Kiitos vierailustasi Nature.comissa.Käytät selainversiota, jossa on rajoitettu CSS-tuki.Parhaan kokemuksen saamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan Yhteensopivuustila käytöstä Internet Explorerissa).Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Näyttää kolmen dian karusellin kerralla.Käytä Edellinen- ja Seuraava-painikkeita siirtyäksesi kolmen dian läpi kerrallaan tai käytä lopussa olevia liukusäädinpainikkeita siirtyäksesi kolmen dian läpi kerrallaan.
Veri-aivoeste ja veri-aivoeste estävät bioterapeuttisia aineita pääsemästä kohteisiinsa keskushermostossa, mikä estää neurologisten sairauksien tehokkaan hoidon.Löytääksemme uusia aivokuljettajia in vivo, otimme käyttöön T7-faagipeptidikirjaston ja keräsimme sarjaan verta ja aivo-selkäydinnestettä (CSF) käyttämällä kanyloitua tietoista suuren rottien mallia.Spesifiset faagikloonit rikastuivat suuresti CSF:ssä neljän valintakierroksen jälkeen.Yksittäisten ehdokaspeptidien testaus paljasti CSF:n yli 1000-kertaisen rikastumisen.Peptidivälitteisen aivoihin kulkeutumisen bioaktiivisuus vahvistettiin amyloidi-p:n 40 %:n alenemisella aivo-selkäydinnesteessä käyttämällä BACE1-peptidi-inhibiittoria, joka oli liitetty tunnistettuun uuteen kulkupeptidiin.Nämä tulokset viittaavat siihen, että in vivo -faagivalintamenetelmillä identifioidut peptidit voivat olla käyttökelpoisia vehikkeleitä makromolekyylien systeemiseen kuljettamiseen aivoihin terapeuttisella vaikutuksella.
Keskushermostoon (CNS) kohdistettu hoitotutkimus on keskittynyt pitkälti optimoitujen lääkkeiden ja aineiden tunnistamiseen, joilla on keskushermostoon kohdistuvia ominaisuuksia, ja vähemmän vaivaa on löydetty mekanismeja, jotka ohjaavat aktiivista lääkkeen toimittamista aivoihin.Tämä alkaa nyt muuttua, kun lääkkeiden jakelu, erityisesti suuret molekyylit, on olennainen osa nykyaikaista neurotieteen lääkekehitystä.Keskushermoston ympäristöä suojaa hyvin aivoverenkierron estejärjestelmä, joka koostuu veri-aivoesteestä (BBB) ​​ja veri-aivoesteestä (BCBB)1, mikä tekee lääkkeiden kuljettamisesta aivoihin haastavaa1,2.On arvioitu, että lähes kaikki suurimolekyyliset lääkkeet ja yli 98 % pienimolekyylisistä lääkkeistä eliminoituvat aivoista3.Siksi on erittäin tärkeää tunnistaa uusia aivojen kuljetusjärjestelmiä, jotka tarjoavat tehokkaan ja spesifisen terapeuttisten lääkkeiden toimituksen keskushermostoon 4,5.BBB ja BCSFB tarjoavat kuitenkin myös erinomaisen mahdollisuuden lääkkeiden toimittamiseen, koska ne tunkeutuvat kaikkiin aivojen rakenteisiin niiden laajan verisuoniston kautta.Siten nykyiset pyrkimykset käyttää ei-invasiivisia menetelmiä kuljettamiseen aivoihin perustuvat suurelta osin reseptorivälitteisen kuljetuksen (PMT) mekanismiin käyttämällä endogeenistä BBB6-reseptoria.Huolimatta viimeaikaisista tärkeistä edistysaskeleista transferriinireseptorireitillä7, 8, tarvitaan edelleen uusien kuljetusjärjestelmien kehittämistä, joilla on parannetut ominaisuudet.Tätä tarkoitusta varten tavoitteemme oli tunnistaa peptidejä, jotka pystyvät välittämään CSF-kuljetusta, koska niitä voitaisiin periaatteessa käyttää makromolekyylien kuljettamiseen keskushermostoon tai uusien reseptorireittien avaamiseen.Erityisesti aivoverisuonijärjestelmän spesifiset reseptorit ja kuljettajat (BBB ja BSCFB) voivat toimia mahdollisina kohteina bioterapeuttisten lääkkeiden aktiiviselle ja spesifiselle kuljetukselle.Aivo-selkäydinneste (CSF) on suonipunoksen (CS) eritystuote, ja se on suorassa kosketuksessa aivojen interstitiaaliseen nesteeseen subarachnoidaalisen tilan ja kammiotilan kautta4.Äskettäin on osoitettu, että subarachnoidaalinen aivo-selkäydinneste diffundoituu liikaa aivojen interstitiumiin9.Toivomme pääsevämme parenkymaaliseen tilaan käyttämällä tätä subarachnoidaalista sisäänvirtaustietä tai suoraan BBB:n kautta.Tämän saavuttamiseksi otimme käyttöön vankan in vivo -faagivalintastrategian, joka ihanteellisesti identifioi peptidit, joita kuljetetaan jommallakummalla näistä kahdesta erillisestä reitistä.
Kuvaamme nyt peräkkäistä in vivo faaginäytön seulontamenetelmää CSF-näytteenotolla yhdistettynä korkean suorituskyvyn sekvensointiin (HTS) ensimmäisten valintakierrosten seuraamiseksi suurimmalla kirjastodiversiteetillä.Seulonta suoritettiin tajuissaan oleville rotille, joilla oli pysyvästi istutettu suuri säiliö (CM) kanyyli veren kontaminaation välttämiseksi.Tärkeää on, että tämä lähestymistapa valitsee sekä aivoihin kohdistamisen että peptidit, joilla on kuljetusaktiivisuutta aivoverenkierron läpi.Käytimme T7-faageja niiden pienen koon (~ 60 nm)10 vuoksi ja ehdotimme, että ne soveltuvat rakkuloiden kuljettamiseen, jotka mahdollistavat endoteelin ja/tai epiteeli-ydinesteen solunsisäisen risteyksen.Neljän panorointikierroksen jälkeen faagipopulaatiot eristettiin, mikä osoitti vahvaa in vivo CSF-rikastumista ja aivojen mikroverisuoniyhdistystä.Tärkeää on, että pystyimme vahvistamaan havaintomme osoittamalla, että edulliset ja kemiallisesti syntetisoidut parhaat ehdokaspeptidit pystyvät kuljettamaan proteiinilastia aivo-selkäydinnesteeseen.Ensinnäkin keskushermoston farmakodynaamiset vaikutukset määritettiin yhdistämällä johtava transit-peptidi BACE1-peptidin inhibiittoriin.Sen lisäksi, että osoitamme, että in vivo toiminnalliset seulontastrategiat voivat tunnistaa uudet aivojen kuljetuspeptidit tehokkaiksi proteiinilastin kantajiksi, odotamme samanlaisten toiminnallisten valintamenetelmien olevan myös tärkeitä uusien aivojen kuljetusreittien tunnistamisessa.
Plakkia muodostaviin yksiköihin (PFU) perustuen faagin pakkausvaiheen jälkeen suunniteltiin ja luotiin satunnaisten 12-meeristen lineaaristen T7-faagipeptidien kirjasto, jonka monimuotoisuus oli noin 109 (katso Materiaalit ja menetelmät).On tärkeää huomata, että analysoimme tämän kirjaston huolellisesti ennen in vivo panorointia.Faagikirjastonäytteiden PCR-monistus käyttäen modifioituja alukkeita tuotti amplikoneja, jotka olivat suoraan sovellettavissa HTS:ään (täydentävä kuva 1a).Johtuen a) HTS11-sekvensointivirheistä, b) vaikutuksesta alukkeiden (NNK)1-12 laatuun ja c) villityypin (wt) faagin (luuranko-insertien) läsnäolon vuoksi valmiustilassa kirjastossa otettiin käyttöön sekvenssisuodatusmenettely vain varmennettujen sekvenssitietojen poimimiseksi (lisäkuva 1b).Nämä suodatusvaiheet koskevat kaikkia HTS-sekvensointikirjastoja.Standardikirjastosta saatiin yhteensä 233 868 lukua, joista 39% läpäisi suodatuskriteerit ja käytettiin kirjastoanalyysiin ja valintaan seuraaville kierroksille (lisäkuva 1c – e).Lukemat olivat pääasiassa pituudeltaan 3 emäsparin kerrannaisia, ja niiden huippu oli 36 nukleotidissa (lisäkuva 1c), mikä vahvistaa kirjaston suunnittelun (NNK) 1-12.On huomattava, että noin 11 % kirjaston jäsenistä sisälsi 12-ulotteisen villityypin (wt) rungon PAGISRELVDKL-insertin ja lähes puolet sekvensseistä (49 %) sisälsi insertioita tai deleetioita.Kirjastokirjaston HTS vahvisti kirjaston peptidien suuren monimuotoisuuden: yli 81 % peptidisekvensseistä löydettiin vain kerran ja vain 1,5 % esiintyi ≥ 4 kopiona (täydentävä kuva 2a).Aminohappojen (aa) taajuudet repertuaarin kaikissa 12 kohdassa korreloivat hyvin degeneroituneen NKK-kokoelman tuottamien kodonien lukumäärän odotettujen frekvenssien kanssa (täydentävä kuva 2b).Näiden inserttien koodaamien aa-tähteiden havaittu taajuus korreloi hyvin lasketun taajuuden kanssa (r = 0,893) (lisäkuva 2c).Faagikirjastojen valmistaminen injektiota varten sisältää endotoksiinin monistamisen ja poistamisen vaiheet.Tämän on aiemmin osoitettu mahdollisesti vähentävän faagikirjastojen monimuotoisuutta12,13.Siksi sekvensoimme levyllä monistetun faagikirjaston, josta oli poistettu endotoksiini, ja vertasimme sitä alkuperäiseen kirjastoon arvioidaksemme AA:n esiintymistiheyden.Vahva korrelaatio (r = 0,995) havaittiin alkuperäisen poolin ja amplifioidun ja puhdistetun poolin välillä (täydentävä kuva 2d), mikä osoitti, että kilpailu T7-faagia käyttämällä levyillä monistettujen kloonien välillä ei aiheuttanut suurta harhaa.Tämä vertailu perustuu tripeptidimotiivien esiintymistiheyteen kussakin kirjastossa, koska kirjastojen monimuotoisuutta (~109) ei voida täysin siepata edes HTS:llä.Aa:n taajuusanalyysi kussakin paikassa paljasti pienen asemasta riippuvan harhan syötetyn ohjelmiston kolmessa viimeisessä paikassa (lisäkuva 2e).Yhteenvetona päätimme, että kirjaston laatu ja monimuotoisuus olivat hyväksyttäviä, ja monimuotoisuudessa havaittiin vain pieniä muutoksia faagikirjastojen monistamisesta ja valmistelusta useiden valintakierrosten välillä.
Sarjallinen aivo-selkäydinnestenäytteenotto voidaan suorittaa implantoimalla kirurgisesti kanyyli tajuissaan olevien rottien CM:ään suonensisäisesti (iv) BBB:n ja/tai BCSFB:n kautta injektoidun T7-faagin tunnistamisen helpottamiseksi (kuvio la-b).Käytimme kahta itsenäistä valintahaaraa (käsivarret A ja B) kolmella ensimmäisellä in vivo -valintakierroksella (kuvio 1c).Lisäsimme vähitellen valinnan tiukkuutta vähentämällä kolmella ensimmäisellä valintakierroksella tuotujen faagien kokonaismäärää.Neljännellä panorointikierroksella yhdistimme näytteitä haaroista A ja B ja suoritimme kolme muuta riippumatonta valintaa.T7-faagipartikkelien in vivo -ominaisuuksien tutkimiseksi tässä mallissa villityypin faagi (PAGISRELVDKL-pääinsertti) injektoitiin rotille häntälaskimon kautta.Faagien talteenotto aivo-selkäydinnesteestä ja verestä eri ajankohtina osoitti, että suhteellisen pienillä T7-ikosaedriseillä faageilla oli nopea alkuvaiheen puhdistuma veriosastosta (täydentävä kuva 3).Rottien annettujen tiittereiden ja veritilavuuden perusteella laskimme, että vain noin 1 paino-%.annetusta annoksesta saatu faagi havaittiin verestä 10 minuuttia suonensisäisen injektion jälkeen.Tämän alun nopean laskun jälkeen mitattiin hitaampi primaarinen puhdistuma puoliintumisajalla 27,7 minuuttia.Tärkeää on, että vain hyvin harvat faagit saatiin CSF-osastosta, mikä osoittaa villityypin faagien siirtymisen CSF-osastoon alhaisen taustan (täydentävä kuva 3).Keskimäärin vain noin 1 x 10-3 % T7-faagitiittereitä verestä ja 4 x 10-8 % alun perin infusoiduista faageista havaittiin aivo-selkäydinnesteessä koko näytteenottojakson (0-250 min) aikana.Erityisesti villityypin faagin puoliintumisaika (25,7 min) aivo-selkäydinnesteessä oli samanlainen kuin veressä havaittu.Nämä tiedot osoittavat, että este, joka erottaa CSF-osaston verestä, on ehjä CM-kanyloiduissa rotissa, mikä mahdollistaa faagikirjastojen valinnan in vivo kloonien tunnistamiseksi, jotka kuljetetaan helposti verestä CSF-osastoon.
(a) Aivo-selkäydinnesteen (CSF) uudelleennäytteenottomenetelmän luominen suuresta poolista.(b) Kaavio, joka näyttää keskushermoston (CNS) esteen sijainnin soluissa ja valintastrategian, jota käytetään veri-aivoesteen (BBB) ​​ja veri-aivoesteen ylittävien peptidien tunnistamiseen.(c) In vivo faaginäytön seulontavuokaavio.Jokaisella valintakierroksella injektoitiin faageja (eläintunnisteet nuolten sisällä) suonensisäisesti.Kaksi itsenäistä vaihtoehtoista haaraa (A, B) pidetään erikseen neljänteen valintakierrokseen asti.Valintakierroksilla 3 ja 4 jokainen CSF:stä uutettu faagiklooni sekvensoitiin manuaalisesti.(d) Verestä (punaiset ympyrät) ja aivo-selkäydinnesteestä (vihreät kolmiot) eristetyn faagin kinetiikka ensimmäisen valintakierroksen aikana kahdella kanyloidulla rotalla T7-peptidikirjaston suonensisäisen injektion jälkeen (2 x 1012 faagia/eläin).Siniset neliöt osoittavat faagin keskimääräistä alkupitoisuutta veressä, joka on laskettu injektoidun faagin määrästä ottaen huomioon veren kokonaistilavuus.Mustat neliöt osoittavat y-viivan leikkauspisteen ekstrapoloituna verifaagipitoisuuksista.(e,f) Esitä peptidistä löydettyjen kaikkien mahdollisten päällekkäisten tripeptidimotiivien suhteellinen esiintymistiheys ja jakauma.Näytössä näkyy 1000 lukeman aikana löydettyjen aiheiden määrä.Merkittävästi (p < 0,001) rikastetut aiheet on merkitty punaisilla pisteillä.(e) Korrelaatiohajakuvaaja, jossa verrataan injektoidun kirjaston tripeptidimotiivin suhteellista esiintymistiheyttä eläimistä nro 1.1 ja nro 1.2 peräisin olevan veriperäisen faagin kanssa.(f) Korrelaatiohajakuvaaja, jossa verrataan verestä ja aivo-selkäydinnesteestä eristettyjen eläinfaagitripeptidimotiivien #1.1 ja #1.2 suhteellisia esiintymistiheyksiä.(g, h) Sekvenssi-ID:n esitys verellä rikastetusta faagista (g) vs. injektoidut kirjastot ja faagi, joka on rikastettu CSF:llä (h) vs. veri in vivo -valintakierroksen jälkeen molemmissa eläimissä.Yksikirjaimisen koodin koko osoittaa, kuinka usein kyseinen aminohappo esiintyy kyseisessä kohdassa.Vihreä = polaarinen, violetti = neutraali, sininen = emäksinen, punainen = hapan ja musta = hydrofobiset aminohapot.Kuvat 1a, b on suunnitellut ja valmistanut Eduard Urich.
Injektoimme faagipeptidikirjaston kahteen CM-instrumenttirottaan (kladit A ja B) ja eristimme faagin aivo-selkäydinnesteestä ja verestä (kuvio 1d).Alkuperäinen nopea kirjaston puhdistuma oli vähemmän selvä verrattuna villityypin faagiin.Injektoidun kirjaston keskimääräinen puoliintumisaika molemmilla eläimillä oli 24,8 minuuttia veressä, samanlainen kuin villityypin faagissa, ja 38,5 minuuttia CSF:ssä.Veri- ja aivo-selkäydinnestefaaginäytteet kustakin eläimestä altistettiin HTS:lle ja kaikista tunnistetuista peptideistä analysoitiin lyhyen tripeptidimotiivin läsnäolo.Tripeptidi-motiivit valittiin, koska ne tarjoavat minimaalisen perustan rakenteen muodostumiselle ja peptidi-proteiini-vuorovaikutuksille14,15.Löysimme hyvän korrelaation motiivien jakautumisessa injektoidun faagikirjaston ja molempien eläinten verestä uutettujen kloonien välillä (kuvio 1e).Tiedot osoittavat, että kirjaston koostumus on vain marginaalisesti rikastunut veriosastossa.Aminohappotaajuuksia ja konsensussekvenssejä analysoitiin edelleen kussakin paikassa käyttämällä Weblogo16-ohjelmiston adaptaatiota.Mielenkiintoista on, että havaitsimme voimakkaan rikastumisen veren glysiinijäämistä (kuva 1g).Kun verta verrattiin CSF:stä valittuihin klooneihin, havaittiin voimakas selektio ja jonkin verran motiivien valinnan poistamista (kuvio 1f), ja tietyt aminohapot olivat ensisijaisesti läsnä ennalta määrätyissä kohdissa 12-jäsenisessä (kuvio 1h).Erityisesti yksittäiset eläimet erosivat merkittävästi aivo-selkäydinnesteestä, kun taas veren glysiinin rikastuminen havaittiin molemmissa eläimissä (täydentävä kuva 4a-j).Eläinten #1.1 ja #1.2 aivo-selkäydinnesteen sekvenssitietojen tiukan suodattamisen jälkeen saatiin yhteensä 964 ja 420 ainutlaatuista 12-meeripeptidiä (täydentävä kuva 1d-e).Eristetyt faagikloonit monistettiin ja niille tehtiin toinen in vivo -valintakierros.Toiselta valintakierrokselta uutetut faagit altistettiin HTS:lle kussakin eläimessä ja kaikkia tunnistettuja peptidejä käytettiin syötteenä motiivien tunnistusohjelmaan tripeptidimotiivien esiintymisen analysoimiseksi (kuviot 2a, b, ef).Verrattuna CSF:stä talteen otetun faagin ensimmäiseen sykliin havaitsimme monien CSF:n motiivien lisäselektion ja valinnan poistamisen haaroissa A ja B (kuvio 2).Verkon tunnistusalgoritmia käytettiin sen määrittämiseksi, edustavatko ne erilaisia ​​yhtenäisen sekvenssin malleja.Selkeä samankaltaisuus havaittiin CSF:n talteenomien 12-ulotteisten sekvenssien välillä vaihtoehtoisessa kladessa A (kuvio 2c, d) ja kladissa B (kuvio 2g, h).Yhdistetty analyysi kussakin haarassa paljasti erilaiset valintaprofiilit 12-meerisille peptideille (lisäkuva 5c, d) ja CSF/veritiitterisuhteen lisääntyminen ajan myötä yhdistetyillä klooneilla toisen valintakierroksen jälkeen verrattuna ensimmäiseen valintakierrokseen (täydentävä kuva 5e).).
Aivo-selkäydinnesteen motiivien ja peptidien rikastaminen kahdella peräkkäisellä in vivo toiminnallisen faaginäytön valintakierroksella.
Kaikki aivo-selkäydinnesteen faagit, jotka otettiin talteen kunkin eläimen ensimmäiseltä kierroksella (eläimet #1.1 ja #1.2), yhdistettiin, monistettiin, HT-sekvensoitiin ja injektoitiin uudelleen yhteen (2 x 1010 faagia/eläin) 2 SM-kanyloitua rottaa (#1.1 → #).2.1 ja 2.2, 1.2 → 2.3 ja 2.4).(a,b,e,f) Korrelaatiohajotuskaaviot, jotka vertaavat kaikkien CSF-peräisten faagien tripeptidimotiivien suhteellista esiintymistiheyttä ensimmäisellä ja toisella valintakierroksella.Motiivien suhteellinen esiintymistiheys ja jakautuminen, jotka edustavat kaikkia mahdollisia päällekkäisiä tripeptidejä, joita löytyy peptideistä molemmissa orientaatioissa.Näytössä näkyy 1000 lukeman aikana löydettyjen aiheiden määrä.Motiivit, jotka on valittu merkittävästi (p < 0,001) tai jätetty pois jossakin verratuista kirjastoista, on korostettu punaisilla pisteillä.(c, d, g, h) Sekvenssilogoesitys kaikista CSF-rikkaista 12 aminohappoa pitkistä sekvensseistä perustuen in vivo -valinnan kierroksiin 2 ja 1.Yksikirjaimisen koodin koko osoittaa, kuinka usein kyseinen aminohappo esiintyy kyseisessä kohdassa.Logoa edustamaan vertaillaan yksittäisistä eläimistä saatujen CSF-sekvenssien esiintymistiheyttä kahden valintakierroksen välillä ja näytetään toisen kierroksen rikastetut sekvenssit: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ja (h) #1.2–#2.4.Eniten rikastetut aminohapot tietyssä kohdassa (c, d) eläimissä nro.2.1 ja no.2.2 tai (g, h) eläimissä nro.2.3 ja ei.2.4 näkyvät värillisinä.Vihreä = polaarinen, violetti = neutraali, sininen = emäksinen, punainen = hapan ja musta = hydrofobiset aminohapot.
Kolmannen valintakierroksen jälkeen tunnistimme 124 ainutlaatuista peptidisekvenssiä (#3.1 ja #3.2) 332:sta kahdesta eläimestä eristetystä CSF:llä rekonstituoidusta faagikloonista (täydentävä kuva 6a).Sekvenssillä LGSVS (18,7 %) oli suurin suhteellinen osuus, jota seurasivat villityypin insertit PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) ja SARGSWREIVSLS (2,2 %).Viimeisellä neljännellä kierroksella yhdistimme kaksi itsenäisesti valittua oksaa kolmesta erillisestä eläimestä (kuva 1c).925 sekvensoidusta faagikloonista, jotka saatiin talteen CSF:stä, neljännellä kierroksella löysimme 64 ainutlaatuista peptidisekvenssiä (täydentävä kuva 6b), joiden joukossa villityypin faagien suhteellinen osuus putosi 0,8 prosenttiin.Yleisimmät CSF-kloonit neljännellä kierroksella olivat LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18 %), LGSVS (17 %), GFVRFRLSNTR (14 %), KVAWRVFSLFWK (7 %), SVHGV (5 %), GRPQKINGARVC (3,6 %) ja RLSSVDSDLSGC (3, 2 %).%)).Valittujen peptidien pituusalue johtuu nukleotidi-insertioista/deleetioista tai ennenaikaisista lopetuskodoneista kirjaston alukkeissa käytettäessä degeneroituneita kodoneja NNK-kirjaston suunnitteluun.Ennenaikaiset lopetuskodonit tuottavat lyhyempiä peptidejä ja ne valitaan, koska ne sisältävät edullisen aa-motiivin.Pidemmät peptidit voivat johtua synteettisten kirjastojen alukkeiden insertioista/deleetioista.Tämä asettaa suunnitellun lopetuskodonin kehyksen ulkopuolelle ja lukee sitä, kunnes uusi lopetuskodoni ilmestyy alavirtaan.Yleisesti ottaen laskemme rikastuskertoimet kaikille neljälle valintakierrokselle vertaamalla syöttötietoja näytelähtötietoihin.Ensimmäisellä seulontakierroksella käytimme villityypin faagitiittereitä epäspesifisenä taustaviitteenä.Mielenkiintoista on, että negatiivinen faagivalinta oli erittäin voimakasta ensimmäisessä CSF-syklissä, mutta ei veressä (kuvio 3a), mikä saattaa johtua useimpien peptidikirjaston jäsenten passiivisen diffuusion alhaisesta todennäköisyydestä CSF-osastoon tai suhteelliset faagit yleensä säilyvät tai poistuvat verenkierrosta tehokkaammin kuin bakteriofagit.Kuitenkin toisella panning-kierroksella molemmissa kladeissa havaittiin vahva faagien valinta CSF:ssä, mikä viittaa siihen, että edellinen kierros oli rikastettu faageilla, jotka esittivät peptidejä, jotka edistävät CSF:n ottoa (kuvio 3a).Jälleen ilman merkittävää veren rikastumista.Myös kolmannella ja neljännellä kierroksella faagikloonit rikastuivat merkittävästi CSF:ssä.Vertaamalla kunkin ainutlaatuisen peptidisekvenssin suhteellista esiintymistiheyttä kahden viimeisen valintakierroksen välillä havaitsimme, että sekvenssit olivat vieläkin rikastuneita neljännellä valintakierroksella (kuvio 3b).Yhteensä 931 tripeptidimotiivia uutettiin kaikista 64 ainutlaatuisesta peptidisekvenssistä käyttämällä molempia peptidiorientaatioita.Neljännen kierroksen eniten rikastuneita aiheita tutkittiin tarkemmin niiden rikastumisprofiilien suhteen kaikilla kierroksilla verrattuna injektoituun kirjastoon (raja: 10 %:n rikastus) (täydentävä kuva 6c).Yleiset valintamallit osoittivat, että suurin osa tutkituista motiiveista rikastui molempien valintahaarojen kaikilla aikaisemmilla kierroksilla.Jotkut motiivit (esim. SGL, VSG, LGS GSV) olivat kuitenkin pääosin vaihtoehtoisesta kladista A, kun taas toiset (esim. FGW, RTN, WGF, NTR) rikastuivat vaihtoehtoisessa kladissa B.
Streptavidiinin hyötykuormiin konjugoitujen CSF-rikastettujen faagipeptidien ja biotinyloitujen johtopeptidien CSF-kuljetuksen validointi.
(a) Rikastussuhteet, jotka on laskettu kaikilla neljällä kierroksella (R1-R4) perustuen injektoituihin (syöte = I) faagitiittereihin (PFU) ja määritettyihin CSF-faagitiittereihin (lähtö = O).Kolmen viimeisen kierroksen rikastuskertoimet (R2-R4) laskettiin vertaamalla edelliseen kierrokseen ja ensimmäiseen kierrokseen (R1) painotiedoilla.Avoimet palkit ovat aivo-selkäydinnestettä, varjostetut palkit ovat plasmaa.(***p<0,001, Studentin t-testin perusteella).(b) Luettelo runsaimmista faagipeptideistä, järjestettynä niiden suhteellisen osuuden mukaan kaikkiin CSF:ään kerättyihin faageihin valintakierroksen 4 jälkeen.Kuusi yleisintä faagikloonia on korostettu värillä, numeroitu ja niiden rikastustekijät valintakierrosten 3 ja 4 välissä (inset).(c, d) Kuusi eniten rikastettua faagikloonia, tyhjät faagi- ja lähtöfaagipeptidikirjastot kierroksesta 4 analysoitiin yksitellen CSF-näytteenottomallissa.CSF- ja verinäytteet kerättiin ilmoitettuina ajankohtina.(c) Yhtä suuret määrät 6 ehdokasfaagikloonia (2 x 1010 faagia/eläintä), tyhjiä faageja (nro 1779) (2 x 1010 faagia/eläintä) ja faagipeptidikirjastoja (2 x 1012 faagia/eläintä). Injektoi vähintään 3 CM:tä erilliseen suonen eläintä pitkin.Jokaisen injektoidun faagikloonin ja faagipeptidikirjaston CSF-farmakokinetiikka ajan kuluessa esitetään.(d) näyttää keskimääräisen CSF/verisuhteen kaikille talteen otetuille faagille/ml näytteenottoajan aikana.(e) Neljä synteettistä johtopeptidiä ja yksi sekoitettu kontrolli liitettiin biotiinilla streptavidiiniin niiden N-pään kautta (tetrameerinäyttö), mitä seurasi injektio (häntälaskimo iv, 10 mg streptavidiinia/kg).Vähintään kolme intuboitua rottaa (N = 3).).CSF-näytteet kerättiin osoitettuina ajankohtina ja streptavidiinipitoisuudet mitattiin CSF:n anti-streptavidiini ELISA:lla (nd = ei havaittu).(*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, perustuu ANOVA-testiin).(f) Rikastetuimman faagipeptidikloonin #2002 (violetti) aminohapposekvenssin vertailu muiden valittujen faagipeptidikloonien kanssa 4. valintakierroksesta.Identtiset ja samanlaiset aminohappofragmentit ovat värikoodattuja.
Kaikista neljännen kierroksen rikastetuista faageista (kuvio 3b) kuusi ehdokaskloonia valittiin CSF-näytteenottomallin yksittäistä lisäanalyysiä varten.Samat määrät kuutta ehdokasfaagi-, tyhjä-faagi- (ei inserttiä) ja profaagipeptidikirjastoa injektoitiin kolmeen kanyloituun CM-eläimeen, ja farmakokinetiikka määritettiin CSF- (kuvio 3c) ja veren (lisäkuvio 7) -määrityksissä.Kaikki testatut faagikloonit kohdistuivat CSF-osastoon tasolla, joka oli 10-1000 kertaa korkeampi kuin tyhjä kontrollifaagi (#1779).Esimerkiksi klooneilla #2020 ja #2077 oli noin 1000 kertaa korkeammat CSF-tiitterit kuin kontrollifaagilla.Jokaisen valitun peptidin farmakokineettinen profiili on erilainen, mutta niillä kaikilla on korkea aivo-selkäydinnesteen kohdistamiskyky.Havaitsimme jatkuvan laskun ajan myötä klooneilla #1903 ja #2011, kun taas klooneilla #2077, #2002 ja #2009 nousu ensimmäisen 10 minuutin aikana saattaa viitata aktiiviseen kuljetukseen, mutta se on tarkistettava.Kloonit #2020, #2002 ja #2077 vakiintuivat korkeille tasoille, kun taas kloonin #2009 CSF-pitoisuus laski hitaasti alkuperäisen lisäyksen jälkeen.Sitten vertailimme kunkin CSF-ehdokkaan suhteellista esiintymistiheyttä sen veren konsentraatioon (kuvio 3d).Kunkin CSF-ehdokkaan keskimääräisen tiitterin korrelaatio sen veritiitterin kanssa kaikkina näytteenottoaikoina osoitti, että kolme kuudesta ehdokkaasta oli merkittävästi rikastunut veren CSF:ssä.Mielenkiintoista kyllä, klooni #2077 osoitti korkeampaa veren stabiilisuutta (täydentävä kuva 7).Vahvistaaksemme, että peptidit itse pystyvät aktiivisesti kuljettamaan muuta lastia kuin faagipartikkeleita CSF-osastoon, syntetisoimme neljä biotiinilla derivatisoitua johtopeptidiä N-päähän, jossa peptidit kiinnittyvät faagipartikkeliin.Biotinyloidut peptidit (nro 2002, 2009, 2020 ja 2077) konjugoitiin streptavidiiniin (SA) multimeeristen muotojen saamiseksi, jotka matkivat jonkin verran faagigeometriaa.Tämä formaatti antoi meille myös mahdollisuuden mitata SA-altistumista veressä ja aivo-selkäydinnesteessä lastia kuljettavina proteiinipeptideinä.Tärkeää on, että faagitiedot voitiin usein toistaa, kun synteettisiä peptidejä annettiin tässä SA-konjugoidussa muodossa (kuvio 3e).Sekoitetuilla peptideillä oli vähemmän alkualtistusta ja nopeampi CSF-puhdistuma ilman havaittavia tasoja 48 tunnin sisällä.Saadaksemme käsityksen näiden peptidifaagikloonien kuljetusreiteistä CSF-tilaan, analysoimme yksittäisten faagipeptidi-osumien paikantamisen käyttämällä immunohistokemiaa (IHC) faagipartikkelien havaitsemiseksi suoraan 1 tunti suonensisäisen injektion jälkeen in vivo.Erityisesti kloonit #2002, #2077 ja #2009 voitiin havaita vahvalla värjäyksellä aivojen kapillaareissa, kun taas kontrollifaagia (#1779) ja kloonia #2020 ei havaittu (täydentävä kuva 8).Tämä viittaa siihen, että nämä peptidit edistävät vaikutusta aivoihin juuri ylittämällä BBB:n.Tämän hypoteesin testaamiseksi tarvitaan lisäanalyysiä, koska myös BSCFB-reitti voi olla mukana.Kun verrattiin rikastuneimman kloonin (#2002) aminohapposekvenssiä muihin valittuihin peptideihin, havaittiin, että joillakin niistä on samanlaiset aminohappojatkeet, mikä saattaa viitata samanlaiseen kuljetusmekanismiin (kuvio 3f).
Ainutlaatuisen plasmaprofiilinsa ja CSF:n merkittävän lisääntymisen vuoksi ajan myötä faaginäyttökloonia #2077 tutkittiin edelleen pidemmän 48 tunnin ajanjakson aikana ja se kykeni toistamaan CSF:n nopean kasvun, joka havaittiin yhdessä pysyvien SA-tasojen kanssa (kuvio 4a).Mitä tulee muista tunnistetuista faagiklooneista, #2077 värjäytyi voimakkaasti aivojen kapillaareille ja osoitti merkittävää kolokalisaatiota kapillaarimarkkerilektiinin kanssa, kun sitä katsottiin korkeammalla resoluutiolla ja mahdollisesti jonkin verran värjäytymistä parenkymaalisessa tilassa (kuvio 4b).Sen tutkimiseksi, voidaanko peptidivälitteisiä farmakologisia vaikutuksia saada keskushermostoon, suoritimme kokeen, jossa i) #2077-transitpeptidin ja ii) BACE1-inhibiittoripeptidin biotinyloidut versiot sekoitettiin SA:n kanssa kahdessa eri suhteessa.Yhdessä yhdistelmässä käytimme vain BACE1-peptidi-inhibiittoria ja toisessa käytimme BACE1-peptidi-inhibiittorin ja #2077-peptidin suhdetta 1:3.Molemmat näytteet annettiin suonensisäisesti ja beeta-amyloidipeptidi 40:n (Abeta40) tasot verestä ja aivo-selkäydinnesteestä mitattiin ajan myötä.Abeta40 mitattiin CSF:ssä, koska se heijastaa BACE1:n estoa aivojen parenkyymassa.Kuten odotettiin, molemmat kompleksit vähensivät merkittävästi Abeta40:n tasoja veressä (kuvio 4c, d).Kuitenkin vain näytteet, jotka sisältävät peptidin nro.2077 ja SA:han konjugoitu BACE1-peptidin inhibiittori aiheuttivat merkittävän Abeta40:n laskun aivo-selkäydinnesteessä (kuvio 4c).Tiedot osoittavat, että peptidi nro.2077 pystyy kuljettamaan 60 kDa:n SA-proteiinin keskushermostoon ja indusoi myös farmakologisia vaikutuksia BACE1-peptidin SA-konjugoitujen estäjien kanssa.
(a) Klonaalinen injektio (2 x 10 faagia/eläin) T7-faagia, joka osoittaa CSF-peptidin #2077 (RLSSVDSDLSGC) ja injektoimattoman kontrollifaagin (#1779) pitkäaikaiset farmakokineettiset profiilit vähintään kolmessa CM-intuboidussa rotassa.(b) Konfokaalinen mikroskooppinen kuva edustavista aivokuoren mikrosuonista faagiinjektoiduissa rotissa (2 x 1010 faagia/eläin), jossa näkyy peptidin #2077 ja suonten (lektiini) vastavärjäytyminen.Nämä faagikloonit annettiin 3 rotalle ja niiden annettiin kiertää 1 tunti ennen perfuusiota.Aivot leikattiin ja värjättiin polyklonaalisilla FITC-leimatuilla vasta-aineilla T7-faagikapsidia vastaan.Kymmenen minuuttia ennen perfuusiota ja sitä seuraavaa kiinnitystä DyLight594-leimattua lektiiniä annettiin suonensisäisesti.Fluoresoivat kuvat, joissa näkyy lektiinivärjäytymistä (punainen) mikrosuonten ja faagien (vihreä) luminaalisella puolella kapillaarien ja perivaskulaarisen aivokudoksen luumenissa.Asteikkopalkki vastaa 10 µm.(c, d) Biotinyloitu BACE1:tä inhiboiva peptidi yksinään tai yhdistelmänä biotinyloidun transitpeptidin #2077 kanssa kytkettiin streptavidiiniin, mitä seurasi suonensisäinen injektio vähintään kolmelle kanyloidulle CM-rotalle (10 mg streptavidiinia/kg).BACE1-peptidi-inhibiittorivälitteinen Aβ40:n väheneminen mitattiin Aβ1-40 ELISA:lla veressä (punainen) ja aivo-selkäydinnesteessä (oranssi) ilmoitettuina ajankohtina.Selvyyden vuoksi kaavioon piirretään katkoviiva 100 %:n asteikolla.(c) Ap40:n prosentuaalinen väheneminen veressä (punaiset kolmiot) ja aivo-selkäydinnesteessä (oranssit kolmiot) rotilla, joita on käsitelty streptavidiinilla, joka on konjugoitu transitpeptidiin #2077 ja BACE1:tä inhiboivaan peptidiin suhteessa 3:1.(d) Veren Aβ40:n (punaiset ympyrät) ja aivo-selkäydinnesteen (oranssit ympyrät) prosentuaalinen väheneminen rotilla, joita hoidettiin streptavidiinilla, joka on kytketty vain BACE1:tä estävään peptidiin.Ap-pitoisuus kontrollissa oli 420 pg/ml (standardipoikkeama = 101 pg/ml).
Faaginäyttöä on sovellettu menestyksekkäästi useilla biolääketieteen tutkimusalueilla17.Tätä menetelmää on käytetty in vivo verisuonten monimuotoisuustutkimuksissa18,19 sekä aivoverisuoniin kohdistetuissa tutkimuksissa20,21,22,23,24,25,26.Tässä tutkimuksessa laajensimme tämän valintamenetelmän soveltamista aivosuonien kohdistuvien peptidien suoraan tunnistamiseen, vaan myös sellaisten ehdokkaiden löytämiseen, joilla on aktiivisia kuljetusominaisuuksia veri-aivoesteen ylittämiseksi.Kuvaamme nyt in vivo -valintamenettelyn kehittämistä CM-intuboiduissa rotissa ja osoitamme sen potentiaalin tunnistaa peptidejä, joilla on CSF:n kohdennusominaisuuksia.Käyttämällä T7-faagia, jossa on 12-meeristen satunnaisten peptidien kirjasto, pystyimme osoittamaan, että T7-faagi on tarpeeksi pieni (halkaisijaltaan noin 60 nm)10 sopeutuakseen veri-aivoesteeseen, jolloin se ylittää suoraan veri-aivoesteen tai suonipunoksen.Havaitsimme, että CSF:n kerääminen kanyloiduista CM-rotista oli hyvin kontrolloitu in vivo toiminnallinen seulontamenetelmä ja että uutettu faagi ei vain sitoutunut verisuoniin, vaan toimi myös kuljettajana veri-aivoesteen läpi.Lisäksi ottamalla samanaikaisesti verta ja levittämällä HTS:ää CSF:iin ja verestä peräisin oleviin faageihin, vahvistimme, että veren rikastaminen tai soveltuvuus laajentamiseen valintakierrosten välillä ei vaikuttanut CSF-valintaamme.Veriosasto on kuitenkin osa valintamenettelyä, koska faagien, jotka pystyvät saavuttamaan CSF-osaston, on säilyttävä hengissä ja kiertävä verenkierrossa tarpeeksi kauan rikastuakseen aivoissa.Jotta HTS-raakadatasta saadaan luotettavaa sekvenssitietoa, otimme analyysin työnkulkuun käyttöön alustakohtaisiin sekvensointivirheisiin mukautetut suodattimet.Sisällyttämällä kineettisiä parametreja seulontamenetelmään vahvistimme villityypin T7-faagien nopean farmakokinetiikan (t½ ~ 28 min) veressä24, 27, 28 ja määritimme myös niiden puoliintumisajan aivo-selkäydinnesteessä (t½ ~ 26 min) minuutissa).Huolimatta samanlaisista farmakokineettisistä profiileista veressä ja aivo-selkäydinnesteessä, vain 0,001 % faagipitoisuudesta veressä voitiin havaita aivo-selkäydinnesteessä, mikä osoittaa villityypin T7-faagin vähäistä liikkuvuutta taustalla veri-aivoesteen läpi.Tämä työ korostaa ensimmäisen valintakierroksen merkitystä käytettäessä in vivo -panning-strategioita, erityisesti faagijärjestelmille, jotka poistuvat nopeasti verenkierrosta, koska harvat kloonit pääsevät keskushermosto-osastoon.Siten ensimmäisellä kierroksella kirjaston monimuotoisuuden väheneminen oli erittäin suurta, koska vain rajoitettu määrä klooneja kerättiin lopulta tässä erittäin tiukassa CSF-mallissa.Tämä in vivo -seulonnan strategia sisälsi useita valintavaiheita, kuten aktiivisen kerääntymisen CSF-osastoon, kloonien eloonjäämisen veriosastossa ja T7-faagikloonien nopean poistamisen verestä ensimmäisten 10 minuutin aikana (kuvio 1d ja täydentävä kuva 4M).).Siten ensimmäisen kierroksen jälkeen eri faagikloonit tunnistettiin CSF:ssä, vaikka samaa alkuperäistä poolia käytettiin yksittäisille eläimille.Tämä viittaa siihen, että useat tiukat valintavaiheet lähdekirjastoille, joissa on suuri määrä kirjaston jäseniä, vähentävät merkittävästi monimuotoisuutta.Siksi satunnaisista tapahtumista tulee kiinteä osa alkuperäistä valintaprosessia, ja ne vaikuttavat suuresti tulokseen.On todennäköistä, että monilla alkuperäisen kirjaston klooneista oli hyvin samanlainen CSF-rikastumisalttius.Kuitenkin jopa samoissa koeolosuhteissa valintatulokset voivat vaihdella, koska kunkin tietyn kloonin määrä alkuperäisessä poolissa on pieni.
CSF:ssä rikastetut aiheet eroavat veressä olevista.Mielenkiintoista on, että havaitsimme ensimmäisen siirtymisen kohti glysiinirikkaita peptidejä yksittäisten eläinten veressä.(Kuva 1g, lisäkuvat 4e, 4f).Glysiinipeptidejä sisältävät faagit voivat olla vakaampia ja vähemmän todennäköisiä, että ne poistuvat verenkierrosta.Näitä glysiiniä sisältäviä peptidejä ei kuitenkaan havaittu aivo-selkäydinnestenäytteistä, mikä viittaa siihen, että kuratoidut kirjastot kävivät läpi kaksi eri valintavaihetta: yksi veressä ja toisen annettiin kerääntyä aivo-selkäydinnesteeseen.Neljännestä valintakierroksesta saatuja CSF-rikastettuja klooneja on testattu laajasti.Lähes kaikkien yksittäin testattujen kloonien varmistettiin olevan rikastettu CSF:ssä verrattuna nollakoekontrollifaagiin.Yksi peptidiosuma (#2077) tutkittiin tarkemmin.Se osoitti pidemmän puoliintumisajan plasmassa verrattuna muihin osumiin (kuva 3d ja täydentävä kuva 7), ja mielenkiintoista kyllä, tämä peptidi sisälsi kysteiinitähteen C-päässä.Äskettäin on osoitettu, että kysteiinin lisääminen peptideihin voi parantaa niiden farmakokineettisiä ominaisuuksia sitoutumalla albumiiniin 29.Tätä ei tällä hetkellä tunneta peptidille #2077 ja vaatii lisätutkimuksia.Jotkut peptidit osoittivat valenssiriippuvuutta aivo-selkäydinnesteen rikastumisessa (tietoja ei esitetty), mikä saattaa liittyä T7-kapsidin näytettävään pintageometriaan.Käyttämämme T7-järjestelmä osoitti 5-15 kopiota kustakin peptidistä faagipartikkelia kohti.IHC suoritettiin ehdokaslyijyfaagiklooneille, jotka injektoitiin suonensisäisesti rottien aivokuoreen (täydentävä kuva 8).Tiedot osoittivat, että ainakin kolme kloonia (nro 2002, nro 2009 ja nro 2077) oli vuorovaikutuksessa BBB:n kanssa.On vielä määritettävä, johtaako tämä BBB-vuorovaikutus CSF:n kerääntymiseen vai näiden kloonien siirtymiseen suoraan BCSFB:hen.Tärkeää on, että osoitamme, että valitut peptidit säilyttävät CSF-kuljetuskapasiteettinsa syntetisoituna ja proteiinilastiin sitoutuneena.N-terminaalisten biotinyloitujen peptidien sitoutuminen SA:han toistaa olennaisesti tulokset, jotka on saatu niiden vastaavilla faagiklooneilla veressä ja aivo-selkäydinnesteessä (kuvio 3e).Lopuksi osoitamme, että lyijypeptidi #2077 pystyy edistämään SA:han konjugoidun BACE1:n biotinyloidun peptidi-inhibiittorin aivotoimintaa aiheuttaen selkeitä farmakodynaamisia vaikutuksia keskushermostossa vähentämällä merkittävästi Abeta40-tasoja aivo-selkäydinnesteessä (kuvio 4).Emme pystyneet tunnistamaan yhtään homologia tietokannasta suorittamalla peptidisekvenssihomologiahaun kaikista osumista.On tärkeää huomata, että T7-kirjaston koko on noin 109, kun taas teoreettinen kirjaston koko 12-meerille on 4 x 1015. Siksi valitsimme vain pienen osan 12-meerisen peptidikirjaston monimuotoisuusavaruudesta, mikä voi tarkoittaa, että optimoidumpia peptidejä voidaan tunnistaa arvioimalla näiden vierekkäisten osumasekvenssien tila.Hypoteettisesti yksi syy siihen, miksi emme ole löytäneet näiden peptidien luonnollisia homologeja, voi olla valikoinnin poistaminen evoluution aikana, jotta estetään tiettyjen peptidimotiivien hallitsematon pääsy aivoihin.
Yhdessä tuloksemme tarjoavat perustan tulevalle työlle aivoverenkierron esteen kuljetusjärjestelmien tunnistamiseksi ja karakterisoimiseksi yksityiskohtaisemmin in vivo.Tämän menetelmän peruskokoonpano perustuu toiminnalliseen valintastrategiaan, joka ei ainoastaan ​​identifioi klooneja, joilla on aivoverisuonten sitoutumisominaisuuksia, vaan sisältää myös kriittisen vaiheen, jossa onnistuneilla klooneilla on luontainen aktiivisuus ylittää biologiset esteet in vivo keskushermosto-osastoon.Tarkoituksena on selvittää näiden peptidien kuljetusmekanismi ja niiden mieltymys sitoutua aivoalueelle spesifiseen mikroverisuonistoon.Tämä voi johtaa uusien BBB- ja reseptorien kuljetusreittien löytämiseen.Odotamme, että tunnistetut peptidit voivat sitoutua suoraan aivoverisuonireseptoreihin tai verenkierrossa oleviin ligandeihin, jotka kuljetetaan BBB:n tai BCSFB:n kautta.Tässä työssä löydettyjä peptidivektoreita, joilla on CSF-kuljetusaktiivisuutta, tutkitaan edelleen.Tutkimme parhaillaan näiden peptidien aivospesifisyyttä niiden kyvyn suhteen ylittää BBB:n ja/tai BCSFB:n.Nämä uudet peptidit ovat erittäin arvokkaita työkaluja uusien reseptorien tai reittien mahdolliseen löytämiseen ja uusien erittäin tehokkaiden alustojen kehittämiseen makromolekyylien, kuten biologisten aineiden, kuljettamiseksi aivoihin.
Kanyloi suuri vesisäiliö (CM) käyttämällä aiemmin kuvatun menetelmän muunnelmaa.Nukutetut Wistar-rotat (200 - 350 g) kiinnitettiin stereotaksiseen laitteeseen ja ajeltuun ja aseptisesti valmistettuun päänahan päälle tehtiin keskimääräinen viilto kallon paljastamiseksi.Poraa kaksi reikää yläpuitteen alueelle ja kiinnitä kiinnitysruuvit reikiin.Sivuttaiseen takaraivoon porattiin lisäreikä ruostumattoman teräksen kanyylin stereotaktista ohjaamista varten CM:ään.Levitä hammassementtiä kanyylin ympärille ja kiinnitä ruuveilla.Valokovetuksen ja sementtikovettumisen jälkeen ihohaava suljettiin 4/0 supramid-ompeleella.Kanyylin oikea sijoittelu vahvistetaan aivo-selkäydinnesteen (CSF) spontaaniin vuotamiseen.Poista rotta stereotaksisesta laitteesta, saa asianmukaista postoperatiivista hoitoa ja kivunhallintaa ja anna sen toipua vähintään viikon ajan, kunnes aivo-selkäydinnesteessä havaitaan veren merkkejä.Wistar-rotat (Crl:WI/Han) hankittiin Charles Riveriltä (Ranska).Kaikki rotat pidettiin erityisissä patogeenittomissa olosuhteissa.Kaikki eläinkokeet hyväksyi Baselin kaupungin eläinlääkintätoimisto, Sveitsi, ja ne suoritettiin eläinluvan nro 2474 (Assessment of Active Brain Transport by Measuring Levels of Therapeutic Candidates in the Cerebrospinal Fluid and Brain of Rat) mukaisesti.
Pidä rotta varovasti tajuissaan CM-kanyyli kädessä.Poista Datura kanyylistä ja kerää 10 µl spontaanisti virtaavaa aivo-selkäydinnestettä.Koska kanyylin läpinäkyvyys lopulta vaarantui, tähän tutkimukseen sisällytettiin vain kirkkaita aivo-selkäydinnestenäytteitä, joissa ei ollut todisteita veren kontaminaatiosta tai värjäytymisestä.Samanaikaisesti otettiin noin 10–20 μl verta hännän kärjen pienestä viillosta putkiin, joissa oli hepariinia (Sigma-Aldrich).CSF ja veri kerättiin eri ajankohtina T7-faagin suonensisäisen injektion jälkeen.Noin 5–10 μl nestettä heitettiin pois ennen kunkin CSF-näytteen keräämistä, mikä vastaa katetrin kuollutta tilavuutta.
Kirjastot luotiin käyttämällä T7Select 10-3b -vektoria, kuten on kuvattu T7Select-järjestelmän käsikirjassa (Novagen, Rosenberg et ai., InNovations 6, 1-6, 1996).Lyhyesti sanottuna satunnainen 12-meerinen DNA-insertti syntetisoitiin seuraavassa muodossa:
NNK-kodonia käytettiin kaksoislopetuskodonien ja aminohappojen yli-ilmentymisen välttämiseksi insertissä.N on kunkin nukleotidin manuaalisesti sekoitettu ekvimolaarinen suhde, ja K on adeniini- ja sytosiininukleotidien manuaalisesti sekoitettu ekvimolaarinen suhde.Yksijuosteiset alueet muutettiin kaksijuosteiseksi DNA:ksi inkuboimalla edelleen dNTP:n (Novagen) ja Klenow-entsyymin (New England Biolabs) kanssa Klenow-puskurissa (New England Biolabs) 3 tunnin ajan 37 °C:ssa.Reaktion jälkeen kaksijuosteinen DNA otettiin talteen EtOH-saostuksella.Saatu DNA digestoitiin restriktioentsyymeillä EcoRI ja HindIII (molemmat Rochelta).Katkaistu ja puhdistettu (QIAquick, Qiagen) insertti (T4-ligaasi, New England Biolabs) ligoitiin sitten lukukehyksen sisällä esikatkaistuun T7-vektoriin 10B-kapsidigeenin aminohapon 348 jälkeen.Ligaatioreaktioita inkuboitiin 16 °C:ssa 18 tuntia ennen in vitro -pakkausta.Faagin pakkaaminen in vitro suoritettiin T7Select 10-3b -kloonauspakkauksen (Novagen) mukana toimitettujen ohjeiden mukaisesti ja pakkausliuos monistettiin kerran lyysaamaan käyttämällä Escherichia colia (BLT5615, Novagen).Lysaatit sentrifugoitiin, titrattiin ja jäädytettiin -80 °C:ssa glyserolin kantaliuoksena.
Liemessä tai levyssä amplifioitujen faagin vaihtelevien alueiden suora PCR-monistus käyttämällä patentoituja 454/Roche-amplikoni-fuusioalukkeita.Forward-fuusioaluke sisältää sekvenssejä, jotka reunustavat vaihtelevaa aluetta (NNK) 12 (templaattispesifinen), GS FLX Titanium Adapter A:ta ja neljän emäksen kirjastoavainsekvenssiä (TCAG) (lisäkuva 1a):
Käänteisfuusioaluke sisältää myös biotiinia kiinnitettynä sieppaushelmiin ja GS FLX Titanium Adapter B -sovittimen, jota tarvitaan klooniseen monistukseen emulsio-PCR:n aikana:
Amplikoneille suoritettiin sitten 454/Roche-pyrosekvensointi 454 GS-FLX Titanium -protokollan mukaisesti.Manuaalista Sanger-sekvensointia varten (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) T7-faagi-DNA monistettiin PCR:llä ja sekvensoitiin seuraavilla alukepareilla:
Yksittäisistä plakeista peräisin oleville inserteille suoritettiin PCR-monistus käyttämällä Roche Fast Start DNA Polymerase Kit -sarjaa (valmistajan ohjeiden mukaisesti).Suorita kuumakäynnistys (10 min 95 °C:ssa) ja 35 tehostussykliä (50 s 95 °C:ssa, 1 min 50 °C:ssa ja 1 min 72 °C:ssa).
Kirjastoista saatu faagi, villityypin faagi, CSF:stä ja verestä pelastettu faagi tai yksittäiset kloonit monistettiin Escherichia coli BL5615:ssä TB-liemessä (Sigma Aldrich) tai 500 cm2:n maljoissa (Thermo Scientific) 4 tunnin ajan 37 °C:ssa.Faagit uutettiin levyiltä huuhtelemalla levyt Tris-EDTA-puskurilla (Fluka Analytical) tai keräämällä plakit steriileillä pipetin kärjillä.Faagit eristettiin viljelmän supernatantista tai uuttopuskurista yhdellä polyetyleeniglykolisaostuskierroksella (PEG 8000) (Promega) ja suspendoitiin uudelleen Tris-EDTA-puskuriin.
Monistettu faagi alistettiin 2-3 kierrosta endotoksiinin poistolle käyttämällä endotoksiininpoistohelmiä (Miltenyi Biotec) ennen suonensisäistä (IV) injektiota (500 µl/eläin).Ensimmäisellä kierroksella esiteltiin 2 × 1012 faagia;toisessa 2 x 1010 faagia;kolmannella ja neljännellä valintakierroksella 2 × 109 faagia eläintä kohden.Faagipitoisuus aivo-selkäydinnesteessä ja ilmoitetuina ajankohtina kerättyjen verinäytteiden määrä määritettiin plakkilaskennalla valmistajan ohjeiden mukaisesti (T7Select-järjestelmän käsikirja).Faagivalinta suoritettiin injektoimalla suonensisäisesti puhdistetut kirjastot häntälaskimoon tai injektoimalla uudelleen aiemmalta valintakierrokselta CSF:stä uutettua faagia, ja myöhemmät keräykset suoritettiin 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min ja 240 minuutin kohdalla CSF- ja verinäytteillä.In vivo -seulontaa suoritettiin yhteensä neljä kierrosta, joissa kaksi valittua haaraa säilytettiin erikseen ja analysoitiin kolmen ensimmäisen valintakierroksen aikana.Kaikille faagi-inserteille, jotka uutettiin CSF:stä kahdelta ensimmäiseltä valintakierrokselta, suoritettiin 454/Roche-pyrosekvensointi, kun taas kaikki CSF:stä kahdelta viimeiseltä valintakierrokselta uutetut kloonit sekvensoitiin manuaalisesti.Kaikki ensimmäisen valintakierroksen verifaagit altistettiin myös 454/Roche-pyrosekvensoinnille.Faagikloonien injektiota varten valitut faagit monistettiin E. colissa (BL5615) 500 cm2:n levyillä 37 °C:ssa 4 tunnin ajan.Yksilöllisesti valittuja ja manuaalisesti sekvensoituja klooneja lisättiin TB-elatusaineessa.Faagiuuton, puhdistuksen ja endotoksiinin poistamisen (kuten edellä on kuvattu) jälkeen 2 x 1010 faagia/eläin 300 µl:ssa injektoitiin laskimonsisäisesti yhteen häntälaskimoon.
Sekvenssitietojen esikäsittely ja laadullinen suodatus.Raaka 454/Roche-data muunnettiin binaarisesta vakiovirtakarttamuodosta (sff) Pearsonin ihmisluettavaan muotoon (fasta) käyttämällä toimittajan ohjelmistoa.Nukleotidisekvenssin jatkokäsittely suoritettiin käyttämällä patentoituja C-ohjelmia ja komentosarjoja (julkaisematon ohjelmistopaketti), kuten alla on kuvattu.Ensisijaisten tietojen analyysi sisältää tiukat monivaiheiset suodatusmenettelyt.Sellaisten lukujen suodattamiseksi, jotka eivät sisältäneet kelvollista 12-meerin insertti-DNA-sekvenssiä, lukemat kohdistettiin peräkkäin aloitusleimaan (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), lopetusleimaan (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ja tausta-inserttiin (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC)-Wunsch Needsleman -testillä.kohdistus mahdollistaa jopa 2 epäjohdonmukaisuutta kohdistusta kohden31.Tästä syystä kirjastosta poistettiin lukemat ilman aloitus- ja lopetustunnisteita sekä taustalisäyksiä sisältäviä lukuja eli tasauksia, jotka ylittävät sallitun määrän epäsuhtauksia.Mitä tulee jäljellä oleviin lukuihin, N-meeri-DNA-sekvenssi, joka ulottuu aloitusmerkistä ja päättyi ennen lopetusmerkkiä, leikattiin pois alkuperäisestä lukusekvenssistä ja prosessoitiin edelleen (jäljempänä "insertiksi").Insertin translaation jälkeen ensimmäisen lopetuskodonin jälkeinen osa alukkeen 5'-päässä poistetaan insertistä.Lisäksi poistettiin myös nukleotidit, jotka johtivat epätäydellisiin kodoneihin alukkeen 3'-päässä.Vain taustasekvenssejä sisältävien inserttien poissulkemiseksi poistettiin myös transloidut insertit, jotka alkoivat aminohappokuviolla "PAG".Peptidit, joiden translaation jälkeinen pituus oli alle 3 aminohappoa, poistettiin kirjastosta.Lopuksi poista redundanssi lisäosavarannosta ja määritä kunkin yksittäisen lisäkkeen taajuus.Tämän analyysin tulokset sisälsivät luettelon nukleotidisekvensseistä (insertit) ja niiden (luku)taajuuksista (lisäkuvat 1c ja 2).
Ryhmittele N-mer-DNA-insertit sekvenssin samankaltaisuuden mukaan: 454/Roche-spesifisten sekvensointivirheiden (kuten homopolymeerien pidennysten sekvensointiongelmien) poistamiseksi ja vähemmän tärkeiden redundanssien poistamiseksi aiemmin suodatetut N-meeri-DNA-sekvenssi-insertit (insertit) lajitellaan samankaltaisuuden mukaan.lisäykset (enintään 2 yhteensopimatonta kantaa sallittu) käyttämällä iteratiivista algoritmia, joka määritellään seuraavasti: lisäykset lajitellaan ensin niiden tiheyden mukaan (korkeimmasta pienimpään), ja jos ne ovat samat, toissijaisen lajittelun mukaan pituuden mukaan (pisimmästä lyhimpään) ).Näin ollen yleisimmät ja pisimmät lisäykset määrittelevät ensimmäisen "ryhmän".Ryhmätaajuus on asetettu avaintaajuudelle.Sitten jokainen lajiteltuun luetteloon jäänyt lisäys yritettiin lisätä ryhmään parittaisella Needleman-Wunsch-kohduksella.Jos yhteensopimattomien, lisäysten tai poistojen määrä kohdistuksessa ei ylitä kynnysarvoa 2, ryhmään lisätään lisäys ja ryhmän yleistä tiheyttä kasvatetaan lisäyksen lisäystiheydellä.Ryhmään lisätyt liitteet merkitään käytetyiksi ja jätetään jatkokäsittelyn ulkopuolelle.Jos lisäyssekvenssiä ei voida lisätä jo olemassa olevaan ryhmään, lisäyssekvenssiä käytetään uuden ryhmän luomiseen sopivalla lisäystaajuudella ja merkitään käytetyksi.Iteraatio päättyy, kun jokaista lisäyssekvenssiä on joko käytetty uuden ryhmän muodostamiseen tai se voidaan sisällyttää jo olemassa olevaan ryhmään.Loppujen lopuksi ryhmitetyt insertit, jotka koostuvat nukleotideista, transloidaan lopulta peptidisekvensseiksi (peptidikirjastoiksi).Tämän analyysin tulos on joukko lisäyksiä ja niitä vastaavia taajuuksia, jotka muodostavat peräkkäisten lukujen määrän (täydentävä kuva 2).
Motiivin luominen: Ainutlaatuisten peptidien luettelon perusteella luotiin kirjasto, joka sisältää kaikki mahdolliset aminohappomallit (aa), kuten alla on esitetty.Jokainen mahdollinen pituuden 3 kuvio uutettiin peptidistä ja sen käänteinen kuvio lisättiin yhdessä yhteisen motiivikirjaston kanssa, joka sisälsi kaikki kuviot (tripeptidit).Erittäin toistuvien aiheiden kirjastot sekvensoitiin ja redundanssi poistettiin.Sitten tarkistimme kunkin tripeptidin osalta motiivikirjastossa sen läsnäolon kirjastossa käyttämällä laskennallisia työkaluja.Tässä tapauksessa löydetyn motiivitripeptidin sisältävän peptidin frekvenssi lisätään ja osoitetaan motiiville motiivikirjastossa ("motiivien lukumäärä").Motiivin generoinnin tulos on kaksiulotteinen matriisi, joka sisältää kaikki tripeptidien (motiivien) esiintymät ja niiden vastaavat arvot, jotka ovat sekvensointilukemien lukumäärä, jotka johtavat vastaavaan motiiviin, kun lukemat suodatetaan, ryhmitellään ja käännetään.Mittarit kuten yllä on kuvattu yksityiskohtaisesti.
Motiivien määrän ja vastaavien sirontakuvioiden normalisointi: Kunkin näytteen motiivien määrä normalisoitiin käyttämällä
missä ni on aiheen i sisältävien lukujen lukumäärä.Siten vi edustaa motiivin i sisältävien lukujen (tai peptidien) prosenttiosuutta näytteessä.P-arvot motiivien normalisoimattomalle määrälle laskettiin Fisherin tarkkaa testiä käyttäen.Mitä tulee motiivien lukumäärän korrelogrammeihin, Spearmanin korrelaatiot laskettiin käyttämällä normalisoitua motiivien määrää R:llä.
Aminohappojen sisällön visualisoimiseksi kussakin peptidikirjaston kohdassa luotiin verkkologogrammit 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com).Ensinnäkin aminohapposisältö 12-meerisen peptidin kussakin kohdassa tallennetaan 20 x 12 matriisiin.Sitten 1000 peptidin sarja, jotka sisältävät saman suhteellisen aminohappopitoisuuden kussakin kohdassa, luodaan fasta-sekvenssimuodossa ja toimitetaan syötteenä web-logoon 3, joka tuottaa graafisen esityksen suhteellisesta aminohapposisällöstä kussakin kohdassa.tietylle peptidikirjastolle.Moniulotteisten tietojoukkojen visualisoimiseksi lämpökartat luotiin käyttämällä R:n sisäisesti kehitettyä työkalua (biosHeatmap, vielä julkaisematon R-paketti).Lämpökartoissa esitetyt dendrogrammit laskettiin Wardin hierarkkista klusterointimenetelmää käyttäen euklidisen etäisyyden metriikassa.Motiivien pisteytystietojen tilastollista analyysiä varten P-arvot normalisoimattomalle pisteytykselle laskettiin käyttämällä Fisherin tarkkaa testiä.Muiden aineistojen P-arvot laskettiin R:ssä Studentin t-testillä tai ANOVA:lla.
Valitut faagikloonit ja faagit ilman inserttejä injektoitiin suonensisäisesti häntälaskimon kautta (2 x 1010 faagia/eläin 300 µl:ssa PBS:ää).Kymmenen minuuttia ennen perfuusiota ja sitä seuraavaa kiinnitystä samoille eläimille injektoitiin laskimonsisäisesti 100 µl DyLight594-leimattua lektiiniä (Vector Laboratories Inc., DL-1177).60 minuuttia faagiinjektion jälkeen rotat perfusoitiin sydämen läpi 50 ml:lla PBS:ää ja sen jälkeen 50 ml:lla 4 % PFA/PBS:ää.Aivonäytteet kiinnitettiin lisäksi yön yli 4 % PFA/PBS:ssä ja liotettiin 30 % sakkaroosissa yön yli 4 °C:ssa.Näytteet pikajäädytetään OCT-seoksessa.Pakastettujen näytteiden immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin huoneenlämpötilassa 30 um:n kryosektioille, jotka oli blokattu 1 % BSA:lla ja joita inkuboitiin polyklonaalisten FITC-leimattujen T7-faagien (Novus NB 600-376A) vasta-aineiden kanssa 4 °C:ssa.Inkuboi yön yli.Lopuksi leikkeet pestiin 3 kertaa PBS:llä ja tutkittiin konfokaalisella lasermikroskoopilla (Leica TCS SP5).
Kaikki peptidit, joiden puhtaus on vähintään 98 %, syntetisoitiin GenScript USA:lla, biotinyloitiin ja lyofilisoitiin.Biotiini sitoutuu N-päässä olevan ylimääräisen kolmoisglysiinivälikkeen kautta.Tarkista kaikki peptidit massaspektrometrialla.
Streptavidiini (Sigma S0677) sekoitettiin 5-kertaiseen ekvimolaariseen ylimäärään biotinyloitua peptidiä, biotinyloitua BACE1:tä estävää peptidiä tai biotinyloidun BACE1:tä estävän peptidin ja BACE1:tä estävän peptidin yhdistelmää (suhde 3:1) 5–10 % DMSO:ssa/inkuboituna PBS:ssä.1 tunti huoneenlämmössä ennen pistämistä.Streptavidiinikonjugoituja peptidejä injektoitiin suonensisäisesti annoksella 10 mg/kg aivoontelolla omaavien rottien yhteen häntälaskimoon.
Streptavidiini-peptidikompleksien konsentraatio arvioitiin ELISA:lla.Nunc Maxisorp -mikrotiitterilevyt (Sigma) päällystettiin yön yli 4 °C:ssa 1,5 µg/ml hiiren anti-streptavidiinivasta-aineella (Thermo, MA1-20011).Salpauksen jälkeen (estopuskuri: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % gelatiini, 1 % BSA) huoneenlämmössä 2 tunnin ajan, pese levy 0,05 % Tween-20/PBS:llä (pesupuskuri) 3 ajan 000, CSF 1:115).Sitten levyä inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa detektiovasta-aineen kanssa (1 µg/ml, anti-streptavidiini-HRP, Novus NB120-7239).Kolmen pesuvaiheen jälkeen streptavidiini havaittiin inkuboimalla TMB-substraattiliuoksessa (Roche) enintään 20 minuuttia.Kun värin kehittyminen on pysäytetty 1 M H2SO4:lla, mittaa absorbanssi 450 nm:ssä.
Streptavidiini-peptidi-BACE1-inhibiittorikompleksin toiminta arvioitiin Ap(1-40) ELISA:lla valmistajan protokollan mukaisesti (Wako, 294-64701).Lyhyesti sanottuna CSF-näytteet laimennettiin standardilaimentimella (1:23) ja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa 96-kuoppaisilla levyillä, jotka oli päällystetty BNT77-sieppausvasta-aineella.Viiden pesuvaiheen jälkeen lisättiin HRP-konjugoitua BA27-vasta-ainetta ja inkuboitiin 2 tuntia 4 °C:ssa, mitä seurasi viisi pesuvaihetta.Aβ(1-40) havaittiin inkuboimalla TMB-liuoksessa 30 minuuttia huoneenlämpötilassa.Kun värin kehittyminen on pysäytetty stop-liuoksella, mittaa absorbanssi 450 nm:ssä.Plasmanäytteet alistettiin kiinteäfaasiuutolle ennen Aβ(1-40) ELISAa.Plasma lisättiin 0,2 % DEA:han (Sigma) 96-kuoppaisille levyille ja inkuboitiin huoneenlämpötilassa 30 minuuttia.Sen jälkeen kun SPE-levyt (Oasis, 186000679) oli pesty peräkkäin vedellä ja 100 % metanolilla, plasmanäytteet lisättiin SPE-levyille ja kaikki neste poistettiin.Näytteet pestiin (ensin 5 % metanolilla ja sitten 30 % metanolilla) ja eluoitiin 2 % NH4OH/90 % metanolilla.Kun eluaattia oli kuivattu 55 °C:ssa 99 minuuttia vakiolla N2-virralla, näytteet pelkistettiin standardilaimentimissa ja Aβ(1-40) mitattiin edellä kuvatulla tavalla.
Kuinka lainata tätä artikkelia: Urich, E. et al.Lastin toimitus aivoihin käyttämällä in vivo tunnistettuja transitpeptidejä.Tiede.5, 14104;doi: 10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ja Moos T. Makromolekulaaristen lääkkeiden toimittaminen aivoihin kohdistetulla terapialla.Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. ja Martinez-Martinez, P. Peptidi- ja proteiinilääkkeiden toimitus veri-aivoesteen yli.Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Veri-aivoeste: pullonkaula aivolääkkeiden kehityksessä.NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ja Byrd, A. Mahdollisuudet parantaa lääkkeiden toimittamista ja kohdistamista aivoihin suonikalvon plexus-CSF-reitin kautta.Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Biofarmaseuttisten valmisteiden modernisointi molekyylisillä Troijan hevosilla aivojen toimittamista varten.Bioconjug Chem 19, 1327-1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-reseptorivälitteinen peptidikuljetus veri-aivoesteen läpi.Endocr Rev. 7, 314-330 (1986).
Niewoehner, J. et ai.Lisää terapeuttisten vasta-aineiden tunkeutumista aivoihin ja tehokkuutta käyttämällä yksiarvoisia molekyylisukkuloita.Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et ai.Transferriinireseptorin (TfR) kuljetus määrittää TfR-vasta-aineiden affiniteettivarianttien aivoihin oton.J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).