Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com. Waxaad isticmaaleysaa nooc biraawsar ah oo leh taageero CSS oo xaddidan. Waayo-aragnimada ugu fiican, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho biraawsar la cusbooneysiiyay (ama aad joojiso Habka La-qabsiga ee Internet Explorer). Intaa waxaa dheer, si loo hubiyo taageerada socota, waxaan tusineynaa goobta iyada oo aan lahayn qaabab iyo JavaScript.
Waxay soo bandhigaysaa sawir-qaadis saddex sawir-qaadis ah isku mar. Isticmaal badhamada Hore iyo kuwa Xiga si aad ugu dhex marto saddex sawir-qaadis markiiba, ama isticmaal badhamada sawir-qaadis ee dhammaadka si aad ugu dhex marto saddex sawir-qaadis markiiba.
Caqabadda dhiigga-maskaxda iyo caqabadda dhiigga-maskaxda waxay ka hortagtaa wakiilada bayoterabi-ku-daweynta inay gaaraan bartilmaameedyadooda nidaamka dhexe ee neerfaha, taasoo caqabad ku ah daaweynta waxtarka leh ee cudurrada neerfaha. Si aan u helno gaadiidleyda cusub ee maskaxda ee gudaha jirka, waxaan soo bandhignay maktabadda peptide-ka phage T7 iyo dhiigga iyo dareeraha maskaxda (CSF) oo si taxane ah loo ururiyey iyadoo la adeegsanayo qaab jiir oo miyir qaba oo miyir qaba. Noocyada phage-ka gaarka ah ayaa si aad ah loogu hodaneeyay CSF ka dib afar wareeg oo xulasho ah. Tijaabinta peptide-yada musharraxa shaqsiga ah ayaa muujisay in ka badan 1000-laab kobcinta CSF. Hawlgalka bayoolojiga ee gaarsiinta peptide-ka ee maskaxda waxaa lagu xaqiijiyay hoos u dhac 40% ah heerka amyloid-β ee dareeraha maskaxda iyadoo la adeegsanayo inhibitor peptide BACE1 ah oo ku xiran peptide-ka cusub ee transit-ka ee la aqoonsaday. Natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in peptide-yada lagu aqoonsaday hababka xulashada phage-ka ee in vivo ay noqon karaan gaadiid waxtar leh oo loogu talagalay gaarsiinta nidaamsan ee macromolecules-ka maskaxda iyadoo leh saameyn daaweyn.
Cilmi-baarista daaweynta ee bartilmaameedsanaysa nidaamka neerfaha dhexe (CNS) ayaa inta badan diiradda saartay aqoonsashada daawooyinka iyo wakiilada la hagaajiyay ee muujiya sifooyinka bartilmaameedsan ee CNS, iyadoo dadaal yar la gelinayo helitaanka hababka kiciya gudbinta daawada firfircoon ee maskaxda. Tani waxay hadda bilaabaysaa inay isbeddesho maadaama keenista daawada, gaar ahaan molecules-ka waaweyn, ay tahay qayb muhiim ah oo ka mid ah horumarinta daawada neerfaha casriga ah. Deegaanka nidaamka neerfaha dhexe waxaa si fiican u ilaaliya nidaamka xannibaadda maskaxda, oo ka kooban xannibaadda dhiigga-maskaxda (BBB) ​​​​iyo xannibaadda dhiigga-maskaxda (BCBB)1, taasoo ka dhigaysa mid adag in daawooyinka la gaarsiiyo maskaxda1,2. Waxaa lagu qiyaasaa in ku dhawaad ​​​​dhammaan daawooyinka molecule-ka waaweyn iyo in ka badan 98% daawooyinka molecule-ka yaryar laga saaro maskaxda3. Taasi waa sababta ay aad muhiim u tahay in la aqoonsado nidaamyada cusub ee gaadiidka maskaxda ee bixiya gaarsiinta waxtarka leh oo gaar ah ee daawooyinka daaweynta CNS 4,5. Si kastaba ha ahaatee, BBB iyo BCSFB waxay sidoo kale bixiyaan fursad aad u fiican oo loogu talagalay keenista daroogada iyagoo dhex galaya oo galaya dhammaan qaab-dhismeedka maskaxda iyada oo loo marayo xididdada dhiigga ee ballaaran. Sidaa darteed, dadaallada hadda socda ee lagu adeegsanayo hababka aan duullaanka ahayn ee gaarsiinta maskaxda waxay inta badan ku salaysan yihiin habka gaadiidka dhexdhexaadinta qaataha (PMT) iyadoo la adeegsanayo qaataha BBB6 ee gudaha. Iyadoo ay jiraan horumarro muhiim ah oo dhawaan la sameeyay iyadoo la adeegsanayo habka qaataha wareejinta 7,8, horumar dheeraad ah oo nidaamyada keenista cusub oo leh sifooyin la hagaajiyay ayaa loo baahan yahay. Si taas loo gaaro, hadafkayagu wuxuu ahaa inaan aqoonsanno peptides-ka awood u leh inay dhexdhexaadiyaan gaadiidka CSF, maadaama mabda' ahaan loo isticmaali karo in macromolecules loo geeyo CNS ama si loo furo dariiqooyin cusub oo qaataha ah. Gaar ahaan, qaataha gaarka ah iyo kuwa qaada nidaamka maskaxda (BBB iyo BSCFB) waxay u adeegi karaan bartilmaameedyo suurtagal ah oo loogu talagalay keenista firfircoon iyo gaarka ah ee daawooyinka bayoterabiga. Dareeraha maskaxda (CSF) waa wax soo saar qarsoon oo ka mid ah choroid plexus (CS) wuxuuna si toos ah ula xiriiraa dareeraha maskaxda iyada oo loo marayo booska subarachnoid iyo booska ventricular4. Dhawaan waxaa la muujiyay in dareeraha maskaxda ee subarachnoid uu si xad dhaaf ah ugu faafo interstitium-ka maskaxda9. Waxaan rajeyneynaa inaan galno booska barrenchymal annagoo adeegsanayna marin-haweedkan soo galaya ee subarachnoid ama si toos ah iyada oo loo marayo BBB. Si aan tan u gaarno, waxaan hirgelinay istiraatiijiyad xulasho oo xooggan oo ku saabsan habka in vivo phage kaas oo si fiican u aqoonsanaya peptides-ka ay qaadaan mid ka mid ah labadan waddo ee kala duwan.
Hadda waxaan ku qeexeynaa habka baaritaanka ee isku xigxiga ee phage-ka in vivo oo leh muunad CSF ah oo ay weheliso taxane sare oo wax soo saar ah (HTS) si loola socdo wareegyada xulashada bilowga ah oo leh kala duwanaanshaha maktabadda ugu sarreysa. Baaritaanka waxaa lagu sameeyay jiirar miyir qaba oo leh cannula weyn oo si joogto ah loogu beeray cisterna (CM) si looga fogaado wasakhowga dhiigga. Muhiimad ahaan, habkani wuxuu doortaa labadaba bartilmaameedka maskaxda iyo peptides oo leh dhaqdhaqaaqa gaadiidka ee ka gudba caqabadda maskaxda. Waxaan isticmaalnay phages-ka T7 sababtoo ah cabbirkooda yar (~ 60 nm)10 waxaanan soo jeedinay inay ku habboon yihiin qaadista vesicles-ka kuwaas oo u oggolaanaya ka gudubka unugyada unugyada ee xannibaadda endothelial iyo/ama epithelial-medulla. Ka dib afar wareeg oo duubis ah, dadka phage-ka ayaa la go'doomiyay iyagoo muujinaya kobcinta CSF ​​oo xooggan in vivo iyo isku xirnaanta microvessel-ka maskaxda. Muhiimad ahaan, waxaan awoodnay inaan xaqiijinno natiijooyinkeenna annagoo muujinayna in peptide-yada la doorbidayo oo kiimikada lagu sameeyay ay awood u leeyihiin inay qaadaan xamuulka borotiinka dareeraha maskaxda. Marka hore, saameynta daawada ee CNS waxaa lagu aasaasay iyadoo la isku darayo peptide transit ah oo hormuud ah iyo joojiye ka tirsan peptide-ka BACE1. Marka laga soo tago muujinta in istaraatiijiyadaha baaritaanka shaqada ee gudaha jirka ay aqoonsan karaan peptides-ka cusub ee gaadiidka maskaxda sida kuwa xamuulka borotiinka wax ku oolka ah, waxaan fileynaa in hababka xulashada shaqada ee la midka ah ay sidoo kale muhiim u noqon doonaan aqoonsashada waddooyinka cusub ee gaadiidka maskaxda.
Iyada oo ku saleysan cutubyada sameynta huurada (PFU), ka dib tallaabada baakadka phage, maktabad ka kooban peptides phage T7 linear 12-mer oo aan kala sooc lahayn oo leh kala duwanaansho qiyaastii 109 ah ayaa la naqshadeeyay oo la sameeyay (fiiri Qalabka iyo Hababka). Waa muhiim in la ogaado inaan si taxaddar leh u falanqeynay maktabaddan ka hor inta aan la samayn in vivo panning. Kordhinta PCR ee muunadaha maktabadda phage iyadoo la adeegsanayo amplicons-ka la beddelay ee la soo saaray kuwaas oo si toos ah loogu dabaqi jiray HTS (Sawirka Dheeraadka ah 1a). Sababtoo ah a) khaladaadka taxanaha HTS11, b) saameynta tayada primers-ka (NNK)1-12, iyo c) joogitaanka phage-ka nooca duurjoogta ah (qalfoofka la geliyo) ee maktabadda heeganka, habraac shaandhaynta taxanaha ah ayaa la hirgeliyay si loo soo saaro oo keliya macluumaadka taxanaha ah ee la xaqiijiyay (Sawirka Dheeraadka ah 1b). Tallaabooyinkan shaandhaynta waxay khuseeyaan dhammaan maktabadaha taxanaha HTS. Maktabadda caadiga ah, wadarta guud ee akhrinta waxaa la helay 233,868, kuwaas oo 39% ay ka gudbeen shuruudaha shaandhada waxaana loo isticmaalay falanqaynta maktabadda iyo xulashada wareegyada xiga (Jaantuska Dheeraadka ah 1c–e). Akhrisyadu waxay ahaayeen inta badan tirooyin 3 lammaane saldhig ah dherer ahaan iyadoo ugu sarreysa ay tahay 36 nucleotide (Jaantuska Dheeraadka ah 1c), taasoo xaqiijinaysa naqshadda maktabadda (NNK) 1-12. Waxaa xusid mudan, qiyaastii 11% xubnaha maktabadda waxay ka koobnaayeen 12-cabbir oo ah nooca duurjoogta ah (wt) oo la geliyay PAGISRELVDKL laf-dhabarta, ku dhawaad ​​​​kala bar taxanaha (49%) waxay ka koobnaayeen gelinta ama tirtirka. HTS ee maktabadda maktabadda waxay xaqiijisay kala duwanaanshaha sare ee peptides ee maktabadda: in ka badan 81% taxanaha peptide ayaa la helay hal mar oo keliya 1.5% oo keliya ayaa ka dhacay ≥4 nuqul (Jaantuska Dheeraadka ah 2a). Soo noqnoqoshada amino acids (aa) dhammaan 12ka boos ee ku jira repertoire-ka ayaa si fiican ula xiriiray soo noqnoqoshada la filayo tirada codons-ka ee ay soo saaraan repertoire-ka NKK ee burburay (Jaantuska Dheeraadka ah 2b). Soo noqnoqoshada la arkay ee haraaga aa ee lagu codeeyay gelintani waxay si fiican ula xiriirtay soo noqnoqoshada la xisaabiyay (r = 0.893) (Jaantuska Dheeraadka ah 2c). Diyaarinta maktabadaha phage-ka ee duritaanka waxaa ka mid ah tallaabooyinka kor u qaadista iyo ka saarista endotoxin. Tani waxaa hore loo muujiyay inay yareyn karto kala duwanaanshaha maktabadaha phage-ka12,13. Sidaa darteed, waxaan isku xigxignay maktabadda phage-ka ee lagu xoojiyay saxanka oo laga saaray endotoxin waxaana la barbar dhigay maktabadda asalka ah si loo qiyaaso soo noqnoqoshada AA. Xiriir xooggan (r = 0.995) ayaa la arkay inta u dhaxaysa barkadda asalka ah iyo barkadda la ballaariyay oo la safeeyey (Jaantuska Dheeraadka ah 2d), taasoo muujinaysa in tartanka u dhexeeya clones-ka lagu xoojiyay saxannada iyadoo la adeegsanayo phage-ka T7 uusan sababin eex weyn. Isbarbardhiggani wuxuu ku salaysan yahay inta jeer ee qaababka tripeptide ee maktabad kasta, maadaama kala duwanaanshaha maktabadaha (~109) aan si buuxda loo qaban karin xitaa HTS. Falanqaynta soo noqnoqoshada ee aa ee boos kasta waxay muujisay eex yar oo ku xiran booska saddexdii boos ee ugu dambeeyay ee dib-u-soo-celinta la geliyay (Jaantuska Dheeraadka ah 2e). Gunaanadkii, waxaan ku soo gabagabeynay in tayada iyo kala duwanaanshaha maktabadda ay ahaayeen kuwo la aqbali karo oo isbeddello yar yar oo kala duwanaanshuhu ay ahaayeen kuwo la arkay sababtoo ah ballaarinta iyo diyaarinta maktabadaha phage inta u dhaxaysa dhowr wareeg oo xulasho ah.
Muunad qaadashada dareeraha maskaxda ee taxanaha ah waxaa lagu samayn karaa iyadoo qalliin lagu gelinayo cannula CM ee jiirka miyir qaba si loo fududeeyo aqoonsiga fage-ka T7 ee lagu muday xididka (iv) iyada oo loo marayo BBB iyo/ama BCSFB (Sawirka 1a-b). Waxaan isticmaalnay laba gacmood oo xulasho madax-bannaan (gacmo A iyo B) saddexda wareeg ee ugu horreeya ee xulashada in vivo (Sawirka 1c). Waxaan si tartiib tartiib ah u kordhinay xoojinta xulashada annagoo yaraynayna wadarta guud ee fage-ka lagu soo bandhigay saddexda wareeg ee ugu horreeya ee xulashada. Wareeggii afraad ee foorarsiga, waxaan isku darnay muunado laga soo qaaday laamaha A iyo B waxaanan sameynay saddex xulasho oo madax-bannaan oo dheeraad ah. Si aan u baranno sifooyinka in vivo ee walxaha fage-ka T7 ee qaabkan, fage-ka nooca duurjoogta ah (PAGISRELVDKL master insert) ayaa lagu duray jiirka iyada oo loo marayo xididka dabada. Soo kabashada fage-yada laga soo qaaday dareeraha cerebrospinal iyo dhiigga waqtiyo kala duwan ayaa muujiyay in fage-yada icosahedral ee T7 ee yar yar ay lahaayeen marxalad degdeg ah oo nadiifin ah oo ka timid qaybta dhiigga (Sawirka Dheeraadka ah 3). Iyada oo lagu saleynayo titers-ka la siiyay iyo mugga dhiigga ee jiirka, waxaan xisaabinay in qiyaastii 1% wt. phage laga helay qiyaasta la siiyay laga helay dhiigga 10 daqiiqo ka dib duritaanka xididka. Ka dib hoos u dhacan degdegga ah ee bilowga ah, waxaa la cabbiray nadiifin hoose oo gaabis ah iyadoo nus-nololeedku yahay 27.7 daqiiqo. Waxaa muhiim ah, kaliya fages aad u yar ayaa laga soo qaatay qaybta CSF, taasoo muujinaysa asal hoose oo loogu talagalay u guurista fages-ka nooca duurjoogta ah ee qaybta CSF (Jaantuska Dheeraadka ah 3). Celcelis ahaan, kaliya qiyaastii 1 x 10-3% titers oo fages-ka T7 ah oo ku jira dhiigga iyo 4 x 10-8% ee fages-ka markii hore la geliyay ayaa laga helay dareeraha cerebrospinal muddada muunadda oo dhan (0-250 daqiiqo). Waxaa xusid mudan, nus-nololeed (25.7 daqiiqo) ee fages-ka nooca duurjoogta ah ee dareeraha cerebrospinal wuxuu la mid ahaa kan lagu arkay dhiigga. Xogtani waxay muujinaysaa in caqabadda kala soocda qaybta CSF iyo dhiigga ay ku jirto jiirka lagu dahaadhay CM, taasoo u oggolaanaysa in vivo xulashada maktabadaha phage-ka si loo aqoonsado unugyada si fudud looga qaado dhiigga una gudbiyo qaybta CSF.
(a) Dejinta hab dib loogu qaado muunad qaadashada dareeraha maskaxda (CSF) laga bilaabo barkad weyn. (b) Jaantus muujinaya goobta unugyada ee xannibaadda habdhiska neerfaha dhexe (CNS) iyo istaraatiijiyadda xulashada ee loo isticmaalo in lagu aqoonsado peptides-ka ka gudba xannibaadda dhiigga-maskaxda (BBB) ​​​​iyo xannibaadda dhiigga-maskaxda. (c) Shaxda socodka baaritaanka bandhigga phage-ka ee In vivo. Wareeg kasta oo xulasho ah, phages (aqoonsiga xayawaanka ee ku jira fallaadhaha) ayaa lagu duray xididka. Laba laamood oo beddel ah oo madax-bannaan (A, B) ayaa si gaar ah loo hayaa ilaa wareegga 4aad ee xulashada. Wareegyada xulashada 3aad iyo 4aad, phage-ka kasta oo laga soo saaray CSF waxaa gacanta lagu sameeyay isku xigxiga. (d) Kinetics-ka phage-ka ee laga soocay dhiigga (goobaabinta cas) iyo dareeraha maskaxda (saddex-xagalka cagaaran) inta lagu jiro wareegga koowaad ee xulashada laba jiir oo cannulated ah ka dib duritaanka xididka ee maktabadda peptide T7 (2 x 1012 phages/xayawaan). Labajibbaarane buluug ah ayaa tilmaamaya celceliska isku-darka bilowga ah ee phage-ka ee dhiigga, oo laga xisaabiyay xaddiga phage-ka la duray, iyadoo la tixgelinayo wadarta mugga dhiigga. Labajibbaarane madow waxay tilmaamayaan barta isgoyska xariiqda y ee laga soo saaray fiirsashada phage-ka dhiigga. (e,f) Soo bandhig soo noqnoqoshada qaraabada ah iyo qaybinta dhammaan qaababka tripeptide ee is dulsaaran ee laga helo peptide-ka. Tirada qaababka laga helay 1000 akhrin ayaa la muujiyay. Si muhiim ah (p < 0.001) qaababka hodanka ah waxaa lagu calaamadeeyay dhibco cas. (e) Kala-baxa isku-dhafka ah ee isbarbardhigaya soo noqnoqoshada qaraabada ah ee qaabka tripeptide-ka ee maktabadda la duray oo leh phage-ka dhiigga laga soo qaatay xayawaanka #1.1 iyo #1.2. (f) Kala-baxa isku-dhafka ah ee isbarbardhigaya soo noqnoqoshada qaraabada ah ee qaababka tripeptide-ka ee phage-ka xayawaanka #1.1 iyo #1.2 oo lagu go'doomiyay dhiigga iyo dareeraha maskaxda. (g, h) Matalaadda Aqoonsiga Taxanaha ee phage-ka lagu hodanka ah ee dhiigga (g) iyo maktabadaha la duray iyo phage-ka lagu hodanka ah ee CSF (h) iyo dhiigga ka dib wareeg ah xulashada in vivo ee labada xayawaan. Cabbirka koodka hal-xaraf ah wuxuu muujinayaa inta jeer ee amino acid-ku ka dhaco booskaas. Cagaar = cidhif, guduud = dhexdhexaad, buluug = aasaasi ah, casaan = aashito iyo madow = aashitooyin hydrophobic ah. Jaantuska 1a, b waxaa naqshadeeyay oo soo saaray Eduard Urich.
Waxaan ku duray maktabad peptide phage ah laba jiir oo qalabka CM ah (clades A iyo B) iyo phage go'doonsan oo ka yimid dareeraha iyo dhiigga maskaxda (Jaantuska 1d). Bilawga degdegga ah ee maktabadda ayaa si yar u muuqday marka loo eego phage-ka nooca duurjoogta ah. Celceliska nus-nololeedka maktabadda la duray ee labada xayawaan wuxuu ahaa 24.8 daqiiqo oo dhiig ah, oo la mid ah phage-ka nooca duurjoogta ah, iyo 38.5 daqiiqo oo CSF ​​ah. Muunadaha phage-ka dhiigga iyo dareeraha maskaxda ee laga soo qaaday xayawaan kasta waxaa lagu sameeyay HTS dhammaan peptide-yada la aqoonsadayna waxaa lagu falanqeeyay jiritaanka phage-ka tripeptide-ka gaaban. phage-yada Tripeptide-ka ayaa la doortay sababtoo ah waxay bixiyaan saldhig yar oo loogu talagalay sameynta qaab-dhismeedka iyo isdhexgalka peptide-protein14,15. Waxaan helnay isku xirnaan wanaagsan oo ku saabsan qaybinta motifs-ka u dhexeeya maktabadda phage-ka la duray iyo clones-ka laga soo saaray dhiigga labada xayawaan (Jaantuska 1e). Xogtu waxay tilmaamaysaa in halabuurka maktabadda uu si yar u hodan yahay qaybta dhiigga. Soo noqnoqoshada amino acid-ka iyo taxanaha isku raacsanaanta ayaa si dheeraad ah loogu falanqeeyay boos kasta iyadoo la adeegsanayo la qabsiga barnaamijka Weblogo16. Waxa xiiso leh, waxaan helnay koboc xooggan oo ku jira haraaga glycine ee dhiigga (Jaantuska 1g). Markii dhiigga la barbar dhigay koodhka laga soo xulay CSF, waxaa la arkay xulasho xooggan iyo qaar ka mid ah kala-goynta noocyada (Jaantuska 1f), amino acids-ka qaarkoodna waxay si gaar ah ugu jireen boosas hore loo sii qorsheeyay oo ku jira 12-ka xubnood (Jaantuska 1h). Waxaa xusid mudan, xayawaannada shaqsiga ah waxay si weyn ugu kala duwanaayeen dareeraha maskaxda, halka kobcinta glycine ee dhiigga lagu arkay labada xayawaan (Jaantuska Dheeraadka ah 4a–j). Ka dib markii si adag loo shaandheeyay xogta taxanaha ah ee dareeraha maskaxda ee xayawaanka #1.1 iyo #1.2, wadarta guud ee 964 iyo 420 peptides 12-mer gaar ah ayaa la helay (Jaantuska Dheeraadka ah 1d–e). Koodhka fage-ka ee go'doonsan ayaa la ballaariyay waxaana la mariyay wareeg labaad oo ah xulashada in vivo. Qaybta laga soo saaray wareegga labaad ee xulashada waxaa lagu sameeyay HTS xayawaan kasta, dhammaan peptide-yada la aqoonsadayna waxaa loo isticmaalay sidii wax lagu gelinayo barnaamijka aqoonsiga motif-ka si loo falanqeeyo dhacdooyinka motif-yada tripeptide (Jaantuska 2a, b, ef). Marka la barbardhigo wareegga koowaad ee fage-ka laga soo helay CSF, waxaan aragnay xulasho dheeraad ah iyo kala-goyn motifyo badan oo ku jira CSF laamaha A iyo B (Jaantuska 2). Algorithm-ka aqoonsiga shabakadda ayaa la adeegsaday si loo go'aamiyo inay matalaan qaabab kala duwan oo isku xigxig ah. Isku ekaanshaha cad ayaa la arkay inta u dhaxaysa taxanaha 12-cabbirka ah ee ay soo ceshatay CSF ee clade-ka kale ee A (Jaantuska 2c, d) iyo clade B (Jaantuska 2g, h). Falanqaynta la isku daray ee laan kasta waxay muujisay astaamo kala duwan oo xulasho ah oo loogu talagalay peptides 12-mer (Jaantuska Dheeraadka ah 5c, d) iyo kororka saamiga CSF/titer-ka dhiigga waqti ka dib clones-ka la isku daray ka dib wareegga labaad ee xulashada marka la barbar dhigo wareegga koowaad ee xulashada (Jaantuska Dheeraadka ah 5e).).
Kobcinta qaababka iyo peptides-ka dareeraha maskaxda iyadoo la adeegsanayo laba wareeg oo isku xiga oo ah xulashada bandhigga phage-ka ee firfircoon ee in vivo.
Dhammaan fajiyada dareeraha maskaxda ee laga soo helay wareeggii koowaad ee xayawaan kasta (xayawaanka #1.1 iyo #1.2) waxaa la isku daray, la ballaariyay, la isku daray HT oo dib loogu duray (2 x 1010 fajis/xayawaan) 2 jiir oo SM ah oo la dahaadhay (#1.1 → #). 2.1 iyo 2.2, 1.2 → 2.3 iyo 2.4). (a,b,e,f) Kala firdhinta isku xidhka oo barbar dhigaya inta jeer ee fajiyada tripeptide ee dhammaan fajiyada laga soo qaatay CSF wareegyada xulashada koowaad iyo labaad. Soo noqnoqoshada qaraabada iyo qaybinta fajiyada oo matalaya dhammaan tripeptides-ka is dulsaaran ee suurtagalka ah ee laga helo peptides labada jiho. Tirada fajiyada laga helay 1000 akhrin ayaa la muujiyay. Fajiyada si weyn loo doortay (p < 0.001) ama laga saaray mid ka mid ah maktabadaha la barbar dhigay waxaa lagu iftiimiyay dhibco cas. (c, d, g, h) Matalaadda astaanta taxanaha ah ee dhammaan taxanaha dheer ee amino acid-ka hodanka ku ah CSF ee ku salaysan wareegyada 2 iyo 1 ee xulashada in vivo. Cabbirka koodhka hal-xaraf ah wuxuu tilmaamayaa inta jeer ee amino acid-kaas uu ka dhaco booskaas. Si loo matalo astaanta, inta jeer ee taxanaha CSF ee laga soo saaray xayawaanka shaqsiga ah inta u dhaxaysa laba wareeg oo xulasho ah ayaa la barbar dhigayaa taxanaha la kobciyay ee wareegga labaadna waxaa la tusayaa: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 iyo (h) #1.2–#2.4. Amino acids-ka ugu hodansan booska la siiyay ee (c, d) xayawaanka lambar 2.1 iyo lambarka 2.2 ama (g, h) ee xayawaanka lambar 2.3 iyo lambarka 2.4 waxaa lagu muujiyay midab. Cagaar = cidhif, guduud = dhexdhexaad, buluug = aasaasi ah, casaan = aashito iyo madow = aashito amino hydrophobic ah.
Ka dib wareegii saddexaad ee xulashada, waxaan aqoonsannay 124 taxane peptide gaar ah (#3.1 iyo #3.2) laga soo bilaabo 332 xirmooyin phage ah oo dib loo habeeyay oo CSF ​​ah oo laga soocay laba xayawaan (Jaantuska Dheeraadka ah ee 6a). Taxanaha LGSVS (18.7%) wuxuu lahaa saamiga ugu sarreeya ee qaraabada, waxaana ku xigay gelitaannada nooca duurjoogta ah ee PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), iyo SARGSWREIVSLS (2.2%). Wareeggii afraad ee ugu dambeeyay, waxaan isku darnay laba laamood oo si madax-bannaan loo soo xulay saddex xayawaan oo kala duwan (Jaantuska 1c). 925 xirmooyin phage ah oo taxane ah oo laga soo helay CSF, wareegii afraad waxaan ka helnay 64 taxane peptide gaar ah (Jaantuska Dheeraadka ah ee 6b), kuwaas oo ka mid ah saamiga qaraabada ah ee nooca duurjoogta ah uu hoos ugu dhacay 0.8%. Xididdada CSF ee ugu badan wareega afraad waxay ahaayeen LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) iyo RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %). Kala duwanaanshaha dhererka peptide-yada la xushay waxay sabab u tahay gelinta/tirtirka nucleotide ama codons-ka joojinta ee dhicis ah ee ku jira hordhaca maktabadda marka la isticmaalayo codons-ka xumaaday ee naqshadeynta maktabadda NNK. Codons-ka joojinta ee dhicis ah waxay soo saaraan peptides-ka gaaban waxaana la doortaa sababtoo ah waxay ka kooban yihiin motif-ka wanaagsan ee aa. Peptides-ka dheer waxay ka dhalan karaan gelinta/tirtirka astaamaha gudaha maktabadaha isku-dhafka ah. Tani waxay dhigtaa codon-ka joojinta ee loogu talagalay meel ka baxsan qaab-dhismeedka waxayna akhrinaysaa ilaa codon-ka joojinta ee cusub uu ka soo muuqdo dhinaca hoose. Guud ahaan, waxaan xisaabinay arrimaha kobcinta ee dhammaan afarta wareeg ee xulashada annagoo isbarbar dhigeyna xogta gelinta iyo xogta wax soo saarka muunadda. Wareeggii koowaad ee baaritaanka, waxaan u isticmaalnay titers-ka nooca duurjoogta ah tixraac aan gaar ahayn oo asal ah. Waxaa xiiso leh, xulashada phage-ka taban aad bay u xoog badnayd wareegga CSF ee ugu horreeyay, laakiin ma ahayn dhiigga (Jaantuska 3a), taas oo laga yaabo inay sabab u tahay fursadda yar ee faafinta dadban ee xubnaha badan ee maktabadda peptide-ka ee qaybta CSF ama phages-ka qaraabada ah waxay u muuqdaan inay si hufan u hayaan ama uga saaraan dhiigga marka loo eego bakteeriyada. Si kastaba ha ahaatee, wareegii labaad ee duubista, xulasho xooggan oo phages ah oo ku jira CSF ayaa lagu arkay labada qaybood, taasoo soo jeedinaysa in wareegii hore lagu hodaneeyay phages-ka muujinaya peptides-ka kor u qaada qaadashada CSF (Jaantuska 3a). Mar labaad, iyada oo aan lahayn kobcin dhiig oo muhiim ah. Sidoo kale wareegyadii saddexaad iyo afraad, phage-ka ayaa si weyn loogu hodaneeyay CSF. Marka la barbardhigo soo noqnoqoshada qaraabada ah ee taxanaha peptide kasta oo gaar ah inta u dhaxaysa labadii wareeg ee ugu dambeeyay ee xulashada, waxaan ogaanay in taxanaha uu aad uga hodansanaa wareegii afraad ee xulashada (Jaantuska 3b). Wadarta 931 nooc oo tripeptide ah ayaa laga soo saaray dhammaan 64-ta taxane ee peptide-ka gaarka ah iyadoo la adeegsanayo labada jiho ee peptide-ka. Qaababka ugu qanisan wareegga afraad ayaa si dhow loogu baaray qaab-dhismeedkooda kobcinta dhammaan wareegyada marka la barbar dhigo maktabadda la duray (jarista: kobcinta 10%) (Jaantuska Dheeraadka ah ee 6c). Qaababka guud ee xulashada ayaa muujiyay in inta badan ujeeddooyinka la bartay lagu kobciyay dhammaan wareegyadii hore ee labada laamood ee xulashada. Si kastaba ha ahaatee, qaabab qaar (tusaale ahaan SGL, VSG, LGS GSV) waxay inta badan ka yimaadeen clade kale A, halka kuwa kale (tusaale ahaan FGW, RTN, WGF, NTR) lagu kobciyay clade kale B.
Xaqiijinta rarista CSF ee peptides-ka lagu soo bandhigay fage-ka ee CSF iyo peptides-ka hoggaamiyaha biotinylated ee ku xiran culayska streptavidin.
(a) Saamiyada kobcinta ee lagu xisaabiyay dhammaan afarta wareeg (R1-R4) iyadoo lagu saleynayo titers-ka la isku duro (gelinta = I) phage (PFU) iyo titers-ka phage ee CSF ee la go'aamiyay (wax soo saar = O). Arrimaha kobcinta ee saddexdii wareeg ee ugu dambeeyay (R2-R4) waxaa lagu xisaabiyay iyadoo la barbar dhigayo wareeggii hore iyo wareegii koowaad (R1) oo leh xogta miisaanka. Baararka furan waa dareeraha maskaxda, baararka hadhsan waa balaasma. (***p<0.001, iyadoo lagu saleynayo imtixaanka t-ga ee Ardayga). (b) Liiska peptide-yada phage-ka ugu badan, oo lagu kala saaray iyadoo loo eegayo saamiga ay la leeyihiin dhammaan phages-ka lagu soo ururiyey CSF ka dib wareegga 4aad ee xulashada. Lixda phage-ka ugu badan waxaa lagu iftiimiyay midab, lambarro iyo arrimo kobcintooda inta u dhaxaysa wareegyada 3aad iyo 4aad ee xulashada (insets). (c,d) Lixda phage-ka ugu hodansan, phage-ka madhan iyo maktabadaha peptide-ka phage ee waalidka laga soo bilaabo wareegga 4aad waxaa si gaar ah loogu falanqeeyay qaabka muunadda CSF. Muunadaha CSF iyo dhiig ayaa la ururiyay waqtiyada la tilmaamay. (c) Xaddi siman oo ah 6 xabbo oo fage ah (2 x 1010 fage/xayawaan), fage madhan (#1779) (2 x 1010 fage/xayawaan) iyo maktabadaha peptide-ka ee fage (2 x 1012 fage/xayawaan). Ku dur ugu yaraan 3 CM xayawaanka la shubay si gaar ah iyada oo loo marayo xididka dabada. Farmashiyaha CSF ee fage clone kasta oo la duray iyo maktabadda peptide-ka ee fage waqti ka dib ayaa la muujiyay. (d) waxay muujinaysaa celceliska saamiga CSF/dhiig ee dhammaan fage-yada la soo celiyay/mL muddada muunadda. (e) Afar peptides oo hoggaamiye macmal ah iyo hal xakameyn la isku qasay ayaa lala xiriiriyay biotin streptavidin iyada oo loo marayo N-terminus (bandhigga tetramer) oo ay ku xigto duritaan (xididka dabada iv, 10 mg streptavidin/kg). Ugu yaraan saddex jiir oo la shubay (N = 3).). Shaybaarada CSF waxaa la soo ururiyay waqtiyada la tilmaamay, fiirsashada streptavidin waxaa lagu cabiray CSF anti-streptavidin ELISA (nd = lama ogaan). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, iyadoo lagu saleynayo tijaabada ANOVA). (f) Isbarbardhigga taxanaha amino acid ee phage peptide clone #2002 (guduud) iyo phage peptide clones kale oo la soo xulay laga soo bilaabo wareega 4aad ee xulashada. Qaybaha amino acid ee isku midka ah iyo kuwa la midka ah waxaa lagu calaamadeeyay midab.
Dhammaan fajiyada la kobciyay ee wareegga afraad (Jaantuska 3b), lix faji oo musharrax ah ayaa loo xushay falanqayn shaqsiyeed oo dheeraad ah oo ku saabsan qaabka muunadda CSF. Tiro siman oo lix faji oo musharrax ah, faji madhan (aan la gelin) iyo maktabadaha peptide-ka prophage ayaa lagu duray saddex xayawaan oo CM ah oo la dahaadhay, farmashiyahana waxaa lagu go'aamiyay tijaabooyinka CSF (Jaantuska 3c) iyo dhiigga (Jaantuska Dheeraadka ah ee 7). Dhammaan fajiyada la tijaabiyay waxay bartilmaameedsadeen qaybta CSF heer 10-1000 jeer ka sarreeya kan fajiyada xakamaynta madhan (#1779). Tusaale ahaan, fajiyada #2020 iyo #2077 waxay lahaayeen qiyaastii 1000 jeer oo ka sarreeya titers-ka CSF marka loo eego fajiyada xakamaynta. Astaamaha farmashiyaha ee peptide kasta oo la doortay waa ka duwan yahay, laakiin dhammaantood waxay leeyihiin awood homing CSF oo sare. Waxaan aragnay hoos u dhac joogto ah oo ku yimid unugyada #1903 iyo #2011, halka unugyada #2077, #2002 iyo #2009 ay kordhiyeen 10-kii daqiiqo ee ugu horreeyay waxay muujin karaan gaadiid firfircoon laakiin waa in la xaqiijiyaa. Noocyada #2020, #2002, iyo #2077 waxay ku xasileen heerar sare, halka kuwa CSF ee unugyada #2009 ay si tartiib tartiib ah hoos ugu dhaceen ka dib kororka bilowga ah. Kadib waxaan isbarbar dhignay inta jeer ee musharax kasta oo CSF ​​ah iyo kuwa dhiigga ku jira (Jaantuska 3d). Isku xirnaanta celceliska tirada musharax kasta oo CSF ​​ah iyo kuwa dhiigga ku jira dhammaan waqtiyada muunadda ayaa muujisay in saddex ka mid ah lixda musharax ay si weyn ugu hodansan yihiin dhiigga CSF. Waxaa xiiso leh, unugyada #2077 waxay muujiyeen xasillooni dhiig oo sarreysa (Jaantuska Dheeraadka ah 7). Si loo xaqiijiyo in peptides-ku laftoodu ay awood u leeyihiin inay si firfircoon u qaadaan xamuulka aan ahayn walxaha unugyada ee unugyada CSF, waxaan soo saarnay afar peptides oo hormuud ah oo laga soo saaray biotin oo ku yaal N-terminus halkaas oo peptide-yadu ay ku dhegaan walxaha unugyada. Peptides-ka biotinylated (lambarrada 2002, 2009, 2020 iyo 2077) ayaa lagu daray streptavidin (SA) si loo helo qaabab badan oo isku mid ah oo u eg qaab-dhismeedka phage. Qaabkani wuxuu sidoo kale noo oggolaaday inaan cabbirno soo-gaadhista SA ee dhiigga iyo dareeraha maskaxda sida peptides-ka borotiinka qaada xamuulka. Waxaa muhiim ah, xogta phage-ka badanaa waa la soo saari karaa marka peptides-ka synthetic-ga lagu maamulo qaabkan isku-xidhan ee SA (Jaantuska 3e). Peptides-ka la shiiday waxay lahaayeen soo-gaadhis hore oo yar iyo nadiifinta CSF oo dhakhso badan oo leh heerar aan la ogaan karin 48 saacadood gudahood. Si aan u helno aragti ku saabsan waddooyinka keenista ee peptide-yadan phage-ka ee loo diro booska CSF, waxaan falanqeynay meelaynta peptide-ka shaqsiga ah ee phage-ka iyadoo la adeegsanayo immunohistochemistry (IHC) si toos ah loogu ogaado walxaha phage-ka 1 saac ka dib duritaanka xididka ee vivo. Waxaa xusid mudan in tirooyinka #2002, #2077, iyo #2009 lagu ogaan karo midabayn xooggan oo ku jirta xididdada maskaxda, halka phage-ka xakamaynta (#1779) iyo tirooyinka #2020 aan la ogaan (Jaantuska Dheeraadka ah 8). Tani waxay soo jeedinaysaa in peptide-yadani ay gacan ka geystaan ​​​​saamaynta maskaxda si sax ah iyagoo ka gudbaya BBB. Falanqayn faahfaahsan oo dheeraad ah ayaa loo baahan yahay si loo tijaabiyo mala-awaalkan, maadaama wadada BSCFB ay sidoo kale ku lug yeelan karto. Marka la barbar dhigo taxanaha amino acid ee tirooyinka ugu hodansan (#2002) iyo peptides kale oo la xushay, waxaa la ogaaday in qaar ka mid ah ay leeyihiin fidin amino acid oo la mid ah, taasoo muujin karta farsamo gaadiid oo la mid ah (Jaantuska 3f).
Sababtoo ah muuqaalkeeda balaasmaha gaarka ah iyo kororka weyn ee CSF waqti ka dib, phage display clone #2077 ayaa si dheeraad ah loo sahamiyay muddo 48-saacadood ah waxayna awood u yeelatay inay soo saarto kororka degdegga ah ee CSF ee la arkay iyadoo lala xiriirinayo heerarka SA ee joogtada ah (Jaantuska 4a). Marka laga hadlayo phage clones kale oo la aqoonsaday, #2077 si xoog leh ayaa loogu rinjiyeeyay xididdada maskaxda waxayna muujisay isku-xidhnaan muhiim ah oo leh lectin calaamadeeyaha xididdada dhiigga marka la eego xallinta sare iyo suurtogalnimada midabaynta booska laf-dhabarta (Jaantuska 4b). Si loo baaro in saameynta daawada ee dhexdhexaadka ah ee peptide laga heli karo CNS, waxaan sameynay tijaabo kaas oo noocyada biotinylated ee i) peptide transit #2077 iyo ii) peptide-ka BACE1 ee joojiya lagu qasay SA laba saami oo kala duwan. Hal isku-darka waxaan isticmaalnay oo keliya BACE1 peptide inhibitor kan kalena waxaan isticmaalnay saamiga 1:3 ee BACE1 peptide inhibitor ilaa #2077 peptide. Labada muunadoodba waxaa lagu shubay xididka, heerarka dhiigga iyo dareeraha maskaxda ee beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) ayaa la cabbiray waqti ka dib. Abeta40 waxaa lagu cabiray CSF maadaama ay ka tarjumayso joojinta BACE1 ee maskaxda. Sida la filayay, labada isku-dhafanba si weyn ayay u yareeyeen heerarka dhiigga ee Abeta40 (Sawirka 4c, d). Si kastaba ha ahaatee, muunado ka kooban isku-darka peptide no. 2077 iyo joojiye peptide BACE1 oo ku xiran SA ayaa sababay hoos u dhac weyn oo ku yimid Abeta40 ee dareeraha maskaxda (Sawirka 4c). Xogtu waxay muujinaysaa in peptide no. 2077 uu awood u leeyahay inuu borotiinka 60 kDa SA u qaado CNS sidoo kalena uu kiciyo saameyn daawo oo leh daawooyinka ka hortagga SA ee isku-dhafan ee peptide BACE1.
(a) Cirbadda Clonal (2 × 10 phages/xayawaan) ee fage-ka T7 oo muujinaya astaamaha daawada muddada dheer ee peptide-ka CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) iyo fage-ka xakamaynta aan la durin (#1779) ugu yaraan saddex jiir oo CM-intubated ah. (b) Sawirka mikroskoobka ee isku-dhafka ah ee microvessels-ka cortical-ka ee matalaya jiirarka lagu duray fage-ka (2 × 10 10 phages/xayawaan) oo muujinaya midabaynta peptide #2077 iyo xididdada dhiigga (lectin). Fage-yadan waxaa la siiyay 3 jiir waxaana loo oggolaaday inay ku wareegaan 1 saac ka hor inta aan la shubin. Maskaxda waxaa la kala saaray oo lagu rinjiyeeyay antibodies-ka polyclonal FITC-ka ee ka dhanka ah fage-ka T7. Toban daqiiqo ka hor inta aan la shubin iyo hagaajinta ka dib, lectin-ka lagu calaamadeeyay DyLight594 ayaa si xididada loogu shubay. Sawirrada dhalaalaya oo muujinaya rinjiga lectin (casaan) ee dhinaca iftiinka ee microvessels iyo phages (cagaar) ee lumen-ka xididdada dhiigga iyo unugyada maskaxda ee perivascular. Barka miisaanka wuxuu u dhigmaa 10 µm. (c, d) Biotinylated BACE1 inhibitor peptide keligiis ama iyadoo lagu darayo biotinylated transit peptide #2077 waxaa lagu xidhay streptavidin ka dibna waxaa lagu duray ugu yaraan saddex jiir oo CM ah oo la dahaadhay (10 mg streptavidin/kg). Hoos u dhaca dhexdhexaadinta BACE1 peptide inhibitor ee Aβ40 waxaa lagu cabiray Aβ1-40 ELISA dhiigga (casaanka) iyo dareeraha maskaxda (liimiga) waqtiyada la tilmaamay. Si loo helo caddayn wanaagsan, xariiq dhibco leh ayaa lagu sawiray garaafka miisaan dhan 100%. (c) Boqolkiiba hoos u dhaca Aβ40 ee dhiigga (saddex-xagalka cas) iyo dareeraha maskaxda (saddex-xagalka oranji) ee jiirka lagu daweeyay streptavidin oo lagu daray peptide transit #2077 iyo peptide-ka BACE1 ee xakamaynta saamiga 3:1. (d) Boqolkiiba hoos u dhaca dhiigga Aβ40 (goobaabin cas) iyo dareeraha maskaxda (goobaabin oranji) ee jiirka lagu daweeyay streptavidin oo lagu daray peptide-ka xakamaynta BACE1 oo keliya. Xoogga Aβ ee xakamaynta wuxuu ahaa 420 pg/ml (kala-goynta caadiga ah = 101 pg/ml).
Bandhigga wejiga ayaa si guul leh loogu adeegsaday dhowr meelood oo cilmi-baaris bayooloji ah17. Habkan waxaa loo isticmaalay daraasadaha kala duwanaanshaha xididdada dhiigga ee gudaha jirka18,19 iyo sidoo kale daraasadaha lagu bartilmaameedsanayo xididdada maskaxda20,21,22,23,24,25,26. Daraasaddan, waxaan ku ballaarinay adeegsiga habkan xulashada ma aha oo kaliya aqoonsiga tooska ah ee peptides-ka bartilmaameedsanaya xididdada maskaxda, laakiin sidoo kale helitaanka musharixiinta leh astaamaha gaadiidka firfircoon si ay uga gudbaan caqabadda dhiigga-maskaxda. Hadda waxaan ku sharxeynaa horumarinta habka xulashada in vivo ee jiirka la geliyay CM waxaanan muujineynaa awooddeeda lagu aqoonsan karo peptides-ka leh sifooyinka hoyga CSF. Annagoo adeegsanayna fage-ka T7 oo muujinaya maktabad ka kooban peptides aan kala sooc lahayn oo 12-mer ah, waxaan awoodnay inaan muujinno in fage-ka T7 uu yar yahay (qiyaastii 60 nm dhexroor ahaan)10 si loogu waafajiyo caqabadda dhiigga-maskaxda, sidaas darteedna si toos ah uga gudbaya caqabadda dhiigga-maskaxda ama plexus-ka choroid. Waxaan aragnay in ka soo goosashada CSF ee jiirka CM ee la dahaadhay ay ahayd hab baaritaan oo si fiican loo xakameeyey oo shaqeynaya, iyo in fage-ka la soo saaray uusan kaliya ku xirnayn xididdada dhiigga laakiin sidoo kale uu u shaqeynayay sidii qaadiye ka gudbaya caqabadda dhiigga-maskaxda. Intaa waxaa dheer, annagoo isku mar ururinayna dhiigga oo aan HTS ku marinaynay CSF ​​iyo fage-yada dhiigga laga soo qaado, waxaan xaqiijinay in doorashadayada CSF aysan saameyn ku yeelan kobcinta dhiigga ama taam ahaanshaha ballaarinta inta u dhaxaysa wareegyada xulashada. Si kastaba ha ahaatee, qaybta dhiiggu waa qayb ka mid ah habka xulashada, maadaama fage-yada awood u leh inay gaaraan qaybta CSF ay tahay inay ku noolaadaan oo ay ku wareegaan dhiigga muddo ku filan si ay naftooda ugu kobciyaan maskaxda. Si aan uga soo saarno macluumaad isku xigxig ah oo la isku halleyn karo xogta HTS ee cayriin, waxaan hirgelinay shaandheynno loo habeeyey khaladaadka isku xigxiga ee gaarka ah ee socodka shaqada falanqaynta. Annagoo ku darnay xuduudaha kinetic-ga habka baaritaanka, waxaan xaqiijinay farmashiyada degdega ah ee fage-yada T7 ee nooca duurjoogta ah (t½ ~ 28 daqiiqo) ee dhiigga24, 27, 28 waxaanan sidoo kale go'aaminay nus-nololeedkooda dareeraha maskaxda (t½ ~ 26 daqiiqo) daqiiqaddii). Iyadoo ay jiraan astaamo isku mid ah oo farmashiyaha ah oo ku jira dhiigga iyo CSF, kaliya 0.001% oo ka mid ah fiirsashada dhiigga ee fage ayaa laga ogaan karaa CSF, taasoo muujinaysa dhaqdhaqaaq hoose oo asal ah oo fage T7 ah oo ka gudba caqabadda dhiigga-maskaxda. Shaqadani waxay iftiiminaysaa muhiimadda wareegga koowaad ee xulashada marka la isticmaalayo istaraatiijiyadaha fage-ka ee in vivo, gaar ahaan nidaamyada fage-ka ee si degdeg ah looga nadiifiyo wareegga, maadaama tiro yar oo fage-ka ah ay awoodaan inay gaaraan qaybta CNS. Sidaa darteed, wareegii koowaad, hoos u dhaca kala duwanaanshaha maktabadda ayaa aad u weynaa, maadaama tiro kooban oo fage-ka ah ugu dambeyntii lagu soo ururiyay qaabkan aadka u adag ee CSF. Istaraatiijiyaddan fage-ka ee in vivo waxaa ka mid ahaa dhowr tallaabo oo xulasho ah sida ururinta firfircoon ee qaybta CSF, badbaadada fage-ka ee qaybta dhiigga, iyo ka saarista degdegga ah ee fage-ka T7 ee dhiigga 10-kii daqiiqo ee ugu horreeyay (Jaantuska 1d iyo Sawirka Dheeraadka ah 4M). ). Sidaa darteed, ka dib wareegii koowaad, fage-ka kala duwan ayaa lagu aqoonsaday CSF, inkastoo isla barkaddii hore loo isticmaalay xayawaan shaqsiyeed. Tani waxay soo jeedinaysaa in tallaabooyin badan oo adag oo xulasho ah oo loogu talagalay maktabadaha ilaha oo leh tiro badan oo xubno maktabad ah ay keenaan hoos u dhac weyn oo ku yimaada kala duwanaanshaha. Sidaa darteed, dhacdooyinka aan kala sooca lahayn waxay noqon doonaan qayb muhiim ah oo ka mid ah habka xulashada bilowga ah, taasoo si weyn u saameynaysa natiijada. Waxay u badan tahay in qaar badan oo ka mid ah nuqullada maktabadda asalka ah ay lahaayeen u janjeera kobcinta CSF oo aad u la mid ah. Si kastaba ha ahaatee, xitaa xaaladaha tijaabada ah ee isku midka ah, natiijooyinka xulashada way kala duwanaan karaan sababtoo ah tirada yar ee nuqul kasta oo gaar ah oo ku jira barkadda bilowga ah.
Noocyada ku hodanka ah CSF way ka duwan yihiin kuwa dhiigga ku jira. Waxaa xiiso leh, waxaan xusnay isbeddelka ugu horreeya ee loo qaaday peptides-ka hodanka ku ah glycine ee dhiigga xayawaanka shaqsiga ah. (Jaantuska 1g, Jaantusyada Dheeraadka ah. 4e, 4f). Phage-ka ay ku jiraan peptides-ka glycine ayaa laga yaabaa inay aad u xasilloon yihiin oo ay u yar tahay in laga saaro wareegga dhiigga. Si kastaba ha ahaatee, peptides-kan hodanka ku ah glycine laguma ogaan muunadaha dareeraha maskaxda, taasoo soo jeedinaysa in maktabadaha la diyaariyey ay soo mareen laba tallaabo oo kala duwan oo xulasho ah: mid dhiigga ku jira mid kalena loo oggolaaday inuu ku ururo dareeraha maskaxda. Clones-ka hodanka ku ah CSF ee ka dhashay wareegga afraad ee xulashada ayaa si ballaaran loo tijaabiyay. Ku dhawaad ​​​​dhammaan clones-ka si gaar ah loo tijaabiyay ayaa la xaqiijiyay inay ku hodan yihiin CSF marka la barbar dhigo phage-ka xakamaynta madhan. Hal peptide hit (#2077) ayaa si faahfaahsan loo baaray. Waxay muujisay cimri badh ah oo balaasma ah oo dheer marka la barbar dhigo hits-ka kale (Jaantuska 3d iyo Jaantuska Dheeraadka ah 7), waxaana xiiso leh, peptide-kani wuxuu ka koobnaa haraaga cysteine ​​​​ee C-terminus. Dhawaan ayaa la muujiyay in ku darista cysteine ​​​​ee peptides ay horumarin karto sifooyinkooda farmashiyaha iyagoo ku xiraya albumin 29. Tani hadda lama yaqaan peptide #2077 waxayna u baahan tahay daraasad dheeraad ah. Qaar ka mid ah peptides waxay muujiyeen ku tiirsanaan valence ah oo ku jirta kobcinta CSF (xog aan la muujin), taas oo laga yaabo inay la xiriirto joomatari dusha sare ee la soo bandhigay ee T7 capsid. Nidaamka T7 ee aan isticmaalnay wuxuu muujiyay 5-15 nuqul oo peptide kasta ah qayb kasta oo phage ah. IHC waxaa lagu sameeyay klones-ka phage-ka ee musharaxiinta ah ee lagu duray xididada maskaxda ee jiirka (Jaantuska Dheeraadka ah 8). Xogtu waxay muujisay in ugu yaraan saddex klones (Lambarka 2002, Lambarka 2009 iyo Lambarka 2077) ay la falgaleen BBB. Wali lama go'aamin in isdhexgalka BBB uu keeno ururinta CSF ama dhaqdhaqaaqa klones-kan si toos ah ugu socda BCSFB. Muhiimad ahaan, waxaan tusinaynaa in peptide-yada la doortay ay haystaan ​​​​awooddooda gaadiidka CSF marka la sameeyo oo lagu xidho xamuulka borotiinka. Ku xidhidda peptide-yada N-terminal ee biotinylated SA waxay asal ahaan ku celinaysaa natiijooyinka laga helay unugyada phage-ka ee dhiigga iyo dareeraha maskaxda (Jaantuska 3e). Ugu dambeyntii, waxaan muujinaynaa in peptide-ka lead #2077 uu awood u leeyahay inuu kor u qaado ficilka maskaxda ee peptide-ka biotinylated ee BACE1 ee ku xiran SA, taasoo keenta saameyn farmashiye oo muuqda oo ku jirta CNS iyadoo si weyn hoos ugu dhigaysa heerarka Abeta40 ee CSF (Jaantuska 4). Ma aanan awoodin inaan aqoonsanno wax isku mid ah oo ku jira xogta annagoo samaynayna raadinta isku midka ah ee taxanaha peptide ee dhammaan hits-ka. Waa muhiim in la ogaado in cabbirka maktabadda T7 uu yahay qiyaastii 109, halka cabbirka maktabadda aragtida ee 12-mers uu yahay 4 x 1015. Sidaa darteed, waxaan doorannay oo keliya qayb yar oo ka mid ah booska kala duwan ee maktabadda peptide-ka 12-mer, taas oo macnaheedu noqon karo in peptide-yada la hagaajiyay lagu aqoonsan karo iyadoo la qiimeynayo booska isku xiga ee ku xiga ee hits-yadan la aqoonsaday. Male ahaan, mid ka mid ah sababaha aan u helin wax isku mid ah oo dabiici ah oo peptides-kan ah ayaa laga yaabaa inay tahay ka-go'naanta inta lagu jiro horumarka si looga hortago gelitaanka aan la xakamayn ee noocyada peptide qaarkood ee maskaxda.
Marka la isku soo wada duubo, natiijooyinkayagu waxay saldhig u yihiin shaqada mustaqbalka si loo aqoonsado loona garto nidaamyada gaadiidka ee caqabadda maskaxda ee gudaha jirka si faahfaahsan. Dejinta aasaasiga ah ee habkan waxay ku salaysan tahay istaraatiijiyad xulasho oo shaqeyneysa oo aan kaliya aqoonsanayn qaafiyado leh sifooyin isku xidhka xididdada dhiigga ee maskaxda, laakiin sidoo kale waxaa ku jira tallaabo muhiim ah oo qaafiyado guuleysta ay leeyihiin firfircooni gudaha ah si ay uga gudbaan caqabadaha bayoolojiga ee gudaha jirka una galaan qaybta CNS. waa in la caddeeyo habka gaadiidka peptides-kan iyo doorbidkooda ku xidhnaanta qaafiyadaha yaryar ee gaarka u ah gobolka maskaxda. Tani waxay horseedi kartaa helitaanka waddooyin cusub oo loogu talagalay gaadiidka BBB iyo soo-dhoweeyayaasha. Waxaan rajeyneynaa in peptide-yada la aqoonsaday ay si toos ah ugu xidhmi karaan soo-dhoweeyayaasha xididdada dhiigga ama ligands-ka wareegaya ee lagu qaado BBB ama BCSFB. Vectors-ka peptide-ka leh dhaqdhaqaaqa gaadiidka CSF ee lagu ogaaday shaqadan ayaa si dheeraad ah loo baari doonaa. Waxaan hadda baareynaa gaar ahaanshaha maskaxda ee peptides-kan awooddooda ay uga gudbaan BBB iyo/ama BCSFB. Peptides-kan cusub waxay noqon doonaan qalab aad u qiimo badan oo lagu ogaan karo soo-dhoweeyayaasha ama dariiqyada cusub iyo horumarinta goobo cusub oo aad waxtar u leh oo loogu talagalay gaarsiinta macromolecules-ka, sida bayoolajiga, maskaxda.
Ku shub cisterna-da weyn (CM) adigoo isticmaalaya wax ka beddel habka hore loo sharraxay. Jiirarka Wistar ee la suuxiyay (200-350 g) ayaa lagu rakibay qalab stereotaxic ah, jeexitaan dhexdhexaad ahna waxaa laga sameeyay madaxa la xiiray oo si loo soo bandhigo madaxa. Ka qod laba god oo ku yaal qaybta sare ee sash-ka oo ku dheji boolal hagaajin ah godadka. God dheeraad ah ayaa laga qoday lafta lafta lafta si loogu hago stereotactic ee cannula bir aan daxal lahayn oo ku jira CM. Ku mari sibidhka ilkaha agagaarka cannula oo ku xidh boolal. Ka dib sawir-ka-qaadista iyo adkaynta sibidhka, nabarka maqaarka waxaa lagu xidhay tolmo 4/0 supramid ah. Meelaynta saxda ah ee cannula waxaa lagu xaqiijiyay daadashada degdegga ah ee dareeraha cerebrospinal (CSF). Ka saar jiirka qalabka stereotaxic, hel daryeel habboon oo qalliinka kadib ah iyo maaraynta xanuunka, oo u ogolow inuu soo kabsado ugu yaraan hal toddobaad ilaa calaamadaha dhiigga laga arko dareeraha cerebrospinal. Jiirarka Wistar (Crl:WI/Han) waxaa laga helay Charles River (Faransiiska). Dhammaan jiirarka waxaa lagu hayay xaalado gaar ah oo aan lahayn cudur-sidaha. Dhammaan tijaabooyinka xayawaanka waxaa ansixiyay Xafiiska Xoolaha ee Magaalada Basel, Switzerland, waxaana lagu sameeyay iyadoo la raacayo Ruqsadda Xoolaha ee Lambarka 2474 (Qiimaynta Gaadiidka Maskaxda ee Firfircoon iyadoo la cabbirayo Heerarka Musharixiinta Daaweynta ee Dareeraha Cerebrospinal iyo Maskaxda Jiirka).
Si tartiib ah jiirka u qabo miyir-qabka iyadoo gacanta lagu hayo cannula-da CM. Ka saar Datura cannula-da oo ururi 10 µl oo dareere cerebrospinal ah oo si iskiis ah u socda. Maadaama awoodda cannula-da ugu dambeyntii ay waxyeello soo gaartay, waxaa daraasaddan lagu daray muunado cad oo dheecaanka cerebrospinal ah oo aan lahayn wax caddayn ah oo ku saabsan wasakhowga dhiigga ama midab-beddelidda. Isla mar ahaantaana, qiyaastii 10-20 μl oo dhiig ah ayaa laga soo qaaday jeex yar oo ku yaal caaradda dabada oo loo geliyay tuubooyin leh heparin (Sigma-Aldrich). CSF iyo dhiig ayaa la soo ururiyay waqtiyo kala duwan ka dib markii la duray phage-ka T7. Qiyaastii 5-10 μl oo dareere ah ayaa la tuuray ka hor inta aan la ururin muunad kasta oo CSF ​​ah, taasoo u dhiganta mugga dhintay ee kateetarka.
Maktabadaha waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo vector-ka T7Select 10-3b sida lagu sharaxay buug-gacmeedka nidaamka T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Si kooban, gelin DNA oo 12-mer ah oo aan kala sooc lahayn ayaa lagu sameeyay qaabkan soo socda:
Koodonka NNK waxaa loo isticmaalay in laga fogaado koodon-ka laba-jibbaaran ee joojinta iyo muujinta xad-dhaafka ah ee amino acid ee ku jira gelinta. N waa saamiga isku-dhafka ah ee gacanta lagu sameeyo ee nucleotide kasta, K-na waa saamiga isku-dhafka ah ee gacanta lagu sameeyo ee nucleotide-ka adenine iyo cytosine. Gobollada hal-jibbaaran waxaa loo beddelay DNA laba-jibbaaran iyadoo la sii marinayo dNTP (Novagen) iyo enzyme-ka Klenow (New England Biolabs) ee Klenow buffer (New England Biolabs) muddo 3 saacadood ah heerkul ah 37°C. Ka dib falcelinta, DNA-da laba-jibbaaran waxaa dib u soo ceshaday roobabka EtOH. DNA-da ka dhalatay waxaa lagu dheefshiiday ensaymes-ka xaddidan EcoRI iyo HindIII (labaduba waxay ka yimaadeen Roche). Gelinta la jarjaray oo la safeeyey (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) ayaa markaa lagu dhejiyay qaab-dhismeedka vector-ka T7 ee hore loo jeexay ka dib amino acid 348 ee hidda-wadaha 10B capsid. Falcelinta ligation-ka waxaa lagu kululeeyay 16° C. muddo 18 saacadood ah ka hor baakadka in vitro. Baakadaha Phage ee ku jira vitro waxaa la sameeyay iyadoo la raacayo tilmaamaha la siiyay qalabka T7Select 10-3b cloning (Novagen) xalka baakadana waxaa la ballaariyay hal mar iyadoo la isticmaalayo Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lysates-ka waxaa lagu centrifuge, titrated oo lagu qaboojiyay -80° C. sidii xal kayd ah oo glycerol ah.
Kordhinta PCR ee tooska ah ee gobollada doorsoomayaasha phage ee lagu xoojiyay maraq ama saxan iyadoo la adeegsanayo astaamaha isku-dhafka 454/Roche-amplicon ee gaarka ah. Qalabka isku-dhafka hore wuxuu ka kooban yahay taxane ku yaal gobolka doorsoomayaasha (NNK) 12 (qaab-gaar ah), GS FLX Titanium Adapter A, iyo taxane fure maktabad afar-saldhig ah (TCAG) (Jaantuska Dheeraadka ah 1a):
Qalabka isku-dhafka ee rogan waxa kale oo uu ka kooban yahay biotin ku lifaaqan kuulaha qabashada iyo GS FLX Titanium Adapter B oo loo baahan yahay kordhinta clonal inta lagu jiro emulsion PCR:
Kadib amplicons-ka waxaa lagu sameeyay 454/Roche pyrosequencing iyadoo la raacayo hab-maamuuska Titanium 454 GS-FLX. Si loo sameeyo taxanaha Sanger ee gacanta (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), T7 phage DNA waxaa lagu xoojiyay PCR waxaana lagu sameeyay isku xigxiga lammaanayaasha asaasiga ah ee soo socda:
Gelitaannada laga soo qaaday lakabyada shaqsiga ah ayaa lagu sameeyay kor u qaadis PCR iyadoo la adeegsanayo Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (sida waafaqsan tilmaamaha soo saaraha). Samee bilow kulul (10 daqiiqo 95 °C) iyo 35 wareeg oo kor u qaadis ah (50 ilbiriqsi 95 °C, 1 daqiiqo 50 °C, iyo 1 daqiiqo 72 °C).
Fage-ka laga soo qaaday maktabadaha, fage-ka nooca duurjoogta ah, fage-ka laga soo badbaadiyay CSF iyo dhiigga, ama nuqullo shaqsi ah ayaa lagu xoojiyay Escherichia coli BL5615 oo ku jira maraq TB ah (Sigma Aldrich) ama saxanno 500 cm2 ah (Thermo Scientific) muddo 4 saacadood ah heerkul ah 37°C. Fage-ka waxaa laga soo saaray saxannada iyadoo lagu raaciyo saxannada Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) ama iyadoo lagu ururinayo lakabyada leh cidhifyada pipette-ka oo nadiif ah. Fage-ka waxaa laga soocay sunta ka soo baxda dhaqanka ama kaydka soo saarista iyadoo la adeegsanayo hal wareeg oo ah polyethylene glycol (PEG 8000) roobka (Promega) oo dib loogu celiyey kaydka Tris-EDTA.
Fage-ka la ballaariyay waxaa lagu sameeyay 2-3 wareeg oo ka saarista endotoxin ah iyadoo la adeegsanayo kuul ka saarista endotoxin (Miltenyi Biotec) ka hor inta aan la durin xididka (IV) (500 μl/xayawaan). Wareeggii hore, 2×1012 fage ayaa la soo bandhigay; kii labaad, 2×1010 fage; wareegyadii saddexaad iyo afraad ee xulashada, 2×109 fage xayawaankiiba. Waxyaabaha ku jira fage-ka ee CSF iyo muunadaha dhiigga ee la ururiyey waqtiyada la tilmaamay waxaa lagu go'aamiyay tirinta huurada iyadoo la raacayo tilmaamaha soo saaraha (Buugga nidaamka T7Select). Xulashada fage-ka waxaa lagu sameeyay duritaan xididka ah oo maktabado la safeeyey lagu shubay xididka dabada ama dib-u-durin fage-ka laga soo saaray CSF wareegii hore ee xulashada, goosashada xigana waxaa lagu sameeyay 10 daqiiqo, 30 daqiiqo, 60 daqiiqo, 90 daqiiqo, 120 daqiiqo, 180 daqiiqo, iyo 240 daqiiqo siday u kala horreeyaan muunadaha CSF iyo dhiigga. Wadarta afar wareeg oo ah in vivo panning ayaa la sameeyay kaas oo labada laamood ee la doortay si gaar ah loo kaydiyay loona falanqeeyay saddexdii wareeg ee ugu horreeyay ee xulashada. Dhammaan gelinta phage ee laga soo saaray CSF labadii wareeg ee ugu horreeyay ee xulashada waxaa lagu sameeyay 454/Roche pyrosequencing, halka dhammaan clones-ka laga soo saaray CSF labadii wareeg ee ugu dambeeyay ee xulashada gacanta lagu sameeyay. Dhammaan phages-ka dhiigga ee laga soo qaaday wareegii koowaad ee xulashada waxaa sidoo kale lagu sameeyay 454/Roche pyrosequencing. Si loogu duro phage clones-ka, phages-ka la soo xulay waxaa lagu kordhiyay E. coli (BL5615) oo ku yaal saxanno 500 cm2 ah heerkul ah 37°C muddo 4 saacadood ah. phages-ka si gaar ah loo soo xulay oo gacanta lagu soo xigtay ayaa lagu faafiyay TB-da. Ka dib soo saarista phage-ka, nadiifinta iyo ka saarista endotoxin (sida kor lagu sharaxay), 2×1010 phages/xayawaan oo ku jira 300 μl ayaa xididka lagu duray hal xidid dabada ah.
Horumarin hore iyo shaandheyn tayo leh oo xogta taxanaha ah. Xogta cayriin 454/Roche waxaa laga beddelay qaab khariidadeed oo caadi ah oo laba-geesood ah (sff) una beddelay qaab Pearson ah oo la akhrin karo oo bini'aadam ah (fasta) iyadoo la adeegsanayo software-ka iibiyaha. Habayn dheeraad ah oo taxanaha nucleotide ah ayaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo barnaamijyada C ee gaarka ah iyo qoraallada (xirmo software aan la sii deyn) sida hoos lagu sharaxay. Falanqaynta xogta aasaasiga ah waxaa ka mid ah hababka shaandhaynta ee adag ee marxaladaha badan leh. Si loo shaandheeyo akhrinta aan ku jirin taxanaha DNA-da ee 12mer ee ansax ah, akhrinta waxaa si isdaba joog ah loogu habeeyay calaamadda bilowga (GTGATGTCGGGGATCCGGAATTCT), calaamadda joojinta (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) iyo gelinta asalka ah (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) iyadoo la adeegsanayo tijaabada caalamiga ah ee Needleman-Wunsch. oo u oggolaanaysa ilaa 2 iswaafaqla'aan isku-xidhka 31. Sidaa darteed, akhrinta aan lahayn calaamadaha bilowga iyo joojinta iyo akhrinta ka kooban gelinta asalka, tusaale ahaan, isku-xidhka ka badan tirada la oggol yahay ee isku-waafaqla'aanta, ayaa laga saaray maktabadda. Marka laga hadlayo akhrinta soo hartay, taxanaha DNA-da N-mer ee ka soo bilaabmaya calaamadda bilowga iyo dhammaadka ka hor inta aan calaamadda joojinta laga saarin taxanaha akhrinta asalka ah oo si dheeraad ah loo farsameeyay (halkan ka dib waxaa loogu yeeraa "geli"). Ka dib turjumaadda gelinta, qaybta ka dambeysa kodon-ka joojinta koowaad ee dhammaadka 5′ ee primer-ka ayaa laga saarayaa gelinta. Intaa waxaa dheer, nucleotides-ka horseedaya kodon-yada aan dhammaystirnayn ee dhammaadka 3′ ee primer-ka ayaa sidoo kale laga saaray. Si looga saaro gelinta ka kooban taxanaha asalka oo keliya, gelinta la tarjumay ee ka bilaabmaysa qaabka amino acid "PAG" ayaa sidoo kale laga saaray maktabadda. Peptides-ka leh dherer ka dambeeya tarjumaadda oo ka yar 3 amino acids ayaa laga saaray maktabadda. Ugu dambeyntii, ka saar dib-u-dhaca barkadda gelinta oo go'aami inta jeer ee gelinta gaarka ah. Natiijooyinka falanqayntan waxaa ka mid ahaa liis taxane ah oo nucleotide ah (gelisyo) iyo soo noqnoqoshadooda (akhris) (Jaantusyada Dheeraadka ah 1c iyo 2).
Gelinta DNA-da Kooxda N-mer iyadoo loo eegayo isku ekaanshaha taxanaha: Si loo baabi'iyo khaladaadka taxanaha 454/Roche-ga gaarka ah (sida dhibaatooyinka fidinta isku xigxiga ee homopolymer) iyo ka saarista dib-u-dhacyada aan muhiimka ahayn, gelitaannada taxanaha DNA-da N-mer ee hore loo sifeeyay (gelitaannada) waxaa lagu kala saaraa isku ekaanshaha. Gelinta (ilaa 2 saldhig oo aan isku mid ahayn ayaa loo oggol yahay) iyadoo la adeegsanayo algorithm soo noqnoqda oo lagu qeexay sida soo socota: gelitaannada waxaa marka hore lagu kala saaraa soo noqnoqoshadooda (ugu sarreysa ilaa ugu hooseeya), haddii ay isku mid yihiinna, kala soociddooda labaad dherer ahaan (ugu dheer ilaa ugu gaaban)). Sidaa darteed, gelitaannada ugu badan uguna dheer waxay qeexayaan "kooxda koowaad". Soo noqnoqoshada kooxda waxaa loo dejiyay soo noqnoqoshada furaha. Kadib, gelitaan kasta oo ku haray liiska la kala saaray waxaa la isku dayay in lagu daro kooxda iyadoo la raacayo isku-xidhka Needleman-Wunsch ee labada dhinac. Haddii tirada isku dheelitir la'aanta, gelinta, ama tirtirka isku-xidhka aysan ka badnayn heerka 2, gelin ayaa lagu daraa kooxda, soo noqnoqoshada kooxda guudna waxaa lagu kordhiyaa inta jeer ee lagu daray gelinta. Gelinta lagu daray koox waxaa lagu calaamadeeyay inay la isticmaalay oo laga saaray habayn dheeraad ah. Haddii taxanaha gelinta aan lagu dari karin koox hore u jirtay, taxanaha gelinta waxaa loo isticmaalaa in lagu abuuro koox cusub oo leh soo noqnoqoshada gelinta ee ku habboon oo loo calaamadeeyay sidii loo isticmaalay. Soo noqnoqoshadu waxay dhammaataa marka taxane kasta oo gelinta ah loo isticmaalo in lagu sameeyo koox cusub ama lagu dari karo koox hore u jirtay. Ka dib oo dhan, gelinta kooxaysan oo ka kooban nucleotides ayaa ugu dambeyntii loo turjumaa taxanaha peptide (maktabadyada peptide). Natiijada falanqayntani waa gelinta iyo soo noqnoqoshadooda u dhiganta oo ka kooban tirada akhrinta isku xigta (Jaantuska Dheeraadka ah 2).
Jiilka Motif: Iyada oo lagu saleynayo liiska peptides-ka gaarka ah, maktabad ayaa la sameeyay oo ka kooban dhammaan qaababka amino acid ee suurtogalka ah (aa) sida hoos ku cad. Qaab kasta oo suurtagal ah oo dhererkiisu yahay 3 ayaa laga soo saaray peptide-ka waxaana lagu daray qaabkiisa rogan oo ay weheliso maktabad motif caadi ah oo ka kooban dhammaan qaababka (tripeptides). Maktabadaha motif-yada aadka u soo noqnoqda ayaa la isku xigxigay oo laga saaray dib-u-dhac. Kadib, tripeptide kasta oo ku jira maktabadda motif-ka, waxaan hubinay joogitaankiisa maktabadda annagoo adeegsanayna qalab xisaabeed. Xaaladdan oo kale, soo noqnoqoshada peptide-ka oo ka kooban tripeptide-ka motif-ka la helay ayaa lagu daraa oo loo qoondeeyaa motif-ka maktabadda motif-ka ("tirada motif-yada"). Natiijada jiilka motif-ka waa taxane laba-geesood ah oo ka kooban dhammaan dhacdooyinka tripeptides-ka (motifs) iyo qiimayaashooda, kuwaas oo ah tirada akhrinta taxanaha ah ee keenta motif-ka u dhigma marka akhrinta la sifeeyo, la kooxeeyo, oo la turjumo. Cabbirrada sida si faahfaahsan loogu sharraxay kor.
Caadiyeynta tirada qaababka iyo jaantusyada kala firdhisan ee u dhigma: Tirada qaababka muunad kasta waxaa loo habeeyey iyadoo la isticmaalayo
halkaas oo ni uu yahay tirada akhrinta oo ka kooban mowduuca i. Sidaas darteed, vi wuxuu matalaa boqolleyda soo noqnoqoshada akhrinta (ama peptides) oo ka kooban motif i ee muunadda. Qiimaha P ee tirada aan caadiga ahayn ee motifs waxaa lagu xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo tijaabada saxda ah ee Fisher. Marka laga hadlayo isku-xidhka tirada ujeeddooyinka, isku-xidhka Spearman waxaa lagu xisaabiyay iyadoo la isticmaalayo tirada ujeeddooyinka caadiga ah ee R.
Si loo sawiro nuxurka amino acids-ka boos kasta oo ku yaal maktabadda peptide-ka, calaamadaha shabakada 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ayaa la sameeyay. Marka hore, nuxurka amino acids-ka boos kasta oo ka mid ah peptide-ka 12-mer waxaa lagu kaydiyaa matrix 20 × 12 ah. Kadib, set 1000 peptides ah oo ka kooban isla nuxurka amino acid ee boos kasta ayaa lagu soo saaraa qaab dhakhso ah waxaana loo bixiyaa sidii talooyin loogu talagalay astaanta shabakadda 3, kaas oo soo saara matalaad garaaf ah oo ka mid ah nuxurka amino acid ee boos kasta. maktabad peptide ah oo la bixiyay. Si loo sawiro xog ururin badan, khariidadaha kulaylka waxaa la sameeyay iyadoo la adeegsanayo qalab gudaha lagu sameeyay oo ku jira R (biosHeatmap, xirmo R oo aan weli la sii deyn). Dendrogram-yada lagu soo bandhigay khariidadaha kulaylka waxaa lagu xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo habka isku-dhafka ee Ward oo leh cabbirka masaafada Euclidean. Falanqaynta tirakoobka ee xogta dhibcaha motif-ka, qiimayaasha P ee dhibcaha aan caadiga ahayn waxaa lagu xisaabiyay iyadoo la adeegsanayo imtixaanka saxda ah ee Fisher. Qiimaha P ee xog ururinnada kale waxaa lagu xisaabiyay R iyadoo la isticmaalayo imtixaanka t-test-ka ee Ardayga ama ANOVA.
Xididdada phage-ka ee la soo xulay iyo phages-ka aan lahayn wax lagu geliyo ayaa lagu duray xididka dabada (2×1010 phages/xayawaan ku jira 300 μl PBS). Toban daqiiqo ka hor inta aan la shubin iyo markii la isku daray, isla xayawaankaas waxaa lagu duray xididka 100 μl oo lectin ah oo lagu calaamadeeyay DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 daqiiqo ka dib markii la duray phage-ka, jiirarka waxaa lagu shubay wadnaha iyadoo la isticmaalayo 50 ml PBS oo ay ku xigto 50 ml 4% PFA/PBS. Muunadaha maskaxda waxaa sidoo kale lagu hagaajiyay habeenkii 4% PFA/PBS waxaana lagu qooyay 30% sucrose habeenkii heerkul ah 4°C. Muunadaha waxaa si toos ah loogu qaboojiyay isku darka OCT. Falanqaynta Immunohistochemical ee muunadaha la qaboojiyey waxaa lagu sameeyay heerkulka qolka iyadoo la adeegsanayo 30 µm cryosections oo lagu xiray 1% BSA waxaana lagu dhex geliyay antibodies-ka polyclonal FITC ee ka dhanka ah T7 phage (Novus NB 600-376A) heerkul ah 4 °C. Ku shid habeenkii. Ugu dambeyntii, qaybaha waxaa lagu dhaqay 3 jeer PBS waxaana lagu baaray mikroskoobka laysarka ee confocal (Leica TCS SP5).
Dhammaan peptide-yada nadiifka ugu yaraan 98% ah waxaa sameeyay GenScript USA, biotinylated iyo lyophilized. Biotin waxaa lagu xiraa meel kale oo saddex geesood ah oo glycine ah oo ku taal N-terminus. Hubi dhammaan peptide-yada adoo isticmaalaya spectrometry cuf.
Streptavidin (Sigma S0677) waxaa lagu qasay 5-laab oo ah peptide biotinylated, peptide BACE1 inhibitor biotinylated, ama isku-darka (saamiga 3:1) ee peptide BACE1 inhibitor biotinylated iyo peptide BACE1 inhibitor ah oo ku jira 5-10% DMSO/lagu dhex geliyay PBS. 1 saac heerkulka qolka ka hor inta aan la durin. Peptides-ka isku xiran ee Streptavidin ayaa lagu duray xididka qiyaas dhan 10 mg/kg mid ka mid ah xididdada dabada ee jiirka oo leh god maskaxda ah.
Isugeynta isku-dhafka streptavidin-peptide waxaa qiimeeyay ELISA. Saxannada Nunc Maxisorp microtiter (Sigma) waxaa lagu dahaadhay habeenkii heerkul ah 4°C iyadoo la isticmaalayo antibody-ga jiirka ee 1.5 μg/ml (Thermo, MA1-20011). Ka dib markii la xannibo (xirmidda kaydka: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) heerkulka qolka muddo 2 saacadood ah, saxanka ku dhaq 0.05% Tween-20/PBS (mashiinka lagu dhaqo) muddo 3 ilbiriqsi ah, muunado CSF ​​iyo balaasma ah ayaa lagu daray ceelasha lagu qasi jiray kaydka xannibaya (plasma 1:10,000, CSF 1:115). Saxanka waxaa lagu kululeeyay habeenkii heerkul ah 4°C iyadoo la adeegsanayo antibody-ga ogaanshaha (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Saddex tallaabo oo dhaqid ah ka dib, streptavidin waxaa lagu ogaaday ku-shubid xal substrate TMB ah (Roche) ilaa 20 daqiiqo. Ka dib marka la joojiyo koritaanka midabka iyadoo la isticmaalayo 1M H2SO4, cabbir nuugista 450 nm.
Shaqada isku-dhafka daawada streptavidin-peptide-BACE1 waxaa qiimeeyay Aβ(1-40) ELISA sida waafaqsan hab-raaca soo saaraha (Wako, 294-64701). Si kooban, muunadaha CSF waxaa lagu qasi jiray dareere caadi ah (1:23) waxaana lagu kululayn jiray habeenkii 4°C saxanno 96-god ah oo lagu dahaadhay antibody qabasho BNT77. Shan tallaabo oo dhaqid ah ka dib, antibody-ga HRP-conjugated BA27 ayaa lagu daray oo lagu kululayn jiray 2 saacadood heerkul ah 4°C, waxaana ku xigay shan tallaabo oo dhaqid ah. Aβ(1–40) waxaa lagu ogaaday ku-shubista xalka TMB muddo 30 daqiiqo ah heerkulka qolka. Ka dib markii la joojiyo horumarinta midabka iyadoo la isticmaalayo xalka joojinta, cabbir nuugista 450 nm. Muunadaha plasma waxaa lagu sameeyay soo saarista wejiga adag ka hor Aβ(1–40) ELISA. Balaasmaha waxaa lagu daray 0.2% DEA (Sigma) saxanno 96-god ah waxaana lagu kululayn jiray heerkulka qolka muddo 30 daqiiqo ah. Ka dib markii si isdaba joog ah loogu dhaqay saxannada SPE (Oasis, 186000679) biyo iyo 100% methanol, muunado balaasma ah ayaa lagu daray saxannada SPE dhammaan dareerahana waa laga saaray. Muunado ayaa la dhaqay (marka hore 5% methanol ka dibna 30% methanol) waxaana lagu shubay 2% NH4OH/90% methanol. Ka dib markii la qalajiyey eluate heerkul ah 55°C muddo 99 daqiiqo ah iyadoo la adeegsanayo N2 joogto ah, muunado ayaa lagu yareeyay milmiyaal caadi ah waxaana la cabbiray Aβ(1–40) sida kor lagu sharaxay.
Sida loo soo xigto maqaalkan: Urich, E. et al. Gaarsiinta xamuulka maskaxda iyadoo la adeegsanayo peptides-ka transit-ka ee lagu aqoonsaday in vivo. sayniska. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB iyo Moos T. Bixinta daawooyinka macromolecular-ka maskaxda iyadoo la adeegsanayo daaweyn bartilmaameedsan. Joornaalka Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., iyo Martinez-Martinez, P. Bixinta daawooyinka peptide iyo borotiinka ee ka gudba caqabadda dhiigga-maskaxda. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Caqabadda dhiigga-maskaxda: caqabad ku ah horumarinta daroogada maskaxda. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, iyo Byrd, A. Rajada laga qabo in la hagaajiyo keenista daawada iyo bartilmaameedsiga maskaxda iyada oo loo marayo marinka choroid plexus-CSF. Cilmi-baarista Daawada 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Casriyeynta daawooyinka bayoolojiga ah oo leh fardaha Trojan-ka ee molecular-ka si loogu keeno maskaxda. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM receptor-ka oo dhexdhexaadiya peptide-ka iyada oo loo marayo caqabadda dhiigga-maskaxda. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Kordhi gelinta maskaxda iyo waxtarka unugyada difaaca jirka ee daaweynta iyadoo la adeegsanayo shuttles molecular monovalent. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Gaadiidka Transferrin reseptor (TfR) wuxuu go'aamiyaa qaadashada maskaxda ee noocyada isku xirnaanta ee unugyada difaaca jirka ee TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).