Nature.comను సందర్శించినందుకు ధన్యవాదాలు. మీరు పరిమిత CSS మద్దతు ఉన్న బ్రౌజర్ వెర్షన్‌ను ఉపయోగిస్తున్నారు. ఉత్తమ అనుభవం కోసం, మీరు అప్‌డేట్ చేయబడిన బ్రౌజర్‌ను ఉపయోగించాలని (లేదా ఇంటర్నెట్ ఎక్స్‌ప్లోరర్‌లో కంపాటిబిలిటీ మోడ్‌ను నిలిపివేయాలని) మేము సిఫార్సు చేస్తున్నాము. అదనంగా, నిరంతర మద్దతును నిర్ధారించడానికి, మేము సైట్‌ను స్టైల్స్ మరియు జావాస్క్రిప్ట్ లేకుండా చూపిస్తాము.
ఒకేసారి మూడు స్లయిడ్‌ల క్యారౌసెల్‌ను ప్రదర్శిస్తుంది. ఒకేసారి మూడు స్లయిడ్‌ల ద్వారా ముందుకు వెళ్లడానికి 'మునుపటి' మరియు 'తదుపరి' బటన్‌లను ఉపయోగించండి, లేదా చివరన ఉన్న స్లైడర్ బటన్‌లను ఉపయోగించి ఒకేసారి మూడు స్లయిడ్‌ల ద్వారా ముందుకు వెళ్లండి.
రక్త-మెదడు అవరోధం, జీవ చికిత్సా ఏజెంట్లు కేంద్ర నాడీ వ్యవస్థలోని వాటి లక్ష్యాలను చేరకుండా నిరోధిస్తుంది, తద్వారా నాడీ సంబంధిత వ్యాధుల సమర్థవంతమైన చికిత్సకు ఆటంకం కలిగిస్తుంది. ఇన్ వివోలో నూతన మెదడు ట్రాన్స్‌పోర్టర్లను కనుగొనడానికి, మేము ఒక T7 ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీని ప్రవేశపెట్టి, కాన్యులేటెడ్ కాన్షియస్ లార్జ్ పూల్ ఎలుకల నమూనాను ఉపయోగించి రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్ (CSF)ను వరుసగా సేకరించాము. నాలుగు రౌండ్ల ఎంపిక తర్వాత, నిర్దిష్ట ఫేజ్ క్లోన్‌లు CSFలో అధికంగా సమృద్ధి చెందాయి. వ్యక్తిగత అభ్యర్థి పెప్టైడ్‌లను పరీక్షించగా, CSFలో 1000 రెట్లకు పైగా సమృద్ధి ఉన్నట్లు వెల్లడైంది. గుర్తించబడిన నూతన ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్‌కు అనుసంధానించబడిన BACE1 పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్‌ను ఉపయోగించి సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్‌లో అమైలాయిడ్-β స్థాయిలో 40% తగ్గింపు ద్వారా, మెదడుకు పెప్టైడ్-మధ్యవర్తిత్వ డెలివరీ యొక్క జీవక్రియాశీలత నిర్ధారించబడింది. ఈ ఫలితాలు, ఇన్ వివో ఫేజ్ ఎంపిక పద్ధతుల ద్వారా గుర్తించబడిన పెప్టైడ్‌లు, చికిత్సా ప్రభావంతో స్థూల అణువులను మెదడుకు వ్యవస్థాగతంగా అందించడానికి ఉపయోగకరమైన వాహకాలుగా ఉండవచ్చని సూచిస్తున్నాయి.
కేంద్ర నాడీ వ్యవస్థ (CNS) లక్షిత చికిత్స పరిశోధన, మెదడుకు ఔషధాలను చురుకుగా చేరవేసే యంత్రాంగాలను కనుగొనడంపై తక్కువ కృషి చేస్తూ, CNS-లక్ష్య లక్షణాలను ప్రదర్శించే ఆప్టిమైజ్డ్ ఔషధాలు మరియు ఏజెంట్లను గుర్తించడంపై ఎక్కువగా దృష్టి సారించింది. ఆధునిక న్యూరోసైన్స్ ఔషధ అభివృద్ధిలో ఔషధ పంపిణీ, ముఖ్యంగా పెద్ద అణువుల పంపిణీ, ఒక అంతర్భాగం కావడంతో ఇప్పుడు ఈ పరిస్థితి మారడం ప్రారంభమైంది. కేంద్ర నాడీ వ్యవస్థ యొక్క వాతావరణం, బ్లడ్-బ్రెయిన్ బారియర్ (BBB) ​​మరియు బ్లడ్-బ్రెయిన్ బారియర్ (BCBB)1 లతో కూడిన సెరెబ్రోవాస్కులర్ బారియర్ వ్యవస్థ ద్వారా బాగా రక్షించబడుతుంది, ఇది మెదడుకు ఔషధాలను చేరవేయడాన్ని సవాలుగా మారుస్తుంది1,2. దాదాపు అన్ని పెద్ద అణువుల ఔషధాలు మరియు 98% కంటే ఎక్కువ చిన్న అణువుల ఔషధాలు మెదడు నుండి తొలగించబడతాయని అంచనా3. అందుకే CNSకు చికిత్సా ఔషధాలను సమర్థవంతంగా మరియు నిర్దిష్టంగా చేరవేసే కొత్త మెదడు రవాణా వ్యవస్థలను గుర్తించడం చాలా ముఖ్యం4,5. అయితే, BBB మరియు BCSFB కూడా ఔషధ పంపిణీకి ఒక అద్భుతమైన అవకాశాన్ని అందిస్తాయి, ఎందుకంటే అవి మెదడు యొక్క విస్తృతమైన రక్తనాళాల ద్వారా దానిలోని అన్ని నిర్మాణాలలోకి చొచ్చుకుపోయి ప్రవేశిస్తాయి. అందువల్ల, మెదడుకు నాన్-ఇన్వాసివ్ పద్ధతుల ద్వారా మందులను చేరవేసే ప్రస్తుత ప్రయత్నాలు, ప్రధానంగా ఎండోజెనస్ BBB6 రిసెప్టర్‌ను ఉపయోగించి, రిసెప్టర్-మీడియేటెడ్ ట్రాన్స్‌పోర్ట్ (PMT) అనే యంత్రాంగంపై ఆధారపడి ఉన్నాయి. ట్రాన్స్‌ఫెర్రిన్ రిసెప్టర్ మార్గాన్ని ఉపయోగించి ఇటీవల కీలక పురోగతులు సాధించినప్పటికీ7,8, మెరుగైన లక్షణాలతో కూడిన కొత్త డెలివరీ వ్యవస్థలను మరింతగా అభివృద్ధి చేయాల్సిన అవసరం ఉంది. ఈ లక్ష్యంతో, CSF రవాణాను మధ్యవర్తిత్వం చేయగల పెప్టైడ్‌లను గుర్తించడమే మా ఉద్దేశ్యం. ఎందుకంటే, సూత్రప్రాయంగా వీటిని CNSకు మాక్రోమాలిక్యూల్స్‌ను చేరవేయడానికి లేదా కొత్త రిసెప్టర్ మార్గాలను తెరవడానికి ఉపయోగించవచ్చు. ముఖ్యంగా, సెరెబ్రోవాస్కులర్ సిస్టమ్ (BBB మరియు BSCFB) యొక్క నిర్దిష్ట రిసెప్టర్లు మరియు ట్రాన్స్‌పోర్టర్లు, బయోథెరప్యూటిక్ మందులను చురుకుగా మరియు నిర్దిష్టంగా చేరవేయడానికి సంభావ్య లక్ష్యాలుగా ఉపయోగపడతాయి. సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్ (CSF) అనేది కోరాయిడ్ ప్లెక్సస్ (CS) యొక్క స్రావక ఉత్పత్తి మరియు ఇది సబరాక్నాయిడ్ స్పేస్ మరియు వెంట్రిక్యులర్ స్పేస్ ద్వారా మెదడు యొక్క ఇంటర్‌స్టీషియల్ ఫ్లూయిడ్‌తో ప్రత్యక్ష సంబంధంలో ఉంటుంది4. ఇటీవల, సబరాక్నాయిడ్ సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్ మెదడు యొక్క ఇంటర్‌స్టీషియంలోకి అధికంగా వ్యాపిస్తుందని చూపబడింది9. మేము ఈ సబరాక్నాయిడ్ ఇన్‌ఫ్లో ట్రాక్ట్ ద్వారా లేదా నేరుగా BBB ద్వారా పారెన్‌కైమల్ స్పేస్‌లోకి ప్రవేశించాలని ఆశిస్తున్నాము. దీనిని సాధించడానికి, ఈ రెండు విభిన్న మార్గాలలో దేని ద్వారా అయినా రవాణా చేయబడిన పెప్టైడ్‌లను ఆదర్శంగా గుర్తించే ఒక పటిష్టమైన ఇన్ వివో ఫేజ్ సెలెక్షన్ వ్యూహాన్ని మేము అమలు చేశాము.
అత్యధిక లైబ్రరీ వైవిధ్యంతో ప్రారంభ ఎంపిక దశలను పర్యవేక్షించడానికి, మేము ఇప్పుడు CSF నమూనాతో పాటు హై థ్రూపుట్ సీక్వెన్సింగ్ (HTS)ను ఉపయోగించి, ఒక క్రమబద్ధమైన ఇన్ వివో ఫేజ్ డిస్ప్లే స్క్రీనింగ్ పద్ధతిని వివరిస్తున్నాము. రక్త కాలుష్యాన్ని నివారించడానికి, శాశ్వతంగా అమర్చిన పెద్ద సిస్టెర్నా (CM) కాన్యులాతో స్పృహలో ఉన్న ఎలుకలపై స్క్రీనింగ్ నిర్వహించబడింది. ముఖ్యంగా, ఈ విధానం మెదడును లక్ష్యంగా చేసుకునే పెప్టైడ్‌లను మరియు సెరెబ్రోవాస్కులర్ అవరోధం గుండా రవాణా కార్యకలాపాలు కలిగిన పెప్టైడ్‌లను రెండింటినీ ఎంపిక చేస్తుంది. మేము T7 ఫేజ్‌లను వాటి చిన్న పరిమాణం (~60 nm)10 కారణంగా ఉపయోగించాము మరియు ఎండోథెలియల్ మరియు/లేదా ఎపిథీలియల్-మెడుల్లా అవరోధం యొక్క ట్రాన్స్‌సెల్యులార్ క్రాసింగ్‌ను అనుమతించే వెసికిల్స్ రవాణాకు అవి అనుకూలంగా ఉంటాయని సూచించాము. నాలుగు దశల ప్యానింగ్ తర్వాత, బలమైన ఇన్ వివో CSF సమృద్ధిని మరియు సెరిబ్రల్ మైక్రోవెసెల్ అనుబంధాన్ని చూపిస్తున్న ఫేజ్ పాపులేషన్‌లు వేరుచేయబడ్డాయి. ముఖ్యంగా, ప్రాధాన్యతనిచ్చిన మరియు రసాయనికంగా సంశ్లేషణ చేయబడిన ఉత్తమ అభ్యర్థి పెప్టైడ్‌లు ప్రోటీన్ కార్గోను సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవంలోకి రవాణా చేయగలవని ప్రదర్శించడం ద్వారా మేము మా పరిశోధనలను ధృవీకరించగలిగాము. మొదటగా, ఒక ప్రముఖ ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్‌ను BACE1 పెప్టైడ్ యొక్క నిరోధకంతో కలపడం ద్వారా CNS యొక్క ఫార్మకోడైనమిక్ ప్రభావాలు స్థాపించబడ్డాయి. ఇన్ వివో ఫంక్షనల్ స్క్రీనింగ్ వ్యూహాలు నూతన మెదడు రవాణా పెప్టైడ్‌లను సమర్థవంతమైన ప్రోటీన్ కార్గో వాహకాలుగా గుర్తించగలవని నిరూపించడంతో పాటు, ఇలాంటి ఫంక్షనల్ సెలక్షన్ విధానాలు నూతన మెదడు రవాణా మార్గాలను గుర్తించడంలో కూడా ముఖ్యమైనవిగా మారతాయని మేము ఆశిస్తున్నాము.
ఫేజ్ ప్యాకేజింగ్ దశ తర్వాత, ప్లాక్-ఫార్మింగ్ యూనిట్ల (PFU) ఆధారంగా, సుమారు 109 వైవిధ్యంతో కూడిన యాదృచ్ఛిక 12-మెర్ లీనియర్ T7 ఫేజ్ పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీని రూపొందించి, సృష్టించడం జరిగింది (మెటీరియల్స్ అండ్ మెథడ్స్ చూడండి). ఇన్ వివో ప్యానింగ్‌కు ముందు మేము ఈ లైబ్రరీని జాగ్రత్తగా విశ్లేషించామని గమనించడం ముఖ్యం. సవరించిన ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి ఫేజ్ లైబ్రరీ నమూనాల PCR యాంప్లిఫికేషన్, HTSకు నేరుగా వర్తించే యాంప్లికాన్‌లను ఉత్పత్తి చేసింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 1a). a) HTS11 సీక్వెన్సింగ్ లోపాలు, b) ప్రైమర్‌ల (NNK)1-12 నాణ్యతపై ప్రభావం, మరియు c) స్టాండ్‌బై లైబ్రరీలో వైల్డ్-టైప్ (wt) ఫేజ్ (స్కెలెటన్ ఇన్సర్ట్‌లు) ఉండటం వలన, ధృవీకరించబడిన సీక్వెన్స్ సమాచారాన్ని మాత్రమే సంగ్రహించడానికి ఒక సీక్వెన్స్ ఫిల్టరింగ్ విధానం అమలు చేయబడింది (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 1b). ఈ ఫిల్టర్ దశలు అన్ని HTS సీక్వెన్సింగ్ లైబ్రరీలకు వర్తిస్తాయి. ప్రామాణిక లైబ్రరీ కోసం, మొత్తం 233,868 రీడ్‌లు పొందబడ్డాయి, వాటిలో 39% ఫిల్టర్ ప్రమాణాలను దాటి, లైబ్రరీ విశ్లేషణ మరియు తదుపరి రౌండ్‌ల ఎంపిక కోసం ఉపయోగించబడ్డాయి (అనుబంధ చిత్రం 1c–e). ఈ రీడ్‌లు ప్రధానంగా 3 బేస్ పెయిర్‌ల గుణిజాల పొడవుతో, 36 న్యూక్లియోటైడ్‌ల వద్ద గరిష్ట స్థాయిని కలిగి ఉన్నాయి (అనుబంధ చిత్రం 1c), ఇది లైబ్రరీ డిజైన్ (NNK) 1-12ను ధృవీకరించింది. ముఖ్యంగా, లైబ్రరీ సభ్యులలో సుమారు 11% 12-డైమెన్షనల్ వైల్డ్-టైప్ (wt) బ్యాక్‌బోన్ PAGISRELVDKL ఇన్సర్ట్‌ను కలిగి ఉన్నాయి, మరియు దాదాపు సగం సీక్వెన్స్‌లు (49%) ఇన్సర్షన్‌లు లేదా డిలీషన్‌లను కలిగి ఉన్నాయి. లైబ్రరీ యొక్క HTS, లైబ్రరీలోని పెప్టైడ్‌ల అధిక వైవిధ్యాన్ని ధృవీకరించింది: 81% కంటే ఎక్కువ పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌లు ఒక్కసారి మాత్రమే కనుగొనబడ్డాయి మరియు కేవలం 1.5% మాత్రమే ≥4 కాపీలలో సంభవించాయి (అనుబంధ చిత్రం 2a). రిపర్టోయిర్‌లోని మొత్తం 12 స్థానాలలో ఉన్న అమైనో ఆమ్లాల (aa) పౌనఃపున్యాలు, క్షీణించిన NKK రిపర్టోయిర్ ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన కోడాన్‌ల సంఖ్యకు ఆశించిన పౌనఃపున్యాలతో బాగా సరిపోయాయి (అనుబంధ చిత్రం 2b). ఈ ఇన్సర్ట్‌ల ద్వారా ఎన్‌కోడ్ చేయబడిన aa అవశేషాల యొక్క గమనించిన పౌనఃపున్యం, లెక్కించిన పౌనఃపున్యంతో బాగా సరిపోయింది (r = 0.893) (అనుబంధ చిత్రం 2c). ఇంజెక్షన్ కోసం ఫేజ్ లైబ్రరీల తయారీలో యాంప్లిఫికేషన్ మరియు ఎండోటాక్సిన్ తొలగింపు దశలు ఉంటాయి. ఇది ఫేజ్ లైబ్రరీల వైవిధ్యాన్ని తగ్గించగలదని గతంలో చూపబడింది¹²,¹³. అందువల్ల, మేము ఎండోటాక్సిన్ తొలగింపుకు గురైన ప్లేట్-యాంప్లిఫైడ్ ఫేజ్ లైబ్రరీని సీక్వెన్స్ చేసి, AA పౌనఃపున్యాన్ని అంచనా వేయడానికి దానిని అసలు లైబ్రరీతో పోల్చాము. అసలు పూల్ మరియు యాంప్లిఫైడ్ మరియు శుద్ధి చేయబడిన పూల్ మధ్య బలమైన సహసంబంధం (r = 0.995) గమనించబడింది (అనుబంధ చిత్రం 2d), ఇది T7 ఫేజ్‌ను ఉపయోగించి ప్లేట్‌లపై యాంప్లిఫై చేయబడిన క్లోన్‌ల మధ్య పోటీ పెద్ద పక్షపాతానికి కారణం కాలేదని సూచిస్తుంది. ఈ పోలిక ప్రతి లైబ్రరీలోని ట్రైపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌ల ఫ్రీక్వెన్సీపై ఆధారపడి ఉంటుంది, ఎందుకంటే HTSతో కూడా లైబ్రరీల వైవిధ్యాన్ని (~109) పూర్తిగా సంగ్రహించడం సాధ్యం కాదు. ప్రతి స్థానంలోని అమైనో ఆమ్లాల ఫ్రీక్వెన్సీ విశ్లేషణ, నమోదు చేయబడిన రెపర్టరీలోని చివరి మూడు స్థానాలలో ఒక చిన్న స్థాన-ఆధారిత పక్షపాతాన్ని వెల్లడించింది (అనుబంధ చిత్రం 2e). ముగింపుగా, లైబ్రరీ యొక్క నాణ్యత మరియు వైవిధ్యం ఆమోదయోగ్యంగా ఉన్నాయని, మరియు అనేక రౌండ్ల ఎంపిక మధ్య ఫేజ్ లైబ్రరీల విస్తరణ మరియు తయారీ కారణంగా వైవిధ్యంలో స్వల్ప మార్పులు మాత్రమే గమనించబడ్డాయని మేము నిర్ధారించాము.
BBB మరియు/లేదా BCSFB ద్వారా సిరల ద్వారా (iv) ఇంజెక్ట్ చేయబడిన T7 ఫేజ్‌ను గుర్తించడాన్ని సులభతరం చేయడానికి, స్పృహలో ఉన్న ఎలుకల CM లోకి శస్త్రచికిత్స ద్వారా ఒక కాన్యులాను అమర్చడం ద్వారా సీరియల్ సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్ నమూనా సేకరణను నిర్వహించవచ్చు (పటం 1a-b). మేము ఇన్ వివో ఎంపిక యొక్క మొదటి మూడు రౌండ్లలో రెండు స్వతంత్ర ఎంపిక విభాగాలను (విభాగం A మరియు B) ఉపయోగించాము (పటం 1c). మొదటి మూడు రౌండ్ల ఎంపికలో ప్రవేశపెట్టిన ఫేజ్ మొత్తం పరిమాణాన్ని తగ్గించడం ద్వారా మేము ఎంపిక యొక్క కఠినత్వాన్ని క్రమంగా పెంచాము. ప్యానింగ్ యొక్క నాల్గవ రౌండ్ కోసం, మేము విభాగం A మరియు B నుండి నమూనాలను కలిపి, అదనంగా మూడు స్వతంత్ర ఎంపికలను నిర్వహించాము. ఈ నమూనాలో T7 ఫేజ్ కణాల ఇన్ వివో లక్షణాలను అధ్యయనం చేయడానికి, వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ (PAGISRELVDKL మాస్టర్ ఇన్సర్ట్)ను తోక సిర ద్వారా ఎలుకలలోకి ఇంజెక్ట్ చేశారు. వివిధ సమయాల్లో సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్ మరియు రక్తం నుండి ఫేజ్‌ల రికవరీ, సాపేక్షంగా చిన్న T7 ఐకోసాహెడ్రల్ ఫేజ్‌లు రక్త భాగం నుండి వేగవంతమైన ప్రారంభ క్లియరెన్స్ దశను కలిగి ఉన్నాయని చూపించింది (అనుబంధ పటం 3). ఎలుకలకు ఇచ్చిన మోతాదులు మరియు వాటి రక్త పరిమాణం ఆధారంగా, సిరల ద్వారా ఇంజక్షన్ చేసిన 10 నిమిషాల తర్వాత రక్తంలో ఇచ్చిన మోతాదు నుండి కేవలం సుమారు 1% బరువు ఫేజ్ మాత్రమే కనుగొనబడిందని మేము లెక్కించాము. ఈ ప్రారంభ వేగవంతమైన క్షీణత తర్వాత, 27.7 నిమిషాల అర్ధ-జీవిత కాలంతో నెమ్మదిగా ప్రాథమిక క్లియరెన్స్ కొలవబడింది. ముఖ్యంగా, CSF భాగం నుండి చాలా తక్కువ ఫేజ్‌లు మాత్రమే తిరిగి పొందబడ్డాయి, ఇది CSF భాగంలోకి వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ వలస వెళ్ళడానికి తక్కువ నేపథ్యాన్ని సూచిస్తుంది (అనుబంధ చిత్రం 3). సగటున, మొత్తం నమూనా సేకరణ కాలంలో (0-250 నిమిషాలు), రక్తంలో కేవలం 1 x 10-3% T7 ఫేజ్ మోతాదులు మరియు ప్రారంభంలో ఎక్కించిన ఫేజ్‌లలో 4 x 10-8% మాత్రమే సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవంలో కనుగొనబడ్డాయి. గమనించదగ్గ విషయం ఏమిటంటే, సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవంలో వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ యొక్క అర్ధ-జీవిత కాలం (25.7 నిమిషాలు) రక్తంలో గమనించిన దానితో సమానంగా ఉంది. ఈ డేటా ప్రకారం, CM-క్యాన్యులేటెడ్ ఎలుకలలో రక్తం నుండి CSF విభాగాన్ని వేరుచేసే అవరోధం చెక్కుచెదరకుండా ఉందని స్పష్టమవుతోంది. దీనివల్ల, రక్తం నుండి CSF విభాగానికి సులభంగా రవాణా చేయబడే క్లోన్‌లను గుర్తించడానికి ఫేజ్ లైబ్రరీలను ఇన్ వివో పద్ధతిలో ఎంపిక చేసుకోవడానికి వీలవుతుంది.
(ఎ) ఒక పెద్ద సముదాయం నుండి సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్ (CSF) ను తిరిగి నమూనాగా సేకరించే పద్ధతిని ఏర్పాటు చేయడం. (బి) కేంద్ర నాడీ వ్యవస్థ (CNS) అవరోధం యొక్క కణ స్థానాన్ని మరియు రక్త-మెదడు అవరోధం (BBB) ​​ను దాటగల పెప్టైడ్‌లను గుర్తించడానికి ఉపయోగించే ఎంపిక వ్యూహాన్ని చూపించే రేఖాచిత్రం. (సి) ఇన్ వివో ఫేజ్ డిస్‌ప్లే స్క్రీనింగ్ ఫ్లోచార్ట్. ఎంపిక యొక్క ప్రతి దశలో, ఫేజ్‌లను (బాణాల లోపల ఉన్న జంతు గుర్తింపులు) సిరల ద్వారా ఇంజెక్ట్ చేశారు. రెండు స్వతంత్ర ప్రత్యామ్నాయ శాఖలు (A, B) 4వ ఎంపిక దశ వరకు విడిగా ఉంచబడతాయి. 3 మరియు 4వ ఎంపిక దశల కోసం, CSF నుండి సంగ్రహించిన ప్రతి ఫేజ్ క్లోన్‌ను మాన్యువల్‌గా సీక్వెన్స్ చేశారు. (డి) T7 పెప్టైడ్ లైబ్రరీని (2 x 10¹² ఫేజ్‌లు/జంతువు) సిరల ద్వారా ఇంజెక్ట్ చేసిన తర్వాత, రెండు కాన్యులేటెడ్ ఎలుకలలో మొదటి ఎంపిక దశలో రక్తం (ఎరుపు వలయాలు) మరియు సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్ (ఆకుపచ్చ త్రిభుజాలు) నుండి వేరుచేయబడిన ఫేజ్‌ల గతిశాస్త్రం. మొత్తం రక్త పరిమాణాన్ని పరిగణనలోకి తీసుకుని, ఇంజెక్ట్ చేసిన ఫేజ్ మొత్తం నుండి లెక్కించిన రక్తంలోని ఫేజ్ యొక్క సగటు ప్రారంభ సాంద్రతను నీలి చతురస్రాలు సూచిస్తాయి. రక్త ఫేజ్ సాంద్రతల నుండి ఎక్స్‌ట్రాపోలేట్ చేయబడిన y రేఖ యొక్క ఖండన బిందువును నలుపు చతురస్రాలు సూచిస్తాయి. (ఇ,ఎఫ్) పెప్టైడ్‌లో కనిపించే, ఒకదానితో ఒకటి అతివ్యాప్తి చెందే అన్ని సాధ్యమైన ట్రైపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌ల సాపేక్ష పౌనఃపున్యం మరియు పంపిణీని ప్రదర్శిస్తాయి. 1000 రీడింగ్‌లలో కనిపించే మోటిఫ్‌ల సంఖ్య చూపబడింది. గణనీయంగా (p < 0.001) సమృద్ధి చెందిన మోటిఫ్‌లు ఎరుపు చుక్కలతో గుర్తించబడ్డాయి. (ఇ) ఇంజెక్ట్ చేయబడిన లైబ్రరీ యొక్క ట్రైపెప్టైడ్ మోటిఫ్ యొక్క సాపేక్ష పౌనఃపున్యాన్ని, జంతువులు #1.1 మరియు #1.2 నుండి రక్తం ద్వారా పొందిన ఫేజ్‌తో పోల్చే సహసంబంధ స్కాటర్‌ప్లాట్. (ఎఫ్) రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్‌లో వేరుచేయబడిన జంతు ఫేజ్ ట్రైపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌లు #1.1 మరియు #1.2 యొక్క సాపేక్ష పౌనఃపున్యాలను పోల్చే సహసంబంధ స్కాటర్‌ప్లాట్. (g, h) రెండు జంతువులలో ఇన్ వివో సెలక్షన్ యొక్క ఒక రౌండ్ తర్వాత, రక్తంలో సమృద్ధి చెందిన ఫేజ్ (g) మరియు ఇంజెక్ట్ చేయబడిన లైబ్రరీల యొక్క సీక్వెన్స్ ID ప్రాతినిధ్యం, అలాగే CSF (h) మరియు రక్తంలో సమృద్ధి చెందిన ఫేజ్ యొక్క సీక్వెన్స్ ID ప్రాతినిధ్యం. ఒక-అక్షర కోడ్ యొక్క పరిమాణం, ఆ అమైనో ఆమ్లం ఆ స్థానంలో ఎంత తరచుగా సంభవిస్తుందో సూచిస్తుంది. ఆకుపచ్చ = ధ్రువ, ఊదా = తటస్థ, నీలం = క్షార, ఎరుపు = ఆమ్ల మరియు నలుపు = జలవిరోధి అమైనో ఆమ్లాలు. చిత్రం 1a, b ను ఎడ్వర్డ్ యూరిచ్ రూపొందించి, తయారుచేశారు.
మేము రెండు CM పరికర ఎలుకలలోకి (క్లేడ్స్ A మరియు B) ఒక ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీని ఇంజెక్ట్ చేసి, సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవం మరియు రక్తం నుండి ఫేజ్‌ను వేరు చేశాము (పటం 1d). వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్‌తో పోలిస్తే లైబ్రరీ యొక్క ప్రారంభ వేగవంతమైన క్లియరెన్స్ తక్కువగా కనిపించింది. రెండు జంతువులలో ఇంజెక్ట్ చేయబడిన లైబ్రరీ యొక్క సగటు అర్ధ-జీవిత కాలం రక్తంలో 24.8 నిమిషాలు, ఇది వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్‌తో సమానంగా ఉంది, మరియు CSFలో 38.5 నిమిషాలుగా ఉంది. ప్రతి జంతువు నుండి సేకరించిన రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవ ఫేజ్ నమూనాలను HTSకు గురిచేసి, గుర్తించిన అన్ని పెప్టైడ్‌లను ఒక చిన్న ట్రైపెప్టైడ్ మోటిఫ్ ఉనికి కోసం విశ్లేషించాము. ట్రైపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌లను ఎంచుకోవడానికి కారణం, అవి నిర్మాణం ఏర్పడటానికి మరియు పెప్టైడ్-ప్రోటీన్ పరస్పర చర్యలకు కనీస ఆధారాన్ని అందిస్తాయి¹⁴,¹⁵. ఇంజెక్ట్ చేయబడిన ఫేజ్ లైబ్రరీకి మరియు రెండు జంతువుల రక్తం నుండి సేకరించిన క్లోన్‌లకు మధ్య మోటిఫ్‌ల పంపిణీలో మేము మంచి సంబంధాన్ని కనుగొన్నాము (పటం 1e). ఈ డేటా ప్రకారం, లైబ్రరీ యొక్క కూర్పు రక్త భాగంలో స్వల్పంగా మాత్రమే సమృద్ధిగా ఉందని సూచిస్తుంది. వెబ్లోగో16 సాఫ్ట్‌వేర్ యొక్క అనుసరణను ఉపయోగించి ప్రతి స్థానంలో అమైనో ఆమ్ల పౌనఃపున్యాలు మరియు ఏకాభిప్రాయ క్రమాలను మరింతగా విశ్లేషించడం జరిగింది. ఆసక్తికరంగా, రక్తంలో గ్లైసిన్ అవశేషాలు అధికంగా ఉన్నట్లు మేము కనుగొన్నాము (పటం 1g). రక్తాన్ని CSF నుండి ఎంపిక చేసిన క్లోన్‌లతో పోల్చినప్పుడు, మోటిఫ్‌ల యొక్క బలమైన ఎంపిక మరియు కొంత తిరస్కరణ గమనించబడ్డాయి (పటం 1f), మరియు కొన్ని అమైనో ఆమ్లాలు 12-మెంబర్‌లో ముందుగా నిర్ణయించిన స్థానాలలో ప్రాధాన్యతతో ఉన్నాయి (పటం 1h). ముఖ్యంగా, సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవంలో ప్రతి జంతువు గణనీయంగా విభిన్నంగా ఉంది, అయితే రెండు జంతువులలోనూ రక్తంలో గ్లైసిన్ అధికంగా ఉన్నట్లు గమనించబడింది (అనుబంధ పటం 4a–j). జంతువులు #1.1 మరియు #1.2 యొక్క సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవంలోని సీక్వెన్స్ డేటాను కఠినంగా ఫిల్టర్ చేసిన తర్వాత, మొత్తం 964 మరియు 420 ప్రత్యేకమైన 12-మెర్ పెప్టైడ్‌లు పొందబడ్డాయి (అనుబంధ పటం 1d–e). వేరుచేసిన ఫేజ్ క్లోన్‌లను విస్తరించి, రెండవ రౌండ్ ఇన్ వివో ఎంపికకు గురిచేయడం జరిగింది. రెండవ దశ ఎంపిక నుండి సంగ్రహించిన ఫేజ్‌లను ప్రతి జంతువులో HTSకు గురిచేసి, గుర్తించబడిన అన్ని పెప్టైడ్‌లను ట్రైపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌ల ఉనికిని విశ్లేషించడానికి ఒక మోటిఫ్ రికగ్నిషన్ ప్రోగ్రామ్‌కు ఇన్‌పుట్‌గా ఉపయోగించారు (పటం 2a, b, ef). CSF నుండి తిరిగి పొందిన ఫేజ్ యొక్క మొదటి చక్రంతో పోలిస్తే, బ్రాంచ్‌లు A మరియు B లలో CSFలో అనేక మోటిఫ్‌ల యొక్క మరింత ఎంపిక మరియు తిరస్కరణను మేము గమనించాము (పటం 2). అవి స్థిరమైన సీక్వెన్స్ యొక్క విభిన్న నమూనాలను సూచిస్తున్నాయో లేదో నిర్ధారించడానికి ఒక నెట్‌వర్క్ ఐడెంటిఫికేషన్ అల్గోరిథంను ఉపయోగించారు. ప్రత్యామ్నాయ క్లేడ్ A (పటం 2c, d) మరియు క్లేడ్ B (పటం 2g, h) లలో CSF ద్వారా తిరిగి పొందిన 12-డైమెన్షనల్ సీక్వెన్స్‌ల మధ్య స్పష్టమైన సారూప్యత గమనించబడింది. ప్రతి బ్రాంచ్‌లోని పూల్డ్ విశ్లేషణ 12-మెర్ పెప్టైడ్‌ల కోసం విభిన్న ఎంపిక ప్రొఫైల్‌లను (సప్లిమెంటరీ పటం 5c,d) మరియు మొదటి దశ ఎంపికతో పోలిస్తే రెండవ దశ ఎంపిక తర్వాత పూల్డ్ క్లోన్‌ల కోసం కాలక్రమేణా CSF/బ్లడ్ టైటర్ నిష్పత్తిలో పెరుగుదలను (సప్లిమెంటరీ పటం 5e) వెల్లడించింది.
ఇన్ వివో ఫంక్షనల్ ఫేజ్ డిస్ప్లే సెలక్షన్ యొక్క రెండు వరుస దశల ద్వారా సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్‌లో మోటిఫ్‌లు మరియు పెప్టైడ్‌ల సుసంపన్నత.
ప్రతి జంతువు (జంతువులు #1.1 మరియు #1.2) యొక్క మొదటి రౌండ్ నుండి సేకరించిన అన్ని సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్ ఫేజ్‌లను కలిపి, వృద్ధి చేసి, HT-సీక్వెన్స్ చేసి, తిరిగి 2 SM కాన్యులేటెడ్ ఎలుకలలోకి (ఒక జంతువుకు 2 x 10¹⁰ ఫేజ్‌లు) ఇంజెక్ట్ చేశారు (#1.1 → #2.1 మరియు 2.2, #1.2 → 2.3 మరియు 2.4). (ఎ,బి,ఇ,ఎఫ్) మొదటి మరియు రెండవ ఎంపిక రౌండ్‌లలోని అన్ని CSF-ఉత్పన్న ఫేజ్‌ల యొక్క ట్రైపెప్టైడ్ మోటిఫ్‌ల సాపేక్ష పౌనఃపున్యాన్ని పోల్చే సహసంబంధ స్కాటర్‌ప్లాట్‌లు. రెండు ఓరియెంటేషన్‌లలోని పెప్టైడ్‌లలో కనిపించే, సాధ్యమయ్యే అన్ని అతివ్యాప్త ట్రైపెప్టైడ్‌లను సూచించే మోటిఫ్‌ల సాపేక్ష పౌనఃపున్యం మరియు పంపిణీ. 1000 రీడింగ్‌లలో కనుగొనబడిన మోటిఫ్‌ల సంఖ్య చూపబడింది. పోల్చబడిన లైబ్రరీలలో ఒకదానిలో గణనీయంగా (p < 0.001) ఎంపిక చేయబడిన లేదా మినహాయించబడిన మోటిఫ్‌లు ఎరుపు చుక్కలతో హైలైట్ చేయబడ్డాయి. (సి, డి, జి, హెచ్) ఇన్ వివో ఎంపిక యొక్క 2వ మరియు 1వ రౌండ్‌ల ఆధారంగా అన్ని CSF-సమృద్ధిగా ఉన్న 12 అమైనో ఆమ్లాల పొడవైన సీక్వెన్స్‌ల యొక్క సీక్వెన్స్ లోగో ప్రాతినిధ్యం. ఒక-అక్షర కోడ్ యొక్క పరిమాణం, ఆ స్థానంలో ఆ అమైనో ఆమ్లం ఎంత తరచుగా సంభవిస్తుందో సూచిస్తుంది. లోగోను సూచించడానికి, రెండు ఎంపిక రౌండ్‌ల మధ్య వ్యక్తిగత జంతువుల నుండి సంగ్రహించిన CSF సీక్వెన్స్‌ల ఫ్రీక్వెన్సీని పోల్చారు మరియు రెండవ రౌండ్‌లో సమృద్ధి చెందిన సీక్వెన్స్‌లను చూపించారు: (సి) #1.1–#2.1 (డి) #1.1–#2.2 (జి) #1.2–#2.3 మరియు (హెచ్) #1.2–#2.4. (సి, డి) జంతువులు నం. 2.1 మరియు నం. 2.2 లేదా (జి, హెచ్) జంతువులు నం. 2.3 మరియు నం. 2.4 లలో ఒక నిర్దిష్ట స్థానంలో అత్యంత సమృద్ధి చెందిన అమైనో ఆమ్లాలను రంగులో చూపించారు. ఆకుపచ్చ = పోలార్, ఊదా = న్యూట్రల్, నీలం = బేసిక్, ఎరుపు = ఆమ్ల మరియు నలుపు = హైడ్రోఫోబిక్ అమైనో ఆమ్లాలు.
మూడవ రౌండ్ ఎంపిక తర్వాత, మేము రెండు జంతువుల నుండి వేరుచేయబడిన 332 CSF-పునఃనిర్మిత ఫేజ్ క్లోన్‌ల నుండి 124 ప్రత్యేక పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌లను (#3.1 మరియు #3.2) గుర్తించాము (అనుబంధ చిత్రం 6a). LGSVS సీక్వెన్స్ (18.7%) అత్యధిక సాపేక్ష నిష్పత్తిని కలిగి ఉంది, దాని తర్వాత వైల్డ్-టైప్ ఇన్సర్ట్‌లు PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), మరియు SARGSWREIVSLS (2.2%) ఉన్నాయి. చివరి నాల్గవ రౌండ్‌లో, మేము మూడు వేర్వేరు జంతువుల నుండి స్వతంత్రంగా ఎంపిక చేయబడిన రెండు శాఖలను కలిపాము (చిత్రం 1c). CSF నుండి తిరిగి పొందిన 925 సీక్వెన్స్ చేయబడిన ఫేజ్ క్లోన్‌లలో, నాల్గవ రౌండ్‌లో మేము 64 ప్రత్యేక పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌లను కనుగొన్నాము (అనుబంధ చిత్రం 6b), వాటిలో వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ యొక్క సాపేక్ష నిష్పత్తి 0.8%కి పడిపోయింది. నాల్గవ రౌండ్‌లో అత్యంత సాధారణ CSF క్లోన్‌లు LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) మరియు RLSSVDSDLSGC (3.2%). ఎంపిక చేయబడిన పెప్టైడ్‌ల పొడవు పరిధికి కారణం, NNK లైబ్రరీ రూపకల్పన కోసం డిజనరేట్ కోడాన్‌లను ఉపయోగించినప్పుడు లైబ్రరీ ప్రైమర్‌లలో న్యూక్లియోటైడ్ చొప్పించడం/తొలగించడం లేదా అకాల స్టాప్ కోడాన్‌లు ఉండటమే. అకాల స్టాప్ కోడాన్‌లు చిన్న పెప్టైడ్‌లను ఉత్పత్తి చేస్తాయి మరియు అవి అనుకూలమైన aa మోటిఫ్‌ను కలిగి ఉన్నందున ఎంపిక చేయబడతాయి. సింథటిక్ లైబ్రరీల ప్రైమర్‌లలో చొప్పించడం/తొలగించడం వల్ల పొడవైన పెప్టైడ్‌లు ఏర్పడవచ్చు. ఇది రూపొందించిన స్టాప్ కోడాన్‌ను ఫ్రేమ్ వెలుపల ఉంచుతుంది మరియు దాని దిగువన కొత్త స్టాప్ కోడాన్ కనిపించే వరకు దానిని చదువుతుంది. సాధారణంగా, మేము ఇన్‌పుట్ డేటాను నమూనా అవుట్‌పుట్ డేటాతో పోల్చడం ద్వారా నాలుగు ఎంపిక రౌండ్‌లన్నింటికీ ఎన్‌రిచ్‌మెంట్ కారకాలను లెక్కించాము. స్క్రీనింగ్ యొక్క మొదటి దశలో, మేము వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్ టైటర్లను ఒక నిర్దిష్టేతర నేపథ్య సూచనగా ఉపయోగించాము. ఆసక్తికరంగా, మొదటి CSF చక్రంలో ప్రతికూల ఫేజ్ ఎంపిక చాలా బలంగా ఉంది, కానీ రక్తంలో లేదు (పటం 3a). దీనికి కారణం, పెప్టైడ్ లైబ్రరీలోని చాలా సభ్యులు CSF భాగంలోకి నిష్క్రియాత్మకంగా వ్యాపించే సంభావ్యత తక్కువగా ఉండటం లేదా బాక్టీరియోఫేజ్‌లతో పోలిస్తే సాపేక్ష ఫేజ్‌లు రక్తప్రవాహం నుండి మరింత సమర్థవంతంగా నిలుపుదల చేయబడటం లేదా తొలగించబడటం కావచ్చు. అయితే, ప్యానింగ్ యొక్క రెండవ దశలో, రెండు క్లేడ్‌లలోనూ CSFలో ఫేజ్‌ల యొక్క బలమైన ఎంపిక గమనించబడింది. ఇది, CSF గ్రహణాన్ని ప్రోత్సహించే పెప్టైడ్‌లను ప్రదర్శించే ఫేజ్‌లతో మునుపటి దశ సమృద్ధమైందని సూచిస్తుంది (పటం 3a). మళ్ళీ, రక్తంలో గణనీయమైన సమృద్ధత లేకుండానే ఇది జరిగింది. అలాగే మూడవ మరియు నాల్గవ దశలలో, ఫేజ్ క్లోన్‌లు CSFలో గణనీయంగా సమృద్ధమయ్యాయి. చివరి రెండు దశల ఎంపికల మధ్య ప్రతి ప్రత్యేక పెప్టైడ్ శ్రేణి యొక్క సాపేక్ష పౌనఃపున్యాన్ని పోల్చి చూసినప్పుడు, నాల్గవ దశ ఎంపికలో శ్రేణులు మరింత సమృద్ధమయ్యాయని మేము కనుగొన్నాము (పటం 3b). రెండు పెప్టైడ్ విన్యాసాలను ఉపయోగించి, మొత్తం 64 ప్రత్యేక పెప్టైడ్ శ్రేణుల నుండి 931 ట్రైపెప్టైడ్ మూలాంశాలు సంగ్రహించబడ్డాయి. ఇంజెక్ట్ చేయబడిన లైబ్రరీతో (కట్-ఆఫ్: 10% సమృద్ధి) పోల్చి, నాల్గవ రౌండ్‌లో అత్యంత సమృద్ధి చెందిన మూలాంశాలను అన్ని రౌండ్‌లలో వాటి సమృద్ధి ప్రొఫైల్‌ల కోసం మరింత నిశితంగా పరిశీలించారు (అనుబంధ చిత్రం 6c). ఎంపిక యొక్క సాధారణ నమూనాలు, అధ్యయనం చేయబడిన చాలా మూలాంశాలు రెండు ఎంపిక శాఖల యొక్క మునుపటి అన్ని రౌండ్‌లలో సమృద్ధిగా ఉన్నాయని చూపించాయి. అయితే, కొన్ని మూలాంశాలు (ఉదా. SGL, VSG, LGS GSV) ప్రధానంగా ప్రత్యామ్నాయ క్లేడ్ A నుండి రాగా, మరికొన్ని (ఉదా. FGW, RTN, WGF, NTR) ప్రత్యామ్నాయ క్లేడ్ Bలో సమృద్ధిగా ఉన్నాయి.
CSF-సంపన్నమైన ఫేజ్-డిస్ప్లేడ్ పెప్టైడ్లు మరియు స్ట్రెప్టావిడిన్ పేలోడ్లకు సంయోగం చేయబడిన బయోటినిలేటెడ్ లీడర్ పెప్టైడ్ల యొక్క CSF రవాణా ధ్రువీకరణ.
(ఎ) ఇంజెక్ట్ చేయబడిన (ఇన్‌పుట్ = I) ఫేజ్ (PFU) టైటర్లు మరియు నిర్ధారించబడిన CSF ఫేజ్ టైటర్ల (అవుట్‌పుట్ = O) ఆధారంగా నాలుగు రౌండ్లలో (R1-R4) లెక్కించబడిన సమృద్ధి నిష్పత్తులు. చివరి మూడు రౌండ్ల (R2-R4) సమృద్ధి కారకాలు, బరువు డేటాతో మునుపటి రౌండ్ మరియు మొదటి రౌండ్ (R1)తో పోల్చడం ద్వారా లెక్కించబడ్డాయి. తెరిచిన బార్‌లు సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్, నీడ ఉన్న బార్‌లు ప్లాస్మా. (***p<0.001, స్టూడెంట్స్ t-టెస్ట్ ఆధారంగా). (బి) ఎంపిక యొక్క 4వ రౌండ్ తర్వాత CSFలో సేకరించిన అన్ని ఫేజ్‌లకు వాటి సాపేక్ష నిష్పత్తి ప్రకారం ర్యాంక్ చేయబడిన, అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్న ఫేజ్ పెప్టైడ్‌ల జాబితా. అత్యంత సాధారణమైన ఆరు ఫేజ్ క్లోన్‌లు రంగులో హైలైట్ చేయబడ్డాయి, వాటికి సంఖ్యలు ఇవ్వబడ్డాయి మరియు ఎంపిక యొక్క 3 మరియు 4వ రౌండ్‌ల మధ్య వాటి సమృద్ధి కారకాలు (ఇన్‌సెట్‌లు) చూపబడ్డాయి. (సి,డి) 4వ రౌండ్ నుండి అత్యంత సమృద్ధి చెందిన ఆరు ఫేజ్ క్లోన్‌లు, ఖాళీ ఫేజ్ మరియు పేరెంటల్ ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీలు ఒక CSF శాంప్లింగ్ మోడల్‌లో విడివిడిగా విశ్లేషించబడ్డాయి. సూచించిన సమయాల్లో CSF మరియు రక్త నమూనాలను సేకరించారు. (c) 6 అభ్యర్థి ఫేజ్ క్లోన్‌లు (2 x 10¹⁰ ఫేజ్‌లు/జంతువులు), ఖాళీ ఫేజ్‌లు (#1779) (2 x 10¹⁰ ఫేజ్‌లు/జంతువులు) మరియు స్టాక్ ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీలు (2 x 10¹² ఫేజ్‌లు/జంతువులు) సమాన పరిమాణంలో తీసుకుని, కనీసం 3 CM లను తోక సిర ద్వారా విడివిడిగా కాన్యులేటెడ్ జంతువుకు ఇంజెక్ట్ చేస్తారు. ఇంజెక్ట్ చేసిన ప్రతి ఫేజ్ క్లోన్ మరియు ఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీ యొక్క CSF ఫార్మకోకైనటిక్స్ కాలక్రమేణా చూపబడింది. (d) నమూనా సేకరణ సమయంలో తిరిగి పొందిన అన్ని ఫేజ్‌లు/mL యొక్క సగటు CSF/రక్త నిష్పత్తిని చూపుతుంది. (e) నాలుగు సింథటిక్ లీడర్ పెప్టైడ్‌లు మరియు ఒక స్క్ర్యాంబుల్డ్ కంట్రోల్‌ను వాటి N-టెర్మినస్ (టెట్రామర్ డిస్‌ప్లే) ద్వారా బయోటిన్‌తో స్ట్రెప్టావిడిన్‌కు అనుసంధానించి, ఆ తర్వాత ఇంజెక్ట్ చేశారు (తోక సిర iv, 10 mg స్ట్రెప్టావిడిన్/kg). కనీసం మూడు ఇంట్యూబేటెడ్ ఎలుకలు (N = 3). సూచించిన సమయాల్లో CSF నమూనాలను సేకరించి, CSF యాంటీ-స్ట్రెప్టావిడిన్ ELISA ద్వారా స్ట్రెప్టావిడిన్ గాఢతలను కొలిచారు (nd = గుర్తించబడలేదు). (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, ANOVA పరీక్ష ఆధారంగా). (f) అత్యంత సమృద్ధమైన ఫేజ్ పెప్టైడ్ క్లోన్ #2002 (ఊదా రంగు) యొక్క అమైనో ఆమ్ల శ్రేణిని, 4వ రౌండ్ ఎంపిక నుండి ఎంచుకున్న ఇతర ఫేజ్ పెప్టైడ్ క్లోన్‌లతో పోల్చడం. ఒకేలాంటి మరియు సారూప్య అమైనో ఆమ్ల శకలాలు రంగులతో సూచించబడ్డాయి.
నాల్గవ రౌండ్‌లో (పటం 3బి) సుసంపన్నం చేయబడిన అన్ని ఫేజ్‌ల నుండి, CSF నమూనా నమూనాలో తదుపరి వ్యక్తిగత విశ్లేషణ కోసం ఆరు అభ్యర్థి క్లోన్‌లను ఎంపిక చేశారు. ఆరు అభ్యర్థి ఫేజ్‌లు, ఖాళీ ఫేజ్ (ఇన్‌సర్ట్ లేనిది) మరియు ప్రోఫేజ్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీలను సమాన పరిమాణంలో మూడు కాన్యులేటెడ్ CM జంతువులలోకి ఇంజెక్ట్ చేశారు, మరియు CSF (పటం 3సి) మరియు రక్త (అనుబంధ పటం 7) పరీక్షలలో ఫార్మకోకైనటిక్స్‌ను నిర్ధారించారు. పరీక్షించిన అన్ని ఫేజ్ క్లోన్‌లు, ఖాళీ కంట్రోల్ ఫేజ్ (#1779) కంటే 10-1000 రెట్లు అధిక స్థాయిలో CSF విభాగాన్ని లక్ష్యంగా చేసుకున్నాయి. ఉదాహరణకు, క్లోన్‌లు #2020 మరియు #2077 కంట్రోల్ ఫేజ్ కంటే సుమారు 1000 రెట్లు అధిక CSF టైటర్లను కలిగి ఉన్నాయి. ఎంపిక చేసిన ప్రతి పెప్టైడ్ యొక్క ఫార్మకోకైనటిక్ ప్రొఫైల్ భిన్నంగా ఉంటుంది, కానీ వాటన్నింటికీ అధిక CSF హోమింగ్ సామర్థ్యం ఉంది. క్లోన్‌లు #1903 మరియు #2011 విషయంలో కాలక్రమేణా స్థిరమైన తగ్గుదలని మేము గమనించాము, అయితే క్లోన్‌లు #2077, #2002 మరియు #2009 విషయంలో మొదటి 10 నిమిషాలలో పెరుగుదల క్రియాశీల రవాణాను సూచించవచ్చు కానీ దానిని ధృవీకరించవలసి ఉంది. క్లోన్‌లు #2020, #2002, మరియు #2077 అధిక స్థాయిలలో స్థిరపడ్డాయి, అయితే క్లోన్ #2009 యొక్క CSF గాఢత ప్రారంభ పెరుగుదల తర్వాత నెమ్మదిగా తగ్గింది. ఆ తర్వాత మేము ప్రతి CSF అభ్యర్థి యొక్క సాపేక్ష పౌనఃపున్యాన్ని దాని రక్త గాఢతతో పోల్చాము (పటం 3డి). అన్ని నమూనా సేకరణ సమయాలలో ప్రతి CSF అభ్యర్థి యొక్క సగటు టైటర్‌కు మరియు దాని రక్త టైటర్‌కు మధ్య ఉన్న సహసంబంధం, ఆరుగురు అభ్యర్థులలో ముగ్గురు రక్త CSFలో గణనీయంగా సమృద్ధి చెందారని చూపించింది. ఆసక్తికరంగా, క్లోన్ #2077 అధిక రక్త స్థిరత్వాన్ని ప్రదర్శించింది (అనుబంధ పటం 7). ఫేజ్ కణాలతో పాటు ఇతర కార్గోను కూడా పెప్టైడ్‌లు స్వయంగా CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి చురుకుగా రవాణా చేయగలవని నిర్ధారించడానికి, మేము ఫేజ్ కణానికి పెప్టైడ్‌లు అతుక్కునే N-టెర్మినస్ వద్ద బయోటిన్‌తో ఉత్పన్నమైన నాలుగు లీడర్ పెప్టైడ్‌లను సంశ్లేషించాము. బయోటిన్‌తో కూడిన పెప్టైడ్‌లను (నం. 2002, 2009, 2020 మరియు 2077) ఫేజ్ జ్యామితిని కొంతవరకు అనుకరించే మల్టీమెరిక్ రూపాలను పొందడానికి స్ట్రెప్టావిడిన్ (SA)తో సంయోగం చేసాము. ఈ ఫార్మాట్, కార్గో-రవాణా చేసే ప్రోటీన్ పెప్టైడ్‌లుగా రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవంలో SA ఎక్స్‌పోజర్‌ను కొలవడానికి కూడా మాకు వీలు కల్పించింది. ముఖ్యంగా, ఈ SA-సంయోగం చేయబడిన ఫార్మాట్‌లో సింథటిక్ పెప్టైడ్‌లను ఇచ్చినప్పుడు ఫేజ్ డేటాను తరచుగా పునరుత్పత్తి చేయగలిగాము (Fig. 3e). స్క్ర్యాంబుల్డ్ పెప్టైడ్‌లు తక్కువ ప్రారంభ ఎక్స్‌పోజర్‌ను మరియు వేగవంతమైన CSF క్లియరెన్స్‌ను కలిగి ఉండి, 48 గంటలలోపు గుర్తించలేని స్థాయిలకు చేరుకున్నాయి. ఈ పెప్టైడ్ ఫేజ్ క్లోన్‌లు CSF ప్రదేశంలోకి చేరే మార్గాల గురించి అవగాహన పొందడానికి, ఇన్ వివోలో సిరల ద్వారా ఇంజెక్ట్ చేసిన 1 గంట తర్వాత ఫేజ్ కణాలను నేరుగా గుర్తించడానికి ఇమ్యునోహిస్టోకెమిస్ట్రీ (IHC)ని ఉపయోగించి, ప్రతి ఫేజ్ పెప్టైడ్ యొక్క స్థానాన్ని మేము విశ్లేషించాము. ముఖ్యంగా, క్లోన్‌లు #2002, #2077, మరియు #2009 మెదడులోని కేశనాళికలలో బలమైన రంగుతో గుర్తించబడ్డాయి, అయితే కంట్రోల్ ఫేజ్ (#1779) మరియు క్లోన్ #2020 గుర్తించబడలేదు (అనుబంధ చిత్రం 8). ఈ పెప్టైడ్‌లు BBBని దాటడం ద్వారానే మెదడుపై ప్రభావాన్ని చూపుతాయని ఇది సూచిస్తుంది. BSCFB మార్గం కూడా ఇందులో పాలుపంచుకోవచ్చు కాబట్టి, ఈ పరికల్పనను పరీక్షించడానికి మరింత వివరణాత్మక విశ్లేషణ అవసరం. అత్యంత సమృద్ధిగా ఉన్న క్లోన్ (#2002) యొక్క అమైనో ఆమ్ల శ్రేణిని ఇతర ఎంపిక చేసిన పెప్టైడ్‌లతో పోల్చినప్పుడు, వాటిలో కొన్ని సారూప్య అమైనో ఆమ్ల విస్తరణలను కలిగి ఉన్నాయని గమనించబడింది, ఇది సారూప్య రవాణా యంత్రాంగాన్ని సూచించవచ్చు (చిత్రం 3f).
దాని ప్రత్యేకమైన ప్లాస్మా ప్రొఫైల్ మరియు కాలక్రమేణా CSFలో గణనీయమైన పెరుగుదల కారణంగా, ఫేజ్ డిస్‌ప్లే క్లోన్ #2077ను 48 గంటల సుదీర్ఘ కాలం పాటు మరింతగా పరిశోధించగా, స్థిరమైన SA స్థాయిలతో సంబంధం కలిగి ఉన్నట్లు గమనించిన CSFలోని వేగవంతమైన పెరుగుదలను ఇది పునరుత్పత్తి చేయగలిగింది (పటం 4a). గుర్తించబడిన ఇతర ఫేజ్ క్లోన్‌ల విషయానికొస్తే, #2077 మెదడులోని కేశనాళికలకు బలంగా రంగును అద్దింది మరియు అధిక రిజల్యూషన్‌లో చూసినప్పుడు కేశనాళిక మార్కర్ లెక్టిన్‌తో గణనీయమైన సహ-స్థానీకరణను, అలాగే పారెన్‌కైమల్ ప్రదేశంలో కూడా కొంత రంగును అద్దడాన్ని చూపించింది (పటం 4b). CNSలో పెప్టైడ్-మధ్యవర్తిత్వ ఔషధ ప్రభావాలను పొందవచ్చో లేదో పరిశోధించడానికి, మేము ఒక ప్రయోగాన్ని నిర్వహించాము. దీనిలో i) #2077 ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్ మరియు ii) BACE1 ఇన్హిబిటర్ పెప్టైడ్ యొక్క బయోటినైలేటెడ్ వెర్షన్‌లను SAతో రెండు వేర్వేరు నిష్పత్తులలో కలిపాము. ఒక కలయిక కోసం మేము కేవలం BACE1 పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్‌ను మాత్రమే ఉపయోగించగా, మరొకదాని కోసం BACE1 పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్ మరియు #2077 పెప్టైడ్‌ల 1:3 నిష్పత్తిని ఉపయోగించాము. రెండు నమూనాలను సిరల ద్వారా ఇచ్చి, కాలక్రమేణా రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవంలోని బీటా-అమైలాయిడ్ పెప్టైడ్ 40 (Abeta40) స్థాయిలను కొలిచారు. మెదడు పారెన్‌కైమాలో BACE1 నిరోధాన్ని ఇది ప్రతిబింబిస్తుంది కాబట్టి, Abeta40ను CSFలో కొలిచారు. ఊహించినట్లుగానే, రెండు కాంప్లెక్స్‌లు రక్తంలోని Abeta40 స్థాయిలను గణనీయంగా తగ్గించాయి (పటం 4c, d). అయితే, పెప్టైడ్ నెం. 2077 మరియు SAకు సంయోగం చేయబడిన BACE1 పెప్టైడ్ యొక్క నిరోధకం యొక్క మిశ్రమాన్ని కలిగిన నమూనాలు మాత్రమే సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవంలో Abeta40లో గణనీయమైన తగ్గుదలకు కారణమయ్యాయి (పటం 4c). ఈ డేటా ప్రకారం, పెప్టైడ్ నెం. 2077, 60 kDa SA ప్రోటీన్‌ను CNSలోకి రవాణా చేయగలదని మరియు SA-సంయోగం చేయబడిన BACE1 పెప్టైడ్ నిరోధకాలతో ఔషధ ప్రభావాలను కూడా ప్రేరేపిస్తుందని తెలుస్తోంది.
(ఎ) కనీసం మూడు CM-ఇంట్యూబేటెడ్ ఎలుకలలో CSF పెప్టైడ్ #2077 (RLSSVDSDLSGC) మరియు ఇంజెక్ట్ చేయని కంట్రోల్ ఫేజ్ (#1779) యొక్క దీర్ఘకాలిక ఫార్మకోకైనటిక్ ప్రొఫైల్‌లను చూపిస్తున్న T7 ఫేజ్ యొక్క క్లోనల్ ఇంజెక్షన్ (ఒక్కో జంతువుకు 2 × 10 ఫేజ్‌లు). (బి) ఫేజ్-ఇంజెక్ట్ చేయబడిన ఎలుకలలో (ఒక్కో జంతువుకు 2 × 10 ఫేజ్‌లు) పెప్టైడ్ #2077 మరియు నాళాల (లెక్టిన్) కౌంటర్‌స్టెయినింగ్‌ను చూపిస్తున్న ప్రతినిధి కార్టికల్ మైక్రోవాస్కులర్ల కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపిక్ చిత్రం. ఈ ఫేజ్ క్లోన్‌లను 3 ఎలుకలకు ఇచ్చి, పెర్ఫ్యూజన్‌కు ముందు 1 గంట పాటు ప్రసరించడానికి అనుమతించారు. మెదళ్లను సెక్షన్ చేసి, T7 ఫేజ్ క్యాప్సిడ్‌కు వ్యతిరేకంగా పాలీక్లోనల్ FITC-లేబుల్డ్ యాంటీబాడీలతో స్టెయిన్ చేశారు. పెర్ఫ్యూజన్ మరియు తదుపరి ఫిక్సేషన్‌కు పది నిమిషాల ముందు, DyLight594-లేబుల్డ్ లెక్టిన్‌ను ఇంట్రావీనస్‌గా ఇచ్చారు. సూక్ష్మ రక్తనాళాల లోపలి వైపున లెక్టిన్ స్టెయినింగ్ (ఎరుపు రంగు) మరియు కేశనాళికల లోపలి భాగంలో మరియు రక్తనాళాల చుట్టూ ఉన్న మెదడు కణజాలంలో ఫేజ్‌లను (ఆకుపచ్చ రంగు) చూపిస్తున్న ఫ్లోరోసెంట్ చిత్రాలు. స్కేల్ బార్ 10 µm కు అనుగుణంగా ఉంటుంది. (సి, డి) బయోటినైలేటెడ్ BACE1 నిరోధక పెప్టైడ్‌ను ఒంటరిగా లేదా బయోటినైలేటెడ్ ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్ #2077తో కలిపి స్ట్రెప్టావిడిన్‌కు జతచేసి, ఆ తర్వాత కనీసం మూడు కాన్యులేటెడ్ CM ఎలుకలకు (10 mg స్ట్రెప్టావిడిన్/kg) సిరల ద్వారా ఇంజెక్ట్ చేశారు. సూచించిన సమయాల్లో రక్తం (ఎరుపు రంగు) మరియు సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవం (నారింజ రంగు)లో Aβ1-40 ELISA ద్వారా BACE1 పెప్టైడ్ నిరోధకం-మధ్యవర్తిత్వంతో Aβ40లో తగ్గుదలను కొలిచారు. మరింత స్పష్టత కోసం, గ్రాఫ్‌పై 100% స్కేల్‌లో ఒక చుక్కల గీత గీయబడింది. (c) ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్ #2077 మరియు BACE1 నిరోధక పెప్టైడ్‌కు 3:1 నిష్పత్తిలో సంయోగం చేయబడిన స్ట్రెప్టావిడిన్‌తో చికిత్స పొందిన ఎలుకలలో రక్తం (ఎరుపు త్రిభుజాలు) మరియు సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవం (నారింజ త్రిభుజాలు) లో Aβ40 శాతం తగ్గుదల. (d) కేవలం BACE1 నిరోధక పెప్టైడ్‌కు జతచేయబడిన స్ట్రెప్టావిడిన్‌తో చికిత్స పొందిన ఎలుకల రక్తం (ఎరుపు వృత్తాలు) మరియు సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవం (నారింజ వృత్తాలు) లో Aβ40 శాతం తగ్గుదల. నియంత్రణలో Aβ గాఢత 420 pg/ml (ప్రామాణిక విచలనం = 101 pg/ml).
బయోమెడికల్ పరిశోధనలోని అనేక రంగాలలో ఫేజ్ డిస్‌ప్లేను విజయవంతంగా ఉపయోగించారు¹⁷. ఈ పద్ధతిని ఇన్ వివో వాస్కులర్ డైవర్సిటీ అధ్యయనాల కోసం¹⁸,¹⁹, అలాగే సెరిబ్రల్ నాళాలను లక్ష్యంగా చేసుకున్న అధ్యయనాల కోసం²⁰,²¹,²²,²³,²⁴,²⁵,²⁶ ఉపయోగించారు. ఈ అధ్యయనంలో, మేము ఈ ఎంపిక పద్ధతి యొక్క అనువర్తనాన్ని, సెరిబ్రల్ నాళాలను లక్ష్యంగా చేసుకున్న పెప్టైడ్‌లను నేరుగా గుర్తించడానికి మాత్రమే కాకుండా, బ్లడ్-బ్రెయిన్ బారియర్‌ను దాటగల క్రియాశీల రవాణా లక్షణాలున్న అభ్యర్థులను కనుగొనడానికి కూడా విస్తరించాము. ఇప్పుడు మేము CM ఇంట్యూబేటెడ్ ఎలుకలలో ఇన్ వివో ఎంపిక ప్రక్రియ యొక్క అభివృద్ధిని వివరిస్తున్నాము మరియు CSF హోమింగ్ లక్షణాలున్న పెప్టైడ్‌లను గుర్తించడంలో దాని సామర్థ్యాన్ని ప్రదర్శిస్తున్నాము. 12-మెర్ యాదృచ్ఛిక పెప్టైడ్‌ల లైబ్రరీని ప్రదర్శించే T7 ఫేజ్‌ను ఉపయోగించి, T7 ఫేజ్ బ్లడ్-బ్రెయిన్ బారియర్‌కు అనుగుణంగా మారడానికి తగినంత చిన్నదిగా (సుమారు 60 nm వ్యాసం)¹⁰ ఉందని, తద్వారా బ్లడ్-బ్రెయిన్ బారియర్ లేదా కోరాయిడ్ ప్లెక్సస్‌ను నేరుగా దాటగలదని మేము ప్రదర్శించగలిగాము. కాన్యులేటెడ్ CM ఎలుకల నుండి CSFను సేకరించడం అనేది ఒక చక్కగా నియంత్రించబడిన ఇన్ వివో ఫంక్షనల్ స్క్రీనింగ్ పద్ధతి అని, మరియు సంగ్రహించిన ఫేజ్ రక్తనాళాలకు బంధించడమే కాకుండా, రక్త-మెదడు అవరోధం గుండా ఒక ట్రాన్స్‌పోర్టర్‌గా కూడా పనిచేస్తుందని మేము గమనించాము. అంతేకాకుండా, ఏకకాలంలో రక్తాన్ని సేకరించి, CSF మరియు రక్తం నుండి తీసిన ఫేజ్‌లకు HTSను వర్తింపజేయడం ద్వారా, ఎంపిక రౌండ్‌ల మధ్య రక్త సమృద్ధి లేదా విస్తరణ యోగ్యత ద్వారా మా CSF ఎంపిక ప్రభావితం కాలేదని మేము నిర్ధారించుకున్నాము. అయితే, రక్త భాగం ఎంపిక ప్రక్రియలో ఒక భాగం, ఎందుకంటే CSF భాగాన్ని చేరగలిగే ఫేజ్‌లు మెదడులో సమృద్ధి చెందడానికి తగినంత కాలం రక్తప్రవాహంలో జీవించి, ప్రసరించాలి. ముడి HTS డేటా నుండి విశ్వసనీయమైన సీక్వెన్స్ సమాచారాన్ని సంగ్రహించడానికి, మేము విశ్లేషణ వర్క్‌ఫ్లోలో ప్లాట్‌ఫారమ్-నిర్దిష్ట సీక్వెన్సింగ్ లోపాలకు అనుగుణంగా ఫిల్టర్‌లను అమలు చేసాము. స్క్రీనింగ్ పద్ధతిలో కైనెటిక్ పారామీటర్లను చేర్చడం ద్వారా, మేము రక్తంలో వైల్డ్-టైప్ T7 ఫేజ్‌ల వేగవంతమైన ఫార్మకోకైనెటిక్స్‌ను (t½ ~ 28 నిమిషాలు) నిర్ధారించాము²⁴,²⁷,²⁸ మరియు సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్‌లో వాటి అర్ధ-జీవిత కాలాన్ని (t½ ~ నిమిషానికి 26 నిమిషాలు) కూడా నిర్ధారించాము. రక్తం మరియు CSF లలో సారూప్య ఫార్మకోకైనెటిక్ ప్రొఫైల్స్ ఉన్నప్పటికీ, రక్తంలోని ఫేజ్ గాఢతలో కేవలం 0.001% మాత్రమే CSFలో గుర్తించబడింది, ఇది బ్లడ్-బ్రెయిన్ బారియర్ గుండా వైల్డ్-టైప్ T7 ఫేజ్ యొక్క తక్కువ బ్యాక్‌గ్రౌండ్ మొబిలిటీని సూచిస్తుంది. ఈ అధ్యయనం, ఇన్ వివో ప్యానింగ్ వ్యూహాలను ఉపయోగించేటప్పుడు, ముఖ్యంగా ప్రసరణ నుండి వేగంగా తొలగించబడే ఫేజ్ వ్యవస్థల విషయంలో, మొదటి రౌండ్ ఎంపిక యొక్క ప్రాముఖ్యతను నొక్కి చెబుతుంది, ఎందుకంటే కొన్ని క్లోన్‌లు మాత్రమే CNS విభాగానికి చేరుకోగలవు. అందువల్ల, మొదటి రౌండ్‌లో, లైబ్రరీ వైవిధ్యంలో తగ్గుదల చాలా ఎక్కువగా ఉంది, ఎందుకంటే ఈ చాలా కఠినమైన CSF నమూనాలో చివరికి పరిమిత సంఖ్యలో క్లోన్‌లు మాత్రమే సేకరించబడ్డాయి. ఈ ఇన్ వివో ప్యానింగ్ వ్యూహంలో CSF కంపార్ట్‌మెంట్‌లో చురుకైన సంచయం, రక్త కంపార్ట్‌మెంట్‌లో క్లోన్ మనుగడ, మరియు మొదటి 10 నిమిషాలలోపు రక్తం నుండి T7 ఫేజ్ క్లోన్‌లను వేగంగా తొలగించడం వంటి అనేక ఎంపిక దశలు ఉన్నాయి (Fig. 1d మరియు సప్లిమెంటరీ Fig. 4M). అందువల్ల, ప్రతి జంతువుకు ఒకే ప్రారంభ పూల్‌ను ఉపయోగించినప్పటికీ, మొదటి రౌండ్ తర్వాత, CSFలో విభిన్న ఫేజ్ క్లోన్‌లు గుర్తించబడ్డాయి. పెద్ద సంఖ్యలో లైబ్రరీ సభ్యులు ఉన్న సోర్స్ లైబ్రరీల కోసం బహుళ కఠినమైన ఎంపిక దశలు వైవిధ్యంలో గణనీయమైన తగ్గింపుకు దారితీస్తాయని ఇది సూచిస్తుంది. అందువల్ల, యాదృచ్ఛిక సంఘటనలు ప్రారంభ ఎంపిక ప్రక్రియలో అంతర్భాగంగా మారి, ఫలితాన్ని బాగా ప్రభావితం చేస్తాయి. అసలు లైబ్రరీలోని చాలా క్లోన్‌లకు చాలా సారూప్యమైన CSF సుసంపన్నత ప్రవృత్తి ఉండే అవకాశం ఉంది. అయినప్పటికీ, ఒకే రకమైన ప్రయోగాత్మక పరిస్థితులలో కూడా, ప్రారంభ పూల్‌లో ప్రతి నిర్దిష్ట క్లోన్ యొక్క తక్కువ సంఖ్య కారణంగా ఎంపిక ఫలితాలు భిన్నంగా ఉండవచ్చు.
CSFలో సమృద్ధిగా ఉన్న మూలాంశాలు రక్తంలోని వాటికి భిన్నంగా ఉంటాయి. ఆసక్తికరంగా, మేము వ్యక్తిగత జంతువుల రక్తంలో గ్లైసిన్-రిచ్ పెప్టైడ్‌ల వైపు మొదటి మార్పును గమనించాము. (Fig. 1g, సప్లిమెంటరీ Figs. 4e, 4f). గ్లైసిన్ పెప్టైడ్‌లను కలిగి ఉన్న ఫేజ్ మరింత స్థిరంగా ఉండవచ్చు మరియు ప్రసరణ నుండి బయటకు తీయబడే అవకాశం తక్కువగా ఉండవచ్చు. అయితే, ఈ గ్లైసిన్-రిచ్ పెప్టైడ్‌లు సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్ నమూనాలలో గుర్తించబడలేదు, ఇది క్యూరేటెడ్ లైబ్రరీలు రెండు వేర్వేరు ఎంపిక దశల ద్వారా వెళ్ళాయని సూచిస్తుంది: ఒకటి రక్తంలో మరియు మరొకటి సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్‌లో పేరుకుపోవడానికి అనుమతించడం. నాల్గవ రౌండ్ ఎంపిక ఫలితంగా వచ్చిన CSF-సమృద్ధి చెందిన క్లోన్‌లు విస్తృతంగా పరీక్షించబడ్డాయి. వ్యక్తిగతంగా పరీక్షించిన దాదాపు అన్ని క్లోన్‌లు ఖాళీ కంట్రోల్ ఫేజ్‌తో పోలిస్తే CSFలో సమృద్ధిగా ఉన్నాయని నిర్ధారించబడ్డాయి. ఒక పెప్టైడ్ హిట్ (#2077) మరింత వివరంగా పరిశీలించబడింది. ఇతర హిట్‌లతో పోలిస్తే ఇది ఎక్కువ ప్లాస్మా హాఫ్-లైఫ్‌ను చూపించింది (చిత్రం 3డి మరియు అనుబంధ చిత్రం 7), మరియు ఆసక్తికరంగా, ఈ పెప్టైడ్ C-టెర్మినస్‌లో సిస్టీన్ అవశేషాన్ని కలిగి ఉంది. పెప్టైడ్‌లకు సిస్టీన్‌ను జోడించడం వల్ల అల్బుమిన్ 29 కు బంధించడం ద్వారా వాటి ఫార్మకోకైనెటిక్ లక్షణాలను మెరుగుపరచవచ్చని ఇటీవల చూపబడింది. ఇది ప్రస్తుతం పెప్టైడ్ #2077 విషయంలో తెలియదు మరియు దీనికి మరింత అధ్యయనం అవసరం. కొన్ని పెప్టైడ్‌లు CSF ఎన్‌రిచ్‌మెంట్‌లో వాలెన్స్-డిపెండెన్సీని చూపించాయి (డేటా చూపబడలేదు), ఇది T7 క్యాప్సిడ్ యొక్క ప్రదర్శిత ఉపరితల జ్యామితితో సంబంధం కలిగి ఉండవచ్చు. మేము ఉపయోగించిన T7 వ్యవస్థ ప్రతి ఫేజ్ కణానికి ప్రతి పెప్టైడ్ యొక్క 5-15 కాపీలను చూపించింది. ఎలుకల సెరిబ్రల్ కార్టెక్స్‌లోకి ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేయబడిన కాండిడేట్ లీడ్ ఫేజ్ క్లోన్‌లపై IHC నిర్వహించబడింది (అనుబంధ చిత్రం 8). కనీసం మూడు క్లోన్‌లు (నం. 2002, నం. 2009 మరియు నం. 2077) BBBతో సంకర్షణ చెందాయని డేటా చూపించింది. ఈ BBB పరస్పర చర్య ఫలితంగా CSF పేరుకుపోతుందా లేదా ఈ క్లోన్‌లు నేరుగా BCSFBకి కదులుతాయా అనేది ఇంకా నిర్ధారించాల్సి ఉంది. ముఖ్యంగా, ఎంచుకున్న పెప్టైడ్‌లు సంశ్లేషణ చేయబడి, ప్రోటీన్ కార్గోకు బంధించబడినప్పుడు వాటి CSF రవాణా సామర్థ్యాన్ని నిలుపుకుంటాయని మేము చూపిస్తున్నాము. N-టెర్మినల్ బయోటినైలేటెడ్ పెప్టైడ్‌లు SAకు బంధించడం అనేది, రక్తం మరియు సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవంలో వాటి సంబంధిత ఫేజ్ క్లోన్‌లతో పొందిన ఫలితాలను ప్రాథమికంగా పునరావృతం చేస్తుంది (Fig. 3e). చివరగా, లీడ్ పెప్టైడ్ #2077, SAకు సంయోగం చేయబడిన BACE1 యొక్క బయోటినైలేటెడ్ పెప్టైడ్ ఇన్హిబిటర్ యొక్క మెదడు చర్యను ప్రోత్సహించగలదని, CSFలో Abeta40 స్థాయిలను గణనీయంగా తగ్గించడం ద్వారా CNSలో స్పష్టమైన ఫార్మకోడైనమిక్ ప్రభావాలను కలిగిస్తుందని మేము చూపిస్తున్నాము (Fig. 4). అన్ని హిట్‌లపై పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్ హోమోలజీ శోధనను నిర్వహించడం ద్వారా మేము డేటాబేస్‌లో ఎలాంటి హోమోలాగ్‌లను గుర్తించలేకపోయాము. T7 లైబ్రరీ పరిమాణం సుమారుగా 10⁹ కాగా, 12-మెర్‌ల కోసం సిద్ధాంతపరమైన లైబ్రరీ పరిమాణం 4 x 10¹⁵ అని గమనించడం ముఖ్యం. అందువల్ల, మేము 12-మెర్ పెప్టైడ్ లైబ్రరీ యొక్క వైవిధ్య ప్రదేశంలో ఒక చిన్న భాగాన్ని మాత్రమే ఎంచుకున్నాము, దీని అర్థం ఈ గుర్తించబడిన హిట్‌ల యొక్క ప్రక్కనే ఉన్న సీక్వెన్స్ స్పేస్‌ను మూల్యాంకనం చేయడం ద్వారా మరింత ఆప్టిమైజ్ చేయబడిన పెప్టైడ్‌లను గుర్తించవచ్చు. ఊహాజనితంగా, ఈ పెప్టైడ్‌ల యొక్క సహజ హోమోలాగ్‌లను మేము కనుగొనకపోవడానికి గల కారణాలలో ఒకటి, కొన్ని పెప్టైడ్ మోటిఫ్‌లు మెదడులోకి అనియంత్రితంగా ప్రవేశించకుండా నిరోధించడానికి పరిణామ క్రమంలో జరిగిన డీసెలెక్షన్ కావచ్చు.
మొత్తంగా చూస్తే, మా ఫలితాలు ఇన్ వివోలో సెరెబ్రోవాస్కులర్ అవరోధం యొక్క రవాణా వ్యవస్థలను మరింత వివరంగా గుర్తించడానికి మరియు వర్గీకరించడానికి భవిష్యత్ పరిశోధనలకు ఒక ఆధారాన్ని అందిస్తాయి. ఈ పద్ధతి యొక్క ప్రాథమిక ఏర్పాటు ఒక క్రియాత్మక ఎంపిక వ్యూహంపై ఆధారపడి ఉంటుంది. ఇది సెరెబ్రల్ వాస్కులర్ బైండింగ్ లక్షణాలు కలిగిన క్లోన్‌లను గుర్తించడమే కాకుండా, విజయవంతమైన క్లోన్‌లు ఇన్ వివోలో జీవసంబంధ అవరోధాలను దాటి CNS కంపార్ట్‌మెంట్‌లోకి ప్రవేశించడానికి అంతర్గత క్రియాశీలతను కలిగి ఉండే ఒక కీలకమైన దశను కూడా కలిగి ఉంటుంది. ఈ పెప్టైడ్‌ల రవాణా యంత్రాంగాన్ని మరియు మెదడు ప్రాంతానికి ప్రత్యేకమైన మైక్రోవాస్కులేచర్‌కు బైండింగ్ అయ్యే వాటి ప్రాధాన్యతను స్పష్టం చేయడమే దీని లక్ష్యం. ఇది BBB మరియు గ్రాహకాల రవాణా కోసం కొత్త మార్గాల ఆవిష్కరణకు దారితీయవచ్చు. గుర్తించబడిన పెప్టైడ్‌లు నేరుగా సెరెబ్రోవాస్కులర్ గ్రాహకాలకు లేదా BBB లేదా BCSFB ద్వారా రవాణా చేయబడిన ప్రసరణ లిగాండ్‌లకు బంధించగలవని మేము ఆశిస్తున్నాము. ఈ పరిశోధనలో కనుగొనబడిన CSF రవాణా క్రియాశీలత కలిగిన పెప్టైడ్ వెక్టర్స్‌పై మరింత పరిశోధన చేయబడుతుంది. మేము ప్రస్తుతం ఈ పెప్టైడ్‌లు BBB మరియు/లేదా BCSFBను దాటగల సామర్థ్యం కోసం వాటి మెదడు ప్రత్యేకతను పరిశోధిస్తున్నాము. ఈ కొత్త పెప్టైడ్‌లు, కొత్త గ్రాహకాలను లేదా మార్గాలను కనుగొనడానికి, మరియు బయోలాజిక్స్ వంటి మాక్రోమాలిక్యూల్స్‌ను మెదడుకు చేరవేయడానికి కొత్త, అత్యంత సమర్థవంతమైన ప్లాట్‌ఫారమ్‌లను అభివృద్ధి చేయడానికి చాలా విలువైన సాధనాలుగా ఉపయోగపడతాయి.
గతంలో వివరించిన పద్ధతిలో మార్పులు చేసి పెద్ద సిస్టెర్నా (CM) లోకి కాన్యులాను ప్రవేశపెట్టాలి. మత్తుమందు ఇచ్చిన విస్టార్ ఎలుకలను (200-350 గ్రా) స్టీరియోటాక్సిక్ పరికరంపై ఉంచి, పుర్రె కనిపించేలా చేయడానికి, షేవ్ చేసి క్రిమిరహితంగా సిద్ధం చేసిన తల చర్మంపై మధ్యలో కోత పెట్టాలి. పై కనుపాప ప్రాంతంలో రెండు రంధ్రాలు చేసి, ఆ రంధ్రాలలో ఫిక్సింగ్ స్క్రూలను బిగించాలి. CM లోకి స్టెయిన్‌లెస్ స్టీల్ కాన్యులాను స్టీరియోటాక్టిక్ పద్ధతిలో మార్గనిర్దేశం చేయడానికి, పార్శ్వ ఆక్సిపిటల్ క్రెస్ట్‌లో అదనంగా ఒక రంధ్రం చేయాలి. కాన్యులా చుట్టూ డెంటల్ సిమెంట్ పూసి, స్క్రూలతో భద్రపరచాలి. ఫోటో-క్యూరింగ్ మరియు సిమెంట్ గట్టిపడిన తర్వాత, చర్మపు గాయాన్ని 4/0 సుప్రామిడ్ సూచర్‌తో కుట్టాలి. సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్ (CSF) దానంతట అదే లీక్ అవ్వడం ద్వారా కాన్యులా సరైన స్థానంలో ఉందని నిర్ధారించుకోవాలి. ఎలుకను స్టీరియోటాక్సిక్ పరికరం నుండి తీసివేసి, తగిన శస్త్రచికిత్స అనంతర సంరక్షణ మరియు నొప్పి నివారణను అందించి, సెరెబ్రోస్పైనల్ ఫ్లూయిడ్‌లో రక్తపు ఆనవాళ్లు కనిపించే వరకు కనీసం ఒక వారం పాటు కోలుకోవడానికి అనుమతించాలి. విస్టార్ ఎలుకలను (Crl:WI/Han) చార్లెస్ రివర్ (ఫ్రాన్స్) నుండి పొందారు. అన్ని ఎలుకలను నిర్దిష్ట వ్యాధికారక-రహిత పరిస్థితులలో ఉంచారు. అన్ని జంతు ప్రయోగాలకు స్విట్జర్లాండ్‌లోని బాసెల్ నగర పశువైద్య కార్యాలయం ఆమోదం తెలిపింది మరియు జంతు లైసెన్స్ నెం. 2474 (ఎలుక యొక్క సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవం మరియు మెదడులో చికిత్సా అభ్యర్థుల స్థాయిలను కొలవడం ద్వారా క్రియాశీల మెదడు రవాణా యొక్క అంచనా)కు అనుగుణంగా నిర్వహించబడ్డాయి.
చేతిలో CM కాన్యులాను పట్టుకుని, ఎలుకను మెల్లగా స్పృహలో ఉంచండి. కాన్యులా నుండి దతూరాను తీసివేసి, దానంతట అదే ప్రవహించే 10 µl సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవాన్ని సేకరించండి. కాన్యులా యొక్క ప్యాటెన్సీ చివరికి దెబ్బతిన్నందున, రక్తం కలుషితమైన లేదా రంగు మారిన ఆనవాళ్లు లేని స్పష్టమైన సెరెబ్రోస్పైనల్ ద్రవ నమూనాలను మాత్రమే ఈ అధ్యయనంలో చేర్చారు. అదే సమయంలో, తోక చివరన ఒక చిన్న కోత నుండి సుమారు 10–20 μl రక్తాన్ని హెపారిన్ (సిగ్మా-ఆల్డ్రిచ్) ఉన్న ట్యూబులలోకి తీసుకున్నారు. T7 ఫేజ్‌ను సిరల ద్వారా ఇంజెక్ట్ చేసిన తర్వాత వివిధ సమయాల్లో CSF మరియు రక్తాన్ని సేకరించారు. ప్రతి CSF నమూనాను సేకరించే ముందు సుమారు 5–10 μl ద్రవాన్ని పారవేశారు, ఇది కాథెటర్ యొక్క డెడ్ వాల్యూమ్‌కు అనుగుణంగా ఉంటుంది.
T7Select సిస్టమ్ మాన్యువల్‌లో (నోవాజెన్, రోసెన్‌బర్గ్ మరియు ఇతరులు, ఇన్నోవేషన్స్ 6, 1-6, 1996) వివరించిన విధంగా T7Select 10-3b వెక్టర్‌ను ఉపయోగించి లైబ్రరీలు రూపొందించబడ్డాయి. క్లుప్తంగా, ఒక యాదృచ్ఛిక 12-మెర్ DNA ఇన్సర్ట్ కింది ఫార్మాట్‌లో సంశ్లేషణ చేయబడింది:
ఇన్సర్ట్‌లో డబుల్ స్టాప్ కోడాన్‌లను మరియు అమైనో ఆమ్ల అతివ్యక్తీకరణను నివారించడానికి NNK కోడాన్‌ను ఉపయోగించారు. N అనేది ప్రతి న్యూక్లియోటైడ్ యొక్క మానవీయంగా కలిపిన సమమోలార్ నిష్పత్తి, మరియు K అనేది అడెనైన్ మరియు సైటోసిన్ న్యూక్లియోటైడ్‌ల యొక్క మానవీయంగా కలిపిన సమమోలార్ నిష్పత్తి. సింగిల్ స్ట్రాండెడ్ ప్రాంతాలను, క్లెనో బఫర్ (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్)లో dNTP (నోవాజెన్) మరియు క్లెనో ఎంజైమ్ (న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్)తో 37°C వద్ద 3 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా డబుల్ స్ట్రాండెడ్ DNAగా మార్చారు. చర్య తర్వాత, EtOH అవక్షేపణ ద్వారా డబుల్-స్ట్రాండెడ్ DNAను తిరిగి పొందారు. ఫలితంగా వచ్చిన DNAను రెస్ట్రిక్షన్ ఎంజైమ్‌లైన EcoRI మరియు HindIII (రెండూ రోష్ నుండి)తో జీర్ణం చేశారు. ఆ తర్వాత, విడగొట్టి శుద్ధి చేసిన (QIAquick, Qiagen) ఇన్సర్ట్‌ను (T4 లైగేస్, న్యూ ఇంగ్లాండ్ బయోలాబ్స్), 10B క్యాప్సిడ్ జన్యువు యొక్క 348వ అమైనో ఆమ్లం తర్వాత, ముందుగా విడగొట్టిన T7 వెక్టర్‌లోకి ఇన్-ఫ్రేమ్‌లో లైగేట్ చేశారు. ఇన్ విట్రో ప్యాకేజింగ్‌కు ముందు లైగేషన్ చర్యలను 16° C వద్ద 18 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. T7సెలెక్ట్ 10-3b క్లోనింగ్ కిట్ (నోవాజెన్)తో అందించిన సూచనల ప్రకారం ఇన్ విట్రో ఫేజ్ ప్యాకేజింగ్ నిర్వహించబడింది మరియు ప్యాకేజింగ్ ద్రావణాన్ని ఎస్చెరిచియా కోలి (BLT5615, నోవాజెన్) ఉపయోగించి లైసిస్ వరకు ఒకసారి విస్తరించారు. లైసేట్‌లను సెంట్రిఫ్యూజ్ చేసి, టైట్రేట్ చేసి, గ్లిసరాల్ యొక్క స్టాక్ ద్రావణంగా -80° C వద్ద ఘనీభవింపజేశారు.
యాజమాన్య 454/రోష్-యాంప్లికాన్ ఫ్యూజన్ ప్రైమర్‌లను ఉపయోగించి బ్రాత్ లేదా ప్లేట్‌లో యాంప్లిఫై చేయబడిన ఫేజ్ వేరియబుల్ రీజియన్‌ల యొక్క డైరెక్ట్ PCR యాంప్లిఫికేషన్. ఫార్వర్డ్ ఫ్యూజన్ ప్రైమర్ వేరియబుల్ రీజియన్ (NNK) 12 (టెంప్లేట్-నిర్దిష్ట), GS FLX టైటానియం అడాప్టర్ A, మరియు నాలుగు-బేస్ లైబ్రరీ కీ సీక్వెన్స్ (TCAG) లను ఆవరించి ఉన్న సీక్వెన్స్‌లను కలిగి ఉంటుంది (సప్లిమెంటరీ ఫిగర్ 1a):
రివర్స్ ఫ్యూజన్ ప్రైమర్‌లో క్యాప్చర్ బీడ్స్‌కు జోడించబడిన బయోటిన్ మరియు ఎమల్షన్ PCR సమయంలో క్లోనల్ యాంప్లిఫికేషన్ కోసం అవసరమైన GS FLX టైటానియం అడాప్టర్ B కూడా ఉంటాయి:
తరువాత ఆంప్లికాన్‌లను 454 GS-FLX టైటానియం ప్రోటోకాల్ ప్రకారం 454/రోష్ పైరోసీక్వెన్సింగ్‌కు గురిచేశారు. మాన్యువల్ సాంగర్ సీక్వెన్సింగ్ (అప్లైడ్ బయోసిస్టమ్స్ హిటాచీ 3730 xl DNA అనలైజర్) కోసం, T7 ఫేజ్ DNAను PCR ద్వారా విస్తరించి, ఈ క్రింది ప్రైమర్ జతలతో సీక్వెన్స్ చేశారు:
ప్రతి ప్లాక్ నుండి తీసిన ఇన్సర్ట్‌లను రోష్ ఫాస్ట్ స్టార్ట్ DNA పాలిమరేస్ కిట్ (తయారీదారు సూచనల ప్రకారం) ఉపయోగించి PCR యాంప్లిఫికేషన్‌కు గురిచేశారు. హాట్ స్టార్ట్ (95 °C వద్ద 10 నిమిషాలు) మరియు 35 బూస్ట్ సైకిల్స్ (95 °C వద్ద 50 సెకన్లు, 50 °C వద్ద 1 నిమిషం, మరియు 72 °C వద్ద 1 నిమిషం) చేయండి.
లైబ్రరీల నుండి ఫేజ్‌లు, వైల్డ్-టైప్ ఫేజ్‌లు, CSF మరియు రక్తం నుండి రక్షించబడిన ఫేజ్‌లు, లేదా వ్యక్తిగత క్లోన్‌లను ఎస్చెరిచియా కోలి BL5615లో TB బ్రాత్ (సిగ్మా ఆల్డ్రిచ్)లో లేదా 500 cm2 డిష్‌లలో (థర్మో సైంటిఫిక్) 37°C వద్ద 4 గంటల పాటు వృద్ధి చేశారు. ప్లేట్లను ట్రిస్-EDTA బఫర్ (ఫ్లూకా అనలిటికల్)తో కడగడం ద్వారా లేదా స్టెరైల్ పైపెట్ చిట్కాలతో ప్లాక్‌లను సేకరించడం ద్వారా ప్లేట్ల నుండి ఫేజ్‌లను సంగ్రహించారు. కల్చర్ సూపర్‌నాటెంట్ లేదా సంగ్రహణ బఫర్ నుండి ఫేజ్‌లను ఒక రౌండ్ పాలిథిలిన్ గ్లైకాల్ (PEG 8000) అవక్షేపణ (ప్రోమెగా) ద్వారా వేరుచేసి, ట్రిస్-EDTA బఫర్‌లో తిరిగి సస్పెండ్ చేశారు.
వృద్ధి చేయబడిన ఫేజ్‌ను, సిరల ద్వారా (IV) ఇంజెక్ట్ చేయడానికి (ఒక్కో జంతువుకు 500 μl) ముందు, ఎండోటాక్సిన్ తొలగింపు పూసలను (మిల్టెనీ బయోటెక్) ఉపయోగించి 2-3 దశల ఎండోటాక్సిన్ తొలగింపుకు గురిచేయడం జరిగింది. మొదటి దశలో, 2×10¹² ఫేజ్‌లను ప్రవేశపెట్టారు; రెండవ దశలో, 2×10¹⁰ ఫేజ్‌లను; మూడవ మరియు నాల్గవ ఎంపిక దశలలో, ఒక్కో జంతువుకు 2×10⁹ ఫేజ్‌లను ప్రవేశపెట్టారు. సూచించిన సమయాల్లో సేకరించిన CSF మరియు రక్త నమూనాలలో ఫేజ్ పరిమాణాన్ని, తయారీదారు సూచనల ప్రకారం (T7సెలెక్ట్ సిస్టమ్ మాన్యువల్) ప్లాక్ కౌంటింగ్ ద్వారా నిర్ధారించారు. శుద్ధి చేసిన లైబ్రరీలను తోక సిరలోకి సిరల ద్వారా ఇంజెక్ట్ చేయడం ద్వారా లేదా మునుపటి ఎంపిక దశ నుండి CSF నుండి సంగ్రహించిన ఫేజ్‌ను తిరిగి ఇంజెక్ట్ చేయడం ద్వారా ఫేజ్ ఎంపికను నిర్వహించారు, మరియు వరుసగా 10 నిమిషాలు, 30 నిమిషాలు, 60 నిమిషాలు, 90 నిమిషాలు, 120 నిమిషాలు, 180 నిమిషాలు, మరియు 240 నిమిషాల వద్ద CSF మరియు రక్త నమూనాల నుండి తదుపరి సేకరణలు జరిపారు. మొత్తం నాలుగు రౌండ్ల ఇన్ వివో ప్యానింగ్ నిర్వహించబడింది, దీనిలో మొదటి మూడు రౌండ్ల ఎంపిక సమయంలో, ఎంపిక చేయబడిన రెండు శాఖలను విడివిడిగా నిల్వ చేసి విశ్లేషించారు. మొదటి రెండు రౌండ్ల ఎంపిక నుండి CSF నుండి సంగ్రహించిన అన్ని ఫేజ్ ఇన్సర్ట్‌లను 454/రోష్ పైరోసీక్వెన్సింగ్‌కు గురిచేయగా, చివరి రెండు రౌండ్ల ఎంపిక నుండి CSF నుండి సంగ్రహించిన అన్ని క్లోన్‌లను మాన్యువల్‌గా సీక్వెన్స్ చేశారు. మొదటి రౌండ్ ఎంపిక నుండి వచ్చిన అన్ని బ్లడ్ ఫేజ్‌లను కూడా 454/రోష్ పైరోసీక్వెన్సింగ్‌కు గురిచేశారు. ఫేజ్ క్లోన్‌లను ఇంజెక్ట్ చేయడానికి, ఎంపిక చేసిన ఫేజ్‌లను 500 cm2 ప్లేట్లపై 37°C వద్ద 4 గంటల పాటు E. coli (BL5615)లో వృద్ధి చేశారు. విడివిడిగా ఎంపిక చేసి, మాన్యువల్‌గా సీక్వెన్స్ చేసిన క్లోన్‌లను TB మీడియంలో వృద్ధి చేశారు. ఫేజ్ సంగ్రహణ, శుద్ధీకరణ మరియు ఎండోటాక్సిన్ తొలగింపు (పైన వివరించిన విధంగా) తర్వాత, 300 μlలో 2×1010 ఫేజ్‌లను ఒక తోక సిరలోకి ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేశారు.
సీక్వెన్స్ డేటా యొక్క ప్రీప్రాసెసింగ్ మరియు గుణాత్మక ఫిల్టరింగ్. విక్రేత సాఫ్ట్‌వేర్‌ను ఉపయోగించి, రా 454/రోష్ డేటాను బైనరీ స్టాండర్డ్ స్ట్రీమ్ మ్యాప్ ఫార్మాట్ (sff) నుండి పియర్సన్ హ్యూమన్ రీడబుల్ ఫార్మాట్ (fasta)కు మార్చబడింది. న్యూక్లియోటైడ్ సీక్వెన్స్ యొక్క తదుపరి ప్రాసెసింగ్, క్రింద వివరించిన విధంగా యాజమాన్య C ప్రోగ్రామ్‌లు మరియు స్క్రిప్ట్‌లను (విడుదల కాని సాఫ్ట్‌వేర్ ప్యాకేజీ) ఉపయోగించి నిర్వహించబడింది. ప్రాథమిక డేటా విశ్లేషణలో కఠినమైన బహుళ-దశల ఫిల్టరింగ్ విధానాలు ఉంటాయి. చెల్లుబాటు అయ్యే 12మెర్ ఇన్సర్ట్ DNA సీక్వెన్స్‌ను కలిగి లేని రీడ్‌లను ఫిల్టర్ చేయడానికి, గ్లోబల్ నీడిల్‌మ్యాన్-వుంష్ పరీక్షను ఉపయోగించి రీడ్‌లను స్టార్ట్ లేబుల్ (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), స్టాప్ లేబుల్ (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) మరియు బ్యాక్‌గ్రౌండ్ ఇన్సర్ట్ (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC)లకు వరుసగా అమర్చబడ్డాయి. ప్రతి అలైన్‌మెంట్‌కు 2 వరకు అసంగతతలను అనుమతించే అలైన్‌మెంట్31. అందువల్ల, స్టార్ట్ మరియు స్టాప్ ట్యాగ్‌లు లేని రీడ్‌లు మరియు బ్యాక్‌గ్రౌండ్ ఇన్సర్ట్‌లను కలిగి ఉన్న రీడ్‌లు, అంటే, అనుమతించబడిన సంఖ్యలో తేడాలను మించిన అలైన్‌మెంట్‌లు, లైబ్రరీ నుండి తొలగించబడ్డాయి. మిగిలిన రీడ్‌ల విషయానికొస్తే, ప్రారంభ గుర్తు నుండి మొదలై ముగింపు గుర్తుకు ముందు ముగిసే N-మెర్ DNA క్రమాన్ని అసలు రీడ్ క్రమం నుండి కత్తిరించి, తదుపరి ప్రాసెస్ చేయబడింది (ఇకపై దీనిని "ఇన్సర్ట్" అని పిలుస్తారు). ఇన్సర్ట్ యొక్క అనువాదం తర్వాత, ప్రైమర్ యొక్క 5′ చివరన ఉన్న మొదటి స్టాప్ కోడాన్ తర్వాత ఉన్న భాగాన్ని ఇన్సర్ట్ నుండి తొలగించారు. అదనంగా, ప్రైమర్ యొక్క 3′ చివరన అసంపూర్ణ కోడాన్‌లకు దారితీసే న్యూక్లియోటైడ్‌లను కూడా తొలగించారు. కేవలం బ్యాక్‌గ్రౌండ్ క్రమాలను మాత్రమే కలిగి ఉన్న ఇన్సర్ట్‌లను మినహాయించడానికి, "PAG" అమైనో ఆమ్ల నమూనాతో ప్రారంభమయ్యే అనువదించబడిన ఇన్సర్ట్‌లను కూడా తొలగించారు. అనువాదానంతర పొడవు 3 అమైనో ఆమ్లాల కంటే తక్కువ ఉన్న పెప్టైడ్‌లను లైబ్రరీ నుండి తొలగించారు. చివరగా, ఇన్సర్ట్ పూల్‌లోని పునరావృతాలను తొలగించి, ప్రతి ప్రత్యేకమైన ఇన్సర్ట్ యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీని నిర్ణయించారు. ఈ విశ్లేషణ ఫలితాలలో న్యూక్లియోటైడ్ క్రమాల (ఇన్సర్ట్‌లు) జాబితా మరియు వాటి (రీడ్) ఫ్రీక్వెన్సీలు ఉన్నాయి (అనుబంధ చిత్రాలు 1c మరియు 2).
సీక్వెన్స్ సారూప్యత ఆధారంగా N-మెర్ DNA ఇన్సర్ట్‌లను సమూహపరచడం: 454/రోష్-నిర్దిష్ట సీక్వెన్సింగ్ లోపాలను (హోమోపాలిమర్ ఎక్స్‌టెన్షన్‌లను సీక్వెన్సింగ్ చేయడంలో సమస్యల వంటివి) తొలగించడానికి మరియు తక్కువ ప్రాముఖ్యత ఉన్న రిడండెన్సీలను తొలగించడానికి, ముందుగా ఫిల్టర్ చేయబడిన N-మెర్ DNA సీక్వెన్స్ ఇన్సర్ట్‌లు (ఇన్సర్ట్‌లు) సారూప్యత ఆధారంగా క్రమబద్ధీకరించబడతాయి. ఈ క్రింది విధంగా నిర్వచించబడిన ఒక ఇటరేటివ్ అల్గారిథమ్‌ను ఉపయోగించి ఇన్సర్షన్‌లు (గరిష్టంగా 2 సరిపోలని బేస్‌లు అనుమతించబడతాయి) క్రమబద్ధీకరించబడతాయి: ఇన్సర్షన్‌లు మొదట వాటి ఫ్రీక్వెన్సీ (అత్యధికం నుండి అత్యల్పం వరకు) ఆధారంగా, మరియు అవి సమానంగా ఉంటే, వాటి పొడవు ఆధారంగా (అతి పొడవైనది నుండి అతి పొట్టిది వరకు) రెండవ క్రమబద్ధీకరణ చేయబడతాయి. ఈ విధంగా, అత్యంత తరచుగా మరియు పొడవైన ఇన్సర్షన్‌లు మొదటి "సమూహాన్ని" నిర్వచిస్తాయి. సమూహ ఫ్రీక్వెన్సీ కీ ఫ్రీక్వెన్సీకి సెట్ చేయబడుతుంది. ఆ తర్వాత, క్రమబద్ధీకరించబడిన జాబితాలో మిగిలి ఉన్న ప్రతి ఇన్సర్షన్‌ను జతవారీ నీడిల్‌మ్యాన్-వుంష్ అలైన్‌మెంట్ ద్వారా సమూహానికి జోడించడానికి ప్రయత్నించబడింది. ఒక అలైన్‌మెంట్‌లో సరిపోలనివి, ఇన్సర్షన్‌లు లేదా తొలగింపుల సంఖ్య 2 థ్రెషోల్డ్‌ను మించకపోతే, ఒక ఇన్సర్షన్ సమూహానికి జోడించబడుతుంది, మరియు ఆ ఇన్సర్షన్ ఎన్నిసార్లు జోడించబడిందో దాని ప్రకారం మొత్తం సమూహ ఫ్రీక్వెన్సీ పెంచబడుతుంది. ఒక సమూహానికి జోడించబడిన ఇన్సర్ట్‌లు 'ఉపయోగించినవి'గా గుర్తించబడి, తదుపరి ప్రాసెసింగ్ నుండి మినహాయించబడతాయి. ఒకవేళ ఇన్సర్ట్ సీక్వెన్స్‌ను ఇప్పటికే ఉన్న సమూహంలో చేర్చలేకపోతే, ఆ ఇన్సర్ట్ సీక్వెన్స్‌ను ఉపయోగించి తగిన ఇన్సర్ట్ ఫ్రీక్వెన్సీతో ఒక కొత్త సమూహం సృష్టించబడి, 'ఉపయోగించినది'గా గుర్తించబడుతుంది. ప్రతి ఇన్సర్షన్ సీక్వెన్స్‌ను ఉపయోగించి ఒక కొత్త సమూహం ఏర్పడినప్పుడు గానీ లేదా ఇప్పటికే ఉన్న సమూహంలో చేర్చగలిగినప్పుడు గానీ ఈ పునరావృతం ముగుస్తుంది. అన్నిటికంటే ముఖ్యంగా, న్యూక్లియోటైడ్‌లతో కూడిన సమూహపరచబడిన ఇన్సర్ట్‌లు చివరికి పెప్టైడ్ సీక్వెన్స్‌లుగా (పెప్టైడ్ లైబ్రరీలుగా) అనువదించబడతాయి. ఈ విశ్లేషణ ఫలితంగా, వరుస రీడ్‌ల సంఖ్యను ఏర్పరిచే ఇన్సర్షన్‌ల సమితి మరియు వాటికి సంబంధించిన ఫ్రీక్వెన్సీలు లభిస్తాయి (అనుబంధ చిత్రం 2).
మోటిఫ్ జనరేషన్: ప్రత్యేకమైన పెప్టైడ్‌ల జాబితా ఆధారంగా, క్రింద చూపిన విధంగా సాధ్యమయ్యే అన్ని అమైనో ఆమ్ల నమూనాలను (aa) కలిగి ఉన్న ఒక లైబ్రరీ సృష్టించబడింది. 3 పొడవు గల ప్రతి సాధ్యమయ్యే నమూనా పెప్టైడ్ నుండి సంగ్రహించబడింది మరియు దాని విలోమ నమూనా అన్ని నమూనాలను (ట్రైపెప్టైడ్‌లు) కలిగి ఉన్న ఒక సాధారణ మోటిఫ్ లైబ్రరీతో పాటు జోడించబడింది. అధిక పునరావృత మోటిఫ్‌ల లైబ్రరీలు సీక్వెన్స్ చేయబడ్డాయి మరియు రిడండెన్సీ తొలగించబడింది. ఆ తర్వాత, మోటిఫ్ లైబ్రరీలోని ప్రతి ట్రైపెప్టైడ్ కోసం, కంప్యూటేషనల్ సాధనాలను ఉపయోగించి లైబ్రరీలో దాని ఉనికిని మేము తనిఖీ చేసాము. ఈ సందర్భంలో, కనుగొనబడిన మోటిఫ్ ట్రైపెప్టైడ్‌ను కలిగి ఉన్న పెప్టైడ్ యొక్క ఫ్రీక్వెన్సీ జోడించబడి, మోటిఫ్ లైబ్రరీలోని మోటిఫ్‌కు కేటాయించబడుతుంది (“మోటిఫ్‌ల సంఖ్య”). మోటిఫ్ జనరేషన్ ఫలితం అనేది ట్రైపెప్టైడ్‌ల (మోటిఫ్‌ల) యొక్క అన్ని ఆవిర్భావాలను మరియు వాటి సంబంధిత విలువలను కలిగి ఉన్న రెండు-డైమెన్షనల్ శ్రేణి. ఈ విలువలు, రీడ్‌లను ఫిల్టర్ చేసి, గ్రూప్ చేసి, మరియు అనువదించినప్పుడు సంబంధిత మోటిఫ్‌కు దారితీసే సీక్వెన్సింగ్ రీడ్‌ల సంఖ్య. పైన వివరంగా వివరించిన విధంగా మెట్రిక్స్.
మోటిఫ్‌ల సంఖ్య మరియు సంబంధిత స్కాటర్‌ప్లాట్‌ల సాధారణీకరణ: ప్రతి నమూనాకు సంబంధించిన మోటిఫ్‌ల సంఖ్యను ఉపయోగించి సాధారణీకరించబడింది
ఇక్కడ ni అనేది టాపిక్ iని కలిగి ఉన్న రీడ్‌ల సంఖ్య. అందువల్ల, vi అనేది నమూనాలో మోటిఫ్ iని కలిగి ఉన్న రీడ్‌ల (లేదా పెప్టైడ్‌ల) శాత పౌనఃపున్యాన్ని సూచిస్తుంది. ప్రామాణీకరించని మోటిఫ్‌ల సంఖ్య కోసం P-విలువలను ఫిషర్ యొక్క ఖచ్చితమైన పరీక్షను ఉపయోగించి లెక్కించారు. మోటిఫ్‌ల సంఖ్య యొక్క కోరిలోగ్రామ్‌ల విషయానికొస్తే, ప్రామాణీకరించిన మోటిఫ్‌ల సంఖ్యను ఉపయోగించి Rతో స్పియర్‌మన్ సహసంబంధాలను లెక్కించారు.
పెప్టైడ్ లైబ్రరీలోని ప్రతి స్థానంలో ఉన్న అమైనో ఆమ్లాల పరిమాణాన్ని దృశ్యమానం చేయడానికి, వెబ్ లోగోగ్రామ్‌లు 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) సృష్టించబడ్డాయి. మొదట, 12-మెర్ పెప్టైడ్‌లోని ప్రతి స్థానంలో ఉన్న అమైనో ఆమ్లాల పరిమాణం 20×12 మాత్రికలో నిల్వ చేయబడుతుంది. ఆ తర్వాత, ప్రతి స్థానంలో ఒకే సాపేక్ష అమైనో ఆమ్ల పరిమాణాన్ని కలిగి ఉన్న 1000 పెప్టైడ్‌ల సమితి ఫాస్టా-సీక్వెన్స్ ఫార్మాట్‌లో రూపొందించబడి, వెబ్-లోగో 3కి ఇన్‌పుట్‌గా అందించబడుతుంది. ఇది ఇచ్చిన పెప్టైడ్ లైబ్రరీ కోసం ప్రతి స్థానంలో ఉన్న సాపేక్ష అమైనో ఆమ్ల పరిమాణం యొక్క గ్రాఫికల్ ప్రాతినిధ్యాన్ని రూపొందిస్తుంది. బహుమితీయ డేటాసెట్‌లను దృశ్యమానం చేయడానికి, Rలో అంతర్గతంగా అభివృద్ధి చేయబడిన ఒక సాధనాన్ని (biosHeatmap, ఇంకా విడుదల కాని R ప్యాకేజీ) ఉపయోగించి హీట్ మ్యాప్‌లు సృష్టించబడ్డాయి. హీట్ మ్యాప్‌లలో ప్రదర్శించబడిన డెండ్రోగ్రామ్‌లు యూక్లిడియన్ దూర కొలమానంతో వార్డ్ యొక్క క్రమానుగత క్లస్టరింగ్ పద్ధతిని ఉపయోగించి లెక్కించబడ్డాయి. మోటిఫ్ స్కోరింగ్ డేటా యొక్క గణాంక విశ్లేషణ కోసం, అన్‌నార్మలైజ్డ్ స్కోరింగ్ కొరకు P విలువలను ఫిషర్ ఎగ్జాక్ట్ టెస్ట్ ఉపయోగించి లెక్కించారు. ఇతర డేటాసెట్‌ల కొరకు P-విలువలను R లో స్టూడెంట్స్ t-టెస్ట్ లేదా ANOVA ఉపయోగించి లెక్కించారు.
ఎంపిక చేసిన ఫేజ్ క్లోన్‌లు మరియు ఇన్సర్ట్‌లు లేని ఫేజ్‌లను తోక సిర ద్వారా ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేశారు (300 μl PBSలో ఒక్కో జంతువుకు 2×10¹⁰ ఫేజ్‌లు). పెర్ఫ్యూజన్ మరియు తదుపరి ఫిక్సేషన్‌కు పది నిమిషాల ముందు, అదే జంతువులకు 100 μl డైలైట్594-లేబుల్డ్ లెక్టిన్‌ను (వెక్టర్ లాబొరేటరీస్ ఇంక్., DL-1177) ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేశారు. ఫేజ్ ఇంజెక్షన్ చేసిన 60 నిమిషాల తర్వాత, ఎలుకల గుండె ద్వారా 50 ml PBS, ఆ తర్వాత 50 ml 4% PFA/PBSతో పెర్ఫ్యూజ్ చేశారు. మెదడు నమూనాలను అదనంగా 4% PFA/PBSలో రాత్రంతా ఫిక్స్ చేసి, 4°C వద్ద 30% సుక్రోజ్‌లో రాత్రంతా నానబెట్టారు. నమూనాలను OCT మిశ్రమంలో ఫ్లాష్ ఫ్రీజ్ చేశారు. ఘనీభవించిన నమూనాల ఇమ్యునోహిస్టోకెమికల్ విశ్లేషణను గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద నిర్వహించారు. దీనికోసం, 1% BSA తో బ్లాక్ చేయబడిన 30 µm క్రయోసెక్షన్లను 4 °C వద్ద T7 ఫేజ్‌కు వ్యతిరేకంగా పాలీక్లోనల్ FITC-లేబుల్డ్ యాంటీబాడీలతో (నోవస్ NB 600-376A) ఇంక్యుబేట్ చేశారు. రాత్రంతా ఇంక్యుబేట్ చేయండి. చివరగా, సెక్షన్లను PBS తో 3 సార్లు కడిగి, కాన్ఫోకల్ లేజర్ మైక్రోస్కోప్ (లీకా TCS SP5) తో పరిశీలించారు.
కనీసం 98% స్వచ్ఛత కలిగిన అన్ని పెప్టైడ్‌లను జెన్‌స్క్రిప్ట్ USA ద్వారా సంశ్లేషణ చేసి, బయోటిన్‌తో అనుసంధానించి, ఘనీభవించి శుద్ధి చేశారు. N-టెర్మినస్ వద్ద అదనపు ట్రిపుల్ గ్లైసిన్ స్పేసర్ ద్వారా బయోటిన్ బంధించబడి ఉంటుంది. మాస్ స్పెక్ట్రోమెట్రీని ఉపయోగించి అన్ని పెప్టైడ్‌లను తనిఖీ చేయండి.
స్ట్రెప్టావిడిన్ (సిగ్మా S0677)ను, 5–10% DMSOలో, బయోటినిలేటెడ్ పెప్టైడ్, బయోటినిలేటెడ్ BACE1 నిరోధక పెప్టైడ్, లేదా బయోటినిలేటెడ్ BACE1 నిరోధక పెప్టైడ్ మరియు BACE1 నిరోధక పెప్టైడ్ యొక్క కలయిక (3:1 నిష్పత్తి) యొక్క 5 రెట్ల సమమోలార్ అధిక పరిమాణంతో కలిపి, ఇంజెక్షన్‌కు ముందు గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద ఒక గంట పాటు PBSలో ఇంక్యుబేట్ చేశారు. స్ట్రెప్టావిడిన్-సంయుక్త పెప్టైడ్‌లను, సెరిబ్రల్ కావిటీ ఉన్న ఎలుకల తోక సిరలలో ఒకదానిలోకి 10 mg/kg మోతాదులో ఇంట్రావీనస్‌గా ఇంజెక్ట్ చేశారు.
స్ట్రెప్టావిడిన్-పెప్టైడ్ కాంప్లెక్స్‌ల గాఢతను ELISA ద్వారా అంచనా వేశారు. నంక్ మాక్సిసోర్ప్ మైక్రోటైటర్ ప్లేట్లను (సిగ్మా) 4°C వద్ద రాత్రంతా 1.5 μg/ml మౌస్ యాంటీ-స్ట్రెప్టావిడిన్ యాంటీబాడీతో (థర్మో, MA1-20011) పూత పూశారు. గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 2 గంటల పాటు బ్లాకింగ్ (బ్లాకింగ్ బఫర్: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% జెలటిన్, 1% BSA) చేసిన తర్వాత, ప్లేట్‌ను 0.05% ట్వీన్-20/PBS (వాష్ బఫర్)తో 3 సెకన్ల పాటు కడిగారు. ఆ తర్వాత, బ్లాకింగ్ బఫర్‌తో పలుచన చేసిన CSF మరియు ప్లాస్మా నమూనాలను (ప్లాస్మా 1:10,000, CSF 1:115) వెల్స్‌లో చేర్చారు. అనంతరం, డిటెక్షన్ యాంటీబాడీతో (1 μg/ml, యాంటీ-స్ట్రెప్టావిడిన్-HRP, నోవస్ NB120-7239) ప్లేట్‌ను 4°C వద్ద రాత్రంతా ఇంక్యుబేట్ చేశారు. మూడు వాషింగ్ దశల తర్వాత, 20 నిమిషాల వరకు TMB సబ్‌స్ట్రేట్ ద్రావణంలో (రోష్) ఇంక్యుబేషన్ చేయడం ద్వారా స్ట్రెప్టావిడిన్‌ను గుర్తించారు. 1M H2SO4తో రంగు అభివృద్ధిని ఆపిన తర్వాత, 450 nm వద్ద అబ్సార్బెన్స్‌ను కొలవండి.
తయారీదారు ప్రోటోకాల్ (వాకో, 294-64701) ప్రకారం, స్ట్రెప్టావిడిన్-పెప్టైడ్-BACE1 ఇన్హిబిటర్ కాంప్లెక్స్ యొక్క పనితీరును Aβ(1-40) ELISA ద్వారా అంచనా వేశారు. క్లుప్తంగా, CSF నమూనాలను ప్రామాణిక డైల్యూయెంట్ (1:23)లో పలుచగా చేసి, BNT77 క్యాప్చర్ యాంటీబాడీతో పూత పూసిన 96-వెల్ ప్లేట్లలో 4°C వద్ద రాత్రంతా ఇంక్యుబేట్ చేశారు. ఐదు వాషింగ్ దశల తర్వాత, HRP-కాన్జుగేటెడ్ BA27 యాంటీబాడీని జోడించి, 4°C వద్ద 2 గంటల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేసి, ఆ తర్వాత ఐదు వాషింగ్ దశలను అనుసరించారు. గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాల పాటు TMB ద్రావణంలో ఇంక్యుబేట్ చేయడం ద్వారా Aβ(1–40)ను గుర్తించారు. స్టాప్ సొల్యూషన్‌తో రంగు అభివృద్ధిని ఆపిన తర్వాత, 450 nm వద్ద అబ్సార్బెన్స్‌ను కొలిచారు. Aβ(1–40) ELISAకు ముందు ప్లాస్మా నమూనాలను సాలిడ్ ఫేజ్ ఎక్స్‌ట్రాక్షన్‌కు గురిచేశారు. ప్లాస్మాను 96-వెల్ ప్లేట్లలో 0.2% DEA (సిగ్మా)కు జోడించి, గది ఉష్ణోగ్రత వద్ద 30 నిమిషాల పాటు ఇంక్యుబేట్ చేశారు. SPE ప్లేట్లను (Oasis, 186000679) వరుసగా నీరు మరియు 100% మెథనాల్‌తో కడిగిన తర్వాత, ప్లాస్మా నమూనాలను SPE ప్లేట్లకు జోడించి, ద్రవం మొత్తాన్ని తొలగించారు. నమూనాలను (మొదట 5% మెథనాల్‌తో, ఆపై 30% మెథనాల్‌తో) కడిగి, 2% NH4OH/90% మెథనాల్‌తో ఎల్యూట్ చేశారు. ఎల్యూయేట్‌ను 55°C వద్ద 99 నిమిషాల పాటు స్థిరమైన N2 కరెంట్‌తో ఆరబెట్టిన తర్వాత, నమూనాలను ప్రామాణిక డైల్యూయెంట్లలో క్షయీకరించి, పైన వివరించిన విధంగా Aβ(1–40)ని కొలిచారు.
ఈ వ్యాసాన్ని ఎలా ఉదహరించాలి: ఉరిచ్, ఇ. మరియు ఇతరులు. ఇన్ వివోలో గుర్తించబడిన ట్రాన్సిట్ పెప్టైడ్లను ఉపయోగించి మెదడుకు కార్గో డెలివరీ. ది సైన్స్. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
లిఖోటా జె., స్కియోరింగే టి., థామ్సెన్ ఎల్‌బి మరియు మూస్ టి. లక్షిత చికిత్సను ఉపయోగించి మెదడుకు స్థూల అణు ఔషధాల పంపిణీ. జర్నల్ ఆఫ్ న్యూరోకెమిస్ట్రీ 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
బ్రాస్న్జెవిక్, ఐ., స్టెయిన్‌బుష్, హెచ్‌డబ్ల్యూ, ష్మిట్జ్, సి., మరియు మార్టినెజ్-మార్టినెజ్, పి. రక్త-మెదడు అవరోధం గుండా పెప్టైడ్ మరియు ప్రోటీన్ ఔషధాల పంపిణీ. ప్రోగ్ న్యూరోబయోల్ 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
పార్డ్రిడ్జ్, WM రక్త-మెదడు అవరోధం: మెదడు ఔషధ అభివృద్ధిలో ఒక అడ్డంకి. న్యూరోఆర్ఎక్స్ 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
జోహన్సన్, కె.ఇ., డంకన్, జె.ఎ., స్టోపా, ఇ.జి., మరియు బైర్డ్, ఎ. కోరాయిడ్ ప్లెక్సస్-సి.ఎస్.ఎఫ్. మార్గం ద్వారా మెదడుకు మెరుగైన ఔషధ పంపిణీ మరియు లక్ష్యీకరణకు అవకాశాలు. ఫార్మాస్యూటికల్ రీసెర్చ్ 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
పార్డ్రిడ్జ్, WM మెదడుకు చేరవేసేందుకు మాలిక్యులర్ ట్రోజన్ హార్స్‌లతో బయోఫార్మాస్యూటికల్స్ ఆధునీకరణ. బయోకాన్జుగ్ కెమ్ 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
పార్డ్రిడ్జ్, రక్త-మెదడు అవరోధం అంతటా WM గ్రాహకం-మధ్యవర్తిత్వ పెప్టైడ్ రవాణా. ఎండోక్రైన్ రివ్యూ. 7, 314–330 (1986).
నీవోహెనర్, జె. మరియు ఇతరులు. మోనోవాలెంట్ మాలిక్యులర్ షటిల్స్‌ను ఉపయోగించి చికిత్సా యాంటీబాడీల మెదడు వ్యాప్తిని మరియు ప్రభావాన్ని పెంచడం. న్యూరాన్ 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
బియెన్-లీ, ఎన్. మరియు ఇతరులు. ట్రాన్స్‌ఫెర్రిన్ రిసెప్టర్ (TfR) రవాణా, TfR యాంటీబాడీల యొక్క అఫినిటీ వేరియంట్‌ల మెదడు గ్రహణాన్ని నిర్ధారిస్తుంది. జె ఎక్స్‌ప్ మెడ్ 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).