გმადლობთ, რომ ეწვიეთ Nature.com-ს. თქვენ იყენებთ ბრაუზერის ვერსიას შეზღუდული CSS მხარდაჭერით. საუკეთესო გამოცდილებისთვის გირჩევთ გამოიყენოთ განახლებული ბრაუზერი (ან გამორთოთ თავსებადობის რეჟიმი Internet Explorer-ში). გარდა ამისა, მუდმივი მხარდაჭერის უზრუნველსაყოფად, ჩვენ ვაჩვენებთ საიტს სტილებისა და JavaScript-ის გარეშე.
ერთდროულად სამი სლაიდის კარუსელის ჩვენება. ერთდროულად სამ სლაიდს შორის გადასაადგილებლად გამოიყენეთ „წინა“ და „შემდეგი“ ღილაკები, ან ერთდროულად სამ სლაიდს შორის გადასაადგილებლად გამოიყენეთ ბოლოში არსებული სლაიდერის ღილაკები.
ჰემატოენცეფალური ბარიერი და ჰემატოენცეფალური ბარიერი ხელს უშლის ბიოთერაპიულ აგენტებს ცენტრალურ ნერვულ სისტემაში მათი სამიზნეების მიღწევაში, რითაც ხელს უშლის ნევროლოგიური დაავადებების ეფექტურ მკურნალობას. ტვინის ახალი ტრანსპორტიორების აღმოსაჩენად in vivo, ჩვენ შემოვიღეთ T7 ფაგის პეპტიდების ბიბლიოთეკა და სერიულად შევაგროვეთ სისხლი და ცერებროსპინალური სითხე (CSF) ვირთხების კანულირებული, ცნობიერი დიდი აუზის მოდელის გამოყენებით. შერჩევის ოთხი რაუნდის შემდეგ, სპეციფიკური ფაგის კლონები ცერებროსპინალურ სითხეში მნიშვნელოვნად გამდიდრდა. ინდივიდუალური კანდიდატი პეპტიდების ტესტირებამ გამოავლინა ცერებროსპინალური სითხის 1000-ჯერ მეტი გამდიდრება. პეპტიდით განპირობებული ტვინში მიწოდების ბიოაქტიურობა დადასტურდა ტვინში ამილოიდ-β-ს დონის 40%-ით შემცირებით BACE1 პეპტიდის ინჰიბიტორის გამოყენებით, რომელიც დაკავშირებულია იდენტიფიცირებულ ახალ ტრანზიტულ პეპტიდთან. ეს შედეგები მიუთითებს, რომ in vivo ფაგის შერჩევის მეთოდებით იდენტიფიცირებული პეპტიდები შეიძლება იყოს სასარგებლო საშუალებები მაკრომოლეკულების სისტემური მიწოდებისთვის ტვინში თერაპიული ეფექტით.
ცენტრალური ნერვული სისტემის (ცნს) მიზნობრივი თერაპიის კვლევა ძირითადად ფოკუსირებულია ოპტიმიზირებული პრეპარატებისა და აგენტების იდენტიფიცირებაზე, რომლებიც ავლენენ ცნს-ზე მიზანმიმართულ თვისებებს, ნაკლები ძალისხმევით ხდება იმ მექანიზმების აღმოჩენა, რომლებიც წამლის აქტიურ მიწოდებას განაპირობებს ტვინში. ეს ახლა იცვლება, რადგან წამლის მიწოდება, განსაკუთრებით დიდი მოლეკულების, თანამედროვე ნეირომეცნიერების წამლების შემუშავების განუყოფელი ნაწილია. ცენტრალური ნერვული სისტემის გარემო კარგად არის დაცული ცერებროვასკულური ბარიერული სისტემით, რომელიც შედგება ჰემატოენცეფალური ბარიერისგან (BBB) ​​და ჰემატოენცეფალური ბარიერისგან (BCBB)1, რაც ართულებს წამლების ტვინში მიწოდებას1,2. დადგენილია, რომ თითქმის ყველა დიდი მოლეკულური პრეპარატი და მცირე მოლეკულური პრეპარატების 98%-ზე მეტი გამოიყოფა ტვინიდან3. სწორედ ამიტომ არის ძალიან მნიშვნელოვანი ტვინის ახალი სატრანსპორტო სისტემების იდენტიფიცირება, რომლებიც უზრუნველყოფენ თერაპიული პრეპარატების ეფექტურ და სპეციფიკურ მიწოდებას ცნს-ში4,5. თუმცა, BBB და BCSFB ასევე წარმოადგენენ წამლების მიწოდების შესანიშნავ შესაძლებლობას, რადგან ისინი აღწევენ და შედიან ტვინის ყველა სტრუქტურაში მისი ფართო სისხლძარღვოვანი ქსელის მეშვეობით. ამგვარად, ტვინში არაინვაზიური მეთოდების გამოყენების ამჟამინდელი ძალისხმევა ძირითადად ეფუძნება რეცეპტორებით განპირობებული ტრანსპორტის (PMT) მექანიზმს ენდოგენური BBB6 რეცეპტორის გამოყენებით. ტრანსფერინის რეცეპტორული გზის გამოყენებით ბოლო დროს მიღწეული მნიშვნელოვანი მიღწევების მიუხედავად7,8, საჭიროა გაუმჯობესებული თვისებების მქონე ახალი მიწოდების სისტემების შემდგომი განვითარება. ამ მიზნით, ჩვენი მიზანი იყო იმ პეპტიდების იდენტიფიცირება, რომლებსაც შეუძლიათ ცერებროვასკულური სითხის ტრანსპორტის შუამავლობა, რადგან ისინი პრინციპში შეიძლება გამოყენებულ იქნას მაკრომოლეკულების ცენტრალურ ნერვულ სისტემაში მიწოდებისთვის ან ახალი რეცეპტორული გზების გასახსნელად. კერძოდ, ცერებროვასკულური სისტემის სპეციფიკური რეცეპტორები და ტრანსპორტიორები (BBB და BSCFB) შეიძლება წარმოადგენდნენ ბიოთერაპიული პრეპარატების აქტიური და სპეციფიკური მიწოდების პოტენციურ სამიზნეებს. ცერებროსპინალური სითხე (CSF) არის ქოროიდული წნულის (CS) სეკრეტორული პროდუქტი და პირდაპირ კონტაქტშია ტვინის ინტერსტიციულ სითხესთან სუბარაქნოიდული და პარკუჭოვანი სივრცის მეშვეობით4. ცოტა ხნის წინ ნაჩვენები იქნა, რომ სუბარაქნოიდული ცერებროსპინალური სითხე ჭარბად დიფუზირდება ტვინის ინტერსტიციუმში9. ვიმედოვნებთ, რომ პარენქიმულ სივრცეში წვდომას ამ სუბარაქნოიდული შემომავალი ტრაქტის გამოყენებით ან პირდაპირ სისხლის-ტვინის ბარიერის მეშვეობით შევძლებთ. ამის მისაღწევად, ჩვენ დანერგეთ ძლიერი in vivo ფაგის შერჩევის სტრატეგია, რომელიც იდეალურად იდენტიფიცირებს ამ ორი განსხვავებული გზით ტრანსპორტირებულ პეპტიდებს.
ახლა ჩვენ აღვწერთ ფაგების ჩვენების თანმიმდევრულ in vivo სკრინინგის მეთოდს ცერებროსპინალური სითხის (CSF) სინჯის აღებით, მაღალი გამტარუნარიანობის სეკვენირებასთან (HTS) ერთად, ბიბლიოთეკის უმაღლესი მრავალფეროვნებით საწყისი შერჩევის რაუნდების მონიტორინგისთვის. სკრინინგი ჩატარდა გონზე მყოფ ვირთხებზე, რომლებსაც მუდმივად ჰქონდათ ჩადგმული დიდი ცისტერნა (CM) კანულა, რათა თავიდან აეცილებინათ სისხლის დაბინძურება. მნიშვნელოვანია, რომ ეს მიდგომა ირჩევს როგორც ტვინზე ორიენტირებულ, ასევე პეპტიდებს, რომლებსაც აქვთ ტრანსპორტირების აქტივობა ცერებროვასკულური ბარიერის გასწვრივ. ჩვენ გამოვიყენეთ T7 ფაგები მათი მცირე ზომის (~60 ნმ)10 გამო და ვივარაუდეთ, რომ ისინი შესაფერისია ვეზიკულების ტრანსპორტირებისთვის, რომლებიც საშუალებას იძლევიან ენდოთელურ და/ან ეპითელურ-მედულას ბარიერის ტრანსუჯრედულ გადაკვეთას. პანირების ოთხი რაუნდის შემდეგ, ფაგების პოპულაციები იზოლირებული იქნა in vivo CSF-ის ძლიერი გამდიდრებით და ცერებრალური მიკროსისხლძარღვების ასოციაციით. მნიშვნელოვანია, რომ ჩვენ შევძელით ჩვენი დასკვნების დადასტურება იმის დემონსტრირებით, რომ სასურველი და ქიმიურად სინთეზირებული საუკეთესო კანდიდატი პეპტიდები ახერხებენ ცილოვანი ტვირთის გადატანას ცერებროსპინალურ სითხეში. პირველ რიგში, ცენტრალური ნერვული სისტემის ფარმაკოდინამიკური ეფექტები დადგინდა წამყვანი ტრანზიტული პეპტიდის BACE1 პეპტიდის ინჰიბიტორთან შერწყმით. გარდა იმისა, რომ in vivo ფუნქციური სკრინინგის სტრატეგიებით შესაძლებელია ტვინის ახალი სატრანსპორტო პეპტიდების, როგორც ცილის ეფექტური ტვირთის მატარებლების, იდენტიფიცირება, ჩვენ ველით, რომ მსგავსი ფუნქციური შერჩევის მიდგომები ასევე მნიშვნელოვანი გახდება ტვინის ახალი სატრანსპორტო გზების იდენტიფიცირებისთვის.
ფაგის შეფუთვის საფეხურის შემდეგ, ფოლაქის წარმომქმნელი ერთეულების (PFU) საფუძველზე, შეიქმნა და შეიქმნა შემთხვევითი 12-მერიანი ხაზოვანი T7 ფაგის პეპტიდების ბიბლიოთეკა, რომელთა მრავალფეროვნება დაახლოებით 109 იყო (იხ. მასალები და მეთოდები). მნიშვნელოვანია აღინიშნოს, რომ ჩვენ ყურადღებით გავაანალიზეთ ეს ბიბლიოთეკა in vivo პანირებამდე. ფაგის ბიბლიოთეკის ნიმუშების PCR ამპლიფიკაციამ მოდიფიცირებული პრაიმერების გამოყენებით წარმოქმნა ამპლიკონები, რომლებიც პირდაპირ გამოიყენებოდა HTS-ზე (დამატებითი სურ. 1ა). ა) HTS11 სეკვენირების შეცდომების, ბ) პრაიმერების (NNK)1-12 ხარისხზე ზემოქმედების და გ) ველური ტიპის (wt) ფაგის (ჩონჩხის ჩანართების) არსებობის გამო სარეზერვო ბიბლიოთეკაში, დანერგილი იქნა თანმიმდევრობის ფილტრაციის პროცედურა მხოლოდ დადასტურებული თანმიმდევრობის ინფორმაციის ამოსაღებად (დამატებითი სურ. 1ბ). ეს ფილტრაციის საფეხურები ვრცელდება ყველა HTS სეკვენირების ბიბლიოთეკაზე. სტანდარტული ბიბლიოთეკისთვის მიღებული იქნა სულ 233,868 წაკითხვა, რომელთაგან 39%-მა დააკმაყოფილა ფილტრის კრიტერიუმები და გამოყენებული იქნა ბიბლიოთეკის ანალიზისა და შემდგომი რაუნდებისთვის შერჩევისთვის (დამატებითი სურ. 1გ–ე). წაკითხვები ძირითადად 3 ფუძე წყვილის სიგრძის ჯერადები იყო 36 ნუკლეოტიდზე პიკით (დამატებითი სურ. 1გ), რაც ადასტურებდა ბიბლიოთეკის დიზაინს (NNK) 1-12. აღსანიშნავია, რომ ბიბლიოთეკის წევრების დაახლოებით 11% შეიცავდა 12-განზომილებიან ველური ტიპის (wt) ჩონჩხის PAGISRELVDKL ჩანართს და თანმიმდევრობების თითქმის ნახევარი (49%) შეიცავდა ჩასერვებს ან წაშლებს. ბიბლიოთეკის ბიბლიოთეკის HTS-მა დაადასტურა ბიბლიოთეკაში პეპტიდების მაღალი მრავალფეროვნება: პეპტიდური თანმიმდევრობების 81%-ზე მეტი მხოლოდ ერთხელ იქნა ნაპოვნი და მხოლოდ 1.5% მოხდა ≥4 ასლში (დამატებითი სურ. 2ა). ამინომჟავების (aa) სიხშირეები რეპერტუარში ყველა 12 პოზიციაზე კარგად კორელირებდა დეგენერირებული NKK რეპერტუარის მიერ გენერირებული კოდონების რაოდენობისთვის მოსალოდნელ სიხშირეებთან (დამატებითი სურ. 2ბ). ამ ჩანართებით კოდირებული aa ნარჩენების დაკვირვებული სიხშირე კარგად კორელირებდა გამოთვლილ სიხშირესთან (r = 0.893) (დამატებითი სურ. 2გ). ფაგების ბიბლიოთეკების ინექციისთვის მომზადება მოიცავს ენდოტოქსინის ამპლიფიკაციისა და მოცილების ეტაპებს. ადრე დადასტურებულად იყო, რომ ეს პოტენციურად ამცირებს ფაგების ბიბლიოთეკების მრავალფეროვნებას12,13. ამიტომ, ჩვენ გამოვყავით ფირფიტაზე გამრავლებული ფაგების ბიბლიოთეკა, რომელსაც ენდოტოქსინის მოცილება ჩაუტარდა და შევადარეთ იგი ორიგინალურ ბიბლიოთეკას AA-ს სიხშირის შესაფასებლად. ძლიერი კორელაცია (r = 0.995) დაფიქსირდა ორიგინალურ პულსა და გამრავლებულ და გაწმენდილ პულს შორის (დამატებითი სურ. 2d), რაც მიუთითებს, რომ T7 ფაგის გამოყენებით ფირფიტებზე გამრავლებულ კლონებს შორის კონკურენცია არ იწვევდა მნიშვნელოვან მიკერძოებას. ეს შედარება ეფუძნება თითოეულ ბიბლიოთეკაში ტრიპეპტიდური მოტივების სიხშირეს, რადგან ბიბლიოთეკების მრავალფეროვნება (~109) სრულად ვერ დაფიქსირდება HTS-ითაც კი. თითოეულ პოზიციაზე aa-ს სიხშირის ანალიზმა გამოავლინა მცირე პოზიციაზე დამოკიდებული მიკერძოება შეყვანილი რეპერტუარის ბოლო სამ პოზიციაში (დამატებითი სურ. 2e). დასკვნის სახით, ჩვენ დავასკვენით, რომ ბიბლიოთეკის ხარისხი და მრავალფეროვნება მისაღები იყო და მრავალფეროვნებაში მხოლოდ მცირე ცვლილებები დაფიქსირდა შერჩევის რამდენიმე რაუნდს შორის ფაგების ბიბლიოთეკების ამპლიფიკაციისა და მომზადების გამო.
ცერებროსპინალური სითხის სერიული ნიმუშის აღება შესაძლებელია გონზე მყოფი ვირთხების CM-ში კანულის ქირურგიული იმპლანტაციით, რათა გაადვილდეს ინტრავენურად (iv) შეყვანილი T7 ფაგის იდენტიფიცირება სისხლის-ტვინის ბარიერის და/ან BCSFB-ის მეშვეობით (სურ. 1ა-ბ). in vivo შერჩევის პირველ სამ რაუნდში გამოვიყენეთ ორი დამოუკიდებელი შერჩევის მკლავი (მკლავები A და B) (სურ. 1გ). შერჩევის სიმკაცრე თანდათან გავზარდეთ შერჩევის პირველ სამ რაუნდში შეყვანილი ფაგის საერთო რაოდენობის შემცირებით. პანირების მეოთხე რაუნდისთვის, ჩვენ გავაერთიანეთ ნიმუშები A და B ტოტებიდან და ჩავატარეთ სამი დამატებითი დამოუკიდებელი შერჩევა. ამ მოდელში T7 ფაგის ნაწილაკების in vivo თვისებების შესასწავლად, ვირთხებში შეიყვანეს ველური ტიპის ფაგი (PAGISRELVDKL მთავარი ჩანართი). ფაგების ცერებროსპინალური სითხიდან და სისხლიდან სხვადასხვა დროს აღდგენამ აჩვენა, რომ შედარებით მცირე T7 იკოსაედრალურ ფაგებს ჰქონდათ სწრაფი საწყისი კლირენსის ფაზა სისხლის კომპარტმენტიდან (დამატებითი სურ. 3). შეყვანილი ტიტრებისა და ვირთხების სისხლის მოცულობის საფუძველზე, ჩვენ გამოვთვალეთ, რომ მხოლოდ დაახლოებით 1% წონაში. შეყვანილი დოზიდან ფაგი სისხლში ინტრავენური ინექციიდან 10 წუთის შემდეგ აღმოჩენილ იქნა. ამ საწყისი სწრაფი შემცირების შემდეგ, პირველადი კლირენსი უფრო ნელი იყო, ნახევარგამოყოფის პერიოდით 27.7 წუთი. მნიშვნელოვანია, რომ ცერებროსპინალური სითხის განყოფილებიდან მხოლოდ ძალიან ცოტა ფაგი იქნა ამოღებული, რაც მიუთითებს ველური ტიპის ფაგის ცერებროსპინალურ სითხეში მიგრაციის დაბალ ფონზე (დამატებითი სურ. 3). საშუალოდ, სისხლში T7 ფაგის მხოლოდ დაახლოებით 1 x 10-3% ტიტრი და თავდაპირველად შეყვანილი ფაგების 4 x 10-8% აღმოჩენილ იქნა ცერებროსპინალურ სითხეში მთელი ნიმუშის აღების პერიოდის განმავლობაში (0-250 წთ). აღსანიშნავია, რომ ველური ტიპის ფაგის ნახევარგამოყოფის პერიოდი (25.7 წთ) ცერებროსპინალურ სითხეში მსგავსი იყო სისხლში დაფიქსირებულისა. ეს მონაცემები აჩვენებს, რომ CM-კანულირებული ვირთხების ცერებროსპინალური სითხის განყოფილების სისხლისგან გამყოფი ბარიერი უცვლელია, რაც საშუალებას იძლევა ფაგების ბიბლიოთეკების in vivo შერჩევისა, რათა იდენტიფიცირდეს კლონები, რომლებიც ადვილად გადადიან სისხლიდან ცერებროსპინალურ სითხეში.
(ა) დიდი აუზიდან ცერებროსპინალური სითხის (CSF) ხელახალი აღების მეთოდის შემუშავება. (ბ) დიაგრამა, რომელიც აჩვენებს ცენტრალური ნერვული სისტემის (CNS) ბარიერის უჯრედულ მდებარეობას და შერჩევის სტრატეგიას, რომელიც გამოიყენება ჰემატოენცეფალურ ბარიერსა (BBB) ​​და ჰემატოენცეფალურ ბარიერში გადამკვეთი პეპტიდების იდენტიფიცირებისთვის. (გ) ფაგის ჩვენების ინ ვივო სკრინინგის დიაგრამა. შერჩევის თითოეულ რაუნდში ფაგები (ცხოველის იდენტიფიკატორები ისრების შიგნით) შეჰყავდათ ინტრავენურად. ორი დამოუკიდებელი ალტერნატიული ტოტი (A, B) ცალკე ინახება შერჩევის მე-4 რაუნდამდე. შერჩევის მე-3 და მე-4 რაუნდებისთვის, ცერებროსპინალური სითხისგან ამოღებული თითოეული ფაგის კლონი ხელით იქნა სეკვენირებული. (დ) სისხლიდან (წითელი წრეები) და ცერებროსპინალური სითხიდან (მწვანე სამკუთხედები) იზოლირებული ფაგის კინეტიკა შერჩევის პირველი რაუნდის დროს ორ კანულირებულ ვირთხში T7 პეპტიდური ბიბლიოთეკის ინტრავენური ინექციის შემდეგ (2 x 1012 ფაგი/ცხოველი). ლურჯი კვადრატები მიუთითებს ფაგის საშუალო საწყის კონცენტრაციაზე სისხლში, რომელიც გამოითვლება შეყვანილი ფაგის რაოდენობიდან, სისხლის საერთო მოცულობის გათვალისწინებით. შავი კვადრატები მიუთითებს სისხლის ფაგის კონცენტრაციებიდან ექსტრაპოლირებული y ხაზის გადაკვეთის წერტილს. (e,f) წარმოადგინეთ პეპტიდში ნაპოვნი ყველა შესაძლო გადაფარვის ტრიპეპტიდური მოტივის ფარდობითი სიხშირე და განაწილება. ნაჩვენებია 1000 წაკითხვაში ნაპოვნი მოტივების რაოდენობა. მნიშვნელოვნად (p < 0.001) გამდიდრებული მოტივები აღნიშნულია წითელი წერტილებით. (e) კორელაციის გაფანტვის დიაგრამა, რომელიც ადარებს ინექციური ბიბლიოთეკის ტრიპეპტიდური მოტივის ფარდობით სიხშირეს #1.1 და #1.2 ცხოველებიდან სისხლიდან მიღებულ ფაგთან. (f) კორელაციის გაფანტვის დიაგრამა, რომელიც ადარებს სისხლსა და ცერებროსპინალურ სითხეში იზოლირებული ცხოველური ფაგის ტრიპეპტიდური მოტივების #1.1 და #1.2 ფარდობით სიხშირეებს. (g, h) სისხლით გამდიდრებული ფაგის თანმიმდევრობის ID წარმოდგენა ინექციურ ბიბლიოთეკებთან და ცერებროსპინალურ სითხეში გამდიდრებულ ფაგთან (h) სისხლთან შედარებით ორივე ცხოველში in vivo შერჩევის რაუნდის შემდეგ. ერთასოიანი კოდის ზომა მიუთითებს, თუ რამდენად ხშირად გვხვდება ეს ამინომჟავა ამ პოზიციაზე. მწვანე = პოლარული, იისფერი = ნეიტრალური, ლურჯი = ფუძე, წითელი = მჟავე და შავი = ​​ჰიდროფობიური ამინომჟავები. სურათი 1ა, ბ შექმნილი და წარმოებულია ედუარდ ურიხის მიერ.
ჩვენ ფაგის პეპტიდური ბიბლიოთეკა შევიყვანეთ ორ CM ინსტრუმენტულ ვირთხაში (კლედები A და B) და ფაგი გამოვყავით ცერებროსპინალური სითხიდან და სისხლიდან (სურათი 1d). ბიბლიოთეკის საწყისი სწრაფი კლირენსი ნაკლებად გამოხატული იყო ველური ტიპის ფაგთან შედარებით. ინექციური ბიბლიოთეკის საშუალო ნახევარგამოყოფის პერიოდი ორივე ცხოველში იყო 24.8 წუთი სისხლში, ველური ტიპის ფაგის მსგავსად, და 38.5 წუთი ცერებროსპინალურ სითხეში. თითოეული ცხოველის სისხლის და ცერებროსპინალური სითხის ფაგის ნიმუშები დაექვემდებარა ჰიდროქლორიდის თერაპიას (HTS) და ყველა იდენტიფიცირებული პეპტიდი გაანალიზდა მოკლე ტრიპეპტიდური მოტივის არსებობაზე. ტრიპეპტიდური მოტივები შეირჩა, რადგან ისინი უზრუნველყოფენ მინიმალურ საფუძველს სტრუქტურის ფორმირებისა და პეპტიდ-ცილის ურთიერთქმედებისთვის14,15. ჩვენ აღმოვაჩინეთ კარგი კორელაცია მოტივების განაწილებაში ინექციურ ფაგის ბიბლიოთეკასა და ორივე ცხოველის სისხლიდან ამოღებულ კლონებს შორის (სურ. 1e). მონაცემები მიუთითებს, რომ ბიბლიოთეკის შემადგენლობა მხოლოდ უმნიშვნელოდ არის გამდიდრებული სისხლის განყოფილებაში. ამინომჟავების სიხშირეები და კონსენსუსის თანმიმდევრობები დამატებით გაანალიზდა თითოეულ პოზიციაზე Weblogo16 პროგრამული უზრუნველყოფის ადაპტაციის გამოყენებით. საინტერესოა, რომ სისხლში გლიცინის ნარჩენების ძლიერი გამდიდრება აღმოვაჩინეთ (სურ. 1გ). როდესაც სისხლი შევადარეთ ცერებროსპინალური სითხისგან შერჩეულ კლონებს, დაფიქსირდა მოტივების ძლიერი შერჩევა და გარკვეული დესელექცია (სურ. 1ვ) და გარკვეული ამინომჟავები უპირატესად იყო წარმოდგენილი 12-წევრიანში წინასწარ განსაზღვრულ პოზიციებზე (სურ. 1ჰ). აღსანიშნავია, რომ ცალკეული ცხოველები მნიშვნელოვნად განსხვავდებოდნენ ცერებროსპინალური სითხის მიხედვით, მაშინ როდესაც სისხლში გლიცინით გამდიდრება დაფიქსირდა ორივე ცხოველში (დამატებითი სურ. 4ა-ჯ). #1.1 და #1.2 ცხოველების ცერებროსპინალურ სითხეში თანმიმდევრობის მონაცემების მკაცრი ფილტრაციის შემდეგ, სულ მიღებული იქნა 964 და 420 უნიკალური 12-მერიანი პეპტიდი (დამატებითი სურ. 1დ-ე). იზოლირებული ფაგის კლონები გამრავლდა და დაექვემდებარა in vivo შერჩევის მეორე რაუნდს. შერჩევის მეორე რაუნდიდან ამოღებული ფაგი დაექვემდებარა HTS-ს თითოეულ ცხოველში და ყველა იდენტიფიცირებული პეპტიდი გამოყენებული იქნა მოტივის ამოცნობის პროგრამის შეყვანის სახით ტრიპეპტიდური მოტივების არსებობის გასაანალიზებლად (სურ. 2ა, ბ, ეფ). ცერებროსპინალური სითხისგან აღდგენილი ფაგის პირველ ციკლთან შედარებით, ჩვენ დავაკვირდით ცერებროსპინალურ სითხეში A და B ტოტებში მრავალი მოტივის შემდგომ შერჩევას და დესელექციას (სურ. 2). ქსელის იდენტიფიკაციის ალგორითმი გამოყენებული იქნა იმის დასადგენად, წარმოადგენდნენ თუ არა ისინი თანმიმდევრული თანმიმდევრობის სხვადასხვა ნიმუშებს. აშკარა მსგავსება დაფიქსირდა ალტერნატიულ A კლადში (სურ. 2გ, დ) და B კლადში (სურ. 2გ, თ) ცერებროსპინალური სითხის მიერ აღდგენილ 12-განზომილებიან თანმიმდევრობებს შორის. თითოეულ ტოტში ჩატარებულმა გაერთიანებულმა ანალიზმა გამოავლინა 12-მერული პეპტიდების განსხვავებული შერჩევის პროფილები (დამატებითი სურ. 5გ, დ) და ცერებროსპინალური სითხის/სისხლის ტიტრის თანაფარდობის დროთა განმავლობაში ზრდა გაერთიანებულ კლონებში შერჩევის მეორე რაუნდის შემდეგ შერჩევის პირველ რაუნდთან შედარებით (დამატებითი სურ. 5ე).
ცერებროსპინალურ სითხეში მოტივებისა და პეპტიდების გამდიდრება in vivo ფუნქციური ფაგის ჩვენების შერჩევის ორი თანმიმდევრული რაუნდით.
თითოეული ცხოველის (ცხოველები #1.1 და #1.2) პირველი რაუნდიდან აღებული ყველა ცერებროსპინალური სითხის ფაგი გაერთიანდა, გამრავლდა, HT-სეკვენცირებული იქნა და ხელახლა შეიყვანეს ერთად (2 x 1010 ფაგი/ცხოველი) 2 SM კანულირებული ვირთხა (#1.1 → #). 2.1 და 2.2, 1.2 → 2.3 და 2.4). (a,b,e,f) კორელაციის გაფანტვის დიაგრამები, რომლებიც ადარებენ ცერებროსპინალური სითხისგან მიღებული ყველა ფაგის ტრიპეპტიდური მოტივების ფარდობით სიხშირეს პირველ და მეორე შერჩევის რაუნდებში. ნაჩვენებია მოტივების ფარდობითი სიხშირე და განაწილება, რომლებიც წარმოადგენენ პეპტიდებში ორივე ორიენტაციაში ნაპოვნი ყველა შესაძლო გადაფარვის ტრიპეპტიდს. ნაჩვენებია 1000 წაკითხვაში ნაპოვნი მოტივების რაოდენობა. მოტივები, რომლებიც მნიშვნელოვნად (p < 0.001) შეირჩა ან გამოირიცხა შედარებული ბიბლიოთეკებიდან ერთ-ერთში, მონიშნულია წითელი წერტილებით. (c, d, g, h) ყველა ცერებროსპინალური სითხის მდიდარი 12 ამინომჟავის გრძელი თანმიმდევრობის თანმიმდევრობის ლოგოს წარმოდგენა in vivo შერჩევის მე-2 და 1 რაუნდების მიხედვით. ერთასოიანი კოდის ზომა მიუთითებს, თუ რამდენად ხშირად გვხვდება ეს ამინომჟავა ამ პოზიციაზე. ლოგოს წარმოსადგენად, შედარებულია ცალკეული ცხოველებიდან ორ შერჩევის რაუნდს შორის ამოღებული ცერებროსპინალური სითხის თანმიმდევრობების სიხშირე და ნაჩვენებია მეორე რაუნდში გამდიდრებული თანმიმდევრობები: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 და (h) #1.2–#2.4. ყველაზე გამდიდრებული ამინომჟავები მოცემულ პოზიციაზე (c, d) ცხოველებში #2.1 და #2.2 ან ცხოველებში #2.3 და #2.4 (g, h) ნაჩვენებია ფერად. მწვანე = პოლარული, იისფერი = ნეიტრალური, ლურჯი = ფუძე, წითელი = მჟავე და შავი = ​​ჰიდროფობიური ამინომჟავები.
შერჩევის მესამე რაუნდის შემდეგ, ორი ცხოველისგან იზოლირებული ცერებროსპინალურ სითხეში აღდგენილი ფაგის 332 კლონიდან (დამატებითი სურ. 6ა) ჩვენ გამოვავლინეთ 124 უნიკალური პეპტიდური თანმიმდევრობა (#3.1 და #3.2). ყველაზე მაღალი ფარდობითი პროპორცია ჰქონდა LGSVS თანმიმდევრობას (18.7%), შემდეგ მოდიოდა ველური ტიპის ჩანართები PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) და SARGSWREIVSLS (2.2%). ბოლო, მეოთხე რაუნდში, ჩვენ გავაერთიანეთ სამი ცალკეული ცხოველის ორი დამოუკიდებლად შერჩეული ტოტი (სურ. 1გ). ცერებროსპინალური სითხედან აღებული 925 სეკვენირებული ფაგის კლონიდან, მეოთხე რაუნდში აღმოვაჩინეთ 64 უნიკალური პეპტიდური თანმიმდევრობა (დამატებითი სურ. 6ბ), რომელთა შორის ველური ტიპის ფაგის ფარდობითი პროპორცია 0.8%-მდე შემცირდა. მეოთხე რაუნდში ყველაზე გავრცელებული ცერებროსპინალური სითხის კლონები იყო LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) და RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). შერჩეული პეპტიდების სიგრძის დიაპაზონი განპირობებულია ნუკლეოტიდების ჩასმით/დელეციით ან ბიბლიოთეკის პრაიმერებში ნაადრევი სტოპ კოდონებით, როდესაც NNK ბიბლიოთეკის დიზაინისთვის გამოიყენება დეგენერირებული კოდონები. ნაადრევი სტოპ კოდონები წარმოქმნიან უფრო მოკლე პეპტიდებს და შეირჩევიან, რადგან ისინი შეიცავენ ხელსაყრელ aa მოტივს. უფრო გრძელი პეპტიდები შეიძლება წარმოიშვას სინთეზური ბიბლიოთეკების პრაიმერებში ჩასმით/დელეციით. ეს ათავსებს შექმნილ სტოპ კოდონს ჩარჩოს გარეთ და კითხულობს მას მანამ, სანამ ახალი სტოპ კოდონი არ გამოჩნდება ქვემოთ. ზოგადად, ჩვენ გამოვთვალეთ გამდიდრების ფაქტორები ოთხივე შერჩევის რაუნდისთვის შეყვანის მონაცემების ნიმუშის გამომავალ მონაცემებთან შედარებით. სკრინინგის პირველი რაუნდისთვის, არასპეციფიკური ფონური საცნობარო ნიშნულის სახით, ჩვენ გამოვიყენეთ ველური ტიპის ფაგების ტიტრები. საინტერესოა, რომ ფაგების ნეგატიური სელექცია ძალიან ძლიერი იყო ცერებროსპინალური სითხის პირველ ციკლში, მაგრამ არა სისხლში (სურ. 3ა), რაც შეიძლება განპირობებული იყოს პეპტიდური ბიბლიოთეკის წევრების უმეტესობის ცერებროსპინალური სითხის კომპარტმენტში პასიური დიფუზიის დაბალი ალბათობით ან შედარებითი ფაგები, როგორც წესი, უფრო ეფექტურად ინარჩუნებენ ან აშორებენ სისხლის მიმოქცევიდან, ვიდრე ბაქტერიოფაგები. თუმცა, პანირების მეორე რაუნდში, ცერებროსპინალურ სითხეში ფაგების ძლიერი სელექცია დაფიქსირდა ორივე კლადში, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ წინა რაუნდი გამდიდრებული იყო ფაგებით, რომლებიც აჩვენებდნენ პეპტიდებს, რომლებიც ხელს უწყობენ ცერებროსპინალური სითხის შეწოვას (სურ. 3ა). კვლავ, სისხლის მნიშვნელოვანი გამდიდრების გარეშე. ასევე, მესამე და მეოთხე რაუნდებში, ფაგის კლონები მნიშვნელოვნად გამდიდრებული იყო ცერებროსპინალური სითხის შემცველობით. შერჩევის ბოლო ორ რაუნდს შორის თითოეული უნიკალური პეპტიდური თანმიმდევრობის ფარდობითი სიხშირის შედარებისას, აღმოვაჩინეთ, რომ თანმიმდევრობები კიდევ უფრო გამდიდრებული იყო შერჩევის მეოთხე რაუნდში (სურ. 3ბ). 64-ვე უნიკალური პეპტიდური თანმიმდევრობიდან გამოიყო 931 ტრიპეპტიდური მოტივი ორივე პეპტიდური ორიენტაციის გამოყენებით. მეოთხე რაუნდში ყველაზე გამდიდრებული მოტივები უფრო დეტალურად იქნა შესწავლილი მათი გამდიდრების პროფილების თვალსაზრისით ყველა რაუნდში, ინექციურ ბიბლიოთეკასთან შედარებით (ზღვრული მაჩვენებელი: 10%-იანი გამდიდრება) (დამატებითი სურ. 6გ). შერჩევის ზოგადი ნიმუშები აჩვენებს, რომ შესწავლილი მოტივების უმეტესობა გამდიდრებული იყო ორივე შერჩევის შტოს ყველა წინა რაუნდში. თუმცა, ზოგიერთი მოტივი (მაგ. SGL, VSG, LGS GSV) უპირატესად ალტერნატიული A კლადიდან იყო, ზოგი კი (მაგ. FGW, RTN, WGF, NTR) გამდიდრებული იყო B ალტერნატიულ კლადში.
სტრეპტავიდინის სასარგებლო დატვირთვასთან კონიუგირებული ცერებროსპინალური სითხის ტრანსპორტის ვალიდაცია, რომელიც გამდიდრებულია ფაგებით დისპლეირებული პეპტიდებით და ბიოტინილირებული ლიდერი პეპტიდებით.
(ა) გამდიდრების კოეფიციენტები, გამოთვლილი ოთხივე რაუნდში (R1-R4), ინექციური (შეყვანა = I) ფაგის (PFU) ტიტრების და განსაზღვრული ცერებროსპინალური სითხის ფაგის ტიტრების (გამომავალი = O) საფუძველზე. ბოლო სამი რაუნდის (R2-R4) გამდიდრების ფაქტორები გამოითვალა წინა რაუნდთან და პირველ რაუნდთან (R1) შედარებით წონის მონაცემებით. ღია სვეტები წარმოადგენს ცერებროსპინალურ სითხეს, დაჩრდილული სვეტები - პლაზმას. (***p<0.001, სტუდენტის t-ტესტის საფუძველზე). (ბ) ყველაზე გავრცელებული ფაგის პეპტიდების სია, დალაგებული მათი ფარდობითი პროპორციის მიხედვით შერჩევის მე-4 რაუნდის შემდეგ ცერებროსპინალურ სითხეში შეგროვებულ ყველა ფაგთან. ექვსი ყველაზე გავრცელებული ფაგის კლონი გამოყოფილია ფერით, დანომრილია და მათი გამდიდრების კოეფიციენტები შერჩევის მე-3 და მე-4 რაუნდებს შორის (ჩანართი). (გ,დ) მე-4 რაუნდიდან ექვსი ყველაზე გამდიდრებული ფაგის კლონი, ცარიელი ფაგი და მშობელი ფაგის პეპტიდური ბიბლიოთეკები ინდივიდუალურად გაანალიზდა ცერებროსპინალური სითხის შერჩევის მოდელში. ცერებროსპინალური სითხის და სისხლის ნიმუშები შეგროვდა მითითებულ დროის წერტილებში. (გ) 6 კანდიდატი ფაგის კლონის (2 x 1010 ფაგი/ცხოველი), ცარიელი ფაგების (#1779) (2 x 1010 ფაგი/ცხოველი) და ფაგის პეპტიდების საწყობის ბიბლიოთეკების (2 x 1012 ფაგი/ცხოველი) თანაბარი რაოდენობა. კანულირებულ ცხოველს კუდის ვენის მეშვეობით ცალ-ცალკე შეჰყავთ მინიმუმ 3 CM. ნაჩვენებია თითოეული ინექცირებული ფაგის კლონის და ფაგის პეპტიდების ბიბლიოთეკის ცერებროსპინალური სითხის ფარმაკოკინეტიკა დროთა განმავლობაში. (დ) აჩვენებს ყველა აღდგენილი ფაგის/მლ-ის ცერებროსპინალური სითხის/სისხლის საშუალო თანაფარდობას ნიმუშების აღების დროის განმავლობაში. (ე) ოთხი სინთეზური ლიდერი პეპტიდი და ერთი შერეული კონტროლი ბიოტინთან დაკავშირებული იყო სტრეპტავიდინთან მათი N-ტერმინუსის მეშვეობით (ტეტრამერული ჩვენება), რასაც მოჰყვა ინექცია (კუდის ვენაში ინტრავენურად, 10 მგ სტრეპტავიდინი/კგ). მინიმუმ სამი ინტუბირებული ვირთხა (N = 3). ცერებროსპინალური სითხის ნიმუშები შეგროვდა მითითებულ დროის წერტილებში და სტრეპტავიდინის კონცენტრაციები გაიზომა ცერებროსპინალურ სითხეში სტრეპტავიდინის საწინააღმდეგო ELISA მეთოდით (nd = არ არის აღმოჩენილი). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA ტესტის საფუძველზე). (ვ) ყველაზე გამდიდრებული ფაგის პეპტიდის კლონის #2002 (იისფერი) ამინომჟავების თანმიმდევრობის შედარება შერჩევის მე-4 რაუნდიდან სხვა შერჩეულ ფაგის პეპტიდის კლონებთან. იდენტური და მსგავსი ამინომჟავების ფრაგმენტები ფერადი კოდირებითაა მონიშნული.
მეოთხე რაუნდში (სურ. 3ბ) გამდიდრებული ფაგებიდან ექვსი კანდიდატი კლონი შეირჩა ცერებროსპინალური სითხის შერჩევის მოდელში შემდგომი ინდივიდუალური ანალიზისთვის. ექვსი კანდიდატი ფაგის, ცარიელი ფაგის (ჩანართი არ არის) და პროფაგის პეპტიდური ბიბლიოთეკის თანაბარი რაოდენობა შეიყვანეს სამ კანულირებულ CM ცხოველში და ფარმაკოკინეტიკა განისაზღვრა ცერებროსპინალური სითხის (სურ. 3გ) და სისხლის (დამატებითი სურ. 7) ანალიზებში. ყველა გამოცდილი ფაგის კლონმა ცერებროსპინალური სითხის კომპარტმენტი 10-1000-ჯერ უფრო მაღალ დონეზე მიიპყრო, ვიდრე ცარიელი საკონტროლო ფაგის (#1779). მაგალითად, კლონებს #2020 და #2077 ჰქონდათ დაახლოებით 1000-ჯერ მაღალი ცერებროსპინალური სითხის ტიტრები, ვიდრე საკონტროლო ფაგს. თითოეული შერჩეული პეპტიდის ფარმაკოკინეტიკური პროფილი განსხვავებულია, მაგრამ ყველა მათგანს აქვს მაღალი ცერებროსპინალურ სითხეში ჰომინგაციის უნარი. #1903 და #2011 კლონებისთვის დროთა განმავლობაში მუდმივი კლება დავაკვირდით, ხოლო #2077, #2002 და #2009 კლონებისთვის პირველი 10 წუთის განმავლობაში ზრდა შესაძლოა აქტიურ ტრანსპორტზე მიუთითებდეს, თუმცა დადასტურებას საჭიროებს. #2020, #2002 და #2077 კლონები მაღალ დონეზე სტაბილიზდა, ხოლო #2009 კლონის ცერებროსპინალურ სითხეში კონცენტრაცია საწყისი ზრდის შემდეგ თანდათან შემცირდა. შემდეგ შევადარეთ თითოეული ცერებროსპინალური სითხის კანდიდატის ფარდობითი სიხშირე მის სისხლში კონცენტრაციას (სურ. 3დ). ცერებროსპინალური სითხის თითოეული კანდიდატის საშუალო ტიტრის კორელაციამ მის სისხლის ტიტრთან ყველა შერჩევის დროს აჩვენა, რომ ექვსიდან სამი კანდიდატი მნიშვნელოვნად გამდიდრებული იყო სისხლის ცერებროსპინალური სითხეთი. საინტერესოა, რომ #2077 კლონმა აჩვენა სისხლის უფრო მაღალი სტაბილურობა (დამატებითი სურათი 7). იმის დასადასტურებლად, რომ თავად პეპტიდებს შეუძლიათ ფაგის ნაწილაკების გარდა სხვა ტვირთის აქტიურად გადატანა ცერებროსპინალური სითხის განყოფილებაში, ჩვენ სინთეზირდა ბიოტინით წარმოებული ოთხი ლიდერი პეპტიდი N-ბოლოში, სადაც პეპტიდები უერთდება ფაგის ნაწილაკს. ბიოტინილირებული პეპტიდები (№№ 2002, 2009, 2020 და 2077) კონიუგირებული იყო სტრეპტავიდინთან (SA), რათა მიგვეღო მულტიმერული ფორმები, რომლებიც გარკვეულწილად მიბაძავდა ფაგის გეომეტრიას. ამ ფორმატმა ასევე საშუალება მოგვცა გაგვეზომა SA-ს ექსპოზიცია სისხლსა და ცერებროსპინალურ სითხეში, როგორც ტვირთის გადამტანი ცილოვანი პეპტიდები. მნიშვნელოვანია, რომ ფაგის მონაცემების რეპროდუცირება ხშირად შესაძლებელი იყო, როდესაც სინთეზური პეპტიდები შეჰყავდათ ამ SA-კონიუგირებულ ფორმატში (სურ. 3e). არეულ პეპტიდებს ჰქონდათ ნაკლები საწყისი ექსპოზიცია და უფრო სწრაფი ცერებროსპინალური სითხის კლირენსი, რომლის დონეები 48 საათის განმავლობაში არ იყო გამოვლენილი. ამ პეპტიდური ფაგის კლონების ცერებროსპინალურ სითხეში მიწოდების გზების გასაგებად, ჩვენ გავაანალიზეთ ინდივიდუალური ფაგის პეპტიდური ჰიტების ლოკალიზაცია იმუნოჰისტოქიმიის (IHC) გამოყენებით, რათა პირდაპირ აღმოგვეჩინა ფაგის ნაწილაკები ინ ვივო ინტრავენური ინექციიდან 1 საათის შემდეგ. აღსანიშნავია, რომ კლონები #2002, #2077 და #2009 გამოვლინდა ტვინის კაპილარებში ძლიერი შეღებვით, ხოლო საკონტროლო ფაგი (#1779) და კლონი #2020 არ იქნა აღმოჩენილი (დამატებითი სურათი 8). ეს იმაზე მიუთითებს, რომ ეს პეპტიდები ტვინზე ზემოქმედებას სწორედ სისხლის-ტვინის ბარიერის გადაკვეთით ახდენენ. ამ ჰიპოთეზის შესამოწმებლად საჭიროა შემდგომი დეტალური ანალიზი, რადგან შესაძლოა BSCFB გზაც იყოს ჩართული. ყველაზე გამდიდრებული კლონის (#2002) ამინომჟავების თანმიმდევრობის სხვა შერჩეულ პეპტიდებთან შედარებისას აღინიშნა, რომ ზოგიერთ მათგანს მსგავსი ამინომჟავების გაფართოებები აქვს, რაც შეიძლება მსგავს ტრანსპორტირების მექანიზმზე მიუთითებდეს (სურ. 3ვ).
უნიკალური პლაზმური პროფილისა და დროთა განმავლობაში ცერებროსპინალური სითხის მნიშვნელოვანი ზრდის გამო, ფაგის ჩვენების კლონი #2077 შემდგომში შესწავლილ იქნა უფრო ხანგრძლივი 48-საათიანი პერიოდის განმავლობაში და შეძლო ცერებროსპინალური სითხის სწრაფი ზრდის რეპროდუცირება, რომელიც დაფიქსირდა SA-ს შენარჩუნებულ დონეებთან ერთად (სურ. 4ა). სხვა იდენტიფიცირებულ ფაგის კლონებთან დაკავშირებით, #2077 ძლიერად იღებებოდა ტვინის კაპილარებზე და ავლენდა მნიშვნელოვან კოლოკალიზაციას კაპილარული მარკერის ლექტინთან მაღალი გარჩევადობით და შესაძლოა გარკვეული შეღებვა პარენქიმულ სივრცეში (სურათი 4ბ). იმის გამოსაკვლევად, შეიძლებოდა თუ არა პეპტიდით განპირობებული ფარმაკოლოგიური ეფექტების მიღება ცენტრალურ ნერვულ სისტემაში, ჩვენ ჩავატარეთ ექსპერიმენტი, რომელშიც i) #2077 ტრანზიტული პეპტიდის და ii) BACE1 ინჰიბიტორის პეპტიდის ბიოტინილირებული ვერსიები შეერია SA-ს ორი განსხვავებული თანაფარდობით. ერთი კომბინაციისთვის გამოვიყენეთ მხოლოდ BACE1 პეპტიდის ინჰიბიტორი, ხოლო მეორესთვის გამოვიყენეთ BACE1 პეპტიდის ინჰიბიტორის 1:3 თანაფარდობა #2077 პეპტიდთან. ორივე ნიმუში შეყვანილი იქნა ინტრავენურად და ბეტა-ამილოიდური პეპტიდის 40 (Abeta40) დონე სისხლში და ცერებროსპინალურ სითხეში დროთა განმავლობაში გაიზომა. Abeta40 გაიზომა ცერებროსპინალურ სითხეში, რადგან ის ასახავს BACE1-ის ინჰიბირებას ტვინის პარენქიმაში. როგორც მოსალოდნელი იყო, ორივე კომპლექსმა მნიშვნელოვნად შეამცირა Abeta40-ის დონე სისხლში (სურ. 4გ, დ). თუმცა, მხოლოდ იმ ნიმუშებმა, რომლებიც შეიცავდნენ პეპტიდ №2077-ის და SA-სთან კონიუგირებული BACE1 პეპტიდის ინჰიბიტორის ნარევს, გამოიწვია Abeta40-ის მნიშვნელოვანი შემცირება ცერებროსპინალურ სითხეში (სურ. 4გ). მონაცემები აჩვენებს, რომ პეპტიდ №2077-ს შეუძლია 60 kDa SA ცილის ცენტრალურ ნერვულ სისტემაში ტრანსპორტირება და ასევე იწვევს ფარმაკოლოგიურ ეფექტებს BACE1 პეპტიდის SA-კონიუგირებული ინჰიბიტორებით.
(ა) T7 ფაგის კლონური ინექცია (2 × 10 ფაგი/ცხოველი), რომელიც აჩვენებს ცერებროსპინალური სითხის პეპტიდის #2077 (RLSSVDSDLSGC) და არაინექცირებული საკონტროლო ფაგის (#1779) გრძელვადიან ფარმაკოკინეტიკურ პროფილებს მინიმუმ სამ CM-ინტუბაციურ ვირთხში. (ბ) ფაგით ინექცირებული ვირთხების (2 × 10 ფაგი/ცხოველი) კორტიკალური მიკროსისხლძარღვების წარმომადგენლობითი კონფოკალური მიკროსკოპული გამოსახულება, რომელიც აჩვენებს პეპტიდი #2077-ის და სისხლძარღვების (ლექტინის) კონტრშეღებვას. ეს ფაგის კლონები მიეცა 3 ვირთხას და პერფუზიამდე 1 საათის განმავლობაში ცირკულირება მოახდინეს. ტვინი გაიჭრა და შეიღება T7 ფაგის კაფსიდის საწინააღმდეგო პოლიკლონური FITC-მონიშნული ანტისხეულებით. პერფუზიამდე და შემდგომ ფიქსაციამდე ათი წუთით ადრე, DyLight594-მონიშნული ლექტინი შეიყვანეს ინტრავენურად. ფლუორესცენტული გამოსახულებები აჩვენებს მიკროსისხლძარღვების სანათურის მხარის ლექტინით შეღებვას (წითელი) და ფაგებს (მწვანე) კაპილარების და პერივასკულარული ტვინის ქსოვილის სანათურში. შკალის ზოლი შეესაბამება 10 µm-ს. (გ, დ) ბიოტინილირებული BACE1 ინჰიბიტორული პეპტიდი ცალკე ან ბიოტინილირებულ ტრანზიტულ პეპტიდ #2077-თან კომბინაციაში შეწყვილებული იყო სტრეპტავიდინთან, რასაც მოჰყვა მინიმუმ სამი კანულირებული CM ვირთხის ინჰიბიტორული ინექცია (10 მგ სტრეპტავიდინი/კგ). BACE1 პეპტიდის ინჰიბიტორით განპირობებული Aβ40-ის შემცირება გაიზომა Aβ1-40 ELISA-ს მეთოდით სისხლში (წითელი) და ცერებროსპინალურ სითხეში (ნარინჯისფერი) მითითებულ დროის წერტილებში. უკეთესი სიცხადისთვის, გრაფიკზე დახატულია წერტილოვანი ხაზი 100%-იანი მასშტაბით. (გ) Aβ40-ის პროცენტული შემცირება სისხლში (წითელი სამკუთხედები) და ცერებროსპინალურ სითხეში (ნარინჯისფერი სამკუთხედები) ვირთხებში, რომლებიც მკურნალობდნენ სტრეპტავიდინით, რომელიც კონიუგირებულია ტრანზიტულ პეპტიდ #2077-თან და BACE1 ინჰიბიტორულ პეპტიდთან 3:1 თანაფარდობით. (დ) მხოლოდ BACE1 ინჰიბიტორულ პეპტიდთან შერწყმული სტრეპტავიდინით ნამკურნალებ ვირთხებში სისხლში Aβ40-ის (წითელი წრეები) და ცერებროსპინალური სითხის (ნარინჯისფერი წრეები) პროცენტული შემცირება. საკონტროლო ჯგუფში Aβ კონცენტრაცია იყო 420 პგ/მლ (სტანდარტული გადახრა = 101 პგ/მლ).
ფაგის ჩვენება წარმატებით გამოიყენება ბიოსამედიცინო კვლევის რამდენიმე სფეროში17. ეს მეთოდი გამოყენებულია in vivo სისხლძარღვთა მრავალფეროვნების კვლევებისთვის18,19, ასევე თავის ტვინის სისხლძარღვებზე ორიენტირებულ კვლევებში20,21,22,23,24,25,26. ამ კვლევაში ჩვენ გავაფართოვეთ ამ შერჩევის მეთოდის გამოყენება არა მხოლოდ თავის ტვინის სისხლძარღვებზე ორიენტირებულ პეპტიდების პირდაპირ იდენტიფიცირებაზე, არამედ ჰემატოენცეფალურ ბარიერში გადასასვლელი აქტიური ტრანსპორტის თვისებების მქონე კანდიდატების აღმოჩენაზე. ახლა ჩვენ აღვწერთ in vivo შერჩევის პროცედურის შემუშავებას CM ინტუბირებულ ვირთხებში და ვაჩვენებთ მის პოტენციალს, იდენტიფიციროს პეპტიდები ცერებროსპინალურ სითხეში ჰომინგაციის თვისებებით. 12-მერიანი შემთხვევითი პეპტიდების ბიბლიოთეკის ჩვენებით T7 ფაგის გამოყენებით, ჩვენ შევძელით გვეჩვენებინა, რომ T7 ფაგი საკმარისად პატარაა (დაახლოებით 60 ნმ დიამეტრით)10, რათა ადაპტირდეს ჰემატოენცეფალურ ბარიერთან, რითაც პირდაპირ გადაკვეთს ჰემატოენცეფალურ ბარიერს ან ქოროიდულ წნულს. ჩვენ დავაკვირდით, რომ კანულირებული CM ვირთხებიდან ცერებროსპინალური სითხის შეგროვება იყო კარგად კონტროლირებადი in vivo ფუნქციური სკრინინგის მეთოდი და რომ ექსტრაგირებული ფაგი არა მხოლოდ უკავშირდება სისხლძარღვებს, არამედ ფუნქციონირებს როგორც ტრანსპორტიორი ჰემატოენცეფალურ ბარიერში. გარდა ამისა, სისხლის ერთდროული შეგროვებით და ცერებროსპინალურ სითხესა და სისხლიდან მიღებულ ფაგებზე HTS-ის გამოყენებით, ჩვენ დავადასტურეთ, რომ ცერებროსპინალური სითხის ჩვენს არჩევანზე გავლენას არ ახდენდა სისხლის გამდიდრება ან შერჩევის რაუნდებს შორის გაფართოების ვარგისიანობა. თუმცა, სისხლის კომპარტმენტი შერჩევის პროცედურის ნაწილია, რადგან ფაგები, რომლებსაც შეუძლიათ ცერებროსპინალური სითხის კომპარტმენტამდე მიღწევა, უნდა გადარჩნენ და ცირკულირდნენ სისხლში საკმარისად დიდხანს, რათა გამდიდრდნენ ტვინში. HTS ნედლი მონაცემებიდან საიმედო თანმიმდევრობის ინფორმაციის მისაღებად, ჩვენ გამოვიყენეთ ფილტრები, რომლებიც ადაპტირებულია პლატფორმის სპეციფიკური თანმიმდევრობის შეცდომებზე ანალიზის სამუშაო პროცესში. კინეტიკური პარამეტრების სკრინინგის მეთოდში ჩართვით, ჩვენ დავადასტურეთ ველური ტიპის T7 ფაგების სწრაფი ფარმაკოკინეტიკა (t½ ~ 28 წთ) სისხლში24, 27, 28 და ასევე განვსაზღვრეთ მათი ნახევარგამოყოფის პერიოდი ცერებროსპინალურ სითხეში (t½ ~ 26 წთ) წუთში. სისხლსა და ცერებროსპინალურ სითხეში მსგავსი ფარმაკოკინეტიკური პროფილების მიუხედავად, ფაგის სისხლში კონცენტრაციის მხოლოდ 0.001% იქნა აღმოჩენილი ცერებროსპინალურ სითხეში, რაც მიუთითებს ველური ტიპის T7 ფაგის დაბალ ფონურ მობილურობაზე ჰემატოენცეფალურ ბარიერში. ეს ნაშრომი ხაზს უსვამს შერჩევის პირველი რაუნდის მნიშვნელობას in vivo პანირების სტრატეგიების გამოყენებისას, განსაკუთრებით ფაგური სისტემებისთვის, რომლებიც სწრაფად გამოიდევნება ცირკულაციიდან, რადგან ცოტა კლონს შეუძლია ცენტრალური ნერვული სისტემის კომპარტმენტამდე მიღწევა. ამრიგად, პირველ რაუნდში ბიბლიოთეკის მრავალფეროვნების შემცირება ძალიან დიდი იყო, რადგან ამ ძალიან მკაცრ ცერებროსპინალური სითხის მოდელში საბოლოოდ მხოლოდ შეზღუდული რაოდენობის კლონები შეგროვდა. ეს in vivo პანირების სტრატეგია მოიცავდა შერჩევის რამდენიმე საფეხურს, როგორიცაა აქტიური დაგროვება ცერებროსპინალური სითხის კომპარტმენტში, კლონის გადარჩენა სისხლის კომპარტმენტში და T7 ფაგის კლონების სწრაფი მოცილება სისხლიდან პირველი 10 წუთის განმავლობაში (სურ. 1დ და დამატებითი სურ. 4M). ამრიგად, პირველი რაუნდის შემდეგ, ცერებროსპინალურ სითხეში იდენტიფიცირებული იქნა სხვადასხვა ფაგის კლონები, თუმცა ცალკეული ცხოველებისთვის გამოყენებული იქნა იგივე საწყისი ჯგუფი. ეს იმაზე მიუთითებს, რომ ბიბლიოთეკის წევრების დიდი რაოდენობით მქონე წყაროს ბიბლიოთეკებისთვის მკაცრი შერჩევის მრავალი ეტაპი მრავალფეროვნების მნიშვნელოვან შემცირებას იწვევს. ამიტომ, შემთხვევითი მოვლენები საწყისი შერჩევის პროცესის განუყოფელი ნაწილი გახდება, რაც დიდ გავლენას მოახდენს შედეგზე. სავარაუდოა, რომ ორიგინალურ ბიბლიოთეკაში არსებულ ბევრ კლონს ცერებროსპინალური სითხის გამდიდრების ძალიან მსგავსი მიდრეკილება ჰქონდა. თუმცა, იგივე ექსპერიმენტულ პირობებშიც კი, შერჩევის შედეგები შეიძლება განსხვავდებოდეს საწყის პულში თითოეული კონკრეტული კლონის მცირე რაოდენობის გამო.
ცერებროსპინალურ სითხეში გამდიდრებული მოტივები განსხვავდება სისხლში არსებული მოტივებისგან. საინტერესოა, რომ ცალკეული ცხოველების სისხლში პირველი ცვლილება გლიცინით მდიდარი პეპტიდებისკენ აღვნიშნეთ (სურ. 1გ, დამატებითი სურ. 4ე, 4ვ). გლიცინის პეპტიდების შემცველი ფაგი შესაძლოა უფრო სტაბილური იყოს და ნაკლებად სავარაუდოა, რომ ცირკულაციიდან ამოიღონ. თუმცა, ეს გლიცინით მდიდარი პეპტიდები ცერებროსპინალური სითხის ნიმუშებში არ აღმოჩნდა, რაც იმაზე მიუთითებს, რომ შერჩეულმა ბიბლიოთეკებმა გაიარეს ორი განსხვავებული შერჩევის ეტაპი: ერთი სისხლში და მეორე ცერებროსპინალურ სითხეში დაგროვების საშუალება. მეოთხე რაუნდის შედეგად მიღებული ცერებროსპინალური სითხეთი გამდიდრებული კლონები ფართოდ იქნა გამოცდილი. დადასტურდა, რომ ინდივიდუალურად გამოცდილი თითქმის ყველა კლონი გამდიდრებული იყო ცერებროსპინალურ სითხეში, ცარიელ საკონტროლო ფაგთან შედარებით. ერთი პეპტიდური ჰიტი (#2077) უფრო დეტალურად იქნა შესწავლილი. მან აჩვენა უფრო ხანგრძლივი პლაზმური ნახევარგამოყოფის პერიოდი სხვა ჰიტებთან შედარებით (სურათი 3დ და დამატებითი სურათი 7) და საინტერესოა, რომ ეს პეპტიდი C-ბოლოში ცისტეინის ნარჩენს შეიცავდა. ცოტა ხნის წინ ნაჩვენები იქნა, რომ პეპტიდებში ცისტეინის დამატებამ შეიძლება გააუმჯობესოს მათი ფარმაკოკინეტიკური თვისებები ალბუმინ 29-თან შეკავშირებით. ეს ამჟამად უცნობია პეპტიდ #2077-ისთვის და საჭიროებს შემდგომ შესწავლას. ზოგიერთმა პეპტიდმა აჩვენა ვალენტურ-დამოკიდებულება ცერებროსპინალური სითხის გამდიდრებაში (მონაცემები არ არის ნაჩვენები), რაც შეიძლება დაკავშირებული იყოს T7 კაფსიდის ზედაპირის გეომეტრიასთან. ჩვენს მიერ გამოყენებულმა T7 სისტემამ აჩვენა თითოეული პეპტიდის 5-15 ასლი ფაგის ნაწილაკზე. ინტრავენურად ვირთხების ცერებრალური ქერქში ინტრავენურად შეყვანილ კანდიდატ წამყვან ფაგებზე (დამატებითი სურ. 8) ჩატარებული იქნა IHC (ინტრავენურად შეყვანილი წამყვანი ფაგის კლონებზე) (დამატებითი სურ. 8). მონაცემებმა აჩვენა, რომ სულ მცირე სამი კლონი (No. 2002, No. 2009 და No. 2077) ურთიერთქმედებდა ჰემატოენცეფალურ ბარიერთან. ჯერ კიდევ გასარკვევია, იწვევს თუ არა ჰემატოენცეფალური ბარიერის ეს ურთიერთქმედება ცერებროსპინალური სითხის დაგროვებას თუ ამ კლონების პირდაპირ BCSFB-ში გადაადგილებას. მნიშვნელოვანია, რომ ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ შერჩეული პეპტიდები ინარჩუნებენ ცერებროსპინალური სითხის ტრანსპორტირების უნარს სინთეზირებისა და ცილის ტვირთთან შეკავშირებისას. N-ტერმინალური ბიოტინილირებული პეპტიდების SA-სთან შეკავშირება არსებითად იმეორებს სისხლსა და ცერებროსპინალურ სითხეში მათი შესაბამისი ფაგის კლონებით მიღებულ შედეგებს (სურ. 3ე). და ბოლოს, ჩვენ ვაჩვენებთ, რომ წამყვან პეპტიდ #2077-ს შეუძლია ხელი შეუწყოს SA-სთან კონიუგირებული BACE1-ის ბიოტინილირებული პეპტიდის ინჰიბიტორის ტვინის მოქმედებას, რაც იწვევს გამოხატულ ფარმაკოდინამიკურ ეფექტებს ცენტრალურ ნერვულ სისტემაში Abeta40-ის დონის მნიშვნელოვნად შემცირებით ცერებროსპინალურ სითხეში (სურ. 4). ჩვენ ვერ შევძელით მონაცემთა ბაზაში რაიმე ჰომოლოგის იდენტიფიცირება ყველა შედეგის პეპტიდური თანმიმდევრობის ჰომოლოგიის ძიების შესრულებით. მნიშვნელოვანია აღინიშნოს, რომ T7 ბიბლიოთეკის ზომა დაახლოებით 109-ია, ხოლო 12-მერის თეორიული ბიბლიოთეკის ზომა 4 x 1015-ია. ამიტომ, ჩვენ შევარჩიეთ 12-მერიანი პეპტიდური ბიბლიოთეკის მრავალფეროვნების სივრცის მხოლოდ მცირე ნაწილი, რაც შეიძლება ნიშნავდეს, რომ უფრო ოპტიმიზირებული პეპტიდების იდენტიფიცირება შესაძლებელია ამ იდენტიფიცირებული შედეგების მიმდებარე თანმიმდევრობის სივრცის შეფასებით. ჰიპოთეტურად, ერთ-ერთი მიზეზი, რის გამოც ამ პეპტიდების ბუნებრივი ჰომოლოგები ვერ ვიპოვეთ, შეიძლება იყოს ევოლუციის დროს დესელექტირება, რათა თავიდან იქნას აცილებული გარკვეული პეპტიდური მოტივების უკონტროლო შესვლა ტვინში.
ჩვენი შედეგები ერთად აღებული, საფუძველს უქმნის სამომავლო სამუშაოებს, რათა უფრო დეტალურად განისაზღვროს და დახასიათდეს ცერებროვასკულური ბარიერის სატრანსპორტო სისტემები in vivo. ამ მეთოდის ძირითადი სტრუქტურა ეფუძნება ფუნქციური შერჩევის სტრატეგიას, რომელიც არა მხოლოდ ადგენს კლონებს ცერებრალური სისხლძარღვების შეკავშირების თვისებებით, არამედ მოიცავს კრიტიკულ ეტაპს, რომლის დროსაც წარმატებულ კლონებს აქვთ შინაგანი აქტივობა ბიოლოგიური ბარიერების in vivo გადაკვეთისთვის ცნს-ის განყოფილებაში. ეს არის ამ პეპტიდების ტრანსპორტირების მექანიზმის და მათი უპირატესობის გარკვევა ტვინის რეგიონისთვის სპეციფიკურ მიკროვასკულატურასთან შეკავშირების მიმართ. ამან შეიძლება გამოიწვიოს ჰემატოენცეფალური ბარიერის და რეცეპტორების ტრანსპორტირების ახალი გზების აღმოჩენა. ჩვენ ველით, რომ იდენტიფიცირებული პეპტიდები პირდაპირ დაუკავშირდებიან ცერებროვასკულარულ რეცეპტორებს ან სისხლის ბარიერის ან BCSFB-ის მეშვეობით ტრანსპორტირებულ მოცირკულირე ლიგანდებს. ამ ნაშრომში აღმოჩენილი პეპტიდური ვექტორები ცერებროვასკულური სითხის ტრანსპორტირების აქტივობით შემდგომში გამოკვლეული იქნება. ამჟამად ჩვენ ვიკვლევთ ამ პეპტიდების ტვინის სპეციფიკურობას მათი უნარის მიხედვით, გადალახონ სისხლის ბარიერი და/ან BCSFB. ეს ახალი პეპტიდები უაღრესად ღირებული ინსტრუმენტები იქნება ახალი რეცეპტორების ან გზების პოტენციური აღმოჩენისთვის და ტვინში მაკრომოლეკულების, მაგალითად, ბიოლოგიური პრეპარატების მიწოდების ახალი, მაღალეფექტური პლატფორმების შემუშავებისთვის.
დიდი ცისტერნის (CM) კანულაცია ადრე აღწერილი მეთოდის მოდიფიკაციის გამოყენებით. ანესთეზირებული Wistar ვირთხები (200-350 გ) დამონტაჟდა სტერეოტაქსურ აპარატზე და თავის ქალის გამოსავლენად გაპარსულ და ასეპტიკურად მომზადებულ თავის კანულაზე გაკეთდა შუა ჭრილობა. ზედა სამაგრის მიდამოში გაბურღეთ ორი ხვრელი და ნახვრეტებში დაამაგრეთ დამამაგრებელი ხრახნები. უჟანგავი ფოლადის კანულას CM-ში სტერეოტაქტიკური წარმართვისთვის დამატებითი ხვრელი გაბურღეს გვერდით კეფის ქედში. კანულას გარშემო დააკარით სტომატოლოგიური ცემენტი და დააფიქსირეთ ხრახნებით. ფოტოგამყარებისა და ცემენტის გამკვრივების შემდეგ, კანის ჭრილობა დაიხურა 4/0 სუპრამიდული ნაკერით. კანულას სწორად განთავსება დასტურდება ცერებროსპინალური სითხის (CSF) სპონტანური გაჟონვით. ვირთხა ამოიღეთ სტერეოტაქსური აპარატიდან, მიიღეთ შესაბამისი პოსტოპერაციული მკურნალობა და ტკივილის მართვა და მიეცით მას გამოჯანმრთელების საშუალება მინიმუმ ერთი კვირის განმავლობაში, სანამ ცერებროსპინალურ სითხეში სისხლის ნიშნები არ შეინიშნება. Wistar ვირთხები (Crl:WI/Han) მიღებული იქნა ჩარლზ რივერიდან (საფრანგეთი). ყველა ვირთხა იმყოფებოდა სპეციფიკური პათოგენებისგან თავისუფალ პირობებში. ყველა ცხოველზე ჩატარებული ექსპერიმენტი დამტკიცებული იყო შვეიცარიის ქალაქ ბაზელის ვეტერინარული ოფისის მიერ და ჩატარდა ცხოველთა ლიცენზიის №2474 (ტვინის აქტიური ტრანსპორტის შეფასება თერაპიული კანდიდატების დონის გაზომვით ვირთხის ცერებროსპინალურ სითხესა და ტვინში) შესაბამისად.
ფრთხილად შეინარჩუნეთ ვირთხა გონზე CM კანულით ხელში. ამოიღეთ დატურა კანულიდან და შეაგროვეთ 10 µლ სპონტანურად გამომავალი ცერებროსპინალური სითხე. ვინაიდან კანულის გამტარობა საბოლოოდ დაირღვა, კვლევაში ჩართული იყო მხოლოდ გამჭვირვალე ცერებროსპინალური სითხის ნიმუშები, რომლებსაც არ აღენიშნებოდათ სისხლის დაბინძურება ან ფერის შეცვლა. პარალელურად, დაახლოებით 10-20 μl სისხლი აღებული იქნა კუდის წვერზე არსებული მცირე ჭრილობიდან ჰეპარინით (Sigma-Aldrich) შეყვანილ მილებში. ცერებროსპინალური სითხე და სისხლი შეგროვდა სხვადასხვა დროს T7 ფაგის ინტრავენური ინექციის შემდეგ. ცერებროსპინალური სითხის თითოეული ნიმუშის შეგროვებამდე დაახლოებით 5-10 μl სითხე გადაიღვარა, რაც შეესაბამება კათეტერის მკვდარი მოცულობას.
ბიბლიოთეკები შეიქმნა T7Select 10-3b ვექტორის გამოყენებით, როგორც ეს აღწერილია T7Select სისტემის სახელმძღვანელოში (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). მოკლედ, შემთხვევითი 12-მერიანი დნმ-ის ჩანართი სინთეზირებული იქნა შემდეგი ფორმატით:
NNK კოდონი გამოყენებული იქნა ჩანართში ორმაგი გაჩერების კოდონებისა და ამინომჟავების ზედმეტად ექსპრესიის თავიდან ასაცილებლად. N არის თითოეული ნუკლეოტიდის ხელით შერეული ეკვიმოლური თანაფარდობა, ხოლო K არის ადენინისა და ციტოზინის ნუკლეოტიდების ხელით შერეული ეკვიმოლური თანაფარდობა. ერთჯაჭვიანი რეგიონები გარდაიქმნა ორჯაჭვიან დნმ-ად dNTP-ით (Novagen) და Klenow-ს ფერმენტით (New England Biolabs) შემდგომი ინკუბაციით Klenow-ს ბუფერში (New England Biolabs) 3 საათის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე. რეაქციის შემდეგ, ორჯაჭვიანი დნმ აღდგა EtOH-ის დალექვით. შედეგად მიღებული დნმ დაიშალა შემზღუდველი ფერმენტებით EcoRI და HindIII (ორივე Roche-დან). გახლეჩილი და გაწმენდილი (QIAquick, Qiagen) ჩანართი (T4 ლიგაზა, New England Biolabs) შემდეგ ჩარჩოში ჩასმული იქნა წინასწარ გახლეჩილ T7 ვექტორში 10B კაფსიდური გენის 348-ე ამინომჟავის შემდეგ. ლიგაციის რეაქციები ინკუბირებული იყო 16°C ტემპერატურაზე 18 საათის განმავლობაში in vitro შეფუთვამდე. ფაგის შეფუთვა in vitro ჩატარდა T7Select 10-3b კლონირების კომპლექტთან (Novagen) მოწოდებული ინსტრუქციის შესაბამისად და შეფუთვის ხსნარი ერთხელ ამპლიფიცირდა ლიზისამდე Escherichia coli-ს (BLT5615, Novagen) გამოყენებით. ლიზატები ცენტრიფუგირდა, ტიტრირდა და გაიყინა -80°C-ზე გლიცეროლის საწყის ხსნარად.
ფაგის ცვლადი რეგიონების პირდაპირი PCR ამპლიფიკაცია ბულიონში ან ფირფიტაში, საკუთრების 454/Roche-ამპლიკონის შერწყმის პრაიმერების გამოყენებით. პირდაპირი შერწყმის პრაიმერი შეიცავს ცვლადი რეგიონის (NNK) 12 (შაბლონ-სპეციფიკური), GS FLX ტიტანის ადაპტერ A-ს და ოთხფუძიანი ბიბლიოთეკის გასაღების თანმიმდევრობის (TCAG) გვერდით მდებარე თანმიმდევრობებს (დამატებითი სურათი 1ა):
უკუშერწყმის პრაიმერი ასევე შეიცავს ბიოტინს, რომელიც მიმაგრებულია მძივების დასაჭერად და GS FLX ტიტანის ადაპტერ B-ს, რომელიც საჭიროა კლონური ამპლიფიკაციისთვის ემულსიური PCR-ის დროს:
შემდეგ ამპლიკონები დაექვემდებარა 454/Roche-ის პიროსექვენირებას 454 GS-FLX ტიტანის პროტოკოლის მიხედვით. სანგერის ხელით სეკვენირებისთვის (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl დნმ ანალიზატორი), T7 ფაგის დნმ ამპლიფიცირებული იქნა PCR-ით და სეკვენირებული იქნა შემდეგი პრაიმერების წყვილებით:
ცალკეული ფოლაქებიდან აღებული ჩანართები დაექვემდებარა PCR ამპლიფიკაციას Roche Fast Start DNA Polymerase Kit-ის გამოყენებით (მწარმოებლის ინსტრუქციის შესაბამისად). ჩატარდა ცხელი სტარტი (10 წთ 95 °C-ზე) და 35 ბუსტ ციკლი (50 წმ 95 °C-ზე, 1 წთ 50 °C-ზე და 1 წთ 72 °C-ზე).
ფაგი ბიბლიოთეკებიდან, ველური ტიპის ფაგი, ცერებროსპინალური სითხისა და სისხლიდან ამოღებული ფაგი ან ინდივიდუალური კლონები გამრავლდა Escherichia coli BL5615-ში TB ბულიონში (Sigma Aldrich) ან 500 სმ2 ჭურჭელში (Thermo Scientific) 4 საათის განმავლობაში 37°C ტემპერატურაზე. ფაგი ამოღებული იქნა ფირფიტებიდან Tris-EDTA ბუფერით (Fluka Analytical) გავლით ან ფოლაქების სტერილური პიპეტის წვერებით შეგროვებით. ფაგი იზოლირებული იქნა კულტურის ზედაპირული შრედან ან ექსტრაქციის ბუფერიდან პოლიეთილენგლიკოლის (PEG 8000) ერთი წრის ნალექით (Promega) და რესუსპენდირებული იქნა Tris-EDTA ბუფერში.
ინტრავენური (IV) ინექციის წინ (500 μl/ცხოველი) გამრავლებული ფაგი ენდოტოქსინის მოცილების 2-3 რაუნდს დაექვემდებარა ენდოტოქსინის მოცილების მძივების (Miltenyi Biotec) გამოყენებით. პირველ რაუნდში შეიყვანეს 2×1012 ფაგი; მეორეში - 2×1010 ფაგი; მესამე და მეოთხე შერჩევის რაუნდებში - 2×109 ფაგი ცხოველზე. ფაგის შემცველობა მითითებულ დროს შეგროვებულ ცერებროსპინალურ სითხესა და სისხლის ნიმუშებში განისაზღვრა ფოლაქების დათვლით მწარმოებლის ინსტრუქციის (T7Select სისტემის სახელმძღვანელო) შესაბამისად. ფაგის შერჩევა განხორციელდა გაწმენდილი ბიბლიოთეკების კუდის ვენაში ინტრავენური ინექციით ან წინა შერჩევის რაუნდიდან ცერებროსპინალური სითხედან ამოღებული ფაგის ხელახალი ინექციით, ხოლო შემდგომი შეგროვება ჩატარდა შესაბამისად 10 წუთში, 30 წუთში, 60 წუთში, 90 წუთში, 120 წუთში, 180 წუთში და 240 წუთში ცერებროსპინალური სითხისა და სისხლის ნიმუშებიდან. სულ ჩატარდა in vivo პანირების ოთხი რაუნდი, რომლის დროსაც ორი შერჩეული ტოტი ცალ-ცალკე შეინახეს და გაანალიზეს შერჩევის პირველი სამი რაუნდის განმავლობაში. შერჩევის პირველი ორი რაუნდიდან ცერებროსპინალური სითხისგან ამოღებული ყველა ფაგის ჩანართი დაექვემდებარა 454/Roche პიროსექვენირებას, ხოლო შერჩევის ბოლო ორი რაუნდიდან ცერებროსპინალური სითხისგან ამოღებული ყველა კლონს ხელით სეკვენირება ჩაუტარდა. შერჩევის პირველი რაუნდიდან ყველა სისხლის ფაგი ასევე დაექვემდებარა 454/Roche პიროსექვენირებას. ფაგის კლონების ინექციისთვის, შერჩეული ფაგები ამპლიფიცირებული იქნა E. coli-ში (BL5615) 500 სმ2 ფირფიტებზე 37°C ტემპერატურაზე 4 საათის განმავლობაში. ინდივიდუალურად შერჩეული და ხელით სეკვენირებული კლონები გამრავლდა TB გარემოში. ფაგის ექსტრაქციის, გაწმენდისა და ენდოტოქსინის მოცილების შემდეგ (როგორც ზემოთ იყო აღწერილი), 2×1010 ფაგი/ცხოველი 300 μl-ში შეიყვანეს ინტრავენურად ერთ კუდის ვენაში.
თანმიმდევრობის მონაცემების წინასწარი დამუშავება და თვისებრივი ფილტრაცია. 454/Roche-ის ნედლი მონაცემები გადაყვანილი იქნა ორობითი სტანდარტული ნაკადის რუკის ფორმატიდან (sff) Pearson-ის ადამიანის მიერ წასაკითხ ფორმატში (fasta) მომწოდებლის პროგრამული უზრუნველყოფის გამოყენებით. ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობის შემდგომი დამუშავება განხორციელდა საკუთრების C პროგრამებისა და სკრიპტების გამოყენებით (გამოუქვეყნებელი პროგრამული პაკეტი), როგორც ეს აღწერილია ქვემოთ. პირველადი მონაცემების ანალიზი მოიცავს მკაცრ მრავალსაფეხურიან ფილტრაციის პროცედურებს. წაკითხვების გასაფილტრად, რომლებიც არ შეიცავდა ვალიდურ 12-მერიან ჩანართ დნმ-ის თანმიმდევრობას, წაკითხვები თანმიმდევრულად გასწორდა საწყის ეტიკეტზე (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), გაჩერების ეტიკეტზე (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) და ფონურ ჩანართზე (CCCTGCAGGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) გლობალური Needleman-Wunsch ტესტის გამოყენებით. გასწორება საშუალებას იძლეოდა 2-მდე შეუსაბამობა თითოეულ გასწორებაზე31. ამიტომ, წაკითხვები დაწყების და გაჩერების ტეგების გარეშე და წაკითხვები, რომლებიც შეიცავდა ფონურ ჩანართებს, ანუ გასწორებები, რომლებიც აჭარბებდა შეუსაბამობების დაშვებულ რაოდენობას, ამოღებული იქნა ბიბლიოთეკიდან. რაც შეეხება დარჩენილ წაკითხვებს, საწყისი ნიშნიდან დაწყებული და გაჩერების ნიშანამდე დამთავრებული N-მერული დნმ-ის თანმიმდევრობა ამოღებული იქნა საწყისი წაკითხვის თანმიმდევრობიდან და შემდგომი დამუშავდა (შემდგომში „ჩანართი“). ჩანართის ტრანსლაციის შემდეგ, ჩანართიდან ამოღებულია პრაიმერის 5' ბოლოში პირველი გაჩერების კოდონის შემდეგ მდებარე ნაწილი. გარდა ამისა, ასევე ამოღებულია პრაიმერის 3' ბოლოში არასრულ კოდონებამდე მიმავალი ნუკლეოტიდები. მხოლოდ ფონური თანმიმდევრობების შემცველი ჩანართების გამოსარიცხად, ასევე ამოღებულია ამინომჟავური ნიმუშით „PAG“ დაწყებული ტრანსლირებული ჩანართები. ბიბლიოთეკიდან ამოღებულია პეპტიდები, რომელთა პოსტ-ტრანსლაციური სიგრძე 3 ამინომჟავაზე ნაკლებია. დაბოლოს, ამოიღეთ ჩანართების პულში ჭარბი რაოდენობა და განსაზღვრეთ თითოეული უნიკალური ჩანართის სიხშირე. ამ ანალიზის შედეგები მოიცავდა ნუკლეოტიდური თანმიმდევრობების (ჩანართების) სიას და მათ (წაკითხვის) სიხშირეებს (დამატებითი ფიგურები 1გ და 2).
ჯგუფური N-მერ დნმ-ის ჩანართები თანმიმდევრობის მსგავსების მიხედვით: 454/Roche-სპეციფიკური თანმიმდევრობის შეცდომების (მაგალითად, ჰომოპოლიმერული გაფართოებების თანმიმდევრობის პრობლემების) აღმოსაფხვრელად და ნაკლებად მნიშვნელოვანი ზედმეტობების მოსაშორებლად, ადრე გაფილტრული N-მერ დნმ-ის თანმიმდევრობის ჩანართები (ჩანართები) დალაგებულია მსგავსების მიხედვით. ჩანართები (დაშვებულია 2-მდე შეუსაბამო ფუძემდე) იტერაციული ალგორითმის გამოყენებით, რომელიც განისაზღვრება შემდეგნაირად: ჩანართები დალაგებულია ჯერ მათი სიხშირის მიხედვით (უმაღლესიდან უმცირესამდე) და თუ ისინი ერთნაირია, მათი მეორადით, დალაგებულია სიგრძის მიხედვით (უგრძესიდან უმოკლესამდე). ამრიგად, ყველაზე ხშირი და გრძელი ჩანართები განსაზღვრავს პირველ „ჯგუფს“. ჯგუფის სიხშირე დაყენებულია საკვანძო სიხშირეზე. შემდეგ, დალაგებულ სიაში დარჩენილი თითოეული ჩანართის დამატება სცადეს ჯგუფში წყვილური ნიდლმან-ვუნშის გასწორებით. თუ გასწორებაში შეუსაბამობების, ჩანართების ან წაშლილების რაოდენობა არ აღემატება 2-ის ზღურბლს, ჯგუფს ემატება ჩანართი და ჯგუფის საერთო სიხშირე იზრდება იმით, თუ რამდენად ხშირად იყო დამატებული ჩანართი. ჯგუფში დამატებული ჩანართები მონიშნულია, როგორც გამოყენებული და გამოირიცხება შემდგომი დამუშავებიდან. თუ ჩანართის თანმიმდევრობის უკვე არსებულ ჯგუფს ვერ დაემატება, ჩანართის თანმიმდევრობა გამოიყენება ახალი ჯგუფის შესაქმნელად შესაბამისი ჩანართის სიხშირით და მონიშნულია, როგორც გამოყენებული. იტერაცია მთავრდება მაშინ, როდესაც თითოეული ჩანართის თანმიმდევრობა გამოყენებული იქნება ახალი ჯგუფის ფორმირებისთვის ან შეიძლება ჩაერთოს უკვე არსებულ ჯგუფში. ბოლოს და ბოლოს, ნუკლეოტიდებისგან შემდგარი დაჯგუფებული ჩანართები საბოლოოდ გარდაიქმნება პეპტიდურ თანმიმდევრობებად (პეპტიდური ბიბლიოთეკები). ამ ანალიზის შედეგია ჩანართების ნაკრები და მათი შესაბამისი სიხშირეები, რომლებიც ქმნიან თანმიმდევრული წაკითხვების რაოდენობას (დამატებითი სურ. 2).
მოტივის გენერაცია: უნიკალური პეპტიდების სიის საფუძველზე შეიქმნა ბიბლიოთეკა, რომელიც შეიცავს ყველა შესაძლო ამინომჟავის ნიმუშს (aa), როგორც ეს ქვემოთ არის ნაჩვენები. პეპტიდიდან ამოღებული იქნა 3 სიგრძის თითოეული შესაძლო ნიმუში და დაემატა მისი შებრუნებული ნიმუში საერთო მოტივის ბიბლიოთეკასთან ერთად, რომელიც შეიცავს ყველა ნიმუშს (ტრიპეპტიდს). მაღალი განმეორებადობის მოტივების ბიბლიოთეკები სეკვენირებული იქნა და მოიხსნა ზედმეტობა. შემდეგ, მოტივის ბიბლიოთეკაში თითოეული ტრიპეპტიდისთვის, გამოთვლითი ინსტრუმენტების გამოყენებით შევამოწმეთ მისი არსებობა ბიბლიოთეკაში. ამ შემთხვევაში, ემატება ნაპოვნი მოტივის ტრიპეპტიდის შემცველი პეპტიდის სიხშირე და ენიჭება მოტივის ბიბლიოთეკაში არსებულ მოტივს („მოტივების რაოდენობა“). მოტივის გენერირების შედეგია ორგანზომილებიანი მასივი, რომელიც შეიცავს ტრიპეპტიდების (მოტივების) ყველა შემთხვევას და მათ შესაბამის მნიშვნელობებს, რომლებიც წარმოადგენს სეკვენირების წაკითხვის რაოდენობას, რომელიც იწვევს შესაბამის მოტივს, როდესაც წაკითხვები ფილტრდება, დაჯგუფდება და ითარგმნება. მეტრიკა, როგორც აღწერილია ზემოთ.
მოტივების რაოდენობისა და შესაბამისი გაფანტული დიაგრამების ნორმალიზაცია: თითოეული ნიმუშის მოტივების რაოდენობა ნორმალიზებული იქნა გამოყენებით
სადაც ni არის თემა i-ს შემცველი წაკითხვების რაოდენობა. ამრიგად, vi წარმოადგენს ნიმუშში i მოტივის შემცველი წაკითხვების (ან პეპტიდების) პროცენტულ სიხშირეს. მოტივების არანორმალიზებული რაოდენობის P-მნიშვნელობები გამოითვალა ფიშერის ზუსტი ტესტის გამოყენებით. მოტივების რაოდენობის კორელოგრამებთან დაკავშირებით, სპირმენის კორელაციები გამოითვალა მოტივების ნორმალიზებული რაოდენობის გამოყენებით R-თან.
პეპტიდების ბიბლიოთეკაში თითოეულ პოზიციაზე ამინომჟავების შემცველობის ვიზუალიზაციისთვის შეიქმნა ვებ ლოგოგრამები 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). პირველ რიგში, 12-მერიანი პეპტიდის თითოეულ პოზიციაზე ამინომჟავების შემცველობა ინახება 20×12 მატრიცაში. შემდეგ, fasta-sequence ფორმატში გენერირდება 1000 პეპტიდის ნაკრები, რომელიც შეიცავს ერთსა და იმავე ფარდობით ამინომჟავების შემცველობას თითოეულ პოზიციაზე და მიეწოდება შეყვანის სახით web-logo 3-ს, რომელიც წარმოქმნის მოცემული პეპტიდების ბიბლიოთეკისთვის თითოეულ პოზიციაზე ამინომჟავების ფარდობითი შემცველობის გრაფიკულ წარმოდგენას. მრავალგანზომილებიანი მონაცემთა ნაკრებების ვიზუალიზაციისთვის, შეიქმნა სითბური რუკები R-ში შინაგანად შემუშავებული ინსტრუმენტის გამოყენებით (biosHeatmap, ჯერ კიდევ გამოსული R პაკეტი). სითბურ რუკებში წარმოდგენილი დენდროგრამები გამოითვალა უორდის იერარქიული კლასტერიზაციის მეთოდით ევკლიდური მანძილის მეტრიკით. მოტივის ქულის მონაცემების სტატისტიკური ანალიზისთვის, არანორმალიზებული ქულის P მნიშვნელობები გამოითვალა ფიშერის ზუსტი ტესტის გამოყენებით. სხვა მონაცემთა ნაკრებების P-მნიშვნელობები გამოითვალა R-ში სტუდენტის t-ტესტის ან ANOVA-ს გამოყენებით.
შერჩეული ფაგის კლონები და ჩანართების გარეშე ფაგები ინტრავენურად შეიყვანეს კუდის ვენის მეშვეობით (2×1010 ფაგი/ცხოველი 300 μl PBS-ში). პერფუზიამდე და შემდგომ ფიქსაციამდე ათი წუთით ადრე, იმავე ცხოველებს ინტრავენურად შეიყვანეს 100 μl DyLight594-ით მონიშნული ლექტინი (Vector Laboratories Inc., DL-1177). ფაგის ინექციიდან 60 წუთის შემდეგ, ვირთხებს გულში შეჰყავდათ 50 მლ PBS, შემდეგ კი 50 მლ 4%-იანი PFA/PBS. ტვინის ნიმუშები დამატებით ფიქსირდებოდა ღამით 4%-იან PFA/PBS-ში და 30%-იან საქაროზაში მთელი ღამით 4°C ტემპერატურაზე აალდებოდა. ნიმუშები იყინებოდა OCT ნარევში. გაყინული ნიმუშების იმუნოჰისტოქიმიური ანალიზი ჩატარდა ოთახის ტემპერატურაზე 30 μm კრიოსექციებზე, რომლებიც დაბლოკილი იყო 1% BSA-თი და ინკუბირებული იყო პოლიკლონური FITC-მონიშნული ანტისხეულებით T7 ფაგის წინააღმდეგ (Novus NB 600-376A) 4°C ტემპერატურაზე. ინკუბაცია მთელი ღამით. და ბოლოს, სექციები 3-ჯერ გაირეცხა PBS-ით და გამოკვლეული იქნა კონფოკალური ლაზერული მიკროსკოპით (Leica TCS SP5).
ყველა პეპტიდი, რომლის მინიმალური სისუფთავე 98%-ია, სინთეზირებული იქნა GenScript USA-ს მიერ, ბიოტინირებული და ლიოფილიზებული. ბიოტინი დაკავშირებულია N-ბოლოზე დამატებითი სამმაგი გლიცინის სპეისერის მეშვეობით. ყველა პეპტიდი შეამოწმეთ მას-სპექტრომეტრიის გამოყენებით.
სტრეპტავიდინი (Sigma S0677) შერეული იყო ბიოტინილირებული პეპტიდის, ბიოტინილირებული BACE1 ინჰიბიტორული პეპტიდის ან ბიოტინილირებული BACE1 ინჰიბიტორული პეპტიდის და BACE1 ინჰიბიტორული პეპტიდის 5-ჯერ ეკვიმოლარულ ჭარბ რაოდენობასთან 5–10% DMSO-ში/ინკუბირებული იყო PBS-ში. ინექციამდე 1 საათით ადრე ოთახის ტემპერატურაზე. სტრეპტავიდინთან კონიუგირებული პეპტიდები ინტრავენურად შეჰყავდათ 10 მგ/კგ დოზით ცერებრალური ღრუს მქონე ვირთხების კუდის ვენაში.
სტრეპტავიდინ-პეპტიდური კომპლექსების კონცენტრაცია შეფასდა ELISA მეთოდით. ​​Nunc Maxisorp მიკროტიტერული ფირფიტები (Sigma) დაფარული იყო 4°C ტემპერატურაზე მთელი ღამით 1.5 μg/მლ თაგვის ანტისტრეპტავიდინის ანტისხეულით (Thermo, MA1-20011). ბლოკირების (ბლოკირების ბუფერი: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% ჟელატინი, 1% BSA) შემდეგ ოთახის ტემპერატურაზე 2 საათის განმავლობაში, ფირფიტა გარეცხილი იყო 0.05% Tween-20/PBS-ით (სარეცხი ბუფერი) 3 წამის განმავლობაში, ცერებროსპინალური სითხის და პლაზმის ნიმუშები დაემატა ბლოკირების ბუფერით (პლაზმა 1:10,000, CSF 1:115) განზავებულ ჭებში. შემდეგ ფირფიტა ინკუბირებული იყო მთელი ღამით 4°C ტემპერატურაზე დეტექციის ანტისხეულით (1 μg/მლ, ანტისტრეპტავიდინ-HRP, Novus NB120-7239). სამი გარეცხვის ეტაპის შემდეგ, სტრეპტავიდინის აღმოჩენა მოხდა TMB სუბსტრატის ხსნარში (Roche) 20 წუთამდე ინკუბაციით. ფერის გაჩენის 1M H2SO4-ით შეწყვეტის შემდეგ, გაზომეთ აბსორბცია 450 ნმ-ზე.
სტრეპტავიდინ-პეპტიდ-BACE1 ინჰიბიტორის კომპლექსის ფუნქცია შეფასდა Aβ(1-40) ELISA-ს მეთოდით მწარმოებლის პროტოკოლის (Wako, 294-64701) შესაბამისად. მოკლედ, ცერებროსპინალური სითხის ნიმუშები განზავდა სტანდარტულ გამხსნელში (1:23) და ინკუბირებული იქნა ღამით 4°C ტემპერატურაზე 96-ჭედიან ფირფიტებში, რომლებიც დაფარული იყო BNT77 დამჭერი ანტისხეულით. ხუთი რეცხვის ეტაპის შემდეგ, დაემატა HRP-კონიუგირებული BA27 ანტისხეული და ინკუბირებული იქნა 2 საათის განმავლობაში 4°C ტემპერატურაზე, რასაც მოჰყვა ხუთი რეცხვის ეტაპი. Aβ(1–40) აღმოჩენილი იქნა TMB ხსნარში 30 წუთის განმავლობაში ოთახის ტემპერატურაზე ინკუბაციით. ფერის განვითარების შეჩერების შემდეგ, შეჩერების ხსნარით, გაზომეთ აბსორბცია 450 ნმ-ზე. პლაზმის ნიმუშები დაექვემდებარა მყარი ფაზის ექსტრაქციას Aβ(1–40) ELISA-მდე. პლაზმა დაემატა 0.2%-იან DEA-ს (Sigma) 96-ჭედიან ფირფიტებში და ინკუბირებული იქნა ოთახის ტემპერატურაზე 30 წუთის განმავლობაში. SPE ფირფიტების (Oasis, 186000679) წყლითა და 100%-იანი მეთანოლით თანმიმდევრული გარეცხვის შემდეგ, პლაზმის ნიმუშები დაემატა SPE ფირფიტებს და მთლიანად ამოიღეს სითხე. ნიმუშები გაირეცხა (ჯერ 5%-იანი მეთანოლით, შემდეგ 30%-იანი მეთანოლით) და გამოირეცხა 2% NH4OH/90% მეთანოლით. ელუატის 55°C ტემპერატურაზე 99 წუთის განმავლობაში მუდმივი N2 დენის ქვეშ გაშრობის შემდეგ, ნიმუშები აღდგა სტანდარტულ გამხსნელებში და Aβ(1–40) გაიზომა ზემოთ აღწერილი მეთოდით.
როგორ მოვიყვანოთ ეს სტატია: ურიხი, ე. და სხვ. ტვირთის მიწოდება ტვინში in vivo იდენტიფიცირებული ტრანზიტული პეპტიდების გამოყენებით. მეცნიერება. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
ლიხოტა ჯ., სკიორინგე თ., თომსენ ლ.ბ. და მუს თ. მაკრომოლეკულური პრეპარატების ტვინში მიწოდება მიზნობრივი თერაპიის გამოყენებით. ნეიროქიმიის ჟურნალი 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
ბრასნევიჩი, ი., შტაინბუში, ჰ.ვ., შმიცი, ს. და მარტინეს-მარტინეზი, პ. პეპტიდური და ცილოვანი პრეპარატების მიწოდება ჰემატოენცეფალურ ბარიერში. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
პარდრიჯი, ვმ. ჰემატოენცეფალური ბარიერი: ტვინისთვის განკუთვნილი წამლების შემუშავების შემაფერხებელი ფაქტორი. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
იოჰანსონი, კ.ე., დანკანი, ჯ.ა., სტოპა, ე.გ. და ბირდი, ა. წამლის მიწოდებისა და ტვინში მიზანმიმართული მიწოდებით გაუმჯობესებული პერსპექტივები ქოროიდული წნულისა და ცერებროსპინალური სითხის გზით. ფარმაცევტული კვლევა 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
პარდრიჯი, ვმ. ბიოფარმაცევტული საშუალებების მოდერნიზაცია მოლეკულური ტროას ცხენებით ტვინის მიწოდებისთვის. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
პარდრიჯი, WM რეცეპტორის მიერ განპირობებული პეპტიდური ტრანსპორტი ჰემატოენცეფალურ ბარიერში. ენდოკრინული ჟურნალი „Rev. 7“, 314–330 (1986).
ნივოენერი, ჯ. და სხვ. თერაპიული ანტისხეულების ტვინში შეღწევადობისა და ეფექტურობის გაზრდა მონოვალენტური მოლეკულური შატლების გამოყენებით. ნეირონი 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
ბიენ-ლი, ნ. და სხვ. ტრანსფერინის რეცეპტორის (TfR) ტრანსპორტი განსაზღვრავს TfR ანტისხეულების აფინური ვარიანტების ტვინში შეწოვას. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).