Nature.com сайтад зочилсонд баярлалаа. Та хязгаарлагдмал CSS дэмжлэгтэй хөтчийн хувилбарыг ашиглаж байна. Хамгийн сайн туршлагын тулд бид танд шинэчлэгдсэн хөтчийг ашиглахыг зөвлөж байна (эсвэл Internet Explorer дээр Тохиромжтой байдлын горимыг идэвхгүй болгох). Үүнээс гадна, тасралтгүй дэмжлэгийг хангахын тулд бид сайтыг хэв маяг болон JavaScriptгүйгээр харуулдаг.
Гурван слайдын тойруулгыг нэг дор харуулна. Өмнөх болон Дараагийн товчлууруудыг ашиглан нэг дор гурван слайдаар шилжих эсвэл төгсгөлд байгаа гулсах товчлууруудыг ашиглан нэг дор гурван слайдаар шилжих боломжтой.
Цус-тархины саад болон цус-тархины саад нь био эмчилгээний бодисууд төв мэдрэлийн системд хүрэхээс сэргийлж, улмаар мэдрэлийн өвчнийг үр дүнтэй эмчлэхэд саад учруулдаг. Шинэ тархины тээвэрлэгчдийг in vivo-д нээхийн тулд бид T7 фагийн пептидийн санг нэвтрүүлж, хархны ухамсартай том сангийн загварыг ашиглан цус болон тархи нугасны шингэнийг (ТАРШ) цувралаар цуглуулсан. Тодорхой фагийн клонуудыг дөрвөн удаагийн сонголтын дараа ТАРШ-аар өндөр баяжуулсан. Бие даасан нэр дэвшигч пептидүүдийг туршихад ТАРШ-аар 1000 дахин их баяжсан болохыг тогтоожээ. Тархинд пептидээр зуучлагдсан хүргэлтийн био идэвхжил нь шинээр илэрсэн дамжин өнгөрөх пептидтэй холбогдсон BACE1 пептидийн дарангуйлагчийг ашиглан тархи нугасны шингэн дэх амилоид-β-ийн түвшин 40%-иар буурснаар батлагдсан. Эдгээр үр дүнгээс харахад in vivo фагийн сонголтын аргаар тодорхойлсон пептидүүд нь макромолекулуудыг тархинд эмчилгээний үр нөлөөтэй системчилсэн хүргэхэд ашигтай хэрэгсэл байж болохыг харуулж байна.
Төв мэдрэлийн систем (ТМС)-ийн зорилтот эмчилгээний судалгаа нь ТМС-ийг чиглүүлэх шинж чанартай оновчтой эм, бодисыг тодорхойлоход голчлон анхаарч ирсэн бөгөөд тархинд идэвхтэй эмийг хүргэх механизмыг нээхэд бага хүчин чармайлт гаргадаг. Эмийн хүргэлт, ялангуяа том молекулууд нь орчин үеийн мэдрэл судлалын эмийн хөгжлийн салшгүй хэсэг болсон тул энэ нь одоо өөрчлөгдөж эхэлж байна. Төв мэдрэлийн системийн орчин нь цус-тархины хориг (BBB) ​​болон цус-тархины хориг (BCBB)-ээс бүрдэх тархины судасны саад тотгорын системээр сайн хамгаалагдсан байдаг1,2 тул тархинд эмийг хүргэхэд хүндрэл учруулдаг1,2. Том молекулын бараг бүх эм, жижиг молекулын эмийн 98 гаруй хувь нь тархинаас гардаг гэсэн тооцоо байдаг3. Тийм ч учраас эмчилгээний эмийг ТМС-д үр ашигтай, тодорхой хүргэх боломжийг олгодог тархины шинэ тээврийн системийг тодорхойлох нь маш чухал юм4,5. Гэсэн хэдий ч BBB болон BCSFB нь тархины өргөн судаснуудаар дамжин тархины бүх бүтцэд нэвтэрч, ордог тул эмийг хүргэх маш сайн боломжийг олгодог. Тиймээс тархинд хүргэх инвазив бус аргуудыг ашиглах одоогийн хүчин чармайлт нь голчлон эндоген BBB6 рецепторыг ашиглан рецептороор зуучлагдсан тээвэрлэлтийн (PMT) механизмд суурилдаг. Трансферрин рецепторын замыг ашиглах сүүлийн үеийн гол дэвшил7,8 хэдий ч сайжруулсан шинж чанартай шинэ хүргэх системийг цаашид хөгжүүлэх шаардлагатай байна. Үүний тулд бидний зорилго бол тархи нугасны шингэний тээвэрлэлтийг зуучлах чадвартай пептидийг тодорхойлох явдал байв, учир нь тэдгээрийг зарчмын хувьд төв мэдрэлийн системд макромолекулуудыг хүргэх эсвэл шинэ рецепторын замыг нээхэд ашиглаж болно. Ялангуяа тархины судасны системийн тодорхой рецептор ба тээвэрлэгчид (BBB ба BSCFB) нь био эмчилгээний эмийг идэвхтэй, өвөрмөц хүргэх боломжит зорилт болж чадна. Тархи нугасны шингэн (CSF) нь choroid plexus (CS)-ийн шүүрлийн бүтээгдэхүүн бөгөөд тархины субарахноид орон зай болон ховдлын орон зайгаар дамжин тархины завсрын шингэнтэй шууд холбогддог4. Саяхан субарахноид тархи нугасны шингэн нь тархины завсрын хэсэгт хэт их хэмжээгээр тархдаг болохыг харуулсан9. Бид энэхүү субарахноид урсгалын замыг ашиглан эсвэл BBB-ээр дамжуулан паренхимийн орон зайд нэвтрэхийг хүсч байна. Үүнийг хэрэгжүүлэхийн тулд бид эдгээр хоёр өөр замын аль нэгээр нь зөөвөрлөгдсөн пептидийг хамгийн тохиромжтой байдлаар тодорхойлдог бат бөх in vivo фаг сонгох стратегийг хэрэгжүүлсэн.
Бид одоо хамгийн өндөр номын сангийн олон янз байдалтай анхны сонголтын үе шатуудыг хянахын тулд тархи нугасны шингэнээс дээж авах, өндөр нэвтрүүлэх дарааллын дараалал (HTS)-тай хослуулсан дараалсан in vivo фагийн дэлгэцийн скрининг аргыг тайлбарлаж байна. Цусны бохирдлоос зайлсхийхийн тулд байнгын суулгацтай том цистерна (CM) канюлятай ухамсартай хархнууд дээр скрининг хийсэн. Чухал зүйл бол энэ арга нь тархины онилох болон тархины судасны саадыг дамжин өнгөрөх идэвхтэй пептидүүдийг хоёуланг нь сонгодог. Бид жижиг хэмжээтэй (~60 нм)10 тул T7 фагуудыг ашигласан бөгөөд эндотел болон/эсвэл хучуур эдийн-тархины саадыг эсийн дотор нэвтрэх боломжийг олгодог цэврүүг тээвэрлэхэд тохиромжтой гэж үзсэн. Дөрвөн удаагийн паннинг хийсний дараа фагийн популяцийг тусгаарласан бөгөөд in vivo тархи нугасны шингэнээр баяжуулж, тархины бичил судасны холбоо хүчтэй байгааг харуулсан. Хамгийн чухал нь бид илүүд үзсэн, химийн аргаар нийлэгжүүлсэн хамгийн сайн нэр дэвшигч пептидүүд нь уургийн ачааг тархи нугасны шингэн рүү тээвэрлэх чадвартай болохыг харуулснаар өөрсдийн олдворыг баталгаажуулж чадсан. Нэгдүгээрт, тэргүүлэх дамжин өнгөрөх пептидийг BACE1 пептидийн дарангуйлагчтай хослуулан Төв мэдрэлийн системийн фармакодинамик нөлөөг тогтоосон. In vivo функциональ скрининг стратеги нь тархины шинэ тээвэрлэлтийн пептидийг үр дүнтэй уургийн ачаа тээвэрлэгч гэж тодорхойлж болохыг харуулахаас гадна ижил төстэй функциональ сонголтын аргууд нь тархины шинэ тээвэрлэлтийн замыг тодорхойлоход чухал ач холбогдолтой болно гэж бид үзэж байна.
Фаг савлах алхамын дараа товруу үүсгэх нэгжүүд (PFU) дээр үндэслэн ойролцоогоор 109 төрлийн олон янз байдалтай санамсаргүй 12-мер шугаман T7 фаг пептидийн номын санг зохион бүтээж, бүтээсэн (Материал ба аргуудыг үзнэ үү). Бид энэ номын санг in vivo паннинг хийхээс өмнө сайтар шинжилсэн гэдгийг тэмдэглэх нь чухал юм. Өөрчлөгдсөн праймеруудыг ашиглан фаг номын сангийн дээжийг ПГУ-аар олшруулах нь HTS-д шууд хамаарах ампликонуудыг үүсгэсэн (Нэмэлт Зураг 1a). a) HTS11 дарааллын алдаа, b) праймерын чанарт үзүүлэх нөлөө (NNK)1-12, c) нөөц номын санд зэрлэг төрлийн (wt) фаг (араг ясны оруулга) байгаа зэргээс шалтгаалан зөвхөн баталгаажсан дарааллын мэдээллийг гаргаж авахын тулд дарааллын шүүлтүүрийн процедурыг хэрэгжүүлсэн (Нэмэлт Зураг 1b). Эдгээр шүүлтүүрийн алхамууд нь бүх HTS дарааллын номын санд хамаарна. Стандарт номын сангийн хувьд нийт 233,868 уншилт хийгдсэн бөгөөд үүний 39% нь шүүлтүүрийн шалгуурыг давсан бөгөөд номын сангийн шинжилгээ, дараагийн шатны сонголтод ашигласан (Нэмэлт Зураг 1c–e). Уншилтууд нь голчлон 3 суурь хосын урттай, 36 нуклеотидын оргилтой олонлог байсан (Нэмэлт Зураг 1c) нь номын сангийн загварыг (NNK) 1-12 баталж байна. Номын сангийн гишүүдийн ойролцоогоор 11% нь 12 хэмжээст зэрлэг төрлийн (жингийн) нурууны PAGISRELVDKL оруулгатай байсан бөгөөд дарааллын бараг тал хувь нь (49%) оруулга эсвэл устгал агуулсан байв. Номын сангийн номын сангийн HTS нь номын сан дахь пептидийн өндөр олон янз байдлыг баталсан: пептидийн дарааллын 81%-иас дээш хувь нь зөвхөн нэг удаа олдсон бөгөөд зөвхөн 1.5% нь ≥4 хувьтай байсан (Нэмэлт Зураг 2a). Репертуарын бүх 12 байрлал дахь амин хүчлүүдийн (aa) давтамж нь доройтсон NKK репертуараас үүссэн кодонуудын тооны хүлээгдэж буй давтамжтай сайн хамааралтай байсан (Нэмэлт Зураг 2b). Эдгээр оруулгаар кодлогдсон aa үлдэгдлийн ажиглагдсан давтамж нь тооцоолсон давтамжтай сайн хамааралтай байсан (r = 0.893) (Нэмэлт Зураг 2c). Фагийн сангуудыг тарилгад бэлтгэх нь эндотоксиныг олшруулах болон зайлуулах алхмуудыг агуулдаг. Энэ нь өмнө нь фагийн сангуудын олон янз байдлыг бууруулж болзошгүйг харуулсан12,13. Тиймээс бид эндотоксиныг зайлуулсан хавтангаар олшруулсан фагийн санг дарааллаар нь гаргаж, AA-ийн давтамжийг тооцоолохын тулд анхны сантай харьцуулсан. Анхны сан болон олшруулж, цэвэршүүлсэн сангийн хооронд хүчтэй хамаарал (r = 0.995) ажиглагдсан (Нэмэлт Зураг 2d), энэ нь T7 фагийг ашиглан хавтан дээр олшруулсан клонуудын хоорондох өрсөлдөөн нь томоохон хазайлт үүсгээгүй болохыг харуулж байна. Энэхүү харьцуулалт нь номын сан бүрийн трипептидийн мотивын давтамж дээр үндэслэсэн болно, учир нь номын сангийн олон янз байдлыг (~109) HTS-ээр ч бүрэн дүрслэх боломжгүй юм. Байршил бүр дэх aa-ийн давтамжийн шинжилгээгээр оруулсан репертуарын сүүлийн гурван байрлалд байрлалаас хамааралтай бага зэргийн хазайлт илэрсэн (Нэмэлт Зураг 2e). Эцэст нь хэлэхэд, номын сангийн чанар, олон янз байдал нь хүлээн зөвшөөрөгдөхүйц бөгөөд хэд хэдэн удаагийн сонголтын хооронд фагийн номын сангуудыг олшруулж, бэлтгэснээс болж олон янз байдалд бага зэргийн өөрчлөлт ажиглагдсан гэж бид дүгнэсэн.
Цусны судас болон/эсвэл BCSFB-ээр дамжуулан судсаар тарьсан Т7 фагийг (iv) тодорхойлоход хялбар болгохын тулд ухамсартай хархны CM-д канюлийг мэс заслын аргаар суулгаснаар тархи нугасны шингэний дараалсан дээж авах ажлыг хийж болно (Зураг 1a-b). Бид in vivo сонголтын эхний гурван үе шатанд хоёр бие даасан сонголтын гар (А ба В гар) ашигласан (Зураг 1c). Бид сонголтын эхний гурван үе шатанд нэвтрүүлсэн фагийн нийт хэмжээг бууруулснаар сонголтын хатуу байдлыг аажмаар нэмэгдүүлсэн. Дөрөв дэх үе шатанд бид А ба В мөчрөөс авсан дээжийг нэгтгэж, гурван нэмэлт бие даасан сонголт хийсэн. Энэ загварт Т7 фагийн хэсгүүдийн in vivo шинж чанарыг судлахын тулд сүүлний судсаар дамжуулан харханд зэрлэг хэлбэрийн фаг (PAGISRELVDKL мастер оруулга) тарьсан. Тархи нугасны шингэн болон цуснаас фагуудыг өөр өөр цаг хугацааны цэгүүдэд гаргаж авах нь харьцангуй жижиг Т7 икосаэдр фагууд цусны хэсгээс хурдан анхны цэвэршүүлэх үе шаттай болохыг харуулсан (Нэмэлт Зураг 3). Харханд өгсөн титр болон цусны эзэлхүүн дээр үндэслэн бид судсаар тарьснаас хойш 10 минутын дараа цусанд хэрэглэсэн тунгаас ойролцоогоор 1% жингийн фаг илэрсэн гэж тооцоолсон. Энэхүү анхны огцом бууралтын дараа анхдагч цэвэрлэгээний удаашралтай, хагас задралын хугацаа 27.7 минут байсан. Чухал зүйл бол тархи нугасны шингэнээс маш цөөхөн фаг гаргаж авсан нь зэрлэг хэлбэрийн фаг тархи нугасны шингэн рүү шилжих хөдөлгөөн бага байгааг харуулж байна (Нэмэлт Зураг 3). Дунджаар дээж авах бүх хугацаанд (0-250 минут) тархи нугасны шингэнд цусан дахь Т7 фагийн зөвхөн 1 x 10-3% титр, анх сэлбэсэн фагийн 4 x 10-8% илэрсэн. Тархи нугасны шингэн дэх зэрлэг хэлбэрийн фагийн хагас задралын хугацаа (25.7 минут) нь цусан дахь ажиглагдсантай төстэй байсан нь анхаарал татаж байна. Эдгээр өгөгдөл нь CM-кануляцитай харханд тархи нугасны шингэний хэсгийг цуснаас тусгаарладаг саад тотгор нь бүрэн бүтэн байгааг харуулж байгаа бөгөөд энэ нь цуснаас тархи нугасны шингэний хэсэг рүү амархан зөөгддөг клонуудыг тодорхойлохын тулд фагийн сангуудыг in vivo сонгох боломжийг олгодог.
(a) Том сангаас тархи нугасны шингэн (CSF)-ийг дахин дээж авах аргыг тохируулах. (b) Төв мэдрэлийн системийн (ТМС) саадын эсийн байршил болон цус-тархины саад (BBB) ​​болон цус-тархины саадыг нэвтэлдэг пептидийг тодорхойлоход ашигласан сонголтын стратегийг харуулсан диаграмм. (c) In vivo фагийн дэлгэцийн скринингийн урсгалын диаграмм. Сонголтын үе шат бүрт фагуудыг (сумны доторх амьтны танигч) судсаар тарьсан. Сонголтын 4-р үе шат хүртэл хоёр бие даасан өөр салбар (A, B)-ийг тусад нь хадгалсан. Сонголтын 3 ба 4-р үе шатанд CSF-ээс гаргаж авсан фагийн клон бүрийг гараар дараалуулсан. (d) T7 пептидийн санг (2 x 1012 фаг/амьтан) судсаар тарьсны дараа хоёр канулят харханд эхний үе шатанд цуснаас (улаан тойрог) болон тархи нугасны шингэнээс (ногоон гурвалжин) тусгаарлагдсан фагийн кинетик. Цэнхэр дөрвөлжин нь цусан дахь фагийн анхны дундаж концентрацийг заана. Үүнийг нийт цусны эзэлхүүнийг харгалзан тарьсан фагийн хэмжээнээс тооцоолно. Хар дөрвөлжин нь цусан дахь фагийн концентрациас экстраполяцилагдсан y шугамын огтлолцлын цэгийг заана. (e,f) Пептидээс олдсон бүх давхцаж болох трипептидийн мотивуудын харьцангуй давтамж ба тархалтыг үзүүлэв. 1000 уншилтад олдсон мотивуудын тоог харуулав. Чухал ач холбогдолтой (p < 0.001) баяжуулсан мотивуудыг улаан цэгүүдээр тэмдэглэсэн. (e) Тарьсан номын сангийн трипептидийн мотивын харьцангуй давтамжийг 1.1 ба 1.2 амьтдаас цуснаас гаргаж авсан фагтай харьцуулсан корреляцийн тархалтын график. (f) Цус болон тархи нугасны шингэнээс тусгаарлагдсан 1.1 ба 1.2 амьтдын фагийн трипептидийн мотивуудын харьцангуй давтамжийг харьцуулсан корреляцийн тархалтын график. (g, h) Хоёр амьтанд цусаар баяжуулсан фаг (g)-ийг тарьсан номын сантай харьцуулж, тархи нугасны шингэнээр баяжуулсан фаг (h)-ийг in vivo сонголтын дараа цустай харьцуулж дарааллын ID дүрслэл. Нэг үсэгтэй кодын хэмжээ нь тухайн амин хүчил тухайн байрлалд хэр олон удаа тохиолддогийг заана. Ногоон = туйлын, нил ягаан = төвийг сахисан, цэнхэр = суурь, улаан = хүчиллэг ба хар = гидрофобик амин хүчил. Зураг 1a, b-г Эдуард Урич зохион бүтээж, үйлдвэрлэв.
Бид хоёр CM багажны харханд (А ба В бүлгүүд) фагийн пептидийн санг тарьж, тархи нугасны шингэн болон цуснаас фагийг ялгаж авсан (Зураг 1d). Номын сангийн анхны хурдан цэвэрлэгээ нь зэрлэг хэлбэрийн фагтай харьцуулахад бага тод илэрсэн. Хоёр амьтанд тарьсан номын сангийн дундаж хагас задралын хугацаа нь цусанд 24.8 минут, зэрлэг хэлбэрийн фагтай төстэй, тархи нугасны шингэнд 38.5 минут байв. Амьтан бүрийн цус болон тархи нугасны шингэний фагийн дээжийг HTS-д хамруулж, тодорхойлсон бүх пептидийг богино трипептидийн мотив байгаа эсэхийг шинжилсэн. Трипептидийн мотивийг сонгосон, учир нь тэдгээр нь бүтэц үүсэх, пептид-уургийн харилцан үйлчлэлийн хамгийн бага үндэслэлийг өгдөг14,15. Бид тарьсан фагийн номын сан болон хоёр амьтны цуснаас гаргаж авсан клонуудын хоорондох мотивын тархалтад сайн хамаарал байгааг олж мэдсэн (Зураг 1e). Өгөгдлүүд нь номын сангийн найрлага нь цусны хэсэгт бага зэрэг баяжсан болохыг харуулж байна. Амин хүчлийн давтамж болон зөвшилцлийн дарааллыг Weblogo16 програм хангамжийн дасан зохицол ашиглан байрлал бүрт цаашид шинжилсэн. Сонирхолтой нь бид цусан дахь глициний үлдэгдэл хүчтэй баяжсан болохыг тогтоосон (Зураг 1g). Цусыг тархи нугасны шингэнээс сонгосон клонуудтай харьцуулах үед хүчтэй сонголт болон зарим мотивын сонголт буурсан байдал ажиглагдсан (Зураг 1f), мөн зарим амин хүчлүүд 12 гишүүнтэй хэсэгт урьдчилан тодорхойлсон байрлалд давуу эрхтэйгээр байсан (Зураг 1h). Анхаарал татахуйц зүйл бол тархи нугасны шингэнд бие даасан амьтад мэдэгдэхүйц ялгаатай байсан бол цусан дахь глициний баяжуулалт хоёр амьтанд ажиглагдсан (Нэмэлт Зураг 4a–j). №1.1 ба №1.2 амьтдын тархи нугасны шингэн дэх дарааллын өгөгдлийг хатуу шүүсний дараа нийт 964 ба 420 өвөрмөц 12-мер пептидийг олж авсан (Нэмэлт Зураг 1d–e). Тусгаарлагдсан фагийн клонуудыг олшруулж, in vivo сонголтын хоёр дахь шатанд оруулсан. Хоёр дахь шатны сонголтоос гаргаж авсан фагийг амьтан бүрт HTS-д хамруулж, бүх тодорхойлогдсон пептидүүдийг трипептидийн мотивын илрэлийг шинжлэх мотив таних хөтөлбөрт оруулсан (Зураг 2a, b, ef). Тархи нугасны шингэнээс гаргаж авсан фагийн эхний мөчлөгтэй харьцуулахад бид А ба В салбаруудад тархи нугасны шингэн дэх олон мотивын цаашдын сонголт болон сонголтоос татгалзах үйл явцыг ажигласан (Зураг 2). Тэдгээр нь тууштай дарааллын өөр өөр хэв маягийг илэрхийлж байгаа эсэхийг тодорхойлохын тулд сүлжээний таних алгоритмыг ашигласан. Өөр хувилбар болох А клад (Зураг 2c, d) болон В клад (Зураг 2g, h)-д тархи нугасны шингэнээр олж авсан 12 хэмжээст дарааллын хооронд тодорхой төстэй байдал ажиглагдсан. Салбар бүрт нэгтгэсэн шинжилгээгээр 12-мер пептидийн өөр өөр сонголтын профайлууд (Нэмэлт Зураг 5c, d) болон сонгон шалгаруулалтын хоёр дахь шатны дараа нэгтгэсэн клонуудын хувьд эхний шаттай харьцуулахад тархи нугасны шингэн/цусны титрийн харьцаа цаг хугацааны явцад нэмэгдсэн болохыг тогтоосон (Нэмэлт Зураг 5e). ).
Тархи нугасны шингэн дэх мотив ба пептидийг in vivo функциональ фагийн дэлгэцийн сонголтын хоёр дараалсан үе шатаар баяжуулах.
Амьтан бүрийн эхний тойргоос (#1.1 ба #1.2 амьтад) гаргаж авсан бүх тархи нугасны шингэний фагуудыг нэгтгэж, олшруулж, HT-ээр дараалуулж, дахин тарьсан (2 x 1010 фаг/амьтан) 2 SM кануляттай харх (#1.1 → #). 2.1 ба 2.2, 1.2 → 2.3 ба 2.4). (a,b,e,f) Эхний болон хоёр дахь сонгон шалгаруулалтын тойрогт тархсан бүх CSF-ээс гаралтай фагуудын трипептидийн мотивын харьцангуй давтамжийг харьцуулсан корреляцийн тархалтын графикууд. Хоёр чиглэлд пептидээс олдсон бүх давхцаж буй трипептидийг төлөөлж буй мотивын харьцангуй давтамж ба тархалт. 1000 уншилтад олдсон мотивын тоог харуулав. Харьцуулсан номын сангийн аль нэгэнд мэдэгдэхүйц (p < 0.001) сонгогдсон эсвэл хасагдсан мотивуудыг улаан цэгүүдээр тодруулсан болно. (c, d, g, h) In vivo сонголтын 2 ба 1-р тойрог дээр үндэслэсэн бүх CSF-ээр баялаг 12 амин хүчлийн урт дарааллын дарааллын лого дүрслэл. Нэг үсэгтэй кодын хэмжээ нь тухайн амин хүчил тухайн байрлалд хэр олон удаа тохиолдож байгааг заана. Логог илэрхийлэхийн тулд хоёр сонголтын тойргийн хооронд амьтдаас гаргаж авсан CSF дарааллын давтамжийг харьцуулж, хоёр дахь тойрог дахь баяжуулсан дарааллыг харуулав: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ба (h) #1.2–#2.4. (c, d) 2.1 ба 2.2 дугаар амьтдын өгөгдсөн байрлал дахь хамгийн их баяжуулсан амин хүчлүүд эсвэл 2.3 ба 2.4 дугаар амьтдын (g, h) өгөгдсөн байрлал дахь хамгийн их баяжуулсан амин хүчлүүдийг өнгөөр ​​харуулав. Ногоон = туйлын, нил ягаан = төвийг сахисан, цэнхэр = шүлтлэг, улаан = хүчиллэг ба хар = гидрофобик амин хүчил.
Гурав дахь шатны шалгаруулалтын дараа бид хоёр амьтнаас тусгаарлагдсан 332 CSF-ээр сэргээгдсэн фагийн клоноос 124 өвөрмөц пептидийн дараалал (#3.1 ба #3.2)-ыг тодорхойлсон (Нэмэлт Зураг 6a). LGSVS дараалал (18.7%) нь хамгийн өндөр харьцангуй харьцаатай байсан бол дараа нь PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), болон SARGSWREIVSLS (2.2%) зэрлэг төрлийн оруулга орсон. Эцсийн дөрөв дэх шатанд бид гурван тусдаа амьтнаас бие даан сонгосон хоёр мөчрийг нэгтгэсэн (Зураг 1c). CSF-ээс сэргээгдсэн 925 дараалсан фагийн клонуудаас дөрөв дэх шатанд бид 64 өвөрмөц пептидийн дараалал олсон (Нэмэлт Зураг 6b), тэдгээрийн дунд зэрлэг төрлийн фагийн харьцангуй хувь 0.8% болж буурсан. Дөрөв дэх шатанд хамгийн түгээмэл тохиолддог CSF клонууд нь LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSLNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) болон RLSSVDSDLSGC (3, 2%) байв. %)). Сонгосон пептидүүдийн уртын хүрээ нь NNK номын сангийн дизайнд доройтсон кодонуудыг ашиглах үед номын сангийн праймеруудад нуклеотидын оруулга/устгалт эсвэл дутуу зогсолтын кодонуудаас үүдэлтэй юм. Дутуу зогсолтын кодонууд нь богино пептид үүсгэдэг бөгөөд тэдгээр нь таатай AA мотив агуулдаг тул сонгодог. Синтетик номын сангийн праймеруудад оруулга/устгалтаас урт пептидүүд үүсч болно. Энэ нь зохион бүтээсэн зогсолтын кодоныг хүрээний гадна байрлуулж, шинэ зогсолтын кодон гарч ирэх хүртэл уншдаг. Ерөнхийдөө бид оролтын өгөгдлийг дээжийн гаралтын өгөгдөлтэй харьцуулж бүх дөрвөн сонголтын шатанд баяжуулах коэффициентийг тооцоолсон. Эхний шатны скринингийн хувьд бид зэрлэг хэлбэрийн фагийн титрийг өвөрмөц бус суурь лавлагаа болгон ашигласан. Сонирхолтой нь, сөрөг фагийн сонголт нь эхний тархи нугасны шингэний мөчлөгт маш хүчтэй байсан боловч цусанд байгаагүй (Зураг 3a), энэ нь пептидийн сангийн ихэнх гишүүдийн тархи нугасны шингэний хэсэгт идэвхгүй тархах магадлал багатай эсвэл харьцангуй фагууд нь бактериофагуудаас илүү үр дүнтэй хадгалагдах эсвэл цусны урсгалаас гарах хандлагатай байдагтай холбоотой байж болох юм. Гэсэн хэдий ч хоёр дахь шатны скринингийн үед тархи нугасны шингэний хүчтэй сонголт хоёр кладад ажиглагдсан бөгөөд энэ нь өмнөх шат нь тархи нугасны шингээлтийг дэмждэг пептидүүдийг харуулсан фагуудаар баяжсан болохыг харуулж байна (Зураг 3a). Дахин хэлэхэд, цусыг мэдэгдэхүйц баяжуулаагүй. Мөн гурав, дөрөв дэх шатны үед фагийн клонууд нь тархи нугасны шингэний хэмжээгээр мэдэгдэхүйц баяжсан байв. Сонголтын сүүлийн хоёр шатны хоорондох өвөрмөц пептидийн дараалал бүрийн харьцангуй давтамжийг харьцуулж үзвэл бид дараалал нь сонголтын дөрөв дэх шатанд бүр ч илүү баяжсан болохыг тогтоожээ (Зураг 3b). Пептидийн чиглэлийг хоёуланг нь ашиглан 64 өвөрмөц пептидийн дарааллаас нийт 931 трипептидийн мотив гаргаж авсан. Дөрөв дэх шатанд хамгийн их баяжуулсан мотивуудыг тарьсан номын сантай харьцуулахад бүх шатанд баяжуулах профайлыг нь илүү нарийвчлан судалсан (таслах хэмжээ: 10% баяжуулалт) (Нэмэлт Зураг 6c). Сонголтын ерөнхий хэв маягаас харахад судлагдсан мотивуудын ихэнх нь хоёр сонголтын салбарын өмнөх бүх шатанд баяжсан байв. Гэсэн хэдий ч зарим мотивууд (жишээ нь SGL, VSG, LGS GSV) нь голчлон өөр хувилбар А кладаас гаралтай байсан бол бусад нь (жишээ нь FGW, RTN, WGF, NTR) өөр хувилбар В кладаас баяжсан байв.
Стрептавидины ачаалалтай холбогдсон тархи нугасны шингэнээр баяжуулсан фагаар харуулсан пептидүүд болон биотинжүүлсэн удирдагч пептидүүдийн тархи нугасны шингэнээр дамжин өнгөрөхийг баталгаажуулах.
(a) Тарьсан (оролт = I) фагийн (PFU) титр болон тодорхойлсон тархи нугасны шингэний фагийн титр (гаралт = O) дээр үндэслэн бүх дөрвөн үе шатанд (R1-R4) тооцоолсон баяжуулалтын харьцаа. Сүүлийн гурван үе шатанд (R2-R4) баяжуулалтын хүчин зүйлсийг өмнөх үе шат болон эхний үе шат (R1)-тэй жингийн өгөгдөлтэй харьцуулж тооцоолсон. Нээлттэй баарууд нь тархи нугасны шингэн, сүүдэртэй баарууд нь сийвэн юм. (***p<0.001, Стьюдентын t-тест дээр үндэслэсэн). (b) Сонголтын 4-р үе шатны дараа тархи нугасны шингэний цуглуулсан бүх фагуудтай харьцуулсан харьцаагаар нь эрэмбэлсэн хамгийн элбэг фагийн пептидүүдийн жагсаалт. Сонголтын 3 ба 4-р үе шатуудын хооронд хамгийн түгээмэл зургаан фагийн клоныг өнгөөр ​​тодруулж, дугаарлаж, баяжуулалтын хүчин зүйлсийг харуулсан (оруулга). (c,d) 4-р үе шатны хамгийн их баяжуулсан зургаан фагийн клон, хоосон фаг болон эцэг эхийн фагийн пептидийн сангуудыг тархи нугасны шингээлтийн загварт тус тусад нь шинжилсэн. Тархины шингэн болон цусны дээжийг заасан хугацаанд цуглуулсан. (в) 6 нэр дэвшигч фагийн клон (2 x 1010 фаг/амьтан), хоосон фаг (#1779) (2 x 1010 фаг/амьтан) болон нөөцийн фагийн пептидийн сангууд (2 x 1012 фаг/амьтан)-ыг тэнцүү хэмжээгээр авсан. Сүүлний судсаар дамжуулан канателжуулсан амьтанд дор хаяж 3 CM тарина. Тарьсан фагийн клон болон фагийн пептидийн сан бүрийн тархины шингэнийн фармакокинетикийг цаг хугацааны явцад харуулав. (г) дээж авах хугацаанд бүх сэргээгдсэн фаг/мл-ийн тархины шингэн/цусны дундаж харьцааг харуулав. (д) Дөрвөн синтетик тэргүүлэгч пептид болон нэг холилдсон хяналтын пептидийг биотиныг стрептавидинтэй N-төгсгөлөөр нь (тетрамер дэлгэц) холбож, дараа нь тарьсан (сүүлний судсаар, 10 мг стрептавидин/кг). Дор хаяж гурван интубаци хийсэн харх (N = 3). Тархи нугасны шингэний дээжийг заасан хугацаанд цуглуулж, стрептавидины концентрацийг тархи нугасны шингэний эсрэг стрептавидины ELISA аргаар хэмжсэн (nd = илрээгүй). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA тест дээр үндэслэсэн). (f) Хамгийн их баяжуулсан фаг пептидийн клон #2002 (нил ягаан)-ийн амин хүчлийн дарааллыг 4-р шатны сонгогдсон бусад фаг пептидийн клонуудтай харьцуулсан. Ижил болон төстэй амин хүчлийн хэлтэрхийг өнгөөр ​​кодлосон.
Дөрөв дэх шатанд (Зураг 3b) баяжуулсан бүх фагуудаас CSF түүвэрлэлтийн загварт цаашид тус тусад нь дүн шинжилгээ хийх зорилгоор зургаан нэр дэвшигч клоныг сонгосон. Зургаан нэр дэвшигч фаг, хоосон фаг (оруулгагүй) болон профагийн пептидийн санг гурван кануляттай CM амьтанд тэнцүү хэмжээгээр тарьж, фармакокинетикийг CSF (Зураг 3c) болон цусаар (Нэмэлт Зураг 7) тодорхойлсон. Туршилт хийсэн бүх фагийн клонууд нь CSF-ийн тасалгааг хоосон хяналтын фаг (#1779)-аас 10-1000 дахин өндөр түвшинд чиглүүлсэн. Жишээлбэл, #2020 ба #2077 клонууд нь хяналтын фагаас CSF титр нь ойролцоогоор 1000 дахин өндөр байсан. Сонгосон пептид бүрийн фармакокинетик профайл өөр өөр боловч тэдгээр нь бүгд CSF-ийг өндөр түвшинд байрлуулах чадвартай байдаг. Бид #1903 ба #2011 клонуудын хувьд цаг хугацааны явцад тогтмол бууралт ажиглагдсан бол #2077, #2002 ба #2009 клонуудын хувьд эхний 10 минутын хугацаанд өсөлт нь идэвхтэй тээвэрлэлтийг илтгэж болох боловч баталгаажуулах шаардлагатай. #2020, #2002, болон #2077 клонууд өндөр түвшинд тогтворжсон бол #2009 клоны CSF-ийн концентраци анхны өсөлтийн дараа аажмаар буурсан. Дараа нь бид CSF нэр дэвшигч бүрийн харьцангуй давтамжийг түүний цусны концентрацитай харьцуулсан (Зураг 3d). Бүх дээж авах үед CSF нэр дэвшигч бүрийн дундаж титр ба цусны титрийн хамаарал нь зургаан нэр дэвшигчийн гурав нь цусны CSF-ээр мэдэгдэхүйц баялаг болохыг харуулсан. Сонирхолтой нь, #2077 клон нь цусны тогтвортой байдлыг өндөр харуулсан (Нэмэлт Зураг 7). Пептидүүд өөрсдөө CSF-ийн тасалгаанд фагийн бөөмсөөс бусад ачааг идэвхтэй тээвэрлэх чадвартай гэдгийг баталгаажуулахын тулд бид пептидүүд фагийн бөөмстэй холбогддог N-төгсгөлд биотиноор гаргаж авсан дөрвөн тэргүүлэгч пептидийг нэгтгэсэн. Биотинжүүлсэн пептидүүдийг (2002, 2009, 2020, 2077 дугаартай) стрептавидин (SA)-тай хольж, фагийн геометрийг дуурайлган олон талт хэлбэрийг гаргаж авсан. Энэ формат нь бидэнд цус болон тархи нугасны шингэн дэх SA-ийн өртөлтийг ачаа тээвэрлэгч уургийн пептид болгон хэмжих боломжийг олгосон. Чухал зүйл бол энэхүү SA-тай холбосон форматаар синтетик пептидийг хэрэглэх үед фагийн өгөгдлийг ихэвчлэн хуулбарлах боломжтой байсан (Зураг 3e). Хольсон пептидүүд нь анхны өртөлт багатай, тархи нугасны шингэний цэвэрлэгээ хурдан, 48 цагийн дотор илрэх боломжгүй түвшинтэй байв. Эдгээр пептидийн фагийн клонуудыг тархи нугасны шингэний орон зайд хүргэх замыг ойлгохын тулд бид in vivo судсаар тарьснаас хойш 1 цагийн дараа фагийн хэсгүүдийг шууд илрүүлэхийн тулд иммуногистохими (IHC) ашиглан бие даасан фагийн пептидийн цохилтын байршлыг шинжилсэн. Тархины хялгасан судаснуудад хүчтэй будалтаар #2002, #2077, болон #2009 клонуудыг илрүүлж болох бол хяналтын фаг (#1779) болон #2020 клоныг илрүүлээгүй болохыг тэмдэглэх нь зүйтэй (Нэмэлт Зураг 8). Энэ нь эдгээр пептидүүд нь BBB-ээр дамжин тархинд үзүүлэх нөлөөнд яг адилхан хувь нэмэр оруулдаг болохыг харуулж байна. BSCFB зам нь мөн оролцож болзошгүй тул энэ таамаглалыг шалгахын тулд цаашид нарийвчилсан шинжилгээ хийх шаардлагатай. Хамгийн их баяжуулсан клоны (#2002) амин хүчлийн дарааллыг бусад сонгосон пептидүүдтэй харьцуулахдаа тэдгээрийн зарим нь ижил төстэй амин хүчлийн өргөтгөлтэй болохыг тэмдэглэсэн бөгөөд энэ нь ижил төстэй тээвэрлэлтийн механизмыг илтгэж магадгүй юм (Зураг 3f).
Өвөрмөц плазмын профайл болон цаг хугацааны явцад тархи нугасны шингэн мэдэгдэхүйц нэмэгдсэн тул фагийн дэлгэцийн клон #2077-г 48 цагийн турш илүү гүнзгий судалж, тогтвортой SA түвшинтэй холбоотойгоор ажиглагдсан тархи нугасны шингэнийн хурдацтай өсөлтийг хуулбарлах боломжтой болсон (Зураг 4a). Бусад тодорхойлогдсон фагийн клонуудын хувьд #2077 нь тархины хялгасан судаснуудад хүчтэй будагдсан бөгөөд өндөр нягтралтайгаар харахад хялгасан судасны маркер лектинтэй мэдэгдэхүйц колокализаци, паренхимийн орон зайд зарим будалт ажиглагдсан (Зураг 4b). Пептидээр зуучлагдсан фармакологийн нөлөөг Төв мэдрэлийн системд авах боломжтой эсэхийг судлахын тулд бид i) #2077 дамжин өнгөрөх пептид болон ii) BACE1 дарангуйлагч пептидийн биотинжүүлсэн хувилбаруудыг SA-тай хоёр өөр харьцаатай хольсон туршилт хийсэн. Нэг хослолын хувьд бид зөвхөн BACE1 пептидийн дарангуйлагчийг ашигласан бол нөгөө хослолын хувьд BACE1 пептидийн дарангуйлагчийг #2077 пептидтэй 1:3 харьцаатай хольсон. Хоёр дээжийг хоёуланг нь судсаар тарьж, цус болон тархи нугасны шингэн дэх бета-амилоид пептид 40 (Abeta40)-ийн түвшинг цаг хугацааны явцад хэмжсэн. Abeta40-ийг тархины шингэний хэсэгт хэмжсэн, учир нь энэ нь тархины паренхимд BACE1 дарангуйллыг тусгадаг. Хүлээгдэж байсанчлан хоёр цогцолбор нь Abeta40-ийн цусан дахь түвшинг мэдэгдэхүйц бууруулсан (Зураг 4c, d). Гэсэн хэдий ч зөвхөн 2077 дугаартай пептид болон SA-тай холбогдсон BACE1 пептидийн дарангуйлагчийн холимог агуулсан дээжүүд нь тархи нугасны шингэн дэх Abeta40-ийн мэдэгдэхүйц бууралтад хүргэсэн (Зураг 4c). Өгөгдлөөс харахад 2077 дугаартай пептид нь 60 кДа SA уургийг төв мэдрэлийн системд тээвэрлэх чадвартай бөгөөд мөн BACE1 пептидийн SA-тай холбогдсон дарангуйлагчтай хамт фармакологийн нөлөө үзүүлдэг.
(a) Дор хаяж гурван CM-интубацитай харханд CSF пептид #2077 (RLSSVDSDLSGC) болон тарилга хийгээгүй хяналтын фагийн (#1779) урт хугацааны фармакокинетикийн профайлыг харуулсан Т7 фагийн клональ тарилга (2 × 10 фаг/амьтан). (b) Фаг тарьсан харханд (2 × 10 10 фаг/амьтан) төлөөлөх кортикал микро судасны конфокал микроскопийн зураг нь пептид #2077 болон судаснуудын (лектин) эсрэг будалтыг харуулж байна. Эдгээр фагийн клонуудыг 3 харханд тарьж, перфузи хийхээс өмнө 1 цагийн турш эргэлтэнд оруулсан. Тархийг хэсэгчилж, Т7 фагийн капсидын эсрэг поликлональ FITC-шошготой эсрэгбиеээр будсан. Перфузи хийхээс болон дараа нь бэхлэхээс арван минутын өмнө DyLight594-шошготой лектиныг судсаар тарьсан. Хялгасан судас болон судасны эргэн тойрон дахь тархины эдийн хөндий дэх бичил судас ба фагийн (ногоон) люмены талын лектин будалтыг (улаан) харуулж буй флуоресцент зургууд. Хэмжээний зураас нь 10 µм-тэй тохирч байна. (c, d) Биотинжүүлсэн BACE1 дарангуйлагч пептидийг дангаар нь эсвэл биотинжүүлсэн дамжин өнгөрөх пептид #2077-тай хослуулан стрептавидинтэй холбож, дараа нь дор хаяж гурван канулятлагдсан CM харханд (10 мг стрептавидин/кг) судсаар тарьсан. BACE1 пептидийн дарангуйлагчаар зуучлагдсан Aβ40-ийн бууралтыг заасан хугацааны цэгүүдэд цус (улаан) болон тархи нугасны шингэнд (улбар шар) Aβ1-40 ELISA-аар хэмжсэн. Илүү тодорхой болгохын тулд график дээр 100%-ийн масштабтай цэгэн шугам зурсан. (в) Стрептавидинээр эмчилсэн харханд 3:1 харьцаатай дамжин өнгөрөх пептид #2077 болон BACE1 дарангуйлагч пептидтэй холбогдсон цусан дахь (улаан гурвалжин) болон тархи нугасны шингэн дэх (улбар шар гурвалжин) Aβ40-ийн хувь буурсан. (г) Зөвхөн BACE1 дарангуйлагч пептидтэй холбогдсон стрептавидинээр эмчилсэн харханд цусан дахь Aβ40 (улаан тойрог) болон тархи нугасны шингэн дэх (улбар шар тойрог) хувь буурсан. Хяналтын бүлгийн Aβ-ийн концентраци 420 пг/мл байсан (стандарт хазайлт = 101 пг/мл).
Фагийн дэлгэцийг биоанагаахын судалгааны хэд хэдэн салбарт амжилттай хэрэгжүүлсэн17. Энэ аргыг in vivo судасны олон янз байдлын судалгаанд18,19, мөн тархины судаснуудыг чиглэсэн судалгаанд20,21,22,23,24,25,26 ашигласан. Энэхүү судалгаанд бид энэхүү сонголтын аргыг зөвхөн тархины судаснуудыг чиглэсэн пептидийг шууд тодорхойлоход төдийгүй цус-тархины саадыг нэвтлэх идэвхтэй тээвэрлэлтийн шинж чанартай нэр дэвшигчдийг нээхэд өргөжүүлсэн. Одоо бид CM интубацитай харханд in vivo сонголтын процедурын хөгжлийг тайлбарлаж, тархины шингэний нэвтрэлтийн шинж чанартай пептидийг тодорхойлох боломжийг харуулж байна. 12-мер санамсаргүй пептидийн санг харуулсан T7 фагийг ашиглан бид T7 фаг нь цус-тархины саадыг дасан зохицоход хангалттай жижиг (ойролцоогоор 60 нм диаметртэй)10 бөгөөд ингэснээр цус-тархины саадыг эсвэл хориоид сүлжээг шууд нэвтэлдэг болохыг харуулж чадсан. Бид канателжуулсан CM хархнаас тархи нугасны шингэнийг цуглуулах нь in vivo функциональ скрининг хийх сайн хяналттай арга болохыг ажигласан бөгөөд гаргаж авсан фаг нь зөвхөн судаснуудтай холбогдоод зогсохгүй цус-тархины саадыг нэвтлэн тээвэрлэгчийн үүрэг гүйцэтгэдэг болохыг ажигласан. Цаашилбал, цус цуглуулж, тархи нугасны шингэн болон цуснаас гаргаж авсан фагуудад HTS хэрэглэснээр бид тархи нугасны шингэнийг сонгохдоо цус баяжуулах эсвэл сонгон шалгаруулалтын үе шатуудын хооронд тэлэхэд бэлэн байх нь нөлөөлөөгүй болохыг баталсан. Гэсэн хэдий ч цусны хэсэг нь сонголтын журмын нэг хэсэг юм, учир нь тархи нугасны шингэнд хүрэх чадвартай фагууд тархинд өөрсдийгөө баяжуулахын тулд хангалттай удаан хугацаанд амьд үлдэж, цусны урсгалд эргэлдэх ёстой. Түүхий HTS өгөгдлөөс найдвартай дарааллын мэдээллийг гаргаж авахын тулд бид шинжилгээний ажлын урсгалд платформд тохирсон дарааллын алдаанд тохируулсан шүүлтүүрүүдийг хэрэгжүүлсэн. Кинетик параметрүүдийг скрининг хийх аргад оруулснаар бид зэрлэг хэлбэрийн T7 фагуудын цусан дахь хурдан фармакокинетикийг (t½ ~ 28 мин) баталгаажуулсан24, 27, 28 мөн тархи нугасны шингэн дэх тэдгээрийн хагас задралын хугацааг (t½ ~ 26 мин) минутанд тодорхойлсон. Цус болон тархи нугасны шингэн дэх фармакокинетикийн ижил төстэй профайлууд байгаа хэдий ч фагийн цусан дахь концентрацийн ердөө 0.001% нь тархи нугасны шингэнд илэрсэн нь зэрлэг хэлбэрийн Т7 фагийн цус-тархины саадыг дамжин өнгөрөх хөдөлгөөн бага байгааг харуулж байна. Энэхүү ажил нь in vivo паннинг стратегийг ашиглах үед, ялангуяа цусны эргэлтээс хурдан цэвэрлэгддэг фагийн системд эхний шатны сонголтын ач холбогдлыг онцолж байна, учир нь цөөн тооны клонууд төв мэдрэлийн системийн хэсэгт хүрч чаддаг. Тиймээс эхний шатанд номын сангийн олон янз байдлын бууралт маш их байсан, учир нь энэхүү маш хатуу тархи нугасны шингэн загварт эцэст нь хязгаарлагдмал тооны клон цуглуулсан. Энэхүү in vivo паннинг стратеги нь тархи нугасны шингэн хэсэгт идэвхтэй хуримтлал, цусны хэсэгт клоны амьд үлдэх, эхний 10 минутын дотор цуснаас Т7 фагийн клоныг хурдан зайлуулах зэрэг хэд хэдэн сонголтын алхмуудыг багтаасан (Зураг 1d болон Нэмэлт Зураг 4M). Тиймээс эхний шатны дараа тархи нугасны шингэнд өөр өөр фагийн клонууд тодорхойлогдсон боловч амьтдад ижил анхны санг ашигласан. Энэ нь олон тооны номын сангийн гишүүдтэй эх сангуудын хувьд олон тооны хатуу сонголтын алхамууд нь олон янз байдлыг мэдэгдэхүйц бууруулдаг болохыг харуулж байна. Тиймээс санамсаргүй үйл явдлууд нь анхны сонголтын үйл явцын салшгүй хэсэг болж, үр дүнд ихээхэн нөлөөлнө. Анхны номын сангийн олон клонууд нь тархины шингэний баяжуулалтын хандлагатай маш төстэй байсан байх магадлалтай. Гэсэн хэдий ч ижил туршилтын нөхцөлд ч гэсэн анхны сан дахь тодорхой клон бүрийн тоо цөөн байгаа тул сонголтын үр дүн өөр байж болно.
Тархи нугасны шингэнээр баяжуулсан мотивууд нь цусан дахь мотивуудаас ялгаатай. Сонирхолтой нь, бид амьтдын цусан дахь глицинээр баялаг пептид рүү шилжих анхны шилжилтийг тэмдэглэсэн. (Зураг 1g, Нэмэлт зураг 4e, 4f). Глицин агуулсан фаг нь илүү тогтвортой бөгөөд цусны эргэлтээс гарах магадлал багатай байж болно. Гэсэн хэдий ч эдгээр глицинээр баялаг пептидүүд нь тархи нугасны шингэний дээжинд илрээгүй бөгөөд энэ нь сонгон шалгаруулсан сангууд хоёр өөр сонголтын үе шатаар дамжсан болохыг харуулж байна: нэг нь цусанд, нөгөө нь тархи нугасны шингэнд хуримтлагдахыг зөвшөөрсөн. Дөрөв дэх шатны сонголтоос үүссэн тархи нугасны шингэнээр баяжуулсан клонуудыг өргөн хүрээнд туршиж үзсэн. Тус тусад нь туршсан бараг бүх клонууд нь хоосон хяналтын фагтай харьцуулахад тархи нугасны шингэнээр баяжсан болохыг баталсан. Нэг пептидийн цохилтыг (#2077) илүү нарийвчлан судалсан. Энэ нь бусад цохилтуудтай харьцуулахад сийвэнгийн хагас задралын хугацаа урт байсан (Зураг 3d болон Нэмэлт Зураг 7), мөн сонирхолтой нь энэхүү пептид нь С-төгсгөлд цистеины үлдэгдэл агуулсан байв. Саяхан пептидэд цистеин нэмэх нь альбумин 29-тэй холбогдож тэдгээрийн фармакокинетик шинж чанарыг сайжруулж болохыг харуулсан. Энэ нь одоогоор #2077 пептидийн хувьд тодорхойгүй бөгөөд цаашид судлах шаардлагатай байна. Зарим пептидүүд нь тархи нугасны шингэний баяжуулалтад валентаас хамааралтай байгааг харуулсан (өгөгдлийг харуулаагүй), энэ нь T7 капсидын харуулсан гадаргуугийн геометртэй холбоотой байж болох юм. Бидний ашигласан T7 систем нь фагийн бөөм бүрт пептид тус бүрээс 5-15 хувь байгааг харуулсан. Хархны тархины бор гадарт судсаар тарьсан хар тугалган фагийн нэр дэвшигч клонууд дээр IHC хийсэн (Нэмэлт Зураг 8). Өгөгдлөөс харахад дор хаяж гурван клон (№ 2002, № 2009 ба № 2077) нь цусан дахь ... Энэхүү BBB харилцан үйлчлэл нь тархи нугасны шингэн хуримтлагдахад хүргэдэг үү эсвэл эдгээр клонууд BCSFB руу шууд шилжихэд хүргэдэг үү гэдгийг тодорхойлох шаардлагатай хэвээр байна. Хамгийн чухал нь сонгосон пептидүүд нь нийлэгжиж, уургийн ачаатай холбогдох үед тархи нугасны шингэн тээвэрлэх чадвараа хадгалдаг болохыг бид харуулж байна. N-төгсгөлийн биотинилжүүлсэн пептидийг SA-тай холбох нь цус болон тархи нугасны шингэн дэх тэдгээрийн харгалзах фагийн клонуудтай олж авсан үр дүнг давтдаг (Зураг 3e). Эцэст нь бид хар тугалганы пептид #2077 нь SA-тай холбогдсон биотинилжүүлсэн пептидийн BACE1 дарангуйлагчийн тархины үйл ажиллагааг дэмжиж, тархи нугасны шингэн дэх Abeta40 түвшинг мэдэгдэхүйц бууруулснаар Төв мэдрэлийн системд мэдэгдэхүйц фармакодинамик нөлөө үзүүлдэг болохыг харуулж байна (Зураг 4). Бид бүх цохилтын пептидийн дарааллын гомологийг хайснаар мэдээллийн санд ямар ч гомолог тодорхойлж чадаагүй. T7 номын сангийн хэмжээ ойролцоогоор 109 байхад 12-мерийн онолын номын сангийн хэмжээ 4 x 1015 гэдгийг тэмдэглэх нь чухал юм. Тиймээс бид 12-мерийн пептидийн номын сангийн олон янз байдлын орон зайн зөвхөн багахан хэсгийг сонгосон бөгөөд энэ нь эдгээр тодорхойлогдсон цохилтуудын зэргэлдээ дарааллын орон зайг үнэлснээр илүү оновчтой пептидүүдийг тодорхойлж болно гэсэн үг байж болох юм. Таамаглалын хувьд эдгээр пептидүүдийн байгалийн гомологийг олоогүй байгаагийн нэг шалтгаан нь хувьслын явцад тархинд тодорхой пептидийн мотивууд хяналтгүй орохоос урьдчилан сэргийлэх зорилгоор сонголтоо цуцалсан явдал байж болох юм.
Нийтдээ бидний үр дүнгүүд нь тархины судасны саад тотгорын тээврийн системийг in vivo илүү нарийвчлан тодорхойлж, тодорхойлох ирээдүйн ажлын үндэс суурийг тавьж өгдөг. Энэхүү аргын үндсэн тохиргоо нь зөвхөн тархины судасны холболтын шинж чанартай клонуудыг тодорхойлоод зогсохгүй амжилттай клонууд in vivo биологийн саад тотгорыг ТМС-ийн хэсэгт нэвтрэх дотоод үйл ажиллагаатай байдаг чухал алхамыг багтаасан функциональ сонголтын стратеги дээр суурилдаг. Эдгээр пептидүүдийн тээвэрлэлтийн механизм болон тархины бүсэд өвөрмөц бичил судасны системд холбогдохыг илүүд үздэгийг тодруулах явдал юм. Энэ нь BBB болон рецепторуудыг тээвэрлэх шинэ замыг нээхэд хүргэж болзошгүй юм. Илэрсэн пептидүүд нь тархины судасны рецепторууд эсвэл BBB эсвэл BCSFB-ээр дамжин тээвэрлэгддэг эргэлдэж буй лигандуудтай шууд холбогдож чадна гэж бид үзэж байна. Энэхүү ажилд илрүүлсэн CSF-ийн тээвэрлэлтийн идэвхжилтэй пептид векторуудыг цаашид судлах болно. Бид одоогоор эдгээр пептидүүдийн BBB болон/эсвэл BCSFB-ээр дамжин өнгөрөх чадварын тархины өвөрмөц байдлыг судалж байна. Эдгээр шинэ пептидүүд нь шинэ рецептор эсвэл замыг нээх, биологийн бүтээгдэхүүн гэх мэт макромолекулуудыг тархинд хүргэх шинэ өндөр үр ашигтай платформуудыг хөгжүүлэхэд маш үнэ цэнэтэй хэрэгсэл болно.
Өмнө нь тайлбарласан аргын өөрчлөлтийг ашиглан том цистерна (CM)-ийг гуурсжуулна. Мэдээгүйжүүлсэн Вистар хархнууд (200-350 гр)-ыг стереотаксик аппарат дээр суурилуулж, хуссан, асептик байдлаар бэлтгэсэн хуйх дээр голын зүсэлт хийж, гавлын ясыг ил гаргана. Дээд бүсний хэсэгт хоёр нүх өрөмдөж, нүхэнд бэхэлгээний боолтыг бэхлэнэ. Зэвэрдэггүй ган канюлийг CM руу стереотаксик чиглүүлэхийн тулд хажуугийн дагзны оройд нэмэлт нүх өрөмдсөн. Канюлийн эргэн тойронд шүдний цемент түрхэж, боолтоор бэхлэнэ. Фото хатаж, цемент хатуурсны дараа арьсны шархыг 4/0 супрамид оёдолоор хаасан. Канюлийг зөв байрлуулсан нь тархи нугасны шингэн (CSF) аяндаа гоожиж байгааг баталгаажуулдаг. Хархыг стереотаксик аппаратаас гаргаж, мэс заслын дараах зохих тусламж, өвдөлт намдаах эмчилгээ хийлгэж, тархи нугасны шингэнд цусны шинж тэмдэг илрэх хүртэл дор хаяж нэг долоо хоног эдгэрнэ. Вистар хархнуудыг (Crl:WI/Han) Чарльз Риверээс (Франц) авсан. Бүх хархыг эмгэг төрүүлэгчгүй тодорхой нөхцөлд хадгалсан. Амьтны бүх туршилтыг Швейцарийн Базель хотын Мал эмнэлгийн газраас зөвшөөрсөн бөгөөд 2474 дугаартай Амьтны лицензийн дагуу (Хархны тархи нугасны шингэн болон тархинд эмчилгээний зорилгоор ашиглагдах бодисын түвшинг хэмжих замаар тархины идэвхтэй тээвэрлэлтийг үнэлэх) гүйцэтгэсэн.
Хархыг гартаа CM канюля барин ухаантай байлга. Датураг канюляас гаргаж аваад аяндаа урсаж буй 10 мкл тархи нугасны шингэн цуглуул. Канюляны нэвчилт эцэстээ алдагдсан тул энэ судалгаанд зөвхөн цусны бохирдол эсвэл өнгө өөрчлөгдсөн шинж тэмдэггүй тунгалаг тархи нугасны шингэний дээжийг оруулсан болно. Үүний зэрэгцээ сүүлний үзүүрт жижиг зүсэлтээс ойролцоогоор 10-20 мкл цусыг гепарин (Sigma-Aldrich) агуулсан хоолой руу авсан. Тархи нугасны шингэн болон цусыг T7 фагийг судсаар тарьсны дараа янз бүрийн цаг үед цуглуулсан. Тархи нугасны шингэн дээж бүрийг цуглуулахаас өмнө ойролцоогоор 5-10 мкл шингэнийг хаясан бөгөөд энэ нь катетерын үхсэн эзэлхүүнтэй тохирч байна.
Номын сангуудыг T7Select системийн гарын авлагад тайлбарласны дагуу T7Select 10-3b векторыг ашиглан үүсгэсэн (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Товчхондоо, санамсаргүй 12-мер ДНХ-ийн оруулгыг дараах форматаар нэгтгэсэн:
NNK кодоныг давхар зогсолтын кодон болон оруулгад амин хүчлийн хэт их илэрхийлэл үүсэхээс зайлсхийхийн тулд ашигласан. N нь нуклеотид бүрийн гараар холилдсон эквимоляр харьцаа, K нь аденин ба цитозин нуклеотидын гараар холилдсон эквимоляр харьцаа юм. Дан судалтай бүсүүдийг dNTP (Novagen) болон Klenow фермент (New England Biolabs)-тай хамт Klenow буферт (New England Biolabs) 37°C-д 3 цагийн турш инкубаци хийж давхар судалтай ДНХ болгон хувиргасан. Урвалын дараа давхар судалтай ДНХ-ийг EtOH тунадасжуулалтаар гаргаж авсан. Үүссэн ДНХ-ийг EcoRI болон HindIII (хоёулаа Roche-ийн) рестрикцийн ферментүүдээр задалсан. Дараа нь задалж цэвэршүүлсэн (QIAquick, Qiagen) оруулга (T4 лигаза, New England Biolabs)-ийг 10B капсидын генийн 348 амин хүчлийн дараа урьдчилан задалсан T7 вектор руу рам дотор холбосон. Боолт хийх урвалыг in vitro савлагаанд оруулахаас өмнө 16°C-д 18 цагийн турш инкубаци хийсэн. In vitro фагийн савлагааг T7Select 10-3b клонжуулах хэрэгсэл (Novagen)-тэй хамт ирсэн зааврын дагуу гүйцэтгэсэн бөгөөд савлагааны уусмалыг Escherichia coli (BLT5615, Novagen) ашиглан лизис болгохын тулд нэг удаа олшруулсан. Лизатуудыг центрифугээр ялгаж, титрлэж, -80°C-д глицеролын нөөц уусмал болгон хөлдөөсөн.
Өмчийн 454/Roche-amplicon хайлуулах праймеруудыг ашиглан шөл эсвэл тавган дээр өсгөсөн фагийн хувьсах бүс нутгуудын шууд PCR олшруулалт. Урагш хайлуулах праймер нь хувьсах бүс (NNK) 12 (загварт тохирсон), GS FLX Titanium Adapter A болон дөрвөн суурьтай номын сангийн түлхүүрийн дараалал (TCAG)-ийг хажуу тийш нь байрлуулсан дарааллыг агуулдаг (Нэмэлт Зураг 1a):
Урвуу хайлуулах праймер нь бөмбөлгүүдийг барихад бэхлэгдсэн биотин болон эмульсийн ПГУ-ын үед клональ олшруулалтад шаардлагатай GS FLX титан адаптер B агуулдаг:
Дараа нь ампликонуудыг 454 GS-FLX Titanium протоколын дагуу 454/Roche пиросеквенцид оруулсан. Гараар Sanger дарааллыг тогтоохын тулд (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl ДНХ анализатор) T7 фагийн ДНХ-г PCR-ээр олшруулж, дараах праймер хосоор дараалуулсан:
Тусдаа товруунаас авсан оруулгуудыг Roche Fast Start ДНХ полимераза иж бүрдэл ашиглан (үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу) PCR олшруулалтад оруулсан. Халуунаар эхлүүлэх (95 °C-д 10 минут) болон 35 удаагийн өдөөлтийн цикл (95 °C-д 50 секунд, 50 °C-д 1 минут, 72 °C-д 1 минут) гүйцэтгэнэ.
Номын сангаас авсан фаг, зэрлэг хэлбэрийн фаг, тархи нугасны шингэн болон цуснаас аврагдсан фаг, эсвэл бие даасан клонуудыг Escherichia coli BL5615-д сүрьеэгийн шөлөнд (Sigma Aldrich) эсвэл 500 см2 аяганд (Thermo Scientific) 37°C-д 4 цагийн турш олшруулсан. Фагийг ялтсуудаас Tris-EDTA буфер (Fluka Analytical)-аар зайлах эсвэл ариутгасан пипеткийн үзүүрээр товруу цуглуулах замаар гаргаж авсан. Фагуудыг өсгөврийн дээд давхарга эсвэл хандлах буфераас нэг удаагийн полиэтилен гликол (PEG 8000) тунадасжуулалтаар (Promega) тусгаарлаж, Tris-EDTA буферт дахин уусгасан.
Судсаар (судсаар) тарихаас өмнө (500 мкл/амьтан) олшруулсан фагийг эндотоксиныг зайлуулах бөмбөлгүүдийг (Miltenyi Biotec) ашиглан 2-3 удаа эндотоксиныг зайлуулсан. Эхний шатанд 2×1012 фаг, хоёр дахь шатанд 2×1010 фаг, гурав, дөрөв дэх сонголтын шатанд амьтан тус бүрээс 2×109 фаг оруулсан. Заасан хугацаанд цуглуулсан тархи нугасны шингэн болон цусны дээж дэх фагийн агууламжийг үйлдвэрлэгчийн зааврын дагуу (T7Select системийн гарын авлага) товруу тоолох замаар тодорхойлсон. Фагийн сонголтыг цэвэршүүлсэн сангуудыг сүүлний судсанд судсаар тарих эсвэл өмнөх сонголтын шатанд тархи нугасны шингэнээс гаргаж авсан фагийг дахин тарих замаар гүйцэтгэсэн бөгөөд дараагийн цуглуулгыг тархи нугасны шингэн болон цусны дээжийг тус тус 10 минут, 30 минут, 60 минут, 90 минут, 120 минут, 180 минут, 240 минутад тархи нугасны шингэн болон цусны дээжээр хийсэн. Нийт дөрвөн удаагийн in vivo паннинг хийсэн бөгөөд сонгогдсон хоёр мөчрийг тусад нь хадгалж, эхний гурван удаагийн сонголтын үеэр шинжилсэн. Эхний хоёр удаагийн сонголтоос тархи нугасны шингэнээс гаргаж авсан бүх фагийн оруулгыг 454/Roche пиросеквенцид оруулсан бол сүүлийн хоёр удаагийн сонголтоос тархи нугасны шингэнээс гаргаж авсан бүх клоныг гараар дараалалд оруулсан. Эхний удаагийн сонголтоос гарсан бүх цусны фагийг мөн 454/Roche пиросеквенцид оруулсан. Фагийн клоныг тарихын тулд сонгосон фагуудыг E. coli (BL5615)-д 500 см2 хэмжээтэй хавтан дээр 37°C-д 4 цагийн турш өсгөвөрлөв. Тус тусад нь сонгосон болон гараар дараалалд оруулсан клонуудыг сүрьеэгийн орчинд үржүүлэв. Фагийг гаргаж аваад цэвэршүүлж, эндотоксиныг зайлуулсны дараа (дээр дурдсанчлан) 300 мкл хэмжээтэй 2×1010 фаг/амьтныг нэг сүүлний судсанд судсаар тарьсан.
Дарааллын өгөгдлийг урьдчилан боловсруулах болон чанарын шүүлтүүр хийх. Түүхий 454/Roche өгөгдлийг үйлдвэрлэгчийн програм хангамж ашиглан хоёртын стандарт урсгалын газрын зургийн форматаас (sff) Пирсоны хүний ​​унших боломжтой формат (fasta) руу хөрвүүлсэн. Нуклеотидын дарааллыг цаашид боловсруулах ажлыг доор тайлбарласны дагуу өөрийн C програмууд болон скриптүүд (гараагүй програм хангамжийн багц) ашиглан гүйцэтгэсэн. Анхдагч өгөгдлийн шинжилгээнд хатуу олон үе шаттай шүүлтүүрийн журмууд багтсан болно. Хүчинтэй 12мер оруулгын ДНХ-ийн дараалал агуулаагүй уншилтыг шүүхийн тулд уншилтыг дэлхийн Needleman-Wunsch тестийг ашиглан эхлэх шошго (GTGATGTCGGGGGATCCGAATTCT), зогсоох шошго (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) болон арын оруулга (CCCTGCAGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) руу дараалан уялдуулсан. уялдуулга нь уялдуулга бүрт 2 хүртэлх зөрүүг зөвшөөрсөн31. Тиймээс эхлэх болон зогсоох шошгогүй уншлага болон арын оруулга агуулсан уншилтыг, өөрөөр хэлбэл зөвшөөрөгдсөн тооноос давсан уялдуулга зэргийг сангаас хассан. Үлдсэн уншлагын хувьд, эхлэх тэмдэгээс эхлээд зогсолтын тэмдгийг анхны уншлагын дарааллаас салгаж, цаашид боловсруулсан (цаашид "оруулга" гэх) N-mer ДНХ-ийн дарааллыг үргэлжлүүлнэ. Оруулгыг орчуулсны дараа праймерын 5' төгсгөлд байрлах эхний зогсолтын кодоны дараах хэсгийг оруулгаас хасна. Үүнээс гадна, праймерын 3' төгсгөлд бүрэн бус кодон руу хөтөлдөг нуклеотидуудыг мөн хассан. Зөвхөн дэвсгэр дарааллыг агуулсан оруулгыг хасахын тулд "PAG" амин хүчлийн хэв маягаар эхэлсэн орчуулагдсан оруулгуудыг мөн хассан. Оруулгын дараах урт нь 3-аас бага амин хүчлээс бүрдсэн пептидүүдийг сангаас хассан. Эцэст нь оруулгын сан дахь илүүдлийг арилгаж, өвөрмөц оруулга бүрийн давтамжийг тодорхойлно уу. Энэхүү шинжилгээний үр дүнд нуклеотидын дарааллын (оруулга) жагсаалт болон тэдгээрийн (унших) давтамжууд багтсан болно (Нэмэлт зураг 1c ба 2).
Дарааллын ижил төстэй байдлаар N-mer ДНХ-ийн бүлгийн оруулга: 454/Рошийн өвөрмөц дарааллын алдааг (жишээлбэл, гомополимерийн өргөтгөлүүдийн дарааллын асуудал) арилгах, чухал бус давхардлыг арилгахын тулд өмнө нь шүүгдсэн N-mer ДНХ-ийн дарааллын оруулгуудыг (оруулга) ижил төстэй байдлаар нь эрэмбэлдэг. оруулгуудыг (2 хүртэлх таарахгүй суурь зөвшөөрөгдөнө) дараах байдлаар тодорхойлсон давталтын алгоритмыг ашиглан эрэмбэлдэг: оруулгуудыг эхлээд давтамжаар нь (хамгийн ихээс хамгийн бага хүртэл), хэрэв тэдгээр нь ижил байвал уртаар нь хоёрдогч эрэмбэлэх замаар (хамгийн уртаас хамгийн богино хүртэл) эрэмбэлдэг. Тиймээс хамгийн олон давтамжтай, хамгийн урт оруулгууд нь эхний "бүлэг"-ийг тодорхойлдог. Бүлгийн давтамжийг түлхүүр давтамжаар тохируулдаг. Дараа нь эрэмбэлэгдсэн жагсаалтад үлдсэн оруулга бүрийг хосоор нь Нийдлман-Вуншийн уялдуулалтаар бүлэгт нэмэхийг оролдсон. Хэрэв уялдуулалт дахь таарахгүй байдал, оруулга эсвэл устгалын тоо 2-ын босго хэмжээнээс хэтрэхгүй бол бүлэгт оруулга нэмж, бүлгийн нийт давтамжийг оруулгыг хэр олон удаа нэмснээс хамааран нэмэгдүүлдэг. Бүлэгт нэмсэн оруулгуудыг ашигласан гэж тэмдэглэж, цаашдын боловсруулалтаас хасдаг. Хэрэв оруулах дарааллыг аль хэдийн байгаа бүлэгт нэмж чадахгүй бол оруулах дарааллыг тохирох оруулах давтамжтай шинэ бүлэг үүсгэхэд ашиглаж, ашигласан гэж тэмдэглэнэ. Оруулсан дараалал бүрийг шинэ бүлэг үүсгэхэд ашигласан эсвэл аль хэдийн байгаа бүлэгт оруулж болох үед давталт дуусна. Эцсийн эцэст нуклеотидуудаас бүрдсэн бүлэглэсэн оруулгууд эцэст нь пептидийн дараалал (пептидийн сан) болж хувирдаг. Энэхүү шинжилгээний үр дүн нь дараалсан уншлагын тоог бүрдүүлдэг оруулгууд болон тэдгээрийн харгалзах давтамжуудын багц юм (Нэмэлт Зураг 2).
Мотив үүсгэлт: Өвөрмөц пептидийн жагсаалтад үндэслэн доор үзүүлсэн шиг бүх боломжит амин хүчлийн хэв маягийг (aa) агуулсан номын санг үүсгэсэн. 3 урттай боломжит хэв маяг бүрийг пептидээс гаргаж аваад түүний урвуу хэв маягийг бүх хэв маягийг (трипептид) агуулсан нийтлэг мотив сантай хамт нэмсэн. Өндөр давтагдсан мотивын сангуудыг дарааллаар нь гаргаж, илүүдлийг арилгасан. Дараа нь мотивын сан дахь трипептид бүрийн хувьд бид тооцооллын хэрэгслийг ашиглан номын санд байгаа эсэхийг шалгасан. Энэ тохиолдолд олдсон мотив трипептидийг агуулсан пептидийн давтамжийг нэмж, мотивын сан дахь мотивт ("мотивын тоо") оноодог. Мотив үүсгэсний үр дүн нь трипептид (мотив)-ын бүх тохиолдлууд болон тэдгээрийн харгалзах утгыг агуулсан хоёр хэмжээст массив бөгөөд эдгээр нь уншлагыг шүүж, бүлэглэж, орчуулах үед харгалзах мотивийг үүсгэдэг дарааллын уншлагын тоо юм. Дээр дэлгэрэнгүй тайлбарласан хэмжүүрүүд.
Мотивын тоо болон харгалзах тархалтын диаграммыг хэвийн болгох: Дээж бүрийн мотивын тоог дараах байдлаар хэвийн болгосон.
энд ni нь i сэдэв агуулсан уншлагын тоо юм. Тиймээс vi нь дээжинд i мотив агуулсан уншлагын (эсвэл пептидийн) хувийг илэрхийлнэ. Хэвийн бус мотивын тооны P-утгыг Фишерийн нарийн тестийг ашиглан тооцоолсон. Мотивын тооны коррелограммын хувьд Спирманы корреляцийг R-тэй хэвийн болгосон мотивын тоог ашиглан тооцоолсон.
Пептидийн сангийн байрлал бүрт амин хүчлүүдийн агуулгыг дүрслэн харуулахын тулд вэб логограмм 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) үүсгэсэн. Эхлээд 12-мер пептидийн байрлал бүрт амин хүчлүүдийн агуулгыг 20×12 матрицад хадгалдаг. Дараа нь байрлал бүрт ижил харьцангуй амин хүчлийн агууламжтай 1000 пептидийн багцыг fasta-sequence форматаар үүсгэж, өгөгдсөн пептидийн сангийн байрлал бүрт харьцангуй амин хүчлийн агуулгын график дүрслэлийг үүсгэдэг вэб лого 3-т оролт болгон өгдөг. Олон хэмжээст өгөгдлийн багцыг дүрслэн харуулахын тулд R-д дотооддоо боловсруулсан хэрэгсэл (biosHeatmap, хараахан худалдаанд гараагүй R багц) ашиглан дулааны газрын зургийг үүсгэсэн. Дулааны газрын зурагт үзүүлсэн дендрограммыг Уордын шаталсан кластерчлалын аргыг ашиглан Евклидийн зайн метрик ашиглан тооцоолсон. Мотив онооны өгөгдлийн статистик шинжилгээнд хэвийн бус онооны P утгыг Фишерийн яг тест ашиглан тооцоолсон. Бусад өгөгдлийн багцын P-утгуудыг R-д Оюутны t-тест эсвэл ANOVA ашиглан тооцоолсон.
Сонгосон фагийн клон болон оруулгагүй фагуудыг сүүлний судсаар судсаар тарьсан (2×1010 фаг/амьтан 300 мкл PBS-д). Перфузи болон дараагийн бэхлэлтээс арван минутын өмнө ижил амьтдад 100 мкл DyLight594-шошготой лектин (Vector Laboratories Inc., DL-1177) судсаар тарьсан. Фагийг тарьснаас хойш 60 минутын дараа харханд 50 мл PBS-ээр зүрхээр нь перфузи хийж, дараа нь 50 мл 4% PFA/PBS-ийг хэрэглэсэн. Тархины дээжийг 4% PFA/PBS-д нэмж шөнөжин бэхлээд, 4°C-д 30% сахарозд дэвтээсэн. Дээжийг OCT хольцонд хөлдөөж хөлдөөсөн. Хөлдөөсөн дээжийн иммуногистохимийн шинжилгээг өрөөний температурт 30 µм криосекц дээр 1% BSA-аар хааж, 4 °C-д T7 фагийн (Novus NB 600-376A) эсрэг поликлональ FITC-шошготой эсрэгбиеээр инкубацлав. Шөнөжин инкубацлав. Эцэст нь хэсгүүдийг PBS-ээр 3 удаа угааж, конфокал лазер микроскопоор (Leica TCS SP5) шалгав.
Хамгийн багадаа 98%-ийн цэвэршилттэй бүх пептидийг GenScript USA-аар нийлэгжүүлж, биотинжүүлж, лиофилжүүлсэн. Биотин нь N-төгсгөлд нэмэлт гурвалсан глициний зайгаар холбогддог. Масс спектрометр ашиглан бүх пептидийг шалгана уу.
Стрептавидин (Sigma S0677)-ийг биотинжүүлсэн пептидийн 5 дахин их эквимоляр илүүдэл, биотинжүүлсэн BACE1 дарангуйлагч пептид эсвэл биотинжүүлсэн BACE1 дарангуйлагч пептид ба BACE1 дарангуйлагч пептидийн хослол (3:1 харьцаа)-тай 5-10% DMSO-д хольж/PBS-д инкубацлав. Тариа хийхээс 1 цагийн өмнө өрөөний температурт байлгана. Стрептавидинтэй хольсон пептидийг тархины хөндийтэй хархны сүүлний судаснуудын нэгэнд 10 мг/кг тунгаар судсаар тарьсан.
Стрептавидин-пептидийн цогцолборын концентрацийг ELISA-аар үнэлсэн. Nunc Maxisorp микротитр хавтанг (Sigma) 4°C-т 1.5 мкг/мл хулганы стрептавидин эсрэгбие (Thermo, MA1-20011)-ээр шөнөжин бүрсэн. Блоклосны дараа (блоклогчийн буфер: 140 нМ NaCL, 5 мМ EDTA, 0.05% NP40, 0.25% желатин, 1% BSA) өрөөний температурт 2 цагийн турш байлгасны дараа хавтанг 0.05% Tween-20/PBS (угаах буфер)-ээр 3 секундын турш угаана. Тархины шингэн болон сийвэнгийн дээжийг блоклогчийн буфераар шингэлсэн худагт (плазм 1:10,000, CSF 1:115) нэмнэ. Дараа нь хавтанг илрүүлэх эсрэгбие (1 мкг/мл, стрептавидин-HRP-ийн эсрэгбие, Novus NB120-7239) 4°C-т шөнөжин инкубацлав. Гурван удаа угаах алхам хийсний дараа стрептавидиныг TMB субстратын уусмалд (Roche) 20 минут хүртэл инкубаци хийж илрүүлсэн. 1M H2SO4-ээр өнгөний үүсэлтийг зогсоосны дараа 450 нм-д шингээлтийг хэмжинэ.
Стрептавидин-пептид-BACE1 дарангуйлагч цогцолборын үйл ажиллагааг үйлдвэрлэгчийн протоколын дагуу (Wako, 294-64701) Aβ(1-40) ELISA аргаар үнэлсэн. Товчхондоо, тархи нугасны шингэний дээжийг стандарт шингэлэгчд (1:23) шингэлж, BNT77 барих эсрэгбиеээр бүрсэн 96 нүхтэй хавтан дээр 4°C-т хонуулсан. Таван удаа угаах үе шатны дараа HRP-тэй холбосон BA27 эсрэгбие нэмж, 4°C-т 2 цаг инкубаци хийж, дараа нь таван удаа угаах үе шаттайгаар хийсэн. Aβ(1–40)-ийг өрөөний температурт TMB уусмалд 30 минут инкубаци хийж илрүүлсэн. Өнгөний хөгжил зогссон уусмалаар зогссоны дараа 450 нм-д шингээлтийг хэмжинэ. Плазмын дээжийг Aβ(1–40) ELISA-аас өмнө хатуу фазын хандлалтад оруулсан. Плазмыг 96 нүхтэй хавтан дээр 0.2% DEA (Sigma) нэмж, өрөөний температурт 30 минут инкубацид оруулсан. SPE хавтангуудыг (Oasis, 186000679) ус болон 100% метанолоор дараалан угаасны дараа плазмын дээжийг SPE хавтангууд дээр нэмж, бүх шингэнийг зайлуулав. Дээжийг угааж (эхлээд 5% метанолоор, дараа нь 30% метанолоор), 2% NH4OH/90% метанолоор элюатлав. Элюатыг 55°C-д 99 минутын турш тогтмол N2 гүйдэлд хатаасаны дараа дээжийг стандарт шингэлэгч бодисоор багасгаж, дээр дурдсанчлан Aβ(1–40) хэмжилтийг хийв.
Энэ өгүүллийг хэрхэн иш татах вэ: Урич, Э. нар. In vivo-д тодорхойлогдсон дамжин өнгөрөх пептидийг ашиглан тархинд ачаа хүргэх нь. Шинжлэх ухаан. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Лихота Ж., Скьорринге Т., Томсен Л.Б. болон Моос Т. Зорилтот эмчилгээг ашиглан тархинд макромолекулын эмийг хүргэх нь. Мэдрэлийн химийн сэтгүүл 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Браснжевич, И., Штайнбуш, Х.В., Шмиц, К., болон Мартинез-Мартинез, П. Цус-тархины саадыг нэвтлэн пептид ба уургийн эмийг хүргэх нь. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, ВМ Цус-тархины саад тотгор: тархины эмийн хөгжлийн саад тотгор. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К.Е., Дункан, Ж.А., Стопа, Э.Г., болон Бирд, А. Хороид мембран-CSF замаар дамжуулан тархинд эмийн хүргэлтийг сайжруулж, чиглүүлэх хэтийн төлөв. Эмийн судалгаа 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардридж, ВМ Тархинд хүргэх молекулын Трояны морь ашиглан биофармацевтикийн шинэчлэл. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардридж, WM рецептороор зуучлагдсан пептидийн цус-тархины саад тотгороор дамжин тээвэрлэлт. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Нивоэнер, Ж. нар. Монокаль шаттл ашиглан тархины нэвтрэлт болон эмчилгээний эсрэгбиеийн үр нөлөөг нэмэгдүүлэх. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Биен-Ли, Н. нар. Трансферрин рецептор (TfR)-ийн тээвэрлэлт нь TfR эсрэгбиеийн хамаарлын хувилбаруудын тархины шингээлтийг тодорхойлдог. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).