Дякуємо за відвідування Nature.com. Ви використовуєте версію браузера з обмеженою підтримкою CSS. Для найкращого досвіду рекомендуємо використовувати оновлений браузер (або вимкнути режим сумісності в Internet Explorer). Крім того, для забезпечення постійної підтримки ми показуємо сайт без стилів та JavaScript.
Відображає карусель із трьох слайдів одночасно. Використовуйте кнопки «Попередній» та «Наступний», щоб переходити між трьома слайдами одночасно, або скористайтеся кнопками-повзунками в кінці, щоб переходити між трьома слайдами одночасно.
Гематоенцефалічний бар'єр та гематоенцефалічний бар'єр перешкоджають біотерапевтичним агентам досягати своїх цілей у центральній нервовій системі, тим самим перешкоджаючи ефективному лікуванню неврологічних захворювань. Щоб виявити нові транспортери мозку in vivo, ми ввели бібліотеку пептидів фага T7 та серійно збирали кров і спинномозкову рідину (СМР) за допомогою канюльованої моделі великого пулу щурів у свідомості. Специфічні фагові клони були високо збагачені в СМР після чотирьох раундів відбору. Тестування окремих пептидів-кандидатів виявило більш ніж 1000-кратне збагачення в СМР. Біоактивність пептид-опосередкованої доставки до мозку була підтверджена 40% зниженням рівня амілоїду-β у спинномозковій рідині за допомогою інгібітора пептиду BACE1, пов'язаного з ідентифікованим новим транзитним пептидом. Ці результати свідчать про те, що пептиди, ідентифіковані методами фагової селекції in vivo, можуть бути корисними транспортерами для системної доставки макромолекул до мозку з терапевтичним ефектом.
Дослідження терапії, спрямованої на центральну нервову систему (ЦНС), значною мірою зосереджені на визначенні оптимізованих препаратів та агентів, що проявляють властивості, спрямовані на ЦНС, з меншими зусиллями на виявленні механізмів, що забезпечують активну доставку ліків до мозку. Зараз це починає змінюватися, оскільки доставка ліків, особливо великих молекул, є невід'ємною частиною сучасної розробки ліків у нейронауці. Середовище центральної нервової системи добре захищене системою цереброваскулярного бар'єру, що складається з гематоенцефалічного бар'єру (ГЕБ) та гематоенцефалічного бар'єру (ГЕБ)1, що ускладнює доставку ліків до мозку1,2. За оцінками, майже всі препарати з великими молекулами та понад 98% препаратів з малими молекулами виводяться з мозку3. Ось чому дуже важливо визначити нові системи транспорту ліків до мозку, які забезпечують ефективну та специфічну доставку терапевтичних препаратів до ЦНС4,5. Однак ГЕБ та ГЕБК також надають чудову можливість для доставки ліків, оскільки вони проникають і потрапляють у всі структури мозку через його розгалужену судинну мережу. Таким чином, сучасні зусилля щодо використання неінвазивних методів доставки до мозку значною мірою базуються на механізмі рецептор-опосередкованого транспорту (РМТ) з використанням ендогенного рецептора ГЕБ6. Незважаючи на нещодавні ключові досягнення у використанні шляху рецептора трансферину7,8, необхідна подальша розробка нових систем доставки з покращеними властивостями. З цією метою нашою метою було ідентифікувати пептиди, здатні опосередковувати транспорт спинномозкової рідини (СМР), оскільки вони в принципі можуть бути використані для доставки макромолекул до ЦНС або для відкриття нових рецепторних шляхів. Зокрема, специфічні рецептори та транспортери цереброваскулярної системи (ГЕБ та БСКФС) можуть служити потенційними мішенями для активної та специфічної доставки біотерапевтичних препаратів. Спинномозкова рідина (СМР) є секреторним продуктом судинного сплетення (ХС) і безпосередньо контактує з інтерстиціальною рідиною мозку через субарахноїдальний простір та шлуночковий простір4. Нещодавно було показано, що субарахноїдальна спинномозкова рідина надмірно дифундує в інтерстицій мозку9. Ми сподіваємося отримати доступ до паренхіматозного простору, використовуючи цей субарахноїдальний вхідний тракт або безпосередньо через гематоенцефалічний бар'єр (ГББ). Для досягнення цієї мети ми запровадили надійну стратегію селекції фагів in vivo, яка ідеально ідентифікує пептиди, що транспортуються будь-яким із цих двох різних шляхів.
Зараз ми описуємо метод послідовного скринінгу фагового дисплею in vivo з відбором проб спинномозкової рідини (СМР) у поєднанні з високопродуктивним секвенуванням (HTS) для моніторингу початкових раундів відбору з найвищим різноманіттям бібліотек. Скринінг проводили на свідомих щурах з постійно імплантованою канюлею великої цистерни (CM), щоб уникнути забруднення крові. Важливо, що цей підхід відбирає як пептиди, що націлені на мозок, так і пептиди з транспортною активністю через цереброваскулярний бар'єр. Ми використовували фаги T7 через їх малий розмір (~60 нм)10 і припустили, що вони підходять для транспортування везикул, що дозволяють трансклітинний перетин ендотеліального та/або епітеліально-мозкового бар'єру. Після чотирьох раундів паннінгу були виділені популяції фагів, що демонструють сильне збагачення СМР in vivo та асоціацію з церебральними мікросудинами. Важливо, що ми змогли підтвердити наші висновки, продемонструвавши, що переважні та хімічно синтезовані найкращі кандидатні пептиди здатні транспортувати білковий вантаж у спинномозкову рідину. По-перше, фармакодинамічні ефекти ЦНС були встановлені шляхом поєднання провідного транзитного пептиду з інгібітором пептиду BACE1. Окрім демонстрації того, що стратегії функціонального скринінгу in vivo можуть ідентифікувати нові пептиди транспорту мозку як ефективні переносники білкового вантажу, ми очікуємо, що подібні підходи до функціонального відбору також стануть важливими у визначенні нових шляхів транспорту мозку.
На основі одиниць, що утворюють бляшки (PFU), після етапу упаковки фагів, було розроблено та створено бібліотеку випадкових 12-мерних лінійних пептидів фага T7 з різноманітністю приблизно 109 (див. Матеріали та методи). Важливо зазначити, що ми ретельно проаналізували цю бібліотеку перед панінгом in vivo. ПЛР-ампліфікація зразків фагової бібліотеки з використанням модифікованих праймерів генерувала амплікони, які були безпосередньо застосовні до HTS (Додатковий рис. 1a). Через a) помилки секвенування HTS11, b) вплив на якість праймерів (NNK)1-12 та c) наявність фага дикого типу (wt) (вставки скелета) у резервній бібліотеці було запроваджено процедуру фільтрації послідовностей для вилучення лише перевіреної інформації про послідовності (Додатковий рис. 1b). Ці етапи фільтрації застосовуються до всіх бібліотек секвенування HTS. Для стандартної бібліотеки було отримано загалом 233 868 зчитувань, з яких 39% пройшли критерії фільтрації та були використані для аналізу та відбору бібліотеки для наступних раундів (Додатковий рис. 1c–e). Зчитування були переважно кратними 3 парам основ за довжиною з піком на рівні 36 нуклеотидів (Додатковий рис. 1c), що підтверджує дизайн бібліотеки (NNK) 1-12. Примітно, що приблизно 11% членів бібліотеки містили 12-вимірну вставку PAGISRELVDKL дикого типу (wt), і майже половина послідовностей (49%) містила вставки або делеції. HTS бібліотеки підтвердив високу різноманітність пептидів у бібліотеці: понад 81% пептидних послідовностей були знайдені лише один раз, і лише 1,5% зустрічалися в ≥4 копіях (Додатковий рис. 2a). Частоти амінокислот (АК) у всіх 12 позиціях репертуару добре корелювали з частотами, очікуваними для кількості кодонів, що генеруються виродженим репертуаром NKK (Додатковий рис. 2b). Спостережувана частота залишків АК, кодованих цими вставками, добре корелювала з розрахованою частотою (r = 0,893) (Додатковий рис. 2c). Підготовка фагових бібліотек для ін'єкції включає етапи ампліфікації та видалення ендотоксину. Раніше було показано, що це потенційно зменшує різноманітність фагових бібліотек12,13. Тому ми секвенували ампліфіковану на планшеті фагову бібліотеку, яка пройшла видалення ендотоксину, та порівняли її з вихідною бібліотекою, щоб оцінити частоту амінокислот (АМК). Спостерігалася сильна кореляція (r = 0,995) між вихідним пулом та ампліфікованим та очищеним пулом (Додатковий рис. 2d), що вказує на те, що конкуренція між клонами, ампліфікованими на планшетах з використанням фага T7, не викликала значного зміщення. Це порівняння базується на частоті трипептидних мотивів у кожній бібліотеці, оскільки різноманітність бібліотек (~109) не може бути повністю охоплена навіть за допомогою HTS. Частотний аналіз АМК у кожній позиції виявив невелике зміщення, залежне від позиції, в останніх трьох позиціях введеного репертуару (Додатковий рис. 2e). На завершення ми дійшли висновку, що якість та різноманітність бібліотеки були прийнятними, і спостерігалися лише незначні зміни в різноманітності через ампліфікацію та підготовку фагових бібліотек між кількома раундами відбору.
Серійний відбір проб спинномозкової рідини можна виконати шляхом хірургічної імплантації канюлі в спинномозковий шар свідомих щурів для полегшення ідентифікації фага T7, введеного внутрішньовенно (в/в) через гематоенцефалічний бар'єр (ГББ) та/або БКСБ (рис. 1a-b). У перших трьох раундах відбору in vivo ми використовували дві незалежні гілки відбору (гілки A та B) (рис. 1c). Ми поступово підвищували строгість відбору, зменшуючи загальну кількість фага, введеного в перших трьох раундах відбору. Для четвертого раунду паннінгу ми об'єднали зразки з гілок A та B та провели три додаткові незалежні відбори. Для вивчення властивостей in vivo частинок фага T7 у цій моделі фаг дикого типу (головна вставка PAGISRELVDKL) вводили щурам через хвостову вену. Виділення фагів із спинномозкової рідини та крові в різні моменти часу показало, що відносно малі ікосаедричні фаги T7 мали швидку початкову фазу виведення з кров'яного компартменту (додатковий рис. 3). Виходячи з введених титрів та об'єму крові щурів, ми підрахували, що через 10 хвилин після внутрішньовенної ін'єкції в крові було виявлено лише приблизно 1% мас. фага від введеної дози. Після цього початкового швидкого зниження було виміряно повільніший первинний кліренс з періодом напіввиведення 27,7 хвилини. Важливо, що з компартменту спинномозкової рідини було отримано лише дуже мало фагів, що вказує на низький фон для міграції фагів дикого типу в компартмент спинномозкової рідини (Додатковий рис. 3). У середньому, протягом усього періоду відбору проб (0-250 хв) у спинномозковій рідині було виявлено лише близько 1 x 10-3% титрів фага T7 у крові та 4 x 10-8% початково введених фагів. Примітно, що період напіввиведення (25,7 хв) фага дикого типу в спинномозковій рідині був подібним до того, що спостерігався в крові. Ці дані демонструють, що бар'єр, що відділяє компартмент спинномозкової рідини від крові, є неушкодженим у щурів з канюляцією комбінованого карцинома (CM), що дозволяє in vivo відбирати фагові бібліотеки для ідентифікації клонів, які легко транспортуються з крові в компартмент спинномозкової рідини.
(a) Розробка методу повторного відбору проб спинномозкової рідини (СМР) з великого пулу. (b) Діаграма, що показує клітинне розташування бар'єру центральної нервової системи (ЦНС) та стратегію відбору, що використовується для ідентифікації пептидів, що перетинають гематоенцефалічний бар'єр (ГЕБ) та гематоенцефалічний бар'єр. (c) Блок-схема скринінгу фагового дисплею in vivo. У кожному раунді відбору фаги (ідентифікатори тварин всередині стрілок) вводили внутрішньовенно. Дві незалежні альтернативні гілки (A, B) зберігалися окремо до 4-го раунду відбору. Для раундів відбору 3 та 4 кожен клон фага, екстрагований з СМР, секвенувався вручну. (d) Кінетика фага, виділеного з крові (червоні кола) та спинномозкової рідини (зелені трикутники) під час першого раунду відбору у двох канюльованих щурів після внутрішньовенного введення бібліотеки пептидів T7 (2 x 1012 фагів/тварину). Сині квадрати вказують на середню початкову концентрацію фага в крові, розраховану за кількістю введеного фага, враховуючи загальний об'єм крові. Чорні квадрати вказують на точку перетину лінії y, екстрапольованої з концентрацій фагів крові. (e,f) Наведіть відносну частоту та розподіл усіх можливих перекриваючихся трипептидних мотивів, знайдених у пептиді. Показано кількість мотивів, знайдених у 1000 показниках. Значно (p < 0,001) збагачені мотиви позначені червоними крапками. (e) Діаграма розсіювання кореляції, що порівнює відносну частоту трипептидного мотиву ін'єктованої бібліотеки з фагом, отриманим з крові тварин №1.1 та №1.2. (f) Діаграма розсіювання кореляції, що порівнює відносні частоти трипептидних мотивів фагів тварин №1.1 та №1.2, виділених у крові та спинномозковій рідині. (g, h) Представлення послідовності ID фага, збагаченого кров'ю (g), порівняно з ін'єктованими бібліотеками та фага, збагаченого спинномозковою рідиною (h), порівняно з кров'ю після раунду селекції in vivo у обох тварин. Розмір однолітерного коду вказує, як часто ця амінокислота зустрічається в цьому положенні. Зелений = полярний, фіолетовий = нейтральний, синій = основний, червоний = кислотний та чорний = гідрофобні амінокислоти. Рисунки 1a, b були розроблені та виготовлені Едуардом Уріхом.
Ми ввели фагову пептидну бібліотеку двом щурам з інструментальною CM-терапією (клади A та B) та виділили фаг зі спинномозкової рідини та крові (Рисунок 1d). Початковий швидкий кліренс бібліотеки був менш вираженим порівняно з фагом дикого типу. Середній період напіввиведення введеної бібліотеки у обох тварин становив 24,8 хвилини в крові, подібно до фага дикого типу, та 38,5 хвилини в спинномозковій рідині. Зразки фагів крові та спинномозкової рідини від кожної тварини піддали високотемпературному токоспецифічного аналізу (HTS), і всі ідентифіковані пептиди були проаналізовані на наявність короткого трипептидного мотиву. Трипептидні мотиви були обрані, оскільки вони забезпечують мінімальну основу для формування структури та пептид-білкових взаємодій14,15. Ми виявили хорошу кореляцію в розподілі мотивів між введеною фаговою бібліотекою та клонами, екстрагованими з крові обох тварин (Рис. 1e). Дані вказують на те, що склад бібліотеки лише незначно збагачений у кров'яному компартменті. Частоти амінокислот та консенсусні послідовності були додатково проаналізовані в кожній позиції за допомогою адаптованого програмного забезпечення Weblogo16. Цікаво, що ми виявили сильне збагачення крові залишками гліцину (рис. 1g). При порівнянні крові з клонами, відібраними з спинномозкової рідини, спостерігався сильний відбір та деяке скасування відбору мотивів (рис. 1f), а певні амінокислоти переважно були присутні в заздалегідь визначених позиціях у 12-членному структурі (рис. 1h). Примітно, що окремі тварини суттєво відрізнялися за складом спинномозкової рідини, тоді як збагачення крові гліцином спостерігалося в обох тварин (додатковий рис. 4a–j). Після суворої фільтрації даних послідовностей у спинномозковій рідині тварин №1.1 та №1.2 було отримано загалом 964 та 420 унікальних 12-мерних пептидів (додатковий рис. 1d–e). Ізольовані фагові клони були ампліфіковані та піддані другому раунду відбору in vivo. Фаги, екстраговані з другого раунду відбору, піддавали високотемпературній томографії (HTS) у кожної тварини, і всі ідентифіковані пептиди використовувалися як вхідні дані для програми розпізнавання мотивів для аналізу наявності трипептидних мотивів (рис. 2a, b, ef). Порівняно з першим циклом фага, виділеного з CSF, ми спостерігали подальший відбір та деселекцію багатьох мотивів у CSF у гілках A та B (рис. 2). Був застосований алгоритм ідентифікації мережі, щоб визначити, чи представляють вони різні патерни узгодженої послідовності. Було виявлено чітку подібність між 12-вимірними послідовностями, виділеними CSF в альтернативній кладі A (рис. 2c, d) та кладі B (рис. 2g, h). Об'єднаний аналіз у кожній гілці виявив різні профілі відбору для 12-мерних пептидів (додатковий рис. 5c, d) та збільшення співвідношення титру CSF/крові з часом для об'єднаних клонів після другого раунду відбору порівняно з першим раундом відбору (додатковий рис. 5e).
Збагачення мотивів та пептидів у спинномозковій рідині шляхом двох послідовних раундів селекції функціонального фагового дисплею in vivo.
Всі фаги спинномозкової рідини, отримані в першому раунді кожної тварини (тварини №1.1 та №1.2), були об'єднані, ампліфіковані, HT-секвеновані та повторно ін'єктовані разом (2 x 1010 фагів/тварину) 2 щурам з канюляцією SM (№1.1 → №). 2.1 та 2.2, 1.2 → 2.3 та 2.4). (a,b,e,f) Діаграми кореляційної розсіювання, що порівнюють відносну частоту трипептидних мотивів усіх фагів, отриманих з спинномозкової рідини, у першому та другому раундах відбору. Відносна частота та розподіл мотивів, що представляють усі можливі перекриваючі трипептиди, знайдені в пептидах в обох орієнтаціях. Показано кількість мотивів, знайдених у 1000 зчитуваннях. Мотиви, які були значно (p < 0,001) відібрані або виключені в одній з порівнюваних бібліотек, виділені червоними крапками. (c, d, g, h) Логотип послідовності, що представляє всі багаті на спинномозкову рідину послідовності довжиною 12 амінокислот, на основі раундів 2 та 1 селекції in vivo. Розмір однолітерного коду вказує, як часто ця амінокислота зустрічається в цій позиції. Для представлення логотипу порівнюється частота послідовностей спинномозкової рідини, виділених з окремих тварин між двома раундами селекції, і показано збагачені послідовності у другому раунді: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 та (h) #1.2–#2.4. Найбільш збагачені амінокислоти в заданій позиції у (c, d) тварин № 2.1 та № 2.2 або (g, h) у тварин № 2.3 та № 2.4 показані кольором. Зелений = полярний, фіолетовий = нейтральний, синій = основний, червоний = кислотний та чорний = гідрофобні амінокислоти.
Після третього раунду відбору ми ідентифікували 124 унікальні пептидні послідовності (№3.1 та №3.2) з 332 клонів фагів, відновлених за допомогою спинномозкової рідини (СМР), виділених від двох тварин (Додатковий рис. 6a). Послідовність LGSVS (18,7%) мала найвищу відносну частку, за нею йшли вставки дикого типу PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) та SARGSWREIVSLS (2,2%). В останньому четвертому раунді ми об'єднали дві незалежно відібрані гілки від трьох окремих тварин (Рис. 1c). З 925 секвенованих клонів фагів, отриманих з СМР, у четвертому раунді ми виявили 64 унікальні пептидні послідовності (Додатковий рис. 6b), серед яких відносна частка фагів дикого типу знизилася до 0,8%. Найпоширенішими клонами CSF у четвертому раунді були LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) та RLSSVDSDLSGC (3,2%). Діапазон довжин вибраних пептидів зумовлений нуклеотидними вставками/делеціями або передчасними стоп-кодонами в праймерах бібліотеки при використанні вироджених кодонів для дизайну бібліотеки NNK. Передчасні стоп-кодони генерують коротші пептиди та вибираються, оскільки вони містять сприятливий мотив α. Довші пептиди можуть виникати в результаті вставок/делецій у праймерах синтетичних бібліотек. Це позиціонує розроблений стоп-кодон поза рамкою та зчитує його, доки не з'явиться новий стоп-кодон нижче за течією. Загалом, ми розрахували коефіцієнти збагачення для всіх чотирьох раундів відбору, порівнюючи вхідні дані з вихідними даними вибірки. Для першого раунду скринінгу ми використовували титри фагів дикого типу як неспецифічний фоновий орієнтир. Цікаво, що негативна селекція фагів була дуже сильною в першому циклі спинномозкової рідини, але не в крові (рис. 3a), що може бути пов'язано з низькою ймовірністю пасивної дифузії більшості членів пептидної бібліотеки в компартмент спинномозкової рідини, або ж відносні фаги, як правило, ефективніше затримуються або видаляються з кровотоку, ніж бактеріофаги. Однак у другому раунді паннінгу спостерігалася сильна селекція фагів у спинномозковій рідині в обох кладах, що свідчить про те, що попередній раунд був збагачений фагами, що демонструють пептиди, що сприяють поглинанню спинномозкової рідини (рис. 3a). Знову ж таки, без значного збагачення крові. Також у третьому та четвертому раундах фагові клони були значно збагачені в спинномозковій рідині. Порівнюючи відносну частоту кожної унікальної пептидної послідовності між двома останніми раундами селекції, ми виявили, що послідовності були ще більш збагачені в четвертому раунді селекції (рис. 3b). Загалом 931 трипептидний мотив було вилучено з усіх 64 унікальних пептидних послідовностей з використанням обох пептидних орієнтацій. Найбільш збагачені мотиви в четвертому раунді були ретельніше досліджені на предмет їх профілів збагачення у всіх раундах порівняно з введеною бібліотекою (порогове значення: 10% збагачення) (Додатковий рис. 6c). Загальні закономірності відбору показали, що більшість досліджуваних мотивів були збагачені у всіх попередніх раундах обох гілок відбору. Однак деякі мотиви (наприклад, SGL, VSG, LGS GSV) переважно походили з альтернативної клади A, тоді як інші (наприклад, FGW, RTN, WGF, NTR) були збагачені альтернативною кладою B.
Валідація транспорту в спинномозковій рідині (СМР) збагачених СМР пептидів, що відображаються фагами, та біотинільованих лідерних пептидів, кон'югованих з корисними навантаженнями стрептавідину.
(a) Коефіцієнти збагачення, розраховані у всіх чотирьох раундах (R1-R4) на основі титрів введених (вхід = I) фагів (PFU) та визначених титрів фагів у спинномозковій рідині (вихід = O). Коефіцієнти збагачення для останніх трьох раундів (R2-R4) були розраховані шляхом порівняння з попереднім раундом та першим раундом (R1) з даними про вагу. Відкриті стовпчики – це спинномозкова рідина, затінені стовпчики – плазма. (***p<0,001, на основі t-критерію Стьюдента). (b) Список найпоширеніших фагових пептидів, ранжованих за їхньою відносною часткою до всіх фагів, зібраних у спинномозковій рідині після 4 раунду відбору. Шість найпоширеніших фагових клонів виділені кольором, пронумеровані, а їхні коефіцієнти збагачення між раундами 3 та 4 відбору (вставки). (c,d) Шість найбільш збагачених фагових клонів, порожні фаги та батьківські бібліотеки фагових пептидів з 4 раунду були проаналізовані окремо в моделі відбору проб спинномозкової рідини. Зразки спинномозкової рідини та крові були зібрані у зазначені моменти часу. (c) Рівні кількості 6 кандидатних фагових клонів (2 x 1010 фагів/тварин), порожніх фагів (#1779) (2 x 1010 фагів/тварин) та вихідних бібліотек фагових пептидів (2 x 1012 фагів/тварин). Вводять щонайменше 3 CM окремо канюльованій тварині через хвостову вену. Показано фармакокінетику спинномозкової рідини кожного введеного фагового клону та бібліотеки фагових пептидів з часом. (d) показує середнє співвідношення спинномозкової рідини/крові для всіх відновлених фагів/мл протягом часу відбору проб. (e) Чотири синтетичні лідерні пептиди та один скрембований контроль були пов'язані біотином зі стрептавідином через їх N-кінець (тетрамерний дисплей) з подальшою ін'єкцією (хвостова вена внутрішньовенно, 10 мг стрептавідину/кг). Щонайменше три інтубовані щури (N = 3). Зразки спинномозкової рідини (СМР) збирали у зазначені моменти часу, а концентрації стрептавідину вимірювали за допомогою ІФА з антистрептавідином у СМР (nd = не виявлено). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, на основі тесту ANOVA). (f) Порівняння амінокислотної послідовності найбільш збагаченого клону фагового пептиду №2002 (фіолетовий) з іншими відібраними клонами фагового пептиду з 4-го раунду відбору. Ідентичні та подібні амінокислотні фрагменти позначені кольором.
З усіх збагачених фагів у четвертому раунді (рис. 3b) шість клонів-кандидатів було відібрано для подальшого індивідуального аналізу в моделі відбору проб спинномозкової рідини (СМР). Рівні кількості бібліотек шести фагів-кандидатів, порожніх фагів (без вставки) та профагів-пептидів були введені трьом канюльованим тваринам з кондиломованою масою (КМ), а фармакокінетику визначали в аналізах СМР (рис. 3c) та крові (додатковий рис. 7). Всі протестовані клони фагів впливали на компартмент СМР на рівні, що в 10-1000 разів перевищував рівень контрольного фага (№1779). Наприклад, клони №2020 та №2077 мали приблизно в 1000 разів вищі титри в СМР, ніж контрольний фаг. Фармакокінетичний профіль кожного вибраного пептиду відрізняється, але всі вони мають високу здатність до хомінгу в СМР. Ми спостерігали постійне зменшення з часом для клонів №1903 та №2011, тоді як для клонів №2077, №2002 та №2009 збільшення протягом перших 10 хвилин може свідчити про активний транспорт, але потребує перевірки. Клони №2020, №2002 та №2077 стабілізувалися на високих рівнях, тоді як концентрація в спинномозковій рідині клону №2009 повільно зменшувалася після початкового збільшення. Потім ми порівняли відносну частоту кожного кандидата в спинномозковій рідині з його концентрацією в крові (рис. 3d). Кореляція середнього титру кожного кандидата в спинномозковій рідині з його титром у крові в усі моменти часу відбору проб показала, що три з шести кандидатів були значно збагачені в спинномозковій рідині крові. Цікаво, що клон №2077 показав вищу стабільність у крові (Додатковий рисунок 7). Щоб підтвердити, що самі пептиди здатні активно транспортувати вантаж, відмінний від фагових частинок, у компартмент спинномозкової рідини, ми синтезували чотири лідерні пептиди, дериватизовані біотином на N-кінці, де пептиди приєднуються до фагової частинки. Біотинільовані пептиди (№ 2002, 2009, 2020 та 2077) були кон'юговані зі стрептавідином (SA) для отримання мультимерних форм, що певною мірою імітують геометрію фагів. Цей формат також дозволив нам виміряти експозицію SA в крові та спинномозковій рідині як пептидів-білків, що транспортують вантаж. Важливо, що дані про фаги часто можна було відтворити, коли синтетичні пептиди вводили в цьому форматі, кон'югованому з SA (рис. 3e). Скрембловані пептиди мали меншу початкову експозицію та швидше виводилися з спинномозкової рідини з невизначеними рівнями протягом 48 годин. Щоб отримати уявлення про шляхи доставки цих пептидних фагових клонів у спинномозкову рідину, ми проаналізували локалізацію окремих потраплянь фагових пептидів за допомогою імуногістохімії (IHC) для безпосереднього виявлення фагових частинок через 1 годину після внутрішньовенної ін'єкції in vivo. Примітно, що клони №2002, №2077 та №2009 можна було виявити за допомогою сильного фарбування в капілярах мозку, тоді як контрольний фаг (№1779) та клон №2020 не були виявлені (Додатковий Рисунок 8). Це свідчить про те, що ці пептиди сприяють впливу на мозок саме шляхом перетину ГЕБ. Для перевірки цієї гіпотези потрібен подальший детальний аналіз, оскільки також може бути задіяний шлях BSCFB. При порівнянні амінокислотної послідовності найбільш збагаченого клону (№2002) з іншими вибраними пептидами було зазначено, що деякі з них мають подібні амінокислотні розширення, що може свідчити про подібний механізм транспорту (Рис. 3f).
Завдяки своєму унікальному плазмовому профілю та значному збільшенню СМР з часом, фаговий дисплейний клон №2077 був додатково досліджений протягом тривалішого 48-годинного періоду та зміг відтворити швидке збільшення СМР, що спостерігалося у зв'язку зі стійкими рівнями сульфату амінокислоти (рис. 4a). Щодо інших ідентифікованих фагових клонів, №2077 сильно забарвлювався на капіляри мозку та демонстрував значну колокалізацію з капілярним маркером лектином при розгляді з вищою роздільною здатністю та, можливо, деяке забарвлення в паренхіматозному просторі (рис. 4b). Щоб дослідити, чи можна отримати пептид-опосередковані фармакологічні ефекти в ЦНС, ми провели експеримент, в якому біотинільовані версії i) транзитного пептиду №2077 та ii) пептиду-інгібітора BACE1 змішували з сульфатом амінокислоти у двох різних співвідношеннях. Для однієї комбінації ми використовували лише інгібітор пептиду BACE1, а для іншої - співвідношення 1:3 інгібітора пептиду BACE1 до пептиду №2077. Обидва зразки вводили внутрішньовенно, і рівні бета-амілоїдного пептиду 40 (Abeta40) у крові та спинномозковій рідині вимірювали з часом. Abeta40 вимірювали в спинномозковій рідині, оскільки він відображає інгібування BACE1 у паренхімі мозку. Як і очікувалося, обидва комплекси значно знизили рівень Abeta40 у крові (рис. 4c, d). Однак лише зразки, що містили суміш пептиду № 2077 та інгібітора пептиду BACE1, кон'югованого з SA, викликали значне зниження Abeta40 у спинномозковій рідині (рис. 4c). Дані показують, що пептид № 2077 здатний транспортувати білок SA 60 кДа в ЦНС, а також індукує фармакологічні ефекти з інгібіторами пептиду BACE1, кон'югованими з SA.
(a) Клональна ін'єкція (2 × 10 фагів/тварину) фага T7, що показує довгострокові фармакокінетичні профілі пептиду CSF №2077 (RLSSVDSDLSGC) та неін'єктованого контрольного фага (№1779) у щонайменше трьох щурів з інтубацією CM. (b) Конфокальне мікроскопічне зображення репрезентативних кортикальних мікросудин у щурів з ін'єкцією фагів (2 × 10 10 фагів/тварину), що показує контрастне фарбування пептиду №2077 та судин (лектин). Ці фагові клони вводили 3 щурам та давали їм циркулювати протягом 1 години перед перфузією. Мозок зрізали та фарбували поліклональними антитілами, міченими FITC, проти капсиду фага T7. За десять хвилин до перфузії та подальшої фіксації внутрішньовенно вводили лектин, мічений DyLight594. Флуоресцентні зображення, що показують лектинове фарбування (червоний) просвітної сторони мікросудин та фагів (зелений) у просвіті капілярів та периваскулярній тканині мозку. Масштабна шкала відповідає 10 мкм. (c, d) Біотинільований інгібуючий пептид BACE1 окремо або в комбінації з біотинільованим транзитним пептидом №2077 був з'єднаний зі стрептавідином, а потім внутрішньовенно введений щонайменше трьом канюльованим щурам CM (10 мг стрептавідину/кг). Зниження рівня Aβ40, опосередковане інгібітором пептиду BACE1, вимірювали за допомогою ELISA на Aβ1-40 у крові (червоний) та спинномозковій рідині (помаранчевий) у зазначені моменти часу. Для кращої наочності на графіку проведено пунктирну лінію в масштабі 100%. (c) Відсоткове зниження рівня Aβ40 у крові (червоні трикутники) та спинномозковій рідині (помаранчеві трикутники) у щурів, яких отримували стрептавідин, кон'югований з транзитним пептидом №2077, та інгібуючим пептидом BACE1 у співвідношенні 3:1. (d) Відсоткове зниження рівня Aβ40 у крові (червоні кола) та спинномозковій рідині (помаранчеві кола) у щурів, яких отримували стрептавідин, з'єднаний лише з інгібуючим пептидом BACE1. Концентрація Aβ у контролі становила 420 пг/мл (стандартне відхилення = 101 пг/мл).
Фаговий дисплей успішно застосовується в кількох галузях біомедичних досліджень17. Цей метод використовувався для досліджень судинної різноманітності in vivo18,19, а також для досліджень, спрямованих на судини головного мозку20,21,22,23,24,25,26. У цьому дослідженні ми розширили застосування цього методу відбору не лише на пряму ідентифікацію пептидів, спрямованих на судини головного мозку, але й на виявлення кандидатів з властивостями активного транспорту для подолання гематоенцефалічного бар'єру. Тепер ми описуємо розробку процедури відбору in vivo у інтубованих щурів з мієломною карциномою (КМ) та демонструємо її потенціал для ідентифікації пептидів з властивостями хомінгу в спинномозковій рідині (СМР). Використовуючи фаг T7, що відображає бібліотеку 12-мерних випадкових пептидів, ми змогли продемонструвати, що фаг T7 достатньо малий (приблизно 60 нм у діаметрі)10, щоб адаптуватися до гематоенцефалічного бар'єру, тим самим безпосередньо перетинаючи гематоенцефалічний бар'єр або судинну оболонку ока. Ми спостерігали, що забір спинномозкової рідини (СМР) у канюльованих щурів CM був добре контрольованим методом функціонального скринінгу in vivo, і що екстрагований фаг не тільки зв'язувався з судинною системою, але й функціонував як транспортер через гематоенцефалічний бар'єр. Крім того, одночасно збираючи кров та застосовуючи HTS до СМР та фагів, отриманих з крові, ми підтвердили, що на наш вибір СМР не вплинуло збагачення крові або придатність до розширення між раундами відбору. Однак, компартмент крові є частиною процедури відбору, оскільки фаги, здатні досягти компартменту СМР, повинні виживати та циркулювати в кровотоці достатньо довго, щоб збагатитися в мозку. Щоб отримати достовірну інформацію про послідовність з необроблених даних HTS, ми впровадили фільтри, адаптовані до специфічних для платформи помилок секвенування, в робочий процес аналізу. Включивши кінетичні параметри в метод скринінгу, ми підтвердили швидку фармакокінетику фагів T7 дикого типу (t½ ~ 28 хв) у крові24, 27, 28, а також визначили їх період напіврозпаду в спинномозковій рідині (t½ ~ 26 хв) за хвилину). Незважаючи на подібні фармакокінетичні профілі в крові та спинномозковій рідині, у спинномозковій рідині можна було виявити лише 0,001% концентрації фага в крові, що свідчить про низьку фонову мобільність фага T7 дикого типу через гематоенцефалічний бар'єр. Ця робота підкреслює важливість першого раунду відбору при використанні стратегій панінгу in vivo, особливо для фагових систем, які швидко виводяться з кровообігу, оскільки мало клонів здатні досягти компартменту ЦНС. Таким чином, у першому раунді зниження різноманітності бібліотеки було дуже значним, оскільки в цій дуже суворій моделі спинномозкової рідини зрештою було зібрано лише обмежену кількість клонів. Ця стратегія панінгу in vivo включала кілька етапів відбору, таких як активне накопичення в компартменті спинномозкової рідини, виживання клонів у компартменті крові та швидке видалення клонів фага T7 з крові протягом перших 10 хвилин (рис. 1d та додатковий рис. 4M). Таким чином, після першого раунду в спинномозковій рідині були ідентифіковані різні клони фагів, хоча для окремих тварин використовувався один і той самий початковий пул. Це свідчить про те, що кілька етапів суворого відбору для вихідних бібліотек з великою кількістю членів бібліотеки призводять до значного зниження різноманітності. Отже, випадкові події стануть невід'ємною частиною початкового процесу відбору, суттєво впливаючи на результат. Ймовірно, що багато клонів у вихідній бібліотеці мали дуже схожу схильність до збагачення спинномозкової рідини (CSF). Однак, навіть за однакових експериментальних умов результати відбору можуть відрізнятися через невелику кількість кожного конкретного клону у вихідному пулі.
Мотиви, збагачені в спинномозковій рідині (СМР), відрізняються від тих, що знаходяться в крові. Цікаво, що ми відзначили перший зсув у бік багатих на гліцин пептидів у крові окремих тварин (рис. 1g, додаткові рис. 4e, 4f). Фаги, що містять гліцинові пептиди, можуть бути стабільнішими та з меншою ймовірністю виводитися з кровообігу. Однак ці багаті на гліцин пептиди не були виявлені у зразках спинномозкової рідини, що свідчить про те, що куровані бібліотеки пройшли два різні етапи відбору: один у крові, а інший накопичувався в спинномозковій рідині. Клони, збагачені СМР, отримані в результаті четвертого раунду відбору, були ретельно протестовані. Було підтверджено, що майже всі окремо протестовані клони збагачені СМР порівняно з фагом-контролем. Один пептидний хіт (#2077) був досліджений більш детально. Він показав довший період напіввиведення з плазми порівняно з іншими хітами (рис. 3d та додатковий рис. 7), і цікаво, що цей пептид містив залишок цистеїну на С-кінці. Нещодавно було показано, що додавання цистеїну до пептидів може покращити їхні фармакокінетичні властивості шляхом зв'язування з альбуміном 29. Наразі це невідомо для пептиду №2077 і потребує подальшого вивчення. Деякі пептиди демонстрували валентну залежність у збагаченні спинномозкової рідини (дані не показані), що може бути пов'язано з відображеною геометрією поверхні капсиду T7. Система T7, яку ми використовували, показала 5-15 копій кожного пептиду на фагову частинку. ІГХ проводили на кандидатних клонах фагів, які вводили внутрішньовенно в кору головного мозку щурів (Додатковий рис. 8). Дані показали, що принаймні три клони (№ 2002, № 2009 та № 2077) взаємодіяли з гематоенцефалічним бар'єром (ГЕБ). Залишається визначити, чи призводить ця взаємодія з ГЕБ до накопичення ГЕБ, чи до переміщення цих клонів безпосередньо до ГЕБ, що містить білковий вантаж. Важливо, що ми показуємо, що вибрані пептиди зберігають свою транспортну здатність до ГЕБ при синтезі та зв'язуванні з білковим вантажем. Зв'язування N-кінцевих біотинільованих пептидів з SA по суті повторює результати, отримані з їхніми відповідними фаговими клонами в крові та спинномозковій рідині (рис. 3e). Нарешті, ми показуємо, що провідний пептид №2077 здатний стимулювати дію біотинільованого пептидного інгібітора BACE1, кон'югованого з SA, на мозок, викликаючи виражені фармакодинамічні ефекти в ЦНС шляхом значного зниження рівнів Abeta40 у спинномозковій рідині (рис. 4). Нам не вдалося ідентифікувати жодних гомологів у базі даних, виконавши пошук гомології пептидних послідовностей усіх відповідей. Важливо зазначити, що розмір бібліотеки T7 становить приблизно 109, тоді як теоретичний розмір бібліотеки для 12-мерів становить 4 x 1015. Тому ми вибрали лише невелику частину простору різноманітності 12-мерної пептидної бібліотеки, що може означати, що більш оптимізовані пептиди можна ідентифікувати, оцінюючи сусідній простір послідовностей цих ідентифікованих відповідей. Гіпотетично, однією з причин, чому ми не знайшли жодних природних гомологів цих пептидів, може бути деселекція під час еволюції, щоб запобігти неконтрольованому потраплянню певних пептидних мотивів у мозок.
Узяті разом, наші результати забезпечують основу для майбутньої роботи з більш детальної ідентифікації та характеристики транспортних систем цереброваскулярного бар'єру in vivo. Основна схема цього методу базується на стратегії функціонального відбору, яка не тільки ідентифікує клони з властивостями зв'язування з церебральними судинами, але й включає критичний крок, на якому успішні клони мають власну активність для подолання біологічних бар'єрів in vivo в компартмент ЦНС. Полягає у з'ясуванні механізму транспорту цих пептидів та їхньої переваги для зв'язування з мікросудинами, специфічними для області мозку. Це може призвести до відкриття нових шляхів транспорту гематоенцефалічного бар'єру (ГЕБ) та рецепторів. Ми очікуємо, що ідентифіковані пептиди можуть безпосередньо зв'язуватися з цереброваскулярними рецепторами або з циркулюючими лігандами, що транспортуються через ГЕБ або БКШБ. Пептидні вектори з активністю транспорту в спинномозковій рідині (СМР), виявлені в цій роботі, будуть досліджені далі. Наразі ми досліджуємо специфічність цих пептидів до мозку щодо їхньої здатності перетинати ГЕБ та/або БКШБ. Ці нові пептиди будуть надзвичайно цінними інструментами для потенційного відкриття нових рецепторів або шляхів, а також для розробки нових високоефективних платформ для доставки макромолекул, таких як біологічні препарати, до мозку.
Канюлювали велику цистерну (ВЦ) за допомогою модифікації раніше описаного методу. Анестезованих щурів Вістар (200-350 г) встановили на стереотаксичний апарат, і над поголеною та асептично підготовленою шкірою голови зробили серединний розріз, щоб оголити череп. Просвердлили два отвори в області верхньої стулки та закріпили фіксуючі гвинти в отворах. Додатковий отвір просвердлили в латеральному потиличному гребені для стереотаксичного наведення канюлі з нержавіючої сталі в ВЦ. Нанесли стоматологічний цемент навколо канюлі та закріпили гвинтами. Після фотополімеризації та затвердіння цементу шкірну рану закрили швом 4/0 супрамід. Правильне розміщення канюлі підтверджується спонтанним витіканням спинномозкової рідини (СМР). Видалили щура зі стереотаксичного апарату, надали йому відповідний післяопераційний догляд та знеболення, і дали йому відновитися протягом щонайменше одного тижня, доки не спостерігатимуться ознаки крові в спинномозковій рідині. Щури Вістар (Crl:WI/Han) були отримані від Charles River (Франція). Усіх щурів утримували в специфічних умовах, вільних від патогенів. Усі експерименти на тваринах були схвалені Ветеринарним управлінням міста Базель, Швейцарія, та проводилися відповідно до Ліцензії на тварин № 2474 (Оцінка активного транспорту мозку шляхом вимірювання рівнів терапевтичних кандидатів у спинномозковій рідині та мозку щурів).
Обережно тримайте щура притомним, тримаючи в руці канюлю спинномозкової рідини (СК). Вийміть дурман з канюлі та зберіть 10 мкл спонтанно текучої спинномозкової рідини. Оскільки прохідність канюлі зрештою була порушена, у це дослідження були включені лише прозорі зразки спинномозкової рідини без ознак забруднення кров’ю або зміни кольору. Паралельно, приблизно 10–20 мкл крові було взято з невеликого розрізу на кінчику хвоста в пробірки з гепарином (Sigma-Aldrich). СМР та кров збирали в різні моменти часу після внутрішньовенного введення фага T7. Приблизно 5–10 мкл рідини видаляли перед кожним збором зразка СМР, що відповідає мертвому об’єму катетера.
Бібліотеки були створені з використанням вектора T7Select 10-3b, як описано в посібнику з використання системи T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Коротко, випадкову 12-мерну вставку ДНК було синтезовано в такому форматі:
Кодон NNK використовували для уникнення подвійних стоп-кодонів та надмірної експресії амінокислот у вставці. N – це еквімолярне співвідношення кожного нуклеотиду, змішане вручну, а K – еквімолярне співвідношення аденіну та цитозину, змішане вручну. Одноланцюгові ділянки перетворювали на дволанцюгову ДНК шляхом подальшої інкубації з dNTP (Novagen) та ферментом Кленова (New England Biolabs) у буфері Кленова (New England Biolabs) протягом 3 годин при 37°C. Після реакції дволанцюгову ДНК відновлювали шляхом осадження EtOH. Отриману ДНК розщеплювали рестрикційними ферментами EcoRI та HindIII (обидва від Roche). Розщеплену та очищену (QIAquick, Qiagen) вставку (лігаза T4, New England Biolabs) потім лігували в рамці з попередньо розщепленим вектором T7 після амінокислоти 348 капсидного гена 10B. Реакції лігування інкубували при 16°C протягом 18 годин перед упаковкою in vitro. Пакування фагів in vitro проводили згідно з інструкціями, що додаються до набору для клонування T7Select 10-3b (Novagen), а розчин для пакування ампліфікували один раз для лізису за допомогою Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Лізати центрифугували, титрували та заморожували при -80°C як матковий розчин гліцерину.
Пряма ПЛР-ампліфікація варіабельних ділянок фагів, ампліфікованих у бульйоні або чашках, з використанням запатентованих праймерів для злиття 454/Roche-amplicon. Праймер для прямого злиття містить послідовності, що фланкують варіабельну ділянку (NNK) 12 (специфічна для шаблону), GS FLX Titanium Adapter A та ключову послідовність бібліотеки з чотирьох основ (TCAG) (Додатковий Рисунок 1a):
Праймер зворотного злиття також містить біотин, приєднаний до захоплювальних кульок, та адаптер GS FLX Titanium Adapter B, необхідний для клональної ампліфікації під час емульсійної ПЛР:
Потім амплікони піддали піросеквенуванню за протоколом 454/Roche згідно з протоколом 454 GS-FLX Titanium. Для ручного секвенування за Сангером (аналізатор ДНК Applied Biosystems Hitachi 3730 xl) ДНК фага T7 ампліфікували за допомогою ПЛР та секвенували з використанням наступних пар праймерів:
Вставки з окремих бляшок піддавали ПЛР-ампліфікації за допомогою набору Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (відповідно до інструкцій виробника). Виконували гарячий старт (10 хв при 95 °C) та 35 циклів бусту (50 с при 95 °C, 1 хв при 50 °C та 1 хв при 72 °C).
Фаги з бібліотек, фаги дикого типу, фаги, виділені з спинномозкової рідини та крові, або окремі клони ампліфікували в Escherichia coli BL5615 у туберкульозному бульйоні (Sigma Aldrich) або в чашках об'ємом 500 см² (Thermo Scientific) протягом 4 годин при 37°C. Фаги екстрагували з планшетів шляхом промивання планшетів буфером Tris-EDTA (Fluka Analytical) або шляхом збору бляшок стерильними наконечниками піпеток. Фаги виділяли з культурального супернатанту або буфера для екстракції одним раундом осадження поліетиленгліколем (PEG 8000) (Promega) та ресуспендували в буфері Tris-EDTA.
Ампліфікований фаг піддали 2-3 раундам видалення ендотоксинів за допомогою кульок для видалення ендотоксинів (Miltenyi Biotec) перед внутрішньовенною (IV) ін'єкцією (500 мкл/тварину). У першому раунді вводили 2×1012 фагів; у другому - 2×1010 фагів; у третьому та четвертому раундах відбору - 2×109 фагів на тварину. Вміст фагів у зразках спинномозкової рідини та крові, зібраних у зазначені моменти часу, визначали шляхом підрахунку бляшок згідно з інструкціями виробника (інструкція з експлуатації системи T7Select). Відбір фагів проводили шляхом внутрішньовенного введення очищених бібліотек у хвостову вену або шляхом повторного введення фага, екстрагованого з спинномозкової рідини з попереднього раунду відбору, а наступні збори проводили через 10 хв, 30 хв, 60 хв, 90 хв, 120 хв, 180 хв та 240 хв відповідно зразків спинномозкової рідини та крові. Загалом було проведено чотири раунди пэннінгу in vivo, в яких дві вибрані гілки окремо зберігалися та аналізувалися протягом перших трьох раундів відбору. Всі фагові вставки, екстраговані з спинномозкової рідини (СМР) з перших двох раундів відбору, були піддані піросеквенуванню 454/Roche, тоді як всі клони, екстраговані з СМР з останніх двох раундів відбору, були секвеновані вручну. Всі фаги крові з першого раунду відбору також були піддані піросеквенуванню 454/Roche. Для ін'єкції фагових клонів вибрані фаги ампліфікували в E. coli (BL5615) на чашках площею 500 см2 при 37°C протягом 4 годин. Окремо відібрані та секвеновані вручну клони розмножували в середовищі TB. Після екстракції фагів, очищення та видалення ендотоксину (як описано вище), 2×1010 фагів/тварину в 300 мкл внутрішньовенно вводили в одну хвостову вену.
Попередня обробка та якісна фільтрація даних послідовностей. Необроблені дані 454/Roche були перетворені з бінарного стандартного формату карти потоку (sff) у формат Pearson, що читається людиною (fasta), за допомогою програмного забезпечення постачальника. Подальша обробка нуклеотидної послідовності була виконана за допомогою власних програм та скриптів на C (невипущений програмний пакет), як описано нижче. Аналіз первинних даних включає суворі багатоетапні процедури фільтрації. Щоб відфільтрувати зчитування, які не містили дійсної послідовності ДНК-вставки 12mer, зчитування послідовно вирівнювали за початковою міткою (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), стоп-міткою (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) та фоновою вставкою (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) за допомогою глобального тесту Нідлмана-Вунша. вирівнювання, що допускає до 2 невідповідностей на вирівнювання31. Тому з бібліотеки були видалені зчитування без початкової та стоп-міток та зчитування, що містять фонові вставки, тобто вирівнювання, що перевищують дозволену кількість невідповідностей. Що стосується решти зчитувань, то N-мерна послідовність ДНК, що простягається від стартової мітки та закінчується перед стоп-міткою, була вирізана з оригінальної послідовності зчитування та додатково оброблена (далі - "вставка"). Після трансляції вставки, частина після першого стоп-кодона на 5'-кінці праймера видаляється з вставки. Крім того, також були видалені нуклеотиди, що призводять до неповних кодонів на 3'-кінці праймера. Щоб виключити вставки, що містять лише фонові послідовності, також були видалені трансльовані вставки, що починаються з амінокислотного шаблону "PAG". Пептиди з посттрансляційною довжиною менше 3 амінокислот були видалені з бібліотеки. Нарешті, видалили надлишковість у пулі вставок та визначили частоту кожної унікальної вставки. Результати цього аналізу включали список нуклеотидних послідовностей (вставок) та їх (зчитування) частот (Додаткові рисунки 1c та 2).
Групування N-мерних ДНК-вставок за подібністю послідовностей: щоб усунути специфічні для 454/Roche помилки секвенування (такі як проблеми із секвенуванням гомополімерних подовжень) та видалити менш важливі надлишки, попередньо відфільтровані N-мерні ДНК-вставки (вставки) сортуються за подібністю. Вставки (вставки) (дозволено до 2 неспівпадаючих основ) сортуються за подібністю (вставки сортуються спочатку за їх частотою (від найвищої до найнижчої), а якщо вони однакові, то за їх вторинним сортуванням за довжиною (від найдовшої до найкоротшої). Таким чином, найчастіші та найдовші вставки визначають першу «групу». Частота групи встановлюється на рівні ключової частоти. Потім кожну вставку, що залишилася в відсортованому списку, намагалися додати до групи за допомогою попарного вирівнювання Нідлмена-Вунша. Якщо кількість невідповідностей, вставок або делецій у вирівнюванні не перевищує порогове значення 2, до групи додається вставка, а загальна частота групи збільшується на частоту додавання вставки. Вставки, додані до групи, позначаються як використані та виключаються з подальшої обробки. Якщо послідовність вставки неможливо додати до вже існуючої групи, послідовність вставки використовується для створення нової групи з відповідною частотою вставки та позначається як використана. Ітерація завершується, коли кожна послідовність вставки або була використана для формування нової групи, або може бути включена до вже існуючої групи. Зрештою, згруповані вставки, що складаються з нуклеотидів, зрештою транслюються в пептидні послідовності (пептидні бібліотеки). Результатом цього аналізу є набір вставок та їх відповідних частот, які складають кількість послідовних зчитувань (Додатковий рис. 2).
Генерація мотивів: На основі списку унікальних пептидів було створено бібліотеку, що містить усі можливі амінокислотні патерни (АК), як показано нижче. Кожен можливий патерн довжиною 3 був вилучений з пептиду, а його інверсний патерн був доданий разом із загальною бібліотекою мотивів, що містить усі патерни (трипептиди). Бібліотеки високоповторних мотивів були секвеновані, а надлишковість видалена. Потім для кожного трипептиду в бібліотеці мотивів ми перевіряли його наявність у бібліотеці за допомогою обчислювальних інструментів. У цьому випадку частота пептиду, що містить знайдений мотив трипептиду, додається та призначається мотиву в бібліотеці мотивів («кількість мотивів»). Результатом генерації мотиву є двовимірний масив, що містить усі входження трипептидів (мотивів) та їх відповідні значення, які є кількістю зчитувань секвенування, що призводять до відповідного мотиву, коли зчитування фільтруються, групуються та транслюються. Метрики, як детально описано вище.
Нормалізація кількості мотивів та відповідних діаграм розсіювання: кількість мотивів для кожного зразка була нормалізована за допомогою
де ni – кількість зчитувань, що містять тему i. Таким чином, vi представляє відсоткову частоту зчитувань (або пептидів), що містять мотив i у вибірці. P-значення для ненормалізованої кількості мотивів були розраховані за допомогою точного тесту Фішера. Щодо корелограм кількості мотивів, кореляції Спірмена були розраховані з використанням нормалізованої кількості мотивів з R.
Для візуалізації вмісту амінокислот у кожній позиції в бібліотеці пептидів були створені веб-логограми 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Спочатку вміст амінокислот у кожній позиції 12-мерного пептиду зберігається в матриці 20×12. Потім набір із 1000 пептидів, що містять однаковий відносний вміст амінокислот у кожній позиції, генерується у форматі fasta-sequence та надається як вхідні дані для web-logo 3, який генерує графічне представлення відносного вмісту амінокислот у кожній позиції для заданої бібліотеки пептидів. Для візуалізації багатовимірних наборів даних теплові карти були створені за допомогою внутрішньо розробленого інструменту в R (biosHeatmap, пакет R, який ще не випущений). Дендрограми, представлені на теплових картах, були розраховані за допомогою методу ієрархічної кластеризації Варда з метрикою евклідової відстані. Для статистичного аналізу даних оцінювання мотивів значення P для ненормалізованого оцінювання були розраховані за допомогою точного тесту Фішера. P-значення для інших наборів даних були розраховані в R за допомогою t-критерію Стьюдента або дисперсійного аналізу (ANOVA).
Відібрані фагові клони та фаги без вставок вводили внутрішньовенно через хвостову вену (2×1010 фагів/тварину у 300 мкл PBS). За десять хвилин до перфузії та подальшої фіксації тим самим тваринам внутрішньовенно вводили 100 мкл лектину, міченого DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177). Через 60 хвилин після ін'єкції фагів щурам перфузували через серце 50 мл PBS, а потім 50 мл 4% PFA/PBS. Зразки мозку додатково фіксували протягом ночі у 4% PFA/PBS та замочували у 30% сахарозі протягом ночі при 4°C. Зразки швидко заморожували в OCT-суміші. Імуногістохімічний аналіз заморожених зразків проводили при кімнатній температурі на кріозрізах 30 мкм, блокованих 1% BSA та інкубованих з поліклональними антитілами, міченими FITC, проти фага T7 (Novus NB 600-376A) при 4°C. Інкубували протягом ночі. Нарешті, зрізи промивали 3 рази PBS та досліджували за допомогою конфокального лазерного мікроскопа (Leica TCS SP5).
Усі пептиди з мінімальною чистотою 98% були синтезовані GenScript USA, біотинільовані та ліофілізовані. Біотин зв'язаний через додатковий потрійний гліциновий спейсер на N-кінці. Перевірте всі пептиди за допомогою мас-спектрометрії.
Стрептавідин (Sigma S0677) змішували з 5-кратним еквімолярним надлишком біотинільованого пептиду, біотинільованого інгібуючого пептиду BACE1 або комбінації (співвідношення 3:1) біотинільованого інгібуючого пептиду BACE1 та інгібуючого пептиду BACE1 у 5–10% DMSO/інкубували в PBS. 1 годину при кімнатній температурі перед ін'єкцією. Кон'юговані зі стрептавідином пептиди вводили внутрішньовенно в дозі 10 мг/кг в одну з хвостових вен щурів з порожниною головного мозку.
Концентрацію стрептавідин-пептидних комплексів оцінювали за допомогою ELISA. Мікротитровальні планшети Nunc Maxisorp (Sigma) покривали протягом ночі при 4°C 1,5 мкг/мл мишачого антистрептавідинового антитіла (Thermo, MA1-20011). Після блокування (блокувальний буфер: 140 нМ NaCL, 5 мМ EDTA, 0,05% NP40, 0,25% желатину, 1% BSA) при кімнатній температурі протягом 2 годин, промивали планшет 0,05% Tween-20/PBS (промивний буфер) протягом 3 секунд. Зразки спинномозкової рідини та плазми додавали до лунок, розведених блокувальним буфером (плазма 1:10 000, спинномозкова рідина 1:115). Потім планшет інкубували протягом ночі при 4°C з детекційним антитілом (1 мкг/мл, анти-стрептавідин-HRP, Novus NB120-7239). Після трьох етапів промивання стрептавідин виявляли шляхом інкубації в розчині субстрату TMB (Roche) протягом до 20 хвилин. Після зупинки розвитку кольору за допомогою 1M H2SO4 вимірювали поглинання при 450 нм.
Функцію комплексу стрептавідин-пептид-інгібітор BACE1 оцінювали за допомогою ELISA Aβ(1-40) згідно з протоколом виробника (Wako, 294-64701). Коротко кажучи, зразки спинномозкової рідини розводили у стандартному розріджувачі (1:23) та інкубували протягом ночі при 4°C у 96-лункових планшетах, покритих антитілом захоплення BNT77. Після п'яти етапів промивання додавали кон'юговане з HRP антитіло BA27 та інкубували протягом 2 годин при 4°C, а потім п'ять етапів промивання. Aβ(1–40) виявляли шляхом інкубації в розчині TMB протягом 30 хвилин при кімнатній температурі. Після зупинки розвитку кольору за допомогою стоп-розчину вимірювали поглинання при 450 нм. Зразки плазми піддавали твердофазній екстракції перед ELISA Aβ(1–40). Плазму додавали до 0,2% DEA (Sigma) у 96-лункових планшетах та інкубували при кімнатній температурі протягом 30 хвилин. Після послідовного промивання пластин ТФЕ (Oasis, 186000679) водою та 100% метанолом, зразки плазми додавали до пластин ТФЕ, і всю рідину видаляли. Зразки промивали (спочатку 5% метанолом, потім 30% метанолом) та елюювали 2% NH4OH/90% метанолом. Після сушіння елюату при 55°C протягом 99 хвилин при постійному струмі N2, зразки відновлювали у стандартних розріджувачах, і Aβ(1–40) вимірювали, як описано вище.
Як цитувати цю статтю: Уріч, Е. та ін. Доставка вантажу до мозку за допомогою транзитних пептидів, ідентифікованих in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Ліхота Дж., Скьорріндж Т., Томсен Л.Б. та Мус Т. Доставка макромолекулярних препаратів у мозок за допомогою цільової терапії. Журнал нейрохімії 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Брасневич, І., Штайнбуш, Х.В., Шмітц, К. та Мартінес-Мартінес, П. Доставка пептидних та білкових препаратів через гематоенцефалічний бар'єр. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Пардрідж, В. М. Гематоенцефалічний бар'єр: вузьке місце в розробці препаратів для мозку. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Йохансон, К.Е., Дункан, Дж.А., Стопа, Е.Г. та Берд, А. Перспективи покращення доставки ліків та їхнього таргетного впливу на мозок через шлях судинного сплетення-ліквору. Фармацевтичні дослідження 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Пардрідж, В. М. Модернізація біофармацевтичних препаратів за допомогою молекулярних троянських коней для доставки в мозок. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Пардрідж, WM рецептор-опосередкований транспорт пептидів через гематоенцефалічний бар'єр. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Нівейнер, Й. та ін. Збільшення проникнення в мозок та ефективності терапевтичних антитіл за допомогою моновалентних молекулярних човників. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. та ін. Транспорт рецептора трансферину (TfR) визначає поглинання мозком афінних варіантів антитіл до TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).