Diolch am ymweld â Nature.com. Rydych chi'n defnyddio fersiwn porwr gyda chefnogaeth CSS gyfyngedig. I gael y profiad gorau, rydym yn argymell eich bod chi'n defnyddio porwr wedi'i ddiweddaru (neu'n analluogi Modd Cydnawsedd yn Internet Explorer). Yn ogystal, er mwyn sicrhau cefnogaeth barhaus, rydym yn dangos y wefan heb arddulliau a JavaScript.
Yn dangos carwsél o dair sleid ar unwaith. Defnyddiwch y botymau Blaenorol a Nesaf i symud trwy dair sleid ar y tro, neu defnyddiwch y botymau llithrydd ar y diwedd i symud trwy dair sleid ar y tro.
Mae'r rhwystr gwaed-ymennydd a'r rhwystr gwaed-ymennydd yn atal asiantau biotherapiwtig rhag cyrraedd eu targedau yn y system nerfol ganolog, a thrwy hynny'n llesteirio triniaeth effeithiol o glefydau niwrolegol. Er mwyn darganfod cludwyr ymennydd newydd in vivo, cyflwynwyd llyfrgell peptidau ffag T7 a chasglwyd gwaed a hylif serebro-sbinol (CSF) yn gyfresol gan ddefnyddio model pwll mawr ymwybodol â chanwl o lygod mawr. Cyfoethogwyd clonau ffag penodol yn fawr mewn CSF ar ôl pedair rownd o ddethol. Datgelodd profion ar peptidau ymgeisydd unigol gyfoethogi mwy na 1000 gwaith mewn CSF. Cadarnhawyd bioweithgarwch y danfoniad a gyfryngir gan peptid i'r ymennydd gan ostyngiad o 40% yn lefel amyloid-β yn yr hylif serebro-sbinol gan ddefnyddio atalydd peptid BACE1 sy'n gysylltiedig â'r peptid trosglwyddo newydd a nodwyd. Mae'r canlyniadau hyn yn awgrymu y gallai'r peptidau a nodwyd gan ddulliau dethol ffag in vivo fod yn gerbydau defnyddiol ar gyfer danfon macromoleciwlau i'r ymennydd yn systemig gydag effaith therapiwtig.
Mae ymchwil i therapi wedi'i dargedu ar gyfer y system nerfol ganolog (CNS) wedi canolbwyntio'n bennaf ar nodi cyffuriau ac asiantau wedi'u optimeiddio sy'n arddangos priodweddau sy'n targedu'r CNS, gyda llai o ymdrech i ddarganfod y mecanweithiau sy'n gyrru cyflenwi cyffuriau gweithredol i'r ymennydd. Mae hyn yn dechrau newid nawr gan fod cyflenwi cyffuriau, yn enwedig moleciwlau mawr, yn rhan annatod o ddatblygu cyffuriau niwrowyddoniaeth fodern. Mae amgylchedd y system nerfol ganolog wedi'i amddiffyn yn dda gan y system rhwystr serebro-fasgwlaidd, sy'n cynnwys y rhwystr gwaed-ymennydd (BBB) ​​a'r rhwystr gwaed-ymennydd (BCBB)1, gan ei gwneud hi'n heriol cyflenwi cyffuriau i'r ymennydd1,2. Amcangyfrifir bod bron pob cyffur moleciwl mawr a mwy na 98% o gyffuriau moleciwl bach yn cael eu dileu o'r ymennydd3. Dyna pam ei bod hi'n bwysig iawn nodi systemau cludo ymennydd newydd sy'n darparu cyflenwi effeithlon a phenodol o gyffuriau therapiwtig i'r CNS 4,5. Fodd bynnag, mae'r BBB a'r BCSFB hefyd yn cyflwyno cyfle rhagorol ar gyfer cyflenwi cyffuriau wrth iddynt dreiddio a mynd i mewn i bob strwythur yn yr ymennydd trwy ei fasgwlariaeth helaeth. Felly, mae'r ymdrechion presennol i ddefnyddio dulliau anfewnwthiol o gyflwyno i'r ymennydd yn seiliedig i raddau helaeth ar fecanwaith cludo a gyfryngir gan dderbynyddion (PMT) gan ddefnyddio'r derbynnydd BBB6 endogenaidd. Er gwaethaf datblygiadau allweddol diweddar gan ddefnyddio'r llwybr derbynnydd transferrin7,8, mae angen datblygu systemau cyflwyno newydd ymhellach gyda phriodweddau gwell. I'r perwyl hwn, ein nod oedd nodi peptidau sy'n gallu cyfryngu cludo CSF, gan y gellid eu defnyddio mewn egwyddor i gyflwyno macromoleciwlau i'r CNS neu i agor llwybrau derbynnydd newydd. Yn benodol, gall derbynyddion a chludwyr penodol y system serebro-fasgwlaidd (BBB a BSCFB) wasanaethu fel targedau posibl ar gyfer cyflwyno cyffuriau biotherapiwtig yn weithredol ac yn benodol. Mae hylif serebro-sbinol (CSF) yn gynnyrch secretaidd o'r plecsws coroid (CS) ac mae mewn cysylltiad uniongyrchol â hylif rhyngrstitial yr ymennydd trwy'r gofod isarachnoid a'r gofod fentriglaidd4. Yn ddiweddar dangoswyd bod hylif serebro-sbinol isarachnoid yn tryledu'n ormodol i'r rhyngrstitiwm yn yr ymennydd9. Rydym yn gobeithio cael mynediad i'r gofod parenchymaidd gan ddefnyddio'r llwybr mewnlif isarachnoid hwn neu'n uniongyrchol drwy'r BBB. I gyflawni hyn, fe wnaethom weithredu strategaeth ddethol ffag in vivo gadarn sy'n ddelfrydol yn nodi peptidau a gludir gan y naill lwybr neu'r llall o'r ddau lwybr gwahanol hyn.
Rydym nawr yn disgrifio dull sgrinio arddangos ffag in vivo dilyniannol gyda samplu CSF ynghyd â dilyniannu trwybwn uchel (HTS) i fonitro rowndiau dethol cychwynnol gyda'r amrywiaeth llyfrgell uchaf. Perfformiwyd sgrinio ar lygod mawr ymwybodol gyda chanwla cisterna mawr (CM) wedi'i fewnblannu'n barhaol i osgoi halogiad gwaed. Yn bwysig, mae'r dull hwn yn dewis peptidau sy'n targedu'r ymennydd a peptidau â gweithgaredd cludo ar draws y rhwystr serebro-fasgwlaidd. Defnyddiwyd ffagau T7 oherwydd eu maint bach (~60 nm)10 ac awgrymwyd eu bod yn addas ar gyfer cludo fesiglau sy'n caniatáu croesi trawsgellog y rhwystr endothelaidd a/neu epithelaidd-medulla. Ar ôl pedair rownd o banio, ynyswyd poblogaethau ffag gan ddangos cyfoethogi CSF in vivo cryf a chysylltiad microlestr ymennydd. Yn bwysig, roeddem yn gallu cadarnhau ein canfyddiadau trwy ddangos bod y peptidau ymgeisydd gorau a ffefrir ac a syntheseiddiwyd yn gemegol yn gallu cludo cargo protein i'r hylif serebro-sbinol. Yn gyntaf, sefydlwyd effeithiau ffarmacodynamig y CNS trwy gyfuno peptid tramwy blaenllaw ag atalydd y peptid BACE1. Yn ogystal â dangos y gall strategaethau sgrinio swyddogaethol in vivo nodi peptidau cludo ymennydd newydd fel cludwyr cargo protein effeithiol, rydym yn disgwyl i ddulliau dethol swyddogaethol tebyg ddod yn bwysig hefyd wrth nodi llwybrau cludo ymennydd newydd.
Yn seiliedig ar unedau ffurfio plac (PFU), ar ôl y cam pecynnu ffag, cynlluniwyd a chrëwyd llyfrgell o beptidau ffag T7 llinol 12-mer ar hap gydag amrywiaeth o tua 109 (gweler Deunyddiau a Dulliau). Mae'n bwysig nodi ein bod wedi dadansoddi'r llyfrgell hon yn ofalus cyn panio in vivo. Cynhyrchodd ymhelaethiad PCR o samplau llyfrgell ffag gan ddefnyddio primerau wedi'u haddasu ampliconau a oedd yn uniongyrchol berthnasol i HTS (Ffig. Atodol 1a). Oherwydd a) gwallau dilyniannu HTS11, b) effaith ar ansawdd primerau (NNK)1-12, ac c) presenoldeb ffag math gwyllt (wt) (mewnosodiadau sgerbwd) yn y llyfrgell wrth gefn, gweithredwyd gweithdrefn hidlo dilyniant i echdynnu gwybodaeth dilyniant wedi'i gwirio yn unig (Ffig. Atodol 1b). Mae'r camau hidlo hyn yn berthnasol i bob llyfrgell ddilyniannu HTS. Ar gyfer y llyfrgell safonol, cafwyd cyfanswm o 233,868 o ddarlleniadau, ac o'r rhain pasiodd 39% y meini prawf hidlo a'u defnyddio ar gyfer dadansoddi a dewis llyfrgell ar gyfer rowndiau dilynol (Ffig. Atodol 1c–e). Roedd y darlleniadau yn bennaf yn lluosrifau o 3 phâr sylfaen o hyd gyda brig ar 36 niwcleotid (Ffig. Atodol 1c), gan gadarnhau dyluniad y llyfrgell (NNK) 1-12. Yn nodedig, roedd tua 11% o aelodau'r llyfrgell yn cynnwys mewnosodiad asgwrn cefn math gwyllt (wt) 12-dimensiwn PAGISRELVDKL, ac roedd bron i hanner y dilyniannau (49%) yn cynnwys mewnosodiadau neu ddileuadau. Cadarnhaodd HTS llyfrgell y llyfrgell yr amrywiaeth uchel o peptidau yn y llyfrgell: canfuwyd mwy nag 81% o ddilyniannau peptid unwaith yn unig a dim ond 1.5% a ddigwyddodd mewn ≥4 copi (Ffig. Atodol 2a). Roedd amleddau asidau amino (aa) ym mhob un o'r 12 safle yn y repertoire yn cydberthyn yn dda â'r amleddau disgwyliedig ar gyfer nifer y codonau a gynhyrchwyd gan y repertoire NKK dirywiedig (Ffig. Atodol 2b). Roedd amlder a welwyd o weddillion aa a amgodir gan y mewnosodiadau hyn yn cydberthyn yn dda â'r amlder a gyfrifwyd (r = 0.893) (Ffig. Atodol 2c). Mae paratoi llyfrgelloedd ffag ar gyfer chwistrelliad yn cynnwys y camau o ymhelaethu a chael gwared ar endotocsin. Dangoswyd yn flaenorol fod hyn o bosibl yn lleihau amrywiaeth llyfrgelloedd ffag12,13. Felly, fe wnaethom ddilyniannu llyfrgell ffag wedi'i hymhelaethu ar blât a oedd wedi cael gwared ar endotocsin a'i chymharu â'r llyfrgell wreiddiol i amcangyfrif amlder AA. Gwelwyd cydberthynas gref (r = 0.995) rhwng y pwll gwreiddiol a'r pwll wedi'i ymhelaethu a'i buro (Ffig. Atodol 2d), sy'n dangos nad oedd cystadleuaeth rhwng cloniau wedi'u hymhelaethu ar blatiau gan ddefnyddio ffag T7 yn achosi rhagfarn fawr. Mae'r gymhariaeth hon yn seiliedig ar amlder motiffau tripeptid ym mhob llyfrgell, gan na ellir dal amrywiaeth y llyfrgelloedd (~109) yn llawn hyd yn oed gyda HTS. Datgelodd dadansoddiad amlder aa ym mhob safle ragfarn fach sy'n ddibynnol ar safle yn y tri safle olaf o'r repertoire a gofnodwyd (Ffig. Atodol 2e). I gloi, daethom i'r casgliad bod ansawdd ac amrywiaeth y llyfrgell yn dderbyniol a dim ond newidiadau bach mewn amrywiaeth a welwyd oherwydd ymhelaethu a pharatoi llyfrgelloedd ffag rhwng sawl rownd o ddethol.
Gellir cynnal samplu hylif serebro-sbinol cyfresol trwy fewnblannu cannula yn llawfeddygol i mewn i CM llygod mawr ymwybodol i hwyluso adnabod ffag T7 a chwistrellwyd yn fewnwythiennol (iv) trwy'r BBB a/neu BCSFB (Ffig. 1a-b). Defnyddiwyd dwy fraich dethol annibynnol (breichiau A a B) yn y tair rownd gyntaf o ddetholiad in vivo (Ffig. 1c). Cynyddwyd llymder y detholiad yn raddol trwy leihau cyfanswm y ffag a gyflwynwyd yn y tair rownd gyntaf o ddetholiad. Ar gyfer y bedwaredd rownd o banio, cyfunwyd samplau o ganghennau A a B a pherfformiwyd tri detholiad annibynnol ychwanegol. I astudio priodweddau in vivo gronynnau ffag T7 yn y model hwn, chwistrellwyd ffag gwyllt (mewnosodiad meistr PAGISRELVDKL) i lygod mawr trwy'r wythïen gynffon. Dangosodd adferiad ffagau o hylif serebro-sbinol a gwaed ar wahanol bwyntiau amser fod gan ffagau icosahedral T7 cymharol fach gyfnod clirio cychwynnol cyflym o'r adran waed (Ffig. Atodol 3). Yn seiliedig ar y titrau a roddwyd a chyfaint gwaed y llygod mawr, fe wnaethom gyfrifo mai dim ond tua 1% o bwysau'r ffag o'r dos a roddwyd a ganfuwyd yn y gwaed 10 munud ar ôl y pigiad mewnwythiennol. Ar ôl y dirywiad cyflym cychwynnol hwn, mesurwyd clirio cynradd arafach gyda hanner oes o 27.7 munud. Yn bwysig, dim ond ychydig iawn o ffagau a gafwyd o'r adran CSF, sy'n dangos cefndir isel ar gyfer mudo ffag math gwyllt i'r adran CSF (Ffig. Atodol 3). Ar gyfartaledd, dim ond tua 1 x 10-3% o titrau'r ffag T7 yn y gwaed a 4 x 10-8% o'r ffagau a drwythwyd yn wreiddiol a ganfuwyd yn yr hylif serebro-sbinol dros y cyfnod samplu cyfan (0-250 munud). Yn nodedig, roedd hanner oes (25.7 munud) y ffag math gwyllt mewn hylif serebro-sbinol yn debyg i'r hyn a welwyd yn y gwaed. Mae'r data hyn yn dangos bod y rhwystr sy'n gwahanu'r adran CSF o'r gwaed yn gyfan mewn llygod mawr sydd wedi'u cannwleiddio â CM, gan ganiatáu detholiad in vivo o lyfrgelloedd ffag i nodi cloniau sy'n cael eu cludo'n rhwydd o'r gwaed i'r adran CSF.
(a) Sefydlu dull ar gyfer ail-samplu hylif serebro-sbinol (CSF) o bwll mawr. (b) Diagram yn dangos lleoliad cellog rhwystr y system nerfol ganolog (CNS) a'r strategaeth ddethol a ddefnyddir i nodi peptidau sy'n croesi'r rhwystr gwaed-ymennydd (BBB) ​​a'r rhwystr gwaed-ymennydd. (c) Siart llif sgrinio arddangos ffag in vivo. Ym mhob rownd o ddethol, chwistrellwyd ffagau (adnabodwyr anifeiliaid y tu mewn i'r saethau) yn fewnwythiennol. Cedwir dwy gangen amgen annibynnol (A, B) ar wahân tan y 4ydd rownd o ddethol. Ar gyfer rowndiau dethol 3 a 4, dilyniannwyd pob clôn ffag a dynnwyd o CSF ​​â llaw. (d) Cineteg ffag a ynyswyd o waed (cylchoedd coch) a hylif serebro-sbinol (trionglau gwyrdd) yn ystod y rownd gyntaf o ddethol mewn dau lygoden fawr wedi'u caniwleiddio ar ôl chwistrelliad mewnwythiennol o'r llyfrgell peptid T7 (2 x 1012 ffag/anifail). Mae sgwariau glas yn nodi crynodiad cychwynnol cyfartalog y ffag yn y gwaed, wedi'i gyfrifo o faint y ffag a chwistrellwyd, gan ystyried cyfanswm cyfaint y gwaed. Mae'r sgwariau du yn dangos pwynt croestoriad y llinell y a allosodwyd o grynodiadau ffagau gwaed. (e,f) Cyflwynwch amlder a dosbarthiad cymharol yr holl fotiffau tripeptid sy'n gorgyffwrdd posibl a geir yn y peptid. Dangosir nifer y motiffau a geir mewn 1000 o ddarlleniadau. Yn arwyddocaol (p < 0.001) mae motiffau wedi'u cyfoethogi wedi'u marcio â dotiau coch. (e) Plot gwasgariad cydberthynas yn cymharu amlder cymharol motiff tripeptid y llyfrgell a chwistrellwyd â ffag sy'n deillio o waed o anifeiliaid #1.1 a #1.2. (f) Plot gwasgariad cydberthynas yn cymharu amleddau cymharol motiffau tripeptid ffag anifeiliaid #1.1 a #1.2 a ynyswyd mewn gwaed a hylif serebro-sbinol. (g, h) Cynrychiolaeth ID Dilyniant o ffag wedi'i gyfoethogi mewn gwaed (g) yn erbyn llyfrgelloedd a chwistrellwyd a ffag wedi'i gyfoethogi mewn CSF (h) yn erbyn gwaed ar ôl rownd o ddetholiad in vivo yn y ddau anifail. Mae maint y cod un llythyren yn dangos pa mor aml y mae'r asid amino hwnnw'n digwydd yn y safle hwnnw. Gwyrdd = pegynol, porffor = niwtral, glas = sylfaenol, coch = asidig a du = asidau amino hydroffobig. Dyluniwyd a chynhyrchwyd Ffigur 1a, b gan Eduard Urich.
Fe wnaethon ni chwistrellu llyfrgell peptid ffag i ddwy lygoden offeryn CM (clades A a B) ac ynysu ffag o hylif serebro-sbinol a gwaed (Ffigur 1d). Roedd clirio cyflym cychwynnol y llyfrgell yn llai amlwg o'i gymharu â'r ffag math gwyllt. Roedd hanner oes cymedrig y llyfrgell a chwistrellwyd yn y ddau anifail yn 24.8 munud yn y gwaed, yn debyg i ffag math gwyllt, a 38.5 munud yn CSF. Cafodd samplau ffag gwaed a hylif serebro-sbinol o bob anifail eu rhoi dan HTS a dadansoddwyd yr holl peptidau a nodwyd am bresenoldeb motiff tripeptid byr. Dewiswyd motiffau tripeptid oherwydd eu bod yn darparu sail leiafswm ar gyfer ffurfio strwythur a rhyngweithiadau peptid-protein14,15. Gwelsom gydberthynas dda yn nosbarthiad motiffau rhwng y llyfrgell ffag a chwistrellwyd a chloniau a dynnwyd o waed y ddau anifail (Ffig. 1e). Mae'r data'n dangos mai dim ond ychydig bach o gyfoethogwyd cyfansoddiad y llyfrgell yn yr adran gwaed. Dadansoddwyd amleddau asid amino a dilyniannau consensws ymhellach ym mhob safle gan ddefnyddio addasiad o'r feddalwedd Weblogo16. Yn ddiddorol, gwelsom gyfoethogi cryf mewn gweddillion glysin yn y gwaed (Ffig. 1g). Pan gymharwyd gwaed â chloniau a ddewiswyd o CSF, gwelwyd detholiad cryf a rhywfaint o ddad-ddethol motiffau (Ffig. 1f), ac roedd rhai asidau amino yn bresennol yn ffafriol mewn safleoedd rhagnodedig yn y 12-aelod (Ffig. 1h). Yn nodedig, roedd anifeiliaid unigol yn wahanol yn sylweddol yn hylif serebro-sbinol, tra gwelwyd cyfoethogi glysin yn y gwaed yn y ddau anifail (Ffig. Atodol 4a–j). Ar ôl hidlo data dilyniant yn llym yn hylif serebro-sbinol anifeiliaid #1.1 a #1.2, cafwyd cyfanswm o 964 a 420 o peptidau 12-mer unigryw (Ffig. Atodol 1d–e). Cafodd y cloniau ffag ynysig eu mwyhau a'u rhoi dan ail rownd o ddetholiad in vivo. Cafodd ffag a dynnwyd o'r ail rownd o ddetholiad ei roi dan HTS ym mhob anifail a defnyddiwyd yr holl peptidau a nodwyd fel mewnbwn i raglen adnabod motiff i ddadansoddi digwyddiad motiffau tripeptid (Ffig. 2a, b, ef). O'i gymharu â chylch cyntaf y ffag a adferwyd o CSF, gwelsom fwy o ddetholiad a dad-ddetholiad o lawer o fotiffau yn CSF yng nghanghenau A a B (Ffig. 2). Cymhwyswyd algorithm adnabod rhwydwaith i benderfynu a oeddent yn cynrychioli gwahanol batrymau o ddilyniant cyson. Gwelwyd tebygrwydd clir rhwng y dilyniannau 12-dimensiwn a adferwyd gan CSF yng nghlad amgen A (Ffig. 2c, d) a chlad B (Ffig. 2g, h). Datgelodd y dadansoddiad cronedig ym mhob cangen wahanol broffiliau dethol ar gyfer peptidau 12-mer (Ffig. Atodol 5c,d) a chynnydd yn y gymhareb titer CSF/gwaed dros amser ar gyfer cloniau cronedig ar ôl yr ail rownd o ddetholiad o'i gymharu â'r rownd gyntaf o ddetholiad (Ffig. Atodol 5e).
Cyfoethogi motiffau a peptidau mewn hylif serebro-sbinol gan ddwy rownd olynol o ddetholiad arddangos ffag swyddogaethol in vivo.
Cafodd yr holl ffagau hylif serebro-sbinol a adferwyd o rownd gyntaf pob anifail (anifeiliaid #1.1 a #1.2) eu cronni, eu mwyhau, eu dilyniannu â HT a'u hail-chwistrellu gyda'i gilydd (2 x 1010 o ffagau/anifail) 2 lygoden fawr wedi'u canwleiddio â SM (#1.1 → #). 2.1 a 2.2, 1.2 → 2.3 a 2.4). (a,b,e,f) Plotiau gwasgariad cydberthynas yn cymharu amlder cymharol motiffau tripeptid yr holl ffagau sy'n deillio o CSF ​​yn y rowndiau dethol cyntaf a'r ail. Amlder cymharol a dosbarthiad motiffau sy'n cynrychioli'r holl dripeptidau gorgyffwrdd posibl a geir mewn peptidau yn y ddau gyfeiriadedd. Dangosir nifer y motiffau a geir mewn 1000 o ddarlleniadau. Mae motiffau a ddewiswyd neu a eithriwyd yn sylweddol (p < 0.001) yn un o'r llyfrgelloedd a gymharwyd wedi'u hamlygu â dotiau coch. (c, d, g, h) Cynrychiolaeth logo dilyniant o bob dilyniant 12 asid amino cyfoethog mewn CSF yn seiliedig ar rowndiau 2 ac 1 o ddetholiad in vivo. Mae maint y cod un llythyren yn nodi pa mor aml y mae'r asid amino hwnnw'n digwydd yn y safle hwnnw. I gynrychioli'r logo, cymharir amlder dilyniannau CSF a dynnwyd o anifeiliaid unigol rhwng dau rownd ddethol a dangosir y dilyniannau cyfoethog yn yr ail rownd: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 a (h) #1.2–#2.4. Dangosir yr asidau amino mwyaf cyfoethog mewn safle penodol yn (c, d) anifeiliaid rhif 2.1 a rhif 2.2 neu (g, h) mewn anifeiliaid rhif 2.3 a rhif 2.4 mewn lliw. Gwyrdd = pegynol, porffor = niwtral, glas = sylfaenol, coch = asidig a du = asidau amino hydroffobig.
Ar ôl y drydedd rownd o ddethol, fe wnaethom nodi 124 o ddilyniannau peptid unigryw (#3.1 a #3.2) o 332 o gloniau ffag wedi'u hailgyfansoddi o CSF ​​a ynyswyd o ddau anifail (Ffig. Atodol 6a). Y dilyniant LGSVS (18.7%) oedd â'r gyfran gymharol uchaf, ac yna'r mewnosodiadau math gwyllt PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), a SARGSWREIVSLS (2.2%). Yn y bedwaredd rownd olaf, fe wnaethom gasglu dwy gangen a ddewiswyd yn annibynnol o dri anifail ar wahân (Ffig. 1c). O'r 925 o gloniau ffag wedi'u dilyniannu a adferwyd o CSF, yn y bedwaredd rownd fe wnaethom ganfod 64 o ddilyniannau peptid unigryw (Ffig. Atodol 6b), ac ymhlith y rhain gostyngodd cyfran gymharol y ffag math gwyllt i 0.8%. Y cloniau CSF mwyaf cyffredin yn y bedwaredd rownd oedd LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) a RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Mae ystod hyd y peptidau a ddewiswyd oherwydd mewnosodiadau/dileu niwcleotid neu godonau stop cynamserol ym mhreimwyr y llyfrgell wrth ddefnyddio codonau dirywiol ar gyfer dylunio llyfrgell NNK. Mae codonau stop cynamserol yn cynhyrchu peptidau byrrach ac yn cael eu dewis oherwydd eu bod yn cynnwys y motiff aa ffafriol. Gall peptidau hirach ddeillio o fewnosodiadau/dileu ym mhreimwyr y llyfrgelloedd synthetig. Mae hyn yn gosod y codon stop a gynlluniwyd y tu allan i'r ffrâm ac yn ei ddarllen nes bod codon stop newydd yn ymddangos i lawr yr afon. Yn gyffredinol, fe wnaethom gyfrifo ffactorau cyfoethogi ar gyfer pob un o'r pedair rownd ddethol trwy gymharu'r data mewnbwn â data allbwn y sampl. Ar gyfer y rownd gyntaf o sgrinio, fe wnaethom ddefnyddio titrau ffag math gwyllt fel cyfeirnod cefndir amhenodol. Yn ddiddorol, roedd detholiad ffag negyddol yn gryf iawn yn y cylch CSF cyntaf, ond nid yn y gwaed (Ffig. 3a), a allai fod oherwydd y tebygolrwydd isel o drylediad goddefol y rhan fwyaf o aelodau'r llyfrgell peptid i'r adran CSF neu mae ffagau cymharol yn tueddu i gael eu cadw neu eu tynnu o'r llif gwaed yn fwy effeithlon na bacterioffagau. Fodd bynnag, yn yr ail rownd o banio, gwelwyd detholiad cryf o ffagau yn CSF yn y ddau glade, gan awgrymu bod y rownd flaenorol wedi'i chyfoethogi mewn ffagau yn arddangos peptidau sy'n hyrwyddo amsugno CSF ​​(Ffig. 3a). Unwaith eto, heb gyfoethogi gwaed yn sylweddol. Hefyd yn y drydedd a'r bedwaredd rownd, roedd y clonau ffag wedi'u cyfoethogi'n sylweddol mewn CSF. Wrth gymharu amlder cymharol pob dilyniant peptid unigryw rhwng y ddwy rownd olaf o ddethol, gwelsom fod y dilyniannau wedi'u cyfoethogi hyd yn oed yn fwy yn y bedwaredd rownd o ddethol (Ffig. 3b). Echdynnwyd cyfanswm o 931 o fotiffau tripeptid o bob un o'r 64 dilyniant peptid unigryw gan ddefnyddio'r ddau gyfeiriadedd peptid. Archwiliwyd y motiffau mwyaf cyfoethog yn y bedwaredd rownd yn fanylach am eu proffiliau cyfoethogi ar draws pob rownd o'i gymharu â'r llyfrgell a chwistrellwyd (torbwynt: cyfoethogi 10%) (Ffig. Atodol 6c). Dangosodd patrymau cyffredinol dethol fod y rhan fwyaf o'r motiffau a astudiwyd wedi'u cyfoethogi ym mhob rownd flaenorol o'r ddwy gangen ddethol. Fodd bynnag, roedd rhai motiffau (e.e. SGL, VSG, LGS GSV) yn bennaf o glade amgen A, tra bod eraill (e.e. FGW, RTN, WGF, NTR) wedi'u cyfoethogi mewn glade amgen B.
Dilysu cludo CSF ​​peptidau wedi'u harddangos â ffagau wedi'u cyfoethogi â CSF a peptidau arweinydd biotinyleiddiedig wedi'u cysylltu â llwythi streptavidin.
(a) Cymhareb cyfoethogi a gyfrifwyd ym mhob un o'r pedair rownd (R1-R4) yn seiliedig ar ditrau ffag (mewnbwn = I) (PFU) wedi'u chwistrellu a titrau ffag CSF wedi'u pennu (allbwn = O). Cyfrifwyd ffactorau cyfoethogi ar gyfer y tair rownd ddiwethaf (R2-R4) trwy gymharu â'r rownd flaenorol a'r rownd gyntaf (R1) gyda data pwysau. Bariau agored yw hylif serebro-sbinol, bariau cysgodol yw plasma. (***p<0.001, yn seiliedig ar brawf-t Myfyriwr). (b) Rhestr o'r peptidau ffag mwyaf niferus, wedi'u rhestru yn ôl eu cyfran gymharol â'r holl ffagau a gasglwyd yn CSF ar ôl rownd 4 o ddethol. Mae'r chwe chlon ffag mwyaf cyffredin wedi'u hamlygu mewn lliw, wedi'u rhifo a'u ffactorau cyfoethogi rhwng rowndiau 3 a 4 o ddethol (mewnosodiadau). (c,d) Dadansoddwyd y chwe chlon ffag mwyaf cyfoethog, llyfrgelloedd ffag gwag a peptid ffag rhieni o rownd 4 yn unigol mewn model samplu CSF. Casglwyd samplau CSF a gwaed ar yr adegau a nodwyd. (c) Symiau cyfartal o 6 clôn ffag ymgeisydd (2 x 1010 ffag/anifeiliaid), ffagau gwag (#1779) (2 x 1010 ffag/anifeiliaid) a llyfrgelloedd peptid ffag stoc (2 x 1012 ffag/anifeiliaid) Chwistrellwch o leiaf 3 CM a roddir i'r anifail sydd wedi'i ganiwleiddio ar wahân trwy'r wythïen gynffon. Dangosir ffarmacocineteg CSF pob clôn ffag a llyfrgell peptid ffag a chwistrellwyd dros amser. (d) yn dangos y gymhareb CSF/gwaed gyfartalog ar gyfer yr holl ffagau/mL a adferwyd dros yr amser samplu. (e) Cysylltwyd pedwar peptid arweinydd synthetig ac un rheolydd wedi'i sgramblo â biotin i streptavidin trwy eu N-derfynfa (arddangosfa tetramer) ac yna chwistrelliad (wythïen gynffon iv, 10 mg streptavidin/kg). O leiaf dair llygoden fawr wedi'u mewndiwbio (N = 3). Casglwyd samplau CSF ar yr adegau a nodwyd a mesurwyd crynodiadau streptavidin gan ELISA gwrth-streptavidin CSF (nd = heb ei ganfod). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, yn seiliedig ar brawf ANOVA). (f) Cymhariaeth o ddilyniant asid amino'r clôn peptid ffag mwyaf cyfoethog #2002 (porffor) â chlonau peptid ffag eraill a ddewiswyd o'r 4ydd rownd o ddethol. Mae darnau asid amino union yr un fath a thebyg wedi'u codio lliw.
O'r holl ffagau cyfoethog yn y bedwaredd rownd (Ffig. 3b), dewiswyd chwech clon ymgeisydd ar gyfer dadansoddiad unigol pellach yn y model samplu CSF. Chwistrellwyd symiau cyfartal o chwe llyfrgell ffag ymgeisydd, ffag gwag (dim mewnosodiad) a peptid profag i dri anifail CM wedi'u canwleiddio, a phenderfynwyd ar ffarmacocineteg mewn asesiadau CSF (Ffig. 3c) a gwaed (Ffig. Atodol 7). Targedodd pob clôn ffag a brofwyd yr adran CSF ar lefel 10-1000 gwaith yn uwch na lefel y ffag rheoli gwag (#1779). Er enghraifft, roedd gan gloniau #2020 a #2077 tua 1000 gwaith yn uwch o ran titrau CSF na'r ffag rheoli. Mae proffil ffarmacocinetig pob peptid a ddewiswyd yn wahanol, ond mae gan bob un ohonynt allu uchel i anelu at y CSF. Gwelsom ostyngiad cyson dros amser ar gyfer cloniau #1903 a #2011, tra ar gyfer cloniau #2077, #2002 a #2009 gallai cynnydd yn ystod y 10 munud cyntaf ddangos cludiant gweithredol ond mae angen ei wirio. Sefydlogodd cloniau #2020, #2002, a #2077 ar lefelau uchel, tra gostyngodd crynodiad CSF clôn #2009 yn araf ar ôl y cynnydd cychwynnol. Yna cymharom amlder cymharol pob ymgeisydd CSF â'i grynodiad gwaed (Ffig. 3d). Dangosodd y gydberthynas rhwng y titer cymedrig o bob ymgeisydd CSF a'i titer gwaed ar bob adeg samplu fod tri o'r chwe ymgeisydd wedi'u cyfoethogi'n sylweddol mewn CSF gwaed. Yn ddiddorol, dangosodd clôn #2077 sefydlogrwydd gwaed uwch (Ffigur Atodol 7). I gadarnhau bod y peptidau eu hunain yn gallu cludo cargo heblaw gronynnau ffag yn weithredol i'r adran CSF, syntheseiddiwyd pedwar peptid arweiniol wedi'u deillio â biotin ar y derfynfa N lle mae'r peptidau'n glynu wrth y gronyn ffag. Cafodd peptidau biotinylated (rhifau 2002, 2009, 2020 a 2077) eu cysylltu â streptavidin (SA) i gael ffurfiau amlmerig a oedd yn dynwared geometreg ffag i ryw raddau. Roedd y fformat hwn hefyd yn caniatáu inni fesur amlygiad i SA mewn gwaed a hylif serebro-sbinol fel peptidau protein sy'n cludo cargo. Yn bwysig, gellid atgynhyrchu data ffag yn aml pan weinyddir peptidau synthetig yn y fformat SA-gysylltiedig hwn (Ffig. 3e). Roedd gan y peptidau wedi'u sgramblo lai o amlygiad cychwynnol a chlirio CSF ​​cyflymach gyda lefelau na ellir eu canfod o fewn 48 awr. Er mwyn cael cipolwg ar lwybrau dosbarthu'r cloniau ffag peptid hyn i'r gofod CSF, dadansoddom leoliad ergydion peptid ffag unigol gan ddefnyddio imiwnohistochemeg (IHC) i ganfod gronynnau ffag yn uniongyrchol 1 awr ar ôl chwistrelliad mewnwythiennol in vivo. Yn arbennig, gellid canfod cloniau #2002, #2077, a #2009 trwy staenio cryf mewn capilarïau'r ymennydd, tra na chanfuwyd ffag rheoli (#1779) a chlôn #2020 (Ffigur Atodol 8). Mae hyn yn awgrymu bod y peptidau hyn yn cyfrannu at yr effaith ar yr ymennydd yn union trwy groesi'r BBB. Mae angen dadansoddiad manwl pellach i brofi'r ddamcaniaeth hon, gan y gallai'r llwybr BSCFB fod yn gysylltiedig hefyd. Wrth gymharu dilyniant asid amino'r clôn mwyaf cyfoethog (#2002) â peptidau eraill a ddewiswyd, nodwyd bod gan rai ohonynt estyniadau asid amino tebyg, a all ddangos mecanwaith cludo tebyg (Ffig. 3f).
Oherwydd ei broffil plasma unigryw a'i gynnydd sylweddol mewn CSF dros amser, archwiliwyd clôn arddangos ffag #2077 ymhellach dros gyfnod hirach o 48 awr ac roedd yn gallu atgynhyrchu'r cynnydd cyflym mewn CSF a welwyd mewn cysylltiad â lefelau SA cynaliadwy (Ffig. 4a). O ran clonau ffag eraill a nodwyd, lliwiodd #2077 yn gryf ar gyfer capilarïau'r ymennydd a dangosodd gydleoliad sylweddol gyda lectin marciwr capilar pan edrychwyd arno ar gydraniad uwch ac o bosibl rhywfaint o staenio yn y gofod parenchymal (Ffigur 4b). I ymchwilio i weld a ellid cael effeithiau ffarmacolegol a gyfryngir gan peptid yn y CNS, cynhaliwyd arbrawf lle cymysgwyd fersiynau biotinylated o i) y peptid trawsnewid #2077 a ii) y peptid atalydd BACE1 ag SA ar ddau gymhareb wahanol. Ar gyfer un cyfuniad defnyddiwyd yr atalydd peptid BACE1 yn unig ac ar gyfer y llall defnyddiwyd cymhareb 1:3 o atalydd peptid BACE1 i peptid #2077. Rhoddwyd y ddau sampl yn fewnwythiennol a mesurwyd lefelau peptid beta-amyloid 40 (Abeta40) yn y gwaed a'r hylif serebro-sbinol dros amser. Mesurwyd Abeta40 yn yr hylif serebro-sbinol (CSF) gan ei fod yn adlewyrchu ataliad BACE1 ym mharenchyma'r ymennydd. Fel y disgwyliwyd, gostyngodd y ddau gymhlyg lefelau Abeta40 yn y gwaed yn sylweddol (Ffig. 4c, d). Fodd bynnag, dim ond samplau yn cynnwys cymysgedd o peptid rhif 2077 ac atalydd o'r peptid BACE1 wedi'i gysylltu â SA a achosodd ostyngiad sylweddol yn Abeta40 yn yr hylif serebro-sbinol (Ffig. 4c). Mae'r data'n dangos bod peptid rhif 2077 yn gallu cludo'r protein SA 60 kDa i'r CNS ac mae hefyd yn achosi effeithiau ffarmacolegol gydag atalyddion SA-gysylltiedig o'r peptid BACE1.
(a) Chwistrelliad clonal (2 × 10 ffag/anifail) o ffag T7 yn dangos proffiliau ffarmacocinetig tymor hir peptid CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) a ffag rheoli heb ei chwistrellu (#1779) mewn o leiaf dair llygoden fawr wedi'u mewndiwbio â CM. (b) Delwedd microsgopig gonffocal o ficrolestri cortigol cynrychioliadol mewn llygod mawr wedi'u chwistrellu â ffag (2 × 10 10 ffag/anifail) yn dangos gwrth-liwio peptid #2077 a phibellau (lectin). Rhoddwyd y clonau ffag hyn i 3 llygoden fawr a chaniatawyd iddynt gylchredeg am 1 awr cyn perfusiwn. Torrwyd yr ymennydd a'u lliwio ag gwrthgyrff polyclonal wedi'u labelu â FITC yn erbyn capsid ffag T7. Deng munud cyn perfusiwn a'r gosodiad dilynol, rhoddwyd lectin wedi'i labelu â DyLight594 yn fewnwythiennol. Delweddau fflwroleuol yn dangos lliwio lectin (coch) ochr luminal microlestri a ffagau (gwyrdd) yn lumen y capilarïau a meinwe'r ymennydd perivasgwlaidd. Mae'r bar graddfa yn cyfateb i 10 µm. (c, d) Cyplyswyd peptid ataliol BACE1 biotinylated ar ei ben ei hun neu mewn cyfuniad â peptid trawsnewid biotinylated #2077 â streptavidin ac yna chwistrellwyd o leiaf dri llygoden fawr CM wedi'u cannwleiddio (10 mg o streptavidin/kg). Mesurwyd gostyngiad mewn Aβ40 a gyfryngwyd gan atalydd peptid BACE1 gan ddefnyddio ELISA Aβ1-40 yn y gwaed (coch) a hylif serebro-sbinol (oren) ar yr adegau a nodir. Er mwyn eglurder gwell, tynnir llinell ddotiog ar y graff ar raddfa o 100%. (c) Canran y gostyngiad mewn Aβ40 yn y gwaed (trionglau coch) a hylif serebro-sbinol (trionglau oren) mewn llygod mawr a gafodd eu trin â streptavidin wedi'i gyfuno â peptid trawsnewid #2077 a peptid ataliol BACE1 mewn cymhareb o 3:1. (d) Canran y gostyngiad mewn Aβ40 yn y gwaed (cylchoedd coch) a hylif serebro-sbinol (cylchoedd oren) mewn llygod mawr a gafodd eu trin â streptavidin wedi'i gyplysu â peptid ataliol BACE1 yn unig. Crynodiad yr Aβ yn y rheolydd oedd 420 pg/ml (gwyriad safonol = 101 pg/ml).
Mae arddangosfa ffag wedi'i chymhwyso'n llwyddiannus mewn sawl maes o ymchwil fiofeddygol17. Defnyddiwyd y dull hwn ar gyfer astudiaethau amrywiaeth fasgwlaidd in vivo18,19 yn ogystal ag astudiaethau sy'n targedu pibellau gwaed yr ymennydd20,21,22,23,24,25,26. Yn yr astudiaeth hon, fe estynnwyd cymhwysiad y dull dethol hwn nid yn unig i adnabod peptidau sy'n targedu pibellau gwaed yr ymennydd yn uniongyrchol, ond hefyd i ddarganfod ymgeiswyr â phriodweddau cludo gweithredol i groesi'r rhwystr gwaed-ymennydd. Rydym bellach yn disgrifio datblygiad gweithdrefn ddethol in vivo mewn llygod mawr sydd wedi'u mewndiwbio â CM ac yn dangos ei photensial i adnabod peptidau â phriodweddau cartrefu CSF. Gan ddefnyddio'r ffag T7 sy'n arddangos llyfrgell o peptidau ar hap 12-mer, roeddem yn gallu dangos bod y ffag T7 yn ddigon bach (tua 60 nm mewn diamedr)10 i gael ei addasu i'r rhwystr gwaed-ymennydd, a thrwy hynny groesi'r rhwystr gwaed-ymennydd neu'r plecsws coroid yn uniongyrchol. Gwelsom fod cynaeafu CSF o lygod mawr CM wedi'u cannwleiddio yn ddull sgrinio swyddogaethol in vivo a reolir yn dda, ac nad oedd y ffag a echdynnwyd yn unig yn rhwymo i'r fasgwlar ond hefyd yn gweithredu fel cludwr ar draws y rhwystr gwaed-ymennydd. Ar ben hynny, trwy gasglu gwaed a rhoi HTS ar CSF a ffagau sy'n deillio o waed ar yr un pryd, cadarnhawyd nad oedd ein dewis o CSF ​​wedi'i ddylanwadu gan gyfoethogi gwaed na'i addasrwydd i ehangu rhwng rowndiau dethol. Fodd bynnag, mae'r adran waed yn rhan o'r weithdrefn ddethol, gan fod yn rhaid i ffagau sy'n gallu cyrraedd yr adran CSF oroesi a chylchredeg yn y llif gwaed yn ddigon hir i gyfoethogi eu hunain yn yr ymennydd. Er mwyn echdynnu gwybodaeth ddilyniant ddibynadwy o ddata HTS crai, gweithredwyd hidlwyr wedi'u haddasu i wallau dilyniannu penodol i'r platfform yn y llif gwaith dadansoddi. Trwy ymgorffori paramedrau cinetig yn y dull sgrinio, cadarnhawyd ffarmacocineteg cyflym ffagau T7 math gwyllt (t½ ~ 28 munud) yn y gwaed24, 27, 28 a phennwyd hefyd eu hanner oes mewn hylif serebro-sbinol (t½ ~ 26 munud) y funud). Er gwaethaf proffiliau ffarmacocinetig tebyg yn y gwaed a CSF, dim ond 0.001% o grynodiad y gwaed o ffag y gellid ei ganfod yn CSF, sy'n dangos symudedd cefndir isel o ffag T7 math gwyllt ar draws y rhwystr gwaed-ymennydd. Mae'r gwaith hwn yn tynnu sylw at bwysigrwydd y rownd gyntaf o ddethol wrth ddefnyddio strategaethau panio in vivo, yn enwedig ar gyfer systemau ffag sy'n cael eu clirio'n gyflym o'r cylchrediad, gan fod ychydig o gloniau'n gallu cyrraedd adran y CNS. Felly, yn y rownd gyntaf, roedd y gostyngiad yn amrywiaeth y llyfrgell yn fawr iawn, gan mai dim ond nifer gyfyngedig o gloniau a gasglwyd yn y pen draw yn y model CSF llym iawn hwn. Roedd y strategaeth panio in vivo hon yn cynnwys sawl cam dethol megis cronni gweithredol yn adran y CSF, goroesiad clôn yn adran y gwaed, a thynnu cloniau ffag T7 o'r gwaed yn gyflym o fewn y 10 munud cyntaf (Ffig. 1d a Ffig. Atodol 4M). Felly, ar ôl y rownd gyntaf, nodwyd gwahanol gloniau ffag yn CSF, er bod yr un gronfa gychwynnol wedi'i defnyddio ar gyfer anifeiliaid unigol. Mae hyn yn awgrymu bod nifer o gamau dethol llym ar gyfer llyfrgelloedd ffynhonnell gyda nifer fawr o aelodau llyfrgell yn arwain at ostyngiad sylweddol mewn amrywiaeth. Felly, bydd digwyddiadau ar hap yn dod yn rhan annatod o'r broses ddethol gychwynnol, gan ddylanwadu'n fawr ar y canlyniad. Mae'n debygol bod gan lawer o'r cloniau yn y llyfrgell wreiddiol duedd gyfoethogi CSF debyg iawn. Fodd bynnag, hyd yn oed o dan yr un amodau arbrofol, gall canlyniadau dethol amrywio oherwydd nifer fach pob clôn penodol yn y gronfa gychwynnol.
Mae'r motiffau sydd wedi'u cyfoethogi mewn CSF yn wahanol i'r rhai yn y gwaed. Yn ddiddorol, nodwyd y symudiad cyntaf tuag at peptidau cyfoethog mewn glysin yng ngwaed anifeiliaid unigol. (Ffig. 1g, Ffigau Atodol. 4e, 4f). Gall ffag sy'n cynnwys peptidau glysin fod yn fwy sefydlog ac yn llai tebygol o gael eu tynnu allan o gylchrediad. Fodd bynnag, ni chanfuwyd y peptidau cyfoethog mewn glysin hyn yn y samplau hylif serebro-sbinol, gan awgrymu bod y llyfrgelloedd wedi'u curadu wedi mynd trwy ddau gam dethol gwahanol: un yn y gwaed ac un arall a ganiatawyd iddo gronni yn yr hylif serebro-sbinol. Mae cloniau wedi'u cyfoethogi mewn CSF sy'n deillio o'r bedwaredd rownd o ddethol wedi'u profi'n helaeth. Cadarnhawyd bod bron pob un o'r cloniau a brofwyd yn unigol wedi'u cyfoethogi mewn CSF o'i gymharu â ffag rheoli gwag. Archwiliwyd un ergyd peptid (#2077) yn fanylach. Dangosodd hanner oes plasma hirach o'i gymharu â thrawiadau eraill (Ffigur 3d a Ffigur Atodol 7), ac yn ddiddorol, roedd y peptid hwn yn cynnwys gweddillion cystein yn y C-derfynfa. Yn ddiweddar, dangoswyd y gall ychwanegu cystein at peptidau wella eu priodweddau ffarmacocinetig trwy rwymo i albwmin 29. Ar hyn o bryd, nid yw hyn yn hysbys ar gyfer peptid #2077 ac mae angen astudiaeth bellach. Dangosodd rhai peptidau ddibyniaeth ar falens wrth gyfoethogi CSF (data heb ei ddangos), a allai fod yn gysylltiedig â geometreg arwyneb a ddangosir ar y capsid T7. Dangosodd y system T7 a ddefnyddiwyd gennym 5-15 copi o bob peptid fesul gronyn ffag. Perfformiwyd IHC ar gloniau ffag blaenllaw ymgeisydd a chwistrellwyd yn fewnwythiennol i gortecs yr ymennydd mewn llygod mawr (Ffig. Atodol 8). Dangosodd y data fod o leiaf dri chlon (Rhif 2002, Rhif 2009 a Rhif 2077) wedi rhyngweithio â'r BBB. Mae'n parhau i fod i'w benderfynu a yw'r rhyngweithio BBB hwn yn arwain at gronni CSF neu symud y cloniau hyn yn uniongyrchol i'r BCSFB. Yn bwysig, rydym yn dangos bod y peptidau a ddewiswyd yn cadw eu gallu cludo CSF ​​pan gânt eu syntheseiddio a'u rhwymo i'r cargo protein. Mae rhwymo peptidau biotinylated N-derfynol i SA yn ailadrodd y canlyniadau a gafwyd gyda'u clonau ffag priodol mewn gwaed a hylif serebro-sbinol (Ffig. 3e). Yn olaf, rydym yn dangos bod peptid arweiniol #2077 yn gallu hyrwyddo gweithred ymennydd atalydd peptid biotinylated o BACE1 wedi'i gysylltu ag SA, gan achosi effeithiau ffarmacodynamig amlwg yn y CNS trwy leihau lefelau Abeta40 yn sylweddol mewn CSF (Ffig. 4). Ni allem nodi unrhyw homologau yn y gronfa ddata trwy gynnal chwiliad homologaeth dilyniant peptid o'r holl drawiadau. Mae'n bwysig nodi bod maint llyfrgell T7 tua 109, tra bod maint y llyfrgell ddamcaniaethol ar gyfer 12-mers yn 4 x 1015. Felly, dim ond cyfran fach o ofod amrywiaeth llyfrgell peptid 12-mer a ddewiswyd gennym, a all olygu y gellir nodi mwy o peptidau wedi'u optimeiddio trwy werthuso gofod dilyniant cyfagos yr drawiadau hyn a nodwyd. Yn ddamcaniaethol, un o'r rhesymau pam nad ydym wedi dod o hyd i unrhyw homologau naturiol o'r peptidau hyn yw dad-ddethol yn ystod esblygiad i atal rhai motiffau peptid rhag mynd i mewn i'r ymennydd yn afreolus.
Gyda'i gilydd, mae ein canlyniadau'n darparu sail ar gyfer gwaith yn y dyfodol i nodi a nodweddu systemau cludo'r rhwystr serebro-fasgwlaidd in vivo yn fanylach. Mae gosodiad sylfaenol y dull hwn yn seiliedig ar strategaeth ddethol swyddogaethol sydd nid yn unig yn nodi cloniau â phriodweddau rhwymo fasgwlaidd yr ymennydd, ond sydd hefyd yn cynnwys cam hollbwysig lle mae gan gloniau llwyddiannus weithgaredd cynhenid ​​i groesi rhwystrau biolegol in vivo i adran y system nerfol ganolog. Y nod yw egluro mecanwaith cludo'r peptidau hyn a'u dewis o rwymo i'r microfasgwleiddiad sy'n benodol i ranbarth yr ymennydd. Gall hyn arwain at ddarganfod llwybrau newydd ar gyfer cludo'r BBB a'r derbynyddion. Rydym yn disgwyl y gall y peptidau a nodwyd rwymo'n uniongyrchol i dderbynyddion serebro-fasgwlaidd neu i ligandau cylchredeg sy'n cael eu cludo trwy'r BBB neu'r BCSFB. Bydd y fectorau peptid â gweithgaredd cludo CSF ​​a ddarganfuwyd yn y gwaith hwn yn cael eu hymchwilio ymhellach. Ar hyn o bryd rydym yn ymchwilio i benodolrwydd ymennydd y peptidau hyn am eu gallu i groesi'r BBB a/neu'r BCSFB. Bydd y peptidau newydd hyn yn offer hynod werthfawr ar gyfer darganfod derbynyddion neu lwybrau newydd o bosibl ac ar gyfer datblygu llwyfannau newydd hynod effeithlon ar gyfer cyflwyno macromoleciwlau, fel biolegau, i'r ymennydd.
Caniwleiddiwch y cisterna fawr (CM) gan ddefnyddio addasiad o'r dull a ddisgrifiwyd yn flaenorol. Gosodwyd llygod mawr Wistar wedi'u hanestheteiddio (200-350 g) ar gyfarpar stereotacsig a gwnaed toriad canolrifol dros groen y pen wedi'i eillio a'i baratoi'n aseptig i ddatgelu'r benglog. Driliwch ddau dwll yn ardal y sash uchaf a chau'r sgriwiau gosod yn y tyllau. Driliwyd twll ychwanegol yn y grib occipital ochrol ar gyfer canllaw stereotactig cannula dur di-staen i'r CM. Rhowch sment deintyddol o amgylch y cannula a'i sicrhau â sgriwiau. Ar ôl halltu ffoto a chaledu sment, caewyd y clwyf croen gyda phwyth supramid 4/0. Cadarnheir lleoliad priodol y cannula gan ollyngiad digymell o hylif serebro-sbinol (CSF). Tynnwch y llygoden fawr o'r cyfarpar stereotacsig, derbyniwch ofal ôl-lawfeddygol a rheoli poen priodol, a gadewch iddi wella am o leiaf wythnos nes bod arwyddion o waed yn cael eu gweld yn yr hylif serebro-sbinol. Cafwyd llygod mawr Wistar (Crl:WI/Han) o Charles River (Ffrainc). Cadwyd yr holl lygod mawr o dan amodau penodol heb bathogenau. Cymeradwywyd yr holl arbrofion anifeiliaid gan Swyddfa Filfeddygol Dinas Basel, y Swistir, a chawsant eu cynnal yn unol â Thrwydded Anifeiliaid Rhif 2474 (Asesiad o Gludiant Ymennydd Gweithredol trwy Fesur Lefelau Ymgeiswyr Therapiwtig yn Hylif Serebro-sbinol ac Ymennydd Llygod Mawr).
Cadwch y llygoden fawr yn ymwybodol yn ysgafn gyda'r cannula CM yn eich llaw. Tynnwch y Datura o'r cannula a chasglwch 10 µl o hylif serebro-sbinol sy'n llifo'n ddigymell. Gan fod patency'r cannula wedi'i beryglu yn y pen draw, dim ond samplau hylif serebro-sbinol clir heb unrhyw dystiolaeth o halogiad gwaed na newid lliw a gynhwyswyd yn yr astudiaeth hon. Ar yr un pryd, cymerwyd tua 10–20 μl o waed o doriad bach ar flaen y gynffon i mewn i diwbiau gyda heparin (Sigma-Aldrich). Casglwyd CSF a gwaed ar wahanol bwyntiau amser ar ôl chwistrelliad mewnwythiennol o ffag T7. Taflwyd tua 5–10 μl o hylif cyn casglu pob sampl CSF, sy'n cyfateb i gyfaint marw'r cathetr.
Cynhyrchwyd llyfrgelloedd gan ddefnyddio'r fector T7Select 10-3b fel y disgrifir yn llawlyfr system T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Yn gryno, syntheseiddiwyd mewnosodiad DNA 12-mer ar hap yn y fformat canlynol:
Defnyddiwyd y codon NNK i osgoi codonau stop dwbl a gorfynegiant asid amino yn y mewnosodiad. Mae N yn gymhareb ecwimolar wedi'i chymysgu â llaw o bob niwcleotid, a K yw cymhareb ecwimolar wedi'i chymysgu â llaw o niwcleotidau adenin a cytosin. Trawsnewidiwyd rhanbarthau llinyn sengl yn DNA llinyn dwbl trwy ddeori pellach gyda dNTP (Novagen) ac ensym Klenow (New England Biolabs) mewn byffer Klenow (New England Biolabs) am 3 awr ar 37°C. Ar ôl yr adwaith, adferwyd DNA llinyn dwbl trwy wlybaniaeth EtOH. Treuliwyd y DNA canlyniadol gyda'r ensymau cyfyngu EcoRI a HindIII (y ddau o Roche). Yna clymwyd y mewnosodiad wedi'i hollti a'i buro (QIAquick, Qiagen) (ligas T4, New England Biolabs) yn y ffrâm i fector T7 wedi'i hollti ymlaen llaw ar ôl asid amino 348 o'r genyn capsid 10B. Deorwyd adweithiau clymu ar 16°C am 18 awr cyn pecynnu in vitro. Perfformiwyd pecynnu ffag in vitro yn ôl y cyfarwyddiadau a gyflenwyd gyda'r pecyn clonio T7Select 10-3b (Novagen) ac ymhelaethwyd y toddiant pecynnu unwaith i lysis gan ddefnyddio Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Cafodd y lysadau eu centrifugio, eu titradu a'u rhewi ar -80°C fel toddiant stoc o glyserol.
Mwyhadur PCR uniongyrchol o ranbarthau amrywiol ffag wedi'u mwyhau mewn cawl neu blât gan ddefnyddio primerau cyfuno 454/Roche-amplicon perchnogol. Mae'r primer cyfuno ymlaen yn cynnwys dilyniannau sy'n ffinio â'r rhanbarth amrywiol (NNK) 12 (penodol i'r templed), Addasydd Titaniwm GS FLX A, a dilyniant allwedd llyfrgell pedair sylfaen (TCAG) (Ffigur Atodol 1a):
Mae'r primer ymasiad gwrthdro hefyd yn cynnwys biotin sydd ynghlwm wrth gleiniau dal a'r Addasydd Titaniwm GS FLX B sy'n ofynnol ar gyfer ymhelaethu clonal yn ystod PCR emwlsiwn:
Yna dilyniannwyd yr ampliconau â pyrosodeinio 454/Roche yn ôl y protocol Titaniwm 454 GS-FLX. Ar gyfer dilyniannu Sanger â llaw (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ymhelaethwyd DNA ffag T7 gan PCR a'i ddilyniannu gyda'r parau primer canlynol:
Cafodd mewnosodiadau o blaciau unigol eu hymhelaethu gan ddefnyddio Pecyn Polymerase DNA Cychwyn Cyflym Roche (yn ôl cyfarwyddiadau'r gwneuthurwr). Perfformiwch gychwyn poeth (10 munud ar 95 °C) a 35 cylch hwb (50 eiliad ar 95 °C, 1 munud ar 50 °C, ac 1 munud ar 72 °C).
Cafodd ffag o lyfrgelloedd, ffag math gwyllt, ffag a achubwyd o CSF ​​a gwaed, neu gloniau unigol eu mwyhau mewn Escherichia coli BL5615 mewn cawl TB (Sigma Aldrich) neu mewn dysglau 500 cm2 (Thermo Scientific) am 4 awr ar 37°C. Cafodd y ffag eu tynnu o'r platiau trwy rinsio'r platiau â byffer Tris-EDTA (Fluka Analytical) neu drwy gasglu'r placiau gyda phennau piped di-haint. Ynysigwyd y ffag o uwchnofiant diwylliant neu fyffer echdynnu gydag un rownd o wlybaniaeth polyethylen glycol (PEG 8000) (Promega) ac ail-ataliwyd mewn byffer Tris-EDTA.
Cafodd y ffag wedi'i ymhelaethu ei roi mewn 2-3 rownd o dynnu endotocsin gan ddefnyddio gleiniau tynnu endotocsin (Miltenyi Biotec) cyn ei chwistrellu'n fewnwythiennol (IV) (500 μl/anifail). Yn y rownd gyntaf, cyflwynwyd 2×1012 ffag; yn yr ail, 2×1010 ffag; yn y drydedd a'r bedwaredd rownd dethol, 2×109 ffag fesul anifail. Penderfynwyd cynnwys y ffag mewn samplau CSF a gwaed a gasglwyd ar yr adegau a nodwyd trwy gyfrif plac yn unol â chyfarwyddiadau'r gwneuthurwr (llawlyfr system T7Select). Perfformiwyd dewis y ffag trwy chwistrellu llyfrgelloedd wedi'u puro yn fewnwythiennol i'r wythïen gynffon neu drwy ail-chwistrellu ffag a dynnwyd o CSF ​​o'r rownd dethol flaenorol, a pherfformiwyd cynaeafu dilynol ar ôl 10 munud, 30 munud, 60 munud, 90 munud, 120 munud, 180 munud, a 240 munud yn y drefn honno, samplau CSF a gwaed. Cynhaliwyd cyfanswm o bedair rownd o banio in vivo lle cafodd y ddwy gangen a ddewiswyd eu storio a'u dadansoddi ar wahân yn ystod y tair rownd gyntaf o ddethol. Cafodd pob mewnosodiad ffag a dynnwyd o CSF ​​o'r ddwy rownd gyntaf o ddethol ei ddilyniannu â llaw trwy broses pyro-ddilyniannu 454/Roche, tra bod pob clôn a dynnwyd o CSF ​​o'r ddwy rownd olaf o ddethol wedi'u dilyniannu â llaw. Cafodd pob ffag gwaed o'r rownd gyntaf o ddethol ei ddilyniannu â llaw trwy broses pyro-ddilyniannu 454/Roche hefyd. Ar gyfer chwistrellu clonau ffag, cafodd ffagau a ddewiswyd eu mwyhau mewn E. coli (BL5615) ar blatiau 500 cm2 ar 37°C am 4 awr. Cafodd clonau a ddewiswyd yn unigol a'u dilyniannu â llaw eu lluosogi mewn cyfrwng TB. Ar ôl echdynnu ffagau, puro a chael gwared ar endotocsin (fel y disgrifiwyd uchod), chwistrellwyd 2 × 1010 ffagau/anifail mewn 300 μl yn fewnwythiennol i un wythïen gynffon.
Rhagbrosesu a hidlo ansoddol data dilyniant. Troswyd data crai 454/Roche o fformat map ffrydio safonol deuaidd (sff) i fformat darllenadwy gan bobl Pearson (fasta) gan ddefnyddio meddalwedd gwerthwr. Perfformiwyd prosesu pellach o'r dilyniant niwcleotid gan ddefnyddio rhaglenni a sgriptiau C perchnogol (pecyn meddalwedd heb ei ryddhau) fel y disgrifir isod. Mae dadansoddiad y data cynradd yn cynnwys gweithdrefnau hidlo aml-gam llym. I hidlo darlleniadau nad oeddent yn cynnwys dilyniant DNA mewnosod 12mer dilys, cafodd y darlleniadau eu halinio'n olynol i label cychwyn (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), label stop (TAAGCTTGGGCCGCACTCGAGTA) a mewnosodiad cefndir (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) gan ddefnyddio'r prawf Needleman-Wunsch byd-eang. Mae aliniad yn caniatáu hyd at 2 anghysondeb fesul aliniad31. Felly, tynnwyd darlleniadau heb dagiau cychwyn a stopio a darlleniadau sy'n cynnwys mewnosodiadau cefndir, h.y., aliniadau sy'n fwy na'r nifer a ganiateir o anghydweddiadau, o'r llyfrgell. O ran y darlleniadau sy'n weddill, torrwyd y dilyniant DNA N-mer sy'n ymestyn o'r marc cychwyn ac yn gorffen cyn y marc stop o'r dilyniant darllen gwreiddiol a'i brosesu ymhellach (y cyfeirir ato o hyn ymlaen fel "mewnosodiad"). Ar ôl cyfieithu'r mewnosodiad, tynnwyd y rhan ar ôl y codon stop cyntaf ar ben 5′ y primer o'r mewnosodiad. Yn ogystal, tynnwyd niwcleotidau sy'n arwain at godonau anghyflawn ar ben 3′ y primer hefyd. Er mwyn eithrio mewnosodiadau sy'n cynnwys dilyniannau cefndir yn unig, tynnwyd mewnosodiadau wedi'u cyfieithu sy'n dechrau gyda'r patrwm asid amino "PAG" hefyd. Tynnwyd peptidau â hyd ôl-gyfieithu o lai na 3 asid amino o'r llyfrgell. Yn olaf, tynnwyd y diswyddiad yn y gronfa mewnosodiadau a phenderfynwyd amlder pob mewnosodiad unigryw. Roedd canlyniadau'r dadansoddiad hwn yn cynnwys rhestr o ddilyniannau niwcleotid (mewnosodiadau) a'u hamlderau (darllen) (Ffigurau Atodol 1c a 2).
Mewnosodiadau DNA N-mer grŵp yn ôl tebygrwydd dilyniant: Er mwyn dileu gwallau dilyniannu penodol i 454/Roche (megis problemau gyda dilyniannu estyniadau homopolymer) a chael gwared ar ddiangeneddau llai pwysig, mae mewnosodiadau dilyniant DNA N-mer (mewnosodiadau) a hidlwyd yn flaenorol yn cael eu didoli yn ôl tebygrwydd. mewnosodiadau (hyd at 2 fas nad ydynt yn cyfateb yn cael eu caniatáu) gan ddefnyddio algorithm iterus a ddiffinnir fel a ganlyn: mae mewnosodiadau'n cael eu didoli yn gyntaf yn ôl eu hamlder (yr uchaf i'r isaf), ac os ydynt yr un fath, yn ôl eu didoli eilaidd yn ôl hyd (yr hiraf i'r byrraf)). Felly, mae'r mewnosodiadau mwyaf cyffredin a hiraf yn diffinio'r "grŵp" cyntaf. Mae amlder y grŵp wedi'i osod i'r amlder allweddol. Yna, ceisiwyd ychwanegu pob mewnosodiad sy'n weddill yn y rhestr wedi'i didoli at y grŵp trwy aliniad Needleman-Wunsch parau. Os nad yw nifer yr anghydweddiadau, y mewnosodiadau, neu'r dileuiadau mewn aliniad yn fwy na throthwy o 2, mae mewnosodiad yn cael ei ychwanegu at y grŵp, a chynyddir amlder cyffredinol y grŵp yn ôl pa mor aml y'i hychwanegwyd. Mae mewnosodiadau a ychwanegir at grŵp yn cael eu marcio fel rhai a ddefnyddiwyd ac wedi'u heithrio rhag prosesu pellach. Os na ellir ychwanegu'r dilyniant mewnosod at grŵp sydd eisoes yn bodoli, defnyddir y dilyniant mewnosod i greu grŵp newydd gyda'r amlder mewnosod priodol a'i farcio fel wedi'i ddefnyddio. Daw'r iteriad i ben pan fydd pob dilyniant mewnosod naill ai wedi'i ddefnyddio i ffurfio grŵp newydd neu pan ellir ei gynnwys mewn grŵp sydd eisoes yn bodoli. Wedi'r cyfan, mae mewnosodiadau wedi'u grwpio sy'n cynnwys niwcleotidau yn cael eu cyfieithu yn y pen draw yn ddilyniannau peptid (llyfrgelloedd peptid). Canlyniad y dadansoddiad hwn yw set o fewnosodiadau a'u hamlderau cyfatebol sy'n ffurfio nifer y darlleniadau olynol (Ffig. Atodol 2).
Cynhyrchu Motiff: Yn seiliedig ar restr o peptidau unigryw, crëwyd llyfrgell yn cynnwys yr holl batrymau asid amino posibl (aa) fel y dangosir isod. Cafodd pob patrwm posibl o hyd 3 ei dynnu o'r peptid ac ychwanegwyd ei batrwm gwrthdro ynghyd â llyfrgell motiff gyffredin yn cynnwys yr holl batrymau (tripeptidau). Cafodd llyfrgelloedd o fotiffau ailadroddus iawn eu dilyniannu a chafodd y diswyddiadau eu tynnu. Yna, ar gyfer pob tripeptid yn y llyfrgell motiff, fe wnaethom wirio am ei bresenoldeb yn y llyfrgell gan ddefnyddio offer cyfrifiadurol. Yn yr achos hwn, caiff amlder y peptid sy'n cynnwys y tripeptid motiff a geir ei ychwanegu a'i aseinio i'r motiff yn y llyfrgell motiff ("nifer y motiffau"). Canlyniad cynhyrchu motiff yw arae dau ddimensiwn sy'n cynnwys pob digwyddiad o dripeptidau (motiffau) a'u gwerthoedd priodol, sef nifer y darlleniadau dilyniannu sy'n arwain at y motiff cyfatebol pan gaiff y darlleniadau eu hidlo, eu grwpio a'u cyfieithu. Metrigau fel y disgrifir yn fanwl uchod.
Normaleiddio nifer y motiffau a'r plotiau gwasgariad cyfatebol: Normaleiddiwyd nifer y motiffau ar gyfer pob sampl gan ddefnyddio
lle mae ni yn cynrychioli nifer y darlleniadau sy'n cynnwys pwnc i. Felly, mae vi yn cynrychioli canran amlder y darlleniadau (neu peptidau) sy'n cynnwys motiff i yn y sampl. Cyfrifwyd gwerthoedd-P ar gyfer y nifer heb ei normaleiddio o fotiffau gan ddefnyddio prawf union Fisher. O ran correlogramau o nifer y cymhellion, cyfrifwyd cydberthnasau Spearman gan ddefnyddio'r nifer wedi'i normaleiddio o gymhellion gydag R.
I ddelweddu cynnwys asidau amino ym mhob safle yn y llyfrgell peptidau, crëwyd logogramau gwe 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Yn gyntaf, caiff cynnwys asidau amino ym mhob safle o'r peptid 12-mer ei storio mewn matrics 20 × 12. Yna, cynhyrchir set o 1000 o peptidau sy'n cynnwys yr un cynnwys asid amino cymharol ym mhob safle ar ffurf dilyniant fasta a'u darparu fel mewnbwn i logo gwe 3, sy'n cynhyrchu cynrychiolaeth graffigol o'r cynnwys asid amino cymharol ym mhob safle ar gyfer llyfrgell peptid benodol. I ddelweddu setiau data amlddimensiwn, crëwyd mapiau gwres gan ddefnyddio offeryn a ddatblygwyd yn fewnol yn R (biosHeatmap, pecyn R sydd heb ei ryddhau eto). Cyfrifwyd y dendrogramau a gyflwynwyd yn y mapiau gwres gan ddefnyddio dull clystyru hierarchaidd Ward gyda'r metrig pellter Ewclidaidd. Ar gyfer dadansoddiad ystadegol o ddata sgorio motiff, cyfrifwyd gwerthoedd P ar gyfer sgorio heb ei normaleiddio gan ddefnyddio prawf union Fisher. Cyfrifwyd gwerthoedd-P ar gyfer setiau data eraill yn R gan ddefnyddio prawf-t Myfyriwr neu ANOVA.
Chwistrellwyd clonau ffag a ffagau dethol heb fewnosodiadau yn fewnwythiennol drwy'r wythïen gynffon (2 × 1010 ffag/anifail mewn 300 μl o PBS). Deng munud cyn perfusiwn a'r gosodiad dilynol, chwistrellwyd yr un anifeiliaid yn fewnwythiennol â 100 μl o lectin wedi'i labelu â DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 munud ar ôl chwistrelliad ffag, perfusiwyd llygod mawr drwy'r galon gyda 50 ml o PBS ac yna 50 ml o 4% PFA/PBS. Yn ogystal, gosodwyd samplau ymennydd dros nos mewn 4% PFA/PBS a'u socian mewn 30% swcros dros nos ar 4°C. Mae samplau'n cael eu rhewi'n gyflym yn y cymysgedd OCT. Perfformiwyd dadansoddiad imiwnohistochemegol o samplau wedi'u rhewi ar dymheredd ystafell ar gryosodiadau 30 µm wedi'u blocio ag 1% BSA a'u deori gydag gwrthgyrff polyclonal wedi'u labelu â FITC yn erbyn ffag T7 (Novus NB 600-376A) ar 4°C. Deori dros nos. Yn olaf, golchwyd yr adrannau 3 gwaith gyda PBS ac archwiliwyd hwy gyda microsgop laser confocal (Leica TCS SP5).
Cafodd yr holl peptidau gyda phurdeb lleiaf o 98% eu syntheseiddio gan GenScript USA, eu biotinyleiddio a'u lyoffilio. Mae biotin wedi'i rwymo trwy wahanydd glycin triphlyg ychwanegol ar y derfynfa N. Gwiriwch yr holl peptidau gan ddefnyddio sbectrometreg màs.
Cymysgwyd streptafidin (Sigma S0677) â gormodedd ecwimolar 5 gwaith o beptid biotinylated, peptid ataliol BACE1 biotinylated, neu gyfuniad (cymhareb 3:1) o beptid ataliol BACE1 biotinylated a peptid ataliol BACE1 mewn 5–10% DMSO/wedi'i ddeori mewn PBS. 1 awr ar dymheredd ystafell cyn ei chwistrellu. Chwistrellwyd peptidau wedi'u cysylltu â streptafidin yn fewnwythiennol ar ddos ​​o 10 mg/kg i un o wythiennau cynffon llygod mawr â cheudod yr ymennydd.
Aseswyd crynodiad y cyfadeiladau streptavidin-peptid gan ddefnyddio ELISA. Gorchuddiwyd platiau microtiter Nunc Maxisorp (Sigma) dros nos ar 4°C gyda gwrthgorff gwrth-streptavidin llygoden 1.5 μg/ml (Thermo, MA1-20011). Ar ôl blocio (byffer blocio: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) ar dymheredd ystafell am 2 awr, golchwyd y plât gyda 0.05% Tween-20/PBS (byffer golchi) am 3 eiliad, ychwanegwyd samplau CSF a plasma at byllau wedi'u gwanhau â byffer blocio (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Yna deorwyd y plât dros nos ar 4°C gyda gwrthgorff canfod (1 μg/ml, gwrth-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Ar ôl tair cam golchi, canfuwyd streptavidin trwy ei ddeori mewn toddiant swbstrad TMB (Roche) am hyd at 20 munud. Ar ôl atal datblygiad lliw gydag 1M H2SO4, mesurwch yr amsugnedd ar 450 nm.
Aseswyd swyddogaeth y cymhlyg atalydd streptavidin-peptid-BACE1 gan ddefnyddio ELISA Aβ(1-40) yn unol â phrotocol y gwneuthurwr (Wako, 294-64701). Yn gryno, cafodd samplau CSF eu gwanhau mewn gwanhawr safonol (1:23) a'u magu dros nos ar 4°C mewn platiau 96-ffynnon wedi'u gorchuddio ag gwrthgorff dal BNT77. Ar ôl pum cam golchi, ychwanegwyd gwrthgorff BA27 wedi'i gyfuno â HRP a'i magu am 2 awr ar 4°C, ac yna pum cam golchi. Canfuwyd Aβ(1–40) trwy ei magu mewn toddiant TMB am 30 munud ar dymheredd ystafell. Ar ôl i ddatblygiad lliw gael ei atal gyda thoddiant stopio, mesurwch yr amsugnedd ar 450 nm. Cafodd samplau plasma eu echdynnu cyfnod solet cyn ELISA Aβ(1–40). Ychwanegwyd plasma at 0.2% DEA (Sigma) mewn platiau 96-ffynnon a'i magu ar dymheredd ystafell am 30 munud. Ar ôl golchi platiau SPE (Oasis, 186000679) yn olynol gyda dŵr a 100% methanol, ychwanegwyd samplau plasma at y platiau SPE a thynnwyd yr holl hylif. Golchwyd y samplau (yn gyntaf gyda 5% methanol ac yna 30% methanol) a'u heluo gyda 2% NH4OH/90% methanol. Ar ôl sychu'r eluad ar 55°C am 99 munud ar gerrynt N2 cyson, gostyngwyd y samplau mewn teneuwyr safonol a mesurwyd Aβ(1–40) fel y disgrifiwyd uchod.
Sut i ddyfynnu'r erthygl hon: Urich, E. et al. Dosbarthu cargo i'r ymennydd gan ddefnyddio peptidau trawsgludo a nodwyd in vivo. y wyddoniaeth. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB a Moos T. Cyflwyno cyffuriau macromoleciwlaidd i'r ymennydd gan ddefnyddio therapi wedi'i dargedu. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., a Martinez-Martinez, P. Dosbarthu cyffuriau peptid a phrotein ar draws y rhwystr gwaed-ymennydd. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Y rhwystr gwaed-ymennydd: tagfa mewn datblygiad cyffuriau i'r ymennydd. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, a Byrd, A. Rhagolygon ar gyfer gwella cyflenwi cyffuriau a thargedu i'r ymennydd trwy'r llwybr coroid plexus-CSF. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Moderneiddio biofferyllol gyda cheffylau Troea moleciwlaidd ar gyfer cyflwyno i'r ymennydd. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, Cludiant peptid a gyfryngir gan dderbynyddion WM ar draws y rhwystr gwaed-ymennydd. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Cynyddu treiddiad yr ymennydd ac effeithiolrwydd gwrthgyrff therapiwtig gan ddefnyddio gwennol moleciwlaidd monovalent. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Mae cludo derbynyddion transferrin (TfR) yn pennu faint o amrywiadau affinedd gwrthgyrff TfR sy'n cael eu cymryd gan yr ymennydd. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).