Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com. Jūs izmantojat pārlūkprogrammas versiju ar ierobežotu CSS atbalstu. Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, iesakām izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer). Turklāt, lai nodrošinātu nepārtrauktu atbalstu, vietne tiek rādīta bez stiliem un JavaScript.
Vienlaikus parāda trīs slaidu karuseli. Izmantojiet pogas Iepriekšējais un Nākamais, lai vienlaikus pārvietotos starp trim slaidiem, vai arī izmantojiet slīdņa pogas galā, lai vienlaikus pārvietotos starp trim slaidiem.
Hematoencefāliskā un hematoencefāliskā barjera neļauj bioterapeitiskajiem līdzekļiem sasniegt savus mērķus centrālajā nervu sistēmā, tādējādi kavējot neiroloģisku slimību efektīvu ārstēšanu. Lai atklātu jaunus smadzeņu transportētājus in vivo, mēs ieviesām T7 fāgu peptīdu bibliotēku un sērijveidā savācām asinis un cerebrospinālo šķidrumu (CSF), izmantojot kanulētu apzinīgu žurku liela baseina modeli. Pēc četrām atlases kārtām specifiski fāgu kloni bija ļoti bagātināti CSF. Atsevišķu kandidātu peptīdu testēšana atklāja vairāk nekā 1000 reižu bagātināšanos CSF. Peptīdu mediētās piegādes smadzenēm bioaktivitāti apstiprināja amiloīda-β līmeņa samazināšanās cerebrospinālajā šķidrumā par 40%, izmantojot BACE1 peptīda inhibitoru, kas saistīts ar identificēto jauno tranzīta peptīdu. Šie rezultāti liecina, ka peptīdi, kas identificēti ar in vivo fāgu atlases metodēm, var būt noderīgi nesēji makromolekulu sistēmiskai piegādei smadzenēm ar terapeitisku efektu.
Centrālās nervu sistēmas (CNS) mērķterapijas pētījumi lielākoties ir vērsti uz optimizētu zāļu un līdzekļu, kam piemīt CNS mērķtiecīgas īpašības, identificēšanu, mazāk pūļu veltot mehānismu atklāšanai, kas veicina aktīvu zāļu piegādi smadzenēm. Tas tagad sāk mainīties, jo zāļu, īpaši lielu molekulu, piegāde ir neatņemama mūsdienu neirozinātnes zāļu izstrādes sastāvdaļa. Centrālās nervu sistēmas vidi labi aizsargā cerebrovaskulārā barjeras sistēma, kas sastāv no hematoencefāliskā barjeras (ASB) ​​un hematoencefāliskā barjera (BCBB)1, apgrūtinot zāļu piegādi smadzenēm1,2. Tiek lēsts, ka gandrīz visas lielmolekulu zāles un vairāk nekā 98% mazmolekulu zāļu tiek izvadītas no smadzenēm3. Tāpēc ir ļoti svarīgi identificēt jaunas smadzeņu transporta sistēmas, kas nodrošina efektīvu un specifisku terapeitisko zāļu piegādi CNS4,5. Tomēr ABS un BCSFB arī sniedz lielisku iespēju zāļu piegādei, jo tās iekļūst un nonāk visās smadzeņu struktūrās caur to plašo asinsvadu sistēmu. Tādējādi pašreizējie centieni izmantot neinvazīvas piegādes metodes smadzenēm lielā mērā balstās uz receptoru mediēta transporta (PMT) mehānismu, izmantojot endogēno BBB6 receptoru. Neskatoties uz nesenajiem būtiskajiem sasniegumiem, izmantojot transferīna receptoru ceļu7,8, ir nepieciešama jaunu piegādes sistēmu ar uzlabotām īpašībām tālāka izstrāde. Šajā nolūkā mūsu mērķis bija identificēt peptīdus, kas spēj mediēt cerebrospinālā šķidruma (CS) transportēšanu, jo tos principā varētu izmantot makromolekulu piegādei CNS vai jaunu receptoru ceļu atvēršanai. Jo īpaši specifiski cerebrovaskulārās sistēmas receptori un transportētāji (BBB un BSCFB) var kalpot kā potenciāli mērķi bioterapeitisko zāļu aktīvai un specifiskai piegādei. Cerebrospinālais šķidrums (CSF) ir horoidālā pinuma (CS) sekrēcijas produkts un atrodas tiešā saskarē ar smadzeņu intersticiālo šķidrumu caur subarahnoidālo telpu un kambaru telpu4. Nesen ir pierādīts, ka subarahnoidālais cerebrospinālais šķidrums pārmērīgi difundē smadzeņu intersticijā9. Mēs ceram piekļūt parenhīmas telpai, izmantojot šo subarahnoidālo ieplūdes traktu vai tieši caur BBB. Lai to panāktu, mēs ieviesām stabilu in vivo fāgu atlases stratēģiju, kas ideālā gadījumā identificē peptīdus, kurus transportē jebkurš no šiem diviem atšķirīgajiem ceļiem.
Tagad mēs aprakstām secīgu in vivo fāgu displeja skrīninga metodi ar cerebrospinālā šķidruma (CSF) paraugu ņemšanu apvienojumā ar augstas caurlaidības sekvencēšanu (HTS), lai uzraudzītu sākotnējās atlases kārtas ar vislielāko bibliotēkas daudzveidību. Skrīnings tika veikts ar pie samaņas esošām žurkām ar pastāvīgi implantētu lielu cisternas (CM) kanulu, lai izvairītos no asins piesārņojuma. Svarīgi ir tas, ka šī pieeja atlasa gan uz smadzenēm vērstus peptīdus, gan peptīdus ar transporta aktivitāti pāri cerebrovaskulārajai barjerai. Mēs izmantojām T7 fāgus to mazā izmēra (~60 nm)10 dēļ un ieteicām, ka tie ir piemēroti pūslīšu transportēšanai, kas ļauj transcelulāri šķērsot endotēlija un/vai epitēlija-serdes barjeru. Pēc četrām panoramēšanas kārtām tika izolētas fāgu populācijas, kas uzrādīja spēcīgu in vivo CSF ​​bagātināšanos un smadzeņu mikrovadu asociāciju. Svarīgi ir tas, ka mēs varējām apstiprināt savus atklājumus, pierādot, ka vēlamie un ķīmiski sintezētie labākie kandidātpeptīdi spēj transportēt olbaltumvielu kravu cerebrospinālajā šķidrumā. Vispirms CNS farmakodinamiskā iedarbība tika noteikta, apvienojot vadošo tranzīta peptīdu ar BACE1 peptīda inhibitoru. Papildus tam, ka in vivo funkcionālās skrīninga stratēģijas var pierādīt, ka jauni smadzeņu transporta peptīdi ir efektīvi olbaltumvielu kravu nesēji, mēs sagaidām, ka līdzīgas funkcionālās atlases pieejas kļūs svarīgas arī jaunu smadzeņu transporta ceļu identificēšanā.
Pamatojoties uz plāksnītes veidojošajām vienībām (PFU), pēc fāgu iepakošanas posma tika izstrādāta un izveidota nejaušu 12-mer lineāru T7 fāgu peptīdu bibliotēka ar aptuveni 109 daudzveidību (skatīt Materiāli un metodes). Ir svarīgi atzīmēt, ka pirms in vivo panoramēšanas mēs rūpīgi analizējām šo bibliotēku. Fāgu bibliotēkas paraugu PCR amplifikācija, izmantojot modificētus praimerus, ģenerēja amplikonus, kas bija tieši piemērojami HTS (1.a papildattēls). Sakarā ar a) HTS11 sekvencēšanas kļūdām, b) ietekmi uz praimeru (NNK)1-12 kvalitāti un c) savvaļas tipa (wt) fāgu (skeleta ieliktņu) klātbūtni gaidīšanas bibliotēkā, tika ieviesta sekvences filtrēšanas procedūra, lai iegūtu tikai pārbaudītu sekvences informāciju (1.b papildattēls). Šīs filtrēšanas darbības attiecas uz visām HTS sekvencēšanas bibliotēkām. Standarta bibliotēkai tika iegūti kopumā 233 868 lasījumi, no kuriem 39% izturēja filtrēšanas kritērijus un tika izmantoti bibliotēkas analīzei un atlasei nākamajām kārtām (1.c–e papildattēls). Nolasījumi pārsvarā bija 3 bāzes pāru garuma daudzkārtņi ar maksimumu pie 36 nukleotīdiem (1.c papildattēls), apstiprinot bibliotēkas dizainu (NNK) 1-12. Jāatzīmē, ka aptuveni 11% bibliotēkas locekļu saturēja 12 dimensiju savvaļas tipa (wt) mugurkaula PAGISRELVDKL ieliktni, un gandrīz puse no sekvencēm (49%) saturēja ieliktņus vai delēcijas. Bibliotēkas bibliotēkas HTS apstiprināja lielo peptīdu daudzveidību bibliotēkā: vairāk nekā 81% peptīdu sekvenču tika atrastas tikai vienu reizi, un tikai 1,5% parādījās ≥4 kopijās (2.a papildattēls). Aminoskābju (aa) frekvences visās 12 pozīcijās repertuārā labi korelēja ar biežumiem, kas paredzēti deģenerētā NKK repertuāra ģenerēto kodonu skaitam (2.b papildattēls). Novērotā aminoskābju atlikumu biežums, ko kodē šie ieliktņi, labi korelēja ar aprēķināto frekvenci (r = 0,893) (2.c papildattēls). Fāgu bibliotēku sagatavošana injekcijai ietver amplifikācijas un endotoksīna noņemšanas soļus. Iepriekš ir pierādīts, ka tas potenciāli samazina fāgu bibliotēku daudzveidību12,13. Tāpēc mēs sekvencējām uz plāksnes amplificētu fāgu bibliotēku, kas bija pakļauta endotoksīna atdalīšanai, un salīdzinājām to ar sākotnējo bibliotēku, lai novērtētu AA biežumu. Tika novērota spēcīga korelācija (r = 0,995) starp sākotnējo kopumu un amplificēto un attīrīto kopumu (2.d papildattēls), kas norāda, ka konkurence starp kloniem, kas amplificēti uz plāksnēm, izmantojot T7 fāgu, neizraisīja būtisku novirzi. Šis salīdzinājums ir balstīts uz tripeptīdu motīvu biežumu katrā bibliotēkā, jo bibliotēku daudzveidību (~109) nevar pilnībā uztvert pat ar HTS. AA frekvences analīze katrā pozīcijā atklāja nelielu no pozīcijas atkarīgu novirzi ievadītā repertuāra pēdējās trīs pozīcijās (2.e papildattēls). Noslēgumā mēs secinājām, ka bibliotēkas kvalitāte un daudzveidība bija pieņemama, un tika novērotas tikai nelielas izmaiņas daudzveidībā, pateicoties amplifikācijai un fāgu bibliotēku sagatavošanai starp vairākām atlases kārtām.
Seriālu cerebrospinālā šķidruma paraugu ņemšanu var veikt, ķirurģiski implantējot kanulu apzinīgu žurku cerebrospinālā šķidruma (CM) dobumā, lai atvieglotu intravenozi (iv) caur BBB un/vai BCSFB injicēta T7 fāga identificēšanu (1.a-b att.). Pirmajās trīs in vivo atlases kārtās mēs izmantojām divas neatkarīgas atlases rokas (A un B rokas) (1.c att.). Pakāpeniski palielinājām atlases stingrību, samazinot pirmajās trīs atlases kārtās ievadītā fāga kopējo daudzumu. Ceturtajā panoramēšanas kārtā mēs apvienojām paraugus no A un B atzariem un veicām trīs papildu neatkarīgas atlases. Lai pētītu T7 fāga daļiņu īpašības in vivo šajā modelī, savvaļas tipa fāgs (PAGISRELVDKL galvenais ieliktnis) tika injicēts žurkām caur astes vēnu. Fāgu atgūšana no cerebrospinālā šķidruma un asinīm dažādos laika punktos parādīja, ka relatīvi maziem T7 ikosaedriskiem fāgiem bija ātra sākotnējā klīrensa fāze no asins nodalījuma (3. papildattēls). Pamatojoties uz ievadītajiem titriem un žurku asins tilpumu, mēs aprēķinājām, ka 10 minūtes pēc intravenozas injekcijas asinīs tika konstatēts tikai aptuveni 1% fāga svara no ievadītās devas. Pēc šī sākotnējā straujā samazinājuma tika mērīts lēnāks primārais klīrenss ar pusperiodu 27,7 minūtes. Svarīgi, ka no cerebrospinālā šķidruma nodalījuma tika iegūts tikai ļoti maz fāgu, kas norāda uz zemu fonu savvaļas tipa fāgu migrācijai cerebrospinālajā šķidrumā (3. papildattēls). Vidēji visā paraugu ņemšanas periodā (0–250 min) cerebrospinālajā šķidrumā tika konstatēti tikai aptuveni 1 x 10-3% T7 fāga titru asinīs un 4 x 10-8% sākotnēji ievadīto fāgu. Jāatzīmē, ka savvaļas tipa fāga pusperiods (25,7 min) cerebrospinālajā šķidrumā bija līdzīgs tam, kas novērots asinīs. Šie dati liecina, ka barjera, kas atdala cerebrospinālā šķidruma (CSF) nodalījumu no asinīm, CM kanulētām žurkām ir neskarta, ļaujot in vivo atlasīt fāgu bibliotēkas, lai identificētu klonus, kas no asinīm viegli transportējas CSF nodalījumā.
(a) Metodes izveide atkārtotai cerebrospinālā šķidruma (CSF) paraugu ņemšanai no liela kopuma. (b) Diagramma, kurā parādīta centrālās nervu sistēmas (CNS) barjeras atrašanās vieta šūnās un atlases stratēģija, kas izmantota, lai identificētu peptīdus, kas šķērso hematoencefālisko barjeru (HEB) un hematoencefālisko barjeru. (c) In vivo fāgu displeja skrīninga blokshēma. Katrā atlases kārtā fāgi (dzīvnieku identifikatori bultiņu iekšpusē) tika injicēti intravenozi. Divas neatkarīgas alternatīvās atzaras (A, B) tiek turētas atsevišķi līdz 4. atlases kārtai. 3. un 4. atlases kārtā katrs no CSF ​​iegūtais fāgu klons tika manuāli sekvencēts. (d) Fāgu, kas izolēti no asinīm (sarkani apļi) un cerebrospinālā šķidruma (zaļi trīsstūri) pirmajā atlases kārtā divām kanulētām žurkām pēc T7 peptīdu bibliotēkas intravenozas injekcijas (2 x 1012 fāgi/dzīvnieks), kinētika. Zilie kvadrāti norāda vidējo sākotnējo fāga koncentrāciju asinīs, kas aprēķināta no injicētā fāga daudzuma, ņemot vērā kopējo asins tilpumu. Melnie kvadrāti norāda y līnijas krustpunktu, kas ekstrapolēts no asins fāgu koncentrācijām. (e, f) Attēlo visu iespējamo pārklājošo tripeptīdu motīvu relatīvo biežumu un sadalījumu peptīdā. Attēlots 1000 nolasījumos atrasto motīvu skaits. Ar sarkaniem punktiem ir atzīmēti nozīmīgi (p < 0,001) bagātinātie motīvi. (e) Korelācijas izkliedes diagramma, kurā salīdzināta injicētās bibliotēkas tripeptīdu motīva relatīvā biežums ar no asinīm iegūtu fāgu no dzīvniekiem Nr. 1.1 un Nr. 1.2. (f) Korelācijas izkliedes diagramma, kurā salīdzināta asinīs un cerebrospinālajā šķidrumā izolēto dzīvnieku fāgu tripeptīdu motīvu Nr. 1.1 un Nr. 1.2 relatīvā biežums. (g, h) Asinīs bagātinātā fāga secības ID attēlojums (g) salīdzinājumā ar injicētajām bibliotēkām un cerebrospinālajā šķidrumā bagātinātā fāga secības ID attēlojums (g) salīdzinājumā ar injicētajām bibliotēkām un CSF bagātinātā fāga secības ID attēlojums salīdzinājumā ar asinīm pēc in vivo atlases kārtas abiem dzīvniekiem. Vienburta koda lielums norāda, cik bieži šī aminoskābe rodas šajā pozīcijā. Zaļa = polāra, violeta = neitrāla, zila = bāzīga, sarkana = skāba un melna = hidrofobas aminoskābes. 1.a, b attēlu izstrādāja un izgatavoja Eduards Urihs.
Mēs injicējām fāgu peptīdu bibliotēku divām CM instrumentu žurkām (A un B klade) un izolējām fāgu no cerebrospinālā šķidruma un asinīm (1.d attēls). Sākotnēji straujā bibliotēkas klīrenss bija mazāk izteikts salīdzinājumā ar savvaļas tipa fāgu. Injicētās bibliotēkas vidējais pussabrukšanas periods abiem dzīvniekiem bija 24,8 minūtes asinīs, līdzīgi kā savvaļas tipa fāgam, un 38,5 minūtes cerebrospinālajā šķidrumā. Katra dzīvnieka asins un cerebrospinālā šķidruma fāgu paraugi tika pakļauti HTS, un visi identificētie peptīdi tika analizēti, lai noteiktu īsa tripeptīdu motīva klātbūtni. Tripeptīdu motīvi tika izvēlēti, jo tie nodrošina minimālu pamatu struktūras veidošanai un peptīdu-olbaltumvielu mijiedarbībai14,15. Mēs atradām labu korelāciju motīvu sadalījumā starp injicēto fāgu bibliotēku un kloniem, kas ekstrahēti no abu dzīvnieku asinīm (1.e attēls). Dati liecina, ka bibliotēkas sastāvs asins nodalījumā ir tikai nedaudz bagātināts. Aminoskābju frekvences un konsensa secības tika tālāk analizētas katrā pozīcijā, izmantojot Weblogo16 programmatūras adaptāciju. Interesanti, ka mēs atradām spēcīgu glicīna atlikumu bagātināšanos asinīs (1.g att.). Salīdzinot asinis ar no cerebrospinālā šķidruma atlasītiem kloniem, tika novērota spēcīga motīvu atlase un zināma motīvu deselekcija (1.f att.), un noteiktas aminoskābes 12 locekļu struktūrā galvenokārt atradās iepriekš noteiktās pozīcijās (1.h att.). Jāatzīmē, ka atsevišķi dzīvnieki būtiski atšķīrās cerebrospinālajā šķidrumā, savukārt abiem dzīvniekiem tika novērota glicīna bagātināšanās asinīs (4.a–j. papildattēls). Pēc stingras secības datu filtrēšanas dzīvnieku Nr. 1.1 un Nr. 1.2 cerebrospinālajā šķidrumā tika iegūti kopumā 964 un 420 unikāli 12-mer peptīdi (1.d–e. papildattēls). Izolētie fāgu kloni tika amplificēti un pakļauti otrajai in vivo atlases kārtai. No otrās atlases kārtas iegūtie fāgi tika pakļauti HTS katrā dzīvniekā, un visi identificētie peptīdi tika izmantoti kā ievade motīvu atpazīšanas programmā, lai analizētu tripeptīdu motīvu rašanos (2.a, b, ef att.). Salīdzinot ar pirmo no cerebrospinālā šķidruma (CSF) atgūtā fāga ciklu, mēs novērojām daudzu motīvu turpmāku atlasi un atlases zudumu CSF A un B atzaros (2. att.). Lai noteiktu, vai tie pārstāv dažādus konsekventas secības modeļus, tika izmantots tīkla identifikācijas algoritms. Tika novērota skaidra līdzība starp 12 dimensiju sekvencēm, kas atgūtas ar CSF alternatīvajā A kladē (2.c, d att.) un B kladē (2.g, h att.). Apvienotā analīze katrā atzarā atklāja atšķirīgus atlases profilus 12 mer peptīdiem (5.c, d papildatt.) un CSF/asins titra attiecības palielināšanos laika gaitā apvienotajiem kloniem pēc otrās atlases kārtas, salīdzinot ar pirmo atlases kārtu (5.e papildatt.).
Motīvu un peptīdu bagātināšana cerebrospinālajā šķidrumā, izmantojot divas secīgas in vivo funkcionālās fāgu displeja atlases kārtas.
Visi cerebrospinālā šķidruma fāgi, kas tika atgūti no katra dzīvnieka pirmās kārtas (dzīvnieki Nr. 1.1 un Nr. 1.2), tika apvienoti, amplificēti, HT sekvencēti un atkārtoti injicēti kopā (2 x 1010 fāgi/dzīvnieks) 2 SM kanulētām žurkām (Nr. 1.1 → Nr. 2.1 un 2.2, 1.2 → 2.3 un 2.4). (a, b, e, f) Korelācijas izkliedes diagrammas, kas salīdzina visu no CSF ​​iegūto fāgu tripeptīdu motīvu relatīvo biežumu pirmajā un otrajā atlases kārtā. Motīvu relatīvais biežums un sadalījums, kas pārstāv visus iespējamos pārklājošos tripeptīdus, kas atrodami peptīdos abās orientācijās. Parādīts 1000 lasījumos atrasto motīvu skaits. Motīvi, kas tika nozīmīgi (p < 0,001) atlasīti vai izslēgti vienā no salīdzinātajām bibliotēkām, ir iezīmēti ar sarkaniem punktiem. (c, d, g, h) Visu CSF bagāto 12 aminoskābju garo sekvenču secības logotipa attēlojums, pamatojoties uz in vivo atlases 2. un 1. kārtu. Vienburta koda lielums norāda, cik bieži šī aminoskābe rodas šajā pozīcijā. Lai attēlotu logotipu, tiek salīdzināta no atsevišķiem dzīvniekiem iegūto CSF ​​sekvenču biežums starp divām atlases kārtām, un tiek parādītas bagātinātās sekvences otrajā kārtā: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 un (h) #1.2–#2.4. Visvairāk bagātinātās aminoskābes noteiktā pozīcijā (c, d) dzīvniekiem Nr. 2.1 un Nr. 2.2 vai (g, h) dzīvniekiem Nr. 2.3 un Nr. 2.4 ir attēlotas krāsaini. Zaļa = polāra, violeta = neitrāla, zila = bāziska, sarkana = skāba un melna = hidrofobas aminoskābes.
Pēc trešās atlases kārtas mēs identificējām 124 unikālas peptīdu sekvences (#3.1 un #3.2) no 332 CSF rekonstituētiem fāgu kloniem, kas izolēti no diviem dzīvniekiem (6.a papildattēls). Secībai LGSVS (18,7%) bija visaugstākā relatīvā proporcija, kam sekoja savvaļas tipa ieliktņi PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) un SARGSWREIVSLS (2,2%). Pēdējā ceturtajā kārtā mēs apvienojām divus neatkarīgi atlasītus zarus no trim atsevišķiem dzīvniekiem (1.c att.). No 925 sekvencētajiem fāgu kloniem, kas atgūti no CSF, ceturtajā kārtā mēs atradām 64 unikālas peptīdu sekvences (6.b papildattēls), starp kurām savvaļas tipa fāgu relatīvā proporcija samazinājās līdz 0,8%. Visbiežāk sastopamie CSF kloni ceturtajā kārtā bija LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) un RLSSVDSDLSGC (3, 2%).). Atlasīto peptīdu garuma diapazons ir saistīts ar nukleotīdu ievietojumiem/delēcijām vai priekšlaicīgiem stopkodoniem bibliotēkas praimeros, izmantojot deģenerētus kodonus NNK bibliotēkas dizainam. Priekšlaicīgi stopkodoni ģenerē īsākus peptīdus un tiek atlasīti, jo tie satur labvēlīgo aminoskābju motīvu. Garāki peptīdi var rasties ievietojumu/delēciju rezultātā sintētisko bibliotēku praimeros. Tas novieto izstrādāto stopkodonu ārpus rāmja un nolasa to, līdz lejpus parādās jauns stopkodons. Kopumā mēs aprēķinājām bagātināšanas koeficientus visām četrām atlases kārtām, salīdzinot ievades datus ar parauga izejas datiem. Pirmajā skrīninga kārtā mēs izmantojām savvaļas tipa fāgu titrus kā nespecifisku fona atsauci. Interesanti, ka negatīvā fāgu atlase bija ļoti spēcīga pirmajā cerebrospinālā šķidruma (CSF) ciklā, bet ne asinīs (3.a att.), kas varētu būt saistīts ar zemo vairuma peptīdu bibliotēkas locekļu pasīvās difūzijas varbūtību CSF nodalījumā vai arī relatīvie fāgi mēdz efektīvāk tikt aizturēti vai izvadīti no asinsrites nekā bakteriofāgi. Tomēr otrajā panning kārtā abās kladēs tika novērota spēcīga fāgu atlase CSF, kas liecina, ka iepriekšējā kārtā bija bagātināti fāgi, kas demonstrēja peptīdus, kas veicina CSF uzņemšanu (3.a att.). Atkal bez ievērojamas asiņu bagātināšanās. Arī trešajā un ceturtajā kārtā fāgu kloni bija ievērojami bagātināti CSF. Salīdzinot katras unikālās peptīdu secības relatīvo biežumu starp pēdējām divām atlases kārtām, mēs atklājām, ka ceturtajā atlases kārtā secības bija vēl bagātākas (3.b att.). Izmantojot abas peptīdu orientācijas, no visām 64 unikālajām peptīdu sekvencēm tika iegūti kopumā 931 tripeptīdu motīvi. Ceturtajā kārtā visvairāk bagātinātie motīvi tika rūpīgāk pārbaudīti, lai noteiktu to bagātināšanas profilus visās kārtās, salīdzinot ar ievadīto bibliotēku (robežvērtība: 10% bagātinājums) (6.c papildinājums). Vispārējie atlases modeļi parādīja, ka lielākā daļa pētīto motīvu bija bagātināti visās iepriekšējās abu atlases atzaru kārtās. Tomēr daži motīvi (piemēram, SGL, VSG, LGS GSV) galvenokārt bija no alternatīvās A klades, bet citi (piemēram, FGW, RTN, WGF, NTR) bija bagātināti alternatīvajā B kladē.
CSF bagātinātu fāgu attēlotu peptīdu un biotinilētu līderpeptīdu, kas konjugēti ar streptavidīna lietderīgo slodzi, CSF transporta validācija.
(a) Bagātināšanas koeficienti, kas aprēķināti visās četrās kārtās (R1–R4), pamatojoties uz injicētajiem (ievades = I) fāgu (PFU) titriem un noteiktajiem CSF fāgu titriem (izvades = O). Pēdējo trīs kārtu (R2–R4) bagātināšanas koeficienti tika aprēķināti, salīdzinot ar iepriekšējo kārtu un pirmo kārtu (R1) ar svara datiem. Atvērtie stabiņi ir cerebrospinālais šķidrums, iekrāsotie stabiņi ir plazma. (***p<0,001, pamatojoties uz Stjudenta t-testu). (b) Visbiežāk sastopamo fāgu peptīdu saraksts, kas sakārtoti pēc to relatīvās proporcijas pret visiem fāgiem, kas savākti CSF pēc 4. atlases kārtas. Seši visbiežāk sastopamie fāgu kloni ir iezīmēti krāsā, numurēti, un to bagātināšanas koeficienti starp 3. un 4. atlases kārtu (ieliktņi). (c, d) Seši visvairāk bagātinātie fāgu kloni, tukšie fāgi un vecāku fāgu peptīdu bibliotēkas no 4. kārtas tika analizēti individuāli CSF paraugu ņemšanas modelī. CSF un asins paraugi tika savākti norādītajos laika punktos. (c) Vienāds daudzums 6 kandidātu fāgu klonu (2 x 1010 fāgi/dzīvnieki), tukšu fāgu (#1779) (2 x 1010 fāgi/dzīvnieki) un fāgu peptīdu krājumu bibliotēku (2 x 1012 fāgi/dzīvnieki). Kanulētajam dzīvniekam atsevišķi caur astes vēnu injicē vismaz 3 CM. Parādīta katra injicētā fāgu klona un fāgu peptīdu bibliotēkas CSF farmakokinētika laika gaitā. (d) parādīta visu atgūto fāgu/ml vidējā CSF/asiņu attiecība paraugu ņemšanas laikā. (e) Četri sintētiskie līderpeptīdi un viens sajaukts kontroles paraugs tika savienoti ar biotīnu pie streptavidīna caur to N-galu (tetramēru displejs), kam sekoja injekcija (astes vēnā i.v., 10 mg streptavidīna/kg). Vismaz trīs intubētas žurkas (N = 3). CSF paraugi tika savākti norādītajos laika punktos, un streptavidīna koncentrācijas tika mērītas ar CSF anti-streptavidīna ELISA (nd = nav konstatēts). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, pamatojoties uz ANOVA testu). (f) Visbagātinātākā fāga peptīda klona #2002 (violets) aminoskābju secības salīdzinājums ar citiem atlasītajiem fāga peptīdu kloniem no 4. atlases kārtas. Identiski un līdzīgi aminoskābju fragmenti ir iekrāsoti.
No visiem bagātinātajiem fāgiem ceturtajā kārtā (3.b att.) seši kandidātu kloni tika atlasīti tālākai individuālai analīzei CSF paraugu ņemšanas modelī. Vienāds daudzums sešu kandidātu fāgu, tukšu fāgu (bez ieliktņa) un profāgu peptīdu bibliotēku tika injicēts trīs kanulētos CM dzīvniekos, un farmakokinētika tika noteikta CSF (3.c att.) un asins (7. papildattēls) testos. Visi testētie fāgu kloni mērķēja uz CSF nodalījumu 10–1000 reižu augstākā līmenī nekā tukšajam kontroles fāgam (#1779). Piemēram, kloniem #2020 un #2077 bija aptuveni 1000 reižu augstāki CSF titri nekā kontroles fāgam. Katra atlasītā peptīda farmakokinētiskais profils ir atšķirīgs, taču visiem tiem ir augsta CSF iekļūšanas spēja. Kloniem #1903 un #2011 mēs novērojām pastāvīgu samazinājumu laika gaitā, savukārt kloniem #2077, #2002 un #2009 pieaugums pirmajās 10 minūtēs varētu liecināt par aktīvu transportu, taču tas ir jāpārbauda. Kloni Nr. 2020, Nr. 2002 un Nr. 2077 stabilizējās augstā līmenī, savukārt klona Nr. 2009 koncentrācija cerebrospinālajā šķidrumā (CSF) pēc sākotnējā pieauguma lēnām samazinājās. Pēc tam mēs salīdzinājām katra CSF kandidāta relatīvo biežumu ar tā koncentrāciju asinīs (3.d att.). Katra CSF kandidāta vidējā titra korelācija ar tā titru asinīs visos paraugu ņemšanas laikos parādīja, ka trīs no sešiem kandidātiem bija ievērojami bagātināti ar asins CSF. Interesanti, ka klons Nr. 2077 uzrādīja augstāku stabilitāti asinīs (7. papildattēls). Lai apstiprinātu, ka paši peptīdi spēj aktīvi transportēt CSF nodalījumā citas vielas, nevis fāgu daļiņas, mēs sintezējām četrus vadošos peptīdus, kas derivatizēti ar biotīnu N-galā, kur peptīdi piesaistās fāgu daļiņai. Biotinilētie peptīdi (Nr. 2002, 2009, 2020 un 2077) tika konjugēti ar streptavidīnu (SA), lai iegūtu multimēriskas formas, kas nedaudz atdarina fāgu ģeometriju. Šis formāts ļāva mums arī izmērīt SA iedarbību asinīs un cerebrospinālajā šķidrumā kā kravu transportējošus olbaltumvielu peptīdus. Svarīgi ir tas, ka fāgu datus bieži varēja reproducēt, kad sintētiskie peptīdi tika ievadīti šajā SA konjugētajā formātā (3.e att.). Sajauktajiem peptīdiem bija mazāka sākotnējā iedarbība un ātrāka cerebrospinālā šķidruma klīrenss ar nenosakāmu līmeni 48 stundu laikā. Lai iegūtu ieskatu šo peptīdu fāgu klonu piegādes ceļos CSF telpā, mēs analizējām atsevišķu fāgu peptīdu trāpījumu lokalizāciju, izmantojot imūnhistoķīmiju (IHC), lai tieši noteiktu fāgu daļiņas 1 stundu pēc intravenozas injekcijas in vivo. Jāatzīmē, ka klonus Nr. 2002, Nr. 2077 un Nr. 2009 varēja noteikt ar spēcīgu iekrāsošanos smadzeņu kapilāros, savukārt kontroles fāgs (Nr. 1779) un klons Nr. 2020 netika atklāti (8. papildattēls). Tas liecina, ka šie peptīdi veicina ietekmi uz smadzenēm tieši, šķērsojot BBB. Lai pārbaudītu šo hipotēzi, ir nepieciešama turpmāka detalizēta analīze, jo var būt iesaistīts arī BSCFB ceļš. Salīdzinot visbagātinātākā klona (#2002) aminoskābju secību ar citiem atlasītajiem peptīdiem, tika atzīmēts, ka dažiem no tiem ir līdzīgi aminoskābju pagarinājumi, kas var liecināt par līdzīgu transporta mehānismu (3.f att.).
Pateicoties unikālajam plazmas profilam un ievērojamajam cerebrospinālā šķidruma (CSF) pieaugumam laika gaitā, fāgu displeja klons Nr. 2077 tika tālāk pētīts ilgākā 48 stundu periodā un spēja reproducēt straujo CSF ​​pieaugumu, kas novērots saistībā ar ilgstošu SA līmeni (4.a att.). Attiecībā uz citiem identificētajiem fāgu kloniem Nr. 2077 spēcīgi iekrāsojās smadzeņu kapilāros un uzrādīja ievērojamu kolokalizāciju ar kapilāru marķiera lektīnu, skatoties augstākā izšķirtspējā, un, iespējams, zināmu iekrāsošanos parenhīmas telpā (4.b attēls). Lai izpētītu, vai CNS var iegūt peptīdu mediētu farmakoloģisku iedarbību, mēs veicām eksperimentu, kurā i) #2077 tranzīta peptīda un ii) BACE1 inhibitora peptīda biotinilētās versijas tika sajauktas ar SA divās dažādās attiecībās. Vienā kombinācijā mēs izmantojām tikai BACE1 peptīda inhibitoru, bet otrā kombinācijā mēs izmantojām BACE1 peptīda inhibitora un Nr. 2077 peptīda attiecību 1:3. Abi paraugi tika ievadīti intravenozi, un laika gaitā tika mērīts beta-amiloidā peptīda 40 (Abeta40) līmenis asinīs un cerebrospinālajā šķidrumā. Abeta40 tika mērīts cerebrospinālajā šķidrumā (CSF), jo tas atspoguļo BACE1 inhibīciju smadzeņu parenhīmā. Kā paredzēts, abi kompleksi ievērojami samazināja Abeta40 līmeni asinīs (4.c, d att.). Tomēr tikai paraugi, kas saturēja peptīda Nr. 2077 un ar SA konjugēta BACE1 peptīda inhibitora maisījumu, izraisīja ievērojamu Abeta40 līmeņa pazemināšanos cerebrospinālajā šķidrumā (4.c att.). Dati liecina, ka peptīds Nr. 2077 spēj transportēt 60 kDa SA proteīnu CNS un arī izraisa farmakoloģisku iedarbību kopā ar BACE1 peptīda SA konjugētiem inhibitoriem.
(a) T7 fāga klonāla injekcija (2 × 10 fāgi/dzīvnieks), kas parāda CSF peptīda Nr. 2077 (RLSSVDSDLSGC) un neinjicēta kontroles fāga (Nr. 1779) ilgtermiņa farmakokinētiskos profilus vismaz trim CM intubētām žurkām. (b) Fāgu injekciju saņēmušu žurku (2 × 10 10 fāgi/dzīvnieks) reprezentatīvu kortikālo mikrovadu konfokālais mikroskopiskais attēls, kas parāda peptīda Nr. 2077 un asinsvadu (lektīna) kontrastkrāsojumu. Šie fāgu kloni tika ievadīti 3 žurkām un pirms perfūzijas tiem ļāva cirkulēt 1 stundu. Smadzenes tika sagrieztas griezumos un iekrāsotas ar poliklonālām FITC iezīmētām antivielām pret T7 fāga kapsīdu. Desmit minūtes pirms perfūzijas un sekojošas fiksācijas intravenozi tika ievadīts ar DyLight594 iezīmēts lektīns. Fluorescējoši attēli, kas parāda lektīna iekrāsojumu (sarkanā krāsā) mikrovadu lūmena pusē un fāgu (zaļā krāsā) kapilāru lūmenā un perivaskulāros smadzeņu audos. Mēroga josla atbilst 10 µm. (c, d) Biotinilēts BACE1 inhibējošais peptīds atsevišķi vai kombinācijā ar biotinilētu tranzīta peptīdu Nr. 2077 tika savienots ar streptavidīnu, kam sekoja intravenoza injekcija vismaz trim kanulētām CM žurkām (10 mg streptavidīna/kg). BACE1 peptīda inhibitora mediētā Aβ40 samazināšanās tika mērīta ar Aβ1-40 ELISA asinīs (sarkanā krāsā) un cerebrospinālajā šķidrumā (oranžā krāsā) norādītajos laika punktos. Labākas skaidrības labad grafikā ir novilkta punktēta līnija 100 % mērogā. (c) Aβ40 procentuālā samazināšanās asinīs (sarkanie trīsstūri) un cerebrospinālajā šķidrumā (oranžie trīsstūri) žurkām, kuras ārstēja ar streptavidīnu, kas konjugēts ar tranzīta peptīdu Nr. 2077, un BACE1 inhibējošo peptīdu attiecībā 3:1. (d) Aβ40 procentuālā samazināšanās asinīs (sarkanie apļi) un cerebrospinālajā šķidrumā (oranži apļi) žurkām, kuras ārstēja tikai ar streptavidīnu, kas savienots tikai ar BACE1 inhibējošo peptīdu. Aβ koncentrācija kontroles grupā bija 420 pg/ml (standartnovirze = 101 pg/ml).
Fāgu attēlošana ir veiksmīgi pielietota vairākās biomedicīnas pētījumu jomās17. Šī metode ir izmantota in vivo asinsvadu daudzveidības pētījumos18,19, kā arī pētījumos, kas vērsti uz smadzeņu asinsvadiem20,21,22,23,24,25,26. Šajā pētījumā mēs paplašinājām šīs atlases metodes pielietojumu ne tikai tiešai peptīdu, kas vērsti uz smadzeņu asinsvadiem, identificēšanai, bet arī kandidātu atklāšanai ar aktīvām transporta īpašībām, lai šķērsotu hematoencefālisko barjeru. Tagad mēs aprakstām in vivo atlases procedūras izstrādi CM intubētām žurkām un demonstrējam tās potenciālu identificēt peptīdus ar CSF mājvietas īpašībām. Izmantojot T7 fāgu, kas attēlo 12-mer nejaušu peptīdu bibliotēku, mēs varējām pierādīt, ka T7 fāgs ir pietiekami mazs (aptuveni 60 nm diametrā)10, lai pielāgotos hematoencefāliskajai barjerai, tādējādi tieši šķērsojot hematoencefālisko barjeru vai dzīslenes pinumu. Mēs novērojām, ka cerebrospinālā šķidruma (CSF) iegūšana no kanulētām CM žurkām bija labi kontrolēta in vivo funkcionālās skrīninga metode un ka iegūtais fāgs ne tikai saistījās ar asinsvadiem, bet arī darbojās kā transportētājs pāri hematoencefāliskajai barjerai. Turklāt, vienlaikus savācot asinis un pielietojot HTS CSF un no asinīm iegūtajiem fāgiem, mēs apstiprinājām, ka mūsu CSF izvēli neietekmēja asins bagātināšana vai piemērotība paplašināšanai starp atlases kārtām. Tomēr asins nodalījums ir daļa no atlases procedūras, jo fāgiem, kas spēj sasniegt CSF nodalījumu, ir jāizdzīvo un jācirkulē asinsritē pietiekami ilgi, lai bagātinātos smadzenēs. Lai iegūtu ticamu secības informāciju no neapstrādātiem HTS datiem, mēs ieviesām filtrus, kas pielāgoti platformas specifiskām secības kļūdām analīzes darbplūsmā. Iekļaujot kinētiskos parametrus skrīninga metodē, mēs apstiprinājām savvaļas tipa T7 fāgu ātro farmakokinētiku (t½ ~ 28 min) asinīs24, 27, 28 un arī noteicām to pusperiodu cerebrospinālajā šķidrumā (t½ ~ 26 min) minūtē). Neskatoties uz līdzīgiem farmakokinētiskiem profiliem asinīs un cerebrospinālajā šķidrumā (CSF), CSF varēja noteikt tikai 0,001% no fāga koncentrācijas asinīs, kas norāda uz zemu savvaļas tipa T7 fāga fona mobilitāti pāri hematoencefāliskajai barjerai. Šis darbs uzsver pirmās atlases kārtas nozīmi, izmantojot in vivo panoramēšanas stratēģijas, īpaši fāgu sistēmām, kas ātri izvadās no asinsrites, jo tikai daži kloni spēj sasniegt CNS nodalījumu. Tādējādi pirmajā kārtā bibliotēkas daudzveidības samazinājums bija ļoti liels, jo šajā ļoti stingrajā CSF modelī galu galā tika savākts tikai ierobežots skaits klonu. Šī in vivo panoramēšanas stratēģija ietvēra vairākus atlases soļus, piemēram, aktīvu uzkrāšanos CSF nodalījumā, klona izdzīvošanu asins nodalījumā un T7 fāgu klonu ātru izņemšanu no asinīm pirmo 10 minūšu laikā (1.d attēls un papildu 4.M attēls). Tādējādi pēc pirmās kārtas CSF tika identificēti dažādi fāgu kloni, lai gan atsevišķiem dzīvniekiem tika izmantots viens un tas pats sākotnējais kopums. Tas liecina, ka vairāki stingri atlases soļi avota bibliotēkām ar lielu bibliotēkas locekļu skaitu ievērojami samazina daudzveidību. Tādēļ nejauši notikumi kļūs par neatņemamu sākotnējās atlases procesa sastāvdaļu, ievērojami ietekmējot rezultātu. Visticamāk, daudziem kloniem sākotnējā bibliotēkā bija ļoti līdzīga cerebrospinālā šķidruma (CSF) bagātināšanās tieksme. Tomēr pat vienādos eksperimentālos apstākļos atlases rezultāti var atšķirties, jo katra konkrētā klona skaits sākotnējā grupā ir neliels.
CSF bagātinātie motīvi atšķiras no asinīs esošajiem. Interesanti, ka atsevišķu dzīvnieku asinīs mēs novērojām pirmo pāreju uz glicīnam bagātiem peptīdiem. (1.g attēls, 4.e, 4.f papildattēls). Fāgi, kas satur glicīna peptīdus, var būt stabilāki un, visticamāk, netiks izņemti no asinsrites. Tomēr šie glicīnam bagātie peptīdi netika konstatēti cerebrospinālā šķidruma paraugos, kas liecina, ka atlasītās bibliotēkas izgāja divus dažādus atlases posmus: vienu asinīs un otru ļāva uzkrāties cerebrospinālajā šķidrumā. Ceturtajā atlases kārtā iegūtie CSF bagātinātie kloni ir plaši pārbaudīti. Gandrīz visi individuāli pārbaudītie kloni tika apstiprināti kā bagātināti CSF, salīdzinot ar tukšo kontroles fāgu. Viens peptīda trāpījums (#2077) tika pārbaudīts detalizētāk. Tas uzrādīja ilgāku plazmas pusperiodu, salīdzinot ar citiem trāpījumiem (3.d attēls un 7. papildattēls), un interesanti, ka šis peptīds C-galā saturēja cisteīna atlikumu. Nesen tika pierādīts, ka cisteīna pievienošana peptīdiem var uzlabot to farmakokinētiskās īpašības, saistoties ar albumīnu 29. Pašlaik tas nav zināms peptīdam Nr. 2077 un prasa turpmākus pētījumus. Dažiem peptīdiem CSF bagātināšanā bija novērojama valences atkarība (dati nav parādīti), kas var būt saistīts ar T7 kapsīda attēloto virsmas ģeometriju. Mūsu izmantotā T7 sistēma uzrādīja 5–15 katra peptīda kopijas uz vienu fāga daļiņu. IHC tika veikta ar kandidātu vadošajiem fāga kloniem, kas intravenozi tika injicēti žurku smadzeņu garozā (8. papildattēls). Dati parādīja, ka vismaz trīs kloni (Nr. 2002, Nr. 2009 un Nr. 2077) mijiedarbojās ar BBB. Vēl jānoskaidro, vai šī BBB mijiedarbība izraisa CSF uzkrāšanos vai šo klonu tiešu pārvietošanos uz BCSFB. Svarīgi ir tas, ka mēs parādām, ka atlasītie peptīdi saglabā savu CSF transportēšanas spēju, kad tie tiek sintezēti un saistīties ar olbaltumvielu kravu. N-terminālo biotinilēto peptīdu saistīšanās ar SA būtībā atkārto rezultātus, kas iegūti ar to attiecīgajiem fāgu kloniem asinīs un cerebrospinālajā šķidrumā (3.e att.). Visbeidzot, mēs parādām, ka vadošais peptīds #2077 spēj veicināt biotinilēta peptīdu inhibitora BACE1, kas konjugēts ar SA, smadzeņu darbību, izraisot izteiktu farmakodinamisku efektu CNS, ievērojami samazinot Abeta40 līmeni cerebrospinālajā šķidrumā (4. att.). Veicot peptīdu secības homoloģijas meklēšanu visiem trāpījumiem, mēs nevarējām identificēt nevienu homologu datubāzē. Ir svarīgi atzīmēt, ka T7 bibliotēkas lielums ir aptuveni 109, savukārt teorētiskais bibliotēkas lielums 12 meriem ir 4 x 1015. Tāpēc mēs atlasījām tikai nelielu daļu no 12 mer peptīdu bibliotēkas daudzveidības telpas, kas var nozīmēt, ka, novērtējot šo identificēto trāpījumu blakus esošo secības telpu, var identificēt optimizētākus peptīdus. Hipotētiski viens no iemesliem, kāpēc mēs neesam atraduši nekādus dabiskus šo peptīdu homologus, varētu būt deselekcija evolūcijas laikā, lai novērstu noteiktu peptīdu motīvu nekontrolētu iekļūšanu smadzenēs.
Kopumā mūsu rezultāti nodrošina pamatu turpmākam darbam, lai detalizētāk identificētu un raksturotu cerebrovaskulārās barjeras transporta sistēmas in vivo. Šīs metodes pamatprincipi ir balstīti uz funkcionālās atlases stratēģiju, kas ne tikai identificē klonus ar cerebrovaskulāro saistīšanās īpašībām, bet arī ietver kritisku soli, kurā veiksmīgiem kloniem piemīt iekšēja aktivitāte in vivo šķērsot bioloģiskās barjeras CNS nodalījumā. Mērķis ir noskaidrot šo peptīdu transporta mehānismu un to priekšroku saistīties ar smadzeņu reģionam specifisko mikrovaskulatūru. Tas var novest pie jaunu BBB un receptoru transporta ceļu atklāšanas. Mēs sagaidām, ka identificētie peptīdi var tieši saistīties ar cerebrovaskulāriem receptoriem vai cirkulējošiem ligandiem, kas tiek transportēti caur BBB vai BCSFB. Šajā darbā atklātie peptīdu vektori ar CSF transporta aktivitāti tiks tālāk pētīti. Pašlaik mēs pētām šo peptīdu smadzeņu specifiskumu attiecībā uz to spēju šķērsot BBB un/vai BCSFB. Šie jaunie peptīdi būs ārkārtīgi vērtīgi instrumenti jaunu receptoru vai ceļu atklāšanai un jaunu ļoti efektīvu platformu izstrādei makromolekulu, piemēram, bioloģisko preparātu, piegādei smadzenēs.
Izmantojot iepriekš aprakstītās metodes modifikāciju, kanulēt lielo cisternu (KC). Anestēzijas skartās Wistar žurkas (200–350 g) tika uzmontētas uz stereotaksiskā aparāta, un virs noskūtās un aseptiski sagatavotās galvas ādas tika veikts vidējais iegriezums, lai atsegtu galvaskausu. Augšējās jostas zonā tika izurbti divi caurumi un tajos tika ieskrūvētas stiprināšanas skrūves. Papildu caurums tika izurbts laterālajā pakauša cekulā nerūsējošā tērauda kanulas stereotaksiskai vadīšanai KC. Ap kanulu tika uzklāts zobu cements un nostiprināts ar skrūvēm. Pēc fotocietināšanas un cementa sacietēšanas ādas brūce tika aizvērta ar 4/0 supramid šuvi. Pareizu kanulas novietojumu apstiprina cerebrospinālā šķidruma (CSF) spontāna noplūde. Izņemt žurku no stereotaksiskā aparāta, nodrošināt atbilstošu pēcoperācijas aprūpi un sāpju mazināšanu, un ļaut tai atveseļoties vismaz vienu nedēļu, līdz cerebrospinālajā šķidrumā tiek novērotas asins pazīmes. Wistar žurkas (Crl:WI/Han) tika iegūtas no Charles River (Francija). Visas žurkas tika turētas īpašos patogēnu nesaturošos apstākļos. Visus dzīvnieku eksperimentus apstiprināja Bāzeles pilsētas veterinārais birojs Šveicē, un tie tika veikti saskaņā ar dzīvnieku licences Nr. 2474 (Aktīvā smadzeņu transporta novērtēšana, mērot terapeitisko kandidātu līmeni žurku cerebrospinālajā šķidrumā un smadzenēs).
Uzmanīgi turiet žurku pie samaņas, turot rokā CM kanulu. Izņemiet Datura no kanulas un savāciet 10 µl spontāni plūstoša cerebrospinālā šķidruma. Tā kā kanulas caurlaidība galu galā tika apdraudēta, šajā pētījumā tika iekļauti tikai dzidri cerebrospinālā šķidruma paraugi bez asins piesārņojuma vai krāsas maiņas pazīmēm. Paralēli no neliela iegriezuma astes galā tika ņemti aptuveni 10–20 μl asiņu mēģenēs ar heparīnu (Sigma-Aldrich). Pēc T7 fāga intravenozas injekcijas dažādos laika punktos tika savākts cerebrospinālais šķidrums (CSF) un asinis. Pirms katra CSF parauga savākšanas tika izlieti aptuveni 5–10 μl šķidruma, kas atbilst katetra mirušajam tilpumam.
Bibliotēkas tika ģenerētas, izmantojot T7Select 10-3b vektoru, kā aprakstīts T7Select sistēmas rokasgrāmatā (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Īsumā, nejauši ģenerēts 12-mer DNS ieliktnis tika sintezēts šādā formātā:
NNK kodons tika izmantots, lai izvairītos no dubultiem stopkodoniem un aminoskābju pārekspresijas ieliktnī. N ir manuāli sajaukta katra nukleotīda ekvimolārā attiecība, un K ir manuāli sajaukta adenīna un citozīna nukleotīdu ekvimolārā attiecība. Vienpavedienu reģioni tika pārveidoti par divpavedienu DNS, veicot tālāku inkubāciju ar dNTP (Novagen) un Klenow enzīmu (New England Biolabs) Klenow buferšķīdumā (New England Biolabs) 3 stundas 37°C temperatūrā. Pēc reakcijas divpavedienu DNS tika atdalīta ar EtOH nogulsnēšanu. Iegūtā DNS tika sagremota ar restrikcijas enzīmiem EcoRI un HindIII (abi no Roche). Sašķeltā un attīrītā (QIAquick, Qiagen) ieliktņa (T4 ligāze, New England Biolabs) pēc tam ligēja ietvarā iepriekš sašķeltā T7 vektorā aiz 10B kapsīda gēna 348. aminoskābes. Ligācijas reakcijas tika inkubētas 16°C temperatūrā 18 stundas pirms in vitro iepakošanas. Fāgu iepakošana in vitro tika veikta saskaņā ar T7Select 10-3b klonēšanas komplekta (Novagen) instrukcijām, un iepakošanas šķīdums tika vienreiz amplificēts līdz līzei, izmantojot Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lizāti tika centrifugēti, titrēti un sasaldēti -80°C temperatūrā kā glicerīna standartšķīdums.
Fāgu mainīgo reģionu, kas amplificēti buljonā vai plāksnē, tieša PCR amplifikācija, izmantojot patentētus 454/Roche-amplikona saplūšanas praimerus. Tiešās saplūšanas praimerā ir sekvences, kas ieskauj mainīgo reģionu (NNK) 12 (matricai specifisku), GS FLX titāna adapteri A un četru bāzu bibliotēkas atslēgas secību (TCAG) (1.a papildattēls):
Reversās saplūšanas praimeris satur arī biotīnu, kas piestiprināts pie uztveršanas lodītēm, un GS FLX titāna adapteri B, kas nepieciešams klonu amplifikācijai emulsijas PCR laikā:
Pēc tam amplikoni tika pakļauti 454/Roche pirosekvencēšanai saskaņā ar 454 GS-FLX Titanium protokolu. Manuālai Sanger sekvencēšanai (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) T7 fāga DNS tika amplificēta ar PCR un sekvencēta ar šādiem praimeru pāriem:
No atsevišķām plāksnītēm iegūtie ieliktņi tika pakļauti PCR amplifikācijai, izmantojot Roche Fast Start DNS polimerāzes komplektu (saskaņā ar ražotāja norādījumiem). Veiciet karsto startu (10 min 95 °C temperatūrā) un 35 pastiprināšanas ciklus (50 s 95 °C temperatūrā, 1 min 50 °C temperatūrā un 1 min 72 °C temperatūrā).
Fāgi no bibliotēkām, savvaļas tipa fāgi, no cerebrospinālā šķidruma (CSF) un asinīm izdalītie fāgi vai atsevišķi kloni tika amplificēti Escherichia coli BL5615 baktērijās TB buljonā (Sigma Aldrich) vai 500 cm2 traukos (Thermo Scientific) 4 stundas 37°C temperatūrā. Fāgi tika ekstrahēti no plāksnēm, skalojot tās ar Tris-EDTA buferšķīdumu (Fluka Analytical) vai savācot plāksnītes ar steriliem pipetes uzgaļiem. Fāgi tika izolēti no kultūras supernatāta vai ekstrakcijas buferšķīduma ar vienu polietilēnglikola (PEG 8000) nogulsnēšanas kārtu (Promega) un atkārtoti suspendēti Tris-EDTA buferšķīdumā.
Pirms intravenozas (IV) injekcijas (500 μl/dzīvnieks) amplificētais fāgs tika pakļauts 2–3 endotoksīnu atdalīšanas kārtām, izmantojot endotoksīnu atdalīšanas lodītes (Miltenyi Biotec). Pirmajā kārtā tika ievadīti 2 × 1012 fāgi; otrajā — 2 × 1010 fāgi; trešajā un ceturtajā atlases kārtā — 2 × 109 fāgi uz dzīvnieku. Fāgu saturs cerebrospinālajā šķidrumā (CSF) un asins paraugos, kas savākti norādītajos laika punktos, tika noteikts, skaitot plāksnītes saskaņā ar ražotāja norādījumiem (T7Select sistēmas rokasgrāmata). Fāgu atlase tika veikta, intravenozi injicējot attīrītas bibliotēkas astes vēnā vai atkārtoti injicējot no CSF ​​iegūto fāgu no iepriekšējās atlases kārtas, un turpmākās ievākšanas tika veiktas attiecīgi pēc 10 minūtēm, 30 minūtēm, 60 minūtēm, 90 minūtēm, 120 minūtēm, 180 minūtēm un 240 minūtēm CSF un asins paraugos. Kopumā tika veiktas četras in vivo panoramēšanas kārtas, kurās divas atlasītās filiāles tika atsevišķi uzglabātas un analizētas pirmajās trīs atlases kārtās. Visi fāgu ieliktņi, kas ekstrahēti no cerebrospinālā šķidruma (CSF) pirmajās divās atlases kārtās, tika pakļauti 454/Roche pirosekvencēšanai, savukārt visi kloni, kas ekstrahēti no CSF ​​pēdējās divās atlases kārtās, tika manuāli sekvencēti. Visi asins fāgi no pirmās atlases kārtas arī tika pakļauti 454/Roche pirosekvencēšanai. Fāgu klonu injekcijai atlasītie fāgi tika amplificēti E. coli (BL5615) uz 500 cm2 plāksnēm 37°C temperatūrā 4 stundas. Individuāli atlasītie un manuāli sekvencētie kloni tika pavairoti TB vidē. Pēc fāgu ekstrakcijas, attīrīšanas un endotoksīna atdalīšanas (kā aprakstīts iepriekš) vienā astes vēnā intravenozi tika injicēti 2×1010 fāgi/dzīvnieks 300 μl.
Sekvenču datu pirmapstrāde un kvalitatīva filtrēšana. Neapstrādāti 454/Roche dati tika konvertēti no binārā standarta plūsmas kartes formāta (sff) uz Pearson cilvēkam lasāmu formātu (fasta), izmantojot piegādātāja programmatūru. Turpmāka nukleotīdu secības apstrāde tika veikta, izmantojot patentētas C programmas un skriptus (neizlaista programmatūras pakotne), kā aprakstīts tālāk. Primāro datu analīze ietver stingras daudzpakāpju filtrēšanas procedūras. Lai filtrētu lasījumus, kas nesatur derīgu 12mer ieliktņa DNS secību, lasījumi tika secīgi izlīdzināti ar sākuma marķējumu (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), beigu marķējumu (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) un fona ieliktni (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC), izmantojot globālo Needleman-Wunsch testu. Izlīdzināšana, kas pieļauj līdz 2 neatbilstībām katrā izlīdzināšanā31. Tāpēc no bibliotēkas tika noņemti lasījumi bez sākuma un beigu tagiem, kā arī lasījumi, kas satur fona ieliktņus, t.i., izlīdzinājumi, kas pārsniedz atļauto neatbilstību skaitu. Kas attiecas uz atlikušajiem nolasījumiem, N-mer DNS sekvence, kas stiepjas no sākuma atzīmes un beidzas pirms stop atzīmes, tika izgriezta no sākotnējās nolasīšanas sekvences un tālāk apstrādāta (turpmāk tekstā saukta par "ieliktni"). Pēc ieliktņa translācijas no ieliktņa tiek noņemta daļa pēc pirmā stop kodona praimera 5' galā. Turklāt tika noņemti arī nukleotīdi, kas noved pie nepilnīgiem kodoniem praimera 3' galā. Lai izslēgtu ieliktņus, kas satur tikai fona sekvences, tika noņemti arī translētie ieliktņi, kas sākas ar aminoskābju modeli "PAG". No bibliotēkas tika noņemti peptīdi ar translācijas garumu, kas mazāks par 3 aminoskābēm. Visbeidzot, ieliktņu kopā tika noņemta liekvārdība un noteikta katra unikālā ieliktņa biežums. Šīs analīzes rezultāti ietvēra nukleotīdu secību (ieliktņu) sarakstu un to (nolasīšanas) biežumus (1.c un 2. papildattēls).
Grupējiet N-mer DNS ieliktņus pēc secības līdzības: Lai novērstu 454/Roche specifiskas sekvencēšanas kļūdas (piemēram, problēmas ar sekvencēšanas homopolimēru paplašinājumiem) un noņemtu mazāk svarīgas liekvārdības, iepriekš filtrētie N-mer DNS secības ieliktņi (ieliktņi) tiek kārtoti pēc līdzības. ieliktņi (atļautas līdz 2 nesakrītošām bāzēm), izmantojot iteratīvu algoritmu, kas definēts šādi: ieliktņi vispirms tiek kārtoti pēc to biežuma (no augstākās līdz zemākajai), un, ja tie ir vienādi, pēc to sekundārās kārtošanas pēc garuma (no garākā līdz īsākajam) ). Tādējādi biežākās un garākās ieliktņi definē pirmo “grupu”. Grupas biežums tiek iestatīts uz atslēgas frekvenci. Pēc tam katrs sakārtotajā sarakstā atlikušais ieliktnis tika mēģināts pievienot grupai, izmantojot pāru Needleman-Wunsch izlīdzināšanu. Ja neatbilstību, ieliktņu vai dzējumu skaits izlīdzinājumā nepārsniedz 2 slieksni, grupai tiek pievienots ieliktnis, un kopējā grupas biežums tiek palielināts par to, cik bieži ieliktnis tika pievienots. Grupai pievienotie ieliktņi tiek atzīmēti kā izmantoti un izslēgti no turpmākas apstrādes. Ja ievietošanas secību nevar pievienot jau esošai grupai, ievietošanas secība tiek izmantota, lai izveidotu jaunu grupu ar atbilstošu ievietošanas frekvenci un atzīmētu kā izmantotu. Iterācija beidzas, kad katra ievietošanas secība ir vai nu izmantota jaunas grupas veidošanai, vai arī to var iekļaut jau esošā grupā. Galu galā grupētie ieliktņi, kas sastāv no nukleotīdiem, galu galā tiek translēti peptīdu sekvencēs (peptīdu bibliotēkās). Šīs analīzes rezultāts ir ievietojumu kopa un to atbilstošās frekvences, kas veido secīgo lasījumu skaitu (2. papildattēls).
Motīvu ģenerēšana: Pamatojoties uz unikālu peptīdu sarakstu, tika izveidota bibliotēka, kas satur visus iespējamos aminoskābju modeļus (aa), kā parādīts zemāk. Katrs iespējamais modelis ar garumu 3 tika iegūts no peptīda, un tā apgrieztais modelis tika pievienots kopā ar kopēju motīvu bibliotēku, kas saturēja visus modeļus (tripeptīdus). Ļoti atkārtotu motīvu bibliotēkas tika sekvencētas un noņemta redundanci. Pēc tam katram tripeptīdam motīvu bibliotēkā mēs pārbaudījām tā klātbūtni bibliotēkā, izmantojot skaitļošanas rīkus. Šajā gadījumā peptīda, kas satur atrasto motīva tripeptīdu, biežums tiek pievienots un piešķirts motīvam motīvu bibliotēkā ("motīvu skaits"). Motīvu ģenerēšanas rezultāts ir divdimensiju masīvs, kas satur visus tripeptīdu (motīvu) gadījumus un to attiecīgās vērtības, kas ir sekvencēšanas lasījumu skaits, kas rada atbilstošo motīvu, kad lasījumi tiek filtrēti, grupēti un translēti. Metrika ir detalizēti aprakstīta iepriekš.
Motīvu skaita un atbilstošo izkliedes diagrammu normalizācija: Katra parauga motīvu skaits tika normalizēts, izmantojot
kur ni ir nolasījumu skaits, kas satur i-to tēmu. Tādējādi vi apzīmē nolasījumu (vai peptīdu) procentuālo biežumu paraugā, kas satur i-to motīvu. P-vērtības nenormalizētam motīvu skaitam tika aprēķinātas, izmantojot Fišera precīzo testu. Attiecībā uz motīvu skaita korelogrammām Spīrmena korelācijas tika aprēķinātas, izmantojot normalizētu motīvu skaitu ar R.
Lai vizualizētu aminoskābju saturu katrā peptīdu bibliotēkas pozīcijā, tika izveidotas tīmekļa logogrammas 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Vispirms aminoskābju saturs katrā 12-mer peptīda pozīcijā tiek saglabāts 20×12 matricā. Pēc tam fasta-sekvences formātā tiek ģenerēts 1000 peptīdu kopums, kas satur vienādu relatīvo aminoskābju saturu katrā pozīcijā, un tiek sniegts kā ievade web-logo 3, kas ģenerē relatīvā aminoskābju satura grafisku attēlojumu katrā pozīcijā dotajai peptīdu bibliotēkai. Lai vizualizētu daudzdimensionālu datu kopas, tika izveidotas siltuma kartes, izmantojot iekšēji izstrādātu rīku R valodā (biosHeatmap, vēl neizlaista R pakotne). Siltuma kartēs attēlotās dendrogrammas tika aprēķinātas, izmantojot Varda hierarhisko klasterizācijas metodi ar Eiklīda attāluma metriku. Motīvu vērtēšanas datu statistiskajai analīzei P vērtības nenormalizētai vērtēšanai tika aprēķinātas, izmantojot Fišera precīzo testu. Citu datu kopu P vērtības tika aprēķinātas programmā R, izmantojot Stjudenta t-testu vai ANOVA.
Atlasītie fāgu kloni un fāgi bez ieliktņiem tika injicēti intravenozi caur astes vēnu (2×1010 fāgi/dzīvnieks 300 μl PBS). Desmit minūtes pirms perfūzijas un sekojošas fiksācijas tiem pašiem dzīvniekiem intravenozi injicēja 100 μl ar DyLight594 iezīmēta lektīna (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minūtes pēc fāgu injekcijas žurkām caur sirdi tika perfūzēta 50 ml PBS, kam sekoja 50 ml 4% PFA/PBS. Smadzeņu paraugi papildus tika fiksēti uz nakti 4% PFA/PBS un iemērkti 30% saharozē uz nakti 4°C temperatūrā. Paraugi tiek ātri sasaldēti OCT maisījumā. Saldēto paraugu imūnhistoķīmiskā analīze tika veikta istabas temperatūrā ar 30 µm krioepicēm, kas bloķētas ar 1% BSA un inkubētas ar poliklonālām FITC iezīmētām antivielām pret T7 fāgu (Novus NB 600-376A) 4°C temperatūrā. Inkubēja uz nakti. Visbeidzot, sekcijas 3 reizes mazgāja ar PBS un pārbaudīja ar konfokālo lāzermikroskopu (Leica TCS SP5).
Visi peptīdi ar minimālo tīrību 98% tika sintezēti ar GenScript USA, biotinilēti un liofilizēti. Biotīns ir saistīts caur papildu trīskāršu glicīna starpliku N-galā. Pārbaudiet visus peptīdus, izmantojot masas spektrometriju.
Streptavidīns (Sigma S0677) tika sajaukts ar 5 reizes ekvimolāru biotinilēta peptīda, biotinilēta BACE1 inhibējošā peptīda vai biotinilēta BACE1 inhibējošā peptīda un BACE1 inhibējošā peptīda kombināciju (attiecība 3:1) 5–10% DMSO šķīdumā/inkubēts PBS. 1 stundu istabas temperatūrā pirms injekcijas. Streptavidīna konjugētie peptīdi tika injicēti intravenozi 10 mg/kg devā žurku astes vēnās ar smadzeņu dobumu.
Streptavidīna-peptīdu kompleksu koncentrācija tika noteikta ar ELISA metodi. Nunc Maxisorp mikrotitrēšanas plāksnes (Sigma) tika pārklātas uz nakti 4°C temperatūrā ar 1,5 μg/ml peles anti-streptavidīna antivielām (Thermo, MA1-20011). Pēc bloķēšanas (bloķēšanas buferšķīdums: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% želatīns, 1% BSA) istabas temperatūrā 2 stundas, plāksni mazgā ar 0,05% Tween-20/PBS (mazgāšanas buferšķīdums) 3 sekundes, CSF un plazmas paraugus pievienoja iedobēm, kas atšķaidītas ar bloķējošo buferšķīdumu (plazma 1:10 000, CSF 1:115). Pēc tam plāksni inkubēja uz nakti 4°C temperatūrā ar noteikšanas antivielām (1 μg/ml, anti-streptavidīns-HRP, Novus NB120-7239). Pēc trim mazgāšanas posmiem streptavidīns tika noteikts, inkubējot TMB substrāta šķīdumā (Roche) līdz 20 minūtēm. Pēc krāsas attīstības apturēšanas ar 1M H2SO4 izmēriet absorbciju pie 450 nm.
Streptavidīna-peptīda-BACE1 inhibitora kompleksa funkcija tika novērtēta ar Aβ(1-40) ELISA saskaņā ar ražotāja protokolu (Wako, 294-64701). Īsumā, CSF paraugi tika atšķaidīti standarta atšķaidītājā (1:23) un inkubēti nakti 4°C temperatūrā 96 iedobju plāksnēs, kas pārklātas ar BNT77 uztveršanas antivielu. Pēc piecām mazgāšanas darbībām tika pievienota HRP konjugēta BA27 antiviela un inkubēta 2 stundas 4°C temperatūrā, kam sekoja piecas mazgāšanas darbības. Aβ(1-40) tika noteikts, inkubējot TMB šķīdumā 30 minūtes istabas temperatūrā. Pēc krāsas attīstības apturēšanas ar apturēšanas šķīdumu absorbciju mērīja pie 450 nm. Pirms Aβ(1-40) ELISA plazmas paraugi tika pakļauti cietfāzes ekstrakcijai. Plazma tika pievienota 0,2% DEA (Sigma) 96 iedobju plāksnēs un inkubēta istabas temperatūrā 30 minūtes. Pēc SPE plākšņu (Oasis, 186000679) secīgas mazgāšanas ar ūdeni un 100 % metanolu, SPE plāksnēm tika pievienoti plazmas paraugi un viss šķidrums tika noņemts. Paraugi tika mazgāti (vispirms ar 5 % metanolu, pēc tam ar 30 % metanolu) un eluēti ar 2 % NH4OH/90 % metanolu. Pēc eluāta žāvēšanas 55 °C temperatūrā 99 minūtes pie nemainīgas N2 strāvas paraugi tika reducēti standarta atšķaidītājos un Aβ(1–40) tika mērīts, kā aprakstīts iepriekš.
Kā citēt šo rakstu: Urich, E. et al. Kravu piegāde smadzenēm, izmantojot in vivo identificētus tranzīta peptīdus. The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB un Moos T. Makromolekulāru zāļu piegāde smadzenēm, izmantojot mērķterapiju. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. un Martinez-Martinez, P. Peptīdu un olbaltumvielu zāļu piegāde caur hematoencefālisko barjeru. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneumobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM. Hematoencefāliskā barjera: smadzeņu zāļu izstrādes šķērslis. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, un Byrd, A. Uzlabotas zāļu piegādes un mērķtiecīgas nogādāšanas uz smadzenēm perspektīvas, izmantojot horoidālā pinuma-CSF ceļu. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Biofarmaceitisko līdzekļu modernizācija ar molekulāriem Trojas zirgiem piegādei smadzenēs. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptoru mediēta peptīdu transportēšana pāri hematoencefāliskajai barjerai. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Palieliniet terapeitisko antivielu iekļūšanu smadzenēs un efektivitāti, izmantojot monovalentas molekulārās transportēšanas sistēmas. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transferīna receptora (TfR) transports nosaka TfR antivielu afinitātes variantu uzņemšanu smadzenēs. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).