Ташаккур барои боздид аз Nature.com. Шумо версияи браузерро бо дастгирии маҳдуди CSS истифода мебаред. Барои беҳтарин таҷриба, мо тавсия медиҳем, ки шумо браузери навшударо истифода баред (ё Реҷаи Мутобиқатро дар Internet Explorer ғайрифаъол кунед). Илова бар ин, барои таъмини дастгирии доимӣ, мо сайтро бе услубҳо ва JavaScript нишон медиҳем.
Карусели се слайдро якбора нишон медиҳад. Барои гузаштан аз се слайд дар як вақт тугмаҳои "Пешина" ва "Баъдӣ"-ро истифода баред, ё барои гузаштан аз се слайд дар як вақт тугмаҳои лағжандаро дар охир истифода баред.
Монеаи хун-мағзи сар ва монеаи хун-мағзи сар монеъ мешаванд, ки агентҳои биотерапӣ ба ҳадафҳои худ дар системаи марказии асаб бирасанд ва бо ин васила табобати самараноки бемориҳои неврологиро боздоранд. Барои кашф кардани интиқолдиҳандагони нави мағзи сар дар in vivo, мо китобхонаи пептиди фаги T7-ро ҷорӣ кардем ва моеъи хун ва мағзи сар (CSF)-ро бо истифода аз модели ҳавзи калони бошууронаи каламушҳо ҷамъоварӣ кардем. Клонҳои мушаххаси фагҳо пас аз чор даври интихоб дар CSF хеле ғанӣ шуданд. Санҷиши пептидҳои инфиродии номзадҳо беш аз 1000 маротиба ғанӣ шудани CSF-ро нишон дод. Фаъолияти биоактивии интиқоли пептид ба мағзи сар бо коҳиши 40% сатҳи амилоид-β дар моеъи мағзи сар бо истифода аз ингибитори пептиди BACE1, ки бо пептиди нави транзитии муайяншуда алоқаманд аст, тасдиқ карда шуд. Ин натиҷаҳо нишон медиҳанд, ки пептидҳое, ки тавассути усулҳои интихоби фаги in vivo муайян карда шудаанд, метавонанд воситаҳои муфид барои интиқоли системавии макромолекулаҳо ба мағзи сар бо таъсири терапевтӣ бошанд.
Тадқиқоти терапияи мақсадноки системаи асаби марказӣ (CNS) асосан ба муайян кардани доруҳо ва агентҳои оптимизатсияшуда, ки хосиятҳои ҳадафгирии CNS-ро нишон медиҳанд, нигаронида шудааст ва кӯшиши камтар барои кашфи механизмҳое, ки интиқоли фаъоли доруҳоро ба мағзи сар таъмин мекунанд, равона шудааст. Ин ҳоло тағйир меёбад, зеро интиқоли доруҳо, бахусус молекулаҳои калон, қисми ҷудонашавандаи таҳияи доруҳои муосири неврология мебошад. Муҳити системаи асаби марказӣ аз ҷониби системаи монеаи мағзи сар, ки аз монеаи хун-мағзи сар (BBB) ​​ва монеаи хун-мағзи сар (BCBB) иборат аст, хуб ҳифз карда мешавад1,2, ки интиқоли доруҳоро ба мағзи сар душвор мегардонад1,2. Тибқи ҳисобҳо, қариб ҳамаи доруҳои молекулаҳои калон ва зиёда аз 98% доруҳои молекулаҳои хурд аз мағзи сар хориҷ карда мешаванд3. Аз ин рӯ, муайян кардани системаҳои нави интиқоли мағзи сар, ки интиқоли самаранок ва мушаххаси доруҳои терапевтиро ба CNS таъмин мекунанд, хеле муҳим аст4,5. Бо вуҷуди ин, BBB ва BCSFB инчунин имконияти аъло барои интиқоли доруҳоро фароҳам меоранд, зеро онҳо тавассути рагҳои васеи он ба ҳама сохторҳои мағзи сар ворид ва ворид мешаванд. Ҳамин тариқ, кӯшишҳои кунунӣ барои истифодаи усулҳои ғайриинвазивии интиқол ба мағзи сар асосан ба механизми интиқоли тавассути рецепторҳо (PMT) бо истифода аз ретсептори эндогении BBB6 асос ёфтаанд. Сарфи назар аз пешрафтҳои калидии ахир дар истифодаи роҳи ретсептори трансферрин7,8, таҳияи минбаъдаи системаҳои нави интиқол бо хосиятҳои беҳтаршуда зарур аст. Барои ин мақсад, ҳадафи мо муайян кардани пептидҳое буд, ки қодиранд интиқоли CSF-ро миёнаравӣ кунанд, зеро онҳо дар асл метавонанд барои интиқоли макромолекулаҳо ба CNS ё кушодани роҳҳои нави ретсепторҳо истифода шаванд. Аз ҷумла, ретсепторҳо ва интиқолдиҳандагони мушаххаси системаи рагҳои мағзи сар (BBB ва BSCFB) метавонанд ҳамчун ҳадафҳои эҳтимолӣ барои интиқоли фаъол ва мушаххаси доруҳои биотерапӣ хизмат кунанд. Моеъи мағзи сар (CSF) маҳсули секретории плексуси хориоидӣ (CS) буда, бо моеъи интерстициалии мағзи сар тавассути фазои субарахноидӣ ва фазои меъдачаҳо мустақиман дар тамос аст4. Ба наздикӣ нишон дода шудааст, ки моеъи субарахноидии мағзи сар ба интерстиции мағзи сар аз ҳад зиёд паҳн мешавад9. Мо умедворем, ки ба фазои паренхималӣ бо истифода аз ин роҳи воридшавии субарахноидӣ ё мустақиман тавассути BBB дастрасӣ пайдо кунем. Барои ноил шудан ба ин, мо як стратегияи мустаҳками интихоби фагҳои in vivo-ро татбиқ кардем, ки пептидҳоеро, ки тавассути яке аз ин ду роҳи мухталиф интиқол дода мешаванд, беҳтарин муайян мекунад.
Ҳоло мо усули скрининги пайдарпайи намоиши фагҳои in vivo бо намунагирии CSF дар якҷоягӣ бо секвенсияҳои баланди гузариш (HTS)-ро барои назорат кардани даврҳои ибтидоии интихоб бо баландтарин гуногунии китобхона тавсиф мекунем. Скрининг дар каламушҳои бошуур бо канюлаи калони цистерна (CM)-и доимӣ ҷойгиршуда барои пешгирӣ аз ифлосшавии хун гузаронида шуд. Муҳим он аст, ки ин равиш ҳам ҳадафгирии мағзи сар ва ҳам пептидҳоро бо фаъолияти интиқол тавассути монеаи рагҳои мағзи сар интихоб мекунад. Мо фагҳои T7-ро аз сабаби андозаи хурди онҳо (~60 нм)10 истифода бурдем ва пешниҳод кардем, ки онҳо барои интиқоли везикулаҳое мувофиқанд, ки имкон медиҳанд монеаи эндотелиалӣ ва/ё эпителиалӣ-медулла гузаранд. Пас аз чор даври паннинг, популятсияҳои фагҳо ҷудо карда шуданд, ки ғанӣ гардонидани CSF дар in vivo ва ассотсиатсияи микрорагҳои мағзи сарро нишон доданд. Муҳим он аст, ки мо тавонистем бо нишон додани он, ки пептидҳои беҳтарини номзадҳои афзалиятнок ва синтезшуда қодиранд борҳои сафедаро ба моеъи мағзи сар интиқол диҳанд, тасдиқ кунем. Аввалан, таъсири фармакодинамикии системаи асаби марказӣ бо роҳи якҷоя кардани пептиди пешбари транзитӣ бо ингибитори пептиди BACE1 муқаррар карда шуданд. Илова бар нишон додани он, ки стратегияҳои скрининги функсионалии in vivo метавонанд пептидҳои нави интиқоли мағзи сарро ҳамчун интиқолдиҳандагони муассири боркаши сафеда муайян кунанд, мо интизорем, ки равишҳои шабеҳи интихоби функсионалӣ низ дар муайян кардани роҳҳои нави интиқоли мағзи сар муҳим хоҳанд шуд.
Бар асоси воҳидҳои ташаккулдиҳандаи пластинка (PFU), пас аз марҳилаи бастабандии фагҳо, китобхонаи пептидҳои фаги T7-и тасодуфии хаттии 12-mer бо гуногунии тақрибан 109 тарҳрезӣ ва сохта шуд (нигаред ба Маводҳо ва усулҳо). Қайд кардан муҳим аст, ки мо ин китобхонаро пеш аз паннинги in vivo бодиққат таҳлил кардем. Такмили PCR-и намунаҳои китобхонаи фагҳо бо истифода аз праймерҳои тағйирёфта ампликонҳоеро ба вуҷуд овард, ки мустақиман ба HTS татбиқ мешуданд (Расми иловагии 1a). Аз сабаби а) хатогиҳои пайдарпайии HTS11, б) таъсир ба сифати праймерҳо (NNK)1-12 ва в) мавҷудияти фаги навъи ваҳшӣ (wt) (иловаҳои скелетӣ) дар китобхонаи интизорӣ, тартиби филтркунии пайдарпайӣ барои истихроҷи танҳо маълумоти тасдиқшудаи пайдарпайӣ амалӣ карда шуд (Расми иловагии 1b). Ин қадамҳои филтркунӣ ба ҳамаи китобхонаҳои пайдарпайии HTS татбиқ мешаванд. Барои китобхонаи стандартӣ, дар маҷмӯъ 233,868 хондан ба даст оварда шуд, ки аз он 39% аз меъёрҳои филтр гузаштанд ва барои таҳлили китобхона ва интихоби даврҳои минбаъда истифода шуданд (Расми иловагии 1c-e). Хонданҳо асосан аз 3 ҷуфти асосӣ бо дарозии зиёд бо қулла дар 36 нуклеотид иборат буданд (Расми иловагии 1c), ки тарҳи китобхонаро (NNK) 1-12 тасдиқ мекунад. Қобили зикр аст, ки тақрибан 11% аъзои китобхона дорои иловаи PAGISRELVDKL-и 12-ченака бо навъи ваҳшӣ (wt) буданд ва қариб нисфи пайдарпайиҳо (49%) дорои воридкунӣ ё несткунӣ буданд. HTS-и китобхона гуногунии баланди пептидҳоро дар китобхона тасдиқ кард: зиёда аз 81% пайдарпайиҳои пептидӣ танҳо як маротиба пайдо шуданд ва танҳо 1,5% дар ≥4 нусха пайдо шуданд (Расми иловагии 2a). Басомадҳои аминокислотаҳо (aa) дар ҳамаи 12 мавқеъ дар репертуар бо басомадҳои интизоршуда барои шумораи кодонҳое, ки аз ҷониби репертуари NKK-и дегенеративӣ тавлид шудаанд, хуб алоқаманд буданд (Расми иловагии 2b). Басомади мушоҳидашудаи боқимондаҳои aa, ки бо ин воридкуниҳо рамзгузорӣ шудаанд, бо басомади ҳисобшуда хуб алоқаманд буданд (r = 0.893) (Расми иловагии 2c). Омодасозии китобхонаҳои фагҳо барои тазриқ марҳилаҳои тақвият ва хориҷ кардани эндотоксинро дар бар мегирад. Ин қаблан нишон дода шуда буд, ки эҳтимолан гуногунии китобхонаҳои фагро коҳиш медиҳад12,13. Аз ин рӯ, мо китобхонаи фаги тақвиятёфтаи бо табақча, ки аз хориҷ кардани эндотоксин гузашта буд, пайдарпайӣ кардем ва онро бо китобхонаи аслӣ муқоиса кардем, то басомади AA-ро арзёбӣ кунем. Байни ҳавзи аслӣ ва ҳавзи тақвиятёфта ва тозашуда ҳамбастагии қавӣ (r = 0.995) мушоҳида шуд (Расми иловагии 2d), ки нишон медиҳад, ки рақобат байни клонҳое, ки дар табақчаҳо бо истифода аз фаги T7 тақвият дода шудаанд, боиси таассуби ҷиддӣ нашудаанд. Ин муқоиса ба басомади мотивҳои трипептидӣ дар ҳар як китобхона асос ёфтааст, зеро гуногунии китобхонаҳо (~109) ҳатто бо HTS пурра дарк карда намешавад. Таҳлили басомади аа дар ҳар як мавқеъ як таассуби хурди вобаста ба мавқеъро дар се мавқеъи охирини репертуари воридшуда ошкор кард (Расми иловагии 2e). Хулоса, мо ба хулосае омадем, ки сифат ва гуногунии китобхона қобили қабул аст ва танҳо тағйироти ночиз дар гуногунрангӣ аз сабаби тақвият ва омодасозии китобхонаҳои фагҳо байни якчанд даври интихоб мушоҳида шуданд.
Намунагирии силсилавии моеъи мағзи сарро метавон бо роҳи ҷарроҳии имплантатсияи канюла ба CM каламушҳои ҳушёр анҷом дод, то муайян кардани фаги T7-ро, ки ба таври дохиливарданӣ (iv) тавассути BBB ва/ё BCSFB ворид карда шудааст, осон кунад (Расми 1a-b). Мо дар се даври аввали интихоби in vivo ду бозуи мустақили интихоб (бозуҳои A ва B)-ро истифода бурдем (Расми 1c). Мо тадриҷан сахтгирии интихобро бо кам кардани миқдори умумии фаги воридшуда дар се даври аввали интихоб зиёд кардем. Барои даври чоруми паннинг, мо намунаҳоро аз шохаҳои A ва B муттаҳид кардем ва се интихоби мустақили иловагиро анҷом додем. Барои омӯзиши хосиятҳои in vivo зарраҳои фаги T7 дар ин модел, фаги навъи ваҳшӣ (PAGISRELVDKL master insert) тавассути раги дум ба каламушҳо ворид карда шуд. Барқароршавии фагҳо аз моеъи мағзи сар ва хун дар нуқтаҳои гуногуни вақт нишон дод, ки фагҳои нисбатан хурди икосаҳедралии T7 марҳилаи аввали тозакунии босуръатро аз қисмати хун доштанд (Расми иловагӣ 3). Бар асоси титрҳои воридшуда ва ҳаҷми хуни каламушҳо, мо ҳисоб кардем, ки танҳо тақрибан 1% вазни фаги воридшуда аз вояи воридшуда дар хун 10 дақиқа пас аз воридкунии дохиливарданӣ муайян карда шудааст. Пас аз ин коҳиши босуръати аввалия, клиренси ибтидоии сусттар бо нимҳаёти 27,7 дақиқа чен карда шуд. Муҳим он аст, ки аз қисмати CSF танҳо хеле кам фагҳо гирифта шуданд, ки заминаи пасти муҳоҷирати фагҳои навъи ваҳшӣ ба қисмати CSF-ро нишон медиҳад (Расми иловагӣ 3). Ба ҳисоби миёна, дар тамоми давраи намунагирӣ (0-250 дақиқа) дар моеъи мағзи сар (мағзи сар) танҳо тақрибан 1 x 10-3% титрҳои фаги T7 дар хун ва 4 x 10-8% фагҳои ибтидоии воридшуда муайян карда шуданд. Қобили зикр аст, ки нимҳаёти фаги навъи ваҳшӣ (25,7 дақиқа) дар моеъи мағзи сар (мағзи сар) ба он чизе, ки дар хун мушоҳида шудааст, монанд буд. Ин маълумотҳо нишон медиҳанд, ки монеае, ки қисмати CSF-ро аз хун ҷудо мекунад, дар каламушҳои бо каннулятсияшудаи CM солим боқӣ мемонад ва имкон медиҳад, ки дар in vivo китобхонаҳои фагҳоро муайян кунанд, ки клонҳоеро, ки аз хун ба қисмати CSF ба осонӣ интиқол дода мешаванд, муайян кунанд.
(а) Муқаррар кардани усули намунагирии дубораи моеъи мағзи сар (CSF) аз ҳавзи калон. (б) Диаграммае, ки макони ҳуҷайравии монеаи системаи марказии асаб (CNS) ва стратегияи интихобро нишон медиҳад, ки барои муайян кардани пептидҳое, ки монеаи хун-мағзи сар (BBB) ​​ва монеаи хун-мағзи сарро убур мекунанд. (в) Ҷадвали ҷараёни скрининги намоиши фагҳои in vivo. Дар ҳар даври интихоб, фагҳо (идентификаторҳои ҳайвонот дар дохили тирҳо) ба таври дохиливарданӣ ворид карда шуданд. Ду шохаи алтернативии мустақил (A, B) то даври 4-уми интихоб алоҳида нигоҳ дошта мешаванд. Барои даврҳои 3 ва 4-уми интихоб, ҳар як клони фаг, ки аз CSF истихроҷ карда шудааст, дастӣ пайдарпай карда шуд. (г) Кинетикаи фаг, ки аз хун (доираҳои сурх) ва моеъи мағзи сар (секунҷаҳои сабз) ҷудо карда шудааст, дар даври аввали интихоб дар ду каламуши каннулятсионӣ пас аз ворид кардани китобхонаи пептидии T7 ба дохиливарданӣ (2 x 1012 фаг/ҳайвон). Мураббаъҳои кабуд консентратсияи ибтидоии миёнаи фагро дар хун нишон медиҳанд, ки аз миқдори фаги воридшуда бо назардошти ҳаҷми умумии хун ҳисоб карда мешавад. Мураббаъҳои сиёҳ нуқтаи буриши хати y-ро нишон медиҳанд, ки аз консентратсияи фаги хун экстраполятсия карда шудаанд. (e, f) Басомади нисбӣ ва тақсимоти ҳама мотивҳои эҳтимолии ҳампӯши трипептидро, ки дар пептид ёфт шудаанд, пешниҳод кунед. Шумораи мотивҳое, ки дар 1000 хониш ёфт шудаанд, нишон дода шудааст. Мотивҳои ғанӣ (p < 0.001) бо нуқтаҳои сурх қайд карда шудаанд. (e) Нақшаи парокандагии коррелятсия, ки басомади нисбии мотиви трипептидии китобхонаи воридшударо бо фаги аз хун гирифташуда аз ҳайвоноти №1.1 ва №1.2 муқоиса мекунад. (f) Нақшаи парокандагии коррелятсия, ки басомади нисбии мотивҳои трипептидии фаги ҳайвоноти №1.1 ва №1.2-ро, ки дар моеъи хун ва мағзи сар ҷудо карда шудаанд, муқоиса мекунад. (g, h) Намояндагии пайдарпайии ID-и фаги ғанӣ дар хун (g) дар муқоиса бо китобхонаҳои тазриқшуда ва фаги ғанӣ дар мағзи сар (h) дар муқоиса бо хун пас аз даври интихоби in vivo дар ҳарду ҳайвон. Андозаи рамзи якҳарфа нишон медиҳад, ки ин аминокислота дар он мавқеъ чӣ қадар зуд-зуд рух медиҳад. Сабз = қутбӣ, арғувонӣ = бетараф, кабуд = асосӣ, сурх = туршӣ ва сиёҳ = аминокислотаҳои гидрофобӣ. Расми 1a, b аз ҷониби Эдуард Урих тарҳрезӣ ва истеҳсол шудааст.
Мо ба ду каламуши асбобии CM (кладҳои A ва B) китобхонаи пептиди фагро ворид кардем ва фагро аз моеъи мағзи сар ва хун ҷудо кардем (Расми 1d). Тозакунии босуръати ибтидоии китобхона дар муқоиса бо фаги навъи ваҳшӣ камтар намоён буд. Нисфи миёнаи китобхонаи воридшуда дар ҳарду ҳайвон дар хун 24,8 дақиқа, ба фаги навъи ваҳшӣ монанд ва дар CSF 38,5 дақиқа буд. Намунаҳои фаги хун ва моеъи мағзи сар аз ҳар як ҳайвон ба HTS дучор карда шуданд ва ҳамаи пептидҳои муайяншуда барои мавҷудияти мотиви кӯтоҳи трипептид таҳлил карда шуданд. Мотивҳои трипептид интихоб карда шуданд, зеро онҳо асоси ҳадди ақалро барои ташаккули сохтор ва таъсири мутақобилаи пептид-сафеда фароҳам меоранд14,15. Мо дар тақсимоти мотивҳо байни китобхонаи фаги воридшуда ва клонҳое, ки аз хуни ҳарду ҳайвон истихроҷ шудаанд, ҳамбастагии хуб пайдо кардем (Расми 1e). Маълумотҳо нишон медиҳанд, ки таркиби китобхона дар қисмати хун танҳо каме ғанӣ шудааст. Басомади аминокислотаҳо ва пайдарпайиҳои консенсусӣ дар ҳар як мавқеъ бо истифода аз мутобиқсозии нармафзори Weblogo16 минбаъд таҳлил карда шуданд. Ҷолиб он аст, ки мо ғанӣ гардонидани қавии боқимондаҳои глицини хунро мушоҳида кардем (Расми 1g). Вақте ки хун бо клонҳои аз CSF интихобшуда муқоиса карда шуд, интихоби қавӣ ва баъзе аз интихоби ғайримустақим мушоҳида шуд (Расми 1f) ва баъзе аминокислотаҳо дар мавқеъҳои пешакӣ муайяншуда дар 12-узв афзалият доштанд (Расми 1h). Қобили зикр аст, ки ҳайвоноти алоҳида дар моеъи мағзи сар ба таври назаррас фарқ мекарданд, дар ҳоле ки ғанӣ гардонидани глицини хун дар ҳарду ҳайвон мушоҳида шуд (Расми иловагии 4a-j). Пас аз филтркунии қатъии маълумоти пайдарпайӣ дар моеъи мағзи сар ва ҳароммағзи ҳайвонот #1.1 ва #1.2, дар маҷмӯъ 964 ва 420 пептидҳои беназири 12-мер ба даст оварда шуданд (Расми иловагии 1d-e). Клонҳои ҷудошудаи фагҳо тақвият дода шуданд ва ба даври дуюми интихоби in vivo дучор карда шуданд. Фагҳои аз даври дуюми интихоб истихроҷшуда дар ҳар як ҳайвон ба HTS дучор карда шуданд ва ҳамаи пептидҳои муайяншуда ҳамчун вуруд ба барномаи шинохти мотивҳо барои таҳлили пайдоиши мотивҳои трипептидӣ истифода шуданд (Расми 2a, b, ef). Дар муқоиса бо давраи аввали фагҳои аз CSF барқароршуда, мо интихоби минбаъда ва бекор кардани интихоби бисёр мотивҳоро дар CSF дар шохаҳои A ва B мушоҳида кардем (Расми 2). Алгоритми муайянкунии шабака барои муайян кардани он, ки оё онҳо намунаҳои гуногуни пайдарпайии мувофиқро ифода мекунанд, истифода шуд. Байни пайдарпайиҳои 12-ченакае, ки аз ҷониби CSF дар клади алтернативии A (Расми 2c, d) ва клади B (Расми 2g, h) барқарор карда шудаанд, як монандӣ ба таври возеҳ мушоҳида шуд. Таҳлили якҷояшуда дар ҳар як шоха профилҳои гуногуни интихобро барои пептидҳои 12-мер (Расми иловагии 5c, d) ва афзоиши таносуби титри CSF/хунро бо мурури замон барои клонҳои якҷояшуда пас аз даври дуюми интихоб дар муқоиса бо даври аввали интихоб нишон дод (Расми иловагии 5e).
Ғанигардонии мотивҳо ва пептидҳо дар моеъи мағзи сар тавассути ду даври пайдарпайи интихоби намоиши функсионалии фагҳои in vivo.
Ҳамаи фагҳои моеъи мағзи сар, ки аз даври аввали ҳар як ҳайвон (ҳайвонҳои №1.1 ва №1.2) барқарор карда шуданд, муттаҳид карда шуданд, бо HT пайдарпайӣ карда шуданд ва якҷоя дубора ворид карда шуданд (2 x 1010 фаг/ҳайвон) 2 каламуши каннулии SM (#1.1 → #). 2.1 ва 2.2, 1.2 → 2.3 ва 2.4). (a,b,e,f) Диаграммаҳои парокандагии коррелятсионӣ, ки басомади нисбии мотивҳои трипептидии ҳамаи фагҳои аз CSF гирифташударо дар даврҳои якум ва дуюми интихоб муқоиса мекунанд. Басомади нисбӣ ва тақсимоти мотивҳо, ки ҳамаи трипептидҳои эҳтимолии ҳампӯшро, ки дар пептидҳо дар ҳарду самт мавҷуданд, ифода мекунанд. Шумораи мотивҳои ёфтшуда дар 1000 хониш нишон дода шудааст. Мотивҳое, ки дар яке аз китобхонаҳои муқоисашуда ба таври назаррас (p <0.001) интихоб ё хориҷ карда шудаанд, бо нуқтаҳои сурх қайд карда шудаанд. (c, d, g, h) Намояндагии логотипи пайдарпайии ҳамаи пайдарпайиҳои дарози 12 аминокислотаи бой аз CSF, ки бар асоси даврҳои 2 ва 1-и интихоби in vivo асос ёфтаанд. Андозаи рамзи якҳарфа нишон медиҳад, ки ин аминокислотаҳо дар он мавқеъ чӣ қадар зуд-зуд рух медиҳанд. Барои намояндагии логотип, басомади пайдарпайиҳои CSF, ки аз ҳайвоноти алоҳида байни ду даври интихоб гирифта шудаанд, муқоиса карда мешавад ва пайдарпайиҳои ғанӣ дар даври дуюм нишон дода мешаванд: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 ва (h) #1.2–#2.4. Аминокислотаҳои аз ҳама ғанӣ дар мавқеи муайян дар ҳайвоноти (c, d) рақамҳои 2.1 ва рақамҳои 2.2 ё (g, h) дар ҳайвоноти рақамҳои 2.3 ва рақамҳои 2.4 бо ранг нишон дода шудаанд. Сабз = қутбӣ, арғувонӣ = бетараф, кабуд = асосӣ, сурх = туршӣ ва сиёҳ = аминокислотаҳои гидрофобӣ.
Пас аз даври сеюми интихоб, мо 124 пайдарпайии пептидҳои беназирро (#3.1 ва #3.2) аз 332 клонҳои фагҳои барқароршудаи CSF, ки аз ду ҳайвон ҷудо карда шудаанд, муайян кардем (Расми иловагии 6a). Пайдарпайии LGSVS (18.7%) нисбати баландтаринро дошт, пас аз он воридҳои навъи ваҳшӣ PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) ва SARGSWREIVSLS (2.2%) қарор гирифтанд. Дар даври чоруми ниҳоии мо, мо ду шохаи мустақилона интихобшударо аз се ҳайвони алоҳида ҷамъ кардем (Расми 1c). Аз 925 клонҳои пайдарпайи фагҳои аз CSF барқароршуда, дар даври чорум мо 64 пайдарпайии пептидҳои беназирро пайдо кардем (Расми иловагии 6b), ки дар байни онҳо таносуби нисбии фагҳои навъи ваҳшӣ то 0.8% коҳиш ёфт. Клонҳои маъмултарини CSF дар даври чорум LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSLNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ва RLSSVDSDLSGC (3, 2%) буданд. %)). Диапазони дарозии пептидҳои интихобшуда аз сабаби воридкунӣ/несткунии нуклеотидҳо ё кодонҳои бармаҳали қатъкунӣ дар праймерҳои китобхона ҳангоми истифодаи кодонҳои дегенеративӣ барои тарроҳии китобхонаи NNK ба вуҷуд меояд. Кодонҳои қатъкунии бармаҳал пептидҳои кӯтоҳтарро ба вуҷуд меоранд ва интихоб карда мешаванд, зеро онҳо мотиви мусоиди AA-ро дар бар мегиранд. Пептидҳои дарозтар метавонанд аз воридкунӣ/несткунӣ дар праймерҳои китобхонаҳои синтетикӣ ба вуҷуд оянд. Ин кодони қатъкунии тарҳрезишударо дар беруни чаҳорчӯба ҷойгир мекунад ва онро то пайдо шудани кодони нави қатъкунӣ дар поён мехонад. Умуман, мо омилҳои ғанӣ гардониданро барои ҳар чор даври интихоб бо муқоисаи маълумоти вурудӣ бо маълумоти намунавии баромад ҳисоб кардем. Дар даври аввали скрининг, мо титрҳои фагҳои навъи ваҳширо ҳамчун истиноди заминаи ғайримушаххас истифода бурдем. Ҷолиб он аст, ки интихоби манфии фагҳо дар давраи аввали CSF хеле қавӣ буд, аммо дар хун не (Расми 3a), ки метавонад аз эҳтимолияти пасти паҳншавии ғайрифаъоли аксари аъзои китобхонаи пептидҳо ба қисмати CSF вобаста бошад ё фагҳои нисбӣ нисбат ба бактериофагҳо самараноктар нигоҳ дошта ё аз ҷараёни хун хориҷ карда мешаванд. Аммо, дар даври дуюми паннинг, интихоби қавии фагҳо дар CSF дар ҳарду клад мушоҳида шуд, ки нишон медиҳад, ки даври қаблӣ бо фагҳое, ки пептидҳоеро нишон медиҳанд, ки ҷабби CSF-ро мусоидат мекунанд, ғанӣ гардонида шудааст (Расми 3a). Боз ҳам, бе ғанӣ гардонидани назарраси хун. Инчунин дар даврҳои сеюм ва чорум, клонҳои фагҳо дар CSF ба таври назаррас ғанӣ гардонида шуданд. Бо муқоисаи басомади нисбии ҳар як пайдарпайии пептидии беназир байни ду даври охирини интихоб, мо муайян кардем, ки пайдарпайҳо дар даври чоруми интихоб боз ҳам ғанӣтар буданд (Расми 3b). Дар маҷмӯъ, аз ҳамаи 64 пайдарпайии пептидҳои беназир бо истифода аз ҳарду самти пептидӣ 931 мотиви трипептидӣ истихроҷ карда шуданд. Мотивҳои аз ҳама ғанӣ гардонидашуда дар даври чорум нисбат ба китобхонаи воридшуда (ҳадди ниҳоӣ: ғанӣ гардонидани 10%) аз нигоҳи профилҳои ғанӣ гардонидани онҳо дар ҳама даврҳо бодиққаттар таҳқиқ карда шуданд (Расми иловагӣ 6c). Нақшҳои умумии интихоб нишон доданд, ки аксари мотивҳои омӯхташуда дар ҳама даврҳои қаблии ҳарду шохаи интихоб ғанӣ гардонида шудаанд. Бо вуҷуди ин, баъзе мотивҳо (масалан, SGL, VSG, LGS GSV) асосан аз клади алтернативии А буданд, дар ҳоле ки дигарон (масалан, FGW, RTN, WGF, NTR) дар клади алтернативии В ғанӣ гардонида шуданд.
Тасдиқи интиқоли CSF-и пептидҳои бо фаг нишондодашудаи ғанӣ бо CSF ва пептидҳои пешсафи биотинилшуда, ки бо борҳои стрептавидин пайваст шудаанд.
(a) Таносубҳои ғанӣгардонӣ дар ҳар чор давр (R1-R4) дар асоси титрҳои фагҳои воридшуда (вуруд = I) ва титрҳои фагҳои муайяншудаи CSF (баромад = O) ҳисоб карда шуданд. Омилҳои ғанӣгардонӣ барои се даври охир (R2-R4) бо муқоиса бо даври қаблӣ ва даври аввал (R1) бо маълумоти вазн ҳисоб карда шуданд. Сутунҳои кушода моеъи мағзи сар ва сутунҳои сояафкан плазма мебошанд. (***p<0.001, дар асоси санҷиши t-и Стюдент). (b) Рӯйхати пептидҳои фаровонтарини фагҳо, ки мувофиқи таносуби нисбии онҳо ба ҳамаи фагҳои ҷамъовардашуда дар CSF пас аз даври 4-уми интихоб ҷойгир карда шудаанд. Шаш клони маъмултарини фагҳо бо ранг, рақамгузорӣ ва омилҳои ғанӣгардонии онҳо байни даврҳои 3 ва 4-уми интихоб нишон дода шудаанд (замимаҳо). (c,d) Шаш клони пурғанӣтарини фагҳо, китобхонаҳои холӣ ва пептидҳои фагҳои волидайн аз даври 4 дар модели намунагирии CSF алоҳида таҳлил карда шуданд. Намунаҳои CSF ва хун дар нуқтаҳои вақти нишондодашуда ҷамъоварӣ карда шуданд. (в) Миқдори баробари 6 клони номзади фаг (2 x 1010 фаг/ҳайвон), фагҳои холӣ (#1779) (2 x 1010 фаг/ҳайвон) ва китобхонаҳои пептидҳои фагҳои захиравӣ (2 x 1012 фаг/ҳайвон). Ҳадди ақал 3 CM ба ҳайвони каннулятсионӣ алоҳида тавассути раги дум ворид карда мешавад. Фармакокинетикаи CSF-и ҳар як клони фаг ва китобхонаи пептиди фагҳои воридшуда дар тӯли вақт нишон дода шудааст. (г) таносуби миёнаи CSF/хунро барои ҳамаи фагҳои барқароршуда/мл дар тӯли вақти намунагирӣ нишон медиҳад. (д) Чор пептиди пешбари синтетикӣ ва як гурӯҳи назоратии омехташуда бо биотин ба стрептавидин тавассути N-терминали худ (намоиши тетрамер) пайваст карда шуданд ва баъдан тазриқ (раги дум ба IV, 10 мг стрептавидин/кг). Ҳадди ақал се каламуши интубатсияшуда (N = 3). Намунаҳои CSF дар нуқтаҳои вақти нишондодашуда ҷамъоварӣ карда шуданд ва консентратсияи стрептавидин бо истифода аз ELISA-и зиддистрептавидини CSF чен карда шуд (nd = муайян карда нашуд). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, дар асоси санҷиши ANOVA). (f) Муқоисаи пайдарпайии аминокислотаи клони пептиди фаг #2002 (арғувонӣ) бо дигар клонҳои пептиди фагҳои интихобшуда аз даври 4-уми интихоб. Қисмҳои аминокислотаҳои якхела ва монанд бо ранг рамзгузорӣ шудаанд.
Аз ҳамаи фагҳои ғанӣ дар даври чорум (Расми 3b), шаш клони номзад барои таҳлили минбаъдаи инфиродӣ дар модели намунагирии CSF интихоб карда шуданд. Миқдори баробари шаш китобхонаи фаги номзад, фаги холӣ (бе воридкунӣ) ва пептиди профаг ба се ҳайвони каннулятсионӣ ворид карда шуданд ва фармакокинетика дар таҳлилҳои CSF (Расми 3c) ва хун (Расми иловагӣ 7) муайян карда шуд. Ҳамаи клони фагҳои санҷидашуда қисмати CSF-ро дар сатҳи 10-1000 маротиба баландтар аз фаги назоратии холӣ (#1779) ҳадаф қарор доданд. Масалан, клонҳои #2020 ва #2077 титрҳои CSF-и тақрибан 1000 маротиба баландтар аз фаги назоратӣ доштанд. Профили фармакокинетикии ҳар як пептиди интихобшуда гуногун аст, аммо ҳамаи онҳо қобилияти баланди ҷойгиркунии CSF доранд. Мо дар тӯли вақт коҳиши доимиро барои клонҳои №1903 ва №2011 мушоҳида кардем, дар ҳоле ки барои клонҳои №2077, №2002 ва №2009 афзоиш дар давоми 10 дақиқаи аввал метавонад интиқоли фаъолро нишон диҳад, аммо бояд тасдиқ карда шавад. Клонҳои №2020, №2002 ва №2077 дар сатҳҳои баланд устувор шуданд, дар ҳоле ки консентратсияи CSF-и клони №2009 пас аз афзоиши аввал оҳиста коҳиш ёфт. Сипас, мо басомади нисбии ҳар як номзади CSF-ро бо консентратсияи хуни он муқоиса кардем (Расми 3d). Ҳамбастагии титри миёнаи ҳар як номзади CSF бо титри хуни он дар ҳама вақтҳои намунагирӣ нишон дод, ки се нафар аз шаш номзад ба таври назаррас аз CSF-и хун бой буданд. Ҷолиб он аст, ки клони №2077 устувории баланди хунро нишон дод (Расми иловагӣ 7). Барои тасдиқи он, ки худи пептидҳо қодиранд борҳои ғайр аз зарраҳои фагро ба қисмати CSF фаъолона интиқол диҳанд, мо чор пептиди пешсафро синтез кардем, ки бо биотин дар N-терминал ҳосил карда шудаанд, ки дар он ҷо пептидҳо ба зарраҳои фаг пайваст мешаванд. Пептидҳои биотинилӣ (рақамҳои 2002, 2009, 2020 ва 2077) бо стрептавидин (SA) пайваст карда шуданд, то шаклҳои бисёрҷонибаро, ки то андозае геометрияи фагро тақлид мекунанд, ба даст орем. Ин формат инчунин ба мо имкон дод, ки таъсири SA-ро дар моеъи хун ва мағзи сар ҳамчун пептидҳои сафедаи интиқолдиҳандаи бор чен кунем. Муҳим он аст, ки маълумоти фагро аксар вақт ҳангоми ворид кардани пептидҳои синтетикӣ дар ин формати пайвастшудаи SA такрор кардан мумкин буд (Расми 3e). Пептидҳои омехта таъсири ибтидоии камтар ва тозакунии тезтари CSF бо сатҳҳои номуайян дар давоми 48 соат доштанд. Барои фаҳмидани роҳҳои интиқоли ин клонҳои фаги пептидӣ ба фазои CSF, мо маҳаллисозии зарбаҳои пептидии инфиродии фагро бо истифода аз иммуногистохимия (IHC) барои муайян кардани мустақими зарраҳои фаг 1 соат пас аз воридкунии дохиливаридӣ дар in vivo таҳлил кардем. Қобили зикр аст, ки клонҳои #2002, #2077 ва #2009-ро бо рангкунии қавӣ дар капиллярҳои мағзи сар муайян кардан мумкин буд, дар ҳоле ки фаги назоратӣ (#1779) ва клони #2020 муайян карда нашуданд (Расми иловагӣ 8). Ин нишон медиҳад, ки ин пептидҳо маҳз тавассути убур аз BBB ба таъсир ба мағзи сар мусоидат мекунанд. Барои санҷидани ин фарзия таҳлили муфассали минбаъда лозим аст, зеро роҳи BSCFB низ метавонад дар ин кор иштирок кунад. Ҳангоми муқоисаи пайдарпайии аминокислотаҳои клони аз ҳама ғанӣ (#2002) бо дигар пептидҳои интихобшуда, қайд карда шуд, ки баъзе аз онҳо васеъшавии шабеҳи аминокислотаҳо доранд, ки метавонад механизми монандро дар интиқол нишон диҳад (Расми 3f).
Аз сабаби профили беназири плазма ва афзоиши назарраси CSF бо мурури замон, клони намоиши фаг #2077 дар тӯли муддати тӯлонитари 48-соата минбаъд омӯхта шуд ва тавонист афзоиши босуръати CSF-ро, ки дар робита бо сатҳи устувори SA мушоҳида шудааст, такрор кунад (Расми 4a). Дар мавриди дигар клонҳои муайяншудаи фаг, #2077 барои капиллярҳои мағзи сар сахт ранг карда шуд ва ҳангоми дидан бо қарори баландтар бо лектини маркери капиллярӣ колокализатсияи назаррасро нишон дод ва эҳтимолан дар фазои паренхималӣ каме рангкунӣ мушоҳида шуд (Расми 4b). Барои таҳқиқи он, ки оё таъсири фармакологии пептидӣ метавонад дар CNS ба даст оварда шавад, мо таҷрибаеро анҷом додем, ки дар он версияҳои биотиншудаи i) пептиди транзитии #2077 ва ii) пептиди ингибитори BACE1 бо SA бо ду таносуби гуногун омехта карда шуданд. Барои як комбинатсия мо танҳо ингибитори пептиди BACE1-ро истифода бурдем ва барои комбинатсияи дигар мо таносуби 1:3-и ингибитори пептиди BACE1 ба пептиди #2077-ро истифода бурдем. Ҳарду намуна ба таври рагӣ ворид карда шуданд ва сатҳи пептиди бета-амилоид 40 (Abeta40) дар хун ва моеъи мағзи сар бо мурури замон чен карда шуд. Abeta40 дар CSF чен карда шуд, зеро он боздории BACE1-ро дар паренхимаи мағзи сар инъикос мекунад. Тавре ки интизор мерафт, ҳарду комплекс сатҳи Abeta40-ро дар хун ба таври назаррас коҳиш доданд (Расми 4c, d). Аммо, танҳо намунаҳое, ки омехтаи пептиди рақами 2077 ва ингибитори пептиди BACE1-ро, ки ба SA пайваст шудааст, дар моеъи мағзи сар коҳиши назарраси Abeta40-ро ба вуҷуд оварданд (Расми 4c). Маълумот нишон медиҳанд, ки пептиди рақами 2077 қодир аст сафедаи 60 kDa SA-ро ба системаи марказии асаб интиқол диҳад ва инчунин бо ингибиторҳои пептиди BACE1, ки бо SA пайваст шудаанд, таъсири фармакологӣ ба вуҷуд меорад.
(а) Тазриқи клоналӣ (2 × 10 фаг/ҳайвон)-и фаги T7, ки профилҳои фармакокинетикии дарозмуддати пептиди CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) ва фаги назоратии тазриқнашуда (#1779)-ро дар ҳадди аққал се каламуши бо интубатсияшудаи CM нишон медиҳад. (б) Тасвири конфокалии микроскопии микрорагҳои кортикалии намояндагӣ дар каламушҳои бо фаг тазриқшуда (2 × 10 10 фаг/ҳайвон), ки рангкунии муқобили пептиди #2077 ва рагҳоро (лектин) нишон медиҳад. Ин клонҳои фаг ба 3 каламуш дода шуданд ва пеш аз перфузия барои 1 соат дар гардиш гузошта шуданд. Мағзи сарҳо бурида ва бо антителоҳои поликлоналии нишонгузорӣшудаи FITC бар зидди капсиди фаги T7 ранг карда шуданд. Даҳ дақиқа пеш аз перфузия ва фиксатсияи минбаъда, лектини нишонгузорӣшудаи DyLight594 ба таври варидӣ ворид карда шуд. Тасвирҳои флуоресентӣ, ки рангкунии лектинро (сурх) дар тарафи люмении микрорагҳо ва фагҳоро (сабз) дар люмени капиллярҳо ва бофтаи периваскулярӣ дар мағзи сар нишон медиҳанд. Хати миқёс ба 10 мкм мувофиқат мекунад. (в, г) Пептиди ингибитории биотинилшудаи BACE1 танҳо ё дар якҷоягӣ бо пептиди транзитии биотинилшудаи #2077 ба стрептавидин пайваст карда шуд ва сипас ба дохили варид ҳадди аққал се каламуши CM-и каннулятсионӣ (10 мг стрептавидин/кг) ворид карда шуд. Камшавии Aβ40, ки аз ҷониби ингибитори пептиди BACE1 ба вуҷуд омадааст, бо истифода аз ELISA Aβ1-40 дар хун (сурх) ва моеъи мағзи сар (норанҷӣ) дар нуқтаҳои вақти нишондодашуда чен карда шуд. Барои равшании беҳтар, дар график хати нуқтадор бо миқёси 100% кашида шудааст. (в) Камшавии фоизии Aβ40 дар хун (секунҷаҳои сурх) ва моеъи мағзи сар (секунҷаҳои норинҷӣ) дар каламушҳое, ки бо стрептавидин табобат карда шудаанд ва ба пептиди транзитии №2077 ва пептиди ингибитории BACE1 бо таносуби 3:1 пайваст шудаанд. (г) Камшавии фоизии Aβ40 дар хун (доираҳои сурх) ва моеъи мағзи сар (доираҳои норинҷӣ) дар каламушҳое, ки бо стрептавидин табобат карда шудаанд, танҳо бо пептиди ингибитории BACE1 пайваст карда шудаанд. Консентратсияи Aβ дар гурӯҳи назоратӣ 420 пг/мл буд (инҳирофи стандартӣ = 101 пг/мл).
Намоиши фаг дар якчанд самтҳои тадқиқоти биотиббӣ бомуваффақият татбиқ шудааст17. Ин усул барои таҳқиқоти гуногунии рагҳои in vivo18,19, инчунин таҳқиқоте, ки ба рагҳои мағзи сар нигаронида шудаанд20,21,22,23,24,25,26 истифода шудааст. Дар ин таҳқиқот, мо татбиқи ин усули интихобро на танҳо барои муайян кардани мустақими пептидҳое, ки ба рагҳои мағзи сар нигаронида шудаанд, балки инчунин барои кашфи номзадҳо бо хосиятҳои интиқоли фаъол барои убур аз монеаи хун-мағзи сар васеъ кардем. Ҳоло мо таҳияи тартиби интихоби in vivo-ро дар каламушҳои интубатсияи CM тавсиф мекунем ва потенсиали онро барои муайян кардани пептидҳо бо хосиятҳои ҳоминги CSF нишон медиҳем. Бо истифода аз фаги T7, ки китобхонаи пептидҳои тасодуфии 12-мерро нишон медиҳад, мо тавонистем нишон диҳем, ки фаги T7 ба қадри кофӣ хурд аст (тақрибан 60 нм диаметр)10, ки ба монеаи хун-мағзи сар мутобиқ шавад ва бо ин васила мустақиман аз монеаи хун-мағзи сар ё плексуси хориоид убур кунад. Мо мушоҳида кардем, ки ҷамъоварии CSF аз каламушҳои CM-и каннулятсионӣ як усули хуб назоратшавандаи скрининги функсионалии in vivo буд ва фаги истихроҷшуда на танҳо ба системаи рагҳо пайваст мешуд, балки ҳамчун интиқолдиҳанда тавассути монеаи хун-мағзи сар низ амал мекард. Ғайр аз ин, бо ҷамъоварии ҳамзамони хун ва истифодаи HTS ба CSF ва фагҳои аз хун ҳосилшуда, мо тасдиқ кардем, ки интихоби мо аз CSF аз ғанӣ гардонидани хун ё мутобиқат барои васеъшавӣ байни даврҳои интихоб таъсир надошт. Аммо, қисмати хун қисми тартиби интихоб аст, зеро фагҳое, ки қодиранд ба қисмати CSF бирасанд, бояд дар ҷараёни хун ба қадри кофӣ зинда монанд ва гардиш кунанд, то дар мағзи сар ғанӣ гарданд. Барои гирифтани маълумоти боэътимоди пайдарпайӣ аз маълумоти хоми HTS, мо филтрҳоеро татбиқ кардем, ки ба хатогиҳои пайдарпайии мушаххаси платформа дар ҷараёни кори таҳлил мутобиқ карда шудаанд. Бо ворид кардани параметрҳои кинетикӣ ба усули скрининг, мо фармакокинетикаи зуди фагҳои T7-и ваҳшӣ (t½ ~ 28 дақиқа) дар хун тасдиқ кардем24, 27, 28 ва инчунин нимҳаёти онҳоро дар моеъи мағзи сар (t½ ~ 26 дақиқа) дар як дақиқа муайян кардем). Сарфи назар аз профилҳои фармакокинетикӣ дар хун ва мағзи сар, танҳо 0,001% консентратсияи фаг дар хун дар мағзи сар муайян карда шуд, ки ин нишон медиҳад, ки ҳаракати заминавии пасти фаги навъи T7-и ваҳшӣ тавассути монеаи хун-мағзи сар. Ин кор аҳамияти даври аввали интихобро ҳангоми истифодаи стратегияҳои паннинги in vivo, махсусан барои системаҳои фаг, ки зуд аз гардиши хун тоза карда мешаванд, нишон медиҳад, зеро чанд клон метавонанд ба қисмати марказии асаб бирасанд. Ҳамин тариқ, дар даври аввал коҳиши гуногунии китобхона хеле калон буд, зеро дар ин модели хеле қатъии мағзи сар танҳо шумораи маҳдуди клонҳо ҷамъоварӣ карда шуданд. Ин стратегияи паннинги in vivo якчанд марҳилаҳои интихобро дар бар мегирифт, ба монанди ҷамъшавии фаъол дар қисмати мағзи сар, зинда мондани клон дар қисмати хун ва хориҷ кардани босуръати клонҳои фаги T7 аз хун дар давоми 10 дақиқаи аввал (Расми 1d ва Расми иловагӣ 4M). Ҳамин тариқ, пас аз даври аввал, клонҳои гуногуни фаг дар мағзи сар муайян карда шуданд, гарчанде ки ҳамон як ҳавзи ибтидоӣ барои ҳайвоноти алоҳида истифода мешуд. Ин нишон медиҳад, ки қадамҳои сершумори интихоби қатъӣ барои китобхонаҳои манбаъ бо шумораи зиёди аъзои китобхона боиси коҳиши назарраси гуногунрангӣ мешаванд. Аз ин рӯ, рӯйдодҳои тасодуфӣ ба қисми ҷудонашавандаи раванди интихоби ибтидоӣ табдил меёбанд ва ба натиҷа таъсири калон мерасонанд. Эҳтимол дорад, ки бисёре аз клонҳо дар китобхонаи аслӣ майли ғанӣ гардонидани CSF-и хеле монанд доштанд. Аммо, ҳатто дар шароити якхелаи таҷрибавӣ, натиҷаҳои интихоб метавонанд аз сабаби шумораи ками ҳар як клони мушаххас дар ҳавзи ибтидоӣ фарқ кунанд.
Мотивҳои ғанӣ дар CSF аз мотивҳои хун фарқ мекунанд. Ҷолиб он аст, ки мо аввалин тағйиротро ба сӯи пептидҳои бой аз глицин дар хуни ҳайвоноти алоҳида мушоҳида кардем. (Расми 1g, Расмҳои иловагӣ 4e, 4f). Пептидҳои фагҳои дорои глицин метавонанд устувортар бошанд ва эҳтимоли камтар аз гардиш хориҷ шудан дошта бошанд. Аммо, ин пептидҳои бой аз глицин дар намунаҳои моеъи мағзи сар муайян карда нашуданд, ки ин нишон медиҳад, ки китобхонаҳои интихобшуда аз ду марҳилаи гуногуни интихоб гузаштаанд: яке дар хун ва дигаре имкон доданд, ки дар моеъи мағзи сар ҷамъ шаванд. Клонҳои ғанӣ дар CSF, ки дар натиҷаи даври чоруми интихоб ба даст омадаанд, ба таври васеъ санҷида шудаанд. Қариб ҳамаи клонҳои алоҳида санҷидашуда дар муқоиса бо фаги назоратии холӣ дар CSF ғанӣ будани онҳо тасдиқ карда шуд. Як пептиди зарбазананда (#2077) муфассалтар таҳқиқ карда шуд. Он дар муқоиса бо дигар зарбаҳо нимҳаёти дарозтари плазмаро нишон дод (Расми 3d ва Расми иловагӣ 7) ва ҷолиб он аст, ки ин пептид боқимондаи систеинро дар терминали C дошт. Ба наздикӣ нишон дода шудааст, ки илова кардани систеин ба пептидҳо метавонад хосиятҳои фармакокинетикии онҳоро тавассути пайвастшавӣ ба албумин 29 беҳтар кунад. Ин дар айни замон барои пептиди №2077 номаълум аст ва омӯзиши минбаъдаро талаб мекунад. Баъзе пептидҳо дар ғанӣ гардонидани CSF вобастагии валентӣ нишон доданд (маълумот нишон дода нашудааст), ки метавонад бо геометрияи сатҳи нишондодашудаи капсиди T7 алоқаманд бошад. Системаи T7, ки мо истифода бурдем, 5-15 нусхаи ҳар як пептидро барои як зарраи фаг нишон дод. IHC дар клонҳои фаги номзадҳои сурб, ки ба таври рагӣ ба қишри мағзи сар аз каламушҳо ворид карда шудаанд, анҷом дода шуд (Расми иловагӣ 8). Маълумот нишон дод, ки ҳадди аққал се клон (№ 2002, № 2009 ва № 2077) бо BBB ҳамкорӣ кардаанд. Ҳанӯз муайян нашудааст, ки оё ин таъсири мутақобилаи BBB боиси ҷамъшавии CSF ё ҳаракати ин клонҳо мустақиман ба BCSFB мегардад. Муҳим он аст, ки мо нишон медиҳем, ки пептидҳои интихобшуда қобилияти интиқоли CSF-и худро ҳангоми синтез ва пайваст шудан ба боркаши сафеда нигоҳ медоранд. Пайвастшавии пептидҳои биотинилшудаи N-терминалӣ ба SA асосан натиҷаҳои бадастомада бо клонҳои фаги мувофиқи онҳоро дар моеъи хун ва мағзи сар такрор мекунад (Расми 3e). Ниҳоят, мо нишон медиҳем, ки пептиди пешбари #2077 қодир аст, ки амали мағзии ингибитори пептиди биотинилшудаи BACE1-ро, ки ба SA пайваст шудааст, тақвият диҳад ва бо коҳиш додани сатҳи Abeta40 дар CSF таъсири фармакодинамикии намоёнро дар системаи марказии асаб ба вуҷуд орад (Расми 4). Мо бо анҷом додани ҷустуҷӯи гомологияи пайдарпайии пептидҳои ҳамаи натиҷаҳо натавонистем ягон гомологро дар пойгоҳи додаҳо муайян кунем. Қайд кардан муҳим аст, ки андозаи китобхонаи T7 тақрибан 109 аст, дар ҳоле ки андозаи назариявии китобхона барои 12-mers 4 x 1015 аст. Аз ин рӯ, мо танҳо як қисми ками фазои гуногунии китобхонаи пептидии 12-mer-ро интихоб кардем, ки ин маънои онро дорад, ки пептидҳои беҳтарро метавон тавассути арзёбии фазои пайдарпайии ҳамшафати ин зарбаҳои муайяншуда муайян кард. Аз ҷиҳати фарзиявӣ, яке аз сабабҳои пайдо накардани ягон гомологи табиии ин пептидҳо метавонад интихоби беэътибор ҳангоми эволютсия барои пешгирии воридшавии беназорати баъзе мотивҳои пептидӣ ба мағзи сар бошад.
Натиҷаҳои мо дар маҷмӯъ барои корҳои оянда барои муайян ва тавсифи муфассалтари системаҳои интиқоли монеаи мағзи сар дар in vivo замина фароҳам меоранд. Тартиби асосии ин усул ба стратегияи интихоби функсионалӣ асос ёфтааст, ки на танҳо клонҳоро бо хосиятҳои пайвастшавии рагҳои мағзи сар муайян мекунад, балки як қадами муҳимро дар бар мегирад, ки дар он клонҳои муваффақ фаъолияти дохилиро барои убур аз монеаҳои биологӣ дар in vivo ба қисмати CNS доранд. равшан кардани механизми интиқоли ин пептидҳо ва афзалияти онҳо барои пайвастшавӣ ба микроваскулатураи хоси минтақаи мағзи сар мебошад. Ин метавонад ба кашфи роҳҳои нави интиқоли BBB ва ретсепторҳо оварда расонад. Мо интизорем, ки пептидҳои муайяншуда метавонанд мустақиман ба ретсепторҳои мағзи сар ё ба лигандҳои гардишкунандае, ки тавассути BBB ё BCSFB интиқол дода мешаванд, пайваст шаванд. Векторҳои пептид бо фаъолияти интиқоли CSF, ки дар ин кор кашф шудаанд, минбаъд таҳқиқ карда мешаванд. Мо айни замон хусусияти мағзи ин пептидҳоро аз рӯи қобилияти онҳо барои убур аз BBB ва/ё BCSFB таҳқиқ мекунем. Ин пептидҳои нав воситаҳои бениҳоят арзишманд барои кашфи эҳтимолии ретсепторҳо ё роҳҳои нав ва барои таҳияи платформаҳои нави хеле самаранок барои интиқоли макромолекулаҳо, ба монанди биологҳо, ба мағзи сар хоҳанд буд.
Систернаи калон (CM)-ро бо истифода аз тағйироти усули қаблан тавсифшуда каннула кунед. Каламушҳои Вистари наркозшуда (200-350 г) ба дастгоҳи стереотаксикӣ насб карда шуданд ва дар болои пӯсти сар, ки тарошида ва асептикӣ омода карда шудааст, буриши миёна анҷом дода шуд, то косахонаи сар ошкор карда шавад. Дар минтақаи тасмаи болоӣ ду сӯрох парма кунед ва винтҳои мустаҳкамкунандаро дар сӯрохиҳо маҳкам кунед. Дар қуллаи паҳлӯии оксипиталӣ сӯрохи иловагӣ барои роҳнамоии стереотаксионии канюлаи пӯлоди зангногир ба CM парма карда шуд. Сементи дандонпизишкиро дар атрофи канюл молед ва бо винтҳо маҳкам кунед. Пас аз фото-қавӣ ва сахтшавии семент, захми пӯст бо дӯзандагии 4/0 супрамидӣ баста шуд. Ҷойгиркунии дурусти канюларо бо ихроҷи худсаронаи моеъи мағзи сар (CSF) тасдиқ кардан мумкин аст. Каламушро аз дастгоҳи стереотаксикӣ ҷудо кунед, нигоҳубини мувофиқ ва идоракунии дардро пас аз ҷарроҳӣ гиред ва бигзоред, ки он ҳадди аққал як ҳафта барқарор шавад, то он даме ки нишонаҳои хун дар моеъи мағзи сар мушоҳида шаванд. Каламушҳои Вистар (Crl:WI/Han) аз Чарлз Ривер (Фаронса) гирифта шуданд. Ҳамаи каламушҳо дар шароити махсуси бе патоген нигоҳ дошта шуданд. Ҳамаи таҷрибаҳо бо ҳайвонот аз ҷониби Идораи байтории шаҳри Базел, Швейтсария тасдиқ карда шуданд ва мувофиқи иҷозатномаи ҳайвонот № 2474 (Арзёбии интиқоли фаъоли мағзи сар тавассути чен кардани сатҳи номзадҳои терапевтӣ дар моеъи мағзи сар ва мағзи каламуш) анҷом дода шуданд.
Бо канюлаи CM дар даст, каламушро бо эҳтиёт ҳушёр нигоҳ доред. Датураро аз канюларо хориҷ кунед ва 10 мкл моеъи мағзи сар, ки худ аз худ ҷорӣ мешавад, ҷамъ кунед. Азбаски гузариши канюл дар ниҳоят вайрон шуд, дар ин таҳқиқот танҳо намунаҳои моеъи шаффофи мағзи сар, ки ягон нишонаи олудашавӣ ё тағйирёбии ранги хунро надоштанд, дохил карда шуданд. Дар баробари ин, тақрибан 10-20 мкл хун аз буриши хурд дар нӯги дум ба найчаҳо бо гепарин (Sigma-Aldrich) гирифта шуд. Мағзи сар ва хун пас аз ворид кардани фаги T7 ба дохили варид дар нуқтаҳои гуногуни вақт ҷамъ карда шуданд. Пеш аз ҷамъоварии ҳар як намунаи мағзи сар тақрибан 5-10 мкл моеъ партофта шуд, ки ба ҳаҷми мурдаи катетер мувофиқат мекунад.
Китобхонаҳо бо истифода аз вектори T7Select 10-3b, тавре ки дар дастури системаи T7Select тавсиф шудааст (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996), тавлид карда шуданд. Хулоса, як вуруди тасодуфии 12-мери ДНК дар формати зерин синтез карда шуд:
Кодон NNK барои пешгирӣ аз кодонҳои дукаратаи қатъ ва аз ҳад зиёд ифода шудани аминокислотаҳо дар вуруд истифода шуд. N таносуби эквимолярии дастӣ омехташудаи ҳар як нуклеотид ва K таносуби эквимолярии дастӣ омехташудаи нуклеотидҳои аденин ва ситозин мебошад. Минтақаҳои якқабатаи бо ДНК-и дуқабатаи бо инкубатсияи минбаъда бо dNTP (Novagen) ва ферменти Klenow (New England Biolabs) дар буфери Klenow (New England Biolabs) барои 3 соат дар ҳарорати 37°C ба ДНК-и дуқабатаи бо табдил дода шуданд. Пас аз реаксия, ДНК-и дуқабатаи бо боришоти EtOH барқарор карда шуд. ДНК-и ҳосилшуда бо ферментҳои рестриксия EcoRI ва HindIII (ҳарду аз Roche) ҳазм карда шуд. Вуруди бурида ва тозашуда (QIAquick, Qiagen) (лигазаи T4, New England Biolabs) сипас дар чаҳорчӯба ба вектори пешакӣ буридашудаи T7 пас аз аминокислотаи 348-и гени капсиди 10B пайваст карда шуд. Реаксияҳои лигатсия дар ҳарорати 16°C ба муддати 18 соат пеш аз бастабандии in vitro инкубатсия карда шуданд. Бастабандии фагҳо дар in vitro мувофиқи дастурҳои додашуда бо маҷмӯаи клонкунии T7Select 10-3b (Novagen) анҷом дода шуд ва маҳлули бастабандӣ як маротиба барои лизис бо истифода аз Escherichia coli (BLT5615, Novagen) амплатсия карда шуд. Лизатҳо ҳамчун маҳлули захиравии глицерин дар ҳарорати -80°C сентрифуга карда, титр карда ва ях карда шуданд.
Тақвияти мустақими PCR-и минтақаҳои тағйирёбандаи фаг, ки дар шӯрбо ё табақ бо истифода аз праймерҳои синтези 454/Roche-amplicon-и хусусӣ тақвият дода шудаанд. Праймери синтези пешакӣ пайдарпайиҳоро дар паҳлӯи минтақаи тағйирёбанда (NNK) 12 (шаблон хос), адаптери титании GS FLX A ва пайдарпайии калидии китобхонаи чорпоя (TCAG) (Расми иловагӣ 1a) дар бар мегирад:
Праймери омехтаи баръакс инчунин дорои биотин аст, ки ба маҳлулҳои сайдкунанда пайваст карда шудааст ва адаптери титании GS FLX B, ки барои тақвияти клоналӣ ҳангоми PCR эмульсия зарур аст:
Сипас ампликонҳо мувофиқи протоколи Titanium 454 GS-FLX ба пиросеквенсияи 454/Roche дучор карда шуданд. Барои секвенсияи дастии Sanger (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), ДНК-и фаги T7 тавассути PCR тақвият дода шуд ва бо ҷуфтҳои праймерҳои зерин секвенсия карда шуд:
Иловаҳо аз лавҳаҳои алоҳида бо истифода аз маҷмӯаи Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда) ба амплификатсияи PCR дучор карда шуданд. Оғози гарм (10 дақиқа дар 95 °C) ва 35 давраи пурқувваткунӣ (50 сония дар 95 °C, 1 дақиқа дар 50 °C ва 1 дақиқа дар 72 °C) -ро иҷро кунед.
Фагҳо аз китобхонаҳо, фагҳои навъи ваҳшӣ, фагҳои аз мағзи сар ва хун наҷотёфта ё клонҳои алоҳида дар Escherichia coli BL5615 дар шўрбои TB (Sigma Aldrich) ё дар зарфҳои 500 см2 (Thermo Scientific) барои 4 соат дар ҳарорати 37°C тақвият дода шуданд. Фагҳо аз табақчаҳо бо шустани табақчаҳо бо буфери Tris-EDTA (Fluka Analytical) ё бо ҷамъоварии лавҳаҳо бо нӯгҳои пипеткаи стерилизатсияшуда истихроҷ карда шуданд. Фагҳо аз болои фарҳанг ё буфери истихроҷ бо як даври боришоти полиэтиленгликол (PEG 8000) (Promega) ҷудо карда шуданд ва дар буфери Tris-EDTA дубора ҳал карда шуданд.
Фаги пурқувватшуда пеш аз ворид намудани тазриқи дохиливаридӣ (IV) (500 мкл/ҳайвон) ба 2-3 даври тозакунии эндотоксин бо истифода аз муҳраҳои тозакунии эндотоксин (Miltenyi Biotec) дучор карда шуд. Дар даври аввал, 2×1012 фаг; дар даври дуюм, 2×1010 фаг; дар даврҳои сеюм ва чоруми интихоб, 2×109 фаг барои як ҳайвон ворид карда шуданд. Миқдори фаг дар мағзи сар ва намунаҳои хун, ки дар нуқтаҳои вақти нишондодашуда ҷамъоварӣ шудаанд, бо ҳисобкунии лавҳа мувофиқи дастурҳои истеҳсолкунанда (дастури системаи T7Select) муайян карда шуд. Интихоби фаг бо роҳи ворид кардани китобхонаҳои тозашуда ба раги дум ё бо роҳи ворид кардани дубораи фаги аз мағзи сар аз даври қаблии интихоб гирифташуда ва ҷамъоварии минбаъда мутаносибан дар 10 дақиқа, 30 дақиқа, 60 дақиқа, 90 дақиқа, 120 дақиқа, 180 дақиқа ва 240 дақиқа бо намунаҳои мағзи сар ва хун анҷом дода шуд. Дар маҷмӯъ, чор даври паннинги in vivo гузаронида шуд, ки дар он ду шохаи интихобшуда алоҳида нигоҳ дошта ва дар се даври аввали интихоб таҳлил карда шуданд. Ҳамаи воридҳои фагҳое, ки аз CSF аз ду даври аввали интихоб гирифта шудаанд, ба пиросеквенсияи 454/Roche дучор карда шуданд, дар ҳоле ки ҳамаи клонҳои аз CSF аз ду даври охири интихоб гирифташуда дастӣ секвенсия карда шуданд. Ҳамаи фагҳои хун аз даври аввали интихоб низ ба пиросеквенсияи 454/Roche дучор карда шуданд. Барои тазриқи клонҳои фаг, фагҳои интихобшуда дар E. coli (BL5615) дар табақчаҳои 500 см2 дар ҳарорати 37°C барои 4 соат тақвият дода шуданд. Клонҳои алоҳида интихобшуда ва дастӣ секвенсияшуда дар муҳити сил паҳн карда шуданд. Пас аз истихроҷи фагҳо, тозакунӣ ва хориҷ кардани эндотоксин (чунон ки дар боло тавсиф шудааст), 2×1010 фаг/ҳайвон дар 300 мкл ба як раги дум ба таври варидӣ ворид карда шуданд.
Коркарди пешакӣ ва филтркунии сифатии маълумоти пайдарпайӣ. Маълумоти хоми 454/Roche аз формати харитаи ҷараёни дуӣ (sff) ба формати хондашавандаи инсонии Pearson (fasta) бо истифода аз нармафзори фурӯшанда табдил дода шуд. Коркарди минбаъдаи пайдарпайии нуклеотидҳо бо истифода аз барномаҳо ва скриптҳои хусусии C (бастаи нармафзори нашрнашуда), тавре ки дар зер тавсиф шудааст, анҷом дода шуд. Таҳлили маълумоти аввалия расмиёти қатъии филтркунии бисёрмарҳилавиро дар бар мегирад. Барои филтр кардани хонданҳое, ки пайдарпайии ДНК-и воридшудаи 12mer-ро дар бар намегирифтанд, хонданҳо пайдарпай ба нишони оғоз (GTGATGTCGGGGGATCCGAATTCT), нишони қатъ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ва воридкунии замина (CCCTGCAGGGGATATCCCCGGGAGCTCGTCGAC) бо истифода аз санҷиши ҷаҳонии Needleman-Wunsch ҳамоҳанг карда шуданд. ҳамоҳангсозӣ то 2 номувофиқатиро барои як ҳамоҳангсозӣ иҷозат медиҳад31. Аз ин рӯ, хонданҳо бе барчаспҳои оғоз ва қатъ ва хонданҳое, ки воридкунии заминаро дар бар мегиранд, яъне ҳамоҳангсозӣ, ки аз шумораи иҷозатдодашудаи номувофиқатиҳо зиёдтаранд, аз китобхона хориҷ карда шуданд. Дар мавриди хондани боқимонда, пайдарпайии ДНК-и N-mer, ки аз аломати оғоз ва пеш аз он ки аломати қатъ аз пайдарпайии хондани аслӣ хориҷ карда шавад ва минбаъд коркард шавад (минбаъд "воридкунӣ" номида мешавад), тӯл мекашад. Пас аз тарҷумаи воридкунӣ, қисмате пас аз кодони аввали қатъкунӣ дар охири 5'-и праймер аз воридкунӣ хориҷ карда мешавад. Илова бар ин, нуклеотидҳое, ки ба кодонҳои нопурра дар охири 3'-и праймер оварда мерасонанд, низ хориҷ карда шуданд. Барои истисно кардани воридкуниҳо, ки танҳо пайдарпайиҳои заминавӣ доранд, воридкуниҳои тарҷумашуда, ки бо намунаи аминокислота "PAG" оғоз мешаванд, низ хориҷ карда шуданд. Пептидҳо бо дарозии пас аз тарҷума камтар аз 3 аминокислота аз китобхона хориҷ карда шуданд. Дар ниҳоят, такрорӣ дар ҳавзи воридкуниро тоза кунед ва басомади ҳар як воридкунии беназирро муайян кунед. Натиҷаҳои ин таҳлил рӯйхати пайдарпайиҳои нуклеотидӣ (воридкуниҳо) ва басомадҳои (хондан)-и онҳоро дар бар мегирифтанд (Расми иловагии 1c ва 2).
Воридҳои ДНК-и гурӯҳи N-mer аз рӯи монандӣ ба пайдарпайӣ: Барои бартараф кардани хатогиҳои пайдарпайии хоси 454/Рош (масалан, мушкилот бо васеъкунии гомополимерҳои пайдарпайӣ) ва бартараф кардани изофаҳои камтар муҳим, воридҳои пайдарпайии N-mer ДНК, ки қаблан филтр карда шуда буданд, аз рӯи монандӣ ҷудо карда мешаванд. воридҳо (то 2 асоси номувофиқ иҷозат дода мешаванд) бо истифода аз алгоритми такрорӣ, ки чунин муайян шудааст: воридҳо аввал аз рӯи басомади онҳо (аз баландтарин то пасттарин) ва агар онҳо якхела бошанд, аз рӯи ҷудокунии дуюмдараҷаи онҳо аз рӯи дарозӣ (аз дарозтарин то кӯтоҳтарин) ҷудо карда мешаванд. Ҳамин тариқ, воридҳои зуд-зуд ва дарозтарин "гурӯҳ"-и аввалро муайян мекунанд. Басомади гурӯҳ ба басомади калидӣ муқаррар карда мешавад. Сипас, ҳар як воридкунии боқимонда дар рӯйхати ҷудошуда кӯшиш карда шуд, ки бо ҳамоҳангсозии ҷуфтии Нидлман-Вунш ба гурӯҳ илова карда шавад. Агар шумораи номувофиқатҳо, воридҳо ё несткуниҳо дар ҳамоҳангӣ аз остонаи 2 зиёд набошад, ба гурӯҳ воридкунӣ илова карда мешавад ва басомади умумии гурӯҳ бо он ки чӣ қадар воридкунӣ илова карда шудааст, зиёд карда мешавад. Воридҳое, ки ба гурӯҳ илова карда шудаанд, ҳамчун истифодашуда қайд карда мешаванд ва аз коркарди минбаъда хориҷ карда мешаванд. Агар пайдарпайии воридкуниро ба гурӯҳи мавҷуда илова кардан имконнопазир бошад, пайдарпайии воридкунӣ барои эҷоди гурӯҳи нав бо басомади мувофиқи воридкунӣ истифода мешавад ва ҳамчун истифодашуда қайд карда мешавад. Итератсия вақте ба охир мерасад, ки ҳар як пайдарпайии воридкунӣ ё барои ташкили гурӯҳи нав истифода шудааст ё метавонад ба гурӯҳи мавҷуда дохил карда шавад. Дар ниҳоят, воридкуниҳои гурӯҳбандишуда, ки аз нуклеотидҳо иборатанд, дар ниҳоят ба пайдарпайиҳои пептидӣ (китобхонаҳои пептидӣ) табдил меёбанд. Натиҷаи ин таҳлил маҷмӯи воридкуниҳо ва басомадҳои мувофиқи онҳо мебошад, ки шумораи хонишҳои пайдарпайро ташкил медиҳанд (Расми иловагӣ 2).
Насли Мотив: Бар асоси рӯйхати пептидҳои беназир, китобхонае сохта шуд, ки дорои ҳамаи намунаҳои имконпазири аминокислотаҳо (aa) мебошад, ки дар зер нишон дода шудааст. Ҳар як намунаи имконпазири дарозии 3 аз пептид гирифта шуд ва намунаи баръакси он дар баробари китобхонаи мотиви умумӣ, ки ҳамаи намунаҳоро (трипептидҳо) дар бар мегирифт, илова карда шуд. Китобхонаҳои мотивҳои хеле такроршаванда пайдарпайӣ карда шуданд ва такрорӣ хориҷ карда шуд. Сипас, барои ҳар як трипептид дар китобхонаи мотив, мо мавҷудияти онро дар китобхона бо истифода аз абзорҳои ҳисоббарорӣ тафтиш кардем. Дар ин ҳолат, басомади пептиде, ки дорои трипептиди мотиви ёфтшуда мебошад, илова карда мешавад ва ба мотив дар китобхонаи мотив таъин карда мешавад ("шумораи мотивҳо"). Натиҷаи тавлиди мотив як массиви дученака мебошад, ки дорои ҳама пайдоиши трипептидҳо (мотивҳо) ва арзишҳои мувофиқи онҳо мебошад, ки шумораи хондани пайдарпайӣ мебошанд, ки ҳангоми филтр кардан, гурӯҳбандӣ кардан ва тарҷума кардани хонданиҳо ба мотиви мувофиқ оварда мерасонанд. Метрикаҳо тавре ки дар боло муфассал тавсиф шудаанд.
Нормализатсияи шумораи мотивҳо ва диаграммаҳои парокандаи мувофиқ: Шумораи мотивҳо барои ҳар як намуна бо истифода аз
ки дар он ni шумораи хонданиҳоест, ки мавзӯи i-ро дар бар мегирад. Ҳамин тариқ, vi фоизи басомади хонданиҳо (ё пептидҳо)-ро, ки мотиви i-ро дар намуна дар бар мегирад, ифода мекунад. Арзишҳои P барои шумораи ғайримуқаррарии мотивҳо бо истифода аз санҷиши дақиқи Фишер ҳисоб карда шуданд. Дар мавриди коррелограммаҳои шумораи мотивҳо, коррелятсияҳои Спирман бо истифода аз шумораи муқаррарии мотивҳо бо R ҳисоб карда шуданд.
Барои тасаввур кардани миқдори аминокислотаҳо дар ҳар як мавқеъ дар китобхонаи пептидҳо, логограммаҳои веб 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) сохта шуданд. Аввалан, миқдори аминокислотаҳо дар ҳар як мавқеъи пептиди 12-мер дар матритсаи 20×12 нигоҳ дошта мешавад. Сипас, маҷмӯи 1000 пептид, ки дорои ҳамон миқдори нисбии аминокислотаҳо дар ҳар як мавқеъ мебошанд, дар формати fasta-sequence тавлид карда мешавад ва ҳамчун вуруд ба логотипи веб 3 пешниҳод карда мешавад, ки намояндагии графикии миқдори нисбии аминокислотаҳо дар ҳар як мавқеъро барои китобхонаи пептиди додашуда тавлид мекунад. Барои тасаввур кардани маҷмӯи додаҳои бисёрченак, харитаҳои гармӣ бо истифода аз асбоби дарунсохт дар R (biosHeatmap, бастаи R, ки ҳанӯз нашр нашудааст) сохта шуданд. Дендрограммаҳое, ки дар харитаҳои гармӣ пешниҳод шудаанд, бо истифода аз усули кластеризатсияи иерархии Уорд бо метрикаи масофаи Евклидӣ ҳисоб карда шуданд. Барои таҳлили омории маълумоти баҳодиҳии мотив, арзишҳои P барои баҳодиҳии ғайримуқаррарӣ бо истифода аз санҷиши дақиқи Фишер ҳисоб карда шуданд. Арзишҳои P барои дигар маҷмӯаҳои додаҳо дар R бо истифода аз санҷиши t-и Студент ё ANOVA ҳисоб карда шуданд.
Клонҳои интихобшудаи фагҳо ва фагҳо бе воридкунӣ тавассути раги дум ба таври дохиливарданӣ ворид карда шуданд (2 × 1010 фаг/ҳайвон дар 300 мкл PBS). Даҳ дақиқа пеш аз перфузия ва фиксатсияи минбаъда, ба ҳамон ҳайвонҳо 100 мкл лектини бо DyLight594 нишонгузорӣшуда (Vector Laboratories Inc., DL-1177) ба таври дохиливарданӣ ворид карда шуданд. 60 дақиқа пас аз ворид кардани фаг, каламушҳо тавассути дил бо 50 мл PBS ва баъдан 50 мл 4% PFA/PBS перфузия карда шуданд. Намунаҳои мағзи сар иловатан шабона дар 4% PFA/PBS фиксатсия карда шуданд ва шабона дар 30% сахароза дар ҳарорати 4°C тар карда шуданд. Намунаҳо дар омехтаи OCT фавран ях карда мешаванд. Таҳлили иммуногистохимиявии намунаҳои яхкардашуда дар ҳарорати хонагӣ дар криосекцияҳои 30 мкм, ки бо 1% BSA баста шуда буданд ва бо антителоҳои поликлоналии FITC бар зидди фаги T7 (Novus NB 600-376A) дар 4 °C инкубатсия карда шуданд, гузаронида шуд. Шабона инкубатсия кунед. Дар ниҳоят, қисмҳо 3 маротиба бо PBS шуста шуданд ва бо микроскопи лазерии конфокалӣ (Leica TCS SP5) таҳқиқ карда шуданд.
Ҳамаи пептидҳо бо тозагии ҳадди ақали 98% аз ҷониби GenScript USA синтез карда шуданд, биотин карда шуданд ва лиофилизатсия карда шуданд. Биотин тавассути фосилаи иловагии сегонаи глицин дар N-терминал пайваст мешавад. Ҳамаи пептидҳоро бо истифода аз спектрометрияи массавӣ санҷед.
Стрептавидин (Sigma S0677) бо пептиди биотинилшудаи 5-каратаи эквимолярии зиёдатӣ, пептиди ингибитории биотинилшудаи BACE1 ё омехтаи (таносуби 3:1) пептиди ингибитории биотинилшудаи BACE1 ва пептиди ингибитории BACE1 дар 5-10% DMSO омехта карда шуд/дар PBS инкубатсия карда шуд. 1 соат пеш аз тазриқ дар ҳарорати хонагӣ. Пептидҳои конъюгатсияшудаи стрептавидин ба таври дохили варидӣ бо миқдори 10 мг/кг ба яке аз рагҳои думии каламушҳо бо ковокии мағзи сар ворид карда шуданд.
Консентратсияи комплексҳои стрептавидин-пептидӣ бо истифода аз ELISA арзёбӣ карда шуд. Пластинаҳои микротитри Nunc Maxisorp (Sigma) шабона дар 4°C бо 1,5 мкг/мл антителои зидди стрептавидини муш (Thermo, MA1-20011) пӯшонида шуданд. Пас аз бастабандӣ (буфери бастабандӣ: 140 nM NaCL, 5 мМ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатин, 1% BSA) дар ҳарорати хонагӣ ба муддати 2 соат, пластинкаро бо 0,05% Tween-20/PBS (буфери шустан) барои 3 сония бишӯед, намунаҳои CSF ва плазма ба чоҳҳое, ки бо буфери бастабандӣ (плазма 1:10,000, CSF 1:115) ҳал карда шуда буданд, илова карда шуданд. Сипас пластинка шабона дар 4°C бо антителои ошкоркунӣ (1 мкг/мл, зидди стрептавидин-HRP, Novus NB120-7239) инкубатсия карда шуд. Пас аз се марҳилаи шустан, стрептавидин тавассути инкубатсия дар маҳлули субстрати TMB (Roche) барои то 20 дақиқа муайян карда шуд. Пас аз қатъ кардани пайдоиши ранг бо 1M H2SO4, ҷаббидашавиро дар 450 нм чен кунед.
Вазифаи комплекси ингибитори стрептавидин-пептид-BACE1 бо истифода аз ELISA Aβ(1-40) мувофиқи протоколи истеҳсолкунанда (Wako, 294-64701) арзёбӣ карда шуд. Хулоса, намунаҳои CSF дар маҳлули стандартӣ (1:23) маҳлул карда шуданд ва шабона дар ҳарорати 4°C дар табақчаҳои 96-чоҳӣ, ки бо антителои забти BNT77 пӯшонида шуда буданд, инкубатсия карда шуданд. Пас аз панҷ марҳилаи шустан, антителои BA27-и HRP илова карда шуд ва барои 2 соат дар ҳарорати 4°C инкубатсия карда шуд ва баъдан панҷ марҳилаи шустан анҷом дода шуд. Aβ(1-40) бо роҳи инкубатсия дар маҳлули TMB барои 30 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ муайян карда шуд. Пас аз қатъ шудани рушди ранг бо маҳлули қатъкунӣ, ҷаббидашавиро дар 450 нм чен кунед. Намунаҳои плазма пеш аз ELISA Aβ(1-40) ба экстраксияи фазаи сахт дучор карда шуданд. Плазма ба 0.2% DEA (Sigma) дар табақчаҳои 96-чоҳӣ илова карда шуд ва барои 30 дақиқа дар ҳарорати хонагӣ инкубатсия карда шуд. Пас аз шустани пайдарпайи лавҳаҳои SPE (Oasis, 186000679) бо об ва 100% метанол, намунаҳои плазма ба лавҳаҳои SPE илова карда шуданд ва тамоми моеъ хориҷ карда шуданд. Намунаҳо шуста шуданд (аввал бо 5% метанол, сипас 30% метанол) ва бо 2% NH4OH/90% метанол элюатсия карда шуданд. Пас аз хушк кардани элюат дар ҳарорати 55°C барои 99 дақиқа бо ҷараёни доимии N2, намунаҳо дар ҳалкунандаҳои стандартӣ кам карда шуданд ва Aβ(1–40) тавре ки дар боло тавсиф шудааст, чен карда шуд.
Чӣ тавр ин мақоларо иқтибос кардан мумкин аст: Урич, Э. ва диг. Интиқоли бор ба мағзи сар бо истифода аз пептидҳои транзитӣ, ки дар in vivo муайян шудаанд. илм. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Лихота Ҷ., Скёрринге Т., Томсен Л.Б. ва Мус Т. Интиқоли доруҳои макромолекулавӣ ба мағзи сар бо истифода аз терапияи мақсаднок. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Брасневич, И., Штайнбуш, Х.В., Шмитс, К. ва Мартинес-Мартинес, П. Интиқоли доруҳои пептидӣ ва сафедаӣ тавассути монеаи хун-мағзи сар. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардридж, ВМ Монеаи хун-мағзи сар: монеа дар таҳияи доруҳои мағзи сар. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К.Е., Дункан, Ҷ.А., Стопа, Э.Г. ва Берд, А. Дурнамои беҳтар кардани интиқоли дору ва ҳадафгирии он ба мағзи сар тавассути роҳи плексуси хориоид-CSF. Тадқиқоти фармасевтӣ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардридж, ВМ Модернизатсияи биофармасевтика бо истифода аз аспҳои троянии молекулавӣ барои интиқоли мағзи сар. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардридж, интиқоли пептид тавассути ретсепторҳои WM тавассути монеаи хун-мағзи сар. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Нивунер, Ҷ. ва дигарон. Баланд бардоштани воридшавӣ ба мағзи сар ва самаранокии антителоҳои терапевтӣ бо истифода аз шаттлҳои молекулавии яквалентӣ. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Биен-Ли, Н. ва дигарон. Интиқоли ретсептори трансферрин (TfR) азхудкунии вариантҳои аффинии антителоҳои TfR-ро аз ҷониби мағзи сар муайян мекунад. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).