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A barreira hematoencefálica impede que agentes bioterapêuticos alcancem seus alvos no sistema nervoso central, dificultando o tratamento eficaz de doenças neurológicas. Para descobrir novos transportadores cerebrais in vivo, introduzimos uma biblioteca de peptídeos de fago T7 e coletamos amostras seriadas de sangue e líquido cefalorraquidiano (LCR) utilizando um modelo de camundongo consciente canulado. Clones de fago específicos foram altamente enriquecidos no LCR após quatro rodadas de seleção. Testes com peptídeos candidatos individuais revelaram um enriquecimento superior a 1000 vezes no LCR. A bioatividade da administração mediada por peptídeos ao cérebro foi confirmada por uma redução de 40% no nível de β-amiloide no LCR, utilizando um inibidor peptídico de BACE1 ligado ao novo peptídeo de trânsito identificado. Esses resultados sugerem que os peptídeos identificados por métodos de seleção de fago in vivo podem ser veículos úteis para a administração sistêmica de macromoléculas ao cérebro com efeito terapêutico.
A pesquisa sobre terapias direcionadas ao sistema nervoso central (SNC) tem se concentrado amplamente na identificação de fármacos e agentes otimizados que exibem propriedades de direcionamento ao SNC, com menos esforço na descoberta dos mecanismos que impulsionam a administração ativa de fármacos ao cérebro. Isso está começando a mudar agora, visto que a administração de fármacos, especialmente de moléculas grandes, é parte integrante do desenvolvimento moderno de medicamentos em neurociência. O ambiente do sistema nervoso central é bem protegido pelo sistema de barreira cerebrovascular, composto pela barreira hematoencefálica (BHE) e pela barreira hemato-sinusal (BHS)¹, o que dificulta a administração de fármacos ao cérebro¹,². Estima-se que quase todos os fármacos de moléculas grandes e mais de 98% dos fármacos de moléculas pequenas sejam eliminados do cérebro³. Por isso, é muito importante identificar novos sistemas de transporte cerebral que proporcionem a administração eficiente e específica de fármacos terapêuticos ao SNC⁴,⁵. No entanto, a BHE e a BHS também representam uma excelente oportunidade para a administração de fármacos, pois penetram e atingem todas as estruturas do cérebro por meio de sua extensa vascularização. Assim, os esforços atuais para utilizar métodos não invasivos de administração de fármacos ao cérebro baseiam-se, em grande parte, no mecanismo de transporte mediado por receptor (PMT), utilizando o receptor endógeno BBB6. Apesar dos recentes avanços importantes na utilização da via do receptor de transferrina7,8, o desenvolvimento de novos sistemas de administração com propriedades aprimoradas ainda é necessário. Para tanto, nosso objetivo foi identificar peptídeos capazes de mediar o transporte de LCR, uma vez que, em princípio, poderiam ser utilizados para administrar macromoléculas ao SNC ou para abrir novas vias de receptores. Em particular, receptores e transportadores específicos do sistema cerebrovascular (BBB e BSCFB) podem servir como alvos potenciais para a administração ativa e específica de fármacos bioterapêuticos. O líquido cefalorraquidiano (LCR) é um produto secretado pelo plexo coroide (PC) e está em contato direto com o fluido intersticial do cérebro através do espaço subaracnóideo e do espaço ventricular4. Recentemente, foi demonstrado que o líquido cefalorraquidiano subaracnóideo difunde-se excessivamente para o interstício cerebral9. Esperamos acessar o espaço parenquimatoso utilizando esse trato de influxo subaracnoide ou diretamente através da barreira hematoencefálica. Para isso, implementamos uma estratégia robusta de seleção de fagos in vivo que identifica, idealmente, peptídeos transportados por qualquer uma dessas duas vias distintas.
Descrevemos agora um método sequencial de triagem in vivo por phage display com amostragem de LCR (líquido cefalorraquidiano) acoplado ao sequenciamento de alto rendimento (HTS) para monitorar as rodadas iniciais de seleção com a maior diversidade da biblioteca. A triagem foi realizada em ratos conscientes com uma cânula de cisterna grande (CM) implantada permanentemente para evitar contaminação sanguínea. É importante ressaltar que essa abordagem seleciona tanto peptídeos com direcionamento cerebral quanto peptídeos com atividade de transporte através da barreira cerebrovascular. Utilizamos fagos T7 devido ao seu pequeno tamanho (~60 nm)¹⁰ e sugerimos que eles sejam adequados para o transporte de vesículas que permitem a travessia transcelular da barreira endotelial e/ou epitelial-medular. Após quatro rodadas de seleção, populações de fagos foram isoladas, demonstrando forte enriquecimento in vivo no LCR e associação com microvasos cerebrais. De forma importante, conseguimos confirmar nossos achados demonstrando que os peptídeos candidatos preferidos e sintetizados quimicamente são capazes de transportar carga proteica para o líquido cefalorraquidiano. Primeiramente, os efeitos farmacodinâmicos no SNC foram estabelecidos combinando um peptídeo de trânsito líder com um inibidor do peptídeo BACE1. Além de demonstrar que estratégias de triagem funcional in vivo podem identificar novos peptídeos de transporte cerebral como transportadores eficazes de carga proteica, esperamos que abordagens semelhantes de seleção funcional também se tornem importantes na identificação de novas vias de transporte cerebral.
Com base nas unidades formadoras de placas (UFP), após a etapa de empacotamento do fago, uma biblioteca de peptídeos lineares aleatórios de 12 aminoácidos do fago T7, com uma diversidade de aproximadamente 10⁹, foi projetada e criada (ver Materiais e Métodos). É importante ressaltar que analisamos cuidadosamente essa biblioteca antes da seleção in vivo. A amplificação por PCR das amostras da biblioteca de fagos, utilizando primers modificados, gerou amplicons diretamente aplicáveis ​​ao sequenciamento de alto rendimento (HTS) (Figura Suplementar 1a). Devido a a) erros de sequenciamento do HTS11, b) impacto na qualidade dos primers (NNK)1-12 e c) presença de fago selvagem (wt) (inserções do esqueleto) na biblioteca de espera, um procedimento de filtragem de sequências foi implementado para extrair apenas as informações de sequência verificadas (Figura Suplementar 1b). Essas etapas de filtragem se aplicam a todas as bibliotecas de sequenciamento de HTS. Para a biblioteca padrão, foram obtidas 233.868 leituras no total, das quais 39% passaram pelos critérios de filtragem e foram utilizadas para análise e seleção da biblioteca para as rodadas subsequentes (Figura Suplementar 1c–e). As leituras eram predominantemente múltiplos de 3 pares de bases de comprimento, com um pico em 36 nucleotídeos (Figura Suplementar 1c), confirmando o desenho da biblioteca (NNK) 1-12. Notavelmente, aproximadamente 11% dos membros da biblioteca continham um inserto PAGISRELVDKL de 12 dimensões com a estrutura de tipo selvagem (wt), e quase metade das sequências (49%) continha inserções ou deleções. O sequenciamento de alto rendimento (HTS) da biblioteca confirmou a alta diversidade de peptídeos na biblioteca: mais de 81% das sequências peptídicas foram encontradas apenas uma vez e apenas 1,5% ocorreram em ≥4 cópias (Figura Suplementar 2a). As frequências de aminoácidos (aa) em todas as 12 posições do repertório correlacionaram-se bem com as frequências esperadas para o número de códons gerados pelo repertório degenerado NKK (Figura Suplementar 2b). A frequência observada de resíduos de aa codificados por esses insertos correlacionou-se bem com a frequência calculada (r = 0,893) (Figura Suplementar 2c). A preparação de bibliotecas de fagos para injeção inclui as etapas de amplificação e remoção de endotoxinas. Já foi demonstrado que isso pode reduzir a diversidade das bibliotecas de fagos^12,13. Portanto, sequenciamos uma biblioteca de fagos amplificada em placa que havia passado por remoção de endotoxinas e a comparamos com a biblioteca original para estimar a frequência de AA. Uma forte correlação (r = 0,995) foi observada entre o pool original e o pool amplificado e purificado (Figura Suplementar 2d), indicando que a competição entre clones amplificados em placas usando o fago T7 não causou viés significativo. Esta comparação baseia-se na frequência de motivos de tripeptídeos em cada biblioteca, uma vez que a diversidade das bibliotecas (~10⁹) não pode ser totalmente capturada nem mesmo com HTS. A análise de frequência de aminoácidos em cada posição revelou um pequeno viés dependente da posição nas três últimas posições do repertório inserido (Figura Suplementar 2e). Em conclusão, consideramos que a qualidade e a diversidade da biblioteca eram aceitáveis ​​e que apenas pequenas alterações na diversidade foram observadas devido à amplificação e preparação das bibliotecas de fagos entre as várias rodadas de seleção.
A amostragem seriada do líquido cefalorraquidiano pode ser realizada através da implantação cirúrgica de uma cânula no CM de ratos conscientes para facilitar a identificação do fago T7 injetado por via intravenosa (iv) através da BHE e/ou BCSFB (Fig. 1a-b). Utilizamos dois braços de seleção independentes (braços A e B) nas três primeiras rodadas de seleção in vivo (Fig. 1c). Aumentamos gradualmente a seletividade da seleção, diminuindo a quantidade total de fago introduzida nas três primeiras rodadas. Para a quarta rodada de seleção, combinamos amostras dos braços A e B e realizamos três seleções independentes adicionais. Para estudar as propriedades in vivo das partículas do fago T7 neste modelo, o fago selvagem (inserto mestre PAGISRELVDKL) foi injetado em ratos através da veia da cauda. A recuperação de fagos do líquido cefalorraquidiano e do sangue em diferentes momentos mostrou que os fagos icosaédricos T7, relativamente pequenos, apresentaram uma fase inicial de eliminação rápida do compartimento sanguíneo (Fig. suplementar 3). Com base nos títulos administrados e no volume sanguíneo dos ratos, calculamos que apenas aproximadamente 1% do peso do fago da dose administrada foi detectado no sangue 10 minutos após a injeção intravenosa. Após esse rápido declínio inicial, observou-se uma depuração primária mais lenta, com meia-vida de 27,7 minutos. É importante ressaltar que apenas uma quantidade muito pequena de fagos foi recuperada do compartimento do LCR, indicando uma baixa migração basal do fago selvagem para o compartimento do LCR (Figura Suplementar 3). Em média, apenas cerca de 1 x 10⁻³% dos títulos de fago T7 no sangue e 4 x 10⁻⁸% dos fagos inicialmente infundidos foram detectados no líquido cefalorraquidiano durante todo o período de amostragem (0-250 min). Notavelmente, a meia-vida (25,7 min) do fago selvagem no líquido cefalorraquidiano foi semelhante à observada no sangue. Esses dados demonstram que a barreira que separa o compartimento do LCR do sangue está intacta em ratos canulados com CM, permitindo a seleção in vivo de bibliotecas de fagos para identificar clones que são facilmente transportados do sangue para o compartimento do LCR.
(a) Configuração de um método para reamostragem de líquido cefalorraquidiano (LCR) a partir de um grande pool. (b) Diagrama mostrando a localização celular da barreira do sistema nervoso central (SNC) e a estratégia de seleção usada para identificar peptídeos que atravessam a barreira hematoencefálica (BHE). (c) Fluxograma de triagem por phage display in vivo. Em cada rodada de seleção, os fagos (identificadores de animais dentro das setas) foram injetados por via intravenosa. Dois ramos alternativos independentes (A, B) são mantidos separadamente até a 4ª rodada de seleção. Para as rodadas de seleção 3 e 4, cada clone de fago extraído do LCR foi sequenciado manualmente. (d) Cinética dos fagos isolados do sangue (círculos vermelhos) e do líquido cefalorraquidiano (triângulos verdes) durante a primeira rodada de seleção em dois ratos canulados após injeção intravenosa da biblioteca de peptídeos T7 (2 x 10¹² fagos/animal). Os quadrados azuis indicam a concentração inicial média de fago no sangue, calculada a partir da quantidade de fago injetado, levando em consideração o volume sanguíneo total. Os quadrados pretos indicam o ponto de intersecção da linha y extrapolada a partir das concentrações de fago no sangue. (e, f) Apresentam a frequência relativa e a distribuição de todos os possíveis motivos de tripeptídeos sobrepostos encontrados no peptídeo. O número de motivos encontrados em 1000 leituras é mostrado. Motivos significativamente enriquecidos (p < 0,001) são marcados com pontos vermelhos. (e) Gráfico de dispersão de correlação comparando a frequência relativa do motivo de tripeptídeo da biblioteca injetada com o fago derivado do sangue dos animais nº 1.1 e nº 1.2. (f) Gráfico de dispersão de correlação comparando as frequências relativas dos motivos de tripeptídeos dos fagos animais nº 1.1 e nº 1.2 isolados no sangue e no líquido cefalorraquidiano. (g, h) Representação da sequência de identificação de fagos enriquecidos no sangue (g) versus bibliotecas injetadas e fagos enriquecidos no LCR (h) versus sangue após uma rodada de seleção in vivo em ambos os animais. O tamanho do código de uma letra indica a frequência com que esse aminoácido ocorre nessa posição. Verde = aminoácidos polares, roxo = neutros, azul = básicos, vermelho = ácidos e preto = hidrofóbicos. As figuras 1a e 1b foram projetadas e produzidas por Eduard Urich.
Injetamos uma biblioteca de peptídeos de fago em dois ratos instrumentados CM (clados A e B) e isolamos fagos do líquido cefalorraquidiano e do sangue (Figura 1d). A rápida eliminação inicial da biblioteca foi menos pronunciada em comparação com o fago selvagem. A meia-vida média da biblioteca injetada em ambos os animais foi de 24,8 minutos no sangue, semelhante à do fago selvagem, e de 38,5 minutos no LCR. Amostras de fago do sangue e do líquido cefalorraquidiano de cada animal foram submetidas a triagem de alto rendimento (HTS) e todos os peptídeos identificados foram analisados ​​quanto à presença de um pequeno motivo tripeptídico. Os motivos tripeptídicos foram escolhidos por fornecerem uma base mínima para a formação de estruturas e interações peptídeo-proteína^14,15. Encontramos uma boa correlação na distribuição de motivos entre a biblioteca de fago injetada e os clones extraídos do sangue de ambos os animais (Figura 1e). Os dados indicam que a composição da biblioteca é apenas marginalmente enriquecida no compartimento sanguíneo. As frequências de aminoácidos e as sequências consenso foram analisadas em cada posição usando uma adaptação do software Weblogo16. Curiosamente, encontramos um forte enriquecimento em resíduos de glicina no sangue (Fig. 1g). Ao comparar o sangue com clones selecionados do LCR, observou-se forte seleção e alguma deseleção de motivos (Fig. 1f), e certos aminoácidos estavam preferencialmente presentes em posições predeterminadas no peptídeo de 12 membros (Fig. 1h). Notavelmente, os animais individuais diferiram significativamente no líquido cefalorraquidiano, enquanto o enriquecimento de glicina no sangue foi observado em ambos os animais (Fig. suplementar 4a–j). Após filtragem rigorosa dos dados de sequência no líquido cefalorraquidiano dos animais #1.1 e #1.2, um total de 964 e 420 peptídeos únicos de 12 aminoácidos foram obtidos (Fig. suplementar 1d–e). Os clones de fago isolados foram amplificados e submetidos a uma segunda rodada de seleção in vivo. Os fagos extraídos da segunda rodada de seleção foram submetidos a triagem de alto rendimento (HTS) em cada animal, e todos os peptídeos identificados foram usados ​​como entrada para um programa de reconhecimento de motivos para analisar a ocorrência de motivos de tripeptídeos (Fig. 2a, b, ef). Comparando com o primeiro ciclo dos fagos recuperados do LCR, observamos seleção e deseleção adicionais de muitos motivos no LCR nos ramos A e B (Fig. 2). Um algoritmo de identificação de rede foi aplicado para determinar se eles representavam diferentes padrões de sequência consistente. Uma clara similaridade foi observada entre as sequências de 12 dimensões recuperadas do LCR no clado alternativo A (Fig. 2c, d) e no clado B (Fig. 2g, h). A análise conjunta em cada ramo revelou diferentes perfis de seleção para peptídeos de 12 aminoácidos (Fig. suplementar 5c,d) e um aumento na razão de título LCR/sangue ao longo do tempo para clones agrupados após a segunda rodada de seleção em comparação com a primeira rodada de seleção (Fig. suplementar 5e).
Enriquecimento de motivos e peptídeos no líquido cefalorraquidiano por meio de duas rodadas sucessivas de seleção funcional in vivo por phage display.
Todos os fagos do líquido cefalorraquidiano recuperados da primeira rodada de cada animal (animais nº 1.1 e nº 1.2) foram agrupados, amplificados, sequenciados por HT e reinjetados juntos (2 x 10¹⁰ fagos/animal) em 2 ratos canulados na veia submucosa (nº 1.1 → nº 2.1 e 2.2, 1.2 → nº 2.3 e 2.4). (a, b, e, f) Gráficos de dispersão de correlação comparando a frequência relativa de motivos de tripeptídeos de todos os fagos derivados do LCR na primeira e na segunda rodadas de seleção. Frequência relativa e distribuição de motivos representando todos os tripeptídeos sobrepostos possíveis encontrados em peptídeos em ambas as orientações. O número de motivos encontrados em 1000 leituras é mostrado. Motivos que foram significativamente (p < 0,001) selecionados ou excluídos em uma das bibliotecas comparadas são destacados com pontos vermelhos. (c, d, g, h) Representação do logotipo da sequência de todas as sequências ricas em LCR com 12 aminoácidos, com base nas rodadas 2 e 1 de seleção in vivo. O tamanho do código de uma letra indica a frequência com que o aminoácido ocorre naquela posição. Para representar o logotipo, a frequência das sequências de LCR extraídas de animais individuais entre duas rodadas de seleção é comparada e as sequências enriquecidas na segunda rodada são mostradas: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 e (h) #1.2–#2.4. Os aminoácidos mais enriquecidos em uma determinada posição nos animais nº 2.1 e nº 2.2 (c, d) ou nos animais nº 2.3 e nº 2.4 (g, h) são mostrados em cores. Verde = aminoácidos polares, roxo = neutros, azul = básicos, vermelho = ácidos e preto = hidrofóbicos.
Após a terceira rodada de seleção, identificamos 124 sequências peptídicas únicas (nº 3.1 e nº 3.2) a partir de 332 clones de fago reconstituídos em LCR isolados de dois animais (Figura Suplementar 6a). A sequência LGSVS (18,7%) apresentou a maior proporção relativa, seguida pelos insertos do tipo selvagem PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) e SARGSWREIVSLS (2,2%). Na quarta e última rodada, agrupamos dois ramos selecionados independentemente de três animais diferentes (Figura 1c). Dos 925 clones de fago sequenciados recuperados do LCR, na quarta rodada encontramos 64 sequências peptídicas únicas (Figura Suplementar 6b), entre as quais a proporção relativa de fago do tipo selvagem caiu para 0,8%. Os clones de LCR mais comuns na quarta rodada foram LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) e RLSSVDSDLSGC (3,2%). A variação no comprimento dos peptídeos selecionados deve-se a inserções/deleções de nucleotídeos ou códons de parada prematuros nos primers da biblioteca quando se utilizam códons degenerados para o desenho da biblioteca NNK. Os códons de parada prematuros geram peptídeos mais curtos e são selecionados por conterem o motivo de aminoácidos favorável. Peptídeos mais longos podem resultar de inserções/deleções nos primers das bibliotecas sintéticas. Isso posiciona o códon de parada projetado fora da fase de leitura e o lê até que um novo códon de parada apareça a jusante. Em geral, calculamos os fatores de enriquecimento para todas as quatro rodadas de seleção comparando os dados de entrada com os dados de saída da amostra. Na primeira rodada de triagem, utilizamos títulos de fagos selvagens como referência de fundo não específica. Curiosamente, a seleção negativa de fagos foi muito forte no primeiro ciclo de LCR, mas não no sangue (Fig. 3a), o que pode ser devido à baixa probabilidade de difusão passiva da maioria dos membros da biblioteca de peptídeos para o compartimento do LCR ou ao fato de que os fagos tendem a ser retidos ou removidos da corrente sanguínea com mais eficiência do que os bacteriófagos. No entanto, na segunda rodada de seleção, observou-se uma forte seleção de fagos no LCR em ambos os clados, sugerindo que a rodada anterior foi enriquecida em fagos que exibem peptídeos que promovem a captação pelo LCR (Fig. 3a). Novamente, sem enriquecimento significativo no sangue. Também na terceira e quarta rodadas, os clones de fagos foram significativamente enriquecidos no LCR. Comparando a frequência relativa de cada sequência peptídica única entre as duas últimas rodadas de seleção, descobrimos que as sequências estavam ainda mais enriquecidas na quarta rodada de seleção (Fig. 3b). Um total de 931 motivos de tripeptídeos foram extraídos de todas as 64 sequências peptídicas únicas, utilizando ambas as orientações dos peptídeos. Os motivos mais enriquecidos na quarta rodada foram examinados mais detalhadamente quanto aos seus perfis de enriquecimento em todas as rodadas, em comparação com a biblioteca injetada (limite: 10% de enriquecimento) (Figura Suplementar 6c). Os padrões gerais de seleção mostraram que a maioria dos motivos estudados estava enriquecida em todas as rodadas anteriores de ambos os ramos de seleção. No entanto, alguns motivos (por exemplo, SGL, VSG, LGS, GSV) eram predominantemente do clado alternativo A, enquanto outros (por exemplo, FGW, RTN, WGF, NTR) estavam enriquecidos no clado alternativo B.
Validação do transporte em LCR de peptídeos exibidos em fagos e enriquecidos em LCR, bem como de peptídeos líderes biotinilados conjugados a cargas úteis de estreptavidina.
(a) Razões de enriquecimento calculadas em todas as quatro rodadas (R1-R4) com base nos títulos de fagos injetados (entrada = I) (UFP) e nos títulos de fagos determinados no LCR (saída = O). Os fatores de enriquecimento para as três últimas rodadas (R2-R4) foram calculados por comparação com a rodada anterior e a primeira rodada (R1) com dados de ponderação. As barras brancas representam o líquido cefalorraquidiano e as barras sombreadas representam o plasma. (***p<0,001, com base no teste t de Student). (b) Lista dos peptídeos de fagos mais abundantes, classificados de acordo com sua proporção relativa a todos os fagos coletados no LCR após a rodada 4 de seleção. Os seis clones de fagos mais comuns estão destacados em cores, numerados e seus fatores de enriquecimento entre as rodadas 3 e 4 de seleção (inserções). (c,d) Os seis clones de fagos mais enriquecidos, as bibliotecas de peptídeos de fagos vazios e de fagos parentais da rodada 4 foram analisados ​​individualmente em um modelo de amostragem de LCR. Amostras de LCR e sangue foram coletadas nos pontos de tempo indicados. (c) Quantidades iguais de 6 clones de fago candidatos (2 x 10¹⁰ fagos/animal), fagos vazios (#1779) (2 x 10¹⁰ fagos/animal) e bibliotecas de peptídeos de fago (2 x 10¹² fagos/animal) foram administradas ao animal canulado separadamente via veia da cauda. A farmacocinética do LCR de cada clone de fago e biblioteca de peptídeos de fago injetados ao longo do tempo é mostrada. (d) mostra a razão média LCR/sangue para todos os fagos recuperados/mL durante o tempo de amostragem. (e) Quatro peptídeos líderes sintéticos e um controle aleatório foram ligados com biotina à estreptavidina através de seu N-terminal (tetrâmero) seguido de injeção (via intravenosa na veia da cauda, ​​10 mg de estreptavidina/kg). Pelo menos três ratos intubados (N = 3). Amostras de LCR foram coletadas nos pontos de tempo indicados e as concentrações de estreptavidina foram medidas por ELISA anti-estreptavidina no LCR (nd = não detectado). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, com base no teste ANOVA). (f) Comparação da sequência de aminoácidos do clone de peptídeo de fago mais enriquecido nº 2002 (roxo) com outros clones de peptídeo de fago selecionados da 4ª rodada de seleção. Fragmentos de aminoácidos idênticos e semelhantes são codificados por cores.
De todos os fagos enriquecidos na quarta rodada (Fig. 3b), seis clones candidatos foram selecionados para análise individual adicional no modelo de amostragem do LCR. Quantidades iguais de seis bibliotecas de fagos candidatos, fagos vazios (sem inserto) e peptídeos de profagos foram injetadas em três animais CM canulados, e a farmacocinética foi determinada em ensaios de LCR (Fig. 3c) e sangue (Fig. suplementar 7). Todos os clones de fagos testados apresentaram direcionamento ao compartimento do LCR em um nível 10 a 1000 vezes maior do que o do fago controle vazio (#1779). Por exemplo, os clones #2020 e #2077 apresentaram títulos no LCR cerca de 1000 vezes maiores do que o fago controle. O perfil farmacocinético de cada peptídeo selecionado é diferente, mas todos eles apresentam alta capacidade de direcionamento ao LCR. Observamos uma diminuição constante ao longo do tempo para os clones #1903 e #2011, enquanto para os clones #2077, #2002 e #2009, um aumento durante os primeiros 10 minutos pode indicar transporte ativo, mas precisa ser verificado. Os clones #2020, #2002 e #2077 estabilizaram-se em níveis elevados, enquanto a concentração no LCR do clone #2009 diminuiu lentamente após o aumento inicial. Em seguida, comparamos a frequência relativa de cada candidato no LCR com sua concentração no sangue (Fig. 3d). A correlação do título médio de cada candidato no LCR com seu título no sangue em todos os tempos de amostragem mostrou que três dos seis candidatos estavam significativamente enriquecidos no LCR sanguíneo. Curiosamente, o clone #2077 apresentou maior estabilidade no sangue (Figura Suplementar 7). Para confirmar que os próprios peptídeos são capazes de transportar ativamente cargas diferentes de partículas de fago para o compartimento do LCR, sintetizamos quatro peptídeos líderes derivados com biotina na extremidade N-terminal, onde os peptídeos se ligam à partícula de fago. Peptídeos biotinilados (nº 2002, 2009, 2020 e 2077) foram conjugados com estreptavidina (SA) para obter formas multiméricas que mimetizam, em certa medida, a geometria dos fagos. Esse formato também nos permitiu medir a exposição à SA no sangue e no líquido cefalorraquidiano (LCR) como peptídeos de proteínas transportadoras de carga. É importante ressaltar que os dados dos fagos puderam ser frequentemente reproduzidos quando os peptídeos sintéticos foram administrados nesse formato conjugado com SA (Fig. 3e). Os peptídeos embaralhados apresentaram menor exposição inicial e eliminação mais rápida do LCR, com níveis indetectáveis ​​em 48 horas. Para obter informações sobre as vias de distribuição desses clones de fagos peptídicos no LCR, analisamos a localização de peptídeos individuais de fagos utilizando imuno-histoquímica (IHQ) para detectar diretamente as partículas de fago 1 hora após a injeção intravenosa in vivo. Notavelmente, os clones #2002, #2077 e #2009 puderam ser detectados por forte marcação nos capilares cerebrais, enquanto o fago controle (#1779) e o clone #2020 não foram detectados (Figura Suplementar 8). Isso sugere que esses peptídeos contribuem para o efeito no cérebro precisamente ao atravessarem a barreira hematoencefálica (BHE). Análises mais detalhadas são necessárias para testar essa hipótese, visto que a via BSCFB também pode estar envolvida. Ao comparar a sequência de aminoácidos do clone mais enriquecido (#2002) com outros peptídeos selecionados, observou-se que alguns deles possuem extensões de aminoácidos semelhantes, o que pode indicar um mecanismo de transporte similar (Fig. 3f).
Devido ao seu perfil plasmático único e ao aumento significativo no LCR ao longo do tempo, o clone de fago #2077 foi explorado mais a fundo durante um período mais longo de 48 horas e foi capaz de reproduzir o rápido aumento no LCR observado em associação com níveis sustentados de SA (Figura 4a). Em relação a outros clones de fago identificados, o #2077 apresentou forte marcação para capilares cerebrais e mostrou colocalização significativa com a lectina, um marcador capilar, quando visualizado em alta resolução, e possivelmente alguma marcação no espaço parenquimatoso (Figura 4b). Para investigar se efeitos farmacológicos mediados por peptídeos poderiam ser obtidos no SNC, realizamos um experimento no qual versões biotiniladas de i) o peptídeo de trânsito #2077 e ii) o peptídeo inibidor de BACE1 foram misturadas com SA em duas proporções diferentes. Para uma combinação, usamos apenas o peptídeo inibidor de BACE1 e, para a outra, usamos uma proporção de 1:3 de peptídeo inibidor de BACE1 para peptídeo #2077. Ambas as amostras foram administradas por via intravenosa e os níveis de peptídeo beta-amiloide 40 (Aβ40) no sangue e no líquido cefalorraquidiano (LCR) foram medidos ao longo do tempo. A Aβ40 foi medida no LCR, pois reflete a inibição da BACE1 no parênquima cerebral. Como esperado, ambos os complexos reduziram significativamente os níveis sanguíneos de Aβ40 (Fig. 4c, d). No entanto, apenas as amostras contendo uma mistura do peptídeo nº 2077 e um inibidor do peptídeo BACE1 conjugado à SA causaram uma diminuição significativa de Aβ40 no LCR (Fig. 4c). Os dados mostram que o peptídeo nº 2077 é capaz de transportar a proteína SA de 60 kDa para o SNC e também induz efeitos farmacológicos com inibidores do peptídeo BACE1 conjugados à SA.
(a) Injeção clonal (2 × 10⁶ fagos/animal) do fago T7 mostrando os perfis farmacocinéticos de longo prazo do peptídeo #2077 (RLSSVDSDLSGC) no LCR e do fago controle não injetado (#1779) em pelo menos três ratos intubados com CM. (b) Imagem de microscopia confocal de microvasos corticais representativos em ratos injetados com fago (2 × 10⁶ fagos/animal) mostrando a contracoloração do peptídeo #2077 e dos vasos (lectina). Esses clones de fago foram administrados a 3 ratos e deixados circular por 1 hora antes da perfusão. Os cérebros foram seccionados e corados com anticorpos policlonais marcados com FITC contra o capsídeo do fago T7. Dez minutos antes da perfusão e subsequente fixação, a lectina marcada com DyLight594 foi administrada por via intravenosa. Imagens de fluorescência mostrando a coloração de lectina (vermelho) no lado luminal dos microvasos e fagos (verde) no lúmen dos capilares e no tecido cerebral perivascular. A barra de escala corresponde a 10 µm. (c, d) O peptídeo inibidor de BACE1 biotinilado, isoladamente ou em combinação com o peptídeo de trânsito biotinilado nº 2077, foi acoplado à estreptavidina, seguido de injeção intravenosa em pelo menos três ratos CM canulados (10 mg de estreptavidina/kg). A redução de Aβ40 mediada pelo inibidor peptídico de BACE1 foi medida por ELISA de Aβ1-40 no sangue (vermelho) e no líquido cefalorraquidiano (laranja) nos pontos de tempo indicados. Para maior clareza, uma linha pontilhada foi desenhada no gráfico em uma escala de 100%. (c) Redução percentual de Aβ40 no sangue (triângulos vermelhos) e no líquido cefalorraquidiano (triângulos laranja) em ratos tratados com estreptavidina conjugada ao peptídeo de trânsito nº 2077 e ao peptídeo inibidor de BACE1 na proporção de 3:1. (d) Redução percentual de Aβ40 no sangue (círculos vermelhos) e no líquido cefalorraquidiano (círculos laranja) de ratos tratados apenas com estreptavidina conjugada a um peptídeo inibidor de BACE1. A concentração de Aβ no grupo controle foi de 420 pg/ml (desvio padrão = 101 pg/ml).
A técnica de phage display tem sido aplicada com sucesso em diversas áreas da pesquisa biomédica¹⁷. Esse método tem sido utilizado em estudos de diversidade vascular in vivo^18,19, bem como em estudos direcionados a vasos cerebrais^{20,21,22,23,24,25,26}. Neste estudo, ampliamos a aplicação desse método de seleção não apenas para a identificação direta de peptídeos direcionados a vasos cerebrais, mas também para a descoberta de candidatos com propriedades de transporte ativo capazes de atravessar a barreira hematoencefálica. Descrevemos agora o desenvolvimento de um procedimento de seleção in vivo em ratos intubados com meio condicionado (MC) e demonstramos seu potencial para identificar peptídeos com propriedades de direcionamento ao líquido cefalorraquidiano (LCR). Utilizando o fago T7 exibindo uma biblioteca de peptídeos aleatórios de 12 aminoácidos, demonstramos que o fago T7 é suficientemente pequeno (aproximadamente 60 nm de diâmetro)¹⁰ para se adaptar à barreira hematoencefálica, atravessando-a diretamente ou atravessando o plexo coroide. Observamos que a coleta de LCR de ratos CM canulados foi um método de triagem funcional in vivo bem controlado e que o fago extraído não apenas se ligou à vasculatura, mas também funcionou como um transportador através da barreira hematoencefálica. Além disso, ao coletar sangue simultaneamente e aplicar HTS ao LCR e aos fagos derivados do sangue, confirmamos que nossa escolha de LCR não foi influenciada pelo enriquecimento sanguíneo ou pela aptidão para expansão entre as rodadas de seleção. No entanto, o compartimento sanguíneo faz parte do procedimento de seleção, uma vez que os fagos capazes de alcançar o compartimento do LCR devem sobreviver e circular na corrente sanguínea por tempo suficiente para se enriquecerem no cérebro. Para extrair informações de sequência confiáveis ​​dos dados brutos de HTS, implementamos filtros adaptados a erros de sequenciamento específicos da plataforma no fluxo de trabalho de análise. Ao incorporar parâmetros cinéticos ao método de triagem, confirmamos a rápida farmacocinética dos fagos T7 selvagens (t½ ~ 28 min) no sangue^{24, 27, 28} e também determinamos sua meia-vida no líquido cefalorraquidiano (LCR) (t½ ~ 26 min). Apesar de perfis farmacocinéticos semelhantes no sangue e no LCR, apenas 0,001% da concentração sanguínea do fago pôde ser detectada no LCR, indicando baixa mobilidade basal do fago T7 selvagem através da barreira hematoencefálica. Este trabalho destaca a importância da primeira rodada de seleção ao usar estratégias de panning in vivo, especialmente para sistemas de fagos que são rapidamente eliminados da circulação, visto que poucos clones conseguem atingir o compartimento do SNC. Assim, na primeira rodada, a redução na diversidade da biblioteca foi muito grande, pois apenas um número limitado de clones foi coletado neste modelo de LCR bastante restritivo. Essa estratégia de seleção in vivo incluiu várias etapas, como acúmulo ativo no compartimento do LCR, sobrevivência do clone no compartimento sanguíneo e remoção rápida dos clones do fago T7 do sangue nos primeiros 10 minutos (Fig. 1d e Fig. Suplementar 4M). Assim, após a primeira rodada, diferentes clones de fago foram identificados no LCR, embora o mesmo conjunto inicial tenha sido usado para cada animal. Isso sugere que múltiplas etapas de seleção rigorosas para bibliotecas de origem com um grande número de membros resultam em uma redução significativa da diversidade. Portanto, eventos aleatórios se tornam parte integrante do processo de seleção inicial, influenciando bastante o resultado. É provável que muitos dos clones na biblioteca original tivessem uma propensão de enriquecimento no LCR muito semelhante. No entanto, mesmo sob as mesmas condições experimentais, os resultados da seleção podem diferir devido ao pequeno número de cada clone específico no conjunto inicial.
Os motivos enriquecidos no LCR diferem daqueles presentes no sangue. Curiosamente, observamos a primeira mudança em direção a peptídeos ricos em glicina no sangue de alguns animais (Fig. 1g, Figs. suplementares 4e, 4f). Os fagos contendo peptídeos de glicina podem ser mais estáveis ​​e menos propensos a serem removidos da circulação. No entanto, esses peptídeos ricos em glicina não foram detectados nas amostras de líquido cefalorraquidiano, sugerindo que as bibliotecas selecionadas passaram por duas etapas de seleção distintas: uma no sangue e outra com acúmulo permitido no líquido cefalorraquidiano. Os clones enriquecidos no LCR, resultantes da quarta rodada de seleção, foram extensivamente testados. Quase todos os clones testados individualmente apresentaram enriquecimento no LCR em comparação com o fago controle negativo. Um peptídeo específico (#2077) foi examinado com mais detalhes. Apresentou uma meia-vida plasmática mais longa em comparação com outros compostos (Figura 3d e Figura Suplementar 7) e, curiosamente, esse peptídeo continha um resíduo de cisteína na extremidade C-terminal. Recentemente, foi demonstrado que a adição de cisteína a peptídeos pode melhorar suas propriedades farmacocinéticas por meio da ligação à albumina²⁹. Isso ainda é desconhecido para o peptídeo nº 2077 e requer estudos adicionais. Alguns peptídeos apresentaram dependência de valência no enriquecimento do LCR (dados não mostrados), o que pode estar relacionado à geometria da superfície do capsídeo T7. O sistema T7 que utilizamos apresentou de 5 a 15 cópias de cada peptídeo por partícula de fago. A IHC foi realizada em clones de fago candidatos injetados por via intravenosa no córtex cerebral de ratos (Figura Suplementar 8). Os dados mostraram que pelo menos três clones (nº 2002, nº 2009 e nº 2077) interagiram com a BHE. Resta determinar se essa interação com a barreira hematoencefálica resulta no acúmulo de LCR ou na movimentação desses clones diretamente para a barreira hematoencefálica. É importante ressaltar que demonstramos que os peptídeos selecionados mantêm sua capacidade de transporte para o LCR quando sintetizados e ligados à proteína de carga. A ligação de peptídeos biotinilados na extremidade N-terminal à SA essencialmente repete os resultados obtidos com seus respectivos clones de fago no sangue e no líquido cefalorraquidiano (Figura 3e). Por fim, mostramos que o peptídeo líder nº 2077 é capaz de promover a ação cerebral de um inibidor peptídico biotinilado da BACE1 conjugado à SA, causando efeitos farmacodinâmicos pronunciados no SNC, reduzindo significativamente os níveis de Abeta40 no LCR (Figura 4). Não conseguimos identificar nenhum homólogo no banco de dados ao realizar uma busca de homologia de sequência peptídica em todos os resultados. É importante notar que o tamanho da biblioteca T7 é de aproximadamente 10⁹, enquanto o tamanho teórico da biblioteca para peptídeos de 12 aminoácidos é de 4 x 10¹⁵. Portanto, selecionamos apenas uma pequena fração do espaço de diversidade da biblioteca de peptídeos de 12 aminoácidos, o que pode significar que mais peptídeos otimizados podem ser identificados avaliando-se o espaço de sequências adjacentes desses resultados já identificados. Hipoteticamente, uma das razões pelas quais não encontramos homólogos naturais desses peptídeos pode ser a deseleção durante a evolução para impedir a entrada descontrolada de certos motivos peptídicos no cérebro.
Em conjunto, nossos resultados fornecem uma base para trabalhos futuros visando identificar e caracterizar com mais detalhes os sistemas de transporte da barreira cerebrovascular in vivo. A configuração básica deste método baseia-se em uma estratégia de seleção funcional que não apenas identifica clones com propriedades de ligação vascular cerebral, mas também inclui uma etapa crítica na qual os clones bem-sucedidos possuem atividade intrínseca para atravessar barreiras biológicas in vivo e atingir o compartimento do SNC. Nosso objetivo é elucidar o mecanismo de transporte desses peptídeos e sua preferência por se ligarem à microvasculatura específica da região cerebral. Isso pode levar à descoberta de novas vias de transporte através da BHE e de seus receptores. Esperamos que os peptídeos identificados possam se ligar diretamente a receptores cerebrovasculares ou a ligantes circulantes transportados através da BHE ou da BCSFB. Os vetores peptídicos com atividade de transporte no LCR descobertos neste trabalho serão investigados mais a fundo. Atualmente, estamos investigando a especificidade cerebral desses peptídeos quanto à sua capacidade de atravessar a BHE e/ou a BCSFB. Esses novos peptídeos serão ferramentas extremamente valiosas para a potencial descoberta de novos receptores ou vias metabólicas e para o desenvolvimento de novas plataformas altamente eficientes para a administração de macromoléculas, como produtos biológicos, ao cérebro.
A canulação da cisterna maior (CM) foi realizada utilizando uma modificação do método previamente descrito. Ratos Wistar anestesiados (200-350 g) foram posicionados em um aparelho estereotáxico e uma incisão mediana foi feita sobre o couro cabeludo previamente raspado e preparado assepticamente para expor o crânio. Dois orifícios foram perfurados na região da parte superior do crânio e parafusos de fixação foram instalados nesses orifícios. Um orifício adicional foi perfurado na crista occipital lateral para guiar estereotaticamente uma cânula de aço inoxidável até a CM. Cimento odontológico foi aplicado ao redor da cânula e fixado com parafusos. Após a fotopolimerização e endurecimento do cimento, a ferida cutânea foi suturada com fio supramid 4/0. O posicionamento correto da cânula foi confirmado pela presença de vazamento espontâneo de líquido cefalorraquidiano (LCR). O rato foi retirado do aparelho estereotáxico, recebeu os cuidados pós-operatórios adequados e analgesia, e foi permitido que se recuperasse por pelo menos uma semana, até que sinais de sangue fossem observados no LCR. Ratos Wistar (Crl:WI/Han) foram obtidos da Charles River (França). Todos os ratos foram mantidos em condições livres de patógenos específicos. Todos os experimentos com animais foram aprovados pelo Departamento de Medicina Veterinária da cidade de Basileia, Suíça, e realizados de acordo com a Licença para Uso de Animais nº 2474 (Avaliação do Transporte Ativo Cerebral por meio da Medição dos Níveis de Candidatos Terapêuticos no Líquido Cefalorraquidiano e no Cérebro de Ratos).
Mantenha o rato consciente com cuidado, segurando a cânula CM. Remova a Datura da cânula e colete 10 µl de líquido cefalorraquidiano (LCR) que flui espontaneamente. Como a permeabilidade da cânula acabou sendo comprometida, apenas amostras de LCR límpido, sem evidências de contaminação sanguínea ou descoloração, foram incluídas neste estudo. Paralelamente, aproximadamente 10–20 µl de sangue foram coletados por meio de uma pequena incisão na ponta da cauda em tubos com heparina (Sigma-Aldrich). O LCR e o sangue foram coletados em diferentes momentos após a injeção intravenosa do fago T7. Aproximadamente 5–10 µl de líquido foram descartados antes de cada coleta de LCR, o que corresponde ao volume morto do cateter.
As bibliotecas foram geradas utilizando o vetor T7Select 10-3b, conforme descrito no manual do sistema T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Resumidamente, um inserto de DNA aleatório de 12 nucleotídeos foi sintetizado no seguinte formato:
O códon NNK foi utilizado para evitar códons de parada duplos e superexpressão de aminoácidos no inserto. N representa uma mistura manual em proporção equimolar de cada nucleotídeo, e K representa uma mistura manual em proporção equimolar de nucleotídeos de adenina e citosina. Regiões de fita simples foram convertidas em DNA de fita dupla por incubação adicional com dNTP (Novagen) e enzima Klenow (New England Biolabs) em tampão Klenow (New England Biolabs) por 3 horas a 37 °C. Após a reação, o DNA de fita dupla foi recuperado por precipitação com etanol. O DNA resultante foi digerido com as enzimas de restrição EcoRI e HindIII (ambas da Roche). O inserto clivado e purificado (QIAquick, Qiagen) (ligase T4, New England Biolabs) foi então ligado em fase em um vetor T7 pré-clivado após o aminoácido 348 do gene do capsídeo 10B. As reações de ligação foram incubadas a 16 °C por 18 horas antes do empacotamento in vitro. O empacotamento do fago in vitro foi realizado de acordo com as instruções fornecidas com o kit de clonagem T7Select 10-3b (Novagen) e a solução de empacotamento foi amplificada uma vez até a lise usando Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Os lisados ​​foram centrifugados, titulados e congelados a -80 °C como uma solução estoque de glicerol.
Amplificação direta por PCR de regiões variáveis ​​de fagos amplificadas em caldo ou placa usando primers de fusão proprietários 454/Roche-amplicon. O primer de fusão direto contém sequências flanqueando a região variável (NNK) 12 (específicas do molde), o adaptador GS FLX Titanium A e uma sequência chave de biblioteca de quatro bases (TCAG) (Figura Suplementar 1a):
O primer de fusão reversa também contém biotina ligada às esferas de captura e o adaptador GS FLX Titanium B, necessário para a amplificação clonal durante a PCR em emulsão:
Os amplificados foram então submetidos ao pirosequenciamento 454/Roche de acordo com o protocolo 454 GS-FLX Titanium. Para o sequenciamento Sanger manual (Analisador de DNA Applied Biosystems Hitachi 3730 xl), o DNA do fago T7 foi amplificado por PCR e sequenciado com os seguintes pares de primers:
Os fragmentos extraídos de placas individuais foram submetidos à amplificação por PCR utilizando o kit Roche Fast Start DNA Polymerase (de acordo com as instruções do fabricante). Realizou-se um ciclo inicial a quente (10 min a 95 °C) e 35 ciclos de reforço (50 s a 95 °C, 1 min a 50 °C e 1 min a 72 °C).
Fagos provenientes de bibliotecas, fagos selvagens, fagos recuperados de LCR e sangue, ou clones individuais foram amplificados em Escherichia coli BL5615 em caldo TB (Sigma Aldrich) ou em placas de 500 cm² (Thermo Scientific) por 4 h a 37 °C. Os fagos foram extraídos das placas lavando-as com tampão Tris-EDTA (Fluka Analytical) ou coletando as placas de lise com ponteiras de pipeta estéreis. Os fagos foram isolados do sobrenadante da cultura ou do tampão de extração com uma rodada de precipitação com polietilenoglicol (PEG 8000) (Promega) e ressuspensos em tampão Tris-EDTA.
O fago amplificado foi submetido a 2-3 rodadas de remoção de endotoxinas utilizando esferas de remoção de endotoxinas (Miltenyi Biotec) antes da injeção intravenosa (IV) (500 μl/animal). Na primeira rodada, foram introduzidos 2×10¹² fagos; na segunda, 2×10¹⁰ fagos; na terceira e quarta rodadas de seleção, 2×10⁹ fagos por animal. O conteúdo de fagos no LCR e nas amostras de sangue coletadas nos pontos de tempo indicados foi determinado por contagem de placas, de acordo com as instruções do fabricante (manual do sistema T7Select). A seleção de fagos foi realizada por injeção intravenosa de bibliotecas purificadas na veia da cauda ou por reinjeção de fagos extraídos do LCR da rodada de seleção anterior, e as coletas subsequentes foram realizadas em 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min e 240 min, respectivamente, nas amostras de LCR e sangue. Um total de quatro rodadas de seleção in vivo foram conduzidas, nas quais os dois ramos selecionados foram armazenados e analisados ​​separadamente durante as três primeiras rodadas. Todos os insertos de fago extraídos do LCR nas duas primeiras rodadas de seleção foram submetidos a pirosequenciamento 454/Roche, enquanto todos os clones extraídos do LCR nas duas últimas rodadas de seleção foram sequenciados manualmente. Todos os fagos sanguíneos da primeira rodada de seleção também foram submetidos a pirosequenciamento 454/Roche. Para a injeção dos clones de fago, os fagos selecionados foram amplificados em E. coli (BL5615) em placas de 500 cm² a 37 °C por 4 horas. Os clones selecionados individualmente e sequenciados manualmente foram propagados em meio TB. Após a extração, purificação e remoção de endotoxinas (conforme descrito acima), 2 × 10¹⁰ fagos/animal em 300 μl foram injetados por via intravenosa em uma veia da cauda.
Pré-processamento e filtragem qualitativa dos dados de sequenciamento. Os dados brutos do 454/Roche foram convertidos de um formato binário padrão de mapa de fluxo (sff) para um formato legível por humanos da Pearson (fasta) usando o software do fornecedor. O processamento adicional da sequência de nucleotídeos foi realizado usando programas e scripts proprietários em C (pacote de software não lançado), conforme descrito abaixo. A análise dos dados primários inclui procedimentos rigorosos de filtragem em múltiplos estágios. Para filtrar as leituras que não continham uma sequência de DNA de inserção de 12 nucleotídeos válida, as leituras foram alinhadas sequencialmente ao marcador de início (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), ao marcador de parada (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) e à inserção de fundo (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) usando o teste global de Needleman-Wunsch. O alinhamento permite até 2 inconsistências por alinhamento31. Portanto, as leituras sem marcadores de início e parada e as leituras contendo inserções de fundo, ou seja, alinhamentos que excedem o número permitido de incompatibilidades, foram removidas da biblioteca. Quanto às sequências restantes, a sequência de DNA N-mer que se estende da marca de início até antes da marca de parada foi excisada da sequência original e processada posteriormente (doravante denominada “inserto”). Após a tradução do inserto, a porção após o primeiro códon de parada na extremidade 5′ do primer foi removida. Além disso, nucleotídeos que levavam a códons incompletos na extremidade 3′ do primer também foram removidos. Para excluir insertos contendo apenas sequências de fundo, insertos traduzidos que começavam com o padrão de aminoácidos “PAG” também foram removidos. Peptídeos com comprimento pós-traducional inferior a 3 aminoácidos foram removidos da biblioteca. Finalmente, a redundância no conjunto de insertos foi removida e a frequência de cada inserto único foi determinada. Os resultados desta análise incluíram uma lista de sequências de nucleotídeos (insertos) e suas frequências (de leitura) (Figuras Suplementares 1c e 2).
Agrupamento de inserções de DNA N-mer por similaridade de sequência: Para eliminar erros de sequenciamento específicos do 454/Roche (como problemas com o sequenciamento de extensões de homopolímeros) e remover redundâncias menos importantes, as inserções de sequência de DNA N-mer previamente filtradas (inserções) são classificadas por similaridade. As inserções (com até 2 bases não correspondentes permitidas) são classificadas usando um algoritmo iterativo definido da seguinte forma: as inserções são classificadas primeiro por sua frequência (da maior para a menor) e, se forem iguais, por sua segunda classificação por comprimento (do mais longo para o mais curto). Assim, as inserções mais frequentes e mais longas definem o primeiro “grupo”. A frequência do grupo é definida como a frequência da chave. Em seguida, cada inserção restante na lista classificada é adicionada ao grupo por meio de alinhamento de Needleman-Wunsch pareado. Se o número de incompatibilidades, inserções ou deleções em um alinhamento não exceder um limite de 2, uma inserção é adicionada ao grupo e a frequência geral do grupo é aumentada pela frequência com que a inserção foi adicionada. Os insertos adicionados a um grupo são marcados como usados ​​e excluídos de processamentos posteriores. Se a sequência de inserto não puder ser adicionada a um grupo já existente, ela é usada para criar um novo grupo com a frequência de inserção apropriada e marcada como usada. A iteração termina quando cada sequência de inserção tiver sido usada para formar um novo grupo ou puder ser incluída em um grupo já existente. Por fim, os insertos agrupados, compostos por nucleotídeos, são traduzidos em sequências peptídicas (bibliotecas de peptídeos). O resultado dessa análise é um conjunto de inserções e suas respectivas frequências, que compõem o número de leituras consecutivas (Figura Suplementar 2).
Geração de Motivos: Com base em uma lista de peptídeos únicos, foi criada uma biblioteca contendo todos os padrões de aminoácidos (aa) possíveis, conforme mostrado abaixo. Cada padrão possível de comprimento 3 foi extraído do peptídeo e seu padrão inverso foi adicionado, juntamente com uma biblioteca de motivos comuns contendo todos os padrões (tripeptídeos). Bibliotecas de motivos altamente repetitivos foram sequenciadas e a redundância removida. Em seguida, para cada tripeptídeo na biblioteca de motivos, verificamos sua presença na biblioteca usando ferramentas computacionais. Nesse caso, a frequência do peptídeo contendo o tripeptídeo do motivo encontrado é adicionada e atribuída ao motivo na biblioteca de motivos ("número de motivos"). O resultado da geração de motivos é uma matriz bidimensional contendo todas as ocorrências de tripeptídeos (motivos) e seus respectivos valores, que são o número de leituras de sequenciamento que resultam no motivo correspondente quando as leituras são filtradas, agrupadas e traduzidas. As métricas são descritas em detalhes acima.
Normalização do número de motivos e respectivos diagramas de dispersão: O número de motivos para cada amostra foi normalizado utilizando
onde ni é o número de leituras contendo o tópico i. Assim, vi representa a frequência percentual de leituras (ou peptídeos) contendo o motivo i na amostra. Os valores de p para o número não normalizado de motivos foram calculados usando o teste exato de Fisher. Em relação aos correlogramas do número de motivos, as correlações de Spearman foram calculadas usando o número normalizado de motivos com o software R.
Para visualizar o conteúdo de aminoácidos em cada posição na biblioteca de peptídeos, foram criados os weblogogramas 32 e 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Primeiramente, o conteúdo de aminoácidos em cada posição do peptídeo de 12 aminoácidos é armazenado em uma matriz 20×12. Em seguida, um conjunto de 1000 peptídeos contendo o mesmo conteúdo relativo de aminoácidos em cada posição é gerado no formato fasta-sequence e fornecido como entrada para o weblogo 3, que gera uma representação gráfica do conteúdo relativo de aminoácidos em cada posição para uma determinada biblioteca de peptídeos. Para visualizar conjuntos de dados multidimensionais, mapas de calor foram criados utilizando uma ferramenta desenvolvida internamente em R (biosHeatmap, um pacote R ainda não lançado). Os dendrogramas apresentados nos mapas de calor foram calculados utilizando o método de agrupamento hierárquico de Ward com a métrica de distância euclidiana. Para a análise estatística dos dados de pontuação de motivos, os valores de p para pontuação não normalizada foram calculados utilizando o teste exato de Fisher. Os valores de p para outros conjuntos de dados foram calculados em R usando o teste t de Student ou ANOVA.
Clones de fagos selecionados e fagos sem insertos foram injetados por via intravenosa através da veia da cauda (2×10¹⁰ fagos/animal em 300 μl de PBS). Dez minutos antes da perfusão e subsequente fixação, os mesmos animais receberam uma injeção intravenosa de 100 μl de lectina marcada com DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Sessenta minutos após a injeção de fagos, os ratos foram perfundidos através do coração com 50 ml de PBS, seguidos por 50 ml de PFA 4% em PBS. Amostras de cérebro foram adicionalmente fixadas durante a noite em PFA 4% em PBS e imersas em sacarose 30% durante a noite a 4°C. As amostras foram congeladas instantaneamente na mistura OCT. A análise imuno-histoquímica de amostras congeladas foi realizada à temperatura ambiente em criosecções de 30 µm bloqueadas com 1% de BSA e incubadas com anticorpos policlonais marcados com FITC contra o fago T7 (Novus NB 600-376A) a 4 °C. A incubação ocorreu durante a noite. Finalmente, as secções foram lavadas 3 vezes com PBS e examinadas com um microscópio confocal a laser (Leica TCS SP5).
Todos os peptídeos, com pureza mínima de 98%, foram sintetizados pela GenScript USA, biotinilados e liofilizados. A biotina está ligada por meio de um espaçador triplo de glicina adicional na extremidade N-terminal. Todos os peptídeos foram analisados ​​por espectrometria de massa.
A estreptavidina (Sigma S0677) foi misturada com um excesso equimolar de 5 vezes de peptídeo biotinilado, peptídeo inibidor de BACE1 biotinilado ou uma combinação (proporção 3:1) de peptídeo inibidor de BACE1 biotinilado e peptídeo inibidor de BACE1 em DMSO a 5-10%/incubada em PBS. A mistura foi mantida por 1 hora à temperatura ambiente antes da injeção. Os peptídeos conjugados à estreptavidina foram injetados por via intravenosa na dose de 10 mg/kg em uma das veias da cauda de ratos com cavidade cerebral.
A concentração dos complexos estreptavidina-peptídeo foi avaliada por ELISA. Placas de microtitulação Nunc Maxisorp (Sigma) foram revestidas durante a noite a 4°C com 1,5 μg/ml de anticorpo anti-estreptavidina de camundongo (Thermo, MA1-20011). Após o bloqueio (solução de bloqueio: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatina, 1% BSA) à temperatura ambiente por 2 horas, a placa foi lavada com 0,05% de Tween-20/PBS (solução de lavagem) por 3 segundos. Amostras de LCR e plasma foram adicionadas aos poços diluídas com a solução de bloqueio (plasma 1:10.000, LCR 1:115). A placa foi então incubada durante a noite a 4°C com o anticorpo de detecção (1 μg/ml, anti-estreptavidina-HRP, Novus NB120-7239). Após três lavagens, a estreptavidina foi detectada por incubação em solução de substrato TMB (Roche) por até 20 minutos. Após interromper o desenvolvimento da cor com H2SO4 1M, a absorbância foi medida a 450 nm.
A função do complexo estreptavidina-peptídeo-inibidor de BACE1 foi avaliada por ELISA para Aβ(1-40) de acordo com o protocolo do fabricante (Wako, 294-64701). Resumidamente, as amostras de LCR foram diluídas em diluente padrão (1:23) e incubadas durante a noite a 4 °C em placas de 96 poços revestidas com o anticorpo de captura BNT77. Após cinco lavagens, o anticorpo BA27 conjugado com HRP foi adicionado e incubado por 2 horas a 4 °C, seguido de cinco lavagens. Aβ(1-40) foi detectado por incubação em solução de TMB por 30 minutos à temperatura ambiente. Após a interrupção da reação com a solução de parada, a absorbância foi medida a 450 nm. As amostras de plasma foram submetidas à extração em fase sólida antes do ELISA para Aβ(1-40). O plasma foi adicionado a 0,2% de DEA (Sigma) em placas de 96 poços e incubado à temperatura ambiente por 30 minutos. Após lavagens sucessivas das placas de SPE (Oasis, 186000679) com água e metanol a 100%, as amostras de plasma foram adicionadas às placas de SPE e todo o líquido foi removido. As amostras foram lavadas (primeiro com metanol a 5% e depois com metanol a 30%) e eluídas com 2% de NH4OH/90% de metanol. Após a secagem do eluato a 55 °C por 99 minutos sob corrente constante de N2, as amostras foram reduzidas em diluentes padrão e o Aβ(1–40) foi medido conforme descrito anteriormente.
Como citar este artigo: Urich, E. et al. Entrega de carga ao cérebro usando peptídeos de trânsito identificados in vivo. The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
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