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A barreira hematoencefálica e a barreira hematoencefálica impedem que agentes bioterapêuticos atinjam seus alvos no sistema nervoso central, dificultando assim o tratamento eficaz de doenças neurológicas. Para descobrir novos transportadores cerebrais in vivo, introduzimos uma biblioteca de peptídeos de fagos T7 e coletamos sangue e líquido cefalorraquidiano (LCR) em série usando um modelo de grande pool consciente canulado de ratos. Clones de fagos específicos foram altamente enriquecidos no LCR após quatro rodadas de seleção. O teste de peptídeos candidatos individuais revelou um enriquecimento de mais de 1000 vezes no LCR. A bioatividade da entrega mediada por peptídeo ao cérebro foi confirmada por uma redução de 40% no nível de beta-amiloide no líquido cefalorraquidiano usando um inibidor de peptídeo BACE1 ligado ao novo peptídeo de trânsito identificado. Esses resultados sugerem que os peptídeos identificados por métodos de seleção de fagos in vivo podem ser veículos úteis para a entrega sistêmica de macromoléculas ao cérebro com efeito terapêutico.
A pesquisa em terapia direcionada ao sistema nervoso central (SNC) tem se concentrado amplamente na identificação de fármacos e agentes otimizados que apresentem propriedades de direcionamento ao SNC, com menos esforço na descoberta dos mecanismos que impulsionam a administração ativa de fármacos ao cérebro. Isso está começando a mudar agora, uma vez que a administração de fármacos, especialmente de moléculas grandes, é parte integrante do desenvolvimento moderno de fármacos em neurociência. O ambiente do sistema nervoso central é bem protegido pelo sistema de barreira cerebrovascular, composto pela barreira hematoencefálica (BHE) e pela barreira hematoencefálica (BCBB)1, tornando desafiador o fornecimento de fármacos ao cérebro1,2. Estima-se que quase todos os fármacos de moléculas grandes e mais de 98% dos fármacos de moléculas pequenas são eliminados do cérebro3. Por isso, é muito importante identificar novos sistemas de transporte cerebral que proporcionem a administração eficiente e específica de fármacos terapêuticos ao SNC4,5. No entanto, a BHE e a BCSFB também apresentam uma excelente oportunidade para a administração de fármacos, pois penetram e entram em todas as estruturas do cérebro através de sua extensa vasculatura. Assim, os esforços atuais para usar métodos não invasivos de entrega ao cérebro são amplamente baseados no mecanismo de transporte mediado por receptor (PMT) usando o receptor BBB6 endógeno. Apesar dos recentes avanços importantes usando a via do receptor de transferrina7,8, o desenvolvimento adicional de novos sistemas de entrega com propriedades aprimoradas é necessário. Para este fim, nosso objetivo foi identificar peptídeos capazes de mediar o transporte do LCR, pois eles poderiam, em princípio, ser usados ​​para entregar macromoléculas ao SNC ou para abrir novas vias de receptor. Em particular, receptores e transportadores específicos do sistema cerebrovascular (BBB e BSCFB) podem servir como alvos potenciais para a entrega ativa e específica de fármacos bioterapêuticos. O líquido cefalorraquidiano (LCR) é um produto secretor do plexo coroide (SC) e está em contato direto com o líquido intersticial do cérebro através do espaço subaracnóideo e do espaço ventricular4. Recentemente, foi demonstrado que o líquido cefalorraquidiano subaracnóideo difunde-se excessivamente para o interstício do cérebro9. Esperamos acessar o espaço parenquimatoso por meio deste trato de entrada subaracnóideo ou diretamente pela BHE. Para isso, implementamos uma estratégia robusta de seleção de fagos in vivo que identifica, idealmente, peptídeos transportados por qualquer uma dessas duas vias distintas.
Descrevemos agora um método de triagem sequencial de exibição de fagos in vivo com amostragem de LCR acoplada a sequenciamento de alto rendimento (HTS) para monitorar rodadas de seleção iniciais com a maior diversidade de biblioteca. A triagem foi realizada em ratos conscientes com uma cânula de cisterna grande (CM) implantada permanentemente para evitar contaminação sanguínea. Importantemente, essa abordagem seleciona tanto peptídeos alvos cerebrais quanto peptídeos com atividade de transporte através da barreira cerebrovascular. Utilizamos fagos T7 devido ao seu pequeno tamanho (~60 nm)10 e sugerimos que eles são adequados para o transporte de vesículas que permitem a travessia transcelular da barreira endotelial e/ou epitelial-medular. Após quatro rodadas de triagem, populações de fagos foram isoladas mostrando forte enriquecimento in vivo de LCR e associação com microvasos cerebrais. Importantemente, fomos capazes de confirmar nossas descobertas demonstrando que os melhores peptídeos candidatos preferidos e sintetizados quimicamente são capazes de transportar carga proteica para o líquido cefalorraquidiano. Primeiramente, os efeitos farmacodinâmicos no SNC foram estabelecidos pela combinação de um peptídeo de trânsito líder com um inibidor do peptídeo BACE1. Além de demonstrar que estratégias de triagem funcional in vivo podem identificar novos peptídeos de transporte cerebral como transportadores eficazes de proteínas, esperamos que abordagens semelhantes de seleção funcional também se tornem importantes na identificação de novas vias de transporte cerebral.
Com base em unidades formadoras de placas (UFP), após a etapa de empacotamento do fago, uma biblioteca de peptídeos aleatórios de fagos T7 lineares de 12-meros com uma diversidade de aproximadamente 109 foi projetada e criada (ver Materiais e Métodos). É importante notar que analisamos cuidadosamente essa biblioteca antes da seleção in vivo. A amplificação por PCR de amostras da biblioteca de fagos usando primers modificados gerou amplicons diretamente aplicáveis ​​ao HTS (Fig. Suplementar 1a). Devido a a) erros de sequenciamento do HTS11, b) impacto na qualidade dos primers (NNK)1-12 e c) presença de fagos selvagens (inserções esqueléticas) na biblioteca de reserva, um procedimento de filtragem de sequências foi implementado para extrair apenas informações de sequência verificadas (Fig. Suplementar 1b). Essas etapas de filtragem se aplicam a todas as bibliotecas de sequenciamento do HTS. Para a biblioteca padrão, um total de 233.868 leituras foram obtidas, das quais 39% passaram pelos critérios de filtragem e foram usadas para análise e seleção da biblioteca para rodadas subsequentes (Figura Suplementar 1c-e). As leituras eram predominantemente múltiplas de 3 pares de bases de comprimento, com um pico em 36 nucleotídeos (Figura Suplementar 1c), confirmando o desenho da biblioteca (NNK) 1-12. Notavelmente, aproximadamente 11% dos membros da biblioteca continham uma inserção PAGISRELVDKL de estrutura 12-dimensional de tipo selvagem (wt), e quase metade das sequências (49%) continham inserções ou deleções. O HTS da biblioteca confirmou a alta diversidade de peptídeos na biblioteca: mais de 81% das sequências de peptídeos foram encontradas apenas uma vez e apenas 1,5% ocorreram em ≥4 cópias (Figura Suplementar 2a). As frequências de aminoácidos (aa) em todas as 12 posições do repertório correlacionaram-se bem com as frequências esperadas para o número de códons gerados pelo repertório NKK degenerado (Fig. 2b Suplementar). A frequência observada de resíduos aa codificados por essas inserções correlacionou-se bem com a frequência calculada (r = 0,893) (Fig. 2c Suplementar). A preparação de bibliotecas de fagos para injeção inclui as etapas de amplificação e remoção de endotoxina. Isso já demonstrou reduzir potencialmente a diversidade de bibliotecas de fagos12,13. Portanto, sequenciamos uma biblioteca de fagos amplificada em placa que havia sido submetida à remoção de endotoxina e a comparamos com a biblioteca original para estimar a frequência de AA. Uma forte correlação (r = 0,995) foi observada entre o pool original e o pool amplificado e purificado (Fig. 2d Suplementar), indicando que a competição entre clones amplificados em placas usando o fago T7 não causou viés significativo. Esta comparação baseia-se na frequência dos motivos tripeptídicos em cada biblioteca, uma vez que a diversidade das bibliotecas (~109) não pode ser totalmente capturada mesmo com HTS. A análise da frequência de aa em cada posição revelou um pequeno viés dependente da posição nas três últimas posições do repertório inserido (Fig. Suplementar 2e). Em conclusão, concluímos que a qualidade e a diversidade da biblioteca eram aceitáveis ​​e que apenas pequenas alterações na diversidade foram observadas devido à amplificação e preparação das bibliotecas de fagos entre várias rodadas de seleção.
A amostragem seriada do líquido cefalorraquidiano pode ser realizada implantando cirurgicamente uma cânula no CM de ratos conscientes para facilitar a identificação do fago T7 injetado intravenosamente (iv) via BBB e/ou BCSFB (Fig. 1a-b). Utilizamos dois braços de seleção independentes (braços A e B) nas três primeiras rodadas de seleção in vivo (Fig. 1c). Aumentamos gradualmente o rigor da seleção, diminuindo a quantidade total de fago introduzida nas três primeiras rodadas de seleção. Para a quarta rodada de seleção, combinamos amostras dos ramos A e B e realizamos três seleções independentes adicionais. Para estudar as propriedades in vivo das partículas de fago T7 neste modelo, o fago selvagem (inserção principal PAGISRELVDKL) foi injetado em ratos através da veia caudal. A recuperação de fagos do líquido cefalorraquidiano e do sangue em diferentes momentos mostrou que fagos icosaédricos T7 relativamente pequenos tiveram uma fase inicial de depuração do compartimento sanguíneo (Fig. Suplementar 3). Com base nos títulos administrados e no volume sanguíneo dos ratos, calculamos que apenas aproximadamente 1% do peso do fago da dose administrada foi detectado no sangue 10 minutos após a injeção intravenosa. Após esse rápido declínio inicial, uma depuração primária mais lenta foi medida, com meia-vida de 27,7 minutos. Importante ressaltar que apenas poucos fagos foram recuperados do compartimento do LCR, indicando um baixo nível de migração de fagos selvagens para o compartimento do LCR (Fig. Suplementar 3). Em média, apenas cerca de 1 x 10-3% dos títulos de fagos T7 no sangue e 4 x 10-8% dos fagos inicialmente infundidos foram detectados no líquido cefalorraquidiano durante todo o período de amostragem (0-250 min). Notavelmente, a meia-vida (25,7 min) do fago selvagem no líquido cefalorraquidiano foi semelhante à observada no sangue. Esses dados demonstram que a barreira que separa o compartimento do LCR do sangue está intacta em ratos canulados com CM, permitindo a seleção in vivo de bibliotecas de fagos para identificar clones que são facilmente transportados do sangue para o compartimento do LCR.
(a) Estabelecimento de um método para reamostragem de líquido cefalorraquidiano (LCR) de um grande pool. (b) Diagrama mostrando a localização celular da barreira do sistema nervoso central (SNC) e a estratégia de seleção usada para identificar peptídeos que cruzam a barreira hematoencefálica (BHE) e a barreira hematoencefálica. (c) Fluxograma de triagem de exibição de fagos in vivo. Em cada rodada de seleção, os fagos (identificadores de animais dentro das setas) foram injetados intravenosamente. Dois ramos alternativos independentes (A, B) são mantidos separadamente até a quarta rodada de seleção. Para as rodadas de seleção 3 e 4, cada clone de fago extraído do LCR foi sequenciado manualmente. (d) Cinética do fago isolado do sangue (círculos vermelhos) e do líquido cefalorraquidiano (triângulos verdes) durante a primeira rodada de seleção em dois ratos canulados após injeção intravenosa da biblioteca de peptídeos T7 (2 x 1012 fagos/animal). Quadrados azuis indicam a concentração inicial média de fago no sangue, calculada a partir da quantidade de fago injetado, levando em consideração o volume total de sangue. Os quadrados pretos indicam o ponto de intersecção da linha y extrapolada das concentrações de fagos no sangue. (e,f) Apresente a frequência relativa e a distribuição de todos os possíveis motivos tripeptídeos sobrepostos encontrados no peptídeo. O número de motivos encontrados em 1000 leituras é mostrado. Motivos significativamente (p < 0,001) enriquecidos são marcados com pontos vermelhos. (e) Diagrama de dispersão de correlação comparando a frequência relativa do motivo tripeptídeo da biblioteca injetada com o fago derivado do sangue dos animais #1.1 e #1.2. (f) Diagrama de dispersão de correlação comparando as frequências relativas dos motivos tripeptídeos #1.1 e #1.2 de fagos animais isolados no sangue e no fluido cerebrospinal. (g, h) Representação da ID da sequência do fago enriquecido no sangue (g) versus bibliotecas injetadas e do fago enriquecido no LCR (h) versus sangue após uma rodada de seleção in vivo em ambos os animais. O tamanho do código de uma letra indica a frequência com que aquele aminoácido ocorre naquela posição. Verde = polar, roxo = neutro, azul = básico, vermelho = ácido e preto = aminoácidos hidrofóbicos. As Figuras 1a e 1b foram projetadas e produzidas por Eduard Urich.
Injetamos uma biblioteca de peptídeos de fagos em dois ratos com instrumento de CM (clados A e B) e isolamos o fago do líquido cefalorraquidiano e do sangue (Figura 1d). A rápida depuração inicial da biblioteca foi menos pronunciada em comparação com o fago selvagem. A meia-vida média da biblioteca injetada em ambos os animais foi de 24,8 minutos no sangue, semelhante ao fago selvagem, e 38,5 minutos no LCR. Amostras de fagos de sangue e líquido cefalorraquidiano de cada animal foram submetidas a HTS e todos os peptídeos identificados foram analisados ​​quanto à presença de um motivo tripeptídeo curto. Os motivos tripeptídeos foram escolhidos porque fornecem uma base mínima para a formação da estrutura e interações peptídeo-proteína14,15. Encontramos uma boa correlação na distribuição de motivos entre a biblioteca de fagos injetada e os clones extraídos do sangue de ambos os animais (Fig. 1e). Os dados indicam que a composição da biblioteca é apenas marginalmente enriquecida no compartimento sanguíneo. As frequências de aminoácidos e as sequências de consenso foram analisadas em cada posição utilizando uma adaptação do software Weblogo16. Curiosamente, encontramos um forte enriquecimento nos resíduos de glicina do sangue (Fig. 1g). Quando o sangue foi comparado com clones selecionados do LCR, observou-se forte seleção e alguma desseleção de motivos (Fig. 1f), e certos aminoácidos estavam preferencialmente presentes em posições predeterminadas no 12-membro (Fig. 1h). Notavelmente, os animais individuais diferiram significativamente no líquido cefalorraquidiano, enquanto o enriquecimento de glicina no sangue foi observado em ambos os animais (Fig. 4a-j suplementares). Após filtragem rigorosa dos dados de sequência no líquido cefalorraquidiano dos animais nº 1.1 e nº 1.2, foram obtidos um total de 964 e 420 peptídeos 12-mer únicos (Fig. 1d-e suplementares). Os clones de fagos isolados foram amplificados e submetidos a uma segunda rodada de seleção in vivo. Os fagos extraídos da segunda rodada de seleção foram submetidos a HTS em cada animal e todos os peptídeos identificados foram usados ​​como entrada para um programa de reconhecimento de motivos para analisar a ocorrência de motivos tripeptídicos (Fig. 2a, b, ef). Comparado ao primeiro ciclo do fago recuperado do LCR, observamos mais seleção e desseleção de muitos motivos no LCR nos ramos A e B (Fig. 2). Um algoritmo de identificação de rede foi aplicado para determinar se eles representavam diferentes padrões de sequência consistente. Uma clara similaridade foi observada entre as sequências 12-dimensionais recuperadas pelo LCR no clado alternativo A (Fig. 2c, d) e no clado B (Fig. 2g, h). A análise combinada em cada ramo revelou diferentes perfis de seleção para peptídeos 12-mer (Fig. 5c, d suplementares) e um aumento na razão do título LCR/sangue ao longo do tempo para clones combinados após a segunda rodada de seleção em comparação com a primeira rodada de seleção (Fig. 5e suplementar).
Enriquecimento de motivos e peptídeos no líquido cefalorraquidiano por duas rodadas sucessivas de seleção de exibição de fagos funcionais in vivo.
Todos os fagos do líquido cefalorraquidiano recuperados da primeira rodada de cada animal (animais #1.1 e #1.2) foram reunidos, amplificados, sequenciados por HT e reinjetados juntos (2 x 1010 fagos/animal) em 2 ratos canulados por SM (#1.1 → #). 2.1 e 2.2, 1.2 → 2.3 e 2.4). (a,b,e,f) Diagramas de dispersão de correlação comparando a frequência relativa de motivos tripeptídeos de todos os fagos derivados do LCR na primeira e segunda rodadas de seleção. Frequência relativa e distribuição de motivos representando todos os possíveis tripeptídeos sobrepostos encontrados em peptídeos em ambas as orientações. O número de motivos encontrados em 1000 leituras é mostrado. Os motivos que foram significativamente (p < 0,001) selecionados ou excluídos em uma das bibliotecas comparadas são destacados com pontos vermelhos. (c, d, g, h) Representação do logotipo da sequência de todas as sequências longas de 12 aminoácidos ricas em LCR com base nas rodadas 2 e 1 da seleção in vivo. O tamanho do código de uma letra indica a frequência com que o aminoácido ocorre naquela posição. Para representar o logotipo, a frequência das sequências de LCR extraídas de animais individuais entre duas rodadas de seleção é comparada e as sequências enriquecidas na segunda rodada são mostradas: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 e (h) #1.2–#2.4. Os aminoácidos mais enriquecidos em uma determinada posição em (c, d) animais n.º 2.1 e n.º 2.2 ou (g, h) em animais n.º 2.3 e n.º 2.4 são mostrados em cores. Verde = polar, roxo = neutro, azul = básico, vermelho = ácido e preto = aminoácidos hidrofóbicos.
Após a terceira rodada de seleção, identificamos 124 sequências peptídicas únicas (#3.1 e #3.2) de 332 clones de fagos reconstituídos no LCR, isolados de dois animais (Fig. 6a suplementar). A sequência LGSVS (18,7%) apresentou a maior proporção relativa, seguida pelos insertos de tipo selvagem PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) e SARGSWREIVSLS (2,2%). Na quarta rodada final, reunimos dois ramos selecionados independentemente de três animais distintos (Fig. 1c). Dos 925 clones de fagos sequenciados recuperados do LCR, na quarta rodada, encontramos 64 sequências peptídicas únicas (Fig. 6b suplementar), entre as quais a proporção relativa de fagos de tipo selvagem caiu para 0,8%. Os clones de LCR mais comuns na quarta rodada foram LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) e RLSSVDSDLSGC (3,2%). A variação de comprimento dos peptídeos selecionados se deve a inserções/deleções de nucleotídeos ou códons de parada prematuros nos primers da biblioteca ao usar códons degenerados para o desenho da biblioteca NNK. Os códons de parada prematuros geram peptídeos mais curtos e são selecionados por conterem o motivo aa favorável. Peptídeos mais longos podem resultar de inserções/deleções nos primers das bibliotecas sintéticas. Isso posiciona o códon de parada projetado fora do quadro e o lê até que um novo códon de parada apareça a jusante. Em geral, calculamos os fatores de enriquecimento para todas as quatro rodadas de seleção comparando os dados de entrada com os dados de saída da amostra. Na primeira rodada de triagem, utilizamos títulos de fagos selvagens como referência de fundo não específica. Curiosamente, a seleção negativa de fagos foi muito forte no primeiro ciclo do LCR, mas não no sangue (Fig. 3a), o que pode ser devido à baixa probabilidade de difusão passiva da maioria dos membros da biblioteca de peptídeos para o compartimento do LCR, ou porque os fagos relacionados tendem a ser retidos ou removidos da corrente sanguínea de forma mais eficiente do que os bacteriófagos. No entanto, na segunda rodada de triagem, observou-se forte seleção de fagos no LCR em ambos os clados, sugerindo que a rodada anterior foi enriquecida em fagos exibindo peptídeos que promovem a captação no LCR (Fig. 3a). Novamente, sem enriquecimento sanguíneo significativo. Também na terceira e quarta rodadas, os clones de fagos foram significativamente enriquecidos no LCR. Comparando a frequência relativa de cada sequência peptídica única entre as duas últimas rodadas de seleção, descobrimos que as sequências foram ainda mais enriquecidas na quarta rodada de seleção (Fig. 3b). Um total de 931 motivos tripeptídicos foram extraídos de todas as 64 sequências peptídicas únicas, utilizando ambas as orientações peptídicas. Os motivos mais enriquecidos na quarta rodada foram examinados mais detalhadamente quanto aos seus perfis de enriquecimento em todas as rodadas, em comparação com a biblioteca injetada (ponto de corte: 10% de enriquecimento) (Fig. 6c Suplementar). Padrões gerais de seleção mostraram que a maioria dos motivos estudados foi enriquecida em todas as rodadas anteriores de ambos os ramos de seleção. No entanto, alguns motivos (por exemplo, SGL, VSG, LGS e GSV) eram predominantemente do clado alternativo A, enquanto outros (por exemplo, FGW, RTN, WGF e NTR) foram enriquecidos no clado alternativo B.
Validação do transporte no LCR de peptídeos exibidos em fagos enriquecidos no LCR e peptídeos líderes biotinilados conjugados a cargas úteis de estreptavidina.
(a) Razões de enriquecimento calculadas em todas as quatro rodadas (R1-R4) com base nos títulos de fagos (PFU) injetados (entrada = 1) e nos títulos de fagos determinados no LCR (saída = 0). Os fatores de enriquecimento das últimas três rodadas (R2-R4) foram calculados por comparação com a rodada anterior e a primeira rodada (R1) com dados de peso. As barras abertas são o líquido cefalorraquidiano, as barras sombreadas são o plasma. (***p<0,001, com base no teste t de Student). (b) Lista dos peptídeos de fagos mais abundantes, classificados de acordo com sua proporção relativa a todos os fagos coletados no LCR após a rodada 4 de seleção. Os seis clones de fagos mais comuns são destacados em cores, numerados e seus fatores de enriquecimento entre as rodadas 3 e 4 de seleção (inserções). (c,d) Os seis clones de fagos mais enriquecidos, fagos vazios e bibliotecas de peptídeos de fagos parentais da rodada 4 foram analisados ​​individualmente em um modelo de amostragem do LCR. Amostras de LCR e sangue foram coletadas nos pontos de tempo indicados. (c) Quantidades iguais de 6 clones de fagos candidatos (2 x 1010 fagos/animais), fagos vazios (#1779) (2 x 1010 fagos/animais) e bibliotecas de peptídeos de fagos de estoque (2 x 1012 fagos/animais). Injetar pelo menos 3 CM é administrado ao animal canulado separadamente através da veia da cauda. A farmacocinética do LCR de cada clone de fago injetado e biblioteca de peptídeos de fagos ao longo do tempo é mostrada. (d) mostra a razão LCR/sangue média para todos os fagos recuperados/mL ao longo do tempo de amostragem. (e) Quatro peptídeos líderes sintéticos e um controle embaralhado foram ligados com biotina à estreptavidina através de seu N-terminal (tetrâmero display) seguido por injeção (veia da cauda iv, 10 mg de estreptavidina/kg). Pelo menos três ratos intubados (N = 3). ). Amostras de LCR foram coletadas nos momentos indicados e as concentrações de estreptavidina foram medidas por ELISA antiestreptavidina no LCR (nd = não detectado). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, com base no teste ANOVA). (f) Comparação da sequência de aminoácidos do clone peptídico de fago mais enriquecido #2002 (roxo) com outros clones peptídicos de fago selecionados da 4ª rodada de seleção. Fragmentos de aminoácidos idênticos e similares são codificados por cores.
De todos os fagos enriquecidos na quarta rodada (Fig. 3b), seis clones candidatos foram selecionados para posterior análise individual no modelo de amostragem de LCR. Quantidades iguais de seis bibliotecas de fagos candidatos, fagos vazios (sem inserção) e peptídeos de profago foram injetadas em três animais CM canulados, e a farmacocinética foi determinada em ensaios de LCR (Fig. 3c) e sangue (Fig. Suplementar 7). Todos os clones de fagos testados atingiram o compartimento do LCR em um nível 10-1000 vezes maior do que o do fago controle vazio (#1779). Por exemplo, os clones #2020 e #2077 apresentaram títulos de LCR cerca de 1000 vezes maiores do que o fago controle. O perfil farmacocinético de cada peptídeo selecionado é diferente, mas todos eles têm uma alta capacidade de homing no LCR. Observamos uma diminuição constante ao longo do tempo para os clones #1903 e #2011, enquanto para os clones #2077, #2002 e #2009 um aumento durante os primeiros 10 minutos pode indicar transporte ativo, mas precisa ser verificado. Os clones #2020, #2002 e #2077 estabilizaram em níveis elevados, enquanto a concentração de LCR do clone #2009 diminuiu lentamente após o aumento inicial. Em seguida, comparamos a frequência relativa de cada candidato de LCR com sua concentração sanguínea (Fig. 3d). A correlação do título médio de cada candidato de LCR com seu título sanguíneo em todos os tempos de amostragem mostrou que três dos seis candidatos estavam significativamente enriquecidos no LCR sanguíneo. Curiosamente, o clone #2077 apresentou maior estabilidade sanguínea (Figura Suplementar 7). Para confirmar que os próprios peptídeos são capazes de transportar ativamente carga diferente de partículas de fago para o compartimento do LCR, sintetizamos quatro peptídeos líderes derivatizados com biotina no N-terminal, onde os peptídeos se ligam à partícula de fago. Peptídeos biotinilados (nºs 2002, 2009, 2020 e 2077) foram conjugados com estreptavidina (SA) para obter formas multiméricas que imitam um pouco a geometria do fago. Este formato também nos permitiu medir a exposição à SA no sangue e no líquido cefalorraquidiano como peptídeos proteicos transportadores de carga. Importantemente, os dados do fago puderam frequentemente ser reproduzidos quando peptídeos sintéticos foram administrados neste formato conjugado com SA (Fig. 3e). Os peptídeos misturados apresentaram menor exposição inicial e depuração mais rápida no LCR, com níveis indetectáveis ​​em 48 horas. Para obter informações sobre as vias de entrega desses clones de fagos peptídicos no espaço do LCR, analisamos a localização de acertos peptídicos individuais do fago usando imuno-histoquímica (IHQ) para detectar diretamente partículas de fago 1 hora após a injeção intravenosa in vivo. Notavelmente, os clones #2002, #2077 e #2009 puderam ser detectados por forte coloração em capilares cerebrais, enquanto o fago controle (#1779) e o clone #2020 não foram detectados (Figura Suplementar 8). Isso sugere que esses peptídeos contribuem para o efeito no cérebro precisamente por atravessarem a BHE. Uma análise mais detalhada é necessária para testar essa hipótese, visto que a via BSCFB também pode estar envolvida. Ao comparar a sequência de aminoácidos do clone mais enriquecido (#2002) com outros peptídeos selecionados, observou-se que alguns deles possuem extensões de aminoácidos semelhantes, o que pode indicar um mecanismo de transporte semelhante (Fig. 3f).
Devido ao seu perfil plasmático único e ao aumento significativo no LCR ao longo do tempo, o clone de exibição de fagos #2077 foi explorado mais detalhadamente por um período mais longo de 48 horas e foi capaz de reproduzir o rápido aumento no LCR observado em associação com níveis sustentados de SA (Fig. 4a). Em relação a outros clones de fagos identificados, o #2077 corou fortemente para capilares cerebrais e mostrou colocalização significativa com a lectina marcadora capilar quando visualizada em maior resolução e possivelmente alguma coloração no espaço parenquimatoso (Figura 4b). Para investigar se os efeitos farmacológicos mediados por peptídeos poderiam ser obtidos no SNC, realizamos um experimento no qual versões biotiniladas de i) o peptídeo de trânsito #2077 e ii) o peptídeo inibidor de BACE1 foram misturadas com SA em duas proporções diferentes. Para uma combinação, usamos apenas o inibidor do peptídeo BACE1 e, para a outra, usamos uma proporção de 1:3 de inibidor do peptídeo BACE1 para peptídeo #2077. Ambas as amostras foram administradas por via intravenosa, e os níveis sanguíneos e do líquido cefalorraquidiano do peptídeo beta-amiloide 40 (Abeta40) foram medidos ao longo do tempo. O Abeta40 foi medido no LCR, pois reflete a inibição da BACE1 no parênquima cerebral. Como esperado, ambos os complexos reduziram significativamente os níveis sanguíneos de Abeta40 (Fig. 4c, d). No entanto, apenas amostras contendo uma mistura do peptídeo nº 2077 e um inibidor do peptídeo BACE1 conjugado ao SA causaram uma diminuição significativa do Abeta40 no líquido cefalorraquidiano (Fig. 4c). Os dados mostram que o peptídeo nº 2077 é capaz de transportar a proteína SA de 60 kDa para o SNC e também induz efeitos farmacológicos com inibidores do peptídeo BACE1 conjugados ao SA.
(a) Injeção clonal (2 × 10 fagos/animal) de fago T7 mostrando perfis farmacocinéticos de longo prazo do peptídeo #2077 (RLSSVDSDLSGC) do LCR e do fago controle não injetado (#1779) em pelo menos três ratos intubados com CM. (b) Imagem microscópica confocal de microvasos corticais representativos em ratos injetados com fago (2 × 1010 fagos/animal) mostrando contracoloração do peptídeo #2077 e vasos (lectina). Esses clones de fago foram administrados a 3 ratos e deixados em circulação por 1 hora antes da perfusão. Os cérebros foram seccionados e corados com anticorpos policlonais marcados com FITC contra o capsídeo do fago T7. Dez minutos antes da perfusão e subsequente fixação, a lectina marcada com DyLight594 foi administrada intravenosamente. Imagens fluorescentes mostrando a coloração de lectina (vermelho) do lado luminal de microvasos e fagos (verde) no lúmen de capilares e tecido cerebral perivascular. A barra de escala corresponde a 10 µm. (c, d) O peptídeo inibidor de BACE1 biotinilado, sozinho ou em combinação com o peptídeo de trânsito biotinilado nº 2077, foi acoplado à estreptavidina, seguido por injeção intravenosa em pelo menos três ratos CM canulados (10 mg de estreptavidina/kg). A redução de Aβ40 mediada pelo inibidor do peptídeo BACE1 foi medida por ELISA de Aβ1-40 no sangue (vermelho) e no líquido cefalorraquidiano (laranja) nos pontos de tempo indicados. Para maior clareza, uma linha pontilhada é desenhada no gráfico em uma escala de 100%. (c) Redução percentual de Aβ40 no sangue (triângulos vermelhos) e no líquido cefalorraquidiano (triângulos laranja) em ratos tratados com estreptavidina conjugada ao peptídeo de trânsito nº 2077 e ao peptídeo inibidor da BACE1 na proporção de 3:1. (d) Redução percentual de Aβ40 no sangue (círculos vermelhos) e no líquido cefalorraquidiano (círculos laranja) de ratos tratados com estreptavidina acoplada apenas a um peptídeo inibidor da BACE1. A concentração de Aβ no controle foi de 420 pg/ml (desvio padrão = 101 pg/ml).
A exibição de fagos tem sido aplicada com sucesso em diversas áreas da pesquisa biomédica17. Este método tem sido utilizado em estudos de diversidade vascular in vivo18,19, bem como em estudos direcionados a vasos cerebrais20,21,22,23,24,25,26. Neste estudo, estendemos a aplicação deste método de seleção não apenas à identificação direta de peptídeos direcionados a vasos cerebrais, mas também à descoberta de candidatos com propriedades de transporte ativo para cruzar a barreira hematoencefálica. Agora, descrevemos o desenvolvimento de um procedimento de seleção in vivo em ratos intubados com CM e demonstramos seu potencial para identificar peptídeos com propriedades de direcionamento ao LCR. Utilizando o fago T7 exibindo uma biblioteca de peptídeos aleatórios de 12-mer, fomos capazes de demonstrar que o fago T7 é pequeno o suficiente (aproximadamente 60 nm de diâmetro)10 para ser adaptado à barreira hematoencefálica, cruzando diretamente a barreira hematoencefálica ou o plexo coroide. Observamos que a coleta de LCR de ratos CM canulados foi um método de triagem funcional in vivo bem controlado, e que o fago extraído não apenas se ligou à vasculatura, mas também funcionou como um transportador através da barreira hematoencefálica. Além disso, ao coletar sangue e aplicar HTS simultaneamente ao LCR e aos fagos derivados do sangue, confirmamos que nossa escolha de LCR não foi influenciada pelo enriquecimento do sangue ou pela aptidão para expansão entre as rodadas de seleção. No entanto, o compartimento sanguíneo faz parte do procedimento de seleção, uma vez que os fagos capazes de atingir o compartimento do LCR devem sobreviver e circular na corrente sanguínea por tempo suficiente para se enriquecerem no cérebro. Para extrair informações de sequência confiáveis ​​dos dados HTS brutos, implementamos filtros adaptados aos erros de sequenciamento específicos da plataforma no fluxo de trabalho de análise. Ao incorporar parâmetros cinéticos ao método de triagem, confirmamos a rápida farmacocinética dos fagos T7 selvagens (t½ ~ 28 min) no sangue24, 27, 28 e também determinamos sua meia-vida no líquido cefalorraquidiano (t½ ~ 26 min) por minuto. Apesar dos perfis farmacocinéticos semelhantes no sangue e no LCR, apenas 0,001% da concentração sanguínea do fago pôde ser detectada no LCR, indicando baixa mobilidade de fundo do fago T7 selvagem através da barreira hematoencefálica. Este trabalho destaca a importância da primeira rodada de seleção ao usar estratégias de triagem in vivo, especialmente para sistemas de fagos que são rapidamente eliminados da circulação, já que poucos clones conseguem atingir o compartimento do SNC. Assim, na primeira rodada, a redução na diversidade da biblioteca foi muito grande, já que apenas um número limitado de clones foi eventualmente coletado neste modelo de LCR muito rigoroso. Esta estratégia de seleção in vivo incluiu várias etapas de seleção, como acúmulo ativo no compartimento do LCR, sobrevivência do clone no compartimento sanguíneo e rápida remoção de clones de fagos T7 do sangue nos primeiros 10 minutos (Fig. 1d e Fig. Suplementar 4M). Assim, após a primeira rodada, diferentes clones de fagos foram identificados no LCR, embora o mesmo pool inicial tenha sido usado para animais individuais. Isso sugere que múltiplas etapas rigorosas de seleção para bibliotecas de origem com grande número de membros da biblioteca resultam em uma redução significativa na diversidade. Portanto, eventos aleatórios se tornarão parte integrante do processo de seleção inicial, influenciando grandemente o resultado. É provável que muitos dos clones na biblioteca original tivessem uma propensão de enriquecimento do LCR muito semelhante. No entanto, mesmo sob as mesmas condições experimentais, os resultados da seleção podem diferir devido ao pequeno número de cada clone específico no pool inicial.
Os motivos enriquecidos no LCR diferem daqueles no sangue. Curiosamente, notamos a primeira mudança em direção a peptídeos ricos em glicina no sangue de animais individuais. (Fig. 1g, Figs. Suplementares 4e, 4f). Fagos contendo peptídeos de glicina podem ser mais estáveis ​​e menos propensos a serem retirados de circulação. No entanto, esses peptídeos ricos em glicina não foram detectados nas amostras de líquido cefalorraquidiano, sugerindo que as bibliotecas curadas passaram por duas etapas de seleção diferentes: uma no sangue e outra permitida a acumulação no líquido cefalorraquidiano. Os clones enriquecidos em LCR resultantes da quarta rodada de seleção foram extensivamente testados. Quase todos os clones testados individualmente foram confirmados como enriquecidos em LCR em comparação com o fago controle em branco. Um peptídeo encontrado (#2077) foi examinado em mais detalhes. Ele apresentou uma meia-vida plasmática mais longa em comparação com outros acertos (Figura 3d e Figura Suplementar 7) e, curiosamente, esse peptídeo continha um resíduo de cisteína no C-terminal. Foi demonstrado recentemente que a adição de cisteína a peptídeos pode melhorar suas propriedades farmacocinéticas por meio da ligação à albumina 29. Isso é atualmente desconhecido para o peptídeo #2077 e requer mais estudos. Alguns peptídeos mostraram uma dependência de valência no enriquecimento do LCR (dados não mostrados), o que pode estar relacionado à geometria da superfície exibida do capsídeo T7. O sistema T7 que usamos mostrou 5-15 cópias de cada peptídeo por partícula de fago. A IHC foi realizada em clones de fagos líderes candidatos injetados intravenosamente no córtex cerebral de ratos (Figura Suplementar 8). Os dados mostraram que pelo menos três clones (nº 2002, nº 2009 e nº 2077) interagiram com a BHE. Resta determinar se essa interação com a BHE resulta no acúmulo de LCR ou no movimento desses clones diretamente para o BCSFB. É importante ressaltar que demonstramos que os peptídeos selecionados retêm sua capacidade de transporte no LCR quando sintetizados e ligados à carga proteica. A ligação de peptídeos biotinilados N-terminais ao SA repete essencialmente os resultados obtidos com seus respectivos clones de fagos no sangue e no líquido cefalorraquidiano (Fig. 3e). Por fim, demonstramos que o peptídeo líder nº 2077 é capaz de promover a ação cerebral de um inibidor peptídico biotinilado de BACE1 conjugado ao SA, causando efeitos farmacodinâmicos pronunciados no SNC, reduzindo significativamente os níveis de Abeta40 no LCR (Fig. 4). Não conseguimos identificar nenhum homólogo no banco de dados realizando uma busca por homologia de sequência peptídica de todos os resultados. É importante observar que o tamanho da biblioteca T7 é de aproximadamente 109, enquanto o tamanho teórico da biblioteca para 12-meros é de 4 x 1015. Portanto, selecionamos apenas uma pequena fração do espaço de diversidade da biblioteca de peptídeos de 12-meros, o que pode significar que peptídeos mais otimizados podem ser identificados pela avaliação do espaço de sequência adjacente desses acertos identificados. Hipoteticamente, uma das razões pelas quais não encontramos homólogos naturais desses peptídeos pode ser a desseleção durante a evolução para impedir a entrada descontrolada de certos motivos peptídicos no cérebro.
Em conjunto, nossos resultados fornecem uma base para trabalhos futuros que visem identificar e caracterizar os sistemas de transporte da barreira vascular cerebral in vivo com mais detalhes. A estrutura básica deste método baseia-se em uma estratégia de seleção funcional que não apenas identifica clones com propriedades de ligação vascular cerebral, mas também inclui uma etapa crítica na qual clones bem-sucedidos apresentam atividade intrínseca para atravessar barreiras biológicas in vivo para o compartimento do SNC. O objetivo é elucidar o mecanismo de transporte desses peptídeos e sua preferência por se ligar à microvasculatura específica da região cerebral. Isso pode levar à descoberta de novas vias para o transporte da BHE e de receptores. Esperamos que os peptídeos identificados possam se ligar diretamente a receptores vasculares cerebrais ou a ligantes circulantes transportados pela BHE ou BCSFB. Os vetores peptídicos com atividade de transporte no LCR descobertos neste trabalho serão investigados mais detalhadamente. Atualmente, estamos investigando a especificidade cerebral desses peptídeos quanto à sua capacidade de atravessar a BHE e/ou BCSFB. Esses novos peptídeos serão ferramentas extremamente valiosas para a potencial descoberta de novos receptores ou vias e para o desenvolvimento de novas plataformas altamente eficientes para a entrega de macromoléculas, como produtos biológicos, ao cérebro.
Canule a cisterna maior (CM) usando uma modificação do método descrito anteriormente. Ratos Wistar anestesiados (200-350 g) foram montados em um aparelho estereotáxico e uma incisão mediana foi feita sobre o couro cabeludo raspado e preparado assepticamente para expor o crânio. Perfure dois furos na área da faixa superior e fixe os parafusos de fixação nos furos. Um furo adicional foi perfurado na crista occipital lateral para guiar uma cânula de aço inoxidável na CM. Aplique cimento odontológico ao redor da cânula e fixe com parafusos. Após a fotopolimerização e o endurecimento do cimento, a ferida cutânea foi fechada com sutura supramid 4/0. O posicionamento adequado da cânula é confirmado pelo vazamento espontâneo de líquido cefalorraquidiano (LCR). Remova o rato do aparelho estereotáxico, receba os cuidados pós-operatórios adequados e controle da dor, e deixe-o se recuperar por pelo menos uma semana até que sinais de sangue sejam observados no líquido cefalorraquidiano. Ratos Wistar (Crl:WI/Han) foram obtidos de Charles River (França). Todos os ratos foram mantidos em condições específicas livres de patógenos. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Serviço Veterinário da Cidade de Basileia, Suíça, e foram realizados de acordo com a Licença Animal nº 2474 (Avaliação do Transporte Cerebral Ativo por Medição dos Níveis de Candidatos Terapêuticos no Líquido Cefalorraquidiano e no Cérebro de Ratos).
Mantenha o rato consciente com a cânula CM em mãos. Remova a Datura da cânula e colete 10 µl de líquido cefalorraquidiano fluindo espontaneamente. Como a permeabilidade da cânula foi comprometida, apenas amostras de líquido cefalorraquidiano transparentes, sem evidência de contaminação ou descoloração sanguínea, foram incluídas neste estudo. Paralelamente, aproximadamente 10–20 µl de sangue foram coletados de uma pequena incisão na ponta da cauda em tubos com heparina (Sigma-Aldrich). LCR e sangue foram coletados em vários momentos após a injeção intravenosa do fago T7. Aproximadamente 5–10 µl de líquido foram descartados antes da coleta de cada amostra de LCR, o que corresponde ao volume morto do cateter.
As bibliotecas foram geradas utilizando o vetor T7Select 10-3b, conforme descrito no manual do sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Resumidamente, uma inserção aleatória de DNA 12-mer foi sintetizada no seguinte formato:
O códon NNK foi usado para evitar códons de parada duplos e superexpressão de aminoácidos na inserção. N é uma razão equimolar manualmente misturada de cada nucleotídeo, e K é uma razão equimolar manualmente misturada de nucleotídeos de adenina e citosina. Regiões de fita simples foram convertidas em DNA de fita dupla por incubação adicional com dNTP (Novagen) e enzima Klenow (New England Biolabs) em tampão Klenow (New England Biolabs) por 3 horas a 37 °C. Após a reação, o DNA de fita dupla foi recuperado por precipitação com EtOH. O DNA resultante foi digerido com enzimas de restrição EcoRI e HindIII (ambas da Roche). A inserção clivada e purificada (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) foi então ligada in-frame em um vetor T7 pré-clivado após o aminoácido 348 do gene do capsídeo 10B. As reações de ligação foram incubadas a 16°C por 18 horas antes do empacotamento in vitro. O empacotamento in vitro dos fagos foi realizado de acordo com as instruções fornecidas com o kit de clonagem T7Select 10-3b (Novagen), e a solução de empacotamento foi amplificada uma vez para lise usando Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Os lisados ​​foram centrifugados, titulados e congelados a -80°C como uma solução estoque de glicerol.
Amplificação direta por PCR de regiões variáveis ​​de fagos amplificadas em caldo ou placa utilizando primers de fusão patenteados 454/Roche-amplicon. O primer de fusão direta contém sequências que flanqueiam a região variável (NNK) 12 (específica do molde), o Adaptador de Titânio GS FLX A e uma sequência-chave de biblioteca de quatro bases (TCAG) (Figura Suplementar 1a):
O primer de fusão reversa também contém biotina anexada às esferas de captura e ao adaptador GS FLX Titanium B necessário para amplificação clonal durante a PCR em emulsão:
Os amplicons foram então submetidos ao pirossequenciamento 454/Roche, de acordo com o protocolo 454 GS-FLX Titanium. Para o sequenciamento manual Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), o DNA do fago T7 foi amplificado por PCR e sequenciado com os seguintes pares de primers:
Inserções de placas individuais foram submetidas à amplificação por PCR utilizando o kit Roche Fast Start DNA Polymerase (de acordo com as instruções do fabricante). Realizaram-se uma inicialização a quente (10 min a 95 °C) e 35 ciclos de reforço (50 s a 95 °C, 1 min a 50 °C e 1 min a 72 °C).
Fagos de bibliotecas, fagos selvagens, fagos recuperados do LCR e sangue, ou clones individuais, foram amplificados em Escherichia coli BL5615 em caldo TB (Sigma Aldrich) ou em placas de 500 cm² (Thermo Scientific) por 4 h a 37 °C. Os fagos foram extraídos das placas por lavagem com tampão Tris-EDTA (Fluka Analytical) ou pela coleta das placas com pontas de pipeta estéreis. Os fagos foram isolados do sobrenadante da cultura ou do tampão de extração com uma rodada de precipitação com polietilenoglicol (PEG 8000) (Promega) e ressuspensos em tampão Tris-EDTA.
O fago amplificado foi submetido a 2-3 rodadas de remoção de endotoxina usando esferas de remoção de endotoxina (Miltenyi Biotec) antes da injeção intravenosa (IV) (500 μl/animal). Na primeira rodada, 2 × 1012 fagos foram introduzidos; na segunda, 2 × 1010 fagos; na terceira e quarta rodadas de seleção, 2 × 109 fagos por animal. O conteúdo de fagos em amostras de LCR e sangue coletadas nos pontos de tempo indicados foi determinado por contagem de placas de acordo com as instruções do fabricante (manual do sistema T7Select). A seleção de fagos foi realizada por injeção intravenosa de bibliotecas purificadas na veia da cauda ou por reinjeção de fagos extraídos do LCR da rodada de seleção anterior, e as colheitas subsequentes foram realizadas em 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min e 240 min, respectivamente, de amostras de LCR e sangue. Foram conduzidas quatro rodadas de triagem in vivo, nas quais os dois ramos selecionados foram armazenados e analisados ​​separadamente durante as três primeiras rodadas de seleção. Todos os insertos de fagos extraídos do LCR das duas primeiras rodadas de seleção foram submetidos a pirossequenciamento 454/Roche, enquanto todos os clones extraídos do LCR das duas últimas rodadas de seleção foram sequenciados manualmente. Todos os fagos sanguíneos da primeira rodada de seleção também foram submetidos a pirossequenciamento 454/Roche. Para a injeção dos clones de fagos, os fagos selecionados foram amplificados em E. coli (BL5615) em placas de 500 cm² a 37 °C por 4 horas. Os clones selecionados individualmente e sequenciados manualmente foram propagados em meio TB. Após a extração do fago, purificação e remoção da endotoxina (conforme descrito acima), 2 x 1010 fagos/animal em 300 μl foram injetados intravenosamente em uma veia da cauda.
Pré-processamento e filtragem qualitativa dos dados da sequência. Os dados brutos 454/Roche foram convertidos de um formato de mapa de fluxo padrão binário (sff) para um formato legível por humanos Pearson (fasta) usando o software do fornecedor. O processamento adicional da sequência de nucleotídeos foi realizado usando programas e scripts C proprietários (pacote de software não lançado) conforme descrito abaixo. A análise dos dados primários inclui procedimentos rigorosos de filtragem em vários estágios. Para filtrar leituras que não continham uma sequência de DNA de inserção 12mer válida, as leituras foram alinhadas sequencialmente ao marcador de início (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), ao marcador de parada (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) e à inserção de fundo (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) usando o teste global de Needleman-Wunsch. alinhamento permitindo até 2 inconsistências por alinhamento31. Portanto, leituras sem marcadores de início e parada e leituras contendo inserções de fundo, ou seja, alinhamentos que excedem o número permitido de incompatibilidades, foram removidas da biblioteca. Quanto às leituras restantes, a sequência de DNA N-mer que se estende da marca inicial e termina antes da marca de parada foi excisada da sequência de leitura original e processada posteriormente (doravante denominada "inserção"). Após a tradução da inserção, a porção após o primeiro códon de parada na extremidade 5' do primer é removida da inserção. Além disso, os nucleotídeos que levam a códons incompletos na extremidade 3' do primer também foram removidos. Para excluir inserções contendo apenas sequências de fundo, inserções traduzidas que começam com o padrão de aminoácidos "PAG" também foram removidas. Peptídeos com comprimento pós-traducional inferior a 3 aminoácidos foram removidos da biblioteca. Por fim, a redundância no conjunto de inserções foi removida e a frequência de cada inserção única foi determinada. Os resultados dessa análise incluíram uma lista de sequências de nucleotídeos (inserções) e suas frequências (leituras) (Figuras Suplementares 1c e 2).
Inserções de DNA N-mer agrupadas por similaridade de sequência: Para eliminar erros de sequenciamento específicos de 454/Roche (como problemas com extensões de homopolímeros de sequenciamento) e remover redundâncias menos importantes, inserções de sequência de DNA N-mer previamente filtradas (inserções) são classificadas por similaridade. inserções (até 2 bases não correspondentes permitidas) usando um algoritmo iterativo definido da seguinte forma: as inserções são classificadas primeiro por sua frequência (maior para menor) e, se forem iguais, por sua classificação secundária por comprimento (maior para menor). Assim, as inserções mais frequentes e mais longas definem o primeiro "grupo". A frequência do grupo é definida como a frequência chave. Em seguida, cada inserção restante na lista classificada foi tentada para ser adicionada ao grupo por alinhamento Needleman-Wunsch em pares. Se o número de incompatibilidades, inserções ou deleções em um alinhamento não exceder um limite de 2, uma inserção é adicionada ao grupo e a frequência geral do grupo é aumentada pela frequência com que a inserção foi adicionada. Inserções adicionadas a um grupo são marcadas como utilizadas e excluídas do processamento posterior. Se a sequência de inserção não puder ser adicionada a um grupo já existente, a sequência de inserção é usada para criar um novo grupo com a frequência de inserção apropriada e marcada como utilizada. A iteração termina quando cada sequência de inserção tiver sido usada para formar um novo grupo ou puder ser incluída em um grupo já existente. Afinal, inserções agrupadas, constituídas por nucleotídeos, são eventualmente traduzidas em sequências peptídicas (bibliotecas peptídicas). O resultado dessa análise é um conjunto de inserções e suas frequências correspondentes, que compõem o número de leituras consecutivas (Figura 2).
Geração de Motivos: Com base em uma lista de peptídeos únicos, uma biblioteca foi criada contendo todos os padrões de aminoácidos possíveis (aa), conforme mostrado abaixo. Cada padrão possível de comprimento 3 foi extraído do peptídeo e seu padrão inverso foi adicionado, juntamente com uma biblioteca de motivos comum contendo todos os padrões (tripeptídeos). Bibliotecas de motivos altamente repetitivos foram sequenciadas e a redundância removida. Em seguida, para cada tripeptídeo na biblioteca de motivos, verificamos sua presença na biblioteca usando ferramentas computacionais. Nesse caso, a frequência do peptídeo contendo o tripeptídeo do motivo encontrado é adicionada e atribuída ao motivo na biblioteca de motivos ("número de motivos"). O resultado da geração de motivos é uma matriz bidimensional contendo todas as ocorrências de tripeptídeos (motivos) e seus respectivos valores, que são o número de leituras de sequenciamento que resultam no motivo correspondente quando as leituras são filtradas, agrupadas e traduzidas. Métricas conforme descrito em detalhes acima.
Normalização do número de motivos e gráficos de dispersão correspondentes: O número de motivos para cada amostra foi normalizado usando
onde ni é o número de leituras contendo o tópico i. Assim, vi representa a frequência percentual de leituras (ou peptídeos) contendo o motivo i na amostra. Os valores de p para o número não normalizado de motivos foram calculados usando o teste exato de Fisher. Em relação aos correlogramas do número de motivos, as correlações de Spearman foram calculadas usando o número normalizado de motivos com R.
Para visualizar o conteúdo de aminoácidos em cada posição na biblioteca de peptídeos, os web logogramas 32 e 33 (http://weblogo.threeplusone.com) foram criados. Primeiro, o conteúdo de aminoácidos em cada posição do peptídeo 12-mer é armazenado em uma matriz 20×12. Em seguida, um conjunto de 1000 peptídeos contendo o mesmo conteúdo relativo de aminoácidos em cada posição é gerado no formato fasta-sequence e fornecido como entrada para o web-logo 3, que gera uma representação gráfica do conteúdo relativo de aminoácidos em cada posição para uma determinada biblioteca de peptídeos. Para visualizar conjuntos de dados multidimensionais, mapas de calor foram criados usando uma ferramenta desenvolvida internamente em R (biosHeatmap, um pacote R ainda a ser lançado). Os dendrogramas apresentados nos mapas de calor foram calculados usando o método de agrupamento hierárquico de Ward com a métrica de distância euclidiana. Para análise estatística dos dados de pontuação de motivos, os valores de P para pontuação não normalizada foram calculados usando o teste exato de Fisher. Os valores de p para outros conjuntos de dados foram calculados em R usando o teste t de Student ou ANOVA.
Clones de fagos selecionados e fagos sem inserções foram injetados intravenosamente através da veia caudal (2 x 1010 fagos/animal em 300 μl de PBS). Dez minutos antes da perfusão e subsequente fixação, os mesmos animais foram injetados intravenosamente com 100 μl de lectina marcada com DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Sessenta minutos após a injeção do fago, os ratos foram perfundidos através do coração com 50 ml de PBS seguidos por 50 ml de PFA/PBS a 4%. Amostras de cérebro foram adicionalmente fixadas durante a noite em PFA/PBS a 4% e embebidas em sacarose a 30% durante a noite a 4°C. As amostras foram congeladas rapidamente na mistura de OCT. A análise imuno-histoquímica das amostras congeladas foi realizada à temperatura ambiente em criossecções de 30 µm bloqueadas com 1% de BSA e incubadas com anticorpos policlonais marcados com FITC contra o fago T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C. Incubar durante a noite. Por fim, as secções foram lavadas três vezes com PBS e examinadas com um microscópio confocal a laser (Leica TCS SP5).
Todos os peptídeos com pureza mínima de 98% foram sintetizados pela GenScript USA, biotinilados e liofilizados. A biotina é ligada por meio de um espaçador triplo de glicina adicional no N-terminal. Verifique todos os peptídeos por espectrometria de massas.
A estreptavidina (Sigma S0677) foi misturada com um excesso equimolar de 5 vezes de peptídeo biotinilado, peptídeo inibidor de BACE1 biotinilado ou uma combinação (proporção 3:1) de peptídeo inibidor de BACE1 biotinilado e peptídeo inibidor de BACE1 em 5–10% de DMSO, incubada em PBS por 1 hora à temperatura ambiente antes da injeção. Os peptídeos conjugados à estreptavidina foram injetados por via intravenosa na dose de 10 mg/kg em uma das veias da cauda de ratos com cavidade cerebral.
A concentração dos complexos estreptavidina-peptídeo foi avaliada por ELISA. Placas de microtitulação Nunc Maxisorp (Sigma) foram revestidas durante a noite a 4 °C com 1,5 μg/ml de anticorpo antiestreptavidina de camundongo (Thermo, MA1-20011). Após o bloqueio (tampão de bloqueio: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatina, 1% BSA) em temperatura ambiente por 2 horas, a placa foi lavada com 0,05% de Tween-20/PBS (tampão de lavagem) por 3 segundos. Amostras de LCR e plasma foram adicionadas aos poços diluídos com tampão de bloqueio (plasma 1:10.000, LCR 1:115). A placa foi então incubada durante a noite a 4 °C com anticorpo de detecção (1 μg/ml, antiestreptavidina-HRP, Novus NB120-7239). Após três etapas de lavagem, a estreptavidina foi detectada por incubação em solução de substrato TMB (Roche) por até 20 minutos. Após interromper o desenvolvimento da cor com H₂SO₂ 1 M, a absorbância foi medida a 450 nm.
A função do complexo estreptavidina-peptídeo-inibidor de BACE1 foi avaliada por ELISA para Aβ(1-40) de acordo com o protocolo do fabricante (Wako, 294-64701). Resumidamente, amostras de LCR foram diluídas em diluente padrão (1:23) e incubadas durante a noite a 4°C em placas de 96 poços revestidas com anticorpo de captura BNT77. Após cinco etapas de lavagem, o anticorpo BA27 conjugado com HRP foi adicionado e incubado por 2 horas a 4°C, seguido por cinco etapas de lavagem. Aβ(1-40) foi detectada por incubação em solução de TMB por 30 minutos à temperatura ambiente. Após o desenvolvimento da cor ter sido interrompido com solução de parada, a absorbância foi medida a 450 nm. As amostras de plasma foram submetidas à extração em fase sólida antes do ELISA para Aβ(1-40). O plasma foi adicionado a 0,2% de DEA (Sigma) em placas de 96 poços e incubado à temperatura ambiente por 30 minutos. Após lavagens sucessivas das placas de SPE (Oasis, 186000679) com água e 100% de metanol, amostras de plasma foram adicionadas às placas de SPE e todo o líquido foi removido. As amostras foram lavadas (primeiro com 5% de metanol e depois com 30% de metanol) e eluídas com 2% de NH4OH/90% de metanol. Após a secagem do eluato a 55 °C por 99 minutos sob corrente constante de N2, as amostras foram reduzidas em diluentes padrão e o Aβ(1-40) foi medido conforme descrito acima.
Como citar este artigo: Urich, E. et al. Entrega de carga ao cérebro usando peptídeos de trânsito identificados in vivo. a ciência. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
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