fi hàn ní ìsàlẹ̀. Ní gbogbogbòò, a ṣírò àwọn ohun tí ó ń mú kí àwọn ìyípadà pọ̀ sí i fún gbogbo àwọn ìpele yíyàn mẹ́rin nípa fífi data ìtẹ̀síwájú wéra pẹ̀lú data àyẹ̀wò tí ó jáde. Fún ìpele àkọ́kọ́ ti ìṣàyẹ̀wò, a lo àwọn àmì phage onírúurú gẹ́gẹ́ bí ìtọ́kasí ìpìlẹ̀ tí kò ṣe pàtó. Lóòótọ́, yíyan phage odi lágbára gan-an ní ìpele CSF àkọ́kọ́, ṣùgbọ́n kìí ṣe nínú ẹ̀jẹ̀ (Àwòrán 3a), èyí tí ó lè jẹ́ nítorí ìṣeeṣe kékeré ti ìtànkálẹ̀ passive ti ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ọmọ ẹgbẹ́ ìkàwé peptide sínú ìpín CSF tàbí àwọn phages ìbátan sábà máa ń di ìpamọ́ tàbí yọ kúrò nínú ẹ̀jẹ̀ ju àwọn bacteriophages lọ. Síbẹ̀síbẹ̀, ní ìpele kejì ti panning, a ṣe àkíyèsí yíyan phages tó lágbára nínú CSF ní àwọn clades méjèèjì, èyí tí ó fihàn pé ìpele tó ṣáájú ní phages tí ó ń ṣe àfihàn peptides tí ó ń gbé CSF lárugẹ (Àwòrán 3a). Lẹ́ẹ̀kan sí i, láìsí ìdàgbàsókè ẹ̀jẹ̀ tó ṣe pàtàkì. Bákan náà ní ìpele kẹta àti kẹrin, àwọn clone phage ní ìdàgbàsókè ní CSF gidigidi. Ní fífi ìpele ìbátan ti ìpele peptide àrà ọ̀tọ̀ kọ̀ọ̀kan wéra láàárín àwọn ìpele méjì tó kẹ́yìn ti yíyan, a rí i pé àwọn ìpele náà ní ìdàgbàsókè ní ìpele kẹrin ti yíyan (Àwòrán 3b). Àròpọ̀ àwọn àwòrán tripeptide 931 ni a yọ jáde láti inú gbogbo àwọn ìtẹ̀léra peptide 64 tí ó yàtọ̀ nípa lílo àwọn ìtọ́sọ́nà peptide méjèèjì. Àwọn àwòrán tí ó lọ́rọ̀ jùlọ ní ìpele kẹrin ni a ṣe àyẹ̀wò dáadáa fún àwọn àwòrán ìdàgbàsókè wọn ní gbogbo àwọn ìyípo ní ìfiwéra pẹ̀lú ìkàwé tí a fún ní abẹ́rẹ́ (ìpín: 10% ìdàgbàsókè) (Àfikún Àwòrán 6c). Àwọn àpẹẹrẹ àṣàyàn gbogbogbò fihàn pé ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ète tí a kẹ́kọ̀ọ́ ni a ti sọ di ọlọ́rọ̀ ní gbogbo àwọn ìyípo ìṣáájú ti àwọn ẹ̀ka àṣàyàn méjèèjì. Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn àwòrán kan (fún àpẹẹrẹ SGL, VSG, LGS GSV) jẹ́ láti inú clade A mìíràn, nígbà tí àwọn mìíràn (fún àpẹẹrẹ FGW, RTN, WGF, NTR) ni a ti sọ di ọlọ́rọ̀ ní clade B mìíràn.
Ìfìdí múlẹ̀ ìrìn CSF ti àwọn peptides tí a fi phage-displayed CSF kún àti àwọn peptides olórí biotinylated tí a so pọ̀ mọ́ àwọn ẹrù streptavidin.
(a) Awọn ipin afikun ti a ṣe iṣiro ni gbogbo awọn iyipo mẹrin (R1-R4) da lori awọn titers ti a fun ni abẹrẹ (input = I) phage (PFU) ati awọn titers ti CSF ti a pinnu (output = O). Awọn ifosiwewe afikun fun awọn iyipo mẹta ti o kẹhin (R2-R4) ni a ṣe iṣiro nipasẹ afiwe pẹlu iyipo ti tẹlẹ ati iyipo akọkọ (R1) pẹlu data iwuwo. Awọn ọpa ṣiṣi jẹ omi cerebrospinal, awọn ọpa ojiji jẹ plasma. (***p<0.001, da lori idanwo t ti ọmọ ile-iwe). (b) Akojopo awọn peptides phage ti o pọ julọ, ti a ṣe akojọ ni ibamu si ipin ibatan wọn si gbogbo awọn phages ti a gba ni CSF lẹhin iyipo 4 ti yiyan. Awọn clone phage mẹfa ti o wọpọ julọ ni a ṣe afihan ni awọ, nọmba ati awọn ifosiwewe afikun wọn laarin awọn iyipo 3 ati 4 ti yiyan (awọn insets). (c,d) Awọn clone phage mẹfa ti o ni ọlọrọ julọ, phage ofo ati awọn ile-ikawe peptide phage obi lati yika 4 ni a ṣe itupalẹ lọtọ ni awoṣe ayẹwo CSF ​​kan. A gba awọn ayẹwo CSF ​​ati ẹjẹ ni awọn aaye akoko ti a fihan. (c) Iye awọn klone phage 6 ti o dogba (2 x 1010 phages/ẹranko), awọn phages ti o ṣofo (#1779) (2 x 1010 phages/ẹranko) ati awọn ile-ikawe peptide phage stock (2 x 1012 phages/ẹranko). A fun ni abẹrẹ o kere ju 3 CM fun ẹranko ti a fi sinu cannulated lọtọ nipasẹ iṣan iru. A fihan awọn oogun CSF ti klone phage phage kọọkan ti a fun ni abẹrẹ lori akoko. (d) fihan apapọ CSF/ẹjẹ fun gbogbo awọn phages/mL ti a gba pada ni akoko ayẹwo. (e) Awọn peptides olori synthetic mẹrin ati iṣakoso ti a fọwọkan kan ni a so pọ mọ biotin si streptavidin nipasẹ N-terminus wọn (ifihan tetramer) atẹle nipa abẹrẹ (iṣan iru iv, 10 mg streptavidin/kg). O kere ju awọn eku intubated mẹta (N = 3). A gba àwọn àpẹẹrẹ CSF ní àkókò tí a fihàn, a sì fi CSF anti-streptavidin ELISA wọn ìṣọ̀kan streptavidin (nd = a kò rí i). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, tí a gbé kalẹ̀ lórí ìdánwò ANOVA). (f) Ìfiwéra ìtẹ̀léra amino acid ti clone peptide phage tí ó ní ọrọ̀ jùlọ #2002 (àwọ̀ elése àlùkò) pẹ̀lú àwọn clone peptide phage mìíràn tí a yàn láti ìpele kẹrin ti yíyàn. Àwọn ègé amino acid tí ó jọra àti èyí tí ó jọra ni a fi àwọ̀ ṣe àmì sí.
Nínú gbogbo àwọn phages tí a ti gbówó lórí ní ìpele kẹrin (Àwòrán 3b), a yan àwọn clones mẹ́fà fún ìwádìí lẹ́nìkọ̀ọ̀kan síwájú sí i nínú àpẹẹrẹ àyẹ̀wò CSF. A fi ìwọ̀n phage mẹ́fà tí a yàn, phage òfo (kò sí ìfikún) àti prophage peptide ikawe sínú àwọn ẹranko CM mẹ́ta tí a ti fi cannulated ṣe àtẹ̀gùn, a sì pinnu pharmacokinetics nínú àwọn àyẹ̀wò CSF (Àwòrán 3c) àti ẹ̀jẹ̀ (Àfikún Àwòrán 7). Gbogbo àwọn clones phage tí a dán wò fojú sí ìpín CSF ní ìpele 10-1000 tí ó ga ju ti phage ìṣàkóso òfo lọ (#1779). Fún àpẹẹrẹ, àwọn clones #2020 àti #2077 ní àwọn titers CSF tí ó ga tó ìgbà 1000 ju phage ìṣàkóso lọ. Ìrísí pharmacokinetic ti peptide kọ̀ọ̀kan tí a yàn yàtọ̀ síra, ṣùgbọ́n gbogbo wọn ní agbára gbígbé CSF gíga. A rí ìdínkù nígbà gbogbo lórí àkókò fún àwọn klóǹpù #1903 àti #2011, nígbàtí fún àwọn klóǹpù #2077, #2002 àti #2009, ìbísí láàárín ìṣẹ́jú mẹ́wàá àkọ́kọ́ lè fi hàn pé a ń gbé nǹkan lọ́wọ́ ṣùgbọ́n ó yẹ kí a fìdí rẹ̀ múlẹ̀. Àwọn klóǹpù #2020, #2002, àti #2077 dúró ṣinṣin ní ìpele gíga, nígbàtí ìfojúsùn CSF ti klóǹpù #2009 dínkù díẹ̀díẹ̀ lẹ́yìn ìbísí àkọ́kọ́. Lẹ́yìn náà, a fi ìfojúsùn ìbáramu ti klóǹpù CSF kọ̀ọ̀kan wé ìfojúsùn ẹ̀jẹ̀ rẹ̀ (Àwòrán 3d). Ìbáṣepọ̀ titr apapọ ti klóǹpù CSF kọ̀ọ̀kan pẹ̀lú titr ẹ̀jẹ̀ rẹ̀ ní gbogbo àkókò ìṣàyẹ̀wò fihàn pé mẹ́ta nínú àwọn klóǹpù mẹ́fà náà ní ìdàgbàsókè nínú ẹ̀jẹ̀ CSF. Ó yani lẹ́nu pé klóǹpù #2077 fi ìdúróṣinṣin ẹ̀jẹ̀ tí ó ga hàn (Àwòrán Àfikún 7). Láti fìdí rẹ̀ múlẹ̀ pé àwọn peptide fúnra wọn lè gbé ẹrù mìíràn yàtọ̀ sí àwọn klóǹpù phage sínú ẹ̀ka CSF, a ṣe àwọn peptide olórí mẹ́rin tí a fi biotin ṣe ní N-terminus níbi tí àwọn peptides so mọ́ phage particle. A so àwọn peptide biotinylated (nọmba 2002, 2009, 2020 àti 2077) pọ̀ mọ́ streptavidin (SA) láti gba àwọn ìrísí multimeric tí ó jọ phage geometry. Ìrísí yìí tún jẹ́ kí a lè wọn ìfarahàn SA nínú ẹ̀jẹ̀ àti omi cerebrospinal gẹ́gẹ́ bí àwọn peptides protein tí ń gbé ẹrù. Lóòótọ́, a sábà máa ń ṣe àtúnṣe data phage nígbà tí a bá fún àwọn peptides oníṣọ̀nà ní ìrísí SA-conjugated yìí (Àwòrán 3e). Àwọn peptide tí a ti yípadà kò ní ìfarahàn ní ìbẹ̀rẹ̀ àti ìparẹ́ CSF kíákíá pẹ̀lú àwọn ìpele tí a kò lè rí láàrín wákàtí 48. Láti ní òye nípa àwọn ipa ọ̀nà ìfijiṣẹ́ ti àwọn clones phage peptide wọ̀nyí sínú ààyè CSF, a ṣe àgbéyẹ̀wò ibi tí àwọn hits peptide phage kọ̀ọ̀kan ti ń lọ nípa lílo immunohistochemistry (IHC) láti ṣàwárí àwọn patikulu phage ní tààrà ní wákàtí kan lẹ́yìn abẹ́rẹ́ inú iṣan ara nínú vivo. Ní pàtàkì, a lè rí àwọn clones #2002, #2077, àti #2009 nípa àbàwọ́n líle nínú àwọn capillaries ọpọlọ, nígbàtí a kò rí phage ìṣàkóso (#1779) àti clone #2020 (Àwòrán Àfikún 8). Èyí fihàn pé àwọn peptide wọ̀nyí ń ṣe àfikún sí ipa lórí ọpọlọ nípa lílo BBB kọjá. A nílò ìwádìí kíkún láti dán àbá yìí wò, nítorí pé ipa ọ̀nà BSCFB náà lè ní ipa nínú rẹ̀. Nígbà tí a bá ń fi ìtẹ̀lé amino acid ti clone tí ó ní ọrọ̀ jùlọ (#2002) wéra pẹ̀lú àwọn peptide mìíràn tí a yàn, a ṣe àkíyèsí pé àwọn kan nínú wọn ní àwọn amino acid ìfàsẹ́yìn tí ó jọra, èyí tí ó lè fi ọ̀nà ìrìnnà kan náà hàn (Àwòrán 3f).
Nítorí ìrísí plasma àrà ọ̀tọ̀ rẹ̀ àti ìbísí pàtàkì nínú CSF lórí àkókò, a tún ṣe àwárí ìfihàn phage #2077 fún àkókò wákàtí 48 tó gùn jù, ó sì lè ṣe àtúnṣe ìbísí kíákíá nínú CSF tí a rí ní ìbáṣepọ̀ pẹ̀lú àwọn ipele SA tí ó dúró (Àwòrán 4a). Ní ​​ti àwọn ìrísí phage mìíràn tí a ti dá mọ̀, #2077 ní àwọ̀ gidigidi fún àwọn ìpele ọpọlọ, ó sì fi ìsopọ̀ pàtàkì hàn pẹ̀lú lectin àmì capillary nígbà tí a bá wò ó ní ìpinnu gíga àti bóyá àwọ̀ díẹ̀ nínú ààyè parenchymal (Àwòrán 4b). Láti ṣe ìwádìí bóyá a lè rí àwọn ipa oògùn tí peptide ń ṣe nínú CNS, a ṣe ìdánwò kan níbi tí a ti da àwọn ẹ̀yà biotinylated ti i) peptide transit #2077 àti ii) peptide inhibitor BACE1 pọ̀ mọ́ SA ní àwọn ìpín méjì ọ̀tọ̀ọ̀tọ̀. Fún àpapọ̀ kan, a lo inhibitor peptide BACE1 nìkan, fún èkejì a lo ìpín 1:3 ti inhibitor peptide BACE1 sí peptide #2077. A fún àwọn àyẹ̀wò méjèèjì ní ìṣàn ẹ̀jẹ̀ àti ìpele omi cerebrospinal ti beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) ní àkókò kan. A wọn Abeta40 ní CSF nítorí pé ó ń ṣàfihàn ìdíwọ́ BACE1 nínú ọpọlọ parenchyma. Gẹ́gẹ́ bí a ṣe retí, àwọn àpapọ̀ méjèèjì dín ìpele ẹ̀jẹ̀ Abeta40 kù ní pàtàkì (Àwòrán 4c, d). Síbẹ̀síbẹ̀, àwọn àyẹ̀wò tí ó ní àdàpọ̀ peptide no. 2077 àti inhibitor ti BACE1 peptide tí a so pọ̀ mọ́ SA nìkan ló fa ìdínkù pàtàkì nínú Abeta40 nínú omi cerebrospinal (Àwòrán 4c). Àwọn ìwádìí náà fihàn pé peptide no. 2077 lè gbé amuaradagba 60 kDa SA sínú CNS, ó sì tún ń fa àwọn ipa oníṣègùn pẹ̀lú àwọn inhibitors SA-conjugated ti peptide BACE1.
(a) Abẹ́rẹ́ clonal (2 × 10 phages/ẹranko) ti phage T7 tí ó ń fi àwọn ìrísí pharmacokinetic ìgbà pípẹ́ ti peptide CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) àti phage ìṣàkóso tí kò ní abẹ́rẹ́ (#1779) hàn nínú ó kéré tán àwọn eku mẹ́ta tí a fi CM ṣe. (b) Àwòrán oníhòkrókrók ti àwọn microvessels cortical tí ó dúró fún ara wọn nínú àwọn eku tí a fi phage ṣe abẹ́rẹ́ (2 × 10 10 phages/ẹranko) tí ó ń fi àwọ̀ peptide #2077 àti àwọn ohun èlò ìṣàn ara hàn (lectin). A fún àwọn eku mẹ́ta ní àwọn clones phage wọ̀nyí, a sì jẹ́ kí wọ́n máa yípo fún wákàtí kan kí wọ́n tó ṣe abẹ́rẹ́ náà. A pín àwọn èròjà antibodies tí a fi polyclonal FITC ṣe abẹ́rẹ́ sí orí capsid phage T7. Ìṣẹ́jú mẹ́wàá ṣáájú ìfọ́ àti ìfọ́mọ́ lẹ́yìn náà, a fún lectin tí a fi DyLight594 ṣe abẹ́rẹ́ nípasẹ̀ iṣan ara. Àwọn àwòrán fluorescent tí ó ń fi àwọ̀ lectin hàn (pupa) ti ẹ̀gbẹ́ ìmọ́lẹ̀ ti àwọn microvessels àti phages (àwọ̀ ewé) nínú lumen ti capillaries àti àsopọ ọpọlọ perivascular. Ìwọ̀n ìwọ̀n náà bá 10 µm mu. (c, d) A so biotinylated BACE1 inhibitory peptide nìkan tàbí ní ìdàpọ̀ pẹ̀lú biotinylated transit peptide #2077 mọ́ streptavidin lẹ́yìn náà a fi abẹ́rẹ́ inú iṣan ti o kere ju awọn eku CM mẹta ti a ti kùn (10 mg streptavidin/kg). A wọn idinku peptide inhibitor BACE1 ninu Aβ40 nipasẹ Aβ1-40 ELISA ninu ẹ̀jẹ̀ (pupa) ati omi cerebrospinal (ọsàn) ni awọn aaye akoko ti a fihan. Fun alaye ti o dara julọ, a ya ila aami kan lori aworan naa ni iwọn 100%. (c) Idinku ogorun ninu Aβ40 ninu ẹjẹ (awọn onigun mẹta pupa) ati omi cerebrospinal (awọn onigun mẹta osan) ninu awọn eku ti a fi streptavidin ti a so pọ mọ peptide transit #2077 ati peptide inhibitory BACE1 ni ipin 3: 1. (d) Idinku ogorun ninu ẹjẹ Aβ40 (awọn iyika pupa) ati omi cerebrospinal (awọn iyika osan) ti awọn eku ti a fi streptavidin ti a so pọ mọ peptide inhibitory BACE1 nikan. Ifojusi Aβ ninu iṣakoso jẹ 420 pg/ml (iyatọ boṣewa = 101 pg/ml).
A ti lo ifihan phage ni ọpọlọpọ awọn agbegbe ti iwadii biomedical17. Ọna yii ni a ti lo fun awọn iwadi oniruuru iṣan inu in vivo18,19 ati awọn iwadi ti o fojusi awọn iṣan inu ọpọlọ20,21,22,23,24,25,26. Ninu iwadi yii, a gbooro sii lilo ọna yiyan yii kii ṣe si idanimọ taara ti awọn peptides ti o fojusi awọn iṣan inu ọpọlọ nikan, ṣugbọn tun si wiwa awọn oludije pẹlu awọn ohun-ini gbigbe ti nṣiṣe lọwọ lati kọja idena ẹjẹ-ọpọlọ. Bayi a ṣe apejuwe idagbasoke ilana yiyan in vivo ninu awọn eku intubated CM ati ṣafihan agbara rẹ lati ṣe idanimọ awọn peptides pẹlu awọn ohun-ini homing CSF. Nipa lilo phage T7 ti o ṣe afihan ibi-ikawe ti awọn peptides laileto 12-mer, a ni anfani lati fihan pe phage T7 kere to (to iwọn 60 nm ni opin)10 lati ṣe deede si idena ẹjẹ-ọpọlọ, nitorinaa rekọja idena ẹjẹ-ọpọlọ tabi plexus choroid taara. A ṣe akiyesi pe gbigbe CSF lati inu awọn eku CM ti a ti fi sinu cannule jẹ ọna ayẹwo iṣẹ-ṣiṣe in vivo ti a ṣakoso daradara, ati pe phage ti a yọ jade kii ṣe pe o so mọ iṣan-ara nikan ṣugbọn o tun ṣiṣẹ bi ohun ti n gbe kọja idena ẹjẹ-ọpọlọ. Pẹlupẹlu, nipa gbigba ẹjẹ ati lilo HTS si CSF ​​ati awọn phages ti a fa lati inu ẹjẹ, a jẹrisi pe yiyan CSF wa ko ni ipa nipasẹ imudara ẹjẹ tabi amọdaju fun imugboroosi laarin awọn iyipo yiyan. Sibẹsibẹ, apakan ẹjẹ jẹ apakan ilana yiyan, nitori awọn phages ti o le de apakan CSF gbọdọ ye ki o si kaakiri ninu ẹjẹ fun igba pipẹ to lati jẹ ki ara wọn ni ọlọrọ ninu ọpọlọ. Lati le fa alaye lẹsẹsẹ ti o gbẹkẹle jade lati inu data HTS aise, a ṣe awọn àlẹmọ ti a ṣe deede si awọn aṣiṣe itẹlera kan pato ninu iṣẹ itupalẹ. Nipa fifi awọn paramita kinetic sinu ọna ayẹwo, a jẹrisi awọn pharmacokinetics iyara ti awọn phages T7 iru-ara (t½ ~ 28 min) ninu ẹjẹ24, 27, 28 ati tun pinnu idaji-aye wọn ninu omi cerebrospinal (t½ ~ 26 min) fun iṣẹju kan). Láìka àwọn ìrísí pharmacokinetic tó jọra nínú ẹ̀jẹ̀ àti CSF sí, 0.001% péré ni a lè rí nínú CSF, èyí tó fi hàn pé ìṣíkiri ìbílẹ̀ díẹ̀ ni phage T7 irú egan kọjá ìdènà ẹ̀jẹ̀-ọpọlọ. Iṣẹ́ yìí tẹnu mọ́ pàtàkì ìyípo àkọ́kọ́ ti yíyàn nígbà tí a bá ń lo àwọn ọgbọ́n panning in vivo, pàápàá jùlọ fún àwọn ètò phage tí a yọ kúrò nínú ìṣàn ẹ̀jẹ̀ ní kíákíá, nítorí pé àwọn clones díẹ̀ ló lè dé ibi tí CNS wà. Nítorí náà, ní ìyípo àkọ́kọ́, ìdínkù nínú onírúurú ìkàwé pọ̀ gan-an, nítorí pé iye clones díẹ̀ ni a kó jọ ní àsẹ̀yìnwá nínú àpẹẹrẹ CSF tó le gan-an yìí. Ọgbọ́n panning in vivo yìí ní ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìgbésẹ̀ yíyàn bíi ìkójọpọ̀ nínú ibi tí CSF wà, ìwàláàyè clone nínú ibi tí ẹ̀jẹ̀ wà, àti yíyọ àwọn clones phage T7 kúrò nínú ẹ̀jẹ̀ láàárín ìṣẹ́jú 10 àkọ́kọ́ (Àwòrán 1d àti Àfikún Àwòrán 4M). ). Nítorí náà, lẹ́yìn ìyípo àkọ́kọ́, a ṣàwárí àwọn clones phage tó yàtọ̀ síra nínú CSF, bó tilẹ̀ jẹ́ pé a lo adágún ìbẹ̀rẹ̀ kan náà fún àwọn ẹranko kọ̀ọ̀kan. Èyí fihàn pé ọ̀pọ̀lọpọ̀ ìgbésẹ̀ yíyàn tí ó muna fún àwọn ilé ìkàwé orísun pẹ̀lú ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ọmọ ẹgbẹ́ ilé ìkàwé yóò dínkù gidigidi nínú onírúurú. Nítorí náà, àwọn ìṣẹ̀lẹ̀ àìròtẹ́lẹ̀ yóò di apá pàtàkì nínú ìlànà yíyàn àkọ́kọ́, tí yóò nípa lórí àbájáde náà gidigidi. Ó ṣeé ṣe kí ọ̀pọ̀lọpọ̀ àwọn ìṣẹ̀dá nínú ilé ìkàwé àtilẹ̀wá ní ìtẹ̀sí ìdàgbàsókè CSF tí ó jọra gan-an. Síbẹ̀síbẹ̀, kódà lábẹ́ àwọn ipò ìdánwò kan náà, àwọn àbájáde yíyàn lè yàtọ̀ nítorí iye díẹ̀ ti ìṣẹ̀dá pàtó kọ̀ọ̀kan nínú adágún àkọ́kọ́.
Àwọn àpẹẹrẹ tí a fi CSF kún yàtọ̀ sí èyí tí ó wà nínú ẹ̀jẹ̀. Ó yani lẹ́nu pé, a kíyèsí ìyípadà àkọ́kọ́ sí àwọn peptides ọlọ́rọ̀ glycine nínú ẹ̀jẹ̀ àwọn ẹranko kọ̀ọ̀kan. (Àwòrán 1g, Àfikún Àwòrán 4e, 4f). Phage tí ó ní peptides glycine lè dúró ṣinṣin díẹ̀ sí i, wọn kò sì ṣeé ṣe kí wọ́n yọ wọ́n kúrò nínú ìṣàn ẹ̀jẹ̀. Síbẹ̀síbẹ̀, a kò rí àwọn peptides ọlọ́rọ̀ glycine wọ̀nyí nínú àwọn àpẹẹrẹ omi cerebrospinal, èyí tí ó fihàn pé àwọn ibi ìkàwé tí a ti tọ́jú ti gba àwọn ìgbésẹ̀ àṣàyàn méjì: ọ̀kan nínú ẹ̀jẹ̀ àti òmíràn tí a gbà láàyè láti kó jọ sínú omi cerebrospinal. Àwọn clones tí a fi CSF kún tí ó jáde láti ìpele kẹrin ti yíyàn ni a ti dán wò gidigidi. Ó fẹ́rẹ̀ẹ́ jẹ́ pé gbogbo àwọn clones tí a dán wò lẹ́nìkọ̀ọ̀kan ni a ti fìdí rẹ̀ múlẹ̀ pé wọ́n ní CSF ní ìfiwéra pẹ̀lú phage ìṣàkóso òfo. A ṣe àyẹ̀wò peptide kan (#2077) ní kúlẹ̀kúlẹ̀ sí i. Ó fi ìdajì ìwàláàyè plasma tí ó gùn ju àwọn hits mìíràn lọ (Àwòrán 3d àti Àfikún Àwòrán 7), àti ní ọ̀nà tí ó yani lẹ́nu, peptide yìí ní cysteine ​​​​àṣẹ́kù ní C-terminus. Láìpẹ́ yìí ni a ti fihàn pé fífi cysteine ​​​​sí àwọn peptides le mu àwọn ohun-ìní pharmacokinetic wọn sunwọ̀n síi nípa dídi mọ́ albumin 29. Èyí kò ṣe àwámọ̀ lọ́wọ́lọ́wọ́ fún peptide #2077 ó sì nílò ìwádìí síwájú síi. Àwọn peptide kan fi ìgbẹ́kẹ̀lé valence hàn nínú ìdàgbàsókè CSF (ìdátà kò hàn), èyí tí ó lè ní í ṣe pẹ̀lú àwòrán ojú tí a fihàn ti T7 capsid. Ètò T7 tí a lò fi àwọn ẹ̀dà 5-15 ti peptide kọ̀ọ̀kan fún phage patiku kan hàn. A ṣe IHC lórí àwọn clones lead phage tí a fi sínú iṣan ara sínú cerebral cortex ti àwọn eku (Àfikún Àwòrán 8). Àwọn ìwádìí náà fihàn pé ó kéré tán àwọn clones mẹ́ta (Nọ́mbà 2002, Nọ́mbà 2009 àti Nọ́mbà 2077) ṣe àjọṣepọ̀ pẹ̀lú BBB. Ó ṣì kù láti pinnu bóyá ìbáṣepọ̀ BBB yìí yọrí sí ìkójọpọ̀ CSF tàbí ìṣípò àwọn clones wọ̀nyí tààrà sí BCSFB. Ní pàtàkì, a fihàn pé àwọn peptide tí a yàn ń pa agbára ìrìnnà CSF wọn mọ́ nígbà tí a bá ṣe é tí a sì so mọ́ ẹrù amuaradagba. Dídìpọ̀ àwọn peptides biotinylated N-terminal sí SA ní pàtàkì ń tún àwọn àbájáde tí a rí pẹ̀lú àwọn klóǹù phage wọn nínú ẹ̀jẹ̀ àti omi cerebrospinal (Àwòrán 3e). Níkẹyìn, a fihàn pé lead peptide #2077 lè gbé iṣẹ́ ọpọlọ ti biotinylated peptide inhibitor ti BACE1 tí a so pọ̀ mọ́ SA lárugẹ, èyí tí ó ń fa àwọn ipa pharmacodynamic tí ó hàn gbangba nínú CNS nípa dín ìwọ̀n Abeta40 kù ní CSF (Àwòrán 4). A kò lè dá àwọn homologues kankan mọ̀ nínú ibi ìpamọ́ nípa ṣíṣe àwárí homology ìpele peptide ti gbogbo àwọn hits. Ó ṣe pàtàkì láti kíyèsí pé ìwọ̀n ìkàwé T7 jẹ́ nǹkan bí 109, nígbà tí ìwọ̀n ìkàwé ìmọ̀-ẹ̀rọ fún 12-mers jẹ́ 4 x 1015. Nítorí náà, a yan ìpín kékeré kan ṣoṣo nínú ààyè onírúurú ti ìkàwé peptide 12-mer, èyí tí ó lè túmọ̀ sí wípé a lè dá àwọn peptide tí a ti mú dara síi mọ̀ nípa ṣíṣe àyẹ̀wò ààyè ìpele tí ó wà ní ẹ̀gbẹ́ àwọn hits tí a ti dámọ̀ wọ̀nyí. Ní àbájáde, ọ̀kan lára ​​àwọn ìdí tí a kò fi rí ìbáramu àdánidá kankan ti àwọn peptide wọ̀nyí lè jẹ́ àìyanjú nígbà ìdàgbàsókè láti dènà wíwọlé àwọn peptide kan sínú ọpọlọ tí a kò ṣàkóso.
Ní àpapọ̀, àwọn àbájáde wa pèsè ìpìlẹ̀ fún iṣẹ́ ọjọ́ iwájú láti dá àwọn ètò ìrìnnà ti ìdènà iṣan ara mọ̀ àti láti ṣe àpèjúwe àwọn ètò ìrìnnà ti ìdènà iṣan ara ní vivo ní kíkún. Ètò ìpìlẹ̀ ọ̀nà yìí dá lórí ètò yíyan iṣẹ́ tí kìí ṣe pé ó ń dá àwọn clones pẹ̀lú àwọn ohun ìní ìsopọ̀ iṣan ara ọpọlọ mọ̀ nìkan, ṣùgbọ́n ó tún ní ìgbésẹ̀ pàtàkì kan nínú èyí tí àwọn clones àṣeyọrí ní ìṣiṣẹ́ inú láti kọjá àwọn ìdènà ẹ̀dá ní vivo sínú apá CNS. ni láti ṣàlàyé ìlànà ìrìnnà àwọn peptide wọ̀nyí àti ìfẹ́ wọn fún dídì mọ́ microvasculature pàtó sí agbègbè ọpọlọ. Èyí lè yọrí sí wíwá àwọn ipa ọ̀nà tuntun fún ìrìnnà ti BBB àti àwọn olugba. A retí pé àwọn peptide tí a ti dámọ̀ lè so mọ́ àwọn olugba cerebrovascular tàbí sí àwọn ligands tí ń rìn kiri tí a gbé nípasẹ̀ BBB tàbí BCSFB. Àwọn vector peptide pẹ̀lú ìṣiṣẹ́ ìrìnnà CSF tí a ṣàwárí nínú iṣẹ́ yìí ni a óò túbọ̀ ṣe ìwádìí síwájú sí i. Lọ́wọ́lọ́wọ́ a ń ṣe ìwádìí lórí bí ọpọlọ àwọn peptide wọ̀nyí ṣe ṣe pàtàkì tó fún agbára wọn láti kọjá BBB àti/tàbí BCSFB. Àwọn peptide tuntun wọ̀nyí yóò jẹ́ irinṣẹ́ tó wúlò gan-an fún wíwá àwọn olugba tàbí ipa ọ̀nà tuntun àti fún ìdàgbàsókè àwọn ìpele tuntun tó gbéṣẹ́ gan-an fún ìfiránṣẹ́ àwọn macromolecules, bí biologics, sí ọpọlọ.
Fi omi ìdènà ńlá (CM) bo inú cesterna (CM) nípa lílo àtúnṣe ọ̀nà tí a ti ṣàlàyé tẹ́lẹ̀. A gbé eku Wistar tí a fi oògùn pa (200-350 g) sórí ohun èlò stereotaxic kan, a sì ṣe gígé àárín orí tí a gé tí a sì ti pèsè láti fi agbárí hàn. Lu ihò méjì sí agbègbè àpò òkè náà, kí o sì so àwọn skru tí ó so mọ́ inú ihò náà. A tún gbẹ́ ihò mìíràn sí ẹ̀gbẹ́ occipital crest fún ìtọ́sọ́nà stereotactic ti cannula irin alagbara sínú CM. Fi simenti eyín sí àyíká cannula náà kí o sì fi skru dè é. Lẹ́yìn yíyọ́ fọ́tò àti líle símẹ́ǹtì, a fi suture supramid 4/0 ti ojú awọ ara. A fi ìṣàn omi cerebrospinal (CSF) tí ó ń jò jáde láìròtẹ́lẹ̀ hàn. Yọ eku kúrò nínú ohun èlò stereotaxic, gba ìtọ́jú lẹ́yìn iṣẹ́ abẹ àti ìtọ́jú ìrora tó yẹ, kí o sì jẹ́ kí ó padà bọ̀ sípò fún ó kéré tán ọ̀sẹ̀ kan títí tí a ó fi rí àmì ẹ̀jẹ̀ nínú omi cerebrospinal. Wọ́n gba àwọn eku Wistar (Crl:WI/Han) láti Charles River (France). Gbogbo àwọn eku ni a pa mọ́ lábẹ́ àwọn ipò pàtó kan tí kò ní àkóràn àrùn. Ọ́fíìsì Ẹranko ti ìlú Basel, Switzerland fọwọ́ sí gbogbo àwọn àyẹ̀wò ẹranko, wọ́n sì ṣe wọ́n ní ìbámu pẹ̀lú ìwé àṣẹ ẹranko No. 2474 (Ìṣàyẹ̀wò Ìrìn Ọpọlọ Alágbára nípa Wíwọ̀n Àwọn Ìpele Àwọn Olùtọ́jú Ìtọ́jú nínú Cerebrospinal Fluid àti Brain of Eku).
Fi ọwọ́ rọra mú kí eku náà máa ronú dáadáa pẹ̀lú ìdènà CM ní ọwọ́. Yọ Datura kúrò nínú ìdènà kí o sì kó 10 µl omi cerebrospinal tí ń ṣàn láìròtẹ́lẹ̀. Níwọ́n ìgbà tí ìdènà ...
A ṣe àgbékalẹ̀ àwọn ìkàwé nípa lílo fíkto T7Select 10-3b gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ nínú ìwé ìtọ́ni ètò T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Ní ​​ṣókí, a ṣe àgbékalẹ̀ DNA 12-mer láìròtẹ́lẹ̀ ní ọ̀nà ìkọ̀wé yìí:
A lo kodon NNK lati yago fun awọn kodon stop double ati amino acid overexpression ninu insert naa. N jẹ ipin equimolar adalu ti nucleotide kọọkan, ati K jẹ ipin equimolar adalu ti adenine ati cytosine nucleotides. Awọn agbegbe ti o ni stranded kan ni a yipada si DNA ti o ni stranded meji nipa fifi sii pẹlu dNTP (Novagen) ati enzyme Klenow (New England Biolabs) ninu Klenow buffer (New England Biolabs) fun wakati mẹta ni 37°C. Lẹhin iṣe naa, a gba DNA ti o ni stranded meji pada nipasẹ ojoriro EtOH. A fi awọn enzymu ihamọ EcoRI ati HindIII (mejeeji lati Roche) ti a ya ati ti a wẹ (QIAquick, Qiagen) insert (T4 ligase, New England Biolabs) lẹhinna a so pọ mọ inu fireemu sinu vector T7 ti a ti fọ tẹlẹ lẹhin amino acid 348 ti jiini capsid 10B. Awọn iṣe ligation ni a fi sinu ina ni 16° C. fun wakati 18 ṣaaju iṣakojọpọ in vitro. A ṣe àkójọpọ̀ Phage in vitro gẹ́gẹ́ bí ìlànà tí a pèsè pẹ̀lú ohun èlò ìṣẹ̀dá ìṣẹ̀dá T7Select 10-3b (Novagen) àti pé a mú omi ìṣẹ̀dá náà pọ̀ sí i lẹ́ẹ̀kan sí lysis nípa lílo Escherichia coli (BLT5615, Novagen). A fi centrifuge, titrated àti dì í ní -80° C. gẹ́gẹ́ bí omi ìṣẹ̀dá glycerol.
Ìmúdàgba PCR taara ti awọn agbegbe oniyipada phage ti a mu pọ si ninu omitooro tabi awo nipa lilo awọn primers fusion 454/Roche-amplicon ti ara ẹni. Primer fusion forward ni awọn sequences ti o wa ni ayika agbegbe oniyipada (NNK) 12 (apẹẹrẹ-pato), GS FLX Titanium Adapter A, ati sequence bọtini ile-ikawe mẹrin-ipilẹ (TCAG) (Afikun Aworan 1a):
Àkọ́kọ́ ìfọ́súnmọ́ra ìyípadà náà tún ní biotin tí a so mọ́ àwọn ìlẹ̀kẹ̀ ìgbámú àti GS FLX Titanium Adapter B tí a nílò fún ìfọ́súnmọ́ra clonal nígbà tí a bá ń lo emulsion PCR:
Lẹ́yìn náà, wọ́n fi agbára ìdènà 454/Roche pyrosequencing ṣe amplicon náà gẹ́gẹ́ bí ìlànà Titanium 454 GS-FLX. Fún ìtẹ̀léra Sanger ní ọwọ́ (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), a fi PCR ṣe àfikún DNA phage T7, a sì ṣe ìtẹ̀léra rẹ̀ pẹ̀lú àwọn pílámẹ́rà wọ̀nyí:
A fi PCR amplification kún àwọn ohun tí a fi sínú àwo kọ̀ọ̀kan nípa lílo Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè). Ṣe ìbẹ̀rẹ̀ gbígbóná (ìṣẹ́jú 10 ní 95 °C) àti ìgbésẹ̀ ìdàgbàsókè 35 (àádọ́ta àádọ́ta ní 95 °C, ìṣẹ́jú 1 ní 50 °C, àti ìṣẹ́jú 1 ní 72 °C).
A mú kí ìgò láti inú àwọn ilé ìkàwé, ìgò irú wild-type phage, ìgò tí a gbà kúrò nínú CSF àti ẹ̀jẹ̀, tàbí àwọn ìgò kọ̀ọ̀kan pọ̀ sí i nínú Escherichia coli BL5615 nínú omi ọbẹ̀ TB (Sigma Aldrich) tàbí nínú àwọn oúnjẹ 500 cm2 (Thermo Scientific) fún wákàtí mẹ́rin ní 37°C. A mú ìgò láti inú àwọn àwo náà nípa fífi Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) fọ àwọn àwo náà tàbí nípa gbígbà àwọn ìgò náà pẹ̀lú àwọn ìgò pipette tí a ti sterile. A ya ìgò láti inú culture supernatant tàbí extraction buffer pẹ̀lú ìyípo kan ti polyethylene glycol (PEG 8000) precipitation (Promega) a sì tún fi sínú ìgò Tris-EDTA.
A lo ìyípo méjì sí mẹ́ta ti yíyọ endotoxin kúrò nípa lílo àwọn ìlẹ̀kẹ̀ yíyọ endotoxin (Miltenyi Biotec) kí a tó fi abẹ́rẹ́ sínú iṣan ara (IV) (500 μl/ẹranko). Ní ​​ìyípo àkọ́kọ́, a ṣe àgbékalẹ̀ phage 2×1012; ní ìyípo kejì, phage 2×1010; ní ìyípo yíyan kẹta àti kẹrin, phage 2×109 fún ẹranko kọ̀ọ̀kan. A pinnu iye phage nínú CSF àti àwọn àpẹẹrẹ ẹ̀jẹ̀ tí a kó ní àkókò tí a fihàn nípa kíkà plaque gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè (Ìwé ìtọ́ni ètò T7Select). A ṣe yíyan phage nípa lílo abẹ́rẹ́ inú iṣan ara ti àwọn ilé ìkàwé tí a ti sọ di mímọ́ sínú iṣan ìrù tàbí nípa àtún-abẹ́rẹ́ phage tí a yọ láti inú CSF láti ìyípo yíyan tẹ́lẹ̀, a sì ṣe ìkórè lẹ́yìn náà ní ìṣẹ́jú 10, ìṣẹ́jú 30, ìṣẹ́jú 60, ìṣẹ́jú 90, ìṣẹ́jú 120, ìṣẹ́jú 180, àti ìṣẹ́jú 240 ní ọ̀kọ̀ọ̀kan CSF àti àwọn àpẹẹrẹ ẹ̀jẹ̀. Àròpọ̀ ìyípo mẹ́rin ti panning in vivo ni a ṣe nínú èyí tí a ti tọ́jú àwọn ẹ̀ka méjì tí a yàn lọtọ̀ọ̀tọ̀ tí a sì ṣe àyẹ̀wò wọn ní àwọn ìyípo mẹ́ta àkọ́kọ́ ti yíyàn. Gbogbo àwọn ìfikún phage tí a yọ láti CSF láti àwọn ìyípo méjì àkọ́kọ́ ti yíyàn ni a fi 454/Roche pyrosequencing ṣe, nígbàtí gbogbo àwọn clone tí a yọ láti CSF láti àwọn ìyípo méjì tó kẹ́yìn ti yíyàn ni a fi ọwọ́ ṣe ìtẹ̀léra. Gbogbo àwọn phage ẹ̀jẹ̀ láti ìyípo àkọ́kọ́ ti yíyàn ni a tún fi 454/Roche pyrosequencing ṣe. Fún abẹ́rẹ́ àwọn clone phage, a mú àwọn phage tí a yàn pọ̀ sí E. coli (BL5615) lórí àwọn àwo 500 cm2 ní 37°C fún wákàtí mẹ́rin. A gbé àwọn clone tí a yàn lẹ́nìkọ̀ọ̀kan àti tí a fi ọwọ́ ṣe ìtẹ̀léra kalẹ̀ nínú medium TB. Lẹ́yìn yíyọ phage, ìwẹ̀nùmọ́ àti yíyọ endotoxin kúrò (gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé lókè), a fi phage 2×1010/ẹranko nínú 300 μl sínú iṣan ara kan.
Ṣíṣe àtúnṣe ṣáájú àti ṣíṣàtúnṣe qualitative data ti sequence. A yípadà data 454/Roche tí a kò mọ̀ tẹ́lẹ̀ láti ìrísí máàpù onípele méjì (sff) sí ìrísí Pearson ènìyàn tí a lè kà (fasta) nípa lílo software olùtajà. A ṣe àtúnṣe síwájú sí i ti sequence nucleotide nípa lílo àwọn ètò àti ìwé C tí ó ní ẹ̀tọ́ (unreleased software package) gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ ní ìsàlẹ̀. Ìwádìí data àkọ́kọ́ ní àwọn ìlànà ìṣàtúnṣe onípele púpọ̀. Láti yọ àwọn ìwé tí kò ní sequence DNA tí ó wúlò kúrò, a ṣe àtúnṣe àwọn ìwé náà ní ìtẹ̀léra sí label ìbẹ̀rẹ̀ (GTGATGTCGGGGATCCGGAATTCT), label stop (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) àti background insert (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) nípa lílo àgbáyé Needleman-Wunsch test. communication tí ó fún ni ààyè tó 2 àìbáramu fún sequence31. Nítorí náà, a yọ àwọn ìwé tí kò ní start àti stop tag àti àwọn ìwé tí ó ní background inserts, ìyẹn ni pé, àwọn sequences tí ó ju iye àìbáramu tí a gbà láàyè lọ kúrò nínú ìkàwé. Ní ti àwọn ìwé tí ó kù, ìtẹ̀lé DNA N-mer tí ó gùn láti àmì ìbẹ̀rẹ̀ àti ìparí kí a tó yọ àmì ìdádúró kúrò nínú ìtẹ̀lé kíkà àtilẹ̀wá, a sì tún ṣe àtúnṣe sí i (tí a ń pè ní “insert”). Lẹ́yìn tí a bá ti túmọ̀ ìtẹ̀lé náà, a ó yọ ìpín lẹ́yìn ìdúró codon àkọ́kọ́ ní ìpẹ̀kun 5′ ti primer kúrò nínú ìtẹ̀lé náà. Ní àfikún, a tún yọ nucleotides tí ó yọrí sí àwọn codon tí kò pé ní ìpẹ̀kun 3′ ti primer kúrò. Láti yọ àwọn ìtẹ̀lé tí ó ní àwọn ìtẹ̀lé ẹ̀yìn nìkan kúrò, a tún yọ àwọn ìtẹ̀lé tí a túmọ̀ tí ó bẹ̀rẹ̀ pẹ̀lú àpẹẹrẹ amino acid “PAG” kúrò. A yọ àwọn peptide tí ó ní gígùn lẹ́yìn ìtumọ̀ tí kò tó amino acid 3 kúrò nínú ìkàwé. Níkẹyìn, yọ àtúnṣe kúrò nínú adágún ìtẹ̀léwá kí o sì pinnu ìtẹ̀léwá ti ìtẹ̀léwá kọ̀ọ̀kan. Àwọn àbájáde ìwádìí yìí ní àkójọ àwọn ìtẹ̀lé nucleotide (ìtẹ̀léwá) àti àwọn ìtẹ̀léwá (ìkà) wọn (Àfikún Àwòrán 1c àti 2).
Àwọn ìfikún DNA N-mer ní ìbámu pẹ̀lú ìbáradọ́gba ìtẹ̀léra: Láti mú àwọn àṣìṣe ìtẹ̀léra pàtó 454/Roche kúrò (bíi àwọn ìṣòro pẹ̀lú ìfàsẹ́yìn homopolymer ìtẹ̀léra) àti láti mú àwọn ìyípadà tí kò ṣe pàtàkì kúrò, àwọn ìfikún DNA N-mer tí a ti yọ́ tẹ́lẹ̀ (àwọn ìfikún) ni a ṣe àtòjọ nípa ìbáradọ́gba. Àwọn ìfikún (tóbi ìpìlẹ̀ méjì tí kò báramu tí a gbà láàyè) nípa lílo algoridimu ìyípadà tí a ṣàlàyé gẹ́gẹ́ bí àtẹ̀léra: a ṣe àtòjọ àwọn ìfikún ní àkọ́kọ́ nípa ìgbasẹ́yìn wọn (tó ga jùlọ sí èyí tí ó kéré jùlọ), àti bí wọ́n bá jẹ́ bákan náà, nípa ìtẹ̀léra kejì wọn nípa gígùn (tó gùn jùlọ sí èyí tí ó kúrú jùlọ)). Nítorí náà, àwọn ìfikún tí ó wọ́pọ̀ jùlọ àti tí ó gùn jùlọ túmọ̀ “ẹgbẹ́” àkọ́kọ́. A ṣètò ìgbasẹ́yìn ẹgbẹ́ sí ìgbasẹ́yìn bọtini. Lẹ́yìn náà, a gbìyànjú láti fi ìfikún kọ̀ọ̀kan tí ó kù nínú àkójọ tí a ṣètò kún ẹgbẹ́ náà nípa ṣíṣe àtòjọ Needleman-Wunsch pairwise. Tí iye àìbáramu, ìfikún, tàbí ìparẹ́ nínú ìbáradọ́gba kò bá ju ààlà 2 lọ, a fi ìfikún kún ẹgbẹ́ náà, a sì mú ìgbasẹ́pọ̀ ẹgbẹ́ náà pọ̀ sí i nípa bí a ṣe fi ìfikún náà kún un nígbàkúgbà. Àwọn ìfikún tí a fi kún ẹgbẹ́ kan ni a samisi gẹ́gẹ́ bí a ti lò wọ́n, a sì yọ wọ́n kúrò nínú ìṣiṣẹ́ síwájú sí i. Tí a kò bá le fi ìtẹ̀lé insert kún ẹgbẹ́ kan tí ó ti wà tẹ́lẹ̀, ìtẹ̀lé insert ni a ń lò láti ṣẹ̀dá ẹgbẹ́ tuntun pẹ̀lú ìtẹ̀lé insert tí ó yẹ tí a sì ń sàmì sí gẹ́gẹ́ bí a ti lò ó. Ìtẹ̀lé insert kọ̀ọ̀kan yóò parí nígbà tí a bá ti lo ìtẹ̀lé insert kọ̀ọ̀kan láti ṣẹ̀dá ẹgbẹ́ tuntun kan tàbí tí a lè fi kún ẹgbẹ́ kan tí ó ti wà tẹ́lẹ̀. Ó ṣe tán, àwọn ìtẹ̀lé insert tí a kó jọ tí ó ní nucleotides ni a óò túmọ̀ sí ìtẹ̀lé peptide (àwọn ìkàwé peptide). Àbájáde ìwádìí yìí ni ìtẹ̀lé insert àti àwọn ìtẹ̀lé insert tí ó báramu wọn tí ó para pọ̀ di iye àwọn ìkàwé tí ó tẹ̀lé ara wọn (Àfikún Àwòrán 2).
Ìṣẹ̀dá Motif: Ní ìbámu pẹ̀lú àkójọ àwọn peptides aláìlẹ́gbẹ́, a ṣẹ̀dá ìkàwé kan tí ó ní gbogbo àwọn àpẹẹrẹ amino acid (aa) tí ó ṣeé ṣe gẹ́gẹ́ bí a ṣe fihàn ní ìsàlẹ̀. A yọ gbogbo àpẹẹrẹ gígùn 3 tí ó ṣeé ṣe kúrò nínú peptide náà, a sì fi àpẹẹrẹ ìyípadà rẹ̀ kún un pẹ̀lú ìkàwé motif kan tí ó ní gbogbo àwọn àpẹẹrẹ (tripeptides). A ṣe ìtòlẹ́sẹẹsẹ àwọn ìkàwé ti àwọn àpẹẹrẹ tí ó ń tún ara wọn ṣe gidigidi, a sì yọ àtúnṣe kúrò. Lẹ́yìn náà, fún tripeptide kọ̀ọ̀kan nínú ìkàwé motif, a ṣàyẹ̀wò wíwà rẹ̀ nínú ìkàwé nípa lílo àwọn irinṣẹ́ ìṣirò. Nínú ọ̀ràn yìí, a fi ìpele peptide tí ó ní tripeptide motif tí a rí kún un, a sì fi sí motif nínú ìkàwé motif náà (“iye àwọn àpẹẹrẹ”). Àbájáde ìṣẹ̀dá motif jẹ́ ìpele onípele méjì tí ó ní gbogbo ìṣẹ̀lẹ̀ ti tripeptides (motifs) àti àwọn ìníyelórí wọn, èyí tí í ṣe iye àwọn ìtẹ̀léra tí ó ń yọrí sí motif tí ó báramu nígbà tí a bá ṣàn àwọn ìkà náà, tí a kó jọ, tí a sì túmọ̀ wọn. Àwọn ìwọ̀n gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé ní kíkún lókè.
Ìṣàtúnṣe iye àwọn àpẹẹrẹ àti àwọn àwòrán tí ó báramu: A ṣe àtúnṣe iye àwọn àpẹẹrẹ fún àpẹẹrẹ kọ̀ọ̀kan nípa lílo
níbi tí ni jẹ́ iye àwọn ìwé tí ó ní àkòrí i. Nítorí náà, vi dúró fún ìpele ìpíndọ́gba àwọn ìwé tí a kà (tàbí peptides) tí ó ní motif i nínú àpẹẹrẹ náà. A ṣírò àwọn iye-P fún iye àwọn motif tí kò ṣe déédé nípa lílo ìdánwò Fisher gangan. Nípa àwọn correlogram ti iye àwọn èrò, a ṣírò àwọn ìbáṣepọ̀ Spearman nípa lílo iye àwọn èrò tí a ṣe déédé pẹ̀lú R.
Láti fojú inú wo àkóónú amino acids ní ipò kọ̀ọ̀kan nínú ìkàwé peptide, a ṣẹ̀dá àmì ojú-òpó wẹ́ẹ̀bù 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Àkọ́kọ́, àkóónú amino acids ní ipò kọ̀ọ̀kan ti peptide 12-mer ni a tọ́jú sínú matrix 20×12. Lẹ́yìn náà, a ṣẹ̀dá àkóónú peptide 1000 tí ó ní àkóónú amino acid kan náà ní ipò kọ̀ọ̀kan ní ọ̀nà ìtẹ̀léra kíákíá, a sì pèsè gẹ́gẹ́ bí ìtẹ̀síwájú sí àmì ojú-òpó wẹ́ẹ̀bù 3, èyí tí ó ń ṣe àfihàn àwòrán ti àkóónú amino acid tí ó ní ìbáṣepọ̀ ní ipò kọ̀ọ̀kan. fún ìkàwé peptide kan. Láti fojú inú wo àwọn ìtòjọ data onípele-pupọ, a ṣẹ̀dá àwọn maapu ooru nípa lílo ohun èlò tí a ṣe àgbékalẹ̀ nínú R (biosHeatmap, àpò R tí a kò tí ì tú sílẹ̀). A ṣírò àwọn dendrogram tí a gbé kalẹ̀ nínú àwọn maapu ooru nípa lílo ọ̀nà ìṣọ̀pọ̀ hierarchical Ward pẹ̀lú metric ijinna Euclidean. Fún ìṣàyẹ̀wò statistiki ti data ìdíwọ̀n motif, a ṣírò àwọn iye P fún ìdíwọ̀n tí kò báramu nípa lílo ìdánwò Fisher gangan. A ṣírò àwọn iye-P fún àwọn ìwádìí ìwádìí míràn ní R nípa lílo ìdánwò t-test ti Student's tàbí ANOVA.
A fi àwọn ìdènà phage clones àti phages tí a yàn láìsí àwọn ohun tí a fi sínú wọn sínú iṣan ara nípasẹ̀ iṣan ìrù (2×1010 phages/ẹranko nínú 300 μl PBS). Ní ​​ìṣẹ́jú mẹ́wàá kí a tó fi ìfúnpọ̀ àti ìdúró lẹ́yìn náà, a fi 100 μl ti lectin DyLight594 tí a fi àmì sí (Vector Laboratories Inc., DL-1177) sínú iṣan ara àwọn ẹranko kan náà. Ní ìṣẹ́jú 60 lẹ́yìn abẹ́rẹ́ phage, a fi 50 ml PBS sínú ọkàn pẹ̀lú 50 ml 4% PFA/PBS. A tún fi 4% PFA/PBS sínú àwọn àpẹẹrẹ ọpọlọ ní alẹ́ ọjọ́ kan náà, a sì fi 30% sucrose sínú wọn ní alẹ́ ọjọ́ kan ní 4°C. A fi àwọn àpẹẹrẹ náà sínú adalu OCT. A ṣe àyẹ̀wò immunohistochemical ti àwọn àyẹ̀wò dídì ní iwọ̀n otútù yàrá lórí àwọn ìṣẹ́lẹ̀ 30 µm tí a ti dí pẹ̀lú 1% BSA, a sì fi àwọn èròjà polyclonal FITC tí a fi àmì sí lórí T7 phage (Novus NB 600-376A) sínú rẹ̀ ní iwọ̀n otútù 4 °C. Gbé e sí inú oòrùn ní òru kan. Níkẹyìn, a fọ ​​àwọn apá náà ní ìgbà mẹ́ta pẹ̀lú PBS, a sì fi ohun èlò amúṣẹ́dá lésà confocal (Leica TCS SP5) ṣe àyẹ̀wò wọn.
Gbogbo awọn peptides ti o kere ju mimọ ti 98% ni a ṣe nipasẹ GenScript USA, biotinylated ati lyophilized. A so Biotin nipasẹ afikun stripe glycine spacer ni N-terminus. Ṣayẹwo gbogbo awọn peptides nipa lilo mass spectrometry.
A da Streptavidin (Sigma S0677) pọ̀ mọ́ ìlọ́po márùn-ún ti peptide biotinylated, peptide inhibitory BACE1 biotinylated, tàbí àpapọ̀ (ìpíndọ́gba 3:1) ti peptide inhibitory BACE1 biotinylated àti peptide inhibitory BACE1 nínú 5–10% DMSO/tí a fi sínú PBS. Wákàtí kan ní iwọ̀n otútù yàrá kí a tó fún abẹ́rẹ́ náà. A fún abẹ́rẹ́ Streptavidin-conjugated peptides ní ìṣàn ẹ̀jẹ̀ ní ìwọ̀n 10 mg/kg sínú ọ̀kan lára ​​àwọn iṣan ìrù àwọn eku pẹ̀lú ihò ọpọlọ.
ELISA ṣe àyẹ̀wò ìpele àwọn èròjà streptavidin-peptide. A fi 1.5 μg/ml eku anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-20011) bo àwọn àwo microtiter Nunc Maxisorp (Sigma) ní alẹ́ ní 4°C. Lẹ́yìn dídínà (dídínà buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) ní iwọ̀n otutu yàrá fún wákàtí méjì, fi 0.05% Tween-20/PBS (wash buffer) fọ àwo náà fún wákàtí 3. A fi àwọn àpẹẹrẹ CSF àti plasma kún àwọn kànga tí a fi blocking buffer pò (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Lẹ́yìn náà, a fi decubate sínú àwo náà ní alẹ́ ní 4°C pẹ̀lú detection antibody (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Lẹ́yìn ìgbésẹ̀ mẹ́ta tí a fi fọ streptavidin, a rí i nípa fífi sínú omi TMB substrate (Roche) fún ìṣẹ́jú 20. Lẹ́yìn tí a bá ti dá ìdàgbàsókè àwọ̀ dúró pẹ̀lú 1M H2SO4, wọ́n ìfàmọ́ra náà ní 450 nm.
A ṣe àyẹ̀wò iṣẹ́ ìdènà streptavidin-peptide-BACE1 gẹ́gẹ́ bí ìlànà olùpèsè (Wako, 294-64701). Ní ​​ṣókí, a fi omi pò àwọn àpẹẹrẹ CSF nínú omi ìfọ́mọ́lẹ̀ déédéé (1:23) a sì fi sínú iná ní òru ní 4°C nínú àwọn àwo 96 tí a fi BNT77 capture antibody bò. Lẹ́yìn ìgbésẹ̀ ìfọ́ márùn-ún, a fi antibody BA27 tí a so pọ̀ mọ́ HRP kún un, a sì fi sínú iná fún wákàtí méjì ní 4°C, lẹ́yìn náà a fi ìgbésẹ̀ ìfọ́ márùn-ún kún un. A ṣe àwárí Aβ(1–40) nípa fífi sínú omi TMB fún ìṣẹ́jú 30 ní iwọ̀n otútù yàrá. Lẹ́yìn tí a ti dá ìdàgbàsókè àwọ̀ dúró pẹ̀lú omi ìdúró, wọn ìfàmọ́ra ní 450 nm. A fi àwọn àpẹẹrẹ plasma sínú ìyọkúrò ipele líle kí Aβ(1–40) ELISA. A fi plasma kún 0.2% DEA (Sigma) nínú àwọn àwo 96 tí a sì fi sínú iná ní iwọ̀n otútù yàrá fún ìṣẹ́jú 30. Lẹ́yìn tí wọ́n ti fi omi àti 100% methanol fọ àwọn àwo SPE (Oasis, 186000679) lẹ́sẹẹsẹ, wọ́n fi àwọn àwo SPE kún àwọn àwo SPE wọ́n sì yọ gbogbo omi kúrò. Wọ́n fọ àwọn àwo náà (ní àkọ́kọ́ pẹ̀lú 5% methanol lẹ́yìn náà 30% methanol) wọ́n sì fi 2% NH4OH/90% methanol tú u jáde. Lẹ́yìn gbígbẹ eluate náà ní 55°C fún ìṣẹ́jú 99 ní ìṣàn N2 tí ó dúró déédéé, wọ́n dín àwọn àwo náà kù ní àwọn ohun èlò ìfọ́mọ́ra tí ó wọ́pọ̀, wọ́n sì wọn Aβ(1–40) gẹ́gẹ́ bí a ti ṣàlàyé rẹ̀ lókè yìí.
Bí a ṣe lè tọ́ka sí àpilẹ̀kọ yìí: Urich, E. àti àwọn ẹlòmíràn. Ìfijiṣẹ́ ẹrù sí ọpọlọ nípa lílo àwọn peptide transit tí a mọ̀ nínú vivo. sáyẹ́ǹsì náà. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB àti Moos T. Ìfijiṣẹ́ àwọn oògùn macromolecular sí ọpọlọ nípa lílo ìtọ́jú tí a fojú sí. Ìwé Ìròyìn ti Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., àti Martinez-Martinez, P. Ìfijiṣẹ́ àwọn oògùn peptide àti amuaradagba kọjá ìdènà ẹ̀jẹ̀-ọpọlọ. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Ìdènà ẹ̀jẹ̀-ọpọlọ: ìdènà kan nínú ìdàgbàsókè oògùn ọpọlọ. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, àti Byrd, A. Àwọn ìrètí fún ìdàgbàsókè ìfijiṣẹ́ oògùn àti ìfojúsùn sí ọpọlọ nípasẹ̀ ọ̀nà choroid plexus-CSF. Ìwádìí Oògùn 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Ìmúdàgba àwọn oògùn biopharmaceuticals pẹ̀lú àwọn ẹṣin Trojan molikula fún ìfijiṣẹ́ ọpọlọ. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor transportation tí ó ń ṣe àkóso peptide kọjá ìdènà ẹ̀jẹ̀-ọpọlọ. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. àti àwọn ẹlòmíràn. Mú kí ọpọlọ wọn wọ́pọ̀ sí i àti bí àwọn èròjà ìtọ́jú ara ṣe ń ṣiṣẹ́ nípa lílo àwọn ohun èlò ìtọ́jú monovalent. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. àti àwọn ẹlòmíràn. Gbigbe Transferrin receptor (TfR) ń pinnu gbígbà ọpọlọ àwọn ìyàtọ̀ affinity ti àwọn antibodies TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).