Nature.com သို့ ဝင်ရောက်ကြည့်ရှုသည့်အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါသည်။ သင်သည် CSS ပံ့ပိုးမှု အကန့်အသတ်ရှိသော ဘရောက်ဆာဗားရှင်းကို အသုံးပြုနေပါသည်။ အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသော ဘရောက်ဆာကို အသုံးပြုရန် (သို့မဟုတ် Internet Explorer ရှိ Compatibility Mode ကို ပိတ်ရန်) အကြံပြုအပ်ပါသည်။ ထို့အပြင်၊ စဉ်ဆက်မပြတ် ပံ့ပိုးမှုကို သေချာစေရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဆိုက်ကို styles နှင့် JavaScript မပါဘဲ ပြသပါသည်။
ဆလိုက်သုံးခုကို တစ်ပြိုင်နက်တည်း လှည့်ပတ်ပြသသည်။ တစ်ပြိုင်နက်တည်း ဆလိုက်သုံးခုကို ရွှေ့ရန် Previous နှင့် Next ခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ၊ သို့မဟုတ် အဆုံးရှိ ဆလိုက်ခလုတ်များကို အသုံးပြု၍ တစ်ပြိုင်နက်တည်း ဆလိုက်သုံးခုကို ရွှေ့ပါ။
သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးနှင့် သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးသည် ဇီဝကုထုံးဆိုင်ရာ အေးဂျင့်များသည် ဗဟိုအာရုံကြောစနစ်ရှိ ၎င်းတို့၏ပစ်မှတ်များထံ ရောက်ရှိခြင်းမှ တားဆီးပေးပြီး အာရုံကြောဆိုင်ရာရောဂါများကို ထိရောက်စွာကုသမှုကို အဟန့်အတားဖြစ်စေသည်။ in vivo တွင် ဦးနှောက်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးကိရိယာအသစ်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် T7 phage peptide စာကြည့်တိုက်ကို မိတ်ဆက်ခဲ့ပြီး ကြွက်များ၏ cannulated conscious large pool မော်ဒယ်ကို အသုံးပြု၍ သွေးနှင့် ဦးနှောက်ကျောရိုးအရည် (CSF) ကို အဆက်မပြတ်စုဆောင်းခဲ့သည်။ ရွေးချယ်မှုလေးကြိမ်အပြီးတွင် သီးခြား phage clones များသည် CSF တွင် အလွန်ကြွယ်ဝလာခဲ့သည်။ တစ်ဦးချင်းကိုယ်စားလှယ်လောင်း peptide များကို စမ်းသပ်ခြင်းသည် CSF တွင် ၁၀၀၀ ဆထက်ပိုကြွယ်ဝကြောင်း ဖော်ပြသည်။ peptide မှတစ်ဆင့် ဦးနှောက်သို့ ပို့ဆောင်ခြင်း၏ ဇီဝလှုပ်ရှားမှုကို ဖော်ထုတ်ထားသော novel transit peptide နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော BACE1 peptide inhibitor ကို အသုံးပြု၍ ဦးနှောက်ကျောရိုးအရည်ရှိ amyloid-β အဆင့် ၄၀% လျော့ကျခြင်းဖြင့် အတည်ပြုခဲ့သည်။ ဤရလဒ်များသည် in vivo phage ရွေးချယ်မှုနည်းလမ်းများဖြင့် ဖော်ထုတ်ထားသော peptide များသည် ကုထုံးဆိုင်ရာအကျိုးသက်ရောက်မှုဖြင့် ဦးနှောက်သို့ macromolecules များကို စနစ်တကျပို့ဆောင်ရန်အတွက် အသုံးဝင်သောယာဉ်များဖြစ်နိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
ဗဟိုအာရုံကြောစနစ် (CNS) ပစ်မှတ်ထားကုထုံးသုတေသနသည် ဦးနှောက်သို့ တက်ကြွသောဆေးဝါးပို့ဆောင်မှုကို မောင်းနှင်သည့်ယန္တရားများကို ရှာဖွေတွေ့ရှိရန် အားထုတ်မှုနည်းပါးစွာဖြင့် CNS-ပစ်မှတ်ထားဂုဏ်သတ္တိများကိုပြသသည့် အကောင်းဆုံးဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ထားသောဆေးဝါးများနှင့်အေးဂျင့်များကို ဖော်ထုတ်ရန် အဓိကထားခဲ့သည်။ ဆေးဝါးပို့ဆောင်မှု၊ အထူးသဖြင့် မော်လီကျူးကြီးများသည် ခေတ်မီအာရုံကြောသိပ္ပံဆေးဝါးဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု၏ မရှိမဖြစ်အစိတ်အပိုင်းတစ်ခုဖြစ်လာသည်နှင့်အမျှ ၎င်းသည် ယခုအခါ ပြောင်းလဲလာပါသည်။ ဗဟိုအာရုံကြောစနစ်၏ပတ်ဝန်းကျင်ကို သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီး (BBB) ​​နှင့် သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီး (BCBB)1 တို့ပါဝင်သော ဦးနှောက်သွေးကြောအတားအဆီးစနစ်ဖြင့် ကောင်းစွာကာကွယ်ထားသောကြောင့် ဦးနှောက်သို့ဆေးဝါးပို့ဆောင်ရန် ခက်ခဲစေသည်1,2။ မော်လီကျူးကြီးဆေးဝါးအားလုံးနီးပါးနှင့် မော်လီကျူးငယ်ဆေးဝါး ၉၈% ကျော်ကို ဦးနှောက်မှ ဖယ်ရှားပစ်သည်ဟု ခန့်မှန်းရသည်3။ ထို့ကြောင့် CNS 4,5 သို့ ကုထုံးဆိုင်ရာဆေးဝါးများကို ထိရောက်ပြီး တိကျစွာပို့ဆောင်ပေးသည့် ဦးနှောက်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးစနစ်အသစ်များကို ဖော်ထုတ်ရန် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။ သို့သော် BBB နှင့် BCSFB တို့သည် ဦးနှောက်၏ကျယ်ပြန့်သောသွေးကြောများမှတစ်ဆင့် ထိုးဖောက်ဝင်ရောက်သောကြောင့် ဆေးဝါးပို့ဆောင်မှုအတွက် အခွင့်အလမ်းကောင်းတစ်ခုကိုလည်း ပေးဆောင်ပါသည်။ ထို့ကြောင့် ဦးနှောက်သို့ ပို့ဆောင်ခြင်းမပြုသည့် ကျူးကျော်ဝင်ရောက်မှုမဟုတ်သော နည်းလမ်းများအသုံးပြုရန် လက်ရှိကြိုးပမ်းမှုများသည် endogenous BBB6 receptor ကို အသုံးပြု၍ receptor-mediated transport (PMT) ၏ ယန္တရားပေါ်တွင် အများအားဖြင့် အခြေခံထားသည်။ transferrin receptor pathway7,8 ကို အသုံးပြုသည့် မကြာသေးမီက အဓိကတိုးတက်မှုများရှိသော်လည်း၊ ပိုမိုကောင်းမွန်သော ဂုဏ်သတ္တိများပါရှိသော ပို့ဆောင်ရေးစနစ်အသစ်များ ထပ်မံဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်ရန် လိုအပ်ပါသည်။ ဤရည်ရွယ်ချက်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ရည်မှန်းချက်မှာ CSF သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးကို ကြားဝင်ဆောင်ရွက်ပေးနိုင်သော peptide များကို ဖော်ထုတ်ရန်ဖြစ်ပြီး၊ ၎င်းတို့ကို CNS သို့ macromolecules များ ပို့ဆောင်ရန် သို့မဟုတ် receptor pathways အသစ်များ ဖွင့်လှစ်ရန် မူအရ အသုံးပြုနိုင်ပါသည်။ အထူးသဖြင့်၊ ဦးနှောက်သွေးကြောစနစ်၏ သီးခြား receptors များနှင့် transporters (BBB နှင့် BSCFB) များသည် ဇီဝကုထုံးဆေးဝါးများ၏ တက်ကြွပြီး သီးခြားပို့ဆောင်မှုအတွက် အလားအလာရှိသောပစ်မှတ်များအဖြစ် ဆောင်ရွက်နိုင်သည်။ ဦးနှောက်အရည် (CSF) သည် choroid plexus (CS) ၏ secretory product တစ်ခုဖြစ်ပြီး subarachnoid space နှင့် ventricular space4 မှတစ်ဆင့် ဦးနှောက်၏ interstitial fluid နှင့် တိုက်ရိုက်ထိတွေ့သည်။ မကြာသေးမီက subarachnoid cerebrospinal fluid သည် ဦးနှောက်၏ interstitium အတွင်းသို့ အလွန်အကျွံပျံ့နှံ့သွားကြောင်း ပြသခဲ့သည်9။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤ subarachnoid inflow tract ကို အသုံးပြု၍ သို့မဟုတ် BBB မှတစ်ဆင့် တိုက်ရိုက် parenchymal space သို့ ဝင်ရောက်နိုင်ရန် မျှော်လင့်ပါသည်။ ၎င်းကို အောင်မြင်စေရန်အတွက်၊ ဤကွဲပြားသောလမ်းကြောင်းနှစ်ခုအနက် တစ်ခုခုမှ သယ်ယူပို့ဆောင်သော peptide များကို စံပြအားဖြင့် ခွဲခြားသတ်မှတ်သည့် ခိုင်မာသော in vivo phage ရွေးချယ်မှုဗျူဟာကို ကျွန်ုပ်တို့ အကောင်အထည်ဖော်ခဲ့ပါသည်။
ယခု ကျွန်ုပ်တို့သည် CSF နမူနာယူခြင်းနှင့် မြင့်မားသော throughput sequencing (HTS) တွဲဖက်ထားသော sequential in vivo phage display screening နည်းလမ်းကို ဖော်ပြထားပါသည်။ သွေးညစ်ညမ်းမှုကို ရှောင်ရှားရန်အတွက် အမြဲတမ်းထည့်သွင်းထားသော large cisterna (CM) cannula ပါသည့် သတိရှိသော ကြွက်များတွင် screening ကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အရေးကြီးသည်မှာ ဤနည်းလမ်းသည် ဦးနှောက်ပစ်မှတ်ထားခြင်းနှင့် cerebrovascular barrier ကိုဖြတ်၍ transport activity ရှိသော peptides နှစ်မျိုးလုံးကို ရွေးချယ်သည်။ ကျွန်ုပ်တို့သည် ၎င်းတို့၏ အရွယ်အစားသေးငယ်ခြင်း (~60 nm)10 ကြောင့် T7 phages များကို အသုံးပြုခဲ့ပြီး endothelial နှင့်/သို့မဟုတ် epithelial-medulla barrier ကို transcellular ဖြတ်ကျော်ခွင့်ပြုသည့် vesicles များသယ်ယူပို့ဆောင်ရေးအတွက် သင့်လျော်ကြောင်း အကြံပြုခဲ့သည်။ panning လေးကြိမ်အပြီးတွင် phage လူဦးရေများကို in vivo CSF ​​​​ကြွယ်ဝမှုနှင့် cerebral microvessel ဆက်စပ်မှုအားကောင်းကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ အရေးကြီးသည်မှာ ဦးစားပေးပြီး ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသော အကောင်းဆုံးကိုယ်စားလှယ်လောင်း peptides များသည် cerebrospinal fluid ထဲသို့ ပရိုတင်းကုန်စည်များကို သယ်ယူပို့ဆောင်နိုင်ကြောင်း ပြသခြင်းဖြင့် ကျွန်ုပ်တို့၏ တွေ့ရှိချက်များကို အတည်ပြုနိုင်ခဲ့သည်။ ပထမဦးစွာ၊ CNS ၏ ဆေးဝါးဒိုင်းနမစ်အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို ဦးဆောင် transit peptide နှင့် BACE1 peptide ၏ inhibitor တို့ကို ပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့် တည်ထောင်ခဲ့သည်။ in vivo လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ စစ်ဆေးရေးဗျူဟာများသည် ဦးနှောက်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေး peptide အသစ်များကို ထိရောက်သော ပရိုတင်းကုန်တင်သယ်ဆောင်သူများအဖြစ် ဖော်ထုတ်နိုင်ကြောင်း ပြသခြင်းအပြင်၊ အလားတူလုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ ရွေးချယ်မှုချဉ်းကပ်မှုများသည် ဦးနှောက်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးလမ်းကြောင်းအသစ်များကို ဖော်ထုတ်ရာတွင်လည်း အရေးကြီးလာမည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ မျှော်လင့်ပါသည်။
plaque-forming units (PFU) ကိုအခြေခံ၍ phage packaging step ပြီးနောက်၊ ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 109 မျိုးကွဲရှိသော random 12-mer linear T7 phage peptides များ၏ library ကို ဒီဇိုင်းထုတ်ပြီး ဖန်တီးခဲ့သည် (Materials and Methods ကိုကြည့်ပါ)။ in vivo panning မလုပ်မီ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤ library ကို ဂရုတစိုက် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ကြောင်း သတိပြုရန် အရေးကြီးပါသည်။ ပြုပြင်ထားသော primer များကို အသုံးပြု၍ phage library နမူနာများ၏ PCR amplification သည် HTS နှင့် တိုက်ရိုက်သက်ဆိုင်သော amplicons များကို ထုတ်ပေးသည် (Supplementary Fig. 1a)။ a) HTS11 sequencing အမှားများ၊ b) primers (NNK)1-12 ၏ အရည်အသွေးအပေါ် သက်ရောက်မှုနှင့် c) standby library တွင် wild-type (wt) phage (skeleton inserts) ရှိနေခြင်းကြောင့်၊ sequence information ကို အတည်ပြုပြီးသာ ထုတ်ယူရန် sequence filtering လုပ်ထုံးလုပ်နည်းကို အကောင်အထည်ဖော်ခဲ့သည် (Supplementary Fig. 1b)။ ဤ filter steps များသည် HTS sequencing library အားလုံးနှင့် သက်ဆိုင်သည်။ စံစာကြည့်တိုက်အတွက်၊ စုစုပေါင်းဖတ်ရှုမှု ၂၃၃,၈၆၈ ကြိမ်ရရှိခဲ့ပြီး ၎င်းတို့အနက် ၃၉% သည် filter criteria ကိုအောင်မြင်ခဲ့ပြီး နောက်ဆက်တွဲ round များအတွက် library analysis နှင့် selection အတွက်အသုံးပြုခဲ့သည် (Supplementary Figure 1c–e)။ ဖတ်ရှုမှုများသည် အဓိကအားဖြင့် အရှည် base pairs ၃ ခု၏ multiples များဖြစ်ပြီး nucleotides ၃၆ ခုတွင် အမြင့်ဆုံးရှိကာ (Supplementary Fig. 1c)၊ ၎င်းသည် library design (NNK) 1-12 ကိုအတည်ပြုပေးသည်။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ library members များ၏ ၁၁% ခန့်တွင် ၁၂-dimensional wild-type (wt) backbone PAGISRELVDKL insert ပါဝင်ပြီး sequences ၏ထက်ဝက်နီးပါး (၄၉%) တွင် insertions သို့မဟုတ် deletion များပါရှိသည်။ library library ၏ HTS သည် library တွင် peptides များ၏ များပြားသော diversity ကို အတည်ပြုခဲ့သည်- peptide sequences ၈၁% ကျော်ကို တစ်ကြိမ်သာတွေ့ရှိခဲ့ပြီး ၁.၅% သာ ≥၄ copies တွင်ဖြစ်ပွားခဲ့သည် (Supplementary Fig. 2a)။ တေးဂီတစာရင်းရှိ နေရာ ၁၂ ခုလုံးတွင် အမိုင်နိုအက်ဆစ် (aa) ၏ ကြိမ်နှုန်းများသည် ယိုယွင်းပျက်စီးနေသော NKK တေးဂီတစာရင်းမှ ထုတ်လုပ်သော codon အရေအတွက်အတွက် မျှော်လင့်ထားသည့် ကြိမ်နှုန်းများနှင့် ကောင်းစွာ ဆက်စပ်နေသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၂ခ)။ ဤထည့်သွင်းမှုများမှ encode လုပ်ထားသော aa အကြွင်းအကျန်များ၏ လေ့လာတွေ့ရှိထားသော ကြိမ်နှုန်းသည် တွက်ချက်ထားသော ကြိမ်နှုန်း (r = 0.893) (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၂ဂ) နှင့် ကောင်းစွာ ဆက်စပ်နေသည်။ ထိုးသွင်းရန်အတွက် phage libraries များ ပြင်ဆင်မှုတွင် endotoxin ချဲ့ထွင်ခြင်းနှင့် ဖယ်ရှားခြင်း အဆင့်များ ပါဝင်သည်။ ၎င်းသည် phage libraries များ၏ မတူကွဲပြားမှုကို အလားအလာရှိရှိ လျှော့ချနိုင်ကြောင်း ယခင်က ပြသခဲ့ပြီးဖြစ်သည်12,13။ ထို့ကြောင့်၊ endotoxin ဖယ်ရှားခြင်း ခံခဲ့ရသော plate-amplified phage library ကို ကျွန်ုပ်တို့ စီစဉ်ပြီး AA ၏ ကြိမ်နှုန်းကို ခန့်မှန်းရန် မူရင်း library နှင့် နှိုင်းယှဉ်ခဲ့သည်။ မူရင်း pool နှင့် ချဲ့ထွင်ပြီး သန့်စင်ထားသော pool အကြားတွင် ခိုင်မာသော ဆက်စပ်မှု (r = 0.995) ကို တွေ့ရှိခဲ့ရပါသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၂ဃ)၊ ၎င်းသည် T7 phage ကိုအသုံးပြု၍ plates များပေါ်တွင် ချဲ့ထွင်ထားသော clones များအကြား ပြိုင်ဆိုင်မှုသည် အဓိက bias မဖြစ်စေကြောင်း ညွှန်ပြသည်။ ဤနှိုင်းယှဉ်မှုသည် စာကြည့်တိုက်တစ်ခုစီရှိ tripeptide motifs များ၏ကြိမ်နှုန်းအပေါ် အခြေခံထားသည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် စာကြည့်တိုက်များ၏ မတူကွဲပြားမှု (~109) ကို HTS ဖြင့်ပင် အပြည့်အဝဖမ်းယူ၍မရသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ တည်နေရာတစ်ခုစီတွင် aa ၏ကြိမ်နှုန်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုက ထည့်သွင်းထားသော စာရင်း၏ နောက်ဆုံးတည်နေရာသုံးခုတွင် တည်နေရာပေါ်မူတည်သော ဘက်လိုက်မှုအနည်းငယ်ကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 2e)။ အဆုံးသတ်အနေဖြင့်၊ စာကြည့်တိုက်၏ အရည်အသွေးနှင့် မတူကွဲပြားမှုသည် လက်ခံနိုင်ဖွယ်ရှိပြီး ရွေးချယ်မှုအကြိမ်များစွာကြားတွင် phage စာကြည့်တိုက်များ၏ ချဲ့ထွင်မှုနှင့် ပြင်ဆင်မှုကြောင့် မတူကွဲပြားမှုတွင် အနည်းငယ်သာပြောင်းလဲမှုများကို တွေ့ရှိခဲ့ရသည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ ကောက်ချက်ချခဲ့သည်။
BBB နှင့်/သို့မဟုတ် BCSFB မှတစ်ဆင့် သွေးကြောထဲသို့ ထိုးသွင်းထားသော T7 phage ကို ခွဲခြားသိရှိနိုင်စေရန်အတွက် သတိရှိသော ကြွက်များ၏ CM ထဲသို့ cannula တစ်ခုကို ခွဲစိတ်ထည့်သွင်းခြင်းဖြင့် ဆက်တိုက် ဦးနှောက်အရည်နမူနာယူခြင်းကို ပြုလုပ်နိုင်သည် (iv)။ in vivo ရွေးချယ်မှု၏ ပထမအကြိမ် သုံးကြိမ်တွင် ကျွန်ုပ်တို့သည် လွတ်လပ်သော ရွေးချယ်မှုလက်တံနှစ်ခု (လက်တံ A နှင့် B) ကို အသုံးပြုခဲ့သည် (ပုံ 1c)။ ရွေးချယ်မှု၏ ပထမအကြိမ် သုံးကြိမ်တွင် ထည့်သွင်းထားသော phage စုစုပေါင်းပမာဏကို လျှော့ချခြင်းဖြင့် ရွေးချယ်မှု၏ တင်းကျပ်မှုကို တဖြည်းဖြည်း တိုးမြှင့်ခဲ့သည်။ panning ၏ စတုတ္ထအကြိမ်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အကိုင်းအခက် A နှင့် B မှ နမူနာများကို ပေါင်းစပ်ပြီး နောက်ထပ် လွတ်လပ်သော ရွေးချယ်မှု သုံးကြိမ်ကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ဤမော်ဒယ်တွင် T7 phage အမှုန်များ၏ in vivo ဂုဏ်သတ္တိများကို လေ့လာရန်အတွက်၊ wild-type phage (PAGISRELVDKL master insert) ကို ကြွက်များထဲသို့ အမြီးသွေးကြောမှတစ်ဆင့် ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ ဦးနှောက်အရည်နှင့် သွေးမှ phage များကို အချိန်အမျိုးမျိုးတွင် ပြန်လည်ရရှိခြင်းက နှိုင်းယှဉ်လျှင် သေးငယ်သော T7 icosahedral phage များသည် သွေးခန်းမှ လျင်မြန်စွာ ကနဦးရှင်းလင်းရေးအဆင့်ရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 3)။ ထိုးသွင်းထားသော titer များနှင့် ကြွက်များ၏ သွေးပမာဏအပေါ် အခြေခံ၍ ထိုးသွင်းထားသော ဆေးပမာဏမှ ၁% wt. phage ကိုသာ သွေးကြောထဲ ထိုးသွင်းပြီး ၁၀ မိနစ်အကြာတွင် သွေးထဲတွင် တွေ့ရှိခဲ့ရသည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ တွက်ချက်ခဲ့ပါသည်။ ဤကနဦး လျင်မြန်စွာ ကျဆင်းပြီးနောက်၊ ၂၇.၇ မိနစ် half-life ဖြင့် နှေးကွေးသော primary clearance ကို တိုင်းတာခဲ့ပါသည်။ အရေးကြီးသည်မှာ CSF compartment မှ phage အနည်းငယ်ကိုသာ ထုတ်ယူနိုင်ခဲ့ပြီး၊ CSF compartment ထဲသို့ wild-type phage ရွှေ့ပြောင်းမှုအတွက် နောက်ခံနည်းပါးကြောင်း ညွှန်ပြနေပါသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၃)။ ပျမ်းမျှအားဖြင့်၊ သွေးထဲတွင် T7 phage ၏ ၁ x ၁၀-၃% titer ခန့်နှင့် အစပိုင်းတွင် ထိုးသွင်းထားသော phage များ၏ ၄ x ၁၀-၈% ကိုသာ နမူနာယူသည့်ကာလတစ်လျှောက်လုံး (၀-၂၅၀ မိနစ်) အတွင်း ဦးနှောက်အရည်တွင် တွေ့ရှိခဲ့ရသည်။ မှတ်သားစရာကောင်းသည်မှာ ဦးနှောက်အရည်ရှိ wild-type phage ၏ half-life (၂၅.၇ မိနစ်) သည် သွေးတွင် တွေ့ရှိရသည်နှင့် ဆင်တူပါသည်။ ဤဒေတာများက CSF အခန်းကို သွေးနှင့် ပိုင်းခြားထားသော အတားအဆီးသည် CM-cannulated ကြွက်များတွင် ကောင်းစွာတည်ရှိနေကြောင်း ပြသနေပြီး၊ သွေးမှ CSF အခန်းထဲသို့ အလွယ်တကူ သယ်ယူပို့ဆောင်သော clones များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် phage စာကြည့်တိုက်များကို in vivo ရွေးချယ်နိုင်စေပါသည်။
(က) ကြီးမားသော ရေကန်တစ်ခုမှ ဦးနှောက်အရည် (CSF) ကို ပြန်လည်နမူနာယူရန် နည်းလမ်းတစ်ခုကို တည်ဆောက်ခြင်း။ (ခ) ဗဟိုအာရုံကြောစနစ် (CNS) အတားအဆီး၏ ဆဲလ်တည်နေရာနှင့် သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီး (BBB) ​​​​နှင့် သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးကို ဖြတ်ကျော်သော peptides များကို ဖော်ထုတ်ရန် အသုံးပြုသည့် ရွေးချယ်မှုဗျူဟာကို ပြသသည့် ပုံ။ (ဂ) In vivo phage display screening flowchart။ ရွေးချယ်မှုအဆင့်တစ်ခုစီတွင် phages (မြားများအတွင်းရှိ တိရစ္ဆာန်ခွဲခြားသတ်မှတ်သူများ) ကို သွေးကြောထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ ရွေးချယ်မှုအဆင့် ၄ အထိ သီးခြားရွေးချယ်စရာ အကိုင်းအခက်နှစ်ခု (A၊ B) ကို သီးခြားစီ သိမ်းဆည်းထားသည်။ ရွေးချယ်မှုအဆင့် ၃ နှင့် ၄ အတွက်၊ CSF မှ ထုတ်ယူထားသော phage clone တစ်ခုစီကို လက်ဖြင့် စီစဉ်ခဲ့သည်။ (ဃ) T7 peptide library (2 x 1012 phages/animal) ကို သွေးကြောထဲသို့ ထိုးသွင်းပြီးနောက် cannulated ကြွက်နှစ်ကောင်တွင် ရွေးချယ်မှုအဆင့် ပထမအဆင့်အတွင်း သွေး (အနီရောင်စက်ဝိုင်းများ) နှင့် ဦးနှောက်အရည် (အစိမ်းရောင်တြိဂံများ) မှ ခွဲထုတ်ထားသော phage ၏ Kinetics။ အပြာရောင်စတုရန်းများသည် ထိုးသွင်းထားသော phage ပမာဏမှ တွက်ချက်ထားသော သွေးထဲတွင် phage ၏ ပျမ်းမျှကနဦးပါဝင်မှုကို ညွှန်ပြပြီး စုစုပေါင်းသွေးပမာဏကို ထည့်သွင်းစဉ်းစားသည်။ အနက်ရောင်စတုရန်းများသည် သွေး phage အာရုံစူးစိုက်မှုမှ ခန့်မှန်းထားသော y မျဉ်း၏ ဖြတ်သွားရာနေရာကို ညွှန်ပြသည်။ (င၊ စ) peptide တွင်တွေ့ရှိရသော ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ထပ်တူကျနေသော tripeptide motifs အားလုံး၏ ဆွေမျိုးကြိမ်နှုန်းနှင့် ဖြန့်ဖြူးမှုကို တင်ပြပါ။ ဖတ်ရှုမှု ၁၀၀၀ တွင်တွေ့ရှိရသော motifs အရေအတွက်ကို ပြသထားသည်။ သိသာထင်ရှားစွာ (p < 0.001) ကြွယ်ဝသော motifs များကို အနီရောင်အစက်များဖြင့် မှတ်သားထားသည်။ (င) ထိုးသွင်းထားသော library ၏ tripeptide motif ၏ ဆွေမျိုးကြိမ်နှုန်းကို တိရစ္ဆာန် #1.1 နှင့် #1.2 မှ သွေးမှရရှိသော phage နှင့် နှိုင်းယှဉ်သော Correlation scatterplot။ (စ) သွေးနှင့် ဦးနှောက်အရည်တွင် သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော တိရစ္ဆာန် phage tripeptide motifs #1.1 နှင့် #1.2 ၏ ဆွေမျိုးကြိမ်နှုန်းများကို နှိုင်းယှဉ်သော Correlation scatterplot။ (ဆ၊ ဇ) သွေးတွင်ကြွယ်ဝသော phage (ဆ) နှင့် ထိုးသွင်းထားသော library များနှင့် CSF တွင်ကြွယ်ဝသော phage (ဇ) တို့၏ sequence ID ကိုယ်စားပြုမှု။ တစ်လုံးတည်းသော ကုဒ်၏ အရွယ်အစားသည် ထိုအမိုင်နိုအက်ဆစ်သည် ထိုနေရာတွင် မည်မျှမကြာခဏ ဖြစ်ပေါ်သည်ကို ဖော်ပြသည်။ အစိမ်းရောင် = ဝင်ရိုးစွန်း၊ ခရမ်းရောင် = ကြားနေ၊ အပြာရောင် = အခြေခံ၊ အနီရောင် = အက်ဆစ်ဓာတ် နှင့် အနက်ရောင် = ဟိုက်ဒရိုဖိုးဗစ် အမိုင်နိုအက်ဆစ်များ။ ပုံ ၁က၊ ခ ကို Eduard Urich မှ ဒီဇိုင်းထုတ်ပြီး ထုတ်လုပ်ခဲ့သည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် phage peptide library ကို CM တူရိယာကြွက်နှစ်ကောင် (clades A နှင့် B) ထဲသို့ထိုးသွင်းခဲ့ပြီး ဦးနှောက်အရည်နှင့်သွေးမှ phage ကိုခွဲထုတ်ခဲ့သည် (ပုံ 1d)။ library ၏အစောပိုင်းအမြန်ရှင်းလင်းမှုသည် wild-type phage နှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါကနည်းပါးသည်။ ထိုးသွင်းထားသော library ၏ပျမ်းမျှဝက်သက်တမ်းမှာ wild-type phage နှင့်ဆင်တူပြီး သွေးတွင် 24.8 မိနစ်နှင့် CSF တွင် 38.5 မိနစ်ဖြစ်သည်။ တိရစ္ဆာန်တစ်ခုစီမှသွေးနှင့် ဦးနှောက်အရည် phage နမူနာများကို HTS သို့ပို့ခဲ့ပြီး ဖော်ထုတ်ထားသော peptide အားလုံးကို tripeptide motif တိုတောင်းခြင်းရှိမရှိ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ Tripeptide motif များကို ရွေးချယ်ခဲ့ခြင်းမှာ ၎င်းတို့သည် ဖွဲ့စည်းပုံဖွဲ့စည်းခြင်းနှင့် peptide-protein အပြန်အလှန်ဆက်သွယ်မှုအတွက် အနည်းဆုံးအခြေခံကို ပံ့ပိုးပေးသောကြောင့်ဖြစ်သည်14,15။ ထိုးသွင်းထားသော phage library နှင့် တိရစ္ဆာန်နှစ်မျိုးလုံး၏သွေးမှထုတ်ယူထားသော clones များအကြား motif များ၏ဖြန့်ဖြူးမှုတွင် ကောင်းမွန်သောဆက်စပ်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 1e)။ အချက်အလက်များအရ library ၏ဖွဲ့စည်းမှုသည် သွေးအခန်းတွင် အနည်းငယ်သာကြွယ်ဝကြောင်းဖော်ပြသည်။ Weblogo16 software ကို လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ခြင်းကို အသုံးပြု၍ အမိုင်နိုအက်ဆစ်ကြိမ်နှုန်းများနှင့် consensus sequence များကို နေရာတစ်ခုစီတွင် ထပ်မံခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းတာက သွေး glycine အကြွင်းအကျန်တွေမှာ ကြွယ်ဝမှုပြင်းထန်တာကို ကျွန်တော်တို့တွေ့ရှိခဲ့ပါတယ် (ပုံ 1g)။ CSF မှရွေးချယ်ထားသော clone များနှင့် သွေးကိုနှိုင်းယှဉ်သောအခါ၊ ခိုင်မာသောရွေးချယ်မှုနှင့် motif အချို့ကို ရွေးချယ်ခြင်းအချို့ကို တွေ့ရှိခဲ့ရပါတယ် (ပုံ 1f)၊ အချို့သော amino acid များသည် 12-member ရှိ ကြိုတင်သတ်မှတ်ထားသောနေရာများတွင် ဦးစားပေးရှိနေပါသည် (ပုံ 1h)။ မှတ်သားစရာကောင်းတာက တစ်ဦးချင်းတိရစ္ဆာန်တွေဟာ cerebrospinal fluid မှာ သိသိသာသာကွဲပြားပေမယ့် တိရစ္ဆာန်နှစ်မျိုးလုံးမှာ သွေး glycine ကြွယ်ဝမှုကို တွေ့ရှိခဲ့ရပါတယ် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 4a–j)။ တိရစ္ဆာန် #1.1 နှင့် #1.2 ၏ cerebrospinal fluid တွင် sequence data ကို တင်းကျပ်စွာစစ်ထုတ်ပြီးနောက်၊ စုစုပေါင်း 964 ခုနှင့် ထူးခြားသော 12-mer peptides 420 ခုကို ရရှိခဲ့ပါသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 1d–e)။ သီးခြား phage clone များကို ချဲ့ထွင်ပြီး in vivo ရွေးချယ်မှု၏ ဒုတိယအကျော့ကို ခံယူခဲ့ပါတယ်။ ဒုတိယအချီရွေးချယ်မှုမှ ထုတ်ယူထားသော phage များကို တိရစ္ဆာန်တစ်ခုစီတွင် HTS ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး ဖော်ထုတ်ထားသော peptide အားလုံးကို tripeptide motif များဖြစ်ပေါ်မှုကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် motif အသိအမှတ်ပြုပရိုဂရမ်သို့ input အဖြစ်အသုံးပြုခဲ့သည် (ပုံ 2a၊ b၊ ef)။ CSF မှပြန်လည်ရရှိသော phage ၏ပထမစက်ဝန်းနှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် အကိုင်းအခက် A နှင့် B ရှိ CSF ရှိ motif အများအပြားကို နောက်ထပ်ရွေးချယ်မှုနှင့် ရွေးချယ်မှုကို ပယ်ဖျက်ခြင်းတို့ကို တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 2)။ ၎င်းတို့သည် တသမတ်တည်း sequence ၏ မတူညီသောပုံစံများကို ကိုယ်စားပြုခြင်းရှိမရှိ ဆုံးဖြတ်ရန် network identification algorithm ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ alternative clade A (ပုံ 2c၊ d) နှင့် clade B (ပုံ 2g၊ h) တွင် CSF မှပြန်လည်ရရှိသော 12-dimensional sequences များအကြားတွင် ရှင်းလင်းသောဆင်တူမှုကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ အကိုင်းအခက်တစ်ခုစီတွင် ပေါင်းစပ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် 12-mer peptides အတွက် မတူညီသောရွေးချယ်မှုပရိုဖိုင်များ (နောက်ဆက်တွဲပုံ 5c၊ d) နှင့် ဒုတိယအချီရွေးချယ်မှုပြီးနောက် ပေါင်းစပ် clones များအတွက် CSF/သွေး titer အချိုးတွင် အချိန်နှင့်အမျှ တိုးလာမှုကို ဖော်ထုတ်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 5e)။
in vivo လုပ်ဆောင်နိုင်သော phage display ရွေးချယ်မှု၏ ဆက်တိုက်နှစ်ကြိမ်ပြုလုပ်ခြင်းဖြင့် cerebrospinal fluid တွင် motifs နှင့် peptides များကြွယ်ဝစေခြင်း။
တိရစ္ဆာန်တစ်ခုစီ၏ ပထမအချီ (တိရစ္ဆာန်များ #1.1 နှင့် #1.2) မှ ပြန်လည်ရရှိသော ဦးနှောက်အရည် phages အားလုံးကို စုစည်း၊ ချဲ့ထွင်၊ HT-sequence လုပ်ကာ အတူတကွ ပြန်လည်ထိုးသွင်းခဲ့သည် (phages/တိရစ္ဆာန် ၂ ခု x 1010)။ SM cannulated ကြွက် ၂ ကောင် (#1.1 → #)။ 2.1 နှင့် 2.2၊ 1.2 → 2.3 နှင့် 2.4)။ (a,b,e,f) ပထမနှင့် ဒုတိယရွေးချယ်မှုအချီများတွင် CSF မှဆင်းသက်လာသော phages အားလုံး၏ tripeptide motifs များ၏ relative frequency ကို နှိုင်းယှဉ်သည့် Correlation scatterplots။ peptides များတွင်တွေ့ရှိရသော ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ထပ်တူကျနေသော tripeptides အားလုံးကို ကိုယ်စားပြုသည့် motifs များ၏ relative frequency နှင့် distribution။ ဖတ်ရှုမှု ၁၀၀၀ တွင်တွေ့ရှိရသော motifs အရေအတွက်ကို ပြသထားသည်။ နှိုင်းယှဉ်ထားသော library တစ်ခုတွင် သိသိသာသာ (p < 0.001) ရွေးချယ်ထားသော သို့မဟုတ် ဖယ်ထုတ်ထားသော motifs များကို အနီရောင်အစက်များဖြင့် မီးမောင်းထိုးပြထားသည်။ (ဂ၊ ဃ၊ ဆ၊ ဇ) in vivo ရွေးချယ်မှု၏ အချီ ၂ နှင့် ၁ အပေါ်အခြေခံ၍ CSF ကြွယ်ဝသော အမိုင်နိုအက်ဆစ် ၁၂ မျိုးပါ အစီအစဥ်အားလုံး၏ အစီအစဥ်လိုဂိုကိုယ်စားပြုမှု။ အက္ခရာတစ်လုံးတည်းပါသော ကုဒ်၏အရွယ်အစားသည် ထိုနေရာတွင် ထိုအမိုင်နိုအက်ဆစ် မည်မျှမကြာခဏဖြစ်ပေါ်သည်ကို ဖော်ပြသည်။ လိုဂိုကိုကိုယ်စားပြုရန်အတွက်၊ ရွေးချယ်မှုအချီနှစ်ခုကြားရှိ တစ်ဦးချင်းတိရစ္ဆာန်များမှ ထုတ်ယူထားသော CSF အစီအစဥ်များ၏ ကြိမ်နှုန်းကို နှိုင်းယှဉ်ပြီး ဒုတိယအချီရှိ ကြွယ်ဝသော အစီအစဥ်များကို ပြသထားသည်- (ဂ) #၁.၁–#၂.၁ (ဃ) #၁.၁–#၂.၂ (ဆ) #၁.၂–#၂.၃ နှင့် (ဇ) #၁.၂–#၂.၄။ (ဂ၊ ဃ) နံပါတ် ၂.၁ နှင့် နံပါတ် ၂.၂ တိရစ္ဆာန်များ သို့မဟုတ် နံပါတ် ၂.၃ နှင့် နံပါတ် ၂.၄ တိရစ္ဆာန်များတွင် ပေးထားသောနေရာတွင် အကြွယ်ဝဆုံး အမိုင်နိုအက်ဆစ်များကို အရောင်ဖြင့်ပြသထားသည်။ အစိမ်းရောင် = ဝင်ရိုးစွန်း၊ ခရမ်းရောင် = ကြားနေ၊ အပြာရောင် = အခြေခံ၊ အနီရောင် = အက်ဆစ်ဓာတ် နှင့် အနက်ရောင် = ဟိုက်ဒရိုဖိုးဗစ် အမိုင်နိုအက်ဆစ်များ။
တတိယအချီရွေးချယ်မှုအပြီးတွင်၊ တိရစ္ဆာန်နှစ်ကောင်မှခွဲထုတ်ထားသော CSF ပြန်လည်ဖွဲ့စည်းထားသော phage clones ၃၃၂ ခုမှ ထူးခြားသော peptide sequences ၁၂၄ ခု (#၃.၁ နှင့် #၃.၂) ကို ကျွန်ုပ်တို့ဖော်ထုတ်နိုင်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၆က)။ sequence LGSVS (၁၈.၇%) သည် အမြင့်ဆုံး relative proportion ရှိပြီး၊ ထို့နောက် wild-type insert များဖြစ်သည့် PAGISRELVDKL (၈.၂%)၊ MRWFFSHASQGR (၃%)၊ DVAKVS (၃%)၊ TWLFSLG (၂.၂%) နှင့် SARGSWREIVSLS (၂.၂%) တို့ အသီးသီးရှိခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးစတုတ္ထအချီတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် သီးခြားတိရစ္ဆာန်သုံးကောင်မှ သီးခြားရွေးချယ်ထားသော အကိုင်းအခက်နှစ်ခုကို စုစည်းခဲ့သည် (ပုံ ၁ဂ)။ CSF မှပြန်လည်ရရှိသော sequence လုပ်ထားသော phage clones ၉၂၅ ခုအနက်၊ စတုတ္ထအချီတွင် ထူးခြားသော peptide sequences ၆၄ ခုကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၆ခ)၊ ၎င်းတို့အနက် wild-type phage ၏ relative proportion သည် ၀.၈% အထိ ကျဆင်းသွားခဲ့သည်။ စတုတ္ထအချီတွင် အသုံးအများဆုံး CSF clones များမှာ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%)၊ LGSVS (17%)၊ GFVRFRLSNTR (14%)၊ KWAWRVFSLFWK (7%)၊ SVHGV (5%)၊ GRPQKINGARVC (3.6%) နှင့် RLSSVDSDLSGC (3, 2%) တို့ဖြစ်သည်။ ရွေးချယ်ထားသော peptides များ၏ အရှည်အပိုင်းအခြားသည် NNK library ဒီဇိုင်းအတွက် degenerate codons များကိုအသုံးပြုသည့်အခါ library primers များတွင် nucleotide ထည့်သွင်းခြင်း/ဖျက်ခြင်း သို့မဟုတ် premature stop codons များကြောင့်ဖြစ်သည်။ Premature stop codons များသည် ပိုတိုသော peptides များကိုထုတ်ပေးပြီး ၎င်းတို့တွင် ကောင်းမွန်သော aa motif ပါ၀င်သောကြောင့် ရွေးချယ်ခြင်းဖြစ်သည်။ synthetic library များ၏ primers များတွင် ထည့်သွင်းခြင်း/ဖျက်ခြင်းမှ ပိုရှည်သော peptides များဖြစ်ပေါ်လာနိုင်သည်။ ၎င်းသည် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသော stop codon ကို frame အပြင်ဘက်တွင် ထားရှိပြီး stop codon အသစ်တစ်ခု ပေါ်လာသည်အထိ ဖတ်သည်။ ယေဘုယျအားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် input data ကို sample output data နှင့် နှိုင်းယှဉ်ခြင်းဖြင့် selection round လေးခုလုံးအတွက် enrichment factors များကို တွက်ချက်ခဲ့သည်။ ပထမအချီ စစ်ဆေးမှုအတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် wild-type phage titers များကို သီးသန့်မဟုတ်သော နောက်ခံကိုးကားချက်အဖြစ် အသုံးပြုခဲ့သည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ၊ negative phage ရွေးချယ်မှုသည် CSF ዘዴ၏ ပထမဆုံးစက်ဝန်းတွင် အလွန်အားကောင်းသော်လည်း သွေးတွင်မူ မဟုတ်ပါ (ပုံ 3a)၊ ၎င်းသည် peptide library ၏ အဖွဲ့ဝင်အများစုသည် CSF compartment ထဲသို့ passive diffusion သို့မဟုတ် relative phages များသည် bacteriophage များထက် သွေးကြောမှ ပိုမိုထိရောက်စွာ ထိန်းသိမ်းထားခြင်း သို့မဟုတ် ဖယ်ရှားခြင်းခံရနိုင်ခြေ နည်းပါးခြင်းကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်။ သို့သော်၊ panning ၏ ဒုတိယအချီတွင်၊ clades နှစ်ခုလုံးတွင် CSF ရှိ phages များကို အားကောင်းစွာ ရွေးချယ်မှုကို တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ ယခင်အချီတွင် CSF စုပ်ယူမှုကို မြှင့်တင်ပေးသော peptides များကို ပြသသည့် phages များတွင် ကြွယ်ဝလာကြောင်း အကြံပြုထားသည် (ပုံ 3a)။ ထပ်မံ၍ သိသာထင်ရှားသော သွေးကြွယ်ဝမှု မရှိပါ။ တတိယနှင့် စတုတ္ထအချီများတွင်လည်း phage clones များသည် CSF တွင် သိသိသာသာ ကြွယ်ဝလာခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးရွေးချယ်မှု အချီနှစ်ခုကြားရှိ ထူးခြားသော peptide sequence တစ်ခုစီ၏ relative frequency ကို နှိုင်းယှဉ်ကြည့်လျှင်၊ စတုတ္ထအချီ ရွေးချယ်မှုတွင် sequences များသည် ပိုမိုကြွယ်ဝလာကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 3b)။ peptide ዘዴနှစ်ခုလုံးကို အသုံးပြု၍ ထူးခြားသော peptide sequence ၆၄ ခုလုံးမှ tripeptide motifs ၉၃၁ ခုကို ထုတ်ယူခဲ့သည်။ စတုတ္ထအချီတွင် အကြွယ်ဝဆုံး motifs များကို ထိုးသွင်းထားသော library (cut-off: 10% enrichment) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အချီအားလုံးတွင် ၎င်းတို့၏ enrichment profiles များအတွက် ပိုမိုနီးကပ်စွာ စစ်ဆေးခဲ့သည် (supplementary Fig. 6c)။ ရွေးချယ်မှု၏ အထွေထွေပုံစံများက လေ့လာထားသော motifs အများစုသည် ရွေးချယ်မှုဌာနခွဲနှစ်ခုလုံး၏ ယခင်အချီအားလုံးတွင် ကြွယ်ဝကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ သို့သော် အချို့ motifs (ဥပမာ SGL၊ VSG၊ LGS GSV) များသည် အဓိကအားဖြင့် alternative clade A မှဖြစ်ပြီး အခြား motifs (ဥပမာ FGW၊ RTN၊ WGF၊ NTR) များကို alternative clade B တွင် ကြွယ်ဝစေသည်။
CSF ကြွယ်ဝသော phage-displayed peptides နှင့် streptavidin payloads နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော biotinylated leader peptides များ၏ CSF သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးကို အတည်ပြုခြင်း။
(က) ထိုးသွင်းထားသော (input = I) phage (PFU) titers နှင့် ဆုံးဖြတ်ထားသော CSF phage titers (output = O) ကို အခြေခံ၍ အချီလေးခုလုံး (R1-R4) တွင် တွက်ချက်ထားသော အာဟာရဖြည့်တင်းမှုအချိုးများ။ နောက်ဆုံး အချီသုံးကြိမ် (R2-R4) အတွက် အာဟာရဖြည့်တင်းမှုအချက်များကို ယခင်အချီနှင့် ပထမအချီ (R1) နှင့် အလေးချိန်ဒေတာဖြင့် နှိုင်းယှဉ်တွက်ချက်ခဲ့သည်။ ပွင့်လင်းသောဘားများသည် ဦးနှောက်အရည်ဖြစ်ပြီး၊ အရိပ်ရှိသောဘားများသည် ပလာစမာဖြစ်သည်။ (***p<0.001၊ ကျောင်းသား၏ t-test အပေါ်အခြေခံသည်)။ (ခ) အပေါများဆုံး phage peptides စာရင်း၊ ရွေးချယ်မှုအချီ ၄ ပြီးနောက် CSF တွင် စုဆောင်းရရှိသော phage အားလုံးနှင့် ၎င်းတို့၏ ဆွေမျိုးအချိုးအစားအလိုက် အဆင့်သတ်မှတ်ထားသည်။ အသုံးအများဆုံး phage clone ခြောက်ခုကို အရောင်ဖြင့် မီးမောင်းထိုးပြထားပြီး၊ နံပါတ်တပ်ထားပြီး ရွေးချယ်မှုအချီ ၃ နှင့် ၄ အကြားတွင် ၎င်းတို့၏ အာဟာရဖြည့်တင်းမှုအချက်များ (insets) ကို ဖော်ပြထားသည်။ (ဂ၊ဃ) အချီ ၄ မှ အကြွယ်ဝဆုံး phage clone ခြောက်ခု၊ ဗလာ phage နှင့် မိဘ phage peptide စာကြည့်တိုက်များကို CSF နမူနာပုံစံတွင် တစ်ဦးချင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ CSF နှင့် သွေးနမူနာများကို ညွှန်ပြထားသော အချိန်အမှတ်များတွင် စုဆောင်းခဲ့သည်။ (ဂ) ကိုယ်စားလှယ်လောင်း phage clone ၆ ခု (၂ x ၁၀၁၀ phages/တိရစ္ဆာန်)၊ ဗလာ phages (#၁၇၇၉) (၂ x ၁၀၁၀ phages/တိရစ္ဆာန်) နှင့် စတော့ phage peptide libraries (၂ x ၁၀၁၂ phages/တိရစ္ဆာန်) တို့ကို ညီမျှသောပမာဏဖြင့် ထိုးသွင်းပါ။ အနည်းဆုံး ၃ CM ကို cannulated တိရစ္ဆာန်သို့ အမြီးသွေးကြောမှတစ်ဆင့် သီးခြားထိုးသွင်းပါ။ ထိုးသွင်းထားသော phage clone တစ်ခုစီနှင့် phage peptide library တစ်ခုစီ၏ CSF ဆေးဝါးဒိုင်းနမစ်ကို အချိန်နှင့်အမျှ ပြသထားသည်။ (ဃ) နမူနာယူချိန်အတွင်း ပြန်လည်ရရှိသော phages/mL အားလုံးအတွက် ပျမ်းမျှ CSF/သွေးအချိုးကို ပြသထားသည်။ (င) ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ဦးဆောင် peptide လေးခုနှင့် ရောနှောထားသော ထိန်းချုပ်ကိရိယာတစ်ခုကို ၎င်းတို့၏ N-terminus (tetramer display) မှတစ်ဆင့် biotin နှင့် streptavidin နှင့် ချိတ်ဆက်ပြီးနောက် ထိုးသွင်းခြင်း (အမြီးသွေးကြော iv၊ 10 mg streptavidin/kg) ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အနည်းဆုံး intubated ကြွက်သုံးကောင် (N = 3)။ ). CSF နမူနာများကို ညွှန်ပြထားသော အချိန်အမှတ်များတွင် စုဆောင်းခဲ့ပြီး streptavidin ပါဝင်မှုများကို CSF anti-streptavidin ELISA ဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည် (nd = မတွေ့ရှိပါ)။ (*p<0.05၊ **p<0.01၊ ***p<0.001၊ ANOVA စမ်းသပ်မှုအပေါ် အခြေခံသည်)။ (f) အကြွယ်ဝဆုံး phage peptide clone #2002 (ခရမ်းရောင်) ၏ အမိုင်နိုအက်ဆစ် အစီအစဉ်နှင့် စတုတ္ထအချီ ရွေးချယ်မှုမှ အခြားရွေးချယ်ထားသော phage peptide clones များကို နှိုင်းယှဉ်ခြင်း။ တူညီသောနှင့် အလားတူ အမိုင်နိုအက်ဆစ် အပိုင်းအစများကို အရောင်ကုဒ်ဖြင့် ဖော်ပြထားသည်။
စတုတ္ထအချီ (ပုံ 3b) ရှိ ကြွယ်ဝသော phage အားလုံးအနက်မှ ကိုယ်စားလှယ်လောင်း clone ခြောက်ခုကို CSF နမူနာပုံစံတွင် နောက်ထပ်တစ်ဦးချင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုအတွက် ရွေးချယ်ခဲ့သည်။ ကိုယ်စားလှယ်လောင်း phage ခြောက်ခု၊ ဗလာ phage (ထည့်သွင်းခြင်းမရှိ) နှင့် prophage peptide libraries များကို တူညီသောပမာဏဖြင့် cannulated CM တိရစ္ဆာန်သုံးကောင်ထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့ပြီး ဆေးဝါးဒိုင်းနမစ်ကို CSF (ပုံ 3c) နှင့် သွေး (နောက်ဆက်တွဲပုံ 7) assays များတွင် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ စမ်းသပ်ထားသော phage clone အားလုံးသည် CSF compartment ကို ဗလာ control phage (#1779) ထက် 10-1000 ဆပိုမိုမြင့်မားသောအဆင့်တွင် ပစ်မှတ်ထားခဲ့သည်။ ဥပမာအားဖြင့်၊ clone #2020 နှင့် #2077 တို့တွင် control phage ထက် 1000 ဆခန့်ပိုမိုမြင့်မားသော CSF titers များရှိသည်။ ရွေးချယ်ထားသော peptide တစ်ခုစီ၏ pharmacokinetic profile သည် မတူညီသော်လည်း ၎င်းတို့အားလုံးတွင် CSF homing စွမ်းရည်မြင့်မားသည်။ ကလုန်း #၁၉၀၃ နှင့် #၂၀၁၁ တို့အတွက် အချိန်နှင့်အမျှ အဆက်မပြတ် ကျဆင်းမှုကို ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့ပြီး၊ ကလုန်း #၂၀၇၇၊ #၂၀၀၂ နှင့် #၂၀၀၉ တို့အတွက် ပထမ ၁၀ မိနစ်အတွင်း တိုးလာခြင်းသည် တက်ကြွသော သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးကို ညွှန်ပြနေနိုင်သော်လည်း အတည်ပြုရန် လိုအပ်ပါသည်။ ကလုန်း #၂၀၂၀၊ #၂၀၀၂ နှင့် #၂၀၇၇ တို့သည် မြင့်မားသောအဆင့်တွင် တည်ငြိမ်နေပြီး ကလုန်း #၂၀၀၉ ၏ CSF ပါဝင်မှုသည် ကနဦးတိုးမြှင့်ပြီးနောက် ဖြည်းဖြည်းချင်း ကျဆင်းသွားခဲ့သည်။ ထို့နောက် CSF ကိုယ်စားလှယ်တစ်ဦးစီ၏ သွေးပါဝင်မှုနှင့် ဆွေမျိုးကြိမ်နှုန်းကို နှိုင်းယှဉ်ခဲ့ပါသည် (ပုံ ၃ဃ)။ နမူနာယူချိန်အားလုံးတွင် CSF ကိုယ်စားလှယ်တစ်ဦးစီ၏ ပျမ်းမျှ titer နှင့် သွေး titer ၏ ဆက်စပ်မှုက ကိုယ်စားလှယ်ခြောက်ဦးတွင် သုံးဦးသည် သွေး CSF တွင် သိသိသာသာ ကြွယ်ဝနေကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ ကလုန်း #၂၀၇၇ သည် သွေးတည်ငြိမ်မှု ပိုမိုမြင့်မားကြောင်း ပြသခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၇)။ peptide များသည် phage အမှုန်များမှလွဲ၍ အခြားကုန်စည်များကို CSF အခန်းထဲသို့ တက်ကြွစွာ သယ်ယူပို့ဆောင်နိုင်ကြောင်း အတည်ပြုရန်အတွက် peptide များသည် phage အမှုန်နှင့် တွယ်ကပ်သည့် N-terminus တွင် biotin ဖြင့် ဆင်းသက်လာသော ခေါင်းဆောင် peptide လေးမျိုးကို ကျွန်ုပ်တို့ ပေါင်းစပ်ခဲ့သည်။ Biotinylated peptides (နံပါတ် ၂၀၀၂၊ ၂၀၀၉၊ ၂၀၂၀ နှင့် ၂၀၇၇) များကို phage geometry နှင့် ဆင်တူသော multimeric ပုံစံများရရှိရန် streptavidin (SA) နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသည်။ ဤပုံစံသည် သွေးနှင့် ဦးနှောက်အရည်တွင် SA ထိတွေ့မှုကို ကုန်စည်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးပရိုတင်း peptides အဖြစ် တိုင်းတာနိုင်စေခဲ့သည်။ အရေးကြီးသည်မှာ၊ ဤ SA-conjugated ပုံစံဖြင့် ဓာတု peptides များကို ထိုးသွင်းသောအခါ phage data ကို မကြာခဏ ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်သည် (ပုံ ၃e)။ ရောနှောထားသော peptides များသည် ကနဦးထိတွေ့မှုနည်းပါးပြီး ၄၈ နာရီအတွင်း မတွေ့ရှိနိုင်သောအဆင့်များဖြင့် CSF ရှင်းလင်းမှုမြန်ဆန်သည်။ ဤ peptide phage clones များ၏ CSF အာကာသထဲသို့ ပို့ဆောင်ရေးလမ်းကြောင်းများကို ထိုးထွင်းသိမြင်နိုင်ရန်အတွက်၊ in vivo တွင် သွေးကြောထဲထိုးသွင်းပြီး ၁ နာရီအကြာတွင် phage အမှုန်များကို တိုက်ရိုက်ထောက်လှမ်းရန် immunohistochemistry (IHC) ကို အသုံးပြု၍ တစ်ဦးချင်း phage peptide ထိတွေ့မှု၏ localization ကို ကျွန်ုပ်တို့ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ထူးခြားသည်မှာ၊ clone #2002၊ #2077 နှင့် #2009 တို့ကို ဦးနှောက်ဆံချည်မျှင်သွေးကြောများတွင် ပြင်းထန်သောအရောင်ခြယ်ခြင်းဖြင့် ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သော်လည်း၊ ထိန်းချုပ် phage (#1779) နှင့် clone #2020 တို့ကို မတွေ့ရှိခဲ့ပါ (နောက်ဆက်တွဲပုံ 8)။ ၎င်းက ဤ peptide များသည် BBB ကိုဖြတ်ကျော်ခြင်းဖြင့် ဦးနှောက်အပေါ် အကျိုးသက်ရောက်မှုကို တိကျစွာ ပံ့ပိုးပေးသည်ဟု အကြံပြုထားသည်။ BSCFB လမ်းကြောင်းလည်း ပါဝင်နိုင်သောကြောင့် ဤယူဆချက်ကို စမ်းသပ်ရန် နောက်ထပ်အသေးစိတ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု လိုအပ်ပါသည်။ အကြွယ်ဝဆုံး clone (#2002) ၏ အမိုင်နိုအက်ဆစ်အစီအစဥ်ကို အခြားရွေးချယ်ထားသော peptide များနှင့် နှိုင်းယှဉ်သောအခါ၊ ၎င်းတို့အချို့တွင် အလားတူ အမိုင်နိုအက်ဆစ်တိုးချဲ့မှုများရှိကြောင်း သတိပြုမိပြီး ၎င်းသည် အလားတူသယ်ယူပို့ဆောင်ရေးယန္တရားကို ညွှန်ပြနိုင်သည် (ပုံ 3f)။
၎င်း၏ထူးခြားသော plasma profile နှင့် CSF တွင် အချိန်နှင့်အမျှ သိသာထင်ရှားသော တိုးလာမှုကြောင့်၊ phage display clone #2077 ကို ၄၈ နာရီကြာ ပိုမိုလေ့လာခဲ့ပြီး SA အဆင့်များ စဉ်ဆက်မပြတ်တိုးလာခြင်းနှင့် ဆက်စပ်၍ တွေ့ရှိရသော CSF တွင် လျင်မြန်စွာတိုးလာမှုကို ပြန်လည်ထုတ်လုပ်နိုင်ခဲ့သည် (ပုံ ၄က)။ အခြားဖော်ထုတ်ထားသော phage clones များနှင့် ပတ်သက်၍၊ #2077 သည် ဦးနှောက်ဆံချည်မျှင်သွေးကြောများအတွက် ပြင်းထန်စွာ stained လုပ်ခဲ့ပြီး ပိုမိုမြင့်မားသော resolution ဖြင့်ကြည့်သောအခါ capillary marker lectin နှင့် သိသာထင်ရှားသော colocalization ကိုပြသခဲ့ပြီး parenchymal space တွင် အချို့သော staining များဖြစ်နိုင်သည် (ပုံ ၄ခ)။ CNS တွင် peptide-mediated ဆေးဝါးဗေဒဆိုင်ရာအကျိုးသက်ရောက်မှုများ ရရှိနိုင်မနိုင်ကို စုံစမ်းစစ်ဆေးရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် i) #2077 transit peptide နှင့် ii) BACE1 inhibitor peptide ၏ biotinylated ဗားရှင်းများကို SA နှင့် အချိုးအစားနှစ်ခုဖြင့် ရောနှောသည့် စမ်းသပ်မှုတစ်ခုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ပေါင်းစပ်မှုတစ်ခုအတွက် BACE1 peptide inhibitor ကိုသာ အသုံးပြုခဲ့ပြီး နောက်တစ်ခုအတွက် BACE1 peptide inhibitor နှင့် #2077 peptide ၏ 1:3 အချိုးကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ နမူနာနှစ်ခုလုံးကို သွေးကြောထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့ပြီး ဘီတာ-အမိုင်လွိုက် ပက်ပတိုက်ဒ် ၄၀ (Abeta40) ၏ သွေးနှင့် ဦးနှောက်အရည်ပမာဏကို အချိန်နှင့်အမျှ တိုင်းတာခဲ့သည်။ Abeta40 ကို CSF တွင် တိုင်းတာခဲ့ပြီး ၎င်းသည် ဦးနှောက် parenchyma ရှိ BACE1 တားဆီးမှုကို ထင်ဟပ်စေသောကြောင့်ဖြစ်သည်။ မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ ဒြပ်ပေါင်းနှစ်ခုစလုံးသည် Abeta40 ၏ သွေးပမာဏကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေသည် (ပုံ ၄ဂ၊ ဃ)။ သို့သော်၊ ပက်ပတိုက်ဒ်နံပါတ် ၂၀၇၇ နှင့် SA နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော BACE1 ပက်ပတိုက်ဒ်၏ inhibitor ပါဝင်သော နမူနာများသာ ဦးနှောက်အရည်တွင် Abeta40 ကို သိသိသာသာ လျော့ကျစေသည် (ပုံ ၄ဂ)။ အချက်အလက်များအရ ပက်ပတိုက်ဒ်နံပါတ် ၂၀၇၇ သည် 60 kDa SA ပရိုတင်းကို CNS သို့ သယ်ယူပို့ဆောင်နိုင်ပြီး BACE1 ပက်ပတိုက်ဒ်၏ SA-ပေါင်းစပ်ထားသော inhibitors များဖြင့် ဆေးဝါးဗေဒဆိုင်ရာ အကျိုးသက်ရောက်မှုများကိုလည်း ဖြစ်ပေါ်စေကြောင်း ပြသထားသည်။
(က) T7 phage ၏ CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) နှင့် ထိုးသွင်းမထားသော control phage (#1779) ၏ ရေရှည် pharmacokinetic profile များကို ပြသသည့် CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) နှင့် ထိုးသွင်းမထားသော control phage (#1779) ၏ ရေရှည် pharmacokinetic profile များကို CM intubated ကြွက်သုံးကောင်တွင် ပြသထားသည်။ (ခ) phage ထိုးသွင်းထားသော ကြွက်များ (2 × 10 10 phages/တိရစ္ဆာန်) ရှိ ကိုယ်စားပြု cortical microvessels များ၏ Confocal microscopic image သည် peptide #2077 နှင့် သွေးကြောများ (lectin) ၏ counter-staining ကို ပြသသည်။ ဤ phage clones များကို ကြွက် ၃ ကောင်ထံ ထိုးပေးပြီး perfusion မလုပ်မီ ၁ နာရီကြာ လည်ပတ်စေခဲ့သည်။ ဦးနှောက်များကို ပိုင်းခြားပြီး T7 phage capsid ကို ဆန့်ကျင်သော polyclonal FITC-labeled antibodies များဖြင့် stain လုပ်ခဲ့သည်။ perfusion နှင့် နောက်ဆက်တွဲ fixation မလုပ်မီ ဆယ်မိနစ်အလိုတွင် DyLight594-labeled lectin ကို သွေးကြောထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ ဆံချည်မျှင်သွေးကြောများနှင့် perivascular ဦးနှောက်တစ်ရှူးများ၏ lumen ရှိ microvessels နှင့် phages များ၏ luminal ဘက်ခြမ်း (အစိမ်းရောင်) ၏ lectin staining (အနီရောင်) ကိုပြသသည့် fluorescent ပုံများ။ scale bar သည် 10 µm နှင့်ကိုက်ညီသည်။ (c, d) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide ကို တစ်မျိုးတည်း သို့မဟုတ် biotinylated transit peptide #2077 နှင့်ပေါင်းစပ်၍ streptavidin နှင့်တွဲဖက်ပြီးနောက် အနည်းဆုံး cannulated CM ကြွက်သုံးကောင် (10 mg streptavidin/kg) ကို သွေးကြောထဲသို့ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ Aβ40 ရှိ BACE1 peptide inhibitor-mediated reduction ကို သွေး (အနီရောင်) နှင့် cerebrospinal fluid (လိမ္မော်ရောင်) တွင် Aβ1-40 ELISA ဖြင့် ညွှန်ပြထားသောအချိန်များတွင် တိုင်းတာခဲ့သည်။ ပိုမိုကောင်းမွန်စွာရှင်းလင်းစေရန်အတွက် 100% scale ဖြင့် graph ပေါ်တွင် အစက်ချမျဉ်းတစ်ကြောင်းဆွဲထားသည်။ (ဂ) transit peptide #2077 နှင့် BACE1 inhibitory peptide နှင့် 3:1 အချိုးဖြင့် streptavidin ဖြင့် ကုသထားသော ကြွက်များ၏ သွေး (အနီရောင်တြိဂံများ) နှင့် ဦးနှောက်အရည် (လိမ္မော်ရောင်တြိဂံများ) ရှိ Aβ40 ရာခိုင်နှုန်း လျော့ကျမှု။ (ဃ) BACE1 inhibitory peptide နှင့်သာ တွဲဖက်၍ streptavidin ဖြင့် ကုသထားသော ကြွက်များ၏ သွေး Aβ40 (အနီရောင်စက်ဝိုင်းများ) နှင့် ဦးနှောက်အရည် (လိမ္မော်ရောင်စက်ဝိုင်းများ) ရှိ ရာခိုင်နှုန်း လျော့ကျမှု။ ထိန်းချုပ်ထားသော Aβ ပါဝင်မှုသည် 420 pg/ml (စံသွေဖည်မှု = 101 pg/ml) ဖြစ်သည်။
Phage display ကို ဇီဝဆေးပညာသုတေသနနယ်ပယ်များစွာတွင် အောင်မြင်စွာအသုံးချခဲ့သည်17။ ဤနည်းလမ်းကို in vivo သွေးကြောမျိုးစုံလေ့လာမှုများ18,19 အပြင် ဦးနှောက်သွေးကြောများကိုပစ်မှတ်ထားသောလေ့လာမှုများအတွက်20,21,22,23,24,25,26 အတွက်လည်း အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဤလေ့လာမှုတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤရွေးချယ်မှုနည်းလမ်း၏အသုံးချမှုကို ဦးနှောက်သွေးကြောများကိုပစ်မှတ်ထားသော peptide များကိုတိုက်ရိုက်ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းအတွက်သာမက သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးကိုဖြတ်ကျော်ရန် တက်ကြွသောသယ်ယူပို့ဆောင်ရေးဂုဏ်သတ္တိများရှိသောကိုယ်စားလှယ်လောင်းများကိုရှာဖွေတွေ့ရှိရန်အထိပါ တိုးချဲ့ခဲ့သည်။ ယခု ကျွန်ုပ်တို့သည် CM intubated ကြွက်များတွင် in vivo ရွေးချယ်မှုလုပ်ထုံးလုပ်နည်းတစ်ခု၏ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကိုဖော်ပြပြီး CSF homing ဂုဏ်သတ္တိများရှိသော peptide များကိုခွဲခြားသတ်မှတ်ရန်၎င်း၏အလားအလာကိုသရုပ်ပြသည်။ 12-mer ကျပန်း peptide များ၏စာကြည့်တိုက်ကိုပြသထားသော T7 phage ကိုအသုံးပြုခြင်းဖြင့် T7 phage သည် သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးနှင့်လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ရန် (အချင်း 60 nm ခန့်)10 လုံလောက်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ပြသနိုင်ခဲ့ပြီး ထို့ကြောင့် သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီး သို့မဟုတ် choroid plexus ကိုတိုက်ရိုက်ဖြတ်ကျော်ခဲ့သည်။ cannulated CM ကြွက်များမှ CSF ထုတ်ယူခြင်းသည် in vivo လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ screening နည်းလမ်းကို ကောင်းစွာထိန်းချုပ်ထားပြီး ထုတ်ယူထားသော phage သည် သွေးကြောများနှင့် ချိတ်ဆက်ထားရုံသာမက သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးကို ဖြတ်ကျော်သည့် transporter အဖြစ်လည်း လုပ်ဆောင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ တွေ့ရှိခဲ့သည်။ ထို့အပြင်၊ သွေးကို တစ်ပြိုင်နက်စုဆောင်းပြီး CSF နှင့် သွေးမှရရှိသော phage များသို့ HTS ကို အသုံးပြုခြင်းဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ CSF ရွေးချယ်မှုသည် သွေးကြွယ်ဝမှု သို့မဟုတ် ရွေးချယ်မှုအဆင့်များအကြား ချဲ့ထွင်ရန် ကြံ့ခိုင်မှုတို့၏ လွှမ်းမိုးမှုမရှိကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။ သို့သော်၊ သွေးအခန်းသည် ရွေးချယ်မှုလုပ်ငန်းစဉ်၏ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းဖြစ်သည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် CSF အခန်းသို့ရောက်ရှိနိုင်သော phage များသည် ဦးနှောက်တွင် ၎င်းတို့ကိုယ်တိုင် ကြွယ်ဝစေရန် လုံလောက်သော အချိန်အတွင်း ရှင်သန်ပြီး သွေးကြောထဲတွင် လည်ပတ်နေရမည်ဖြစ်သည်။ raw HTS data မှ ယုံကြည်စိတ်ချရသော sequence information ကို ထုတ်ယူရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် analysis workflow တွင် platform-specific sequencing error များနှင့် လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် filter များကို အကောင်အထည်ဖော်ခဲ့သည်။ screening နည်းလမ်းတွင် kinetic parameters များကို ထည့်သွင်းခြင်းဖြင့်၊ သွေးတွင် wild-type T7 phage များ၏ မြန်ဆန်သော pharmacokinetics (t½ ~ 28 min) ကို အတည်ပြုခဲ့ပြီး cerebrospinal fluid တွင် ၎င်းတို့၏ half-life (t½ ~ 26 min per minute) ကိုလည်း ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ သွေးနှင့် CSF တွင် အလားတူ ဆေးဝါးဒိုင်းနမစ်ပရိုဖိုင်များရှိသော်လည်း၊ CSF တွင် phage ၏ သွေးပါဝင်မှု၏ 0.001% ကိုသာ တွေ့ရှိနိုင်ပြီး၊ သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးကို ဖြတ်၍ wild-type T7 phage ၏ နောက်ခံရွေ့လျားနိုင်မှု နည်းပါးကြောင်း ညွှန်ပြနေသည်။ ဤလုပ်ငန်းသည် in vivo panning ဗျူဟာများကို အသုံးပြုသည့်အခါ၊ အထူးသဖြင့် သွေးလည်ပတ်မှုမှ လျင်မြန်စွာ ရှင်းလင်းသွားသော phage စနစ်များအတွက် ရွေးချယ်မှု၏ ပထမအချီ၏ အရေးပါမှုကို မီးမောင်းထိုးပြသည်၊ အဘယ်ကြောင့်ဆိုသော် clone အနည်းငယ်သာ CNS အခန်းသို့ ရောက်ရှိနိုင်သောကြောင့်ဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့်၊ ပထမအချီတွင်၊ ဤအလွန်တင်းကျပ်သော CSF မော်ဒယ်တွင် clone အရေအတွက် အကန့်အသတ်ဖြင့်သာ နောက်ဆုံးတွင် စုဆောင်းနိုင်ခဲ့သောကြောင့်၊ library diversity လျော့ကျမှုမှာ အလွန်ကြီးမားခဲ့သည်။ ဤ in vivo panning ဗျူဟာတွင် CSF အခန်းတွင် တက်ကြွစွာစုဆောင်းခြင်း၊ သွေးအခန်းတွင် clone ရှင်သန်မှုနှင့် ပထမ ၁၀ မိနစ်အတွင်း သွေးမှ T7 phage clones များကို လျင်မြန်စွာ ဖယ်ရှားခြင်းကဲ့သို့သော ရွေးချယ်မှုအဆင့်များစွာ ပါဝင်သည် (ပုံ 1d ​​နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 4M)။ ထို့ကြောင့်၊ ပထမအချီပြီးနောက်၊ CSF တွင် phage clones အမျိုးမျိုးကို ဖော်ထုတ်နိုင်ခဲ့သော်လည်း၊ တစ်ဦးချင်းတိရစ္ဆာန်များအတွက် တူညီသော ကနဦးအစုအဝေးကို အသုံးပြုခဲ့သည်။ ဤသည်မှာ စာကြည့်တိုက်အဖွဲ့ဝင်အများအပြားပါဝင်သော အရင်းအမြစ်စာကြည့်တိုက်များအတွက် တင်းကျပ်သောရွေးချယ်မှုအဆင့်များစွာသည် ကွဲပြားမှုကို သိသိသာသာလျော့ကျစေကြောင်း အကြံပြုထားသည်။ ထို့ကြောင့် ကျပန်းဖြစ်ရပ်များသည် ကနဦးရွေးချယ်မှုလုပ်ငန်းစဉ်၏ မရှိမဖြစ်အစိတ်အပိုင်းတစ်ခုဖြစ်လာမည်ဖြစ်ပြီး ရလဒ်ကို သိသိသာသာလွှမ်းမိုးလိမ့်မည်။ မူလစာကြည့်တိုက်ရှိ clone အများစုသည် အလွန်ဆင်တူသော CSF ကြွယ်ဝမှုအလားအလာရှိဖွယ်ရှိသည်။ သို့သော် တူညီသောစမ်းသပ်မှုအခြေအနေများအောက်တွင်ပင် ကနဦးအစုအဝေးတွင် clone တစ်ခုစီ၏ အရေအတွက်နည်းပါးမှုကြောင့် ရွေးချယ်မှုရလဒ်များ ကွဲပြားနိုင်သည်။
CSF တွင်ကြွယ်ဝသော motif များသည် သွေးထဲတွင်ရှိသော motif များနှင့်ကွဲပြားသည်။ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ တစ်ဦးချင်းတိရစ္ဆာန်များ၏သွေးတွင် glycine ကြွယ်ဝသော peptide များဆီသို့ ပထမဆုံးပြောင်းလဲခြင်းကို ကျွန်ုပ်တို့သတိပြုမိခဲ့သည်။ (ပုံ 1g၊ နောက်ဆက်တွဲပုံ 4e၊ 4f)။ glycine peptide များပါဝင်သော phage များသည် ပိုမိုတည်ငြိမ်ပြီး သွေးလည်ပတ်မှုမှ ဖယ်ရှားခံရနိုင်ခြေနည်းပါးနိုင်သည်။ သို့သော်၊ ဤ glycine ကြွယ်ဝသော peptide များကို ဦးနှောက်အရည်နမူနာများတွင် မတွေ့ရှိခဲ့ပါ၊ ၎င်းသည် curated library များသည် ရွေးချယ်မှုအဆင့်နှစ်ဆင့်ကို ဖြတ်သန်းခဲ့ကြောင်း ညွှန်ပြသည်- တစ်ခုမှာ သွေးထဲတွင်ဖြစ်ပြီး နောက်တစ်ခုမှာ ဦးနှောက်အရည်ထဲတွင် စုပုံနေစေခဲ့သည်။ စတုတ္ထအကြိမ်မြောက်ရွေးချယ်မှုမှရရှိသော CSF ကြွယ်ဝသော clones များကို ကျယ်ကျယ်ပြန့်ပြန့်စမ်းသပ်ခဲ့သည်။ တစ်ဦးချင်းစမ်းသပ်ထားသော clones အားလုံးနီးပါးကို blank control phage ထက် CSF ကြွယ်ဝကြောင်း အတည်ပြုခဲ့သည်။ peptide တစ်ခု hit (#2077) ကို ပိုမိုအသေးစိတ်စစ်ဆေးခဲ့သည်။ ၎င်းသည် အခြား hits များနှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက plasma half-life ပိုရှည်ကြောင်းပြသခဲ့သည် (ပုံ 3d နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 7)၊ စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ ဤ peptide တွင် C-terminus တွင် cysteine ​​​​residue ပါဝင်သည်။ မကြာသေးမီက peptide များတွင် cysteine ​​​​ထည့်သွင်းခြင်းသည် albumin 29 နှင့် ချိတ်ဆက်ခြင်းဖြင့် ၎င်းတို့၏ pharmacokinetic ဂုဏ်သတ္တိများကို တိုးတက်စေနိုင်ကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ၎င်းသည် peptide #2077 အတွက် လက်ရှိတွင် မသိရသေးဘဲ နောက်ထပ်လေ့လာမှု လိုအပ်ပါသည်။ အချို့ peptide များသည် CSF ကြွယ်ဝမှုတွင် valence-dependency ကို ပြသခဲ့သည် (ဒေတာမပြထားပါ)၊ ၎င်းသည် T7 capsid ၏ ပြသထားသော မျက်နှာပြင် geometry နှင့် ဆက်စပ်နေနိုင်သည်။ ကျွန်ုပ်တို့အသုံးပြုခဲ့သော T7 စနစ်သည် phage အမှုန်တစ်ခုလျှင် peptide တစ်ခုစီ၏ မိတ္တူ ၅-၁၅ ခုကို ပြသခဲ့သည်။ IHC ကို ကြွက်များ၏ cerebral cortex ထဲသို့ သွေးကြောထဲသို့ ထိုးသွင်းထားသော candidate lead phage clones များတွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၈)။ ဒေတာများအရ အနည်းဆုံး clone သုံးခု (နံပါတ် ၂၀၀၂၊ နံပါတ် ၂၀၀၉ နှင့် နံပါတ် ၂၀၇၇) သည် BBB နှင့် အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုရှိကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ ဤ BBB အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုသည် CSF စုဆောင်းမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေသည် သို့မဟုတ် ဤ clones များကို BCSFB သို့ တိုက်ရိုက်ရွေ့လျားမှုကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်ဖြစ်စေ မဖြစ်စေ ဆုံးဖြတ်ရန် ကျန်ရှိနေသေးသည်။ အရေးကြီးသည်မှာ ရွေးချယ်ထားသော peptide များသည် ပေါင်းစပ်ပြီး ပရိုတင်း cargo နှင့် ချိတ်ဆက်သောအခါ ၎င်းတို့၏ CSF သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးစွမ်းရည်ကို ထိန်းသိမ်းထားသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ ပြသထားသည်။ N-terminal biotinylated peptides များကို SA နှင့် ချိတ်ဆက်ခြင်းသည် သွေးနှင့် ဦးနှောက်အရည်ရှိ ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာ phage clones များဖြင့် ရရှိသော ရလဒ်များကို အခြေခံအားဖြင့် ပြန်လည်ပြုလုပ်ပေးသည် (ပုံ 3e)။ နောက်ဆုံးတွင်၊ lead peptide #2077 သည် SA နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော BACE1 ၏ biotinylated peptide inhibitor ၏ ဦးနှောက်လုပ်ဆောင်ချက်ကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်ပြီး CSF ရှိ Abeta40 အဆင့်များကို သိသိသာသာ လျှော့ချပေးခြင်းဖြင့် CNS တွင် ထင်ရှားသော ဆေးဝါးဒိုင်းနမစ်အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို ဖြစ်ပေါ်စေကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ပြသထားသည် (ပုံ 4)။ hits အားလုံး၏ peptide sequence homology search ကို လုပ်ဆောင်ခြင်းဖြင့် database တွင် မည်သည့် homologues ကိုမျှ ကျွန်ုပ်တို့ ဖော်ထုတ်နိုင်ခြင်း မရှိခဲ့ပါ။ T7 library ၏ အရွယ်အစားသည် ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 109 ရှိပြီး 12-mers အတွက် theoretical library အရွယ်အစားမှာ 4 x 1015 ဖြစ်ကြောင်း မှတ်သားထားရန် အရေးကြီးပါသည်။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် 12-mer peptide library ၏ diversity space ၏ အစိတ်အပိုင်းအနည်းငယ်ကိုသာ ရွေးချယ်ခဲ့ပြီး၊ ဆိုလိုသည်မှာ ပိုမို optimized peptides များကို ဤဖော်ထုတ်ထားသော hits များ၏ adjacent sequence space ကို အကဲဖြတ်ခြင်းဖြင့် ဖော်ထုတ်နိုင်သည်ဟု ဆိုလိုနိုင်သည်။ ယူဆချက်အရ၊ ဤ peptide များ၏ သဘာဝ homologue များကို ကျွန်ုပ်တို့ မတွေ့ရှိရခြင်း၏ အကြောင်းရင်းများထဲမှ တစ်ခုမှာ ဦးနှောက်ထဲသို့ အချို့သော peptide motif များ မထိန်းချုပ်နိုင်စွာ ဝင်ရောက်ခြင်းကို ကာကွယ်ရန် ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ်အတွင်း ရွေးချယ်မှု ပျက်ပြယ်သွားခြင်းကြောင့် ဖြစ်နိုင်သည်။
ပေါင်းစပ်ကြည့်လျှင် ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များသည် in vivo တွင် ဦးနှောက်သွေးကြောအတားအဆီး၏ သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးစနစ်များကို ပိုမိုအသေးစိတ်ဖော်ထုတ်ရန်နှင့် လက္ခဏာရပ်များကို ဖော်ပြရန် အနာဂတ်လုပ်ငန်းအတွက် အခြေခံအုတ်မြစ်ကို ပံ့ပိုးပေးပါသည်။ ဤနည်းလမ်း၏ အခြေခံတည်ဆောက်ပုံသည် ဦးနှောက်သွေးကြောချိတ်ဆက်မှုဂုဏ်သတ္တိရှိသော clone များကို ဖော်ထုတ်ရုံသာမက အောင်မြင်သော clone များသည် in vivo တွင် CNS compartment အတွင်းသို့ ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာအတားအဆီးများကို ဖြတ်ကျော်ရန် intrinsic activity ရှိသော အရေးကြီးသောအဆင့်တစ်ခုလည်း ပါဝင်သော functional selection strategy တစ်ခုပေါ်တွင် အခြေခံထားသည်။ ဤ peptide များ၏ သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးယန္တရားနှင့် ဦးနှောက်ဒေသအတွက် သီးသန့် microvasculature နှင့် ချိတ်ဆက်ရန် ၎င်းတို့၏ ဦးစားပေးမှုကို ရှင်းလင်းဖော်ပြရန်ဖြစ်သည်။ ၎င်းသည် BBB နှင့် receptors များ သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးအတွက် လမ်းကြောင်းအသစ်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိရန် ဦးတည်စေနိုင်သည်။ ဖော်ထုတ်ထားသော peptide များသည် ဦးနှောက်သွေးကြော receptors များ သို့မဟုတ် BBB သို့မဟုတ် BCSFB မှတစ်ဆင့် သယ်ယူပို့ဆောင်သော လည်ပတ်နေသော ligands များနှင့် တိုက်ရိုက်ချိတ်ဆက်နိုင်မည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ မျှော်လင့်ပါသည်။ ဤလုပ်ငန်းတွင် ရှာဖွေတွေ့ရှိထားသော CSF သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးလုပ်ဆောင်ချက်ရှိသော peptide vectors များကို နောက်ထပ်စုံစမ်းစစ်ဆေးသွားမည်ဖြစ်သည်။ BBB နှင့်/သို့မဟုတ် BCSFB ကို ဖြတ်ကျော်နိုင်စွမ်းအတွက် ဤ peptide များ၏ ဦးနှောက်တိကျမှုကို လက်ရှိတွင် ကျွန်ုပ်တို့ စုံစမ်းစစ်ဆေးနေပါသည်။ ဤ peptide အသစ်များသည် receptor အသစ်များ သို့မဟုတ် လမ်းကြောင်းအသစ်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိရန်နှင့် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ ပစ္စည်းများကဲ့သို့သော macromolecules များကို ဦးနှောက်သို့ ပို့ဆောင်ရန်အတွက် အလွန်ထိရောက်သော platform အသစ်များ တီထွင်ရန်အတွက် အလွန်တန်ဖိုးရှိသော ကိရိယာများ ဖြစ်လာလိမ့်မည်။
ယခင်ကဖော်ပြခဲ့သောနည်းလမ်းကိုပြုပြင်မွမ်းမံခြင်းဖြင့် ကြီးမားသောရေကန် (CM) ကို ကန်နူးလ်ထည့်သွင်းပါ။ မေ့ဆေးပေးထားသော Wistar ကြွက်များ (၂၀၀-၃၅၀ ဂရမ်) ကို stereotaxic ကိရိယာပေါ်တွင်တပ်ဆင်ထားပြီး ဦးခေါင်းခွံကိုဖော်ထုတ်ရန် ရိတ်ထားသောနှင့် ပိုးသတ်ထားသောပြင်ဆင်ထားသောဦးရေပြားပေါ်တွင် အလယ်ဗဟိုခွဲစိတ်မှုတစ်ခုပြုလုပ်ခဲ့သည်။ အပေါ်ဘက် sash နေရာတွင် အပေါက်နှစ်ပေါက်ဖောက်ပြီး အပေါက်များတွင် fixing screws များကိုတပ်ဆင်ပါ။ သံမဏိ cannula ၏ stereotactic လမ်းညွှန်မှုအတွက် lateral occipital crest တွင် နောက်ထပ်အပေါက်တစ်ပေါက်ဖောက်ခဲ့သည်။ cannula ပတ်လည်တွင် dental cement ကိုလိမ်းပြီး screws များဖြင့်လုံခြုံအောင်ပြုလုပ်ပါ။ photo-curing နှင့် cement hardening ပြီးနောက် အရေပြားဒဏ်ရာကို 4/0 supramid suture ဖြင့်ပိတ်ခဲ့သည်။ cannula ကို မှန်ကန်စွာနေရာချထားခြင်းကို ဦးနှောက်အရည် (CSF) အလိုအလျောက်ယိုစိမ့်ခြင်းဖြင့် အတည်ပြုသည်။ stereotaxic ကိရိယာမှ ကြွက်ကိုဖယ်ရှားပါ၊ သင့်လျော်သောခွဲစိတ်ကုသမှုနှင့် နာကျင်မှုစီမံခန့်ခွဲမှုကိုခံယူပါ၊ ဦးနှောက်အရည်တွင် သွေးလက္ခဏာများတွေ့ရှိရသည်အထိ အနည်းဆုံးတစ်ပတ်ကြာပြန်လည်ကောင်းမွန်လာပါစေ။ Wistar ကြွက်များ (Crl:WI/Han) ကို Charles River (ပြင်သစ်) မှရရှိခဲ့သည်။ ကြွက်အားလုံးကို ရောဂါပိုးကင်းစင်သော သတ်မှတ်ထားသော အခြေအနေများတွင် ထားခဲ့သည်။ တိရစ္ဆာန်စမ်းသပ်မှုအားလုံးကို ဆွစ်ဇာလန်နိုင်ငံ၊ ဘေဆယ်မြို့၏ တိရစ္ဆာန်ဆေးကုဆရာဝန်ရုံးမှ အတည်ပြုခဲ့ပြီး တိရစ္ဆာန်လိုင်စင်အမှတ် ၂၄၇၄ (ကြွက်၏ ဦးနှောက်အရည်နှင့် ဦးနှောက်ရှိ ကုထုံးဆိုင်ရာ ကိုယ်စားလှယ်လောင်းများ၏ အဆင့်များကို တိုင်းတာခြင်းဖြင့် တက်ကြွသော ဦးနှောက်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးကို အကဲဖြတ်ခြင်း) နှင့်အညီ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။
CM cannula ကို လက်ထဲတွင်ကိုင်ကာ ကြွက်ကို သတိရှိအောင် ညင်သာစွာထားပါ။ Datura ကို cannula မှထုတ်ယူပြီး မိမိဘာသာ စီးဆင်းနေသော ဦးနှောက်အရည် 10 µl ကို စုဆောင်းပါ။ cannula ၏ စိမ့်ဝင်နိုင်စွမ်းသည် နောက်ဆုံးတွင် ထိခိုက်သွားသောကြောင့်၊ သွေးညစ်ညမ်းမှု သို့မဟုတ် အရောင်ပြောင်းခြင်း၏ အထောက်အထားမရှိသော ကြည်လင်သည့် ဦးနှောက်အရည်နမူနာများကိုသာ ဤလေ့လာမှုတွင် ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ တစ်ချိန်တည်းမှာပင်၊ အမြီးဖျားရှိ သေးငယ်သော ခွဲစိတ်မှုမှ သွေး 10–20 µl ခန့်ကို heparin (Sigma-Aldrich) ပါဝင်သော ပြွန်များထဲသို့ ထုတ်ယူခဲ့သည်။ T7 phage ကို သွေးကြောထဲသို့ ထိုးသွင်းပြီးနောက် CSF နှင့် သွေးကို အချိန်အမျိုးမျိုးတွင် စုဆောင်းခဲ့သည်။ CSF နမူနာတစ်ခုစီကို စုဆောင်းခြင်းမပြုမီ အရည် 5–10 µl ခန့်ကို စွန့်ပစ်ခဲ့ပြီး ၎င်းသည် catheter ၏ သေနေသော ပမာဏနှင့် ကိုက်ညီသည်။
T7Select စနစ်လက်စွဲတွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း T7Select 10-3b vector ကို အသုံးပြု၍ စာကြည့်တိုက်များကို ဖန်တီးခဲ့သည် (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996)။ အတိုချုပ်ပြောရလျှင် ကျပန်း 12-mer DNA ထည့်သွင်းမှုကို အောက်ပါပုံစံဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသည်-
NNK codon ကို ထည့်သွင်းမှုတွင် double stop codon များနှင့် အမိုင်နိုအက်ဆစ် အလွန်အကျွံဖော်ပြခြင်းကို ရှောင်ရှားရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။ N သည် နျူကလီယိုတိုက်တစ်ခုစီ၏ လက်ဖြင့်ရောစပ်ထားသော equimolar ratio ဖြစ်ပြီး K သည် adenine နှင့် cytosine နျူကလီယိုတိုက်များ၏ လက်ဖြင့်ရောစပ်ထားသော equimolar ratio ဖြစ်သည်။ single stranded regions များကို Klenow buffer (New England Biolabs) တွင် dNTP (Novagen) နှင့် Klenow enzyme (New England Biolabs) တို့ဖြင့် 37°C တွင် 3 နာရီကြာ ထပ်မံ incubation လုပ်ခြင်းဖြင့် double stranded DNA အဖြစ်သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။ ဓာတ်ပြုပြီးနောက်၊ double-stranded DNA ကို EtOH precipitation ဖြင့် ပြန်လည်ရယူခဲ့သည်။ ရလဒ် DNA ကို restriction enzymes EcoRI နှင့် HindIII (နှစ်ခုစလုံး Roche မှ) တို့ဖြင့် ချေဖျက်ခဲ့သည်။ ဖြတ်တောက်ပြီး သန့်စင်ထားသော (QIAquick, Qiagen) ထည့်သွင်းမှု (T4 ligase, New England Biolabs) ကို 10B capsid gene ၏ amino acid 348 ပြီးနောက် pre-cleaved T7 vector ထဲသို့ in-frame ဖြင့် ချိတ်ဆက်ခဲ့သည်။ Ligation reactions များကို in vitro ထုပ်ပိုးမှုမပြုလုပ်မီ 16°C တွင် 18 နာရီကြာ incubation လုပ်ခဲ့သည်။ T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) တွင် ပါရှိသော ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း in vitro တွင် Phage packaging ကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး Escherichia coli (BLT5615, Novagen) ကို အသုံးပြု၍ lysis သို့ တစ်ကြိမ် amplify လုပ်ခဲ့သည်။ lysates များကို centrifuge လုပ်၊ titrated လုပ်ကာ -80°C တွင် glycerol ၏ stock solution အဖြစ် အေးခဲစေခဲ့သည်။
မူပိုင်ခွင့်ရ 454/Roche-amplicon fusion primers များကို အသုံးပြု၍ broth သို့မဟုတ် plate တွင် ချဲ့ထွင်ထားသော phage variable regions များ၏ direct PCR amplification။ forward fusion primer တွင် variable region (NNK) 12 (template-specific)၊ GS FLX Titanium Adapter A နှင့် four-base library key sequence (TCAG) (Supplementary Figure 1a) တို့ ပါဝင်သည်။
reverse fusion primer တွင် capture beads များနှင့် တွဲဖက်ထားသော biotin နှင့် emulsion PCR အတွင်း clonal amplification အတွက် လိုအပ်သော GS FLX Titanium Adapter B တို့လည်း ပါဝင်သည်။
ထို့နောက် amplicon များကို 454 GS-FLX Titanium protocol အရ 454/Roche pyrosequencing ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ manual Sanger sequencing (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) အတွက်၊ T7 phage DNA ကို PCR ဖြင့် ချဲ့ထွင်ပြီး အောက်ပါ primer အတွဲများဖြင့် sequence လုပ်ခဲ့သည်-
တစ်ဦးချင်းပြားများမှ ထည့်သွင်းထားသော ထည့်သွင်းမှုများကို Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအရ) ကို အသုံးပြု၍ PCR amplification ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ ပူပြင်းစွာစတင်ခြင်း (၉၅ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၁၀ မိနစ်) နှင့် boost cycle ၃၅ ကြိမ် (၉၅ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၅၀ စက္ကန့်၊ ၅၀ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၁ မိနစ် နှင့် ၇၂ ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ၁ မိနစ်) ကို လုပ်ဆောင်ပါ။
စာကြည့်တိုက်များမှ phage၊ wild-type phage၊ CSF နှင့် သွေးမှ ကယ်တင်ထားသော phage သို့မဟုတ် တစ်ဦးချင်း clone များကို Escherichia coli BL5615 တွင် TB ပြုတ်ရည် (Sigma Aldrich) တွင် သို့မဟုတ် 500 cm2 ပန်းကန်လုံးများ (Thermo Scientific) တွင် 37°C တွင် ၄ နာရီကြာ ပွားများစေခဲ့သည်။ Phage ကို Tris-EDTA buffer (Fluka Analytical) ဖြင့် ပန်းကန်များကို ဆေးကြောခြင်း သို့မဟုတ် ပိုးသတ်ထားသော pipette tips များဖြင့် plaque များကို စုဆောင်းခြင်းဖြင့် ပန်းကန်များမှ ထုတ်ယူခဲ့သည်။ Phage ကို polyethylene glycol (PEG 8000) precipitation (Promega) တစ်ကြိမ်ဖြင့် culture supernatant သို့မဟုတ် extraction buffer မှ ခွဲထုတ်ပြီး Tris-EDTA buffer တွင် ပြန်လည်ရောစပ်ခဲ့သည်။
ချဲ့ထွင်ထားသော phage ကို endotoxin ဖယ်ရှားသည့် beads (Miltenyi Biotec) ကို အသုံးပြု၍ endotoxin ဖယ်ရှားခြင်း ၂-၃ ကြိမ် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး (တိရစ္ဆာန်/IV) ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ ပထမအချီတွင် phage ၂ × ၁၀၁၂ ခု ထည့်သွင်းခဲ့ပြီး ဒုတိယအချီတွင် phage ၂ × ၁၀၁၀ ခု ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ တတိယနှင့် စတုတ္ထရွေးချယ်မှုအချီများတွင် တိရစ္ဆာန်တစ်ကောင်လျှင် phage ၂ × ၁၀၉ ခု ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ CSF ရှိ phage ပါဝင်မှုနှင့် ညွှန်ပြထားသောအချိန်များတွင် စုဆောင်းရရှိသော သွေးနမူနာများကို ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များ (T7Select system manual) အရ plaque ရေတွက်ခြင်းဖြင့် ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။ phage ရွေးချယ်မှုကို သန့်စင်ထားသော libraries များကို အမြီးသွေးကြောထဲသို့ ထိုးသွင်းခြင်း သို့မဟုတ် ယခင်ရွေးချယ်မှုအချီမှ CSF မှ ထုတ်ယူထားသော phage ကို ပြန်လည်ထိုးသွင်းခြင်းဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး နောက်ဆက်တွဲ ရိတ်သိမ်းမှုများကို CSF နှင့် သွေးနမူနာများ အသီးသီး ၁၀ မိနစ်၊ ၃၀ မိနစ်၊ ၆၀ မိနစ်၊ ၉၀ မိနစ်၊ ၁၂၀ မိနစ်၊ ၁၈၀ မိနစ် နှင့် ၂၄၀ မိနစ်တွင် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ in vivo panning စုစုပေါင်း လေးကြိမ် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး ရွေးချယ်ထားသော အကိုင်းအခက်နှစ်ခုကို သီးခြားသိမ်းဆည်းပြီး ရွေးချယ်မှု၏ ပထမသုံးကြိမ်အတွင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ ရွေးချယ်မှု၏ ပထမနှစ်ကြိမ်မှ CSF မှ ထုတ်ယူထားသော phage ထည့်သွင်းမှုအားလုံးကို 454/Roche pyrosequencing ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး၊ နောက်ဆုံးရွေးချယ်မှု၏ နောက်ဆုံးနှစ်ကြိမ်မှ CSF မှ ထုတ်ယူထားသော clone အားလုံးကို လက်ဖြင့် sequence လုပ်ခဲ့သည်။ ရွေးချယ်မှု၏ ပထမအချီမှ သွေး phage အားလုံးကို 454/Roche pyrosequencing ကိုလည်း ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ phage clone ထိုးသွင်းရန်အတွက်၊ ရွေးချယ်ထားသော phage များကို E. coli (BL5615) တွင် 37°C တွင် 500 cm2 ပြားများပေါ်တွင် 4 နာရီကြာ ချဲ့ထွင်ခဲ့သည်။ တစ်ဦးချင်းရွေးချယ်ထားပြီး လက်ဖြင့် sequence လုပ်ထားသော clone များကို TB medium တွင် ပွားများစေခဲ့သည်။ phage ထုတ်ယူခြင်း၊ သန့်စင်ခြင်းနှင့် endotoxin ကို ဖယ်ရှားခြင်းပြီးနောက် (အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း)၊ 300 μl ရှိ phage/တိရစ္ဆာန် 2×1010 ကို အမြီးသွေးကြောတစ်ခုထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။
sequence data ၏ ကြိုတင်လုပ်ဆောင်ခြင်းနှင့် အရည်အသွေးစစ်ထုတ်ခြင်း။ Raw 454/Roche data ကို binary standard stream map format (sff) မှ vendor software ကို အသုံးပြု၍ Pearson human readable format (fasta) သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။ nucleotide sequence ကို နောက်ထပ်လုပ်ဆောင်ခြင်းကို အောက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း proprietary C programs များနှင့် scripts (ထုတ်ပြန်ခြင်းမရှိသော software package) ကို အသုံးပြု၍ လုပ်ဆောင်ခဲ့သည်။ primary data ကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခြင်းတွင် တင်းကျပ်သော multi-stage filtering procedures များ ပါဝင်သည်။ တရားဝင် 12mer insert DNA sequence မပါဝင်သော read များကို filter လုပ်ရန်အတွက်၊ read များကို global Needleman-Wunsch test ကို အသုံးပြု၍ start label (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT)၊ stop label (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) နှင့် background insert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGGAC) သို့ အစဉ်လိုက် ချိန်ညှိခဲ့သည်။ alignment31 တွင် မကိုက်ညီမှု ၂ ခုအထိ ခွင့်ပြုသည်။ ထို့ကြောင့်၊ start နှင့် stop tags မပါသော read များနှင့် background insert များပါ၀င်သော read များ၊ ဆိုလိုသည်မှာ ခွင့်ပြုထားသော mismatches အရေအတွက်ထက် ကျော်လွန်သော alignment များကို library မှ ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ ကျန်ရှိနေသော ဖတ်ရှုမှုများအတွက်၊ စတင်အမှတ်အသားမှ ရပ်တန့်အမှတ်အသားမတိုင်မီ အဆုံးသတ်သော N-mer DNA အစီအစဥ်ကို မူရင်းဖတ်ရှုမှုအစီအစဥ်မှ ဖြတ်ယူ၍ ဆက်လက်လုပ်ဆောင်ခဲ့သည် (ယခုမှစ၍ “ထည့်သွင်းမှု” ဟုရည်ညွှန်းသည်)။ ထည့်သွင်းမှုကို ဘာသာပြန်ပြီးနောက်၊ primer ၏ 5′ အဆုံးရှိ ပထမဆုံး stop codon ပြီးနောက် အပိုင်းကို ထည့်သွင်းမှုမှ ဖယ်ရှားသည်။ ထို့အပြင်၊ primer ၏ 3′ အဆုံးရှိ မပြည့်စုံသော codon များဆီသို့ ဦးတည်သော nucleotides များကိုလည်း ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ နောက်ခံအစီအစဥ်များသာပါရှိသော ထည့်သွင်းမှုများကို ဖယ်ထုတ်ရန်အတွက်၊ အမိုင်နိုအက်ဆစ်ပုံစံ “PAG” ဖြင့်စတင်သော ဘာသာပြန်ထားသော ထည့်သွင်းမှုများကိုလည်း ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ အမိုင်နိုအက်ဆစ် ၃ ခုထက်နည်းသော post-translational length ရှိသော peptides များကို library မှ ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ နောက်ဆုံးတွင်၊ ထည့်သွင်းမှု pool ရှိ redundancy ကို ဖယ်ရှားပြီး ထူးခြားသော ထည့်သွင်းမှုတစ်ခုစီ၏ frequency ကို ဆုံးဖြတ်သည်။ ဤခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၏ရလဒ်များတွင် nucleotide အစီအစဥ်များ (ထည့်သွင်းမှုများ) နှင့် ၎င်းတို့၏ (ဖတ်ရှုမှု) frequency စာရင်း ပါဝင်သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၁c နှင့် ၂)။
အုပ်စု N-mer DNA ထည့်သွင်းမှုများ အစီအစဉ်ဆင်တူမှုအလိုက်- 454/Roche-specific sequencing အမှားများ (ဥပမာ sequencing homopolymer extensions ပြဿနာများ) ကို ဖယ်ရှားရန်နှင့် အရေးမပါသော အပိုအလျှံများကို ဖယ်ရှားရန်အတွက်၊ ယခင်က စစ်ထုတ်ထားသော N-mer DNA sequence ထည့်သွင်းမှုများ (ထည့်သွင်းမှုများ) ကို ဆင်တူမှုအလိုက် စီထားသည်။ ထည့်သွင်းမှုများ (မကိုက်ညီသော base ၂ ခုအထိ ခွင့်ပြုသည်) ကို အောက်ပါအတိုင်း iterative algorithm ကို အသုံးပြုသည်- ထည့်သွင်းမှုများကို ၎င်းတို့၏ကြိမ်နှုန်း (အမြင့်ဆုံးမှ အနိမ့်ဆုံး) အလိုက် ဦးစွာ စီထားပြီး၊ ၎င်းတို့သည် အတူတူပင်ဖြစ်ပါက ၎င်းတို့၏ဒုတိယအကြိမ် အရှည် (အရှည်ဆုံးမှ အတိုဆုံး) အလိုက် စီထားသည်။ ထို့ကြောင့်၊ အများဆုံးနှင့် အရှည်ဆုံးထည့်သွင်းမှုများသည် ပထမ “အုပ်စု” ကို သတ်မှတ်ပေးသည်။ အုပ်စုကြိမ်နှုန်းကို အဓိကကြိမ်နှုန်းသို့ သတ်မှတ်ထားသည်။ ထို့နောက်၊ စီထားသောစာရင်းတွင် ကျန်ရှိနေသော ထည့်သွင်းမှုတစ်ခုစီကို Needleman-Wunsch alignment အတွဲလိုက်ဖြင့် အုပ်စုထဲသို့ ထည့်သွင်းရန် ကြိုးစားခဲ့သည်။ alignment တွင် မကိုက်ညီမှုများ၊ ထည့်သွင်းမှုများ သို့မဟုတ် ဖျက်မှုများ၏ အရေအတွက်သည် ၂ ၏ ကန့်သတ်ချက်ထက် မပိုပါက၊ ထည့်သွင်းမှုကို အုပ်စုထဲသို့ ထည့်သွင်းပြီး စုစုပေါင်းအုပ်စုကြိမ်နှုန်းကို ထည့်သွင်းသည့်အကြိမ်ရေအလိုက် တိုးမြှင့်သည်။ အုပ်စုထဲသို့ ထည့်သွင်းထားသော ထည့်သွင်းမှုများကို အသုံးပြုပြီးအဖြစ် အမှတ်အသားပြုပြီး နောက်ထပ်လုပ်ဆောင်မှုမှ ဖယ်ထုတ်ထားသည်။ အကယ်၍ ထည့်သွင်းမှုအစီအစဥ်ကို ရှိပြီးသားအုပ်စုထဲသို့ ထည့်သွင်း၍မရပါက၊ ထည့်သွင်းမှုအစီအစဥ်ကို သင့်လျော်သော ထည့်သွင်းမှုကြိမ်နှုန်းဖြင့် အုပ်စုအသစ်တစ်ခုဖန်တီးပြီး အသုံးပြုပြီးအဖြစ် မှတ်သားရန်အသုံးပြုသည်။ ထည့်သွင်းမှုအစီအစဥ်တစ်ခုစီကို အုပ်စုအသစ်တစ်ခုဖွဲ့စည်းရန် အသုံးပြုသည့်အခါ သို့မဟုတ် ရှိပြီးသားအုပ်စုတွင် ထည့်သွင်းနိုင်သည့်အခါ ထပ်ခါတလဲလဲလုပ်ဆောင်ခြင်းသည် ပြီးဆုံးသည်။ အကယ်စင်စစ်၊ နျူကလီယိုတိုက်များပါဝင်သော အုပ်စုဖွဲ့ထားသော ထည့်သွင်းမှုများကို နောက်ဆုံးတွင် peptide အစီအစဥ်များ (peptide libraries) အဖြစ်သို့ ဘာသာပြန်ဆိုသည်။ ဤခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၏ရလဒ်မှာ ထည့်သွင်းမှုအစုအဝေးနှင့် ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာကြိမ်နှုန်းများသည် ဆက်တိုက်ဖတ်ရှုမှုအရေအတွက်ကို ဖွဲ့စည်းသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ ၂)။
Motif ထုတ်လုပ်မှု- ထူးခြားသော peptide များစာရင်းအပေါ်အခြေခံ၍ အောက်တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော အမိုင်နိုအက်ဆစ်ပုံစံအားလုံး (aa) ပါဝင်သော library တစ်ခုကို ဖန်တီးခဲ့သည်။ အရှည် ၃ ရှိသော ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော ပုံစံတစ်ခုစီကို peptide မှ ထုတ်ယူခဲ့ပြီး ၎င်း၏ inverse pattern ကို ပုံစံအားလုံး (tripeptides) ပါဝင်သော ဘုံ motif library နှင့်အတူ ထည့်သွင်းခဲ့သည်။ အလွန်ထပ်တလဲလဲဖြစ်ပေါ်သော motifs များ၏ library များကို sequence လုပ်ခဲ့ပြီး redundancy ကို ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ ထို့နောက် motif library ရှိ tripeptide တစ်ခုစီအတွက် computational tools များကို အသုံးပြု၍ library တွင် ၎င်း၏ရှိနေမှုကို စစ်ဆေးခဲ့သည်။ ဤကိစ္စတွင်၊ တွေ့ရှိထားသော motif tripeptide ပါဝင်သော peptide ၏ frequency ကို ထည့်သွင်းပြီး motif library (“motifs အရေအတွက်”) ရှိ motif သို့ သတ်မှတ်ပေးသည်။ motif ထုတ်လုပ်မှု၏ရလဒ်မှာ tripeptides (motifs) ၏ ဖြစ်ပျက်မှုအားလုံးနှင့် ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာတန်ဖိုးများပါဝင်သော two-dimensional array တစ်ခုဖြစ်ပြီး ၎င်းတို့သည် reads များကို filter လုပ်ခြင်း၊ group လုပ်ခြင်းနှင့် translated လုပ်ခြင်းပြုလုပ်သောအခါ သက်ဆိုင်ရာ motif ကိုဖြစ်ပေါ်စေသည့် sequencing reads အရေအတွက်ဖြစ်သည်။ အထက်တွင် အသေးစိတ်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း metrics။
motifs အရေအတွက်နှင့် သက်ဆိုင်ရာ scatterplots များကို ပုံမှန်ဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ခြင်း- နမူနာတစ်ခုစီအတွက် motifs အရေအတွက်ကို အသုံးပြု၍ ပုံမှန်ဖြစ်အောင်ပြုလုပ်ခဲ့သည်
ni သည် topic i ပါဝင်သော read အရေအတွက်ဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့် vi သည် sample တွင် motif i ပါဝင်သော read များ (သို့မဟုတ် peptide များ) ၏ ရာခိုင်နှုန်းကြိမ်နှုန်းကို ကိုယ်စားပြုသည်။ ပုံမှန်မဟုတ်သော motif အရေအတွက်အတွက် P-value ​​များကို Fisher's exact test ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်။ motif အရေအတွက်၏ correlogram များနှင့် ပတ်သက်၍ Spearman's correlations ကို R ဖြင့် ပုံမှန်မဟုတ်သော motif အရေအတွက်ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်။
peptide library ရှိ နေရာတစ်ခုစီတွင် အမိုင်နိုအက်ဆစ်ပါဝင်မှုကို မြင်ယောင်ရန်အတွက် web logograms 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ကို ဖန်တီးခဲ့သည်။ ပထမဦးစွာ 12-mer peptide ၏ နေရာတစ်ခုစီတွင် အမိုင်နိုအက်ဆစ်ပါဝင်မှုကို 20×12 matrix တွင် သိမ်းဆည်းထားသည်။ ထို့နောက် နေရာတစ်ခုစီတွင် တူညီသော relative amino acid ပါဝင်မှုပါဝင်သော peptides 1000 အစုံကို fasta-sequence format ဖြင့် ထုတ်လုပ်ပြီး web-logo 3 သို့ input အဖြစ် ပေးအပ်ထားပြီး၊ ၎င်းသည် peptide library အတွက် နေရာတစ်ခုစီတွင် relative amino acid ပါဝင်မှု၏ graphical representation ကို ထုတ်လုပ်ပေးသည်။ multidimensional datasets များကို မြင်ယောင်ရန်အတွက် R (biosHeatmap၊ လောလောဆယ်ထွက်ရှိရန်ကျန်ရှိနေသေးသော R package) ရှိ internally developed tool တစ်ခုကို အသုံးပြု၍ heat map များကို ဖန်တီးခဲ့သည်။ heat map များတွင် တင်ပြထားသော dendrograms များကို Ward ၏ hierarchical clustering နည်းလမ်းဖြင့် Euclidean distance metric ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်။ motif scoring data ၏ statistical analysis အတွက်၊ unnormalized scoring အတွက် P values ​​​​များကို Fisher's exact test ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်။ အခြားဒေတာစုများအတွက် P-တန်ဖိုးများကို Student's t-test သို့မဟုတ် ANOVA ကို အသုံးပြု၍ R ဖြင့် တွက်ချက်ခဲ့သည်။
ရွေးချယ်ထားသော phage clone များနှင့် ထည့်သွင်းမထားသော phage များကို အမြီးသွေးကြောမှတစ်ဆင့် သွေးကြောထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည် (300 μl PBS တွင် phage 2×1010/တိရစ္ဆာန်)။ သွေးလည်ပတ်မှုနှင့် နောက်ဆက်တွဲ ပြုပြင်မှုမတိုင်မီ ဆယ်မိနစ်အလိုတွင်၊ တူညီသောတိရစ္ဆာန်များကို DyLight594-တံဆိပ်ကပ်ထားသော lectin 100 μl (Vector Laboratories Inc., DL-1177) ဖြင့် သွေးကြောထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။ phage ထိုးသွင်းပြီး ၆၀ မိနစ်အကြာတွင် ကြွက်များကို 50 ml PBS ဖြင့် နှလုံးမှတစ်ဆင့် ထိုးသွင်းခဲ့ပြီး 50 ml 4% PFA/PBS ဖြင့် အစားထိုးခဲ့သည်။ ဦးနှောက်နမူနာများကို 4% PFA/PBS တွင် တစ်ညလုံးထည့်သွင်းခဲ့ပြီး 4°C တွင် 30% sucrose တွင် တစ်ညလုံးစိမ်ခဲ့သည်။ နမူနာများကို OCT ရောစပ်မှုတွင် flash frozen လုပ်ထားသည်။ အေးခဲထားသောနမူနာများ၏ Immunohistochemical analysis ကို အခန်းအပူချိန်တွင် 1% BSA ဖြင့်ပိတ်ဆို့ထားသော 30 µm cryosections တွင် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး 4°C တွင် T7 phage (Novus NB 600-376A) ကို ဆန့်ကျင်သော polyclonal FITC-labeled antibodies များဖြင့် incubation လုပ်ခဲ့သည်။ တစ်ညလုံး incubation လုပ်ပါ။ နောက်ဆုံးတွင် အပိုင်းများကို PBS ဖြင့် ၃ ကြိမ်ဆေးကြောပြီး confocal laser microscope (Leica TCS SP5) ဖြင့် စစ်ဆေးခဲ့သည်။
အနည်းဆုံး ၉၈% သန့်စင်မှုရှိသော peptide အားလုံးကို GenScript USA မှ ပေါင်းစပ်ထုတ်လုပ်ပြီး biotinylated လုပ်ကာ lyophilized လုပ်ခဲ့သည်။ Biotin ကို N-terminus တွင် နောက်ထပ် triple glycine spacer တစ်ခုမှတစ်ဆင့် ချည်နှောင်ထားသည်။ mass spectrometry ကို အသုံးပြု၍ peptide အားလုံးကို စစ်ဆေးပါ။
Streptavidin (Sigma S0677) ကို biotinylated peptide ၅ ဆ equimolar ပိုများသော၊ biotinylated BACE1 inhibitory peptide သို့မဟုတ် biotinylated BACE1 inhibitory peptide နှင့် BACE1 inhibitory peptide ပေါင်းစပ်မှု (၃:၁ အချိုး) နှင့် PBS တွင် ၅-၁၀% DMSO/incubated တွင် ရောစပ်ထားသည်။ ထိုးဆေးမထိုးမီ အခန်းအပူချိန်တွင် ၁ နာရီကြာအောင်ထားပါ။ Streptavidin-conjugated peptides များကို ဦးနှောက်အခေါင်းပေါက်ရှိသော ကြွက်များ၏ အမြီးသွေးကြောများထဲမှ တစ်ခုထဲသို့ ၁၀ mg/kg ပမာဏဖြင့် သွေးကြောထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။
streptavidin-peptide complex များ၏ ပါဝင်မှုကို ELISA ဖြင့် အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ Nunc Maxisorp microtiter plates (Sigma) များကို ၄°C တွင် 1.5 μg/ml mouse anti-streptavidin antibody (Thermo, MA1-20011) ဖြင့် တစ်ညလုံး ဖုံးအုပ်ထားသည်။ အခန်းအပူချိန်တွင် ၂ နာရီကြာ ပိတ်ဆို့ပြီးနောက် (ပိတ်ဆို့ခြင်း buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA)၊ ပန်းကန်ကို 0.05% Tween-20/PBS (wash buffer) ဖြင့် ၃ စက္ကန့်ကြာ ဆေးကြောပြီးနောက်၊ CSF နှင့် plasma နမူနာများကို blocking buffer (plasma 1:10,000, CSF 1:115) ဖြင့် ရောစပ်ထားသော wells များထဲသို့ ထည့်ခဲ့သည်။ ထို့နောက် ပန်းကန်ကို ၄°C တွင် detection antibody (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) ဖြင့် တစ်ညလုံး incubation လုပ်ခဲ့သည်။ အဆင့်သုံးဆင့်ဆေးကြောပြီးနောက်၊ streptavidin ကို TMB substrate solution (Roche) တွင် မိနစ် ၂၀ အထိ incubation လုပ်ခြင်းဖြင့် တွေ့ရှိရသည်။ 1M H2SO4 ဖြင့် အရောင်ဖွံ့ဖြိုးမှုကို ရပ်တန့်ပြီးနောက်၊ 450 nm တွင် absorbance ကို တိုင်းတာပါ။
streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex ၏ လုပ်ဆောင်ချက်ကို ထုတ်လုပ်သူ၏ protocol (Wako, 294-64701) အရ Aβ(1-40) ELISA ဖြင့် အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ အကျဉ်းချုပ်ပြောရလျှင် CSF နမူနာများကို standard diluent (1:23) ဖြင့် ရောစပ်ပြီး BNT77 capture antibody ဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသော 96-well plates များတွင် 4°C တွင် တစ်ညလုံး incubation လုပ်ခဲ့သည်။ ဆေးကြောခြင်း အဆင့်ငါးဆင့်ပြီးနောက်၊ HRP-conjugated BA27 antibody ကို ထည့်သွင်းပြီး 4°C တွင် 2 နာရီကြာ incubation လုပ်ပြီးနောက်၊ ဆေးကြောခြင်း အဆင့်ငါးဆင့်ဖြင့် ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ Aβ(1–40) ကို TMB solution တွင် အခန်းအပူချိန်တွင် 30 မိနစ်ကြာ incubation လုပ်ခြင်းဖြင့် တွေ့ရှိခဲ့သည်။ stop solution ဖြင့် အရောင်ဖွံ့ဖြိုးမှုကို ရပ်တန့်ပြီးနောက်၊ 450 nm တွင် absorbance ကို တိုင်းတာပါ။ Plasma နမူနာများကို Aβ(1–40) ELISA မတိုင်မီ solid phase extraction ဖြင့် အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။ Plasma ကို 96-well plates များတွင် 0.2% DEA (Sigma) ထဲသို့ ထည့်သွင်းပြီး အခန်းအပူချိန်တွင် 30 မိနစ်ကြာ incubation လုပ်ခဲ့သည်။ SPE ပြားများ (Oasis, 186000679) ကို ရေနှင့် 100% မီသနောတို့ဖြင့် ဆက်တိုက်ဆေးကြောပြီးနောက်၊ ပလာစမာနမူနာများကို SPE ပြားများထဲသို့ထည့်ကာ အရည်အားလုံးကို ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ နမူနာများကို ဆေးကြောခဲ့သည် (ပထမဦးစွာ 5% မီသနောဖြင့် ထို့နောက် 30% မီသနော) နှင့် 2% NH4OH/90% မီသနောဖြင့် ಲೇಪခဲ့သည်။ ಲೇಪကို 55°C တွင် N2 လျှပ်စီးကြောင်းဖြင့် 99 မိနစ်ကြာ အခြောက်ခံပြီးနောက်၊ နမူနာများကို စံသတ်မှတ်ထားသော ಲೇಪရည်များတွင် လျှော့ချခဲ့ပြီး Aβ(1–40) ကို အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း တိုင်းတာခဲ့သည်။
ဤဆောင်းပါးကို မည်သို့ကိုးကားရမည်နည်း- Urich၊ E. et al. in vivo တွင် ဖော်ထုတ်ထားသော transit peptides များကို အသုံးပြု၍ ဦးနှောက်သို့ ကုန်စည်ပို့ဆောင်ခြင်း။ the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015)။
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB နှင့် Moos T. ပစ်မှတ်ထားကုထုံးကို အသုံးပြု၍ ဦးနှောက်သို့ မက်ခရိုမော်လီကျူးဆေးဝါးများ ပို့ဆောင်ခြင်း။ Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (၂၀၁၀)။
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., နှင့် Martinez-Martinez, P. သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးကိုဖြတ်၍ peptide နှင့် ပရိုတင်းဆေးဝါးများ ပို့ဆောင်ခြင်း။ Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (၂၀၀၉)။
Pardridge, WM သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီး- ဦးနှောက်ဆေးဝါး ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုတွင် ပိတ်ဆို့မှု။ NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (၂၀၀၅)။
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, နှင့် Byrd, A. choroid plexus-CSF လမ်းကြောင်းမှတစ်ဆင့် ဦးနှောက်သို့ ဆေးဝါးပို့ဆောင်မှုနှင့် ပစ်မှတ်ထားမှု ပိုမိုကောင်းမွန်လာစေရန် အလားအလာများ။ ဆေးဝါးသုတေသန ၂၂၊ ၁၀၁၁–၁၀၃၇၊ 10.1007/s11095-005-6039-0 (၂၀၀၅)။
Pardridge၊ WM ဦးနှောက်ပို့ဆောင်မှုအတွက် မော်လီကျူး Trojan မြင်းများဖြင့် ဇီဝဆေးဝါးများကို ခေတ်မီအောင်ပြုလုပ်ခြင်း။ Bioconjug Chem 19၊ 1327–1338၊ 10.1021/bc800148t (2008)။
Pardridge၊ WM receptor-mediated peptide သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးသည် သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးကို ဖြတ်၍ ပို့ဆောင်ပေးသည်။ Endocr Rev. 7, 314–330 (1986)။
Niewoehner၊ J. et al. မိုနိုဗယ်လင့် မော်လီကျူး ရှပ်တယ်များကို အသုံးပြု၍ ဦးနှောက်ထိုးဖောက်ဝင်ရောက်မှုနှင့် ကုထုံးဆိုင်ရာ ပဋိပစ္စည်းများ၏ ထိရောက်မှုကို မြှင့်တင်ခြင်း။ Neuron 81၊ 49–60၊ 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)။
Bien-Lee၊ N. et al. Transferrin receptor (TfR) သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးသည် TfR antibodies များ၏ affinity variants များ၏ ဦးနှောက်စုပ်ယူမှုကို ဆုံးဖြတ်ပေးသည်။ J Exp Med 211၊ 233–244၊ 10.1084/jem.20131660 (2014)။