Paldies, ka apmeklējāt vietni Nature.com.Jūs izmantojat pārlūkprogrammas versiju ar ierobežotu CSS atbalstu.Lai nodrošinātu vislabāko pieredzi, ieteicams izmantot atjauninātu pārlūkprogrammu (vai atspējot saderības režīmu pārlūkprogrammā Internet Explorer).Turklāt, lai nodrošinātu pastāvīgu atbalstu, mēs rādām vietni bez stiliem un JavaScript.
Vienlaicīgi parāda trīs slaidu karuseli.Izmantojiet pogas Iepriekšējais un Nākamais, lai pārvietotos pa trim slaidiem vienlaikus, vai izmantojiet slīdņa pogas, kas atrodas beigās, lai pārvietotos pa trim slaidiem vienlaikus.
Asins-smadzeņu barjera un hematoencefālisko barjera neļauj bioterapeitiskajiem līdzekļiem sasniegt savus mērķus centrālajā nervu sistēmā, tādējādi kavējot efektīvu neiroloģisko slimību ārstēšanu.Lai atklātu jaunus smadzeņu transportētājus in vivo, mēs ieviesām T7 fāga peptīdu bibliotēku un sērijveidā savācām asinis un cerebrospinālo šķidrumu (CSF), izmantojot kanulētu apzinātu žurku liela baseina modeli.Pēc četrām atlases kārtām specifiski fāgu kloni bija ļoti bagātināti ar CSF.Atsevišķu kandidātu peptīdu testēšana atklāja vairāk nekā 1000 reižu bagātināšanos CSF.Peptīdu mediētās piegādes smadzenēs bioaktivitāte tika apstiprināta ar amiloid-β līmeņa samazināšanos cerebrospinālajā šķidrumā par 40%, izmantojot BACE1 peptīda inhibitoru, kas saistīts ar identificēto jauno tranzīta peptīdu.Šie rezultāti liecina, ka peptīdi, kas identificēti ar in vivo fāgu atlases metodēm, var būt noderīgi nesēji makromolekulu sistēmiskai ievadīšanai smadzenēs ar terapeitisku efektu.
Centrālās nervu sistēmas (CNS) mērķtiecīgas terapijas pētījumi galvenokārt ir vērsti uz optimizētu zāļu un līdzekļu identificēšanu, kuriem piemīt CNS mērķtiecīgas īpašības, ar mazāku piepūli, lai atklātu mehānismus, kas veicina aktīvo zāļu piegādi smadzenēs.Tas tagad sāk mainīties, jo zāļu piegāde, īpaši lielas molekulas, ir mūsdienu neiroloģijas zāļu izstrādes sastāvdaļa.Centrālās nervu sistēmas vidi labi aizsargā cerebrovaskulārā barjersistēma, kas sastāv no hematoencefālisko barjeru (BBB) ​​un hematoencefālisko barjeru (BCBB)1, tāpēc ir sarežģīti piegādāt zāles smadzenēm1,2.Tiek lēsts, ka gandrīz visas lielas molekulas zāles un vairāk nekā 98% mazmolekulu zāļu tiek izvadītas no smadzenēm3.Tāpēc ir ļoti svarīgi identificēt jaunas smadzeņu transporta sistēmas, kas nodrošina efektīvu un specifisku terapeitisko zāļu piegādi CNS 4,5.Tomēr BBB un BCSFB ir arī lieliska zāļu piegādes iespēja, jo tās caur plašo asinsvadu sistēmu iekļūst visās smadzeņu struktūrās un iekļūst tajās.Tādējādi pašreizējie centieni izmantot neinvazīvas piegādes metodes smadzenēs lielā mērā ir balstīti uz receptoru mediētā transporta (PMT) mehānismu, izmantojot endogēno BBB6 receptoru.Neskatoties uz nesenajiem galvenajiem sasniegumiem, izmantojot transferīna receptoru ceļu 7, 8, ir jāturpina izstrādāt jaunas piegādes sistēmas ar uzlabotām īpašībām.Šim nolūkam mūsu mērķis bija identificēt peptīdus, kas spēj mediēt CSF transportu, jo tos principā varētu izmantot, lai piegādātu makromolekulas CNS vai atvērtu jaunus receptoru ceļus.Konkrēti, specifiski cerebrovaskulārās sistēmas receptori un transportētāji (BBB un BSCFB) var kalpot par potenciāliem mērķiem bioterapeitisko zāļu aktīvai un specifiskai piegādei.Cerebrospinālais šķidrums (CSF) ir koroidālā pinuma (CS) sekrēcijas produkts, un tas ir tiešā saskarē ar smadzeņu intersticiālo šķidrumu caur subarahnoidālo telpu un ventrikulāro telpu4.Nesen tika pierādīts, ka subarahnoidālais cerebrospinālais šķidrums pārmērīgi izkliedējas smadzeņu intersticijā9.Mēs ceram piekļūt parenhīmas telpai, izmantojot šo subarahnoidālo ieplūdes ceļu vai tieši caur BBB.Lai to panāktu, mēs ieviesām spēcīgu in vivo fāgu atlases stratēģiju, kas ideāli identificē peptīdus, kas tiek transportēti pa kādu no šiem diviem atšķirīgajiem ceļiem.
Tagad mēs aprakstām secīgu in vivo fāgu displeja skrīninga metodi ar CSF paraugu ņemšanu kopā ar augstas caurlaidspējas sekvencēšanu (HTS), lai uzraudzītu sākotnējās atlases kārtas ar vislielāko bibliotēkas daudzveidību.Skrīnings tika veikts pie samaņas esošajām žurkām ar pastāvīgi implantētu lielas cisternas (CM) kanulu, lai izvairītos no asins piesārņojuma.Svarīgi, ka šī pieeja atlasa gan smadzeņu mērķauditorijas atlasi, gan peptīdus ar transporta aktivitāti pāri cerebrovaskulārajai barjerai.Mēs izmantojām T7 fāgus to mazā izmēra (~ 60 nm) dēļ un ierosinājām, ka tie ir piemēroti vezikulu transportēšanai, kas ļauj transcelulāri šķērsot endotēlija un / vai epitēlija-medulla barjeru.Pēc četrām panoramēšanas kārtām fāgu populācijas tika izolētas, parādot spēcīgu in vivo CSF ​​bagātināšanu un smadzeņu mikrovaskulāru asociāciju.Svarīgi, ka mēs varējām apstiprināt savus atklājumus, parādot, ka vēlamie un ķīmiski sintezētie labākie kandidātu peptīdi spēj transportēt olbaltumvielu kravu cerebrospinālajā šķidrumā.Pirmkārt, CNS farmakodinamiskā iedarbība tika noteikta, apvienojot vadošo tranzīta peptīdu ar BACE1 peptīda inhibitoru.Papildus tam, ka tiek parādīts, ka in vivo funkcionālās skrīninga stratēģijas var identificēt jaunus smadzeņu transporta peptīdus kā efektīvus olbaltumvielu kravas nesējus, mēs sagaidām, ka līdzīgas funkcionālās atlases pieejas arī kļūs svarīgas jaunu smadzeņu transporta ceļu noteikšanā.
Pamatojoties uz plāksnīšu veidojošajām vienībām (PFU), pēc fāgu iepakošanas posma tika izstrādāta un izveidota nejaušu 12-mēru lineāru T7 fāgu peptīdu bibliotēka ar aptuveni 109 daudzveidību (skatiet sadaļu Materiāli un metodes).Ir svarīgi atzīmēt, ka mēs rūpīgi analizējām šo bibliotēku pirms in vivo panoramēšanas.Fāgu bibliotēkas paraugu PCR amplifikācija, izmantojot modificētus primerus, radīja amplikonus, kas bija tieši piemērojami HTS (papildu 1.a attēls).Sakarā ar a) HTS11 sekvencēšanas kļūdām, b) ietekmi uz primeru (NNK) 1-12 kvalitāti un c) savvaļas tipa (wt) fāgu (skeleta ieliktņu) klātbūtni gaidstāves bibliotēkā, tika ieviesta secību filtrēšanas procedūra, lai iegūtu tikai pārbaudītu secību informāciju (papildu 1.b attēls).Šīs filtra darbības attiecas uz visām HTS secības bibliotēkām.Standarta bibliotēkai kopumā tika iegūti 233 868 lasījumi, no kuriem 39% izturēja filtra kritērijus un tika izmantoti bibliotēkas analīzei un atlasei turpmākajām kārtām (papildu attēls 1c – e).Nolasījumi pārsvarā bija 3 bāzes pāru garuma reizinājumi ar maksimumu pie 36 nukleotīdiem (papildu attēls 1c), apstiprinot bibliotēkas dizainu (NNK) 1-12.Proti, aptuveni 11% bibliotēkas dalībnieku saturēja 12 dimensiju savvaļas tipa (wt) mugurkaula PAGISRELVDKL ieliktni, un gandrīz puse no sekvencēm (49%) saturēja ievietojumus vai dzēšanu.Bibliotēkas bibliotēkas HTS apstiprināja lielo peptīdu daudzveidību bibliotēkā: vairāk nekā 81% peptīdu sekvences tika atrastas tikai vienu reizi un tikai 1, 5% radās ≥ 4 kopijās (papildu 2.a attēls).Aminoskābju (aa) frekvences visās 12 repertuāra pozīcijās labi korelēja ar frekvencēm, kas sagaidāmas deģenerētā NKK repertuāra radīto kodonu skaitam (papildu 2.b attēls).Novērotais aa atlikumu biežums, ko kodē šie ieliktņi, labi korelēja ar aprēķināto frekvenci (r = 0, 893) (papildu 2.c attēls).Fāgu bibliotēku sagatavošana injekcijām ietver endotoksīna pastiprināšanas un noņemšanas posmus.Iepriekš tika pierādīts, ka tas potenciāli samazina fāgu bibliotēku daudzveidību 12, 13 .Tāpēc mēs sekvencējām plāksnēs pastiprinātu fāgu bibliotēku, kurai bija noņemts endotoksīns, un salīdzinājām to ar sākotnējo bibliotēku, lai novērtētu AA biežumu.Tika novērota spēcīga korelācija (r = 0, 995) starp sākotnējo kopu un pastiprināto un attīrīto baseinu (papildu attēls 2d), norādot, ka konkurence starp kloniem, kas pastiprināti uz plāksnēm, izmantojot T7 fāgu, neizraisīja lielu novirzi.Šis salīdzinājums ir balstīts uz tripeptīdu motīvu biežumu katrā bibliotēkā, jo bibliotēku daudzveidību (~ 109) nevar pilnībā uztvert pat ar HTS.Aa biežuma analīze katrā pozīcijā atklāja nelielu no pozīcijas atkarīgu novirzi ievadītā repertuāra pēdējās trīs pozīcijās (papildu attēls 2e).Noslēgumā secinājām, ka bibliotēkas kvalitāte un daudzveidība bija pieņemama un tika novērotas tikai nelielas daudzveidības izmaiņas, ko izraisīja fāgu bibliotēku pastiprināšana un sagatavošana starp vairākām atlases kārtām.
Sērijveida cerebrospinālā šķidruma paraugu ņemšanu var veikt, ķirurģiski implantējot kanulu pie samaņas esošu žurku CM, lai atvieglotu T7 fāga, kas ievadīts intravenozi (iv) caur BBB un/vai BCSFB, identificēšanu (1.a–b. attēls).Pirmajās trīs in vivo atlases kārtās mēs izmantojām divas neatkarīgas atlases grupas (A un B grupas) (1.c att.).Mēs pakāpeniski palielinājām atlases stingrību, samazinot kopējo fāgu daudzumu, kas tika ievadīts pirmajās trīs atlases kārtās.Ceturtajā panoramēšanas kārtā mēs apvienojām paraugus no A un B filiāles un veicām trīs papildu neatkarīgas atlases.Lai pētītu T7 fāga daļiņu in vivo īpašības šajā modelī, savvaļas tipa fāgs (PAGISRELVDKL galvenais ieliktnis) tika injicēts žurkām caur astes vēnu.Fāgu atgūšana no cerebrospinālā šķidruma un asinīm dažādos laika punktos parādīja, ka salīdzinoši maziem T7 ikosaedriskiem fāgiem bija ātra sākotnējā klīrensa fāze no asins nodalījuma (papildu 3. attēls).Pamatojoties uz ievadītajiem titriem un žurku asins tilpumu, mēs aprēķinājām, ka tikai aptuveni 1 % masas.fāgs no ievadītās devas tika konstatēts asinīs 10 minūtes pēc intravenozas injekcijas.Pēc šīs sākotnējās straujās samazināšanās tika mērīts lēnāks primārais klīrenss ar pusperiodu 27,7 minūtes.Svarīgi, ka no CSF ​​nodalījuma tika iegūti tikai ļoti daži fāgi, kas liecina par zemu fonu savvaļas tipa fāgu migrācijai CSF nodalījumā (papildu 3. attēls).Vidēji visā paraugu ņemšanas periodā (0-250 min) cerebrospinālajā šķidrumā tika konstatēti tikai aptuveni 1 x 10-3% T7 fāga titri asinīs un 4 x 10-8% sākotnēji ievadīto fāgu.Konkrēti, savvaļas tipa fāga pusperiods (25,7 min) cerebrospinālajā šķidrumā bija līdzīgs asinīs novērotajam.Šie dati parāda, ka barjera, kas atdala CSF nodalījumu no asinīm, ir neskarta žurkām ar CM kanulām, ļaujot in vivo atlasīt fāgu bibliotēkas, lai identificētu klonus, kas tiek viegli transportēti no asinīm CSF nodalījumā.
a) Metodes izveide cerebrospinālā šķidruma (CSF) atkārtotai paraugu ņemšanai no liela baseina.(b) Diagramma, kas parāda centrālās nervu sistēmas (CNS) barjeras atrašanās vietu šūnās un atlases stratēģiju, ko izmanto, lai identificētu peptīdus, kas šķērso hematoencefālisko barjeru (BBB) ​​un hematoencefālisko barjeru.c) In vivo fāga displeja skrīninga blokshēma.Katrā atlases kārtā fāgi (dzīvnieku identifikatori bultiņu iekšpusē) tika injicēti intravenozi.Divas neatkarīgas alternatīvas filiāles (A, B) tiek saglabātas atsevišķi līdz 4. atlases kārtai.Atlases 3. un 4. kārtā katrs no CSF ​​ekstrahētais fāga klons tika manuāli sekvencēts.(d) No asinīm (sarkani apļi) un cerebrospinālā šķidruma (zaļie trīsstūri) izolētā fāga kinētika pirmajā atlases kārtā divās kanulētās žurkās pēc T7 peptīdu bibliotēkas intravenozas injekcijas (2 x 1012 fāgi/dzīvnieks).Zilie kvadrāti norāda vidējo sākotnējo fāga koncentrāciju asinīs, kas aprēķināta no ievadītā fāga daudzuma, ņemot vērā kopējo asins tilpumu.Melnie kvadrāti norāda y līnijas krustošanās punktu, kas ekstrapolēts no asins fāgu koncentrācijas.(e, f) Norādiet visu iespējamo peptīdā atrasto tripeptīdu motīvu relatīvo biežumu un sadalījumu.Parādīts 1000 lasījumos atrasto motīvu skaits.Būtiski (p < 0,001) bagātinātie motīvi ir atzīmēti ar sarkaniem punktiem.(e) Korelācijas izkliedes diagramma, kas salīdzina injicētās bibliotēkas tripeptīda motīva relatīvo biežumu ar asinīm iegūto fāgu no dzīvniekiem #1.1 un #1.2.(f) Korelācijas izkliedes diagramma, kas salīdzina dzīvnieku fāga tripeptīdu motīvu #1.1 un #1.2 relatīvās frekvences, kas izolētas asinīs un cerebrospinālajā šķidrumā.(g, h) Ar asinīm bagātināta fāga (g) secības ID attēlojums salīdzinājumā ar injicētām bibliotēkām un ar CSF bagātināto fāgu (h) pret asinīm pēc in vivo atlases abiem dzīvniekiem.Viena burta koda lielums norāda, cik bieži šī aminoskābe rodas šajā pozīcijā.Zaļa = polāra, violeta = neitrāla, zila = bāziska, sarkana = skāba un melna = hidrofobās aminoskābes.Attēlu 1a, b projektējis un izgatavojis Eduards Urichs.
Mēs injicējām fāgu peptīdu bibliotēku divās CM instrumentu žurkām (A un B klades) un izolējām fāgu no cerebrospinālā šķidruma un asinīm (1.d attēls).Sākotnējais ātrais bibliotēkas klīrenss bija mazāk izteikts, salīdzinot ar savvaļas tipa fāgu.Injicētās bibliotēkas vidējais pusperiods abiem dzīvniekiem bija 24,8 minūtes asinīs, līdzīgi kā savvaļas tipa fāgam, un 38,5 minūtes CSF.Katra dzīvnieka asins un cerebrospinālā šķidruma fāgu paraugi tika pakļauti HTS, un visi identificētie peptīdi tika analizēti, lai noteiktu īsa tripeptīda motīva klātbūtni.Tripeptīdu motīvi tika izvēlēti, jo tie nodrošina minimālu pamatu struktūras veidošanai un peptīdu-olbaltumvielu mijiedarbībai14, 15.Mēs atradām labu korelāciju motīvu sadalījumā starp injicēto fāgu bibliotēku un kloniem, kas iegūti no abu dzīvnieku asinīm (1.e attēls).Dati liecina, ka bibliotēkas sastāvs ir tikai nedaudz bagātināts asins nodalījumā.Aminoskābju frekvences un konsensa secības tika tālāk analizētas katrā pozīcijā, izmantojot Weblogo16 programmatūras adaptāciju.Interesanti, ka mēs atklājām spēcīgu glicīna atlieku bagātināšanos asinīs (1.g att.).Salīdzinot asinis ar kloniem, kas atlasīti no CSF, tika novērota spēcīga atlase un zināma motīvu atlases atcelšana (1.f att.), un noteiktas aminoskābes bija klāt iepriekš noteiktās pozīcijās 12 locekļu grupā (1.h attēls).Konkrēti, atsevišķi dzīvnieki būtiski atšķīrās cerebrospinālajā šķidrumā, savukārt glicīna bagātināšanās asinīs tika novērota abiem dzīvniekiem (papildu 4.a–j attēls).Pēc stingras secības datu filtrēšanas 1.1. un 1.2. dzīvnieku cerebrospinālajā šķidrumā kopā tika iegūti 964 un 420 unikāli 12 mēru peptīdi (papildu 1. d–e att.).Izolētie fāgu kloni tika pastiprināti un pakļauti otrajai in vivo atlases kārtai.Fāgi, kas iegūti no otrās atlases kārtas, tika pakļauti HTS katram dzīvniekam, un visi identificētie peptīdi tika izmantoti kā ievade motīvu atpazīšanas programmā, lai analizētu tripeptīdu motīvu rašanos (2.a, b, ef att.).Salīdzinājumā ar pirmo fāga ciklu, kas tika atgūts no CSF, mēs novērojām turpmāku daudzu motīvu atlasi un atcelšanu CSF zaros A un B (2. att.).Tika izmantots tīkla identifikācijas algoritms, lai noteiktu, vai tie pārstāv dažādus konsekventas secības modeļus.Tika novērota skaidra līdzība starp 12-dimensiju sekvencēm, ko CSF ​​atguva alternatīvajā A kladē (2.c, d. att.) un B (2.g, h att.).Apvienotā analīze katrā filiālē atklāja dažādus 12-mer peptīdu atlases profilus (papildu 5.c, d attēls) un CSF/asins titra attiecības pieaugumu laika gaitā apvienotajiem kloniem pēc otrās atlases kārtas, salīdzinot ar pirmo atlases kārtu (papildu 5.e attēls).).
Motīvu un peptīdu bagātināšana cerebrospinālajā šķidrumā ar divām secīgām in vivo funkcionālā fāga displeja atlases kārtām.
Visi cerebrospinālā šķidruma fāgi, kas iegūti no katra dzīvnieka pirmās kārtas (dzīvnieki #1.1 un #1.2), tika apvienoti, amplificēti, HT sekvencēti un atkārtoti injicēti kopā (2 x 1010 fāgi/dzīvnieks) 2 SM kanulētām žurkām (#1.1 → #).2.1 un 2.2, 1.2 → 2.3 un 2.4).(a, b, e, f) Korelācijas izkliedes diagrammas, kas salīdzina visu no CSF ​​atvasināto fāgu tripeptīdu motīvu relatīvo biežumu pirmajā un otrajā atlases kārtā.Motīvu relatīvais biežums un sadalījums, kas pārstāv visus iespējamos pārklājošos tripeptīdus, kas atrodami peptīdos abās orientācijās.Parādīts 1000 lasījumos atrasto motīvu skaits.Motīvi, kas tika nozīmīgi (p < 0,001) atlasīti vai izslēgti kādā no salīdzinātajām bibliotēkām, ir izcelti ar sarkaniem punktiem.(c, d, g, h) Visu ar CSF bagāto 12 aminoskābju garo sekvenču sekvences logotips, pamatojoties uz in vivo atlases 2. un 1. kārtu.Viena burta koda lielums norāda, cik bieži šī aminoskābe rodas šajā pozīcijā.Lai attēlotu logotipu, tiek salīdzināts no atsevišķiem dzīvniekiem iegūto CSF ​​secību biežums starp divām atlases kārtām un tiek parādītas otrās kārtas bagātinātās sekvences: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 un (h) #1.2–#2.4.Visbagātinātākās aminoskābes noteiktā pozīcijā (c, d) dzīvniekiem Nr.2.1 un Nr.2.2 vai (g, h) dzīvniekiem Nr.2.3 un Nr.2.4 ir parādīti krāsaini.Zaļa = polāra, violeta = neitrāla, zila = bāziska, sarkana = skāba un melna = hidrofobās aminoskābes.
Pēc trešās atlases kārtas mēs identificējām 124 unikālas peptīdu sekvences (#3.1 un #3.2) no 332 CSF atjaunotiem fāgu kloniem, kas izolēti no diviem dzīvniekiem (papildu 6.a attēls).Vislielākais relatīvais īpatsvars bija sekvencei LGSVS (18,7%), kam sekoja savvaļas tipa ieliktņi PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) un SARGSWREIVSLS (2,2%).Pēdējā ceturtajā kārtā mēs apvienojām divus neatkarīgi atlasītus zarus no trim atsevišķiem dzīvniekiem (1.c attēls).No 925 sekvencētajiem fāgu kloniem, kas iegūti no CSF, ceturtajā kārtā mēs atradām 64 unikālas peptīdu sekvences (papildu 6.b attēls), starp kurām savvaļas tipa fāgu relatīvais īpatsvars samazinājās līdz 0, 8%.Visbiežāk sastopamie CSF kloni ceturtajā kārtā bija LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) un RLSSVDSDLSGC (3, 6%).%)).Atlasīto peptīdu garuma diapazons ir saistīts ar nukleotīdu ievietošanu / dzēšanu vai priekšlaicīgiem stopkodoniem bibliotēkas primeros, izmantojot deģenerētus kodonus NNK bibliotēkas projektēšanai.Priekšlaicīgi stopkodoni ģenerē īsākus peptīdus un tiek atlasīti, jo tie satur labvēlīgo aa motīvu.Garāki peptīdi var rasties, ievietojot/dzēšot sintētisko bibliotēku primerus.Tas novieto izstrādāto stopkodonu ārpus rāmja un nolasa to, līdz parādās jauns stopkodons lejup pa straumi.Kopumā mēs aprēķinājām bagātināšanas koeficientus visām četrām atlases kārtām, salīdzinot ievades datus ar izlases izejas datiem.Pirmajā skrīninga kārtā mēs izmantojām savvaļas tipa fāgu titrus kā nespecifisku fona atsauci.Interesanti, ka negatīvā fāgu selekcija bija ļoti spēcīga pirmajā CSF ciklā, bet ne asinīs (3.a att.), kas var būt saistīts ar zemo varbūtību vairumam peptīdu bibliotēkas locekļu pasīvās difūzijas CSF nodalījumā vai relatīvie fāgi mēdz būt efektīvāk saglabāti vai izņemti no asinsrites nekā bakteriofāgi.Tomēr otrajā panoramēšanas kārtā tika novērota spēcīga fāgu atlase CSF abās kladēs, kas liecina, ka iepriekšējā kārta bija bagātināta ar fāgiem, kuros bija peptīdi, kas veicina CSF uzņemšanu (3.a attēls).Atkal bez būtiskas asins bagātināšanas.Arī trešajā un ceturtajā kārtā fāgu kloni tika ievērojami bagātināti ar CSF.Salīdzinot katras unikālās peptīdu sekvences relatīvo biežumu starp pēdējām divām atlases kārtām, mēs atklājām, ka ceturtajā atlases kārtā sekvences bija vēl vairāk bagātinātas (3.b att.).Kopumā no visām 64 unikālajām peptīdu sekvencēm, izmantojot abas peptīdu orientācijas, tika iegūts 931 tripeptīda motīvs.Visvairāk bagātinātie motīvi ceturtajā kārtā tika rūpīgāk pārbaudīti attiecībā uz to bagātināšanas profiliem visās kārtās, salīdzinot ar ievadīto bibliotēku (nogrieznis: 10% bagātinājums) (papildu 6.c attēls).Vispārējie atlases modeļi liecināja, ka lielākā daļa pētīto motīvu tika bagātināti visās iepriekšējās abu atlases nozaru kārtās.Tomēr daži motīvi (piemēram, SGL, VSG, LGS GSV) pārsvarā bija no alternatīvās A klades, bet citi (piemēram, FGW, RTN, WGF, NTR) tika bagātināti alternatīvajā B kladē.
Ar CSF bagātinātu fāgu attēloto peptīdu un biotinilēto līderpeptīdu, kas konjugēti ar streptavidīna kravām, CSF transportēšanas validācija.
a) bagātināšanas koeficienti, kas aprēķināti visās četrās kārtās (R1-R4), pamatojoties uz ievadītajiem (ievade = I) fāgu (PFU) titriem un noteiktajiem CSF fāgu titriem (izeja = O).Pēdējās trīs kārtas bagātināšanas koeficienti (R2-R4) tika aprēķināti, salīdzinot ar iepriekšējo kārtu un pirmo kārtu (R1) ar svara datiem.Atvērtās joslas ir cerebrospinālais šķidrums, ēnotās joslas ir plazma.(***p<0,001, pamatojoties uz Stjudenta t-testu).(b) Visbiežāk sastopamo fāgu peptīdu saraksts, kas sakārtots atbilstoši to relatīvajai proporcijai pret visiem fāgiem, kas savākti CSF pēc 4. atlases kārtas.Seši visbiežāk sastopamie fāgu kloni ir izcelti ar krāsu, numurēti un to bagātināšanas faktori starp 3. un 4. atlases kārtu (ielaidumi).( c, d ) Seši visvairāk bagātinātie fāgu kloni, tukšās fāgu un vecāku fāgu peptīdu bibliotēkas no 4. kārtas tika analizētas atsevišķi CSF paraugu ņemšanas modelī.CSF un asins paraugi tika savākti norādītajos laika punktos.(c) Vienāds daudzums 6 kandidātu fāgu klonu (2 x 1010 fāgi/dzīvnieki), tukši fāgi (nr. 1779) (2 x 1010 fāgi/dzīvnieki) un pamatfāgu peptīdu bibliotēkas (2 x 1012 fāgi/dzīvnieki). Injicējiet vismaz 3 CM, lai atsevišķi ievadīts vēnā dzīvnieks.Tiek parādīta katra injicētā fāga klona un fāga peptīdu bibliotēkas CSF farmakokinētika laika gaitā.(d) parāda vidējo CSF/asins attiecību visiem atgūtajiem fāgiem/ml paraugu ņemšanas laikā.(e) Četri sintētiskie līderpeptīdi un viena šifrētā kontrole tika savienoti ar biotīnu ar streptavidīnu caur to N-galu (tetramēra displejs), kam sekoja injekcija (astes vēnas iv, 10 mg streptavidīna / kg).Vismaz trīs intubētas žurkas (N = 3).).CSF paraugi tika savākti norādītajos laika punktos, un streptavidīna koncentrācija tika noteikta ar CSF anti-streptavidīna ELISA metodi (nd = nav konstatēta).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, pamatojoties uz ANOVA testu).(f) Visbagātinātākā fāga peptīdu klona #2002 (violeta) aminoskābju secības salīdzinājums ar citiem atlasītajiem fāga peptīdu kloniem no 4. atlases kārtas.Identiski un līdzīgi aminoskābju fragmenti ir kodēti ar krāsu.
No visiem bagātinātajiem fāgiem ceturtajā kārtā (3.b attēls) turpmākai individuālai analīzei CSF paraugu ņemšanas modelī tika atlasīti seši klonu kandidāti.Vienādos daudzumos sešu kandidātfāgu, tukšo fāgu (bez ieliktņa) un profāgu peptīdu bibliotēku tika injicēts trīs kanulētos CM dzīvniekiem, un farmakokinētika tika noteikta CSF (3.c att.) un asins (7. papildu att.) testos.Visi pārbaudītie fāgu kloni bija vērsti uz CSF nodalījumu līmenī, kas ir 10–1000 reizes augstāks nekā tukšā kontroles fāga (#1779).Piemēram, kloniem #2020 un #2077 CSF titri bija aptuveni 1000 reizes augstāki nekā kontroles fāgam.Katra izvēlētā peptīda farmakokinētiskais profils ir atšķirīgs, taču visiem tiem ir augsta CSF pārvietošanās spēja.Mēs novērojām pastāvīgu samazināšanos laika gaitā kloniem #1903 un #2011, savukārt kloniem #2077, #2002 un #2009 pieaugums pirmajās 10 minūtēs varētu liecināt par aktīvu transportēšanu, taču tas ir jāpārbauda.Kloni #2020, #2002 un #2077 stabilizējās augstā līmenī, savukārt klona #2009 CSF koncentrācija lēnām samazinājās pēc sākotnējā pieauguma.Pēc tam mēs salīdzinājām katra CSF kandidāta relatīvo biežumu ar tā koncentrāciju asinīs (3.d attēls).Katra CSF kandidāta vidējā titra korelācija ar tā asins titru visos paraugu ņemšanas laikos parādīja, ka trīs no sešiem kandidātiem bija ievērojami bagātināti ar asins CSF.Interesanti, ka klonam # 2077 bija augstāka asins stabilitāte (7. papildu attēls).Lai apstiprinātu, ka paši peptīdi spēj aktīvi transportēt citas kravas, izņemot fāgu daļiņas, CSF nodalījumā, mēs sintezējām četrus vadošos peptīdus, kas atvasināti ar biotīnu N-galā, kur peptīdi pievienojas fāga daļiņai.Biotinilētie peptīdi (nr. 2002, 2009, 2020 un 2077) tika konjugēti ar streptavidīnu (SA), lai iegūtu multimēras formas, kas nedaudz atdarina fāga ģeometriju.Šis formāts arī ļāva mums izmērīt SA iedarbību asinīs un cerebrospinālajā šķidrumā kā kravu transportējošo olbaltumvielu peptīdus.Svarīgi, ka fāgu datus bieži varēja reproducēt, ievadot sintētiskos peptīdus šajā SA konjugētajā formātā (3.e attēls).Sajauktajiem peptīdiem bija mazāka sākotnējā iedarbība un ātrāks CSF klīrenss ar nenosakāmu līmeni 48 stundu laikā.Lai gūtu ieskatu par šo peptīdu fāgu klonu piegādes ceļiem CSF telpā, mēs analizējām atsevišķu fāgu peptīdu trāpījumu lokalizāciju, izmantojot imūnhistoķīmiju (IHC), lai tieši noteiktu fāgu daļiņas 1 stundu pēc intravenozas injekcijas in vivo.Proti, klonus #2002, #2077 un #2009 varēja noteikt ar spēcīgu krāsošanu smadzeņu kapilāros, savukārt kontroles fāgs (#1779) un klons #2020 netika atklāts (8. papildu attēls).Tas liecina, ka šie peptīdi veicina ietekmi uz smadzenēm, tieši šķērsojot BBB.Lai pārbaudītu šo hipotēzi, ir nepieciešama turpmāka detalizēta analīze, jo var būt iesaistīts arī BSCFB maršruts.Salīdzinot visvairāk bagātinātā klona (#2002) aminoskābju secību ar citiem atlasītajiem peptīdiem, tika atzīmēts, ka dažiem no tiem ir līdzīgi aminoskābju paplašinājumi, kas var liecināt par līdzīgu transporta mehānismu (3.f att.).
Pateicoties tā unikālajam plazmas profilam un ievērojamam CSF pieaugumam laika gaitā, fāga displeja klons #2077 tika tālāk pētīts ilgākā 48 stundu periodā, un tas spēja reproducēt straujo CSF ​​pieaugumu, kas novērots saistībā ar ilgstošu SA līmeni (4.a attēls).Attiecībā uz citiem identificētajiem fāgu kloniem # 2077 spēcīgi iekrāsojās smadzeņu kapilāros un uzrādīja ievērojamu kolokalizāciju ar kapilāru marķiera lektīnu, skatoties ar augstāku izšķirtspēju un, iespējams, nelielu iekrāsošanos parenhīmas telpā (4.b attēls).Lai noskaidrotu, vai CNS var iegūt ar peptīdu mediētu farmakoloģisko iedarbību, mēs veicām eksperimentu, kurā i) #2077 tranzītpeptīda un ii) BACE1 inhibitora peptīda biotinilētas versijas tika sajauktas ar SA divās dažādās attiecībās.Vienai kombinācijai mēs izmantojām tikai BACE1 peptīda inhibitoru, bet otrai - BACE1 peptīda inhibitora attiecību pret #2077 peptīdu 1:3.Abi paraugi tika ievadīti intravenozi, un laika gaitā tika mērīts beta-amiloīda peptīda 40 (Abeta40) līmenis asinīs un cerebrospinālajā šķidrumā.Abeta40 tika mērīts CSF, jo tas atspoguļo BACE1 inhibīciju smadzeņu parenhīmā.Kā gaidīts, abi kompleksi ievērojami samazināja Abeta40 līmeni asinīs (4.c, d att.).Tomēr tikai paraugi, kas satur peptīdu maisījumu Nr.2077 un BACE1 peptīda inhibitors, kas konjugēts ar SA, izraisīja ievērojamu Abeta40 samazināšanos cerebrospinālajā šķidrumā (4.c attēls).Dati liecina, ka peptīds Nr.2077 spēj transportēt 60 kDa SA proteīnu CNS, kā arī izraisa farmakoloģisku iedarbību ar SA konjugētiem BACE1 peptīda inhibitoriem.
(a) T7 fāga klonāla injekcija (2 × 10 fāgi/dzīvnieks), kas uzrāda CSF peptīda #2077 (RLSSVDSDLSGC) un neinjicēta kontroles fāga (#1779) ilgtermiņa farmakokinētiskos profilus vismaz trīs CM intubētās žurkās.(b) Konfokāls mikroskopisks reprezentatīvu garozas mikrovaskulāru attēls ar fāgu injicētām žurkām (2 × 1010 fāgi/dzīvnieks), kas parāda peptīda #2077 un asinsvadu (lektīna) pretkrāsošanu.Šie fāgu kloni tika ievadīti 3 žurkām un ļāva cirkulēt 1 stundu pirms perfūzijas.Smadzenes tika sadalītas un iekrāsotas ar poliklonālām FITC iezīmētām antivielām pret T7 fāga kapsīdu.Desmit minūtes pirms perfūzijas un turpmākās fiksācijas ar DyLight594 iezīmētais lektīns tika ievadīts intravenozi.Fluorescējoši attēli, kas parāda lektīna iekrāsošanos (sarkanā krāsā) mikrovadu un fāgu luminālajā pusē (zaļā krāsā) kapilāru un perivaskulāro smadzeņu audu lūmenā.Mēroga josla atbilst 10 µm.(c, d) Biotinilēts BACE1 inhibējošais peptīds atsevišķi vai kombinācijā ar biotinilētu tranzītpeptīdu #2077 tika savienots ar streptavidīnu, kam sekoja intravenoza injekcija vismaz trim kanulētām CM žurkām (10 mg streptavidīna / kg).BACE1 peptīda inhibitoru izraisītā Aβ40 samazināšanās tika noteikta ar Aβ1-40 ELISA palīdzību asinīs (sarkanā krāsā) un cerebrospinālajā šķidrumā (oranžā) norādītajos laika punktos.Lai iegūtu labāku skaidrību, grafikā ir novilkta punktēta līnija 100% mērogā.c) Aβ40 procentuālā samazināšanās asinīs (sarkanie trīsstūri) un cerebrospinālajā šķidrumā (oranži trīsstūri) žurkām, kas ārstētas ar streptavidīnu, kas konjugēts ar tranzītpeptīdu #2077 un BACE1 inhibējošo peptīdu attiecībā 3:1.(d) Aβ40 (sarkani apļi) un cerebrospinālā šķidruma (oranži apļi) procentuālā samazināšanās žurkām, kas ārstētas ar streptavidīnu, kas savienots tikai ar BACE1 inhibējošu peptīdu.Aβ koncentrācija kontrolē bija 420 pg/ml (standarta novirze = 101 pg/ml).
Fāgu displejs ir veiksmīgi izmantots vairākās biomedicīnas pētījumu jomās17.Šī metode ir izmantota in vivo asinsvadu daudzveidības pētījumos 18, 19, kā arī pētījumos, kas vērsti uz smadzeņu asinsvadiem 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26.Šajā pētījumā mēs paplašinājām šīs atlases metodes piemērošanu ne tikai tiešai peptīdu identificēšanai, kas vērsti uz smadzeņu asinsvadiem, bet arī kandidātu atklāšanu ar aktīvām transporta īpašībām, lai šķērsotu asins-smadzeņu barjeru.Tagad mēs aprakstām in vivo atlases procedūras izstrādi CM intubētām žurkām un parādām tās potenciālu identificēt peptīdus ar CSF izvietošanas īpašībām.Izmantojot T7 fāgu, kurā ir 12 mer izlases peptīdu bibliotēka, mēs varējām pierādīt, ka T7 fāgs ir pietiekami mazs (apmēram 60 nm diametrā)10, lai to pielāgotu hematoencefālisko barjerai, tādējādi tieši šķērsojot hematoencefālisko barjeru vai dzīslenes pinumu.Mēs novērojām, ka CSF ievākšana no kanulētām CM žurkām bija labi kontrolēta in vivo funkcionālās skrīninga metode un ka ekstrahētais fāgs ne tikai saistījās ar asinsvadu, bet arī darbojās kā transportētājs cauri hematoencefālisko barjerai.Turklāt, vienlaikus savācot asinis un piemērojot HTS CSF un no asinīm iegūtiem fāgiem, mēs apstiprinājām, ka mūsu CSF izvēli neietekmēja asins bagātināšana vai piemērotība paplašināšanai starp atlases kārtām.Tomēr asins nodalījums ir daļa no atlases procedūras, jo fāgiem, kas spēj sasniegt CSF nodalījumu, ir jāizdzīvo un jācirkulē asinsritē pietiekami ilgi, lai bagātinātos smadzenēs.Lai iegūtu ticamu secību informāciju no neapstrādātiem HTS datiem, analīzes darbplūsmā mēs ieviesām filtrus, kas pielāgoti platformai specifiskām secības kļūdām.Iekļaujot skrīninga metodē kinētiskos parametrus, mēs apstiprinājām savvaļas tipa T7 fāgu ātro farmakokinētiku (t½ ~ 28 min) asinīs24, 27, 28, kā arī noteicām to pussabrukšanas periodu cerebrospinālajā šķidrumā (t½ ~ 26 min) minūtē).Neskatoties uz līdzīgiem farmakokinētiskajiem profiliem asinīs un cerebrospinālajā šķidrumā, tikai 0, 001% fāga koncentrācijas asinīs varēja noteikt CSF, kas liecina par savvaļas tipa T7 fāga zemu fona mobilitāti pāri hematoencefālisko barjerai.Šis darbs uzsver pirmās atlases kārtas nozīmi, izmantojot in vivo panoramēšanas stratēģijas, īpaši fāgu sistēmām, kuras ātri tiek iztīrītas no cirkulācijas, jo daži kloni spēj sasniegt CNS nodalījumu.Tādējādi pirmajā kārtā bibliotēku daudzveidības samazinājums bija ļoti liels, jo šajā ļoti stingrajā CSF modelī galu galā tika savākts tikai ierobežots klonu skaits.Šī in vivo panoramēšanas stratēģija ietvēra vairākus atlases posmus, piemēram, aktīvu uzkrāšanos CSF nodalījumā, klonu izdzīvošanu asins nodalījumā un ātru T7 fāgu klonu izņemšanu no asinīm pirmajās 10 minūtēs (1.d attēls un papildu attēls 4M).).Tādējādi pēc pirmās kārtas CSF tika identificēti dažādi fāgu kloni, lai gan atsevišķiem dzīvniekiem tika izmantots viens un tas pats sākotnējais kopums.Tas liek domāt, ka vairākas stingras atlases darbības avotu bibliotēkām ar lielu bibliotēkas dalībnieku skaitu rada ievērojamu daudzveidības samazināšanos.Tāpēc nejauši notikumi kļūs par sākotnējās atlases procesa neatņemamu sastāvdaļu, lielā mērā ietekmējot rezultātu.Iespējams, ka daudziem no sākotnējās bibliotēkas kloniem bija ļoti līdzīga CSF bagātināšanas tieksme.Tomēr pat tādos pašos eksperimenta apstākļos atlases rezultāti var atšķirties, jo sākotnējā kopā ir neliels katra konkrētā klona skaits.
CSF bagātinātie motīvi atšķiras no tiem, kas ir asinīs.Interesanti, ka mēs novērojām pirmo pāreju uz glicīnu bagātiem peptīdiem atsevišķu dzīvnieku asinīs.(1.g. att., papildu 4.e, 4.f att.).Fāgi, kas satur glicīna peptīdus, var būt stabilāki un mazāk izņemti no apgrozības.Tomēr šie ar glicīnu bagātie peptīdi cerebrospinālā šķidruma paraugos netika atklāti, kas liecina, ka atlasītās bibliotēkas izgāja divus dažādus atlases posmus: vienu asinīs un otru ļāva uzkrāties cerebrospinālajā šķidrumā.Ar CSF bagātinātie kloni, kas iegūti ceturtās atlases kārtas rezultātā, ir plaši pārbaudīti.Tika apstiprināts, ka gandrīz visi atsevišķi pārbaudītie kloni ir bagātināti ar CSF, salīdzinot ar tukšo kontroles fāgu.Viens peptīda trāpījums (#2077) tika pārbaudīts sīkāk.Tas uzrādīja garāku plazmas pusperiodu, salīdzinot ar citiem trāpījumiem (3.d attēls un papildu attēls 7), un interesanti, ka šis peptīds C-galā saturēja cisteīna atlikumu.Nesen tika pierādīts, ka cisteīna pievienošana peptīdiem var uzlabot to farmakokinētiskās īpašības, saistoties ar albumīnu 29.Pašlaik tas nav zināms peptīdam #2077, un tam ir nepieciešami turpmāki pētījumi.Daži peptīdi uzrādīja valences atkarību CSF bagātināšanā (dati nav parādīti), kas var būt saistīta ar T7 kapsīda parādīto virsmas ģeometriju.Mūsu izmantotā T7 sistēma parādīja 5–15 katra peptīda kopijas katrā fāga daļiņā.IHC tika veikts ar kandidātu svina fāgu kloniem, kas tika ievadīti intravenozi žurku smadzeņu garozā (8. papildu attēls).Dati liecināja, ka vismaz trīs kloni (Nr. 2002, Nr. 2009 un Nr. 2077) mijiedarbojās ar BBB.Joprojām ir jānosaka, vai šī BBB mijiedarbība izraisa CSF uzkrāšanos vai šo klonu pārvietošanos tieši uz BCSFB.Svarīgi, ka mēs parādām, ka atlasītie peptīdi saglabā savu CSF transportēšanas spēju, kad tie tiek sintezēti un saistīti ar olbaltumvielu kravu.N-gala biotinilēto peptīdu saistīšanās ar SA būtībā atkārto rezultātus, kas iegūti ar to attiecīgajiem fāgu kloniem asinīs un cerebrospinālajā šķidrumā (3.e attēls).Visbeidzot, mēs parādām, ka svina peptīds #2077 spēj veicināt ar SA konjugētā BACE1 biotinilētā peptīda inhibitora smadzeņu darbību, izraisot izteiktu farmakodinamisko iedarbību CNS, ievērojami samazinot Abeta40 līmeni cerebrospinālajā šķidrumā (4. att.).Mēs nevarējām identificēt nevienu homologu datubāzē, veicot peptīdu sekvences homoloģijas meklēšanu visiem trāpījumiem.Ir svarīgi atzīmēt, ka T7 bibliotēkas lielums ir aptuveni 109, savukārt teorētiskais bibliotēkas lielums 12 mēriem ir 4 x 1015. Tāpēc mēs atlasījām tikai nelielu daļu no 12 mēru peptīdu bibliotēkas daudzveidības telpas, kas var nozīmēt, ka optimizētākus peptīdus var identificēt, novērtējot šo identificēto blakus esošo trāpījumu secību telpu.Hipotētiski viens no iemesliem, kāpēc mēs neesam atraduši šo peptīdu dabiskos homologus, var būt atlases atcelšana evolūcijas laikā, lai novērstu noteiktu peptīdu motīvu nekontrolētu iekļūšanu smadzenēs.
Kopumā mūsu rezultāti ir pamats turpmākam darbam, lai sīkāk identificētu un raksturotu smadzeņu asinsvadu barjeras transporta sistēmas in vivo.Šīs metodes pamatiestatījums ir balstīts uz funkcionālās atlases stratēģiju, kas ne tikai identificē klonus ar smadzeņu asinsvadu saistīšanās īpašībām, bet arī ietver kritisku soli, kurā veiksmīgiem kloniem ir raksturīga aktivitāte, lai šķērsotu bioloģiskās barjeras in vivo CNS nodalījumā.mērķis ir noskaidrot šo peptīdu transportēšanas mehānismu un to izvēli saistībā ar smadzeņu reģionam raksturīgo mikrovaskulāciju.Tas var novest pie jaunu ceļu atklāšanas BBB un receptoru transportēšanai.Mēs sagaidām, ka identificētie peptīdi var tieši saistīties ar cerebrovaskulāriem receptoriem vai cirkulējošiem ligandiem, kas tiek transportēti caur BBB vai BCSFB.Šajā darbā atklātie peptīdu vektori ar CSF transportēšanas aktivitāti tiks tālāk pētīti.Pašlaik mēs pētām šo peptīdu smadzeņu specifiku attiecībā uz to spēju šķērsot BBB un / vai BCSFB.Šie jaunie peptīdi būs ārkārtīgi vērtīgi instrumenti jaunu receptoru vai ceļu potenciālai atklāšanai un jaunu ļoti efektīvu platformu izstrādei makromolekulu, piemēram, bioloģisko vielu, piegādei smadzenēs.
Kanulējiet lielo cisternu (CM), izmantojot iepriekš aprakstītās metodes modifikāciju.Anestēzijas Wistar žurkas (200–350 g) tika uzstādītas uz stereotaksiskā aparāta, un uz noskūtas un aseptiski sagatavotas galvas ādas tika veikts vidējais iegriezums, lai atklātu galvaskausu.Augšējās vērtnes zonā izurbiet divus caurumus un piestipriniet caurumos stiprinājuma skrūves.Sānu pakauša cekulā tika izurbts papildu caurums, lai nerūsējošā tērauda kanulu stereotaktiski virzītu CM.Uzklājiet zobu cementu ap kanulu un nostipriniet ar skrūvēm.Pēc fotocietēšanas un cementa sacietēšanas ādas brūce tika noslēgta ar 4/0 supramid šuvi.Pareizu kaniles novietojumu apstiprina spontāna cerebrospinālā šķidruma (CSF) noplūde.Izņemiet žurku no stereotaksiskā aparāta, saņemiet atbilstošu pēcoperācijas aprūpi un sāpju mazināšanu un ļaujiet tai atveseļoties vismaz vienu nedēļu, līdz cerebrospinālajā šķidrumā tiek novērotas asiņu pazīmes.Wistar žurkas (Crl: WI/Han) tika iegūtas no Charles River (Francija).Visas žurkas tika turētas īpašos apstākļos, kas nesatur patogēnus.Visus eksperimentus ar dzīvniekiem apstiprināja Šveices Bāzeles pilsētas veterinārais birojs, un tie tika veikti saskaņā ar dzīvnieku licenci Nr. 2474 (Aktīvās smadzeņu transportēšanas novērtējums, mērot terapeitisko kandidātu līmeni cerebrospinālajā šķidrumā un žurkas smadzenēs).
Uzmanīgi turiet žurku pie samaņas ar CM kanuli rokā.Izņemiet Datura no kanulas un savāciet 10 µl spontāni plūstoša cerebrospinālā šķidruma.Tā kā kanulas caurlaidība galu galā tika apdraudēta, šajā pētījumā tika iekļauti tikai dzidri cerebrospinālā šķidruma paraugi bez asins piesārņojuma vai krāsas maiņas pazīmēm.Paralēli no neliela iegriezuma astes galā mēģenēs ar heparīnu (Sigma-Aldrich) tika ņemti aptuveni 10–20 μl asiņu.CSF un asinis tika savākti dažādos laika punktos pēc T7 fāga intravenozas injekcijas.Pirms katra CSF parauga savākšanas tika izmesti aptuveni 5–10 μl šķidruma, kas atbilst katetra mirušajam tilpumam.
Bibliotēkas tika ģenerētas, izmantojot T7Select 10-3b vektoru, kā aprakstīts T7Select sistēmas rokasgrāmatā (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996).Īsumā, nejaušs 12-mēru DNS ieliktnis tika sintezēts šādā formātā:
NNK kodons tika izmantots, lai izvairītos no dubultās stopkodoniem un aminoskābju pārmērīgas ekspresijas ievietojumā.N ir manuāli sajaukta katra nukleotīda ekvimolārā attiecība, un K ir manuāli sajaukta adenīna un citozīna nukleotīdu ekvimolārā attiecība.Vienpavedienu reģioni tika pārveidoti par divpavedienu DNS, turpmāk inkubējot ar dNTP (Novagen) un Klenow fermentu (New England Biolabs) Klenovas buferšķīdumā (New England Biolabs) 3 stundas 37 ° C temperatūrā.Pēc reakcijas divpavedienu DNS tika iegūta ar EtOH izgulsnēšanos.Iegūtā DNS tika sagremota ar restrikcijas enzīmiem EcoRI un HindIII (abi no Roche).Sadalītais un attīrītais (QIAquick, Qiagen) ieliktnis (T4 ligāze, New England Biolabs) tika ligēts kadrā iepriekš sadalītā T7 vektorā pēc 10B kapsīda gēna 348. aminoskābes.Ligācijas reakcijas tika inkubētas 16 °C temperatūrā 18 stundas pirms iepakošanas in vitro.Fāgu iesaiņošana in vitro tika veikta saskaņā ar instrukcijām, kas pievienotas T7Select 10-3b klonēšanas komplektam (Novagen), un iepakojuma šķīdums tika vienreiz pastiprināts, lai lizētu, izmantojot Escherichia coli (BLT5615, Novagen).Lizāti tika centrifugēti, titrēti un sasaldēti -80°C kā glicerīna izejas šķīdums.
Fāgu mainīgo reģionu tieša PCR amplifikācija, kas pastiprināta buljonā vai plāksnē, izmantojot patentētus 454/Roche-amplikona saplūšanas praimerus.Priekšējā saplūšanas primer satur sekvences, kas atrodas blakus mainīgajam reģionam (NNK) 12 (specifisks veidnei), GS FLX titāna adapteri A un četru bāzu bibliotēkas atslēgu secību (TCAG) (papildu attēls 1a):
Reversās saplūšanas grunts satur arī biotīnu, kas pievienots uztveršanas lodītēm, un GS FLX titāna adapteri B, kas nepieciešams klonālajai amplifikācijai emulsijas PCR laikā:
Pēc tam amplikoni tika pakļauti 454/Roche pirozes noteikšanai saskaņā ar 454 GS-FLX Titanium protokolu.Manuālai Sangera sekvencēšanai (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNS Analyzer) T7 fāga DNS tika pastiprināta ar PCR un sekvencēta ar šādiem primeru pāriem:
Ieliktņi no atsevišķām plāksnēm tika pakļauti PCR amplifikācijai, izmantojot Roche Fast Start DNS polimerāzes komplektu (saskaņā ar ražotāja norādījumiem).Veiciet karsto palaišanu (10 min pie 95 °C) un 35 pastiprināšanas ciklus (50 s pie 95 °C, 1 min pie 50 °C un 1 min pie 72 °C).
Fāgs no bibliotēkām, savvaļas tipa fāgs, no CSF ​​un asinīm izglābtie fāgi vai atsevišķi kloni tika amplificēti Escherichia coli BL5615 TB buljonā (Sigma Aldrich) vai 500 cm2 traukos (Thermo Scientific) 4 stundas 37 °C temperatūrā.Fāgi tika ekstrahēti no plāksnēm, skalojot plāksnes ar Tris-EDTA buferšķīdumu (Fluka Analytical) vai savācot plāksnes ar steriliem pipetes galiem.Fāgi tika izolēti no kultūras supernatanta vai ekstrakcijas buferšķīduma ar vienu polietilēnglikola (PEG 8000) izgulsnēšanas kārtu (Promega) un atkārtoti suspendēti Tris-EDTA buferšķīdumā.
Pastiprinātais fāgs tika pakļauts 2–3 endotoksīna noņemšanas kārtām, izmantojot endotoksīna noņemšanas lodītes (Miltenyi Biotec), pirms intravenozas (IV) injekcijas (500 μl uz dzīvnieku).Pirmajā kārtā tika ieviesti 2×1012 fāgi;otrajā – 2×1010 fāgi;trešajā un ceturtajā atlases kārtā 2×109 fāgi vienam dzīvniekam.Fāgu saturs CSF un asins paraugos, kas savākti norādītajos laika punktos, tika noteikts, skaitot plāksnes saskaņā ar ražotāja norādījumiem (T7Select sistēmas rokasgrāmata).Fāgu atlase tika veikta, intravenozi injicējot attīrītas bibliotēkas astes vēnā vai atkārtoti injicējot fāgu, kas ekstrahēts no CSF ​​no iepriekšējās atlases kārtas, un turpmākās novākšanas tika veiktas attiecīgi 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min un 240 min CSF un asins paraugus.Kopumā tika veiktas četras in vivo panoramēšanas kārtas, kurās abas atlasītās filiāles tika atsevišķi uzglabātas un analizētas pirmajās trīs atlases kārtās.Visiem fāgu ieliktņiem, kas iegūti no CSF ​​no pirmajām divām atlases kārtām, tika veikta 454/Roche pirosekvenēšana, savukārt visi kloni, kas iegūti no CSF ​​no pēdējām divām atlases kārtām, tika manuāli sekvencēti.Visi asins fāgi no pirmās atlases kārtas tika pakļauti arī 454/Roche pirosekvencijai.Fāgu klonu injicēšanai atlasītie fāgi tika amplificēti E. coli (BL5615) uz 500 cm2 plāksnēm 37 °C temperatūrā 4 stundas.Atsevišķi atlasīti un manuāli sekvencēti kloni tika pavairoti TB barotnē.Pēc fāgu ekstrakcijas, attīrīšanas un endotoksīna noņemšanas (kā aprakstīts iepriekš), 2 × 1010 fāgi uz dzīvnieku 300 μl tika ievadīti intravenozi vienā astes vēnā.
Secību datu pirmapstrāde un kvalitatīva filtrēšana.Neapstrādāti 454/Roche dati tika pārveidoti no bināra standarta straumes kartes formāta (sff) uz Pearson cilvēkam lasāmu formātu (fasta), izmantojot pārdevēja programmatūru.Tālāka nukleotīdu secības apstrāde tika veikta, izmantojot patentētas C programmas un skriptus (neizlaista programmatūras pakotne), kā aprakstīts tālāk.Primāro datu analīze ietver stingras daudzpakāpju filtrēšanas procedūras.Lai filtrētu nolasījumus, kas nesatur derīgu 12 mer ieliktņa DNS secību, nolasījumi tika secīgi saskaņoti ar sākuma etiķeti (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), beigu etiķeti (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) un fona ieliktni (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC), izmantojot globālo testu W.izlīdzināšana, pieļaujot līdz 2 neatbilstībām vienā izlīdzinājumā31.Tāpēc no bibliotēkas tika izņemti nolasījumi bez sākuma un beigu tagiem un nolasījumi, kas satur fona ieliktņus, ti, līdzinājumus, kas pārsniedz atļauto neatbilstību skaitu.Kas attiecas uz atlikušajiem nolasījumiem, N-mer DNS sekvence, kas stiepjas no sākuma atzīmes un beidzas pirms beigu atzīmes, tika izgriezta no sākotnējās nolasīšanas secības un tālāk apstrādāta (turpmāk tekstā "ievietot").Pēc ieliktņa translācijas daļa pēc pirmā stopkodona, kas atrodas primera 5′ galā, tiek izņemta no ieliktņa.Turklāt tika noņemti arī nukleotīdi, kas noved pie nepilnīgiem kodoniem praimera 3′ galā.Lai izslēgtu ieliktņus, kas satur tikai fona sekvences, tika noņemti arī tulkotie ieliktņi, kas sākas ar aminoskābju modeli “PAG”.No bibliotēkas tika izņemti peptīdi, kuru pēctranslācijas garums bija mazāks par 3 aminoskābēm.Visbeidzot, noņemiet dublēšanos ieliktņu pūlā un nosakiet katra unikālā ieliktņa biežumu.Šīs analīzes rezultāti ietvēra nukleotīdu secību (ieliktņu) un to (lasīšanas) frekvenču sarakstu (1.c un 2. papildu attēls).
Grupējiet N-mer DNS ieliktņus pēc secības līdzības: lai novērstu 454/Roche specifiskās sekvencēšanas kļūdas (piemēram, problēmas ar sekvencēšanas homopolimēra paplašinājumiem) un noņemtu mazāk svarīgas liekās vietas, iepriekš filtrētie N-mer DNS sekvences ieliktņi (ieliktņi) tiek sakārtoti pēc līdzības.ievietošanas (atļautas līdz 2 neatbilstošām bāzēm), izmantojot iteratīvu algoritmu, kas definēts šādi: ievietojumi vispirms tiek kārtoti pēc to biežuma (no augstākā līdz zemākajam) un, ja tie ir vienādi, pēc sekundārās kārtošanas pēc garuma (no garākā uz īsāko) ).Tādējādi visizplatītākie un garākie ievietojumi nosaka pirmo “grupu”.Grupas frekvence ir iestatīta uz atslēgas frekvenci.Pēc tam katru ievietojumu, kas palika sakārtotajā sarakstā, mēģināja pievienot grupai, veicot pāra Needleman-Wunsch izlīdzināšanu.Ja neatbilstību, ievietošanas vai svītrojumu skaits līdzinājumā nepārsniedz slieksni 2, grupai tiek pievienota ievietošana, un kopējā grupas biežums tiek palielināts par to, cik bieži ievietošana tika pievienota.Grupai pievienotie ieliktņi tiek atzīmēti kā izmantoti un izslēgti no turpmākās apstrādes.Ja ievietošanas secību nevar pievienot jau esošai grupai, ievietošanas secība tiek izmantota, lai izveidotu jaunu grupu ar atbilstošu ievietošanas biežumu un atzīmēta kā lietota.Iterācija beidzas, kad katra ievietošanas secība ir vai nu izmantota, lai izveidotu jaunu grupu, vai arī to var iekļaut jau esošā grupā.Galu galā grupēti ieliktņi, kas sastāv no nukleotīdiem, galu galā tiek pārvērsti peptīdu sekvencēs (peptīdu bibliotēkās).Šīs analīzes rezultāts ir ievietojumu kopums un to atbilstošās frekvences, kas veido secīgu nolasījumu skaitu (2. papildu attēls).
Motīvu ģenerēšana: pamatojoties uz unikālu peptīdu sarakstu, tika izveidota bibliotēka, kas satur visus iespējamos aminoskābju modeļus (aa), kā parādīts zemāk.Katrs iespējamais 3. garuma modelis tika iegūts no peptīda, un tā apgrieztais modelis tika pievienots kopā ar kopēju motīvu bibliotēku, kas satur visus modeļus (tripeptīdus).Tika sakārtotas ļoti atkārtotu motīvu bibliotēkas un noņemta dublēšana.Pēc tam katram tripeptīdam motīvu bibliotēkā, izmantojot skaitļošanas rīkus, mēs pārbaudījām tā klātbūtni bibliotēkā.Šajā gadījumā tiek pievienota atrastā motīva tripeptīda saturošā peptīda frekvence un piešķirta motīvam motīvu bibliotēkā (“motīvu skaits”).Motīvu ģenerēšanas rezultāts ir divdimensiju masīvs, kas satur visus tripeptīdu (motīvu) gadījumus un to attiecīgās vērtības, kas ir secības nolasījumu skaits, kas rada atbilstošo motīvu, kad lasījumi tiek filtrēti, grupēti un tulkoti.Metrika, kā detalizēti aprakstīts iepriekš.
Motīvu skaita un atbilstošo izkliedes diagrammu normalizēšana: katra parauga motīvu skaits tika normalizēts, izmantojot
kur ni ir to lasījumu skaits, kas satur tēmu i.Tādējādi vi apzīmē to nolasījumu (vai peptīdu) procentuālo biežumu, kas paraugā satur motīvu i.P vērtības nenormalizētajam motīvu skaitam tika aprēķinātas, izmantojot Fišera precīzu testu.Attiecībā uz motīvu skaita korelogrammām Spīrmena korelācijas tika aprēķinātas, izmantojot normalizēto motīvu skaitu ar R.
Lai vizualizētu aminoskābju saturu katrā peptīdu bibliotēkas pozīcijā, tika izveidotas tīmekļa logogrammas 32, 33 (//weblogo.threeplusone.com).Pirmkārt, aminoskābju saturs katrā 12-mēru peptīda pozīcijā tiek uzglabāts 20 × 12 matricā.Pēc tam 1000 peptīdu komplekts, kas satur vienādu relatīvo aminoskābju saturu katrā pozīcijā, tiek ģenerēts fasta secības formātā un tiek nodrošināts kā ievade tīmekļa logotipam 3, kas ģenerē relatīvā aminoskābju satura grafisku attēlojumu katrā pozīcijā.noteiktai peptīdu bibliotēkai.Lai vizualizētu daudzdimensiju datu kopas, tika izveidotas siltuma kartes, izmantojot iekšēji izstrādātu rīku R (biosHeatmap, R pakotne, kas vēl nav izlaista).Siltuma kartēs parādītās dendrogrammas tika aprēķinātas, izmantojot Vordas hierarhiskās klasterizācijas metodi ar Eiklīda attāluma metriku.Motīvu vērtēšanas datu statistiskai analīzei P vērtības nenormalizētai vērtēšanai tika aprēķinātas, izmantojot Fišera precīzu testu.Citu datu kopu P vērtības tika aprēķinātas R, izmantojot Studenta t-testu vai ANOVA.
Atlasītie fāgu kloni un fāgi bez ieliktņiem tika injicēti intravenozi caur astes vēnu (2 × 1010 fāgi/dzīvnieks 300 μl PBS).Desmit minūtes pirms perfūzijas un turpmākās fiksācijas tiem pašiem dzīvniekiem intravenozi injicēja 100 μl ar DyLight594 iezīmēta lektīna (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minūtes pēc fāga injekcijas žurkas tika perfūzētas caur sirdi ar 50 ml PBS, kam sekoja 50 ml 4% PFA/PBS.Smadzeņu paraugi tika papildus fiksēti nakti 4% PFA/PBS un iemērc 30% saharozē uz nakti 4 °C temperatūrā.Paraugus ātri sasaldē AZT maisījumā.Saldētu paraugu imūnhistoķīmiskā analīze tika veikta istabas temperatūrā uz 30 µm krio sekcijām, kas bloķētas ar 1% BSA un inkubētas ar poliklonālām FITC iezīmētām antivielām pret T7 fāgu (Novus NB 600-376A) 4 °C temperatūrā.Inkubē pa nakti.Visbeidzot, sekcijas tika mazgātas 3 reizes ar PBS un pārbaudītas ar konfokālo lāzera mikroskopu (Leica TCS SP5).
Visi peptīdi ar minimālo tīrības pakāpi 98% tika sintezēti ar GenScript USA, biotinilēti un liofilizēti.Biotīns ir saistīts ar papildu trīskāršā glicīna starpliku N-galā.Pārbaudiet visus peptīdus, izmantojot masas spektrometriju.
Streptavidīns (Sigma S0677) tika sajaukts ar 5-kārtīgu ekvimolāru biotinilēta peptīda, biotinilēta BACE1 inhibējošā peptīda vai biotinilēta BACE1 inhibējošā peptīda un BACE1 inhibējošā peptīda kombināciju (attiecībā 3:1) 5–10% DMSO/inkubēta PBS.1 stundu istabas temperatūrā pirms injekcijas.Ar streptavidīnu konjugētie peptīdi tika ievadīti intravenozi 10 mg/kg devā vienā no astes vēnām žurkām ar smadzeņu dobumu.
Streptavidīna-peptīdu kompleksu koncentrācija tika novērtēta ar ELISA.Nunc Maxisorp mikrotitrēšanas plāksnes (Sigma) uz nakti tika pārklātas 4 ° C temperatūrā ar 1, 5 μg/ml peles anti-streptavidīna antivielu (Thermo, MA1-20011).Pēc bloķēšanas (bloķējošais buferšķīdums: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% želatīns, 1% BSA) istabas temperatūrā 2 stundas, mazgājiet plāksni ar 0,05% Tween-20/PBS (mazgāšanas buferis) 3 sekundei (plazmas iedobei pievienoja CSF un 1. 000, CSF 1:115).Pēc tam plāksni inkubēja nakti 4 ° C temperatūrā ar noteikšanas antivielu (1 μg / ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239).Pēc trim mazgāšanas posmiem streptavidīns tika noteikts, inkubējot TMB substrāta šķīdumā (Roche) līdz 20 minūtēm.Pēc krāsas attīstības apturēšanas ar 1M H2SO4 izmēra absorbciju pie 450 nm.
Streptavidīna-peptīda-BACE1 inhibitora kompleksa funkcija tika novērtēta ar Aβ(1-40) ELISA metodi saskaņā ar ražotāja protokolu (Wako, 294-64701).Īsumā, CSF paraugus atšķaida standarta šķīdinātājā (1:23) un inkubēja nakti 4 ° C temperatūrā 96 iedobju plāksnēs, kas pārklātas ar BNT77 uztveršanas antivielu.Pēc pieciem mazgāšanas posmiem pievienoja ar HRP konjugētu BA27 antivielu un inkubēja 2 stundas 4 ° C temperatūrā, kam sekoja piecas mazgāšanas darbības.Aβ (1–40) tika noteikts, inkubējot TMB šķīdumā 30 minūtes istabas temperatūrā.Pēc tam, kad krāsas attīstība ir apturēta ar apturēšanas šķīdumu, izmēra absorbciju pie 450 nm.Plazmas paraugi tika pakļauti cietās fāzes ekstrakcijai pirms Aβ (1–40) ELISA.Plazmu pievienoja 0, 2% DEA (Sigma) 96 iedobju plāksnēs un inkubēja istabas temperatūrā 30 minūtes.Pēc secīgas SPE plākšņu (Oasis, 186000679) mazgāšanas ar ūdeni un 100% metanolu SPE plāksnēm tika pievienoti plazmas paraugi un viss šķidrums tika noņemts.Paraugi tika mazgāti (vispirms ar 5% metanolu, tad 30% metanolu) un eluēti ar 2% NH4OH/90% metanolu.Pēc eluāta žāvēšanas 55 ° C temperatūrā 99 minūtes pie nemainīgas N2 strāvas, paraugi tika samazināti standarta atšķaidītājos un Aβ (1–40) tika mērīts, kā aprakstīts iepriekš.
Kā citēt šo rakstu: Urich, E. et al.Kravas piegāde smadzenēs, izmantojot tranzīta peptīdus, kas identificēti in vivo.zinātne.5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB un Moos T. Makromolekulāro zāļu piegāde smadzenēm, izmantojot mērķterapiju.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., un Martinez-Martinez, P. Peptīdu un olbaltumvielu zāļu piegāde pāri asins-smadzeņu barjerai.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Asins-smadzeņu barjera: vājš kakls smadzeņu zāļu attīstībā.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johansons, KE, Duncan, JA, Stopa, EG un Byrd, A. Izredzes uzlabot zāļu piegādi un mērķēšanu uz smadzenēm, izmantojot dzīslas pinuma-CSF ceļu.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Biofarmaceitisko preparātu modernizācija ar molekulārajiem Trojas zirgiem smadzeņu piegādei.Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptoru mediēta peptīdu transportēšana caur asins-smadzeņu barjeru.Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al.Palieliniet iekļūšanu smadzenēs un terapeitisko antivielu efektivitāti, izmantojot monovalentus molekulāros vilcienus.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al.Transferrīna receptoru (TfR) transports nosaka TfR antivielu afinitātes variantu uzņemšanu smadzenēs.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).