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A barriera emato-encefalica è a barriera emato-encefalica impediscenu à l'agenti bioterapici di ghjunghje à i so obiettivi in ​​u sistema nervosu cintrali, impedendu cusì un trattamentu efficace di e malatie neurologiche. Per scopre novi trasportatori cerebrali in vivo, avemu introduttu una biblioteca di peptidi di fagi T7 è avemu raccoltu in serie sangue è fluidu cerebrospinale (CSF) utilizendu un mudellu di grande piscina cusciente cannulatu di ratti. Cloni specifici di fagi sò stati altamente arricchiti in CSF dopu à quattru cicli di selezzione. I testi di peptidi candidati individuali anu rivelatu un arricchimentu di più di 1000 volte in CSF. A bioattività di a consegna mediata da peptidi à u cervellu hè stata cunfirmata da una riduzione di u 40% di u livellu di amiloide-β in u fluidu cerebrospinale utilizendu un inhibitore di peptidi BACE1 ligatu à u novu peptide di transitu identificatu. Quessi risultati suggerenu chì i peptidi identificati da i metudi di selezzione di fagi in vivo ponu esse veiculi utili per a consegna sistemica di macromolecule à u cervellu cù un effettu terapeuticu.
A ricerca nantu à a terapia mirata à u sistema nervosu cintrali (SNC) s'hè cuncentrata soprattuttu nantu à l'identificazione di medicinali è agenti ottimizzati chì mostranu proprietà di mira à u SNC, cù menu sforzu per scopre i meccanismi chì guidanu a consegna attiva di medicinali à u cervellu. Questu principia à cambià avà, postu chì a consegna di medicinali, in particulare e molecule grande, hè una parte integrante di u sviluppu mudernu di medicinali neuroscientifici. L'ambiente di u sistema nervosu cintrali hè ben prutettu da u sistema di barriera cerebrovasculare, custituitu da a barriera emato-encefalica (BEE) è a barriera emato-encefalica (BCBB)1, ciò chì rende difficiule a consegna di medicinali à u cervellu1,2. Si stima chì guasi tutti i medicinali à molecule grande è più di u 98% di i medicinali à molecule chjuche sò eliminati da u cervellu3. Hè per quessa chì hè assai impurtante identificà novi sistemi di trasportu cerebrale chì furniscenu una consegna efficiente è specifica di medicinali terapeutichi à u SNC4,5. Tuttavia, a BEE è a BCSFB presentanu ancu una eccellente opportunità per a consegna di medicinali, postu chì penetranu è entranu in tutte e strutture di u cervellu attraversu a so vasta vasculatura. Cusì, l'attuali sforzi per aduprà metudi non invasivi di consegna à u cervellu sò largamente basati nantu à u mecanismu di trasportu mediatu da recettori (PMT) utilizendu u recettore endogenu BBB6. Malgradu i recenti progressi chjave utilizendu a via di u recettore di a transferrina7,8, hè necessariu un ulteriore sviluppu di novi sistemi di consegna cù proprietà migliorate. À questu scopu, u nostru scopu era di identificà peptidi capaci di medià u trasportu di u CSF, postu chì puderianu in principiu esse aduprati per furnisce macromolecule à u SNC o per apre nuove vie di recettori. In particulare, specifici recettori è trasportatori di u sistema cerebrovasculare (BBB è BSCFB) ponu serve cum'è potenziali bersagli per a consegna attiva è specifica di farmaci bioterapici. U fluidu cerebrospinale (CSF) hè un pruduttu secretoriu di u plessu coroideu (CS) è hè in cuntattu direttu cù u fluidu interstiziale di u cervellu attraversu u spaziu subaracnoideu è u spaziu ventriculare4. Recentemente hè statu dimustratu chì u fluidu cerebrospinale subaracnoideu si diffonde eccessivamente in l'interstiziu di u cervellu9. Speremu di accede à u spaziu parenchimale aduprendu stu trattu d'afflussu subaracnoideu o direttamente attraversu a BBB. Per ghjunghje questu scopu, avemu implementatu una robusta strategia di selezzione di fagi in vivo chì identifica idealmente i peptidi trasportati da una di queste duie vie distinte.
Avà descrivemu un metudu di screening di visualizazione di fagi sequenziale in vivo cù campionamentu di CSF accoppiatu cù sequenziamentu à altu rendimentu (HTS) per monitorà i cicli di selezzione iniziali cù a più alta diversità di librerie. U screening hè statu realizatu nantu à ratti cuscienti cù una cannula di grande cisterna (CM) impiantata permanentemente per evità a contaminazione di u sangue. Impurtantemente, questu approcciu selezziuna sia u targeting cerebrale sia i peptidi cù attività di trasportu attraversu a barriera cerebrovasculare. Avemu utilizatu fagi T7 per via di a so piccula dimensione (~ 60 nm)10 è avemu suggeritu chì sò adatti per u trasportu di vescicule chì permettenu u passaghju transcellulare di a barriera endoteliale è/o epitelio-midollare. Dopu à quattru cicli di panning, e pupulazioni di fagi sò state isolate mustrendu un forte arricchimentu di CSF in vivo è associazione di microvasi cerebrali. Impurtantemente, simu stati capaci di cunfirmà i nostri risultati dimustrendu chì i peptidi candidati migliori preferiti è sintetizzati chimicamente sò capaci di trasportà u cargu proteicu in u fluidu cerebrospinale. Prima, l'effetti farmacodinamici di u SNC sò stati stabiliti cumbinendu un peptide di transitu principale cù un inhibitore di u peptide BACE1. Oltre à dimustrà chì e strategie di screening funzionale in vivo ponu identificà novi peptidi di trasportu cerebrale cum'è trasportatori di carichi proteici efficaci, aspittemu chì approcci di selezzione funzionale simili diventinu ancu impurtanti per identificà nuove vie di trasportu cerebrale.
Basatu annantu à l'unità chì formanu placche (PFU), dopu à a tappa di imballaggio di i fagi, hè stata cuncipita è creata una biblioteca di peptidi fagici T7 lineari aleatorii di 12 mer cù una diversità di circa 109 (vede Materiali è Metodi). Hè impurtante nutà chì avemu analizatu attentamente sta biblioteca prima di u panning in vivo. L'amplificazione PCR di campioni di biblioteca di fagi utilizendu primer mudificati hà generatu ampliconi chì eranu direttamente applicabili à HTS (Figura Supplementare 1a). A causa di a) errori di sequenziamentu HTS11, b) impattu nantu à a qualità di i primer (NNK) 1-12, è c) a presenza di fagi di tipu salvaticu (wt) (inserti di scheletru) in a biblioteca di standby, hè stata implementata una prucedura di filtraggio di sequenza per estrarre solu l'infurmazioni di sequenza verificate (Figura Supplementare 1b). Queste tappe di filtru si applicanu à tutte e biblioteche di sequenziamentu HTS. Per a biblioteca standard, sò state ottenute un totale di 233.868 letture, di e quali u 39% hà passatu i criteri di filtru è sò state aduprate per l'analisi è a selezzione di a biblioteca per i round successivi (Figura Supplementare 1c-e). E letture eranu soprattuttu multipli di 3 coppie di basi in lunghezza cù un piccu à 36 nucleotidi (Fig. Supplementare 1c), cunfirmendu u disignu di a biblioteca (NNK) 1-12. In particulare, circa l'11% di i membri di a biblioteca cuntenenu un insertu PAGISRELVDKL di tipu salvaticu (wt) à 12 dimensioni, è quasi a metà di e sequenze (49%) cuntenenu inserzioni o delezioni. L'HTS di a biblioteca di a biblioteca hà cunfirmatu l'alta diversità di peptidi in a biblioteca: più di l'81% di e sequenze di peptidi sò state trovate solu una volta è solu l'1,5% si sò verificate in ≥4 copie (Fig. Supplementare 2a). E frequenze di l'aminoacidi (aa) in tutte e 12 pusizioni in u repertoriu eranu ben correlate cù e frequenze previste per u numeru di codoni generati da u repertoriu NKK degeneratu (Fig. Supplementare 2b). A frequenza osservata di residui aa codificati da questi inserti era ben correlata cù a frequenza calculata (r = 0,893) (Fig. Supplementare 2c). A preparazione di e biblioteche di fagi per l'iniezione include i passi di amplificazione è rimozione di endotossine. Questu hè statu dimustratu prima per riduce potenzialmente a diversità di e biblioteche di fagi12,13. Dunque, avemu sequenziatu una biblioteca di fagi amplificata à piastra chì avia subitu a rimozione di endotossine è l'avemu paragunata cù a biblioteca originale per stimà a frequenza di AA. Una forte currelazione (r = 0,995) hè stata osservata trà u pool originale è u pool amplificatu è purificatu (Fig. Supplementare 2d), chì indica chì a cumpetizione trà i cloni amplificati nantu à e piastre utilizendu u fagu T7 ùn hà micca causatu un biais maiò. Questa paragone hè basata nantu à a frequenza di i motivi tripeptidici in ogni biblioteca, postu chì a diversità di e biblioteche (~ 109) ùn pò esse cumpletamente catturata ancu cù HTS. L'analisi di frequenza di aa in ogni pusizione hà rivelatu un picculu biais dipendente da a pusizione in l'ultime trè pusizioni di u repertoriu inseritu (Fig. Supplementare 2e). In conclusione, avemu cunclusu chì a qualità è a diversità di a biblioteca eranu accettabili è solu cambiamenti minori in a diversità sò stati osservati per via di l'amplificazione è a preparazione di e biblioteche di fagi trà parechji cicli di selezzione.
U campionamentu seriale di u fluidu cerebrospinale pò esse realizatu impiantendu chirurgicamente una cannula in u CM di i ratti cuscienti per facilità l'identificazione di u fagu T7 iniettatu per via intravenosa (iv) via a BBB è/o BCSFB (Fig. 1a-b). Avemu utilizatu dui bracci di selezzione indipendenti (bracci A è B) in i primi trè giri di selezzione in vivo (Fig. 1c). Avemu aumentatu gradualmente a stringenza di a selezzione diminuendu a quantità tutale di fagu introduttu in i primi trè giri di selezzione. Per u quartu giru di panning, avemu cumminatu campioni da i rami A è B è realizatu trè selezzioni indipendenti supplementari. Per studià e proprietà in vivo di e particelle di fagu T7 in questu mudellu, u fagu di tipu salvaticu (insertu maestru PAGISRELVDKL) hè statu iniettatu in i ratti via a vena caudale. U recuperu di i fagi da u fluidu cerebrospinale è u sangue in diversi punti di tempu hà dimustratu chì i fagi icosaedrichi T7 relativamente chjuchi avianu una fase di eliminazione iniziale rapida da u compartimentu di u sangue (Fig. Supplementare 3). Basatu annantu à i tituli amministrati è u vulume di sangue di i ratti, avemu calculatu chì solu circa l'1% di pesu di u fagu da a dosa amministrata hè statu rilevatu in u sangue 10 minuti dopu l'iniezione intravenosa. Dopu à questu rapidu declinu iniziale, hè stata misurata una eliminazione primaria più lenta cù una mezza vita di 27,7 minuti. Impurtantemente, solu pochissimi fagi sò stati recuperati da u compartimentu CSF, chì indica un bassu sfondate per a migrazione di fagi di tipu salvaticu in u compartimentu CSF (Figura Supplementare 3). In media, solu circa 1 x 10-3% di tituli di fagu T7 in u sangue è 4 x 10-8% di fagi inizialmente infusi sò stati rilevati in u fluidu cerebrospinale durante tuttu u periodu di campionamentu (0-250 min). In particulare, a mezza vita (25,7 min) di u fagu di tipu salvaticu in u fluidu cerebrospinale era simile à quella osservata in u sangue. Questi dati dimustranu chì a barriera chì separa u compartimentu CSF da u sangue hè intatta in i ratti cannulati cù CM, chì permette a selezzione in vivo di e biblioteche di fagi per identificà i cloni chì sò facilmente trasportati da u sangue in u compartimentu CSF.
(a) Configurazione di un metudu per ricampionà u fluidu cerebrospinale (CSF) da un grande gruppu. (b) Diagramma chì mostra a situazione cellulare di a barriera di u sistema nervosu cintrali (SNC) è a strategia di selezzione aduprata per identificà i peptidi chì attraversanu a barriera emato-encefalica (BBB) ​​è a barriera emato-encefalica. (c) Diagramma di flussu di screening di visualizazione di fagi in vivo. In ogni ciclu di selezzione, i fagi (identificatori d'animali in e frecce) sò stati iniettati per via intravenosa. Dui rami alternativi indipendenti (A, B) sò tenuti separatamente finu à u 4u ciclu di selezzione. Per i cicli di selezzione 3 è 4, ogni clone di fagu estrattu da u CSF hè statu sequenziatu manualmente. (d) Cinetica di u fagu isolatu da u sangue (cerchi rossi) è u fluidu cerebrospinale (trianguli verdi) durante u primu ciclu di selezzione in dui ratti cannulati dopu l'iniezione intravenosa di a biblioteca di peptidi T7 (2 x 1012 fagi/animale). I quadrati blu indicanu a cuncentrazione iniziale media di fagi in u sangue, calculata da a quantità di fagi iniettati, tenendu contu di u vulume tutale di sangue. I quadrati neri indicanu u puntu d'intersezione di a linea y extrapolata da e cuncentrazioni di fagi in u sangue. (e, f) Presentanu a frequenza relativa è a distribuzione di tutti i pussibuli motivi tripeptidici sovrapposti truvati in u peptide. Hè mostratu u numeru di motivi truvati in 1000 letture. I motivi arricchiti significativamente (p < 0,001) sò marcati cù punti rossi. (e) Diagramma di dispersione di currelazione chì paraguna a frequenza relativa di u mutivu tripeptidicu di a biblioteca iniettata cù u fagu derivatu da u sangue di l'animali #1.1 è #1.2. (f) Diagramma di dispersione di currelazione chì paraguna e frequenze relative di i motivi tripeptidici di fagi animali #1.1 è #1.2 isolati in u sangue è u fluidu cerebrospinale. (g, h) Rappresentazione di l'ID di sequenza di fagi arricchiti in sangue (g) versus biblioteche iniettate è fagi arricchiti in CSF (h) versus sangue dopu un ciclu di selezzione in vivo in entrambi l'animali. A dimensione di u codice di una lettera indica a frequenza cù a quale quell'aminoacidu si trova in quella pusizione. Verde = polare, viulettu = neutru, blu = basicu, rossu = acidicu è neru = aminoacidi idrofobici. A figura 1a, b hè stata cuncipita è prudutta da Eduard Urich.
Avemu iniettatu una biblioteca di peptidi fagichi in dui ratti di strumentu CM (cladi A è B) è avemu isolatu u fagu da u fluidu cerebrospinale è u sangue (Figura 1d). A rapida eliminazione iniziale di a biblioteca era menu pronunciata paragunata à u fagu di tipu salvaticu. A mezza vita media di a biblioteca iniettata in i dui animali era di 24,8 minuti in u sangue, simile à u fagu di tipu salvaticu, è 38,5 minuti in u CSF. I campioni di sangue è di fluidu cerebrospinale di ogni animale sò stati sottumessi à HTS è tutti i peptidi identificati sò stati analizati per a presenza di un cortu mutivu tripeptidicu. I motivi tripeptidichi sò stati scelti perchè furniscenu una basa minima per a furmazione di strutture è l'interazzione peptide-proteina14,15. Avemu trovu una bona currelazione in a distribuzione di i motivi trà a biblioteca di fagichi iniettata è i cloni estratti da u sangue di i dui animali (Fig. 1e). I dati indicanu chì a cumpusizione di a biblioteca hè solu marginalmente arricchita in u compartimentu di u sangue. E frequenze di l'aminoacidi è e sequenze di consensu sò state ulteriormente analizzate in ogni pusizione utilizendu un adattamentu di u software Weblogo16. Curiosamente, avemu trovu un forte arricchimentu in i residui di glicina in u sangue (Fig. 1g). Quandu u sangue hè statu paragunatu cù i cloni selezziunati da u CSF, sò state osservate una forte selezzione è una certa deselezzione di motivi (Fig. 1f), è certi aminoacidi eranu preferenzialmente presenti in pusizioni predeterminate in u 12-membri (Fig. 1h). In particulare, i singoli animali differianu significativamente in u fluidu cerebrospinale, mentre chì l'arricchimentu di glicina in u sangue hè statu osservatu in i dui animali (Fig. Supplementare 4a-j). Dopu una filtrazione rigorosa di i dati di sequenza in u fluidu cerebrospinale di l'animali #1.1 è #1.2, sò stati ottenuti un totale di 964 è 420 peptidi 12-meri unichi (Fig. Supplementare 1d-e). I cloni di fagi isolati sò stati amplificati è sottumessi à un secondu giru di selezzione in vivo. I fagi estratti da u secondu giru di selezzione sò stati sottumessi à HTS in ogni animale è tutti i peptidi identificati sò stati aduprati cum'è input per un prugramma di ricunniscenza di motivi per analizà l'occorrenza di motivi tripeptidici (Fig. 2a, b, ef). In paragone cù u primu ciclu di u fagu recuperatu da u CSF, avemu osservatu una ulteriore selezzione è deselezzione di parechji motivi in ​​u CSF in i rami A è B (Fig. 2). Un algoritmu d'identificazione di rete hè statu applicatu per determinà s'elli rapprisentavanu mudelli diversi di sequenza consistente. Una chiara similitudine hè stata osservata trà e sequenze 12-dimensionali recuperate da u CSF in u clade alternativu A (Fig. 2c, d) è u clade B (Fig. 2g, h). L'analisi aggregata in ogni ramu hà rivelatu diversi profili di selezzione per i peptidi 12-meri (Fig. Supplementare 5c, d) è un aumentu di u rapportu di titru CSF/sangue in u tempu per i cloni aggregati dopu à u secondu giru di selezzione paragunatu à u primu giru di selezzione (Fig. Supplementare 5e).
Arricchimentu di motivi è peptidi in u fluidu cerebrospinale per mezu di dui cicli successivi di selezzione di visualizazione di fagi funzionali in vivo.
Tutti i fagi di u fluidu cerebrospinale recuperati da u primu giru di ogni animale (animali #1.1 è #1.2) sò stati raggruppati, amplificati, sequenziati HT-sequenziati è reiniettati inseme (2 x 1010 fagi/animale) 2 ratti cannulati SM (#1.1 → #). 2.1 è 2.2, 1.2 → 2.3 è 2.4). (a,b,e,f) Diagrammi di dispersione di currelazione chì paragunanu a frequenza relativa di i motivi tripeptidici di tutti i fagi derivati ​​da u CSF in u primu è u secondu giru di selezzione. Frequenza relativa è distribuzione di i motivi chì rapprisentanu tutti i pussibuli tripeptidi sovrapposti truvati in i peptidi in entrambe l'orientazioni. Hè mostratu u numeru di motivi truvati in 1000 letture. I motivi chì sò stati significativamente (p < 0,001) selezziunati o esclusi in una di e biblioteche paragunate sò evidenziati cù punti rossi. (c, d, g, h) Rappresentazione di u logu di sequenza di tutte e sequenze lunghe di 12 aminoacidi ricche di CSF basate nantu à i round 2 è 1 di selezzione in vivo. A dimensione di u codice di una lettera indica a frequenza cù a quale quell'aminoacidu si trova in quella pusizione. Per rapprisintà u logu, a frequenza di e sequenze CSF estratte da i singoli animali trà dui round di selezzione hè paragunata è e sequenze arricchite in u secondu round sò mostrate: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 è (h) #1.2–#2.4. L'aminoacidi più arricchiti in una data pusizione in (c, d) animali n. 2.1 è n. 2.2 o (g, h) in animali n. 2.3 è n. 2.4 sò mostrati in culore. Verde = polare, viola = neutru, blu = basicu, rossu = acidicu è neru = aminoacidi idrofobici.
Dopu à a terza volta di selezzione, avemu identificatu 124 sequenze peptidiche uniche (#3.1 è #3.2) da 332 cloni di fagi ricostituiti in CSF isolati da dui animali (Figura supplementare 6a). A sequenza LGSVS (18,7%) avia a più alta proporzione relativa, seguitata da l'inserti di tipu salvaticu PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) è SARGSWREIVSLS (2,2%). In l'ultima quarta volta, avemu raggruppatu duie branche selezziunate indipindentamente da trè animali separati (Figura 1c). Di i 925 cloni di fagi sequenziati recuperati da CSF, in a quarta volta avemu trovu 64 sequenze peptidiche uniche (Figura supplementare 6b), trà e quali a proporzione relativa di fagi di tipu salvaticu hè cascata à 0,8%. I cloni CSF i più cumuni in u quartu giru eranu LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) è RLSSVDSDLSGC (3,2%). A gamma di lunghezza di i peptidi selezziunati hè dovuta à inserzioni/delezioni di nucleotidi o codoni di stop prematuri in i primer di a biblioteca quandu si utilizanu codoni degenerati per a cuncepzione di a biblioteca NNK. I codoni di stop prematuri generanu peptidi più corti è sò selezziunati perchè cuntenenu u mutivu aa favurevule. I peptidi più lunghi ponu risultà da inserzioni/delezioni in i primer di e biblioteche sintetiche. Questu pusiziona u codon di stop cuncipitu fora di u quadru è u leghje finu à chì un novu codon di stop appare à valle. In generale, avemu calculatu i fattori di arricchimentu per tutti i quattru giri di selezzione paragunendu i dati d'input cù i dati di output di u campione. Per u primu giru di screening, avemu utilizatu tituli di fagi di tipu salvaticu cum'è riferimentu di fondu non specificu. Curiosamente, a selezzione negativa di i fagi era assai forte in u primu ciclu di u LCR, ma micca in u sangue (Fig. 3a), ciò chì pò esse duvutu à a bassa probabilità di diffusione passiva di a maiò parte di i membri di a biblioteca di peptidi in u compartimentu di u LCR o i fagi relativi tendenu à esse ritenuti o rimossi più efficacemente da u sangue chè i batteriofagi. Tuttavia, in u secondu giru di panning, hè stata osservata una forte selezzione di fagi in u LCR in i dui cladi, ciò chì suggerisce chì u giru precedente era arricchitu in fagi chì mostranu peptidi chì prumove l'assorbimentu di u LCR (Fig. 3a). Di novu, senza arricchimentu significativu di u sangue. Ancu in u terzu è u quartu giru, i cloni di fagi sò stati significativamente arricchiti in u LCR. Paragunendu a frequenza relativa di ogni sequenza peptidica unica trà l'ultimi dui giri di selezzione, avemu trovu chì e sequenze eranu ancu più arricchite in u quartu giru di selezzione (Fig. 3b). Un totale di 931 motivi tripeptidici sò stati estratti da tutte e 64 sequenze peptidiche uniche utilizendu i dui orientamenti peptidici. I motivi i più arricchiti in u quartu giru sò stati esaminati più da vicinu per i so profili d'arricchimentu in tutti i giri paragunatu à a biblioteca iniettata (limitu: arricchimentu di 10%) (Figura supplementare 6c). I mudelli generali di selezzione anu dimustratu chì a maiò parte di i motivi studiati sò stati arricchiti in tutti i giri precedenti di e duie branche di selezzione. Tuttavia, certi motivi (per esempiu SGL, VSG, LGS GSV) eranu principalmente da u clade alternativu A, mentre chì altri (per esempiu FGW, RTN, WGF, NTR) sò stati arricchiti in u clade alternativu B.
Validazione di u trasportu in CSF di peptidi visualizati in fagi arricchiti in CSF è peptidi leader biotinilati coniugati à carichi di streptavidina.
(a) Rapporti d'arricchimentu calculati in tutti i quattru round (R1-R4) basati annantu à i tituli di fagi (PFU) iniettati (input = I) è i tituli di fagi CSF determinati (output = O). I fattori d'arricchimentu per l'ultimi trè round (R2-R4) sò stati calculati per paragone cù u round precedente è u primu round (R1) cù dati di pesu. E barre aperte sò u fluidu cerebrospinale, e barre ombreggiate sò u plasma. (***p<0,001, basatu annantu à u test t di Student). (b) Lista di i peptidi fagichi più abbundanti, classificati secondu a so proporzione relativa à tutti i fagi raccolti in CSF dopu u round 4 di selezzione. I sei cloni di fagi più cumuni sò evidenziati in culore, numerati è i so fattori d'arricchimentu trà i round 3 è 4 di selezzione (inserti). (c,d) I sei cloni di fagi più arricchiti, e biblioteche di peptidi fagichi vioti è parentali di u round 4 sò stati analizati individualmente in un mudellu di campionamentu CSF. Campioni di LCR è di sangue sò stati raccolti à i tempi indicati. (c) Quantità uguali di 6 cloni di fagi candidati (2 x 1010 fagi/animali), fagi vioti (#1779) (2 x 1010 fagi/animali) è biblioteche di peptidi di fagi stock (2 x 1012 fagi/animali). Iniettà almenu 3 CM hè amministratu à l'animale cannulatu separatamente via a vena caudale. Hè mostrata a farmacocinetica di u LCR di ogni clone di fagu iniettatu è di a biblioteca di peptidi di fagi in u tempu. (d) mostra u rapportu mediu LCR/sangue per tutti i fagi/mL recuperati durante u tempu di campionamentu. (e) Quattru peptidi leader sintetici è un cuntrollu mischiatu sò stati ligati cù a biotina à a streptavidina attraversu u so N-terminale (display tetramer) seguitu da iniezione (vena caudale iv, 10 mg di streptavidina/kg). Almenu trè ratti intubati (N = 3). ). I campioni di CSF sò stati raccolti à i punti di tempu indicati è e concentrazioni di streptavidina sò state misurate da ELISA anti-streptavidina in CSF (nd = micca rilevatu). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, basatu annantu à u test ANOVA). (f) Paragone di a sequenza di aminoacidi di u clone di peptide fagicu più arricchitu #2002 (viola) cù altri cloni di peptide fagicu selezziunati da u 4u giru di selezzione. I frammenti di aminoacidi identichi è simili sò codificati per culore.
Di tutti i fagi arricchiti in u quartu giru (Fig. 3b), sei cloni candidati sò stati selezziunati per un'ulteriore analisi individuale in u mudellu di campionamentu CSF. Quantità uguali di sei fagi candidati, fagi vioti (senza insertu) è biblioteche di peptidi di profago sò state iniettate in trè animali CM cannulati, è a farmacocinetica hè stata determinata in saggi CSF (Fig. 3c) è sangue (Fig. Supplementare 7). Tutti i cloni di fagi testati anu miratu u compartimentu CSF à un livellu 10-1000 volte più altu di quellu di u fago di cuntrollu viotu (#1779). Per esempiu, i cloni #2020 è #2077 avianu tituli CSF circa 1000 volte più alti cà u fago di cuntrollu. U prufilu farmacocineticu di ogni peptide selezziunatu hè diversu, ma tutti anu una alta capacità di homing CSF. Avemu osservatu una diminuzione custante cù u tempu per i cloni #1903 è #2011, mentre chì per i cloni #2077, #2002 è #2009 un aumentu durante i primi 10 minuti puderia indicà un trasportu attivu, ma deve esse verificatu. I cloni #2020, #2002 è #2077 si sò stabilizzati à livelli elevati, mentre chì a cuncentrazione di CSF di u clone #2009 hè diminuita lentamente dopu à l'aumentu iniziale. Avemu dopu paragunatu a frequenza relativa di ogni candidatu CSF cù a so cuncentrazione in u sangue (Fig. 3d). A currelazione di u titulu mediu di ogni candidatu CSF cù u so titulu in u sangue in tutti i tempi di campionamentu hà dimustratu chì trè di i sei candidati eranu significativamente arricchiti in CSF in u sangue. Hè interessante nutà chì u clone #2077 hà dimustratu una maggiore stabilità in u sangue (Figura Supplementare 7). Per cunfirmà chì i peptidi stessi sò capaci di trasportà attivamente carichi diversi da e particelle di fagi in u compartimentu CSF, avemu sintetizatu quattru peptidi leader derivatizati cù biotina à l'N-terminale induve i peptidi si attaccanu à a particella di fagi. I peptidi biotinilati (n. 2002, 2009, 2020 è 2077) sò stati cunjugati cù streptavidina (SA) per ottene forme multimeriche chì imitanu in qualchì modu a geometria di i fagi. Stu furmatu ci hà ancu permessu di misurà l'esposizione à SA in u sangue è in u fluidu cerebrospinale cum'è peptidi proteichi di trasportu di carichi. Impurtantemente, i dati di i fagi pudianu spessu esse riprudutti quandu i peptidi sintetici eranu amministrati in questu furmatu cunjugatu cù SA (Fig. 3e). I peptidi mischiati avianu una minore esposizione iniziale è una eliminazione più rapida di u LCR cù livelli indetectabili in 48 ore. Per ottene informazioni nantu à e vie di consegna di questi cloni di fagi peptidici in u spaziu di u LCR, avemu analizatu a lucalizazione di i singoli colpi di peptidi fagichi utilizendu l'immunoistochimica (IHC) per rilevà direttamente e particelle di fagi 1 ora dopu l'iniezione intravenosa in vivo. In particulare, i cloni #2002, #2077, è #2009 puderanu esse rilevati da una forte culurazione in i capillari cerebrali, mentre chì u fagu di cuntrollu (#1779) è u clone #2020 ùn sò stati rilevati (Figura Supplementare 8). Questu suggerisce chì sti peptidi cuntribuiscenu à l'effettu nantu à u cervellu precisamente attraversendu a BBB. Un'analisi più dettagliata hè necessaria per testà sta ipotesi, postu chì a via BSCFB pò ancu esse implicata. Quandu si paraguna a sequenza di aminoacidi di u clone più arricchitu (#2002) cù altri peptidi selezziunati, hè statu nutatu chì alcuni di elli anu estensioni di aminoacidi simili, chì ponu indicà un mecanismu di trasportu simile (Fig. 3f).
A causa di u so prufilu plasmaticu unicu è di l'aumentu significativu di u CSF cù u tempu, u clone di visualizazione di fagi #2077 hè statu ulteriormente esploratu per un periodu più longu di 48 ore è hè statu capace di riproduce l'aumentu rapidu di u CSF osservatu in associazione cù livelli di SA sustinuti (Fig. 4a). In quantu à altri cloni di fagi identificati, #2077 hà culuritu fortemente per i capillari cerebrali è hà mostratu una colocalizazione significativa cù a lectina marcatrice capillare quandu hè stata vista à una risoluzione più alta è forse una certa culurazione in u spaziu parenchimale (Figura 4b). Per investigà se l'effetti farmacologichi mediati da peptidi puderanu esse ottenuti in u SNC, avemu realizatu un esperimentu in u quale e versioni biotinilate di i) u peptide di transitu #2077 è ii) u peptide inibitore BACE1 sò state mischiate cù SA à dui rapporti diversi. Per una cumminazione avemu utilizatu solu l'inibitore di peptidi BACE1 è per l'altra avemu utilizatu un rapportu 1:3 di l'inibitore di peptidi BACE1 à u peptide #2077. Tramindui i campioni sò stati amministrati per via intravenosa è i livelli di u sangue è di u fluidu cerebrospinale di u peptide beta-amiloide 40 (Abeta40) sò stati misurati in u tempu. Abeta40 hè statu misuratu in u LCR postu chì riflette l'inibizione di BACE1 in u parenchima cerebrale. Cum'è previstu, tramindui i cumplessu anu riduttu significativamente i livelli di Abeta40 in u sangue (Fig. 4c, d). Tuttavia, solu i campioni chì cuntenenu una mistura di peptide n. 2077 è un inhibitore di u peptide BACE1 cunjugatu à SA anu causatu una diminuzione significativa di Abeta40 in u fluidu cerebrospinale (Fig. 4c). I dati mostranu chì u peptide n. 2077 hè capace di trasportà a proteina SA di 60 kDa in u SNC è induce ancu effetti farmacologichi cù inhibitori SA-cunjugati di u peptide BACE1.
(a) Iniezione clonale (2 × 10⁵ fagi/animale) di fago T7 chì mostra profili farmacocinetici à longu andà di u peptide CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) è di u fago di cuntrollu micca iniettatu (#1779) in almenu trè ratti intubati cù CM. (b) Immagine microscopica cunfocale di microvasi corticali rappresentativi in ​​ratti iniettati cù fagi (2 × 10⁵ fagi/animale) chì mostra a contracolorazione di u peptide #2077 è di i vasi (lectina). Quessi cloni di fagi sò stati amministrati à 3 ratti è lasciati circulà per 1 ora prima di a perfusione. I cervelli sò stati sezionati è culuriti cù anticorpi policlonali marcati cù FITC contr'à u capside di u fago T7. Dece minuti prima di a perfusione è di a successiva fissazione, a lectina marcata cù DyLight594 hè stata amministrata per via intravenosa. Imagine fluorescenti chì mostranu a culurazione di lectina (rossa) di a parte luminale di i microvasi è di i fagi (verde) in u lume di i capillari è di u tissutu cerebrale perivasculare. A barra di scala currisponde à 10 µm. (c, d) U peptide inibitore BACE1 biotinilatu solu o in cumbinazione cù u peptide di transitu biotinilatu #2077 hè statu accoppiatu à a streptavidina seguita da iniezione intravenosa di almenu trè ratti CM cannulati (10 mg di streptavidina/kg). A riduzione di Aβ40 mediata da l'inibitore di u peptide BACE1 hè stata misurata da Aβ1-40 ELISA in sangue (rossu) è fluidu cerebrospinale (aranciu) à i punti di tempu indicati. Per una migliore chiarezza, una linea punteggiata hè tracciata nantu à u graficu à una scala di 100%. (c) Riduzione percentuale di Aβ40 in u sangue (trianguli rossi) è in u fluidu cerebrospinale (trianguli aranciu) in i ratti trattati cù streptavidina coniugata à u peptide di transitu #2077 è u peptide inibitore BACE1 in un rapportu 3:1. (d) Riduzione percentuale di Aβ40 in u sangue (cerchi rossi) è in u fluidu cerebrospinale (cerchi aranciu) di i ratti trattati cù streptavidina accoppiata solu à un peptide inibitore BACE1. A cuncentrazione di Aβ in u cuntrollu era di 420 pg/ml (deviazione standard = 101 pg/ml).
A visualizazione di i fagi hè stata applicata cù successu in parechji duminii di a ricerca biomedica17. Stu metudu hè statu utilizatu per studii di diversità vascolare in vivo18,19 è ancu per studii chì miranu i vasi cerebrali20,21,22,23,24,25,26. In questu studiu, avemu allargatu l'applicazione di stu metudu di selezzione micca solu à l'identificazione diretta di peptidi chì miranu i vasi cerebrali, ma ancu à a scuperta di candidati cù proprietà di trasportu attivu per attraversà a barriera emato-encefalica. Avà descrivemu u sviluppu di una prucedura di selezzione in vivo in ratti intubati CM è dimustremu u so putenziale per identificà peptidi cù proprietà di homing CSF. Usendu u fagu T7 chì mostra una biblioteca di peptidi aleatorii 12-mer, simu stati capaci di dimustrà chì u fagu T7 hè abbastanza chjucu (circa 60 nm di diametru)10 per esse adattatu à a barriera emato-encefalica, attraversendu cusì direttamente a barriera emato-encefalica o u plessu coroideu. Avemu osservatu chì a raccolta di CSF da ratti CM cannulati era un metudu di screening funzionale in vivo ben cuntrullatu, è chì u fagu estrattu ùn solu si legava à a vasculatura, ma funzionava ancu cum'è trasportatore attraversu a barriera emato-encefalica. Inoltre, raccogliendu simultaneamente sangue è applicendu HTS à CSF è fagi derivati ​​da u sangue, avemu cunfirmatu chì a nostra scelta di CSF ùn era micca influenzata da l'arricchimentu di u sangue o da l'idoneità per l'espansione trà i cicli di selezzione. Tuttavia, u compartimentu di u sangue face parte di a prucedura di selezzione, postu chì i fagi capaci di ghjunghje à u compartimentu CSF devenu sopravvive è circulà in u sangue abbastanza longu per arricchisce si in u cervellu. Per estrarre informazioni di sequenza affidabili da dati HTS grezzi, avemu implementatu filtri adattati à errori di sequenziamentu specifichi di a piattaforma in u flussu di travagliu di analisi. Incorporendu parametri cinetici in u metudu di screening, avemu cunfirmatu a farmacocinetica rapida di i fagi T7 di tipu salvaticu (t½ ~ 28 min) in u sangue24, 27, 28 è avemu ancu determinatu a so emivita in u fluidu cerebrospinale (t½ ~ 26 min) per minutu). Malgradu profili farmacocinetichi simili in u sangue è in u LCR, solu u 0,001% di a cuncentrazione di fagi in u sangue hà pussutu esse rilevata in u LCR, ciò chì indica una bassa mobilità di fondu di u fagu T7 di tipu salvaticu attraversu a barriera emato-encefalica. Stu travagliu mette in risaltu l'impurtanza di u primu giru di selezzione quandu si utilizanu strategie di panning in vivo, in particulare per i sistemi di fagi chì sò rapidamente eliminati da a circulazione, postu chì pochi cloni sò capaci di ghjunghje à u compartimentu di u SNC. Cusì, in u primu giru, a riduzione di a diversità di a biblioteca hè stata assai grande, postu chì solu un numeru limitatu di cloni sò stati infine raccolti in questu mudellu LCR assai strettu. Sta strategia di panning in vivo hà inclusu parechji passi di selezzione cum'è l'accumulazione attiva in u compartimentu di u LCR, a sopravvivenza di i cloni in u compartimentu di u sangue è a rapida rimozione di i cloni di fagi T7 da u sangue in i primi 10 minuti (Fig. 1d è Fig. Supplementare 4M). Cusì, dopu à u primu giru, sò stati identificati diversi cloni di fagi in u LCR, ancu se u listessu pool iniziale hè statu utilizatu per i singoli animali. Questu suggerisce chì parechji passi di selezzione stretta per e biblioteche surghjente cù un gran numeru di membri di a biblioteca risultanu in una riduzione significativa di a diversità. Dunque, l'eventi aleatorii diventeranu una parte integrante di u prucessu di selezzione iniziale, influenzendu assai u risultatu. Hè prubabile chì parechji di i cloni in a biblioteca originale avianu una propensione à l'arricchimentu di CSF assai simile. Tuttavia, ancu in e stesse cundizioni sperimentali, i risultati di a selezzione ponu differisce per via di u picculu numeru di ogni clone particulare in u gruppu iniziale.
I motivi arricchiti in CSF sò diffirenti da quelli in u sangue. Hè interessante nutà u primu cambiamentu versu i peptidi ricchi di glicina in u sangue di i singoli animali. (Fig. 1g, Fig. Supplementari 4e, 4f). I fagi chì cuntenenu peptidi di glicina ponu esse più stabili è menu prubabili di esse cacciati da a circulazione. Tuttavia, sti peptidi ricchi di glicina ùn sò stati rilevati in i campioni di fluidu cerebrospinale, ciò chì suggerisce chì e biblioteche curate anu passatu per duie diverse tappe di selezzione: una in u sangue è un'altra lasciata accumulà si in u fluidu cerebrospinale. I cloni arricchiti in CSF risultanti da u quartu giru di selezzione sò stati testati ampiamente. Quasi tutti i cloni testati individualmente sò stati cunfirmati arricchiti in CSF paragunatu à u fagu di cuntrollu biancu. Un successu di peptide (#2077) hè statu esaminatu in più dettagliu. Hà mostratu una emivita plasmatica più longa paragunata à altri successi (Figura 3d è Figura Supplementare 7), è hè interessante nutà chì stu peptide cuntene un residuu di cisteina à u C-terminale. Hè statu dimustratu pocu fà chì l'aghjunta di cisteina à i peptidi pò migliurà e so proprietà farmacocinetiche ligandu si à l'albumina 29. Questu hè attualmente scunnisciutu per u peptide #2077 è richiede ulteriori studii. Certi peptidi anu mostratu una dipendenza da a valenza in l'arricchimentu di u CSF (dati micca mostrati), chì pò esse ligata à a geometria di a superficia visualizata di u capside T7. U sistema T7 chì avemu utilizatu hà mostratu 5-15 copie di ogni peptide per particella di fagu. L'IHC hè stata realizata nantu à cloni di fagu candidati iniettati per via intravenosa in a corteccia cerebrale di i ratti (Figura Supplementare 8). I dati anu mostratu chì almenu trè cloni (N ° 2002, N ° 2009 è N ° 2077) anu interagitu cù u BBB. Resta da determinà se sta interazione BBB provoca l'accumulazione di CSF o u muvimentu di questi cloni direttamente à u BCSFB. Impurtantemente, mostremu chì i peptidi selezziunati mantenenu a so capacità di trasportu di CSF quandu sò sintetizzati è ligati à u carcu proteicu. U ligame di peptidi biotinilati N-terminali à SA ripete essenzialmente i risultati ottenuti cù i so rispettivi cloni di fagi in u sangue è u fluidu cerebrospinale (Fig. 3e). Infine, mostremu chì u peptide principale #2077 hè capace di prumove l'azione cerebrale di un inhibitore peptidicu biotinilatu di BACE1 cunjugatu à SA, causendu effetti farmacodinamici pronunciati in u SNC riducendu significativamente i livelli di Abeta40 in u CSF (Fig. 4). Ùn simu stati capaci di identificà alcun omologu in a basa di dati eseguendu una ricerca di omologia di sequenza peptidica di tutti i risultati. Hè impurtante nutà chì a dimensione di a biblioteca T7 hè circa 109, mentre chì a dimensione teorica di a biblioteca per i 12-meri hè 4 x 1015. Dunque, avemu sceltu solu una piccula frazione di u spaziu di diversità di a biblioteca di peptidi 12-meri, ciò chì pò significà chì peptidi più ottimizzati ponu esse identificati valutendu u spaziu di sequenza adiacente di questi risultati identificati. Ipoteticamente, una di e ragioni per chì ùn avemu trovu alcun omologu naturale di sti peptidi puderia esse a deselezzione durante l'evoluzione per impedisce l'entrata incontrollata di certi motivi peptidici in u cervellu.
Pigliati inseme, i nostri risultati furniscenu una basa per u travagliu futuru per identificà è caratterizà i sistemi di trasportu di a barriera cerebrovasculare in vivo in più dettagliu. A cunfigurazione di basa di stu metudu hè basata annantu à una strategia di selezzione funzionale chì ùn solu identifica i cloni cù proprietà di ligame vasculare cerebrale, ma include ancu un passu criticu in u quale i cloni riesciuti anu attività intrinseca per attraversà e barriere biologiche in vivo in u compartimentu di u SNC. hè di elucidà u mecanismu di trasportu di sti peptidi è a so preferenza per u ligame à a microvasculatura specifica di a regione di u cervellu. Questu pò purtà à a scuperta di novi vie per u trasportu di u BBB è di i receptori. Aspittemu chì i peptidi identificati possinu ligà direttamente à i receptori cerebrovasculari o à i ligandi circulanti trasportati attraversu u BBB o u BCSFB. I vettori peptidici cù attività di trasportu CSF scuperti in questu travagliu seranu ulteriormente investigati. Attualmente stemu investigendu a specificità cerebrale di sti peptidi per a so capacità di attraversà u BBB è/o u BCSFB. Questi novi peptidi saranu strumenti estremamente preziosi per a scuperta putenziale di novi recettori o vie è per u sviluppu di nuove piattaforme altamente efficienti per a consegna di macromolecule, cum'è i biologichi, à u cervellu.
Cannulà a grande cisterna (CM) aduprendu una mudificazione di u metudu discrittu prima. I ratti Wistar anestetizzati (200-350 g) sò stati muntati nantu à un apparecchiu stereotassicu è una incisione mediana hè stata fatta sopra u scalp rasatu è preparatu asetticamente per espone u craniu. Perforà dui fori in a zona di a fascia superiore è fissà e viti di fissaggio in i fori. Un foru supplementu hè statu perforatu in a cresta occipitale laterale per a guida stereotassica di una cannula in acciaio inox in u CM. Applicà cimentu dentale intornu à a cannula è fissallu cù viti. Dopu a fotopolimerizazione è l'indurimentu di u cimentu, a ferita di a pelle hè stata chjusa cù una sutura supramid 4/0. U piazzamentu currettu di a cannula hè cunfirmatu da a perdita spontanea di fluidu cerebrospinale (CSF). Rimuovere u rattu da l'apparecchiu stereotassicu, riceve cure postoperatorie è gestione di u dolore appropriate, è lasciallu ricuperà per almenu una settimana finu à chì si osservanu segni di sangue in u fluidu cerebrospinale. I ratti Wistar (Crl:WI/Han) sò stati ottenuti da Charles River (Francia). Tutti i ratti sò stati tenuti in cundizioni specifiche senza agenti patogeni. Tutti l'esperimenti nantu à l'animali sò stati appruvati da l'Uffiziu Veterinariu di a Città di Basilea, Svizzera, è sò stati realizati in cunfurmità cù a Licenza Animale N ° 2474 (Valutazione di u Trasportu Cerebrale Attivu Misurà i Livelli di Candidati Terapeutici in u Liquidu Cerebrospinale è u Cervellu di Rattu).
Mantene delicatamente u rattu cusciente cù a cannula CM in manu. Eliminate Datura da a cannula è raccogliete 10 µl di fluidu cerebrospinale chì scorre spontaneamente. Siccomu a pervietà di a cannula hè stata infine compromessa, solu campioni di fluidu cerebrospinale chjari senza evidenza di contaminazione di sangue o decolorazione sò stati inclusi in questu studiu. In parallelu, circa 10-20 μl di sangue sò stati prelevati da una piccula incisione à a punta di a coda in tubi cù eparina (Sigma-Aldrich). U CSF è u sangue sò stati raccolti in diversi momenti dopu l'iniezione intravenosa di fago T7. Circa 5-10 μl di fluidu sò stati scartati prima di raccoglie ogni campione di CSF, chì currisponde à u vulume mortu di u catetere.
E biblioteche sò state generate aduprendu u vettore T7Select 10-3b cum'è descrittu in u manuale di u sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). In breve, un insertu di DNA aleatoriu di 12 mer hè statu sintetizatu in u furmatu seguente:
U codon NNK hè statu utilizatu per evità i codoni di stop doppi è a sovraespressione di l'aminoacidi in l'insertu. N hè un rapportu equimolare mischiatu manualmente di ogni nucleotide, è K hè un rapportu equimolare mischiatu manualmente di nucleotidi di adenina è citosina. E regioni à filamentu unicu sò state cunvertite in DNA à filamentu unicu per incubazione ulteriore cù dNTP (Novagen) è l'enzima Klenow (New England Biolabs) in tampone Klenow (New England Biolabs) per 3 ore à 37°C. Dopu a reazione, u DNA à filamentu unicu hè statu recuperatu per precipitazione cù EtOH. U DNA risultante hè statu digeritu cù enzimi di restrizione EcoRI è HindIII (tramindui da Roche). L'insertu scissu è purificatu (QIAquick, Qiagen) (ligasi T4, New England Biolabs) hè statu dopu ligatu in-frame in un vettore T7 pre-scissu dopu l'aminoacidu 348 di u genu di u capside 10B. E reazioni di ligazione sò state incubate à 16°C per 18 ore prima di l'imballaggio in vitro. L'imballaggio di fagi in vitro hè statu realizatu secondu l'istruzzioni furnite cù u kit di clonazione T7Select 10-3b (Novagen) è a suluzione d'imballaggio hè stata amplificata una volta à lisi aduprendu Escherichia coli (BLT5615, Novagen). I lisati sò stati centrifugati, titrati è congelati à -80° C cum'è una suluzione stock di glicerolu.
Amplificazione PCR diretta di e regioni variabili di u fagu amplificate in brodu o piastra utilizendu primer di fusione 454/Roche-amplicon proprietarii. U primer di fusione diretta cuntene sequenze chì fiancheghjanu a regione variabile (NNK) 12 (specifica di u mudellu), l'adattatore GS FLX Titanium A, è una sequenza chjave di biblioteca à quattru basi (TCAG) (Figura Supplementare 1a):
U primer di fusione inversa cuntene ancu biotina attaccata à e perle di cattura è l'adattatore GS FLX Titanium B necessariu per l'amplificazione clonale durante a PCR in emulsione:
L'ampliconi sò stati dopu sottumessi à pirosequenziamentu 454/Roche secondu u protocolu 454 GS-FLX Titanium. Per u sequenziamentu manuale Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), u DNA di u fagu T7 hè statu amplificatu per PCR è sequenziatu cù e seguenti coppie di primer:
L'inserti di e placche individuali sò stati sottumessi à l'amplificazione PCR utilizendu u kit Roche Fast Start DNA Polymerase (secondu l'istruzzioni di u fabricatore). Eseguite un avviu à caldo (10 min à 95 °C) è 35 cicli di boost (50 s à 95 °C, 1 min à 50 °C è 1 min à 72 °C).
I fagi da e biblioteche, i fagi di tipu salvaticu, i fagi recuperati da u LCR è u sangue, o i cloni individuali sò stati amplificati in Escherichia coli BL5615 in brodu TB (Sigma Aldrich) o in piastre di 500 cm2 (Thermo Scientific) per 4 ore à 37°C. I fagi sò stati estratti da e piastre sciacquendu e piastre cù tampone Tris-EDTA (Fluka Analytical) o raccogliendu e placche cù punte di pipetta sterili. I fagi sò stati isolati da u surnatante di cultura o da u tampone d'estrazione cù un ciclu di precipitazione di polietilenglicole (PEG 8000) (Promega) è risospesi in tampone Tris-EDTA.
U fagu amplificatu hè statu sottumessu à 2-3 cicli di rimuzione di endotossine utilizendu perle di rimuzione di endotossine (Miltenyi Biotec) prima di l'iniezione intravenosa (IV) (500 μl/animale). In u primu ciclu, sò stati introdutti 2×1012 fagi; in u secondu, 2×1010 fagi; in u terzu è u quartu ciclu di selezzione, 2×109 fagi per animale. U cuntenutu di fagi in i campioni di CSF è di sangue raccolti à i punti di tempu indicati hè statu determinatu da u cuntu di a placca secondu l'istruzzioni di u fabricatore (manuale di u sistema T7Select). A selezzione di i fagi hè stata effettuata per iniezione intravenosa di biblioteche purificate in a vena di a coda o per reiniezione di fagi estratti da u CSF da u ciclu di selezzione precedente, è e raccolte successive sò state effettuate rispettivamente à 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min è 240 min di campioni di CSF è di sangue. Un totale di quattru cicli di panning in vivo sò stati realizati in i quali i dui rami selezziunati sò stati almacenati separatamente è analizzati durante i primi trè cicli di selezzione. Tutti l'inserti di fagi estratti da u CSF da i primi dui cicli di selezzione sò stati sottumessi à pirosequenziamentu 454/Roche, mentre chì tutti i cloni estratti da u CSF da l'ultimi dui cicli di selezzione sò stati sequenziati manualmente. Tutti i fagi di u sangue di u primu ciclu di selezzione sò stati ancu sottumessi à pirosequenziamentu 454/Roche. Per l'iniezione di cloni di fagi, i fagi selezziunati sò stati amplificati in E. coli (BL5615) nantu à piastre di 500 cm2 à 37°C per 4 ore. I cloni selezziunati individualmente è sequenziati manualmente sò stati propagati in u mezu TB. Dopu l'estrazione di i fagi, a purificazione è a rimozione di l'endotossina (cum'è descrittu sopra), 2×1010 fagi/animale in 300 μl sò stati iniettati per via intravenosa in una vena di coda.
Preelaborazione è filtrazione qualitativa di i dati di sequenza. I dati grezzi 454/Roche sò stati cunvertiti da un furmatu binariu di mappa di flussu standard (sff) à un furmatu leggibile da l'omu Pearson (fasta) utilizendu u software di u venditore. L'ulteriore elaborazione di a sequenza di nucleotidi hè stata realizata utilizendu prugrammi è script C pruprietarii (pacchettu software micca publicatu) cum'è descrittu quì sottu. L'analisi di i dati primari include procedure di filtrazione multi-stadio strette. Per filtrà e letture chì ùn cuntenenu micca una sequenza di DNA d'insertu 12mer valida, e letture sò state allineate sequenzialmente à l'etichetta di partenza (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), l'etichetta di fine (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) è l'insertu di fondu (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) utilizendu u test globale Needleman-Wunsch. L'allineamentu permette finu à 2 incongruenze per allineamentu31. Dunque, e letture senza tag di partenza è di fine è e letture chì cuntenenu inserti di fondu, vale à dì, allineamenti chì superanu u numeru permessu di discrepanze, sò state rimosse da a biblioteca. In quantu à e letture rimanenti, a sequenza di DNA N-mer chì si estende da a marca di partenza è finisce prima di a marca di stop hè stata escisa da a sequenza di lettura originale è ulteriormente processata (in seguitu chjamata "insertu"). Dopu a traduzzione di l'insertu, a parte dopu à u primu codon di stop à l'estremità 5' di u primer hè eliminata da l'insertu. Inoltre, sò stati ancu eliminati i nucleotidi chì portanu à codoni incompleti à l'estremità 3' di u primer. Per escludere l'inserti chì cuntenenu solu sequenze di fondu, sò stati ancu eliminati l'inserti tradotti chì cumincianu cù u mudellu di aminoacidi "PAG". I peptidi cù una lunghezza post-traduzionale inferiore à 3 aminoacidi sò stati eliminati da a biblioteca. Infine, eliminate a ridondanza in u pool di inserti è determinate a frequenza di ogni insertu unicu. I risultati di sta analisi includenu una lista di sequenze di nucleotidi (inserti) è e so frequenze (di lettura) (Figure Supplementari 1c è 2).
Raggruppà l'inserti di DNA N-mer per similarità di sequenza: Per eliminà l'errori di sequenziamentu specifichi di 454/Roche (cum'è i prublemi cù u sequenziamentu di l'estensioni di l'omopolimeri) è rimuovere e ridondanze menu impurtanti, l'inserti di sequenza di DNA N-mer filtrati prima (inserti) sò urdinati per similarità. inserzioni (finu à 2 basi non currispondenti permesse) utilizendu un algoritmu iterativu definitu cusì: l'inserzioni sò urdinate prima per a so frequenza (da a più alta à a più bassa), è s'elle sò listesse, per u so urdinamentu secundariu per lunghezza (da a più longa à a più corta)). Cusì, l'inserzioni più frequenti è più lunghe definiscenu u primu "gruppu". A frequenza di u gruppu hè impostata à a frequenza chjave. Dopu, ogni inserzione restante in a lista urdinata hè stata pruvata à esse aghjunta à u gruppu per allineamentu Needleman-Wunsch à coppie. Se u numeru di discrepanze, inserzioni o delezioni in un allineamentu ùn supera micca una soglia di 2, una inserzione hè aghjunta à u gruppu, è a frequenza generale di u gruppu hè aumentata per a frequenza di l'aghjunta di l'inserzione. L'inserti aghjunti à un gruppu sò marcati cum'è usati è esclusi da l'ulteriore trasfurmazione. Sè a sequenza d'inserzione ùn pò esse aghjunta à un gruppu digià esistente, a sequenza d'inserzione hè aduprata per creà un novu gruppu cù a frequenza d'inserzione adatta è marcata cum'è aduprata. L'iterazione finisce quandu ogni sequenza d'inserzione hè stata aduprata per furmà un novu gruppu o pò esse inclusa in un gruppu digià esistente. Dopu tuttu, l'inserti raggruppati custituiti da nucleotidi sò infine tradutti in sequenze peptidiche (biblioteche di peptidi). U risultatu di sta analisi hè un inseme d'inserzioni è e so frequenze currispondenti chì custituiscenu u numeru di letture consecutive (Figura Supplementare 2).
Generazione di Motivi: Basatu annantu à una lista di peptidi unichi, hè stata creata una biblioteca chì cuntene tutti i pussibuli mudelli di aminoacidi (aa) cum'è mostratu quì sottu. Ogni pussibule mudellu di lunghezza 3 hè statu estrattu da u peptide è u so mudellu inversu hè statu aghjuntu inseme cù una biblioteca di motivi cumuna chì cuntene tutti i mudelli (tripeptidi). E biblioteche di motivi altamente ripetitivi sò state sequenziate è a ridondanza hè stata eliminata. Dopu, per ogni tripeptide in a biblioteca di motivi, avemu verificatu a so presenza in a biblioteca utilizendu strumenti computazionali. In questu casu, a frequenza di u peptide chì cuntene u tripeptide di mutivu trovu hè aghjunta è assignata à u mutivu in a biblioteca di motivi ("numeru di motivi"). U risultatu di a generazione di motivi hè un array bidimensionale chì cuntene tutte l'occorrenze di tripeptidi (motivi) è i so rispettivi valori, chì sò u numeru di letture di sequenziamentu chì risultanu in u mutivu currispundente quandu e letture sò filtrate, raggruppate è tradutte. Metriche cum'è descritte in dettagliu sopra.
Nurmalizazione di u numeru di motivi è di i grafici di dispersione currispondenti: U numeru di motivi per ogni campione hè statu nurmalizatu aduprendu
induve ni hè u numeru di letture chì cuntenenu u tema i. Cusì, vi rapprisenta a frequenza percentuale di letture (o peptidi) chì cuntenenu u mutivu i in u campione. I valori P per u numeru micca nurmalizatu di mutivi sò stati calculati cù u test esattu di Fisher. In quantu à i correlogrammi di u numeru di mutivi, e correlazioni di Spearman sò state calculate cù u numeru nurmalizatu di mutivi cù R.
Per visualizà u cuntenutu di l'aminoacidi in ogni pusizione in a biblioteca di peptidi, sò stati creati i logogrammi web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Prima, u cuntenutu di l'aminoacidi in ogni pusizione di u peptide 12-mer hè almacenatu in una matrice 20 × 12. Dopu, un inseme di 1000 peptidi chì cuntenenu u listessu cuntenutu relativu di l'aminoacidi in ogni pusizione hè generatu in furmatu fasta-sequence è furnitu cum'è input à web-logo 3, chì genera una rapprisentazione grafica di u cuntenutu relativu di l'aminoacidi in ogni pusizione per una data biblioteca di peptidi. Per visualizà i datasets multidimensionali, sò state create mappe di calore utilizendu un strumentu sviluppatu internamente in R (biosHeatmap, un pacchettu R chì deve esse ancu publicatu). I dendrogrammi presentati in e mappe di calore sò stati calculati utilizendu u metudu di clustering gerarchicu di Ward cù a metrica di distanza euclidea. Per l'analisi statistica di i dati di puntuazione di motivi, i valori P per u puntuazione micca nurmalizzata sò stati calculati utilizendu u test esattu di Fisher. I valori P per altri datasets sò stati calculati in R aduprendu u test t di Student o ANOVA.
I cloni di fagi selezziunati è i fagi senza inserti sò stati iniettati per via intravenosa via a vena caudale (2 × 1010 fagi/animale in 300 μl di PBS). Dece minuti prima di a perfusione è a fissazione successiva, i stessi animali sò stati iniettati per via intravenosa cù 100 μl di lectina marcata cù DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuti dopu l'iniezione di fagi, i ratti sò stati perfusi attraversu u core cù 50 ml di PBS seguitu da 50 ml di 4% PFA/PBS. I campioni di cervellu sò stati ancu fissati durante a notte in 4% PFA/PBS è immersi in 30% di saccarosio durante a notte à 4°C. I campioni sò congelati rapidamente in a mistura OCT. L'analisi immunoistochimica di campioni congelati hè stata realizata à temperatura ambiente nantu à criosezioni di 30 µm bluccate cù 1% BSA è incubate cù anticorpi policlonali marcati cù FITC contr'à u fagu T7 (Novus NB 600-376A) à 4 °C. Incubate per tutta a notte. Infine, e sezioni sò state lavate 3 volte cù PBS è esaminate cù un microscopiu laser cunfocale (Leica TCS SP5).
Tutti i peptidi cù una purità minima di 98% sò stati sintetizati da GenScript USA, biotinilati è liofilizzati. A biotina hè ligata per mezu di un distanziatore di glicina tripla supplementariu à l'N-terminale. Verificate tutti i peptidi cù a spettrometria di massa.
A streptavidina (Sigma S0677) hè stata mischiata cù un eccessu equimolare di 5 volte di peptide biotinilatu, peptide inibitore BACE1 biotinilatu, o una cumminazione (rapportu 3:1) di peptide inibitore BACE1 biotinilatu è peptide inibitore BACE1 in 5-10% DMSO/incubatu in PBS. 1 ora à temperatura ambiente prima di l'iniezione. I peptidi cuniugati cù streptavidina sò stati iniettati per via intravenosa à una dosa di 10 mg/kg in una di e vene di a coda di i ratti cù una cavità cerebrale.
A cuncentrazione di cumplessu streptavidina-peptide hè stata valutata per ELISA. E piastre di microtitolazione Nunc Maxisorp (Sigma) sò state rivestite per una notte à 4°C cù 1,5 μg/ml di anticorpu di topo anti-streptavidina (Thermo, MA1-20011). Dopu u bluccamentu (buffer di bloccu: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatina, 1% BSA) à temperatura ambiente per 2 ore, lavate a piastra cù 0,05% Tween-20/PBS (buffer di lavaggio) per 3 secondi, i campioni di CSF è plasma sò stati aghjunti à i pozzetti diluiti cù buffer di bloccu (plasma 1:10.000, CSF 1:115). A piastra hè stata poi incubata per una notte à 4°C cù anticorpu di rilevazione (1 μg/ml, anti-streptavidina-HRP, Novus NB120-7239). Dopu à trè tappe di lavaggio, a streptavidina hè stata rilevata per incubazione in una soluzione di substratu TMB (Roche) finu à 20 minuti. Dopu avè firmatu u sviluppu di u culore cù 1M H2SO4, misurate l'assorbanza à 450 nm.
A funzione di u cumplessu inhibitore di streptavidina-peptide-BACE1 hè stata valutata da Aβ(1-40) ELISA secondu u protocolu di u fabricatore (Wako, 294-64701). In breve, i campioni di CSF sò stati diluiti in diluente standard (1:23) è incubati durante a notte à 4°C in piastre à 96 pozzetti rivestite cù anticorpu di cattura BNT77. Dopu à cinque passi di lavaggio, l'anticorpu BA27 cunjugatu cù HRP hè statu aghjuntu è incubatu per 2 ore à 4°C, seguitu da cinque passi di lavaggio. Aβ(1-40) hè statu rilevatu per incubazione in soluzione TMB per 30 minuti à temperatura ambiente. Dopu chì u sviluppu di u culore hè statu fermatu cù a soluzione di stop, misurate l'assorbanza à 450 nm. I campioni di plasma sò stati sottumessi à estrazione in fase solida prima di Aβ(1-40) ELISA. U plasma hè statu aghjuntu à 0,2% DEA (Sigma) in piastre à 96 pozzetti è incubatu à temperatura ambiente per 30 minuti. Dopu avè lavatu successivamente e piastre SPE (Oasis, 186000679) cù acqua è 100% metanolu, i campioni di plasma sò stati aghjunti à e piastre SPE è tuttu u liquidu hè statu eliminatu. I campioni sò stati lavati (prima cù 5% metanolu dopu 30% metanolu) è eluiti cù 2% NH4OH/90% metanolu. Dopu avè asciugatu l'eluatu à 55°C per 99 minuti à corrente costante di N2, i campioni sò stati ridutti in diluenti standard è Aβ(1–40) hè statu misuratu cum'è descrittu sopra.
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