Kiitos, että kävit Nature.com-sivustolla. Käytät selainversiota, jossa on rajoitettu CSS-tuki. Parhaan käyttökokemuksen saavuttamiseksi suosittelemme käyttämään päivitettyä selainta (tai poistamaan yhteensopivuustilan käytöstä Internet Explorerissa). Lisäksi jatkuvan tuen varmistamiseksi näytämme sivuston ilman tyylejä ja JavaScriptiä.
Näyttää kolmen dian karusellin kerralla. Siirry kolmen dian läpi kerrallaan Edellinen- ja Seuraava-painikkeilla tai siirry kolmen dian läpi kerrallaan lopussa olevilla liukusäätimen painikkeilla.
Veri-aivoeste ja veri-aivoeste estävät bioterapeuttisia aineita saavuttamasta kohteitaan keskushermostossa, mikä haittaa neurologisten sairauksien tehokasta hoitoa. Löytääksemme uusia aivokuljettajia in vivo, otimme käyttöön T7-faagipeptidikirjaston ja keräsimme sarjanäytteitä verestä ja aivo-selkäydinnesteestä (CSF) käyttämällä kanyloitua, tietoista rottien suurta poolimallia. Spesifiset faagikloonit rikastuivat voimakkaasti aivo-selkäydinnesteessä neljän valintakierroksen jälkeen. Yksittäisten kandidaattipeptidien testaaminen paljasti yli 1000-kertaisen rikastumisen aivo-selkäydinnesteessä. Peptidivälitteisen aivoihin kulkeutumisen bioaktiivisuus vahvistettiin 40 %:n laskulla amyloid-β:n pitoisuudessa aivo-selkäydinnesteessä käyttämällä BACE1-peptidin estäjää, joka oli kytketty tunnistettuun uuteen kauttakulkupeptidiin. Nämä tulokset viittaavat siihen, että in vivo -faagivalintamenetelmillä tunnistetut peptidit voivat olla hyödyllisiä vehikkeleitä makromolekyylien systeemiseen kulkeutumiseen aivoihin terapeuttisella vaikutuksella.
Keskushermostoon (CNS) kohdistuvien kohdennettujen lääkkeiden (CNS) tutkimus on keskittynyt pitkälti optimoitujen lääkkeiden ja aineiden tunnistamiseen, joilla on keskushermostoon kohdistuvia ominaisuuksia, ja vähemmän vaivaa niiden mekanismien löytämiseen, jotka ohjaavat aktiivisten lääkkeiden kulkeutumista aivoihin. Tämä on nyt muuttumassa, kun lääkkeiden, erityisesti suurten molekyylien, kulkeutuminen on olennainen osa nykyaikaista neurotieteellistä lääkekehitystä. Keskushermoston ympäristö on hyvin suojattu aivoverisuoniesteen järjestelmän avulla, joka koostuu veri-aivoesteestä (BBB) ​​​​ja veri-aivoesteestä (BCBB)1, mikä tekee lääkkeiden toimittamisesta aivoihin haastavaa1,2. On arvioitu, että lähes kaikki suurimolekyyliset lääkeaineet ja yli 98 % pienimolekyylisistä lääkeaineista poistuu aivoista3. Siksi on erittäin tärkeää tunnistaa uusia aivojen kuljetusjärjestelmiä, jotka mahdollistavat terapeuttisten lääkkeiden tehokkaan ja spesifisen kulkeutumisen keskushermostoon4,5. BBB ja BCSFB tarjoavat kuitenkin myös erinomaisen tilaisuuden lääkkeiden kulkeutumiseen, sillä ne tunkeutuvat ja pääsevät kaikkiin aivojen rakenteisiin laajan verisuoniston kautta. Näin ollen nykyiset pyrkimykset käyttää ei-invasiivisia aivoihin annostelumenetelmiä perustuvat pitkälti reseptorivälitteiseen kuljetukseen (PMT) käyttäen endogeenistä BBB6-reseptoria. Huolimatta viimeaikaisista merkittävistä edistysaskeleista transferriinireseptorireitin7,8 käytössä, tarvitaan uusien, ominaisuuksiltaan parannettujen annostelujärjestelmien kehittämistä. Tätä varten tavoitteemme oli tunnistaa peptidejä, jotka kykenevät välittämään aivo-selkäydinnesteen kuljetusta, koska niitä voitaisiin periaatteessa käyttää makromolekyylien toimittamiseen keskushermostoon tai uusien reseptorireittien avaamiseen. Erityisesti aivoverisuonijärjestelmän spesifiset reseptorit ja kuljettajat (BBB ja BSCFB) voivat toimia potentiaalisina kohteina bioterapeuttisten lääkkeiden aktiiviselle ja spesifiselle annostelulle. Aivo-selkäydinneste (CSF) on suonikalvon hermopunoksen (CS) erittämä tuote ja on suorassa kosketuksessa aivojen kudosnesteen kanssa lukinkalvonalaisen tilan ja kammiotilan4 kautta. Äskettäin on osoitettu, että lukinkalvonalaista aivo-selkäydinnestettä diffundoituu liikaa aivojen kudosnesteeseen9. Toivomme pääsevämme parenkyymitilaan tämän lukinkalvonalaisen sisäänvirtausreitin kautta tai suoraan BBB:n kautta. Tämän saavuttamiseksi otimme käyttöön vankan in vivo -faagivalintastrategian, joka ihanteellisessa tapauksessa tunnistaa jommankumman näistä kahdesta erillisestä reitistä kuljettamat peptidit.
Kuvaamme nyt peräkkäisen in vivo -faaginäyttöseulontamenetelmän, jossa aivo-selkäydinnesteestä otetaan näytteitä ja suoritetaan suuren läpimenon sekvensointi (HTS), jotta voidaan seurata alustavia valintakierroksia kirjaston monimuotoisuuden maksimoimiseksi. Seulonta suoritettiin tajuissaan olevilla rotilla, joille oli pysyvästi implantoitu suuri cisterna (CM) -kanyyli veren kontaminaation välttämiseksi. Tärkeää on, että tämä lähestymistapa valitsee sekä aivoihin kohdistuvia peptidejä että peptidejä, joilla on kuljetusaktiivisuutta aivoverisuoniesteen läpi. Käytimme T7-faageja niiden pienen koon (~60 nm)10 vuoksi ja ehdotimme, että ne soveltuvat vesikkelien kuljetukseen, jotka mahdollistavat endoteeli- ja/tai epiteeli-ydinesteen transsellulaarisen ylityksen. Neljän seulontakierroksen jälkeen eristettiin faagipopulaatiot, jotka osoittivat voimakasta in vivo -selkäydinnesteen rikastumista ja aivojen mikroverisuonten yhteyttä. Tärkeää on, että pystyimme vahvistamaan havaintomme osoittamalla, että edulliset ja kemiallisesti syntetisoidut parhaat peptidikandidaatit pystyvät kuljettamaan proteiinilastia aivo-selkäydinnesteeseen. Ensin keskushermoston farmakodynaamiset vaikutukset osoitettiin yhdistämällä johtava kauttakulkupeptidi BACE1-peptidin estäjään. Sen lisäksi, että osoitamme, että in vivo -funktionaaliset seulontastrategiat voivat tunnistaa uusia aivojen kuljetuspeptidejä tehokkaiksi proteiininkuljetusreiteiksi, odotamme vastaavien funktionaalisten valintamenetelmien tulevan tärkeiksi myös uusien aivojen kuljetusreittien tunnistamisessa.
Plakin muodostavien yksiköiden (PFU) perusteella faagien pakkausvaiheen jälkeen suunniteltiin ja luotiin satunnaisten 12-meeristen lineaaristen T7-faagipeptidien kirjasto, jonka monimuotoisuus on noin 109 (katso Materiaalit ja menetelmät). On tärkeää huomata, että analysoimme tämän kirjaston huolellisesti ennen in vivo -seulontaa. Faagikirjastonäytteiden PCR-monistus modifioituja alukkeita käyttäen tuotti amplikoneja, jotka olivat suoraan sovellettavissa HTS:ään (lisäkuva 1a). Johtuen a) HTS11-sekvensointivirheistä, b) alukkeiden (NNK)1-12 laatuun vaikuttavista vaikutuksista ja c) villityypin (wt) faagin (luurankoinsertit) läsnäolosta valmiuskirjastossa, sekvenssisuodatusmenetelmä otettiin käyttöön vain varmistettujen sekvenssitietojen poimimiseksi (lisäkuva 1b). Nämä suodatusvaiheet koskevat kaikkia HTS-sekvensointikirjastoja. Standardikirjastossa saatiin yhteensä 233 868 lukukertaa, joista 39 % läpäisi suodatuskriteerit ja niitä käytettiin kirjastoanalyysiin ja valintaan seuraaville kierroksille (lisäkuva 1c–e). Luetut sekvenssit olivat pääasiassa kolmen emäsparin pituisia monikertoja, ja huippu oli 36 nukleotidin kohdalla (lisäkuva 1c), mikä vahvisti kirjastorakenteen (NNK) 1-12. Merkillepantavaa oli, että noin 11 % kirjaston jäsenistä sisälsi 12-ulotteisen villityypin (wt) rungon PAGISRELVDKL-insertin, ja lähes puolet sekvensseistä (49 %) sisälsi insertioita tai deleetioita. Kirjastokirjaston HTS vahvisti peptidien suuren monimuotoisuuden kirjastossa: yli 81 % peptidisekvensseistä löydettiin vain kerran ja vain 1,5 % esiintyi ≥4 kopiona (lisäkuva 2a). Aminohappojen (aa) frekvenssit kaikissa 12 repertuaarin asemassa korreloivat hyvin degeneroituneen NKK-repertuaarin tuottamien kodonien lukumäärän odotettujen frekvenssien kanssa (lisäkuva 2b). Näiden inserttien koodaamien aminohappotähteiden havaittu frekvenssi korreloi hyvin lasketun frekvenssin kanssa (r = 0,893) (lisäkuva 2c). Faagikirjastojen valmistelu injektiota varten sisältää endotoksiinin monistamisen ja poiston vaiheet. Tämän on aiemmin osoitettu mahdollisesti vähentävän faagikirjastojen monimuotoisuutta12,13. Siksi sekvensoimme levyllä monistetun faagikirjaston, josta oli poistettu endotoksiini, ja vertasimme sitä alkuperäiseen kirjastoon arvioidaksemme aminohappojen (AA) esiintymistiheyttä. Alkuperäisen poolin ja monistetun ja puhdistetun poolin välillä havaittiin vahva korrelaatio (r = 0,995) (lisäkuva 2d), mikä osoittaa, että levyillä T7-faagilla monistettujen kloonien välinen kilpailu ei aiheuttanut merkittävää harhaa. Tämä vertailu perustuu tripeptidimotiivien esiintymistiheyteen kussakin kirjastossa, koska kirjastojen monimuotoisuutta (~109) ei voida täysin mitata edes HTS:llä. Aminohappojen esiintymistiheysanalyysi kussakin asemassa paljasti pienen asemasta riippuvan harhan syötetyn repertuaarin kolmessa viimeisessä asemassa (lisäkuva 2e). Yhteenvetona voidaan todeta, että kirjaston laatu ja monimuotoisuus olivat hyväksyttäviä ja että monimuotoisuudessa havaittiin vain pieniä muutoksia monistuksen ja faagikirjastojen valmistuksen vuoksi useiden valintakierrosten välillä.
Sarjanäytteenotto aivo-selkäydinnesteestä voidaan suorittaa implantoimalla kirurgisesti kanyyli tajuissaan olevien rottien aivo-selkäydinnesteeseen (CM), mikä helpottaa laskimoon (iv) aivo-selkäydinnesteen ja/tai aivo-selkäydinnesteen kautta injektoitujen T7-faagien tunnistamista (kuva 1a-b). Käytimme kahta itsenäistä valintahaaraa (haarat A ja B) kolmella ensimmäisellä in vivo -valintakierroksella (kuva 1c). Lisäsimme valinnan tiukkuutta vähitellen vähentämällä kolmella ensimmäisellä valintakierroksella lisättyjen faagien kokonaismäärää. Neljättä seulontakierrosta varten yhdistimme näytteet haaroista A ja B ja suoritimme kolme ylimääräistä itsenäistä valintaa. Tutkiaksemme T7-faagihiukkasten in vivo -ominaisuuksia tässä mallissa, villityypin faagia (PAGISRELVDKL-pääinsertti) injektoitiin rottiin häntälaskimoon. Faagien talteenotto aivo-selkäydinnesteestä ja verestä eri ajankohtina osoitti, että suhteellisen pienillä T7-ikosaedrisilla faageilla oli nopea alkuvaiheen poistuminen veritilasta (lisäkuva 3). Annettujen tiitterien ja rottien veritilavuuden perusteella laskimme, että vain noin 1 painoprosentti annetusta annoksesta faagia havaittiin veressä 10 minuuttia laskimonsisäisen injektion jälkeen. Tämän alkuvaiheen nopean laskun jälkeen mitattiin hitaampi primaarinen puhdistuma, jonka puoliintumisaika oli 27,7 minuuttia. Tärkeää on, että aivo-selkäydinnesteestä löydettiin vain hyvin vähän faageja, mikä viittaa alhaiseen taustaan ​​villityypin faagien kulkeutumiselle aivo-selkäydinnesteeseen (lisäkuva 3). Keskimäärin vain noin 1 x 10-3 % T7-faagin tiittereistä verestä ja 4 x 10-8 % alun perin infusoiduista faageista havaittiin aivo-selkäydinnesteessä koko näytteenottojakson (0-250 min) aikana. Huomionarvoista on, että villityypin faagin puoliintumisaika (25,7 min) aivo-selkäydinnesteessä oli samanlainen kuin veressä havaittu. Nämä tiedot osoittavat, että aivo-selkäydinnesteosaston ja veren välinen este on ehjä CM-kanyloiduilla rotilla, mikä mahdollistaa faagikirjastojen valinnan in vivo sellaisten kloonien tunnistamiseksi, jotka kulkeutuvat helposti verestä aivo-selkäydinnesteosastoon.
(a) Menetelmän laatiminen aivo-selkäydinnesteen (CSF) uudelleennäytteenottoon suuresta näytteenottoryhmästä. (b) Kaavio, joka näyttää keskushermoston (CNS) solun sijainnin ja valintastrategian, jota käytetään veri-aivoesteen (BBB) ​​ja veri-aivoesteen läpäisevien peptidien tunnistamiseen. (c) In vivo -faaginäyttöseulonnan vuokaavio. Jokaisella valintakierroksella faagit (eläintunnisteet nuolien sisällä) injektoitiin laskimoon. Kaksi toisistaan ​​riippumatonta vaihtoehtoista haaraa (A, B) pidetään erikseen neljänteen valintakierrokseen asti. Valintakierroksilla 3 ja 4 jokainen aivo-selkäydinnesteestä uutettu faagiklooni sekvensoitiin manuaalisesti. (d) Verestä (punaiset ympyrät) ja aivo-selkäydinnesteestä (vihreät kolmiot) eristettyjen faagien kinetiikka ensimmäisen valintakierroksen aikana kahdella kanyloidulla rotalla T7-peptidikirjaston laskimonsisäisen injektion jälkeen (2 x 1012 faagia/eläin). Siniset neliöt osoittavat faagin keskimääräisen alkupitoisuuden veressä, laskettuna injektoidun faagin määrästä ottaen huomioon veren kokonaistilavuus. Mustat neliöt osoittavat veren faagipitoisuuksista ekstrapoloidun y-viivan leikkauspisteen. (e, f) Esittää kaikkien peptidissä mahdollisesti esiintyvien päällekkäisten tripeptidimotiivien suhteellisen esiintymistiheyden ja jakauman. 1000 lukemassa löydettyjen motiivien lukumäärä on esitetty. Merkitsevästi (p < 0,001) rikastuneet motiivit on merkitty punaisilla pisteillä. (e) Korrelaatiohajotuskaavio, jossa verrataan injektoidun kirjaston tripeptidimotiivin suhteellista esiintymistiheyttä eläinten #1.1 ja #1.2 verestä peräisin olevaan faagiin. (f) Korrelaatiohajotuskaavio, jossa verrataan verestä ja aivo-selkäydinnesteestä eristettyjen eläinfaagitripeptidimotiivien #1.1 ja #1.2 suhteellisia esiintymistiheyksiä. (g, h) Veressä rikastetun faagin (g) ja injektoitujen kirjastojen sekä aivo-selkäydinnesteessä rikastetun faagin (h) ja veren sekvenssi-ID-esitys in vivo -valintakierroksen jälkeen molemmissa eläimissä. Yhden kirjaimen koodin koko osoittaa, kuinka usein kyseinen aminohappo esiintyy kyseisessä kohdassa. Vihreä = polaarinen, violetti = neutraali, sininen = emäksinen, punainen = hapan ja musta = hydrofobiset aminohapot. Kuvan 1a, b suunnitteli ja valmisti Eduard Urich.
Injektoimme faagipeptidikirjaston kahteen CM-instrumenttirottiin (haarat A ja B) ja eristimme faagin aivo-selkäydinnesteestä ja verestä (kuva 1d). Kirjaston aluksi nopea poistuminen oli vähemmän selvää verrattuna villityypin faagiin. Injektoidun kirjaston keskimääräinen puoliintumisaika molemmissa eläimissä oli 24,8 minuuttia veressä, samanlainen kuin villityypin faagilla, ja 38,5 minuuttia aivo-selkäydinnesteessä. Kunkin eläimen veri- ja aivo-selkäydinnestefaaginäytteet altistettiin HTS:lle ja kaikki tunnistetut peptidit analysoitiin lyhyen tripeptidimotiivin esiintymisen varalta. Tripeptidimotiivit valittiin, koska ne tarjoavat minimaalisen perustan rakenteen muodostumiselle ja peptidi-proteiini-vuorovaikutuksille14,15. Havaitsimme hyvän korrelaation motiivien jakautumisessa injektoidun faagikirjaston ja molempien eläinten verestä uutettujen kloonien välillä (kuva 1e). Tiedot osoittavat, että kirjaston koostumus on rikastunut vain marginaalisesti veriosastossa. Aminohappofrekvenssejä ja konsensussekvenssejä analysoitiin edelleen kussakin kohdassa käyttämällä Weblogo16-ohjelmiston mukautusta. Mielenkiintoista kyllä, havaitsimme voimakasta rikastumista veren glysiinitähteissä (kuva 1g). Kun verta verrattiin aivo-selkäydinnesteestä valittuihin klooneihin, havaittiin voimakasta valintaa ja jonkin verran motiivien valinnan puutetta (kuva 1f), ja tietyt aminohapot olivat ensisijaisesti läsnä ennalta määrätyissä kohdissa 12-jäsenisessä järjestelmässä (kuva 1h). Huomionarvoista on, että yksittäiset eläimet erosivat merkittävästi aivo-selkäydinnesteessä, kun taas veren glysiinin rikastumista havaittiin molemmilla eläimillä (lisäkuva 4a–j). Eläinten #1.1 ja #1.2 aivo-selkäydinnesteen sekvenssitietojen tiukan suodatuksen jälkeen saatiin yhteensä 964 ja 420 ainutlaatuista 12-meeripeptidiä (lisäkuva 1d–e). Eristetyt faagikloonit monistettiin ja niille tehtiin toinen in vivo -valintakierros. Toisesta valintakierroksesta uutetut faagit altistettiin HTS:lle jokaisessa eläimessä, ja kaikkia tunnistettuja peptidejä käytettiin syötteenä motiivin tunnistusohjelmaan tripeptidimotiivien esiintymisen analysoimiseksi (kuva 2a, b, ef). Verrattuna aivo-selkäydinnesteestä talteen otetun faagin ensimmäiseen sykliin, havaitsimme monien motiivien lisäselektiota ja deselektiota aivo-selektiossa haaroissa A ja B (kuva 2). Verkon tunnistusalgoritmia käytettiin sen määrittämiseksi, edustivatko ne erilaisia ​​yhdenmukaisen sekvenssin kuvioita. Selvä samankaltaisuus havaittiin aivo-selektiolla vaihtoehtoisessa kladissa A (kuva 2c, d) ja kladissa B (kuva 2g, h) talteen otettujen 12-ulotteisten sekvenssien välillä. Kummankin haaran yhdistetty analyysi paljasti erilaiset valintaprofiilit 12-meeripeptideille (lisäkuva 5c, d) ja aivo-selektori/veri-tiitterisuhteen kasvun ajan myötä yhdistetyille klooneille toisen valintakierroksen jälkeen verrattuna ensimmäiseen valintakierrokseen (lisäkuva 5e).
Motiivien ja peptidien rikastaminen aivo-selkäydinnesteessä kahdella peräkkäisellä in vivo -funktionaalisen faaginäyttövalinnan kierroksella.
Kunkin eläimen (eläimet #1.1 ja #1.2) ensimmäiseltä kierrokselta talteen otetut aivo-selkäydinnesteestä peräisin olevat faagit yhdistettiin, monistettiin, HT-sekvensoitiin ja injektoitiin uudelleen yhdessä (2 x 1010 faagia/eläin) 2 SM-kanyloitua rottaa (#1.1 → #). 2.1 ja 2.2, 1.2 → 2.3 ja 2.4). (a, b, e, f) Korrelaatiohajotuskaaviot, joissa verrataan kaikkien aivo-selkäydinnesteestä peräisin olevien faagien tripeptidimotiivien suhteellista frekvenssiä ensimmäisellä ja toisella valintakierroksella. Motiivien suhteellinen frekvenssi ja jakauma, jotka edustavat kaikkia mahdollisia päällekkäisiä tripeptidejä, joita löytyy peptideistä molemmissa orientaatioissa. 1000 lukemassa löydettyjen motiivien lukumäärä on esitetty. Motiivit, jotka valittiin tai suljettiin pois tilastollisesti merkitsevästi (p < 0,001) jostakin vertailluista kirjastoista, on korostettu punaisilla pisteillä. (c, d, g, h) Sekvenssilogoesitys kaikista CSF-rikkaista 12 aminohapon pituisista sekvensseistä in vivo -valinnan kierrosten 2 ja 1 perusteella. Yksikirjaimisen koodin koko osoittaa, kuinka usein kyseinen aminohappo esiintyy kyseisessä kohdassa. Logon esittämiseksi verrataan yksittäisistä eläimistä uutettujen CSF-sekvenssien esiintymistiheyttä kahden valintakierroksen välillä ja esitetään toisen kierroksen rikastuneet sekvenssit: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ja (h) #1.2–#2.4. Eläinten nro 2.1 ja nro 2.2 (c, d) tai eläinten nro 2.3 ja 2.4 (g, h) tietyssä kohdassa rikastuneimmat aminohapot on esitetty värillisinä. Vihreä = polaarinen, violetti = neutraali, sininen = emäksinen, punainen = hapan ja musta = hydrofobiset aminohapot.
Kolmannen valintakierroksen jälkeen tunnistimme 124 ainutlaatuista peptidisekvenssiä (#3.1 ja #3.2) 332 aivo-selkäydinnesteestä rekonstituoidusta faagikloonista, jotka oli eristetty kahdesta eläimestä (lisäkuva 6a). Sekvenssillä LGSVS (18,7 %) oli suurin suhteellinen osuus, jota seurasivat villityypin insertit PAGISRELVDKL (8,2 %), MRWFFSHASQGR (3 %), DVAKVS (3 %), TWLFSLG (2,2 %) ja SARGSWREIVSLS (2,2 %). Viimeisellä neljännellä kierroksella yhdistimme kaksi itsenäisesti valittua haaraa kolmesta erillisestä eläimestä (kuva 1c). Aivo-selkäydinnesteestä talteen otetuista 925 sekvensoidusta faagikloonista löysimme neljännellä kierroksella 64 ainutlaatuista peptidisekvenssiä (lisäkuva 6b), joista villityypin faagin suhteellinen osuus laski 0,8 prosenttiin. Yleisimmät CSF-kloonit neljännellä kierroksella olivat LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) ja RLSSVDSDLSGC (3,2%). Valittujen peptidien pituusvaihtelu johtuu nukleotidien insertioista/deleetioista tai ennenaikaisista lopetuskodoneista kirjastoalukkeissa, kun NNK-kirjaston suunnittelussa käytetään degeneroituneita kodoneja. Ennenaikaiset lopetuskodonit tuottavat lyhyempiä peptidejä ja ne valitaan, koska ne sisältävät suotuisan aminohappomotiivin. Pidemmät peptidit voivat johtua synteettisten kirjastojen alukkeiden insertioista/deleetioista. Tämä sijoittaa suunnitellun lopetuskodonin kehyksen ulkopuolelle ja lukee sitä, kunnes uusi lopetuskodoni ilmestyy alavirtaan. Yleisesti ottaen laskimme rikastuskertoimet kaikille neljälle valintakierrokselle vertaamalla syöttödataa näytteen lähtödataan. Ensimmäisellä seulontakierroksella käytimme villityypin faagitiittereitä epäspesifisenä taustareferenssinä. Mielenkiintoista kyllä, negatiivinen faagivalinta oli erittäin voimakasta ensimmäisessä aivo-selkäydinnestesyklissä, mutta ei veressä (kuva 3a), mikä voi johtua useimpien peptidikirjaston jäsenten passiivisen diffuusion pienestä todennäköisyydestä aivo-selkäydinnestelokeroon tai suhteelliset faagit yleensä pidättyvät tai poistuvat verenkierrosta tehokkaammin kuin bakteriofagit. Toisella seulontakierroksella havaittiin kuitenkin vahva faagivalinta aivo-selkäydinnesteessä molemmissa kladeissa, mikä viittaa siihen, että edellinen kierros oli rikastunut faageilla, jotka esittivät peptidejä, jotka edistävät aivo-selkäydinnesteen ottoa (kuva 3a). Jälleen kerran, ilman merkittävää veren rikastumista. Myös kolmannella ja neljännellä kierroksella faagikloonit rikastuivat merkittävästi aivo-selkäydinnesteessä. Vertaamalla kunkin ainutlaatuisen peptidisekvenssin suhteellista frekvenssiä kahden viimeisen valintakierroksen välillä havaitsimme, että sekvenssit olivat vieläkin rikastuneempia neljännellä valintakierroksella (kuva 3b). Yhteensä 931 tripeptidimotiivia uutettiin kaikista 64 ainutlaatuisesta peptidisekvenssistä käyttäen molempia peptidiorientaatioita. Neljännen kierroksen rikastuneimpia motiiveja tutkittiin tarkemmin niiden rikastusprofiilien suhteen kaikilla kierroksilla verrattuna injektoituun kirjastoon (raja-arvo: 10 %:n rikastus) (lisäkuva 6c). Yleiset valintamallit osoittivat, että useimmat tutkituista motiiveista olivat rikastuneet molemmissa valintahaaroissa kaikilla aiemmilla kierroksilla. Jotkut motiivit (esim. SGL, VSG, LGS GSV) olivat kuitenkin pääasiassa vaihtoehtoisesta kladista A, kun taas toiset (esim. FGW, RTN, WGF, NTR) olivat rikastuneet vaihtoehtoisessa kladissa B.
CSF-rikastettujen faaginäyttöisten peptidien ja streptavidiinihyötykuormiin konjugoitujen biotinyloitujen johtopeptidien aivo-selkäydinnestekuljetuksen validointi.
(a) Rikastussuhteet laskettiin kaikilla neljällä kierroksella (R1-R4) injektoitujen (syöttö = I) faagi (PFU) tiitterien ja määritettyjen aivo-selkäydinnesteen faagitiitterien (tulos = O) perusteella. Kolmen viimeisen kierroksen (R2-R4) rikastuskertoimet laskettiin vertaamalla edelliseen kierrokseen ja ensimmäiseen kierrokseen (R1) painotietoineen. Avoimet palkit ovat aivo-selkäydinnestettä, varjostetut palkit ovat plasmaa. (***p < 0,001, perustuu Studentin t-testiin). (b) Luettelo runsaimmista faagipeptideistä, järjestettynä niiden suhteellisen osuuden mukaan kaikkiin aivo-selkäydinnesteeseen kerättyihin faageihin valintakierroksen 4 jälkeen. Kuusi yleisintä faagikloonia on korostettu värillä ja numeroitu, ja niiden rikastuskertoimet valintakierrosten 3 ja 4 välillä (lisäkkeet). (c, d) Kuusi eniten rikastunutta faagikloonia, tyhjän faagin ja emofaagipeptidikirjastoa kierrokselta 4 analysoitiin erikseen aivo-selkäydinnesteen näytteenottomallilla. Aivo-selkäydinneste ja verinäytteet kerättiin ilmoitettuina ajankohtina. (c) Yhtä suuret määrät kuutta kandidaattifaagikloonia (2 x 1010 faagia/eläin), tyhjiä faageja (#1779) (2 x 1010 faagia/eläin) ja faagipeptidivarastoja (2 x 1012 faagia/eläin). Kanyloidulle eläimelle injektoidaan vähintään 3 CM:ää erikseen häntälaskimoon. Kunkin injektoidun faagikloonin ja faagipeptidikirjaston farmakokinetiikka aivo-selkäydinnesteessä ajan kuluessa on esitetty. (d) esittää kaikkien talteen otettujen faagien/ml keskimääräisen aivo-selkäydinneste/veri-suhteen näytteenottoaikana. (e) Neljä synteettistä johtopeptidiä ja yksi sekoitettu kontrolli liitettiin biotiinilla streptavidiiniin N-terminaalinsa kautta (tetrameerinäyttö), minkä jälkeen ne injektoitiin (häntälaskimoon i.v., 10 mg streptavidiinia/kg). Vähintään kolme intuboitua rottaa (N = 3). Aivo-selkäydinnestenäytteet kerättiin ilmoitetuin aikapistein ja streptavidiinipitoisuudet mitattiin aivo-selkäydinnesteessä tapahtuvalla streptavidiini-ELISA:lla (nd = ei havaittu). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, perustuen ANOVA-testiin). (f) Rikastuneimman faagipeptidikloonin #2002 (violetti) aminohapposekvenssin vertailu muihin valittuihin faagipeptidiklooneihin neljänneltä valintakierrokselta. Identtiset ja samankaltaiset aminohappofragmentit on värikoodattu.
Kaikista neljännen kierroksen rikastetuista faageista (kuva 3b) valittiin kuusi ehdokaskloonia jatkotutkimuksiin aivo-selkäydinnesteen näytteenottomallissa. Yhtä suuret määrät kuutta ehdokasfaagi-, tyhjän faagin (ei inserttiä) ja profaagipeptidikirjastoja injektoitiin kolmeen kanyloituun CM-eläimeen, ja farmakokinetiikka määritettiin aivo-selkäydinnesteessä (kuva 3c) ja veressä (lisäkuva 7). Kaikki testatut faagikloonit kohdistuivat aivo-selkäydinnestelokeroon 10–1000 kertaa korkeammalla tasolla kuin tyhjän kontrollifaagin (#1779). Esimerkiksi klooneilla #2020 ja #2077 oli noin 1000 kertaa korkeammat aivo-selkäydinnestetiitterit kuin kontrollifaagilla. Kunkin valitun peptidin farmakokineettinen profiili on erilainen, mutta niillä kaikilla on korkea aivo-selkäydinnesteeseen itseohjautumiskyky. Havaitsimme jatkuvan laskun ajan myötä klooneilla #1903 ja #2011, kun taas klooneilla #2077, #2002 ja #2009 nousu ensimmäisten 10 minuutin aikana saattaa viitata aktiiviseen kuljetukseen, mutta tämä on varmistettava. Kloonit #2020, #2002 ja #2077 vakiintuivat korkeille tasoille, kun taas kloonin #2009 aivo-selkäydinnesteen pitoisuus laski hitaasti alkuvaiheen nousun jälkeen. Sitten vertasimme kunkin aivo-selkäydinnestekandidaatin suhteellista esiintymistiheyttä sen veren pitoisuuteen (kuva 3d). Kunkin aivo-selkäydinnestekandidaatin keskimääräisen tiitterin korrelaatio sen veren tiitterin kanssa kaikkina näytteenottoaikoina osoitti, että kolme kuudesta ehdokkaasta oli merkittävästi rikastunut veren aivo-selkäydinnesteen suhteen. Mielenkiintoista kyllä, klooni #2077 osoitti korkeampaa veren stabiiliutta (lisäkuva 7). Vahvistaaksemme, että peptidit itse kykenevät kuljettamaan aktiivisesti muutakin lastia kuin faagihiukkasia aivo-selkäydinnestelokeroon, syntetisoimme neljä johtopeptidiä, jotka oli derivatisoitu biotiinilla N-terminaalissa, jossa peptidit kiinnittyvät faagihiukkaseen. Biotinyloidut peptidit (nro 2002, 2009, 2020 ja 2077) konjugoitiin streptavidiinin (SA) kanssa, jolloin saatiin multimeerisiä muotoja, jotka jäljittelivät jonkin verran faagigeometriaa. Tämä formaatti mahdollisti myös SA-altistuksen mittaamisen veressä ja aivo-selkäydinnesteessä lastia kuljettavina proteiinipeptideinä. Tärkeää on, että faagitiedot voitiin usein toistaa, kun synteettisiä peptidejä annettiin tässä SA-konjugoidussa muodossa (kuva 3e). Sekoitetuilla peptideillä oli pienempi alkualtistus ja nopeampi aivo-selkäydinnesteen poistuminen, ja pitoisuudet olivat havaitsemattomia 48 tunnin kuluessa. Saadaksemme käsityksen näiden peptidifaagikloonien kulkeutumisreiteistä aivo-selkäydinnestetilaan, analysoimme yksittäisten faagipeptidiosumien lokalisaatiota immunohistokemialla (IHC) faagihiukkasten havaitsemiseksi suoraan tunnin kuluttua laskimonsisäisestä injektiosta in vivo. Huomionarvoista oli, että kloonit #2002, #2077 ja #2009 voitiin havaita voimakkaalla värjäytymisellä aivojen kapillaareissa, kun taas kontrollifaagia (#1779) ja kloonia #2020 ei havaittu (lisäkuva 8). Tämä viittaa siihen, että nämä peptidit vaikuttavat aivoihin juuri ylittämällä aivojen estokanavan. Tämän hypoteesin testaamiseksi tarvitaan yksityiskohtaisempia analyysejä, koska myös BSCFB-reitti voi olla mukana. Verrattaessa rikastuneimman kloonin (#2002) aminohapposekvenssiä muihin valittuihin peptideihin, havaittiin, että joillakin niistä on samanlaisia ​​aminohappojatkeita, mikä voi viitata samanlaiseen kuljetusmekanismiin (kuva 3f).
Ainutlaatuisen plasmaprofiilinsa ja ajan myötä merkittävän aivo-selkäydinnesteen määrän nousun vuoksi faaginäyttökloonia #2077 tutkittiin edelleen pidemmän 48 tunnin jakson aikana, ja se pystyi toistamaan pysyvien SA-tasojen yhteydessä havaitun nopean aivo-selkäydinnesteen nousun (kuva 4a). Muiden tunnistettujen faagikloonien osalta #2077 värjäytyi voimakkaasti aivokapillaarien osalta ja osoitti merkittävää kolokalisaatiota kapillaarimarkkerilektiinin kanssa tarkasteltuna suuremmalla resoluutiolla ja mahdollisesti jonkin verran värjäytymistä parenkyymitilassa (kuva 4b). Selvittääksemme, voidaanko peptidivälitteisiä farmakologisia vaikutuksia saada aikaan keskushermostossa, suoritimme kokeen, jossa i) #2077-siirtopeptidin ja ii) BACE1-inhibiittoripeptidin biotinyloituja versioita sekoitettiin SA:n kanssa kahdessa eri suhteessa. Toisessa yhdistelmässä käytimme vain BACE1-peptidin inhibiittoria ja toisessa käytimme BACE1-peptidin inhibiittorin ja #2077-peptidin suhdetta 1:3. Molemmat näytteet annettiin laskimoon, ja beeta-amyloidipeptidi 40:n (Abeta40) pitoisuudet veressä ja aivo-selkäydinnesteessä mitattiin ajan kuluessa. Abeta40 mitattiin aivo-selkäydinnesteestä, koska se heijastaa BACE1:n estoa aivojen parenkyymissä. Kuten odotettua, molemmat kompleksit alensivat merkittävästi Abeta40:n pitoisuuksia veressä (kuva 4c, d). Kuitenkin vain näytteet, jotka sisälsivät peptidin nro 2077 ja SA:han konjugoidun BACE1-peptidin inhibiittorin seosta, aiheuttivat merkittävän Abeta40:n laskun aivo-selkäydinnesteessä (kuva 4c). Tiedot osoittavat, että peptidi nro 2077 pystyy kuljettamaan 60 kDa:n SA-proteiinia keskushermostoon ja aiheuttaa myös farmakologisia vaikutuksia SA-konjugoitujen BACE1-peptidin inhibiittorien kanssa.
(a) T7-faagin klonaalinen injektio (2 × 10⁶ faagia/eläin), joka osoittaa CSF-peptidin #2077 (RLSSVDSDLSGC) ja injektoimattoman kontrollifaagin (#1779) pitkäaikaisia ​​farmakokineettisiä profiileja vähintään kolmella CM-intuboidulla rotalla. (b) Faagilla injektoitujen rottien (2 × 10⁶ faagia/eläin) edustavien aivokuoren mikroverisuonten konfokaalimikroskooppikuva, joka osoittaa peptidin #2077 ja verisuonten (lektiini) vastavärjäyksen. Nämä faagikloonit annettiin kolmelle rotalle ja niiden annettiin kiertää 1 tunnin ajan ennen perfuusiota. Aivot leikattiin ja värjättiin polyklonaalisilla FITC-leimatuilla vasta-aineilla T7-faagin kapsidia vastaan. Kymmenen minuuttia ennen perfuusiota ja sitä seuraavaa fiksaatiota annettiin DyLight594-leimattua lektiiniä laskimonsisäisesti. Fluoresoivat kuvat, jotka osoittavat mikroverisuonten luminaalisen puolen lektiinivärjäytymisen (punainen) ja faagien (vihreä) värjäytymisen kapillaarien ja perivaskulaarisen aivokudoksen luumenissa. Skaalapalkki vastaa 10 µm:ä. (c, d) Biotinyloitu BACE1:tä estävä peptidi yksinään tai yhdistelmänä biotinyloidun transitpeptidin #2077 kanssa kytkettiin streptavidiiniin, minkä jälkeen sitä annettiin laskimonsisäisesti vähintään kolmelle kanyloidulle CM-rotalle (10 mg streptavidiinia/kg). BACE1-peptidin estäjän välittämä Aβ40-pitoisuuden väheneminen mitattiin Aβ1-40 ELISA:lla veressä (punainen) ja aivo-selkäydinnesteessä (oranssi) ilmoitettuina ajankohtina. Selkeyden vuoksi kaavioon on piirretty katkoviiva asteikolla 100 %. (c) Aβ40:n prosentuaalinen väheneminen veressä (punaiset kolmiot) ja aivo-selkäydinnesteessä (oranssit kolmiot) rotilla, joita hoidettiin transitpeptidiin #2077 konjugoidulla streptavidiinilla ja BACE1:tä estävällä peptidillä suhteessa 3:1. (d) Veren Aβ40:n (punaiset ympyrät) ja aivo-selkäydinnesteessä (oranssit ympyrät) prosentuaalinen väheneminen rotilla, joita hoidettiin pelkällä streptavidiinilla, joka oli kytketty BACE1:tä estävään peptidiin. Kontrollin Aβ-pitoisuus oli 420 pg/ml (keskihajonta = 101 pg/ml).
Faaginäyttöä on sovellettu menestyksekkäästi useilla biolääketieteellisen tutkimuksen alueilla17. Tätä menetelmää on käytetty in vivo -verisuonten monimuotoisuustutkimuksissa18,19 sekä aivoverisuoniin kohdistuvissa tutkimuksissa20,21,22,23,24,25,26. Tässä tutkimuksessa laajensimme tämän valintamenetelmän soveltamista paitsi aivoverisuoniin kohdistuvien peptidien suoraan tunnistamiseen, myös sellaisten ehdokkaiden löytämiseen, joilla on aktiivisia kuljetusominaisuuksia veri-aivoesteen läpäisemiseksi. Kuvaamme nyt in vivo -valintamenetelmän kehittämistä CM-intuboiduilla rotilla ja osoitamme sen potentiaalin tunnistaa peptidejä, joilla on aivo-aivonesteen itseohjautumiseen liittyviä ominaisuuksia. Käyttämällä T7-faagia, joka esitteli 12-meeristen satunnaispeptidien kirjaston, pystyimme osoittamaan, että T7-faagi on riittävän pieni (halkaisijaltaan noin 60 nm)10 sopeutuakseen veri-aivoesteeseen ja ylittääkseen siten suoraan veri-aivoesteen tai suonikalvon plexuksen. Havaitsimme, että kanyloitujen CM-rottien aivo-selkäydinnesteen kerääminen oli hyvin kontrolloitu in vivo -funktionaalinen seulontamenetelmä ja että uutettu faagi ei ainoastaan ​​sitoutunut verisuonistoon, vaan toimi myös kuljettajana veri-aivoesteen yli. Lisäksi keräämällä samanaikaisesti verta ja levittämällä HTS:ää aivo-selkäydinnesteeseen ja verestä peräisin oleviin faageihin varmistimme, että aivo-selkäydinnesteen valintaan ei vaikuttanut veren rikastuminen tai soveltuvuus laajenemiseen valintakierrosten välillä. Veriosasto on kuitenkin osa valintaprosessia, koska aivo-selkäydinnesteosastoon pääsevien faagien on hengissä ja kiertävä verenkierrossa riittävän kauan rikastuakseen aivoissa. Jotta saisimme luotettavaa sekvenssitietoa raaka-HTS-datasta, käytimme analyysityönkulussa suodattimia, jotka oli mukautettu alustakohtaisiin sekvensointivirheisiin. Sisällyttämällä kineettisiä parametreja seulontamenetelmään varmistimme villityypin T7-faagien nopean farmakokinetiikan (t½ ~ 28 min) veressä (24, 27, 28) ja määritimme myös niiden puoliintumisajan aivo-selkäydinnesteessä (t½ ~ 26 min) minuutissa). Vaikka veressä ja aivo-selkäydinnesteessä on samankaltaisia ​​farmakokineettisiä profiileja, vain 0,001 % faagin veren pitoisuudesta voitiin havaita aivo-selkäydinnesteessä, mikä viittaa villityypin T7-faagin alhaiseen taustaliikkuvuuteen veri-aivoesteen läpi. Tämä työ korostaa ensimmäisen valintakierroksen merkitystä in vivo -seulontastrategioita käytettäessä, erityisesti faagijärjestelmissä, jotka poistuvat nopeasti verenkierrosta, koska vain harvat kloonit pääsevät keskushermosto-osastoon. Siten ensimmäisellä kierroksella kirjaston monimuotoisuuden väheneminen oli erittäin suuri, koska tässä erittäin tiukassa aivo-selkäydinnestemallissa kerättiin lopulta vain rajallinen määrä klooneja. Tämä in vivo -seulontastrategia sisälsi useita valintavaiheita, kuten aktiivisen kertymisen aivo-selkäydinnesteosastoon, kloonin selviytymisen veriosastossa ja T7-faagikloonien nopean poistamisen verestä ensimmäisten 10 minuutin aikana (kuva 1d ja lisäkuva 4M). Näin ollen ensimmäisen kierroksen jälkeen aivo-selkäydinnesteestä tunnistettiin eri faagiklooneja, vaikka samaa alkuperäistä poolia käytettiin yksittäisille eläimille. Tämä viittaa siihen, että useat tiukat valintavaiheet lähdekirjastoille, joissa on suuri määrä kirjaston jäseniä, johtavat merkittävään monimuotoisuuden vähenemiseen. Siksi satunnaisista tapahtumista tulee olennainen osa alkuperäistä valintaprosessia, mikä vaikuttaa suuresti tulokseen. On todennäköistä, että monilla alkuperäisen kirjaston klooneilla oli hyvin samanlainen aivo-selkäydinnesteen rikastumisalttius. Kuitenkin jopa samoissa koeolosuhteissa valintatulokset voivat vaihdella alkuperäisen kloonin pienen lukumäärän vuoksi.
Aivo-selkäydinnesteessä rikastuneet motiivit eroavat veressä olevista. Mielenkiintoista kyllä, havaitsimme ensimmäisen siirtymän kohti glysiinirikastettuja peptidejä yksittäisten eläinten veressä. (Kuva 1g, lisäkuvat 4e, 4f). Glysiinipeptidejä sisältävät faagit saattavat olla vakaampia ja niiden poistuminen verenkierrosta on epätodennäköisempää. Näitä glysiinirikastettuja peptidejä ei kuitenkaan havaittu aivo-selkäydinnestenäytteissä, mikä viittaa siihen, että kuratoidut kirjastot kävivät läpi kaksi eri valintavaihetta: yksi veressä ja toinen kertyi aivo-selkäydinnesteeseen. Neljännen valintakierroksen tuloksena syntyneitä aivo-selkäydinnesteessä rikastettuja klooneja on testattu laajasti. Lähes kaikkien yksittäin testattujen kloonien vahvistettiin olevan rikastettuja aivo-selkäydinnesteessä verrattuna nollakontrollifaagiin. Yhtä osumapeptidiä (#2077) tutkittiin tarkemmin. Se osoitti pidemmän puoliintumisajan plasmassa verrattuna muihin osumiin (kuva 3d ja lisäkuva 7), ja mielenkiintoista kyllä, tämä peptidi sisälsi kysteiinitähteen C-terminaalissa. Äskettäin on osoitettu, että kysteiinin lisääminen peptideihin voi parantaa niiden farmakokineettisiä ominaisuuksia sitoutumalla albumiiniin 29. Tämä on tällä hetkellä tuntematon peptidille nro 2077 ja vaatii lisätutkimuksia. Joillakin peptideillä havaittiin valenssiriippuvuutta aivo-selkäydinnesteen rikastuksessa (tietoja ei esitetty), mikä voi liittyä T7-kapsidin esitettyyn pintageometriaan. Käyttämämme T7-järjestelmä osoitti 5–15 kopiota kutakin peptidiä faagipartikkelia kohden. IHC suoritettiin rottien aivokuoreen laskimonsisäisesti injektoiduille lyijyfaagiklooneille (lisäkuva 8). Tiedot osoittivat, että ainakin kolme kloonia (nro 2002, nro 2009 ja nro 2077) oli vuorovaikutuksessa aivo-apin esteen (BBB) ​​kanssa. On vielä selvitettävä, johtaako tämä BBB-vuorovaikutus aivo-selkäydinnesteen kertymiseen vai näiden kloonien siirtymiseen suoraan aivo-selkäydinnesteeseen (BCSFB). Tärkeää on, että osoitamme, että valitut peptidit säilyttävät aivo-selkäydinnesteen kuljetuskykynsä, kun ne syntetisoidaan ja sitoutuvat proteiinilastiin. N-terminaalisten biotinyloitujen peptidien sitoutuminen SA:han toistaa olennaisesti tuloksia, jotka on saatu vastaavilla faagiklooneilla veressä ja aivo-selkäydinnesteessä (kuva 3e). Lopuksi osoitamme, että johtopeptidi #2077 pystyy edistämään SA:han konjugoidun BACE1:n biotinyloidun peptidi-inhibiittorin aivotoimintaa, aiheuttaen voimakkaita farmakodynaamisia vaikutuksia keskushermostossa vähentämällä merkittävästi Abeta40-tasoja aivo-selkäydinnesteessä (kuva 4). Emme pystyneet tunnistamaan homologeja tietokannassa suorittamalla peptidisekvenssihomologiahakua kaikista osumista. On tärkeää huomata, että T7-kirjaston koko on noin 109, kun taas 12-meerien teoreettinen kirjaston koko on 4 x 1015. Siksi valitsimme vain pienen osan 12-meerien peptidikirjaston monimuotoisuusavaruudesta, mikä voi tarkoittaa, että optimoidumpia peptidejä voidaan tunnistaa arvioimalla näiden tunnistettujen osumien vierekkäistä sekvenssiavaruutta. Hypoteettisesti yksi syy siihen, miksi emme ole löytäneet näiden peptidien luonnollisia homologeja, voi olla evoluution aikana tapahtunut deselektio, jolla estetään tiettyjen peptidimotiivien hallitsematon pääsy aivoihin.
Yhteenvetona voidaan todeta, että tuloksemme tarjoavat pohjan tulevalle työlle, jossa aivoverisuoniesteen kuljetusjärjestelmiä tunnistetaan ja karakterisoidaan yksityiskohtaisemmin in vivo. Tämän menetelmän perusrakenne perustuu funktionaaliseen valintastrategiaan, joka ei ainoastaan ​​tunnista aivoverisuoniin sitoutumisominaisuuksilla varustettuja klooneja, vaan sisältää myös kriittisen vaiheen, jossa onnistuneilla klooneilla on sisäinen aktiivisuus ylittää biologiset esteet in vivo keskushermosto-osastoon. Tavoitteena on selvittää näiden peptidien kuljetusmekanismi ja niiden mieltymys sitoutua aivoalueelle spesifiseen mikrovaskulaatioon. Tämä voi johtaa uusien BBB:n ja reseptorien kuljetusreittien löytämiseen. Odotamme, että tunnistetut peptidit voivat sitoutua suoraan aivoverisuonireseptoreihin tai verenkierrossa oleviin ligandeihin, jotka kuljetetaan BBB:n tai BCSFB:n kautta. Tässä työssä löydettyjä peptidivektoreita, joilla on aivo-selkäydinnesteen kuljetusaktiivisuutta, tutkitaan edelleen. Tutkimme parhaillaan näiden peptidien aivospesifisyyttä niiden kyvyn suhteen ylittää BBB ja/tai BCSFB. Nämä uudet peptidit ovat erittäin arvokkaita työkaluja uusien reseptorien tai reittien löytämiseksi ja uusien erittäin tehokkaiden alustojen kehittämiseksi makromolekyylien, kuten biologisten lääkkeiden, toimittamiseksi aivoihin.
Kanyloi suuri cisterna (CM) aiemmin kuvatun menetelmän muunnelmalla. Nukutetut Wistar-rotat (200–350 g) kiinnitettiin stereotaksiseen laitteeseen ja ajellun ja aseptisesti valmistellun päänahan päälle tehtiin mediaaniviilto kallon paljastamiseksi. Poraa kaksi reikää ylemmän vyötärön alueelle ja kiinnitä kiinnitysruuvit reikiin. Sivusuunnassa olevaan niskakyhmyn harjanteeseen porattiin lisäreikä ruostumattomasta teräksestä valmistetun kanyylin stereotaktista ohjaamista varten CM:ään. Levitä hammassementtiä kanyylin ympärille ja kiinnitä ruuveilla. Fotokovetuksen ja sementin kovettumisen jälkeen ihohaava suljettiin 4/0 supramid-ompeleella. Kanyylin oikea sijoitus vahvistetaan aivo-selkäydinnesteen (CSF) spontaanilla vuodolla. Poista rotta stereotaksisesta laitteesta, anna sille asianmukaista leikkauksen jälkeistä hoitoa ja kivunlievitystä ja anna sen toipua vähintään viikon ajan, kunnes aivo-selkäydinnesteessä havaitaan merkkejä verestä. Wistar-rotat (Crl:WI/Han) hankittiin Charles Riveriltä (Ranska). Kaikkia rottia pidettiin tietyissä patogeenittomissa olosuhteissa. Kaikki eläinkokeet hyväksyttiin Baselin kaupungin eläinlääkintäviraston toimesta Sveitsissä, ja ne suoritettiin eläinluvan nro 2474 (Aktiivisen aivokuljetuksen arviointi mittaamalla terapeuttisten ehdokkaiden tasoja rotan aivo-selkäydinnesteessä ja aivoissa) mukaisesti.
Pidä rotta varovasti tajuissaan CM-kanyyli kädessä. Poista Datura kanyylistä ja kerää 10 µl spontaanisti virtaavaa aivo-selkäydinnestettä. Koska kanyylin avoimuus lopulta vaarantui, tutkimukseen otettiin mukaan vain kirkkaita aivo-selkäydinnestenäytteitä, joissa ei ollut merkkejä veren kontaminaatiosta tai värjäytymisestä. Samanaikaisesti otettiin noin 10–20 μl verta pienestä viillosta hännänpäästä putkiin, joissa oli hepariinia (Sigma-Aldrich). Aivo-selkäydinneste ja veri kerättiin eri ajankohtina T7-faagin laskimonsisäisen injektion jälkeen. Noin 5–10 μl nestettä poistettiin ennen kunkin aivo-selkäydinnestenäytteen keräämistä, mikä vastaa katetrin kuollutta tilavuutta.
Kirjastot luotiin käyttämällä T7Select 10-3b -vektoria T7Select-järjestelmän käyttöoppaassa (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) kuvatulla tavalla. Lyhyesti sanottuna syntetisoitiin satunnainen 12-meerinen DNA-insertti seuraavassa muodossa:
NNK-kodonia käytettiin välttämään kaksoislopetuskodoneja ja aminohappojen yliekspressiota insertissä. N on kunkin nukleotidin manuaalisesti sekoitettu ekvimolaarinen suhde, ja K on adeniini- ja sytosiininukleotidien manuaalisesti sekoitettu ekvimolaarinen suhde. Yksijuosteiset alueet muunnettiin kaksijuosteiseksi DNA:ksi inkuboimalla niitä edelleen dNTP:n (Novagen) ja Klenow-entsyymin (New England Biolabs) kanssa Klenow-puskurissa (New England Biolabs) 3 tunnin ajan 37 °C:ssa. Reaktion jälkeen kaksijuosteinen DNA otettiin talteen EtOH-saostuksella. Tuloksena oleva DNA digestoitiin restriktioentsyymeillä EcoRI ja HindIII (molemmat Rochelta). Pilkottu ja puhdistettu (QIAquick, Qiagen) insertti (T4-ligaasi, New England Biolabs) ligoitiin sitten lukukehyksessä esipilkottuun T7-vektoriin 10B-kapsidigeenin aminohapon 348 jälkeen. Ligaatioreaktioita inkuboitiin 16 °C:ssa 18 tuntia ennen in vitro -pakkaamista. Faagien pakkaus in vitro suoritettiin T7Select 10-3b -kloonauspakkauksen (Novagen) mukana toimitettujen ohjeiden mukaisesti, ja pakkausliuos monistettiin kerran lysiiniin asti käyttämällä Escherichia colia (BLT5615, Novagen). Lysaatit sentrifugoitiin, titrattiin ja pakastettiin -80 °C:ssa glyserolin kantaliuoksena.
Liemessä tai levyllä monistettujen faagivaihtelevien alueiden suora PCR-monistus käyttämällä patentoituja 454/Roche-amplikoni-fuusioalukkeita. Eteenpäin suuntautuva fuusioaluke sisältää sekvenssejä, jotka reunustavat vaihtelevaa aluetta (NNK) 12 (templaattikohtainen), GS FLX Titanium Adapter A:ta ja neljän emäksen kirjastoavainsekvenssiä (TCAG) (lisäkuva 1a):
Käänteisfuusioaluke sisältää myös biotiinia kiinnitettynä sieppaushelmiin ja GS FLX Titanium Adapter B:hen, jota tarvitaan klonaaliseen monistukseen emulsio-PCR:n aikana:
Amplikoneille tehtiin sitten 454/Roche-pyrosekvensointi 454 GS-FLX Titanium -protokollan mukaisesti. Manuaalista Sanger-sekvensointia (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) varten T7-faagin DNA monistettiin PCR:llä ja sekvensoitiin seuraavilla alukepareilla:
Yksittäisistä plakeista peräisin olevat insertit PCR-amplifioitiin käyttämällä Roche Fast Start DNA Polymerase -pakkausta (valmistajan ohjeiden mukaisesti). Suoritettiin kuumakäynnistys (10 min 95 °C:ssa) ja 35 tehostesykliä (50 s 95 °C:ssa, 1 min 50 °C:ssa ja 1 min 72 °C:ssa).
Kirjastoista peräisin olevat faagit, villityypin faagit, aivo-selkäydinnesteestä ja verestä talteen otetut faagit tai yksittäiset kloonit monistettiin Escherichia coli BL5615 -bakteerissa TB-liemessä (Sigma Aldrich) tai 500 cm2:n maljoissa (Thermo Scientific) 4 tunnin ajan 37 °C:ssa. Faagit uutettiin levyiltä huuhtelemalla levyt Tris-EDTA-puskurilla (Fluka Analytical) tai keräämällä plakit steriileillä pipetinkärjillä. Faagit eristettiin viljelynesteestä tai uuttopuskurista yhdellä kierroksella polyetyleeniglykolisaostusta (PEG 8000) (Promega) ja suspendoitiin uudelleen Tris-EDTA-puskuriin.
Monistettu faagi altistettiin 2–3 endotoksiininpoistokierrokselle endotoksiininpoistohelmillä (Miltenyi Biotec) ennen laskimonsisäistä (IV) injektiota (500 μl/eläin). Ensimmäisellä kierroksella lisättiin 2 × 1012 faagia; toisella 2 × 1010 faagia; kolmannella ja neljännellä valintakierroksella 2 × 109 faagia eläintä kohden. Ilmoitetuin ajankohtina kerättyjen aivo-selkäydinnesteen ja verinäytteiden faagipitoisuus määritettiin plakkilaskennalla valmistajan ohjeiden mukaisesti (T7Select-järjestelmän käyttöohje). Faagivalinta suoritettiin injektoimalla puhdistettuja kirjastoja laskimoon häntälaskimoon tai injektoimalla uudelleen edelliseltä valintakierrokselta aivo-selkäydinnesteestä uutettua faagia, ja seuraavat keräykset tehtiin vastaavasti 10 minuutin, 30 minuutin, 60 minuutin, 90 minuutin, 120 minuutin, 180 minuutin ja 240 minuutin kohdalla aivo-selkäydinneste- ja verinäytteistä. Yhteensä neljä in vivo -seulontaa suoritettiin, joissa kaksi valittua haaraa säilytettiin ja analysoitiin erikseen kolmen ensimmäisen valintakierroksen aikana. Kaikille kahdesta ensimmäisestä valintakierroksesta aivo-selkäydinnesteestä uutetuille faagi-inserteille tehtiin 454/Roche-pyrosekvensointi, kun taas kahdelta viimeiseltä valintakierrokselta aivo-selkäydinnesteestä uutetuille klooneille tehtiin manuaalinen sekvensointi. Myös kaikille ensimmäisen valintakierroksen verifaageille tehtiin 454/Roche-pyrosekvensointi. Faagikloonien injektoimiseksi valitut faagit monistettiin E. colissa (BL5615) 500 cm2:n levyillä 37 °C:ssa 4 tunnin ajan. Yksittäin valitut ja manuaalisesti sekvensoidut kloonit lisättiin TB-elatusaineessa. Faagien uuttamisen, puhdistuksen ja endotoksiinin poistamisen (kuten edellä on kuvattu) jälkeen injektoitiin laskimonsisäisesti 2 × 1010 faagia/eläin 300 μl:ssa yhteen häntälaskimoon.
Sekvenssidatan esikäsittely ja kvalitatiivinen suodatus. Raakadatan 454/Roche-tiedosto muunnettiin binäärisestä standardistream map -muodosta (sff) Pearsonin ihmisen luettavaan muotoon (fasta) käyttämällä toimittajan ohjelmistoa. Nukleotidisekvenssin jatkokäsittely suoritettiin käyttämällä C-kielisiä ohjelmia ja skriptejä (julkaisematon ohjelmistopaketti) alla kuvatulla tavalla. Primääridatan analyysi sisältää tiukat monivaiheiset suodatusmenetelmät. Jotta voitaisiin suodattaa pois lukemat, jotka eivät sisältäneet kelvollista 12-meerin insertti-DNA-sekvenssiä, lukemat kohdistettiin peräkkäin aloitusleimaan (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), lopetusleimaan (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ja taustainserttiin (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) käyttämällä globaalia Needleman-Wunsch-testiä. Kohdistus sallii jopa kaksi epäjohdonmukaisuutta kohdistusta kohden31. Siksi lukemat, joissa ei ollut aloitus- ja lopetustunnisteita, sekä lukemat, jotka sisälsivät taustainserttejä, eli kohdistukset, jotka ylittivät sallitun määrän epäsuhtautumisia, poistettiin kirjastosta. Jäljelle jäävien lukujen osalta N-meeri-DNA-sekvenssi, joka ulottui aloitusmerkistä lopetusmerkkiin, leikattiin pois alkuperäisestä lukusekvenssistä ja käsiteltiin edelleen (jäljempänä "insertti"). Insertin translaation jälkeen alukkeen 5'-päässä ensimmäisen lopetuskodonin jälkeinen osa poistetaan insertistä. Lisäksi poistettiin myös nukleotidit, jotka johtivat alukkeen 3'-pään epätäydellisiin kodoneihin. Jotta insertit eivät sisältäisi vain taustasekvenssejä, poistettiin myös aminohappokuviolla "PAG" alkavat transloidut insertit. Peptidit, joiden translaation jälkeinen pituus oli alle 3 aminohappoa, poistettiin kirjastosta. Lopuksi inserttipoolista poistettiin redundanssi ja määritettiin kunkin ainutlaatuisen insertin frekvenssi. Tämän analyysin tuloksiin sisältyi luettelo nukleotidisekvensseistä (inserteistä) ja niiden (luku)frekvensseistä (lisäkuvat 1c ja 2).
Ryhmittele N-meeri-DNA-insertit sekvenssin samankaltaisuuden mukaan: 454/Roche-spesifisten sekvensointivirheiden (kuten sekvensointihomopolymeerilaajennusten ongelmien) poistamiseksi ja vähemmän tärkeiden redundanssien poistamiseksi aiemmin suodatetut N-meeri-DNA-sekvenssin insertit (insertit) lajitellaan samankaltaisuuden mukaan. insertiot (sallittu enintään 2 ei-yhteensopivaa emästä) lajitellaan iteratiivisella algoritmilla, joka on määritelty seuraavasti: insertiot lajitellaan ensin niiden esiintymistiheyden mukaan (suurimmasta pienimpään) ja jos ne ovat samat, niiden toissijaisen lajittelun mukaan pituuden mukaan (pisimmästä lyhyimpään) ). Siten yleisimmät ja pisimmät insertiot määrittelevät ensimmäisen "ryhmän". Ryhmäfrekvenssi asetetaan avainfrekvenssin mukaan. Sitten jokainen lajiteltuun luetteloon jäänyt insertti yritettiin lisätä ryhmään parittaisella Needleman-Wunsch-rinnastuksella. Jos yhteensopimattomien, insertioiden tai deleetioiden määrä linjauksessa ei ylitä 2:n kynnysarvoa, insertio lisätään ryhmään ja ryhmän kokonaisfrekvenssiä kasvatetaan insertion lisäystiheyden verran. Ryhmään lisätyt insertit merkitään käytetyiksi ja jätetään pois jatkokäsittelystä. Jos inserttisekvenssiä ei voida lisätä jo olemassa olevaan ryhmään, inserttisekvenssiä käytetään uuden ryhmän luomiseen sopivalla inserttifrekvenssillä ja merkitään käytetyksi. Iteraatio päättyy, kun kutakin inserttisekvenssiä on joko käytetty uuden ryhmän muodostamiseen tai se voidaan sisällyttää jo olemassa olevaan ryhmään. Loppujen lopuksi ryhmitellyt nukleotideista koostuvat insertit lopulta transloidaan peptidisekvensseiksi (peptidikirjastoiksi). Tämän analyysin tuloksena on joukko insertioita ja niitä vastaavia frekvenssejä, jotka muodostavat peräkkäisten lukukertojen lukumäärän (lisäkuva 2).
Motiivien luominen: Ainutlaatuisten peptidien luettelon perusteella luotiin kirjasto, joka sisälsi kaikki mahdolliset aminohappokuviot (aa), kuten alla on esitetty. Jokainen mahdollinen 3:n pituinen kuvio erotettiin peptidistä ja sen käänteiskuvio lisättiin yhdessä yhteisen motiivikirjaston kanssa, joka sisälsi kaikki kuviot (tripeptidit). Erittäin toistuvien motiivien kirjastot sekvensoitiin ja redundanssi poistettiin. Sitten tarkistimme jokaisen motiivikirjaston tripeptidin läsnäolon kirjastossa laskennallisten työkalujen avulla. Tässä tapauksessa löydetyn motiivitripeptidin sisältävän peptidin esiintymistiheys lisätään ja liitetään motiivikirjaston motiiviin ("motiivien lukumäärä"). Motiivien luomisen tulos on kaksiulotteinen taulukko, joka sisältää kaikki tripeptidien (motiivien) esiintymät ja niiden vastaavat arvot, jotka ovat sekvensointilukujen lukumäärä, jotka johtavat vastaavaan motiiviin, kun lukemat suodatetaan, ryhmitellään ja käännetään. Mittarit on kuvattu yksityiskohtaisesti edellä.
Motiivien lukumäärän ja vastaavien sirontakuvioiden normalisointi: Kunkin näytteen motiivien lukumäärä normalisoitiin käyttämällä
jossa ni on aiheen i sisältävien lukukertojen lukumäärä. Täten vi edustaa motiivin i sisältävien lukukertojen (tai peptidien) prosentuaalista esiintymistiheyttä otoksessa. Normalisoimattoman motiivimäärän P-arvot laskettiin Fisherin tarkalla testillä. Motiivien lukumäärän korrelogrammien osalta Spearmanin korrelaatiot laskettiin käyttämällä normalisoitua motiivimäärää, jossa R on normalisoitu.
Aminohappojen sisällön visualisoimiseksi peptidikirjaston kussakin asemassa luotiin web-logogrammit 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Ensin 12-meeripeptidin kunkin aseman aminohappojen sisältö tallennetaan 20×12-matriisiin. Sitten luodaan 1000 peptidin joukko, jotka sisältävät saman suhteellisen aminohappopitoisuuden kussakin asemassa, fasta-sekvenssimuodossa ja syötetään web-logo 3:lle, joka luo graafisen esityksen suhteellisesta aminohappopitoisuudesta kussakin asemassa tietylle peptidikirjastolle. Moniulotteisten datajoukkojen visualisoimiseksi luotiin lämpökartat käyttämällä R:ssä kehitettyä sisäisesti työkalua (biosHeatmap, vielä julkaisematon R-paketti). Lämpökartoissa esitetyt dendrogrammit laskettiin käyttämällä Wardin hierarkkista klusterointimenetelmää euklidisen etäisyysmetriikan avulla. Motiivipisteytysdatan tilastollista analyysia varten normalisoimattoman pisteytyksen P-arvot laskettiin käyttämällä Fisherin tarkkaa testiä. Muiden tietojoukkojen P-arvot laskettiin R:ssä käyttämällä Studentin t-testiä tai ANOVAa.
Valitut faagikloonit ja insertittömät faagit injektoitiin laskimonsisäisesti häntälaskimoon (2 × 1010 faagia/eläin 300 μl:ssa PBS:ää). Kymmenen minuuttia ennen perfuusiota ja sitä seuraavaa fiksaatiota samoille eläimille injektoitiin laskimonsisäisesti 100 μl DyLight594-leimattua lektiiniä (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minuuttia faagi-injektion jälkeen rotille perfusoitiin sydämen läpi 50 ml:lla PBS:ää ja sen jälkeen 50 ml:lla 4 % PFA/PBS:ää. Aivonäytteet fiksoitiin lisäksi yön yli 4 % PFA/PBS:ssä ja liotettiin 30 % sakkaroosissa yön yli 4 °C:ssa. Näytteet pikapakastettiin OCT-seokseen. Pakastettujen näytteiden immunohistokemiallinen analyysi suoritettiin huoneenlämmössä 30 µm:n kryosektioilla, jotka oli blokattu 1 % BSA:lla ja inkuboitu polyklonaalisten FITC-leimattujen T7-faagivasta-aineiden (Novus NB 600-376A) kanssa 4 °C:ssa. Inkuboitiin yön yli. Lopuksi leikkeet pestiin kolme kertaa PBS:llä ja tutkittiin konfokaalilasermikroskoopilla (Leica TCS SP5).
Kaikki vähintään 98 %:n puhtausasteen peptidit syntetisoitiin GenScript USA:lla, biotinyloitiin ja kylmäkuivattiin. Biotiini on sitoutunut N-terminaaliin ylimääräisen kolmoisglysiinivälikappaleen kautta. Tarkista kaikki peptidit massaspektrometrialla.
Streptavidiinia (Sigma S0677) sekoitettiin 5-kertaisen ekvimolaarisen ylimäärän kanssa biotinyloidtua peptidiä, biotinyloidtua BACE1:tä estävää peptidiä tai biotinyloidun BACE1:tä estävän peptidin ja BACE1:tä estävän peptidin yhdistelmää (suhde 3:1) 5–10 % DMSO:ssa ja inkuboitiin PBS:ssä 1 tunti huoneenlämmössä ennen injektiota. Streptavidiinikonjugoituja peptidejä injektoitiin laskimoon 10 mg/kg annoksella aivoontelon omaavien rottien häntälaskimoon.
Streptavidiini-peptidikompleksien pitoisuus määritettiin ELISA-menetelmällä. Nunc Maxisorp -mikrotiitterilevyt (Sigma) päällystettiin yön yli 4 °C:ssa 1,5 μg/ml hiiren anti-streptavidiini-vasta-aineella (Thermo, MA1-20011). Eston (estopuskuri: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05 % NP40, 0,25 % gelatiini, 1 % BSA) jälkeen huoneenlämmössä kahden tunnin ajan, minkä jälkeen levy pestiin 0,05 % Tween-20/PBS:llä (pesupuskuri) kolmen sekunnin ajan. Tämän jälkeen aivo-selkäydinneste- ja plasmanäytteet lisättiin estopuskurilla (plasma 1:10 000, aivo-selkäydinneste 1:115) laimennettuihin kuoppiin. Levyä inkuboitiin sitten yön yli 4 °C:ssa detektiovasta-aineen (1 μg/ml, anti-streptavidiini-HRP, Novus NB120-7239) kanssa. Kolmen pesuvaiheen jälkeen streptavidiini havaittiin inkuboimalla sitä TMB-substraattiliuoksessa (Roche) jopa 20 minuutin ajan. Kun värinkehitys oli pysäytetty 1M H2SO4:lla, mittaa absorbanssi 450 nm:ssä.
Streptavidiini-peptidi-BACE1-estäjäkompleksin toimintaa arvioitiin Aβ(1-40) ELISA:lla valmistajan ohjeiden mukaisesti (Wako, 294-64701). Lyhyesti sanottuna, aivo-selkäydinnestenäytteet laimennettiin standardilaimentimella (1:23) ja inkuboitiin yön yli 4 °C:ssa 96-kuoppalevyillä, jotka oli päällystetty BNT77-sieppausvasta-aineella. Viiden pesuvaiheen jälkeen lisättiin HRP-konjugoitu BA27-vasta-aine ja inkuboitiin 2 tuntia 4 °C:ssa, minkä jälkeen suoritettiin viisi pesuvaihetta. Aβ(1-40) havaittiin inkuboimalla TMB-liuoksessa 30 minuuttia huoneenlämmössä. Kun värin kehittyminen oli pysäytetty pysäytysliuoksella, mitattiin absorbanssi 450 nm:ssä. Plasmanäytteet altistettiin kiinteäfaasiuutolle ennen Aβ(1-40) ELISA:a. Plasma lisättiin 0,2 % DEA:han (Sigma) 96-kuoppalevyillä ja inkuboitiin huoneenlämmössä 30 minuuttia. Kun SPE-levyt (Oasis, 186000679) oli pesty peräkkäin vedellä ja 100 % metanolilla, plasmanäytteet lisättiin SPE-levyille ja kaikki neste poistettiin. Näytteet pestiin (ensin 5 % metanolilla, sitten 30 % metanolilla) ja eluoitiin 2 % NH4OH/90 % metanolilla. Kun eluaattia oli kuivattu 55 °C:ssa 99 minuuttia vakiotyppivirrassa, näytteet pelkistettiin standardilaimentimissa ja Aβ(1–40) mitattiin edellä kuvatulla tavalla.
Artikkelin viittausohjeet: Urich, E. ym. Rahdin toimitus aivoihin in vivo -menetelmällä tunnistettujen kauttakulkupeptidien avulla. The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ja Moos T. Makromolekyylisten lääkkeiden toimitus aivoihin kohdennetun hoidon avulla. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. ja Martinez-Martinez, P. Peptidi- ja proteiinilääkkeiden kuljetus veri-aivoesteen läpi. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneumobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Veri-aivoeste: aivojen lääkekehityksen pullonkaula. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ja Byrd, A. Näkymät lääkkeiden kuljettamisen ja kohdentamisen parantamiseen aivoihin suonipunoksen ja aivo-selkäydinnesteen välisen reitin kautta. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Biolääkkeiden modernisointi molekyylitroijalaisilla aivoihin annostelua varten. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-reseptorin välittämä peptidien kuljetus veri-aivoesteen läpi. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. ym. Lisää terapeuttisten vasta-aineiden aivoihin tunkeutumista ja tehoa käyttämällä monovalensseja molekyylisukkureita. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. ym. Transferriinireseptorin (TfR) kuljetus määrää TfR-vasta-aineiden affiniteettivarianttien aivoihin imeytymisen. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).