Nature.com ကိုလာရောက်လည်ပတ်တဲ့အတွက် ကျေးဇူးတင်ပါတယ်။သင်သည် အကန့်အသတ်ရှိသော CSS ပံ့ပိုးမှုဖြင့် ဘရောက်ဆာဗားရှင်းကို အသုံးပြုနေပါသည်။အကောင်းဆုံးအတွေ့အကြုံအတွက်၊ အပ်ဒိတ်လုပ်ထားသောဘရောက်ဆာ (သို့မဟုတ် Internet Explorer တွင် လိုက်ဖက်ညီသောမုဒ်ကိုပိတ်ပါ) ကိုအသုံးပြုရန် ကျွန်ုပ်တို့အကြံပြုအပ်ပါသည်။ထို့အပြင်၊ ဆက်လက်ပံ့ပိုးမှုသေချာစေရန်၊ ပုံစံများနှင့် JavaScript မပါဘဲ ဝဘ်ဆိုက်ကို ပြသပါသည်။
ဆလိုက် သုံးခုပါသော အဝိုင်းကို တစ်ပြိုင်နက် ပြသသည်။တစ်ကြိမ်လျှင် ဆလိုက်သုံးခုကို ရွှေ့ရန် ယခင်နှင့် နောက်ခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ သို့မဟုတ် တစ်ကြိမ်လျှင် ဆလိုက်သုံးခုကို ရွှေ့ရန် အဆုံးရှိ ဆလိုက်ခလုတ်များကို အသုံးပြုပါ။
သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးနှင့် သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးတို့သည် ဗဟိုအာရုံကြောစနစ်ရှိ ၎င်းတို့၏ပစ်မှတ်များသို့ ဇီဝကုထုံးအေးဂျင့်များထံသို့ မရောက်ရှိစေရန် တားဆီးပေးသောကြောင့် အာရုံကြောဆိုင်ရာရောဂါများကို ထိရောက်စွာကုသခြင်းကို ဟန့်တားစေသည်။Vivo တွင် ဆန်းသစ်သော ဦးနှောက်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးကိရိယာများကို ရှာဖွေတွေ့ရှိရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် T7 phage peptide စာကြည့်တိုက်ကို မိတ်ဆက်ပေးခဲ့ပြီး ကြွက်များ၏ အာရုံခံရေကန်ပုံစံကို အသုံးပြု၍ သွေးနှင့် ဦးနှောက်အရည်များ (CSF) ကို ဆက်တိုက်စုဆောင်းခဲ့သည်။လေးကြိမ်ရွေးချယ်ပြီးနောက် CSF တွင် တိကျသော phage clones များကို ကြွယ်ဝစွာ ဖြည့်တင်းထားသည်။ကိုယ်စားလှယ်လောင်းတစ်ဦးချင်းစီ၏ peptides စမ်းသပ်ခြင်း CSF တွင် အဆ 1000 ကျော် ကြွယ်ဝမှုကို ပြသခဲ့သည်။ဦးနှောက်သို့ peptide-mediated ပေးပို့ခြင်း၏ ဇီဝကမ္မလုပ်ဆောင်မှုကို BACE1 peptide inhibitor နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော Novel transit peptide နှင့် ချိတ်ဆက်ထားသော BACE1 peptide inhibitor ကိုအသုံးပြု၍ ဦးနှောက်အရည်ထဲတွင် amyloid-β အဆင့်ကို 40% လျှော့ချခြင်းဖြင့် အတည်ပြုခဲ့ပါသည်။ဤရလဒ်များသည် vivo phage ရွေးချယ်ရေးနည်းလမ်းများတွင် ဖော်ထုတ်ထားသော peptides များသည် ဦးနှောက်ဆီသို့ macromolecules များစနစ်တကျပေးပို့ခြင်းအတွက် အသုံးဝင်သောယာဉ်များဖြစ်နိုင်သည်ဟု အကြံပြုထားသည်။
ဗဟိုအာရုံကြောစနစ် (CNS) ပစ်မှတ်ထားကုထုံးသုတေသနသည် CNS-ပစ်မှတ်ထားသောဂုဏ်သတ္တိများကိုပြသသည့်အကောင်းဆုံးဆေးများနှင့်အေးဂျင့်များကိုခွဲခြားသတ်မှတ်ရန်အဓိကအာရုံစိုက်ထားပြီး၊ ဦးနှောက်သို့တက်ကြွသောမူးယစ်ဆေးပို့ဆောင်သည့်ယန္တရားများကိုရှာဖွေတွေ့ရှိရန်ကြိုးစားမှုနည်းပါးသည်။အထူးသဖြင့် ကြီးမားသော မော်လီကျူးများ သည် ခေတ်မီ အာရုံကြောသိပ္ပံ ဆေးဝါး ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှု၏ မရှိမဖြစ် အစိတ်အပိုင်း တစ်ခု ဖြစ်သောကြောင့် မူးယစ်ဆေးဝါး ပေးပို့ခြင်း သည် ယခု စတင် ပြောင်းလဲနေပြီ ဖြစ်သည်။ဗဟိုအာရုံကြောစနစ်၏ပတ်ဝန်းကျင်ကို သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီး (BBB) ​​နှင့် သွေးဦးနှောက်အတားအဆီး (BCBB)1 တို့ပါ၀င်သော cerebrovascular barrier system ဖြင့် ကောင်းမွန်စွာကာကွယ်ထားသောကြောင့် ဦးနှောက်သို့ဆေးများပို့ဆောင်ရန် စိန်ခေါ်မှုဖြစ်စေသည်။ကြီးမားသော မော်လီကျူးဆေးများ အားလုံးနီးပါးနှင့် သေးငယ်သော မော်လီကျူးဆေးများ၏ 98% ကျော်ကို ဦးနှောက်မှ ဖယ်ရှားပစ်သည်ဟု ခန့်မှန်းရသည်။ထို့ကြောင့် CNS 4,5 သို့ ထိရောက်ပြီး တိကျသော ကုထုံးဆေးဝါးများ ပို့ဆောင်ပေးသည့် ဦးနှောက်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးစနစ်အသစ်များကို ဖော်ထုတ်ရန် အလွန်အရေးကြီးပါသည်။သို့သော်၊ BBB နှင့် BCSFB တို့သည် ၎င်း၏ကျယ်ပြန့်သောသွေးကြောများမှတစ်ဆင့် ဦးနှောက်၏ဖွဲ့စည်းပုံအားလုံးကို ထိုးဖောက်ဝင်ရောက်နိုင်သောကြောင့် မူးယစ်ဆေးဝါးပေးပို့ခြင်းအတွက် အကောင်းဆုံးအခွင့်အရေးတစ်ရပ်ကိုလည်း တင်ပြထားပါသည်။ထို့ကြောင့်၊ ဦးနှောက်သို့မထိုးဖောက်နိုင်သောနည်းလမ်းများကိုအသုံးပြုရန်လက်ရှိကြိုးပမ်းမှုများသည် endogenous BBB6 receptor ကိုအသုံးပြုထားသော receptor-mediated transport (PMT) ၏ယန္တရားအပေါ်အခြေခံသည်။Transferrin receptor pathway7,8 ကိုအသုံးပြုပြီး မကြာသေးမီက အဓိကတိုးတက်မှုများရှိနေသော်လည်း၊ ပိုမိုကောင်းမွန်သောဂုဏ်သတ္တိများဖြင့် ပို့ဆောင်မှုစနစ်အသစ်များ ထပ်မံဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်ရန် လိုအပ်ပါသည်။ဤအဆုံးသတ်ရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ပန်းတိုင်မှာ CSF သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးကို ဖျန်ဖြေပေးနိုင်စွမ်းရှိသော peptides များကို CNS သို့ macromolecules များပေးပို့ရန် သို့မဟုတ် receptor လမ်းကြောင်းအသစ်များဖွင့်ရန် မူအားဖြင့်အသုံးပြုထားနိုင်သောကြောင့် ၎င်းတို့အား ဖော်ထုတ်ရန်ဖြစ်သည်။အထူးသဖြင့်၊ ဦးနှောက်သွေးကြောစနစ် (BBB နှင့် BSCFB) ၏ သီးခြား receptors နှင့် transporters များသည် biotherapeutic ဆေးဝါးများ၏ တက်ကြွပြီး တိကျသော ဆေးဝါးများပေးပို့ခြင်းအတွက် အလားအလာရှိသော ပစ်မှတ်များအဖြစ် ဆောင်ရွက်နိုင်ပါသည်။Cerebrospinal fluid (CSF) သည် choroid plexus (CS) ၏ secretory ထုတ်ကုန်တစ်ခုဖြစ်ပြီး subarachnoid space နှင့် ventricular space4 မှတဆင့် ဦးနှောက်ကြားရှိအရည်များနှင့် တိုက်ရိုက်ထိတွေ့သည်။မကြာသေးမီက ၎င်းသည် subarachnoid cerebrospinal fluid သည် ဦးနှောက်၏ interstitium အတွင်းသို့ အလွန်အမင်းပျံ့နှံ့သွားကြောင်း ပြသခဲ့သည်။ဤ subarachnoid စီးဆင်းမှုလမ်းကြောင်းကိုအသုံးပြု၍ သို့မဟုတ် BBB မှတဆင့်တိုက်ရိုက်အသုံးပြု၍ parenchymal space ကိုရယူရန်မျှော်လင့်ပါသည်။၎င်းကိုအောင်မြင်ရန်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဤကွဲပြားသောလမ်းကြောင်းနှစ်ခုမှ နှစ်ခုစလုံးမှ သယ်ဆောင်လာသော peptides များကို စံနမူနာပြပေးသော vivo phage ရွေးချယ်ရေးဗျူဟာတွင် ခိုင်မာသောနည်းလမ်းကို အကောင်အထည်ဖော်ခဲ့ပါသည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် ယခုအခါတွင် vivo phage မျက်နှာပြင်ပြသမှု စိစစ်ရေးနည်းလမ်းတွင် ဆက်တိုက်ပြုလုပ်ထားသော CSF နမူနာယူခြင်းနှင့်အတူ မြင့်မားသော throughput sequencing (HTS) နှင့်အတူ ကနဦးရွေးချယ်မှုအကြိမ်များကို အမြင့်ဆုံးစာကြည့်တိုက်ကွဲပြားမှုဖြင့် စောင့်ကြည့်ရန် ဖော်ပြထားပါသည်။သွေးညစ်ညမ်းမှုကို ရှောင်ရှားရန် အမြဲတမ်းထည့်သွင်းထားသော ကြီးမားသော cisterna (CM) cannula ဖြင့် သတိရှိကြွက်များကို စစ်ဆေးခြင်း ပြုလုပ်ခဲ့သည်။အရေးကြီးသည်မှာ၊ ဤချဉ်းကပ်မှုသည် ဦးနှောက်အာရုံကြောဆိုင်ရာ အတားအဆီးကိုဖြတ်၍ သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးလှုပ်ရှားမှုဖြင့် ဦးနှောက်ပစ်မှတ်နှင့် peptides နှစ်မျိုးလုံးကို ရွေးချယ်သည်။၎င်းတို့၏သေးငယ်သောအရွယ်အစား (~60 nm)10 ကြောင့် T7 phages ကိုအသုံးပြုခဲ့ပြီး ၎င်းတို့သည် endothelial နှင့်/သို့မဟုတ် epithelial-medulla barrier ၏ transcellular ဖြတ်ကျော်ခြင်းကိုခွင့်ပြုသော vesicles များသယ်ယူပို့ဆောင်ရန်အတွက်သင့်လျော်သည်ဟုအကြံပြုခဲ့သည်။panning လေးကြိမ်ပြုလုပ်ပြီးနောက်၊ phage လူဦးရေများကို vivo CSF ​​​​ဖြည့်တင်းမှုနှင့် cerebral microvessel ပေါင်းစည်းမှုတွင် အားကောင်းကြောင်းပြသပြီး သီးခြားခွဲထုတ်ခဲ့သည်။အရေးကြီးသည်မှာ၊ ဦးစားပေးပြီး ဓာတုဗေဒနည်းဖြင့် ပေါင်းစပ်ဖန်တီးထားသော အကောင်းဆုံး ကိုယ်စားလှယ်လောင်း peptides များသည် ပရိုတင်းကုန်တင်များကို ဦးနှောက်အရည်ထဲသို့ ပို့ဆောင်ပေးနိုင်ကြောင်း သရုပ်ပြခြင်းဖြင့် ကျွန်ုပ်တို့၏တွေ့ရှိချက်များကို အတည်ပြုနိုင်ခဲ့ပါသည်။ပထမဦးစွာ၊ CNS ၏ pharmacodynamic သက်ရောက်မှုများကို BACE1 peptide ၏ inhibitor နှင့် ဦး ဆောင်အကူးအပြောင်း peptide ကိုပေါင်းစပ်ခြင်းဖြင့်တည်ဆောက်ခဲ့သည်။vivo functional screening strategies တွင် ဆန်းသစ်သော ဦးနှောက်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေး peptides များကို ထိရောက်သော ပရိုတိန်းကုန်တင်သယ်ဆောင်သူများအဖြစ် ခွဲခြားသိရှိနိုင်စေသည့်အပြင်၊ အလားတူလုပ်ဆောင်ချက်ရွေးချယ်မှုနည်းလမ်းများသည် ဆန်းသစ်သောဦးနှောက်သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးလမ်းကြောင်းများကို ဖော်ထုတ်ရာတွင်လည်း အရေးပါလာမည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့မျှော်လင့်ပါသည်။
plaque-forming units (PFU) ကိုအခြေခံ၍ phage ထုပ်ပိုးမှုအဆင့်ပြီးနောက်၊ ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 109 ကွဲပြားမှုရှိသော ကျပန်း 12-mer linear T7 phage peptides ၏စာကြည့်တိုက်ကို ဒီဇိုင်းရေးဆွဲဖန်တီးခဲ့သည် ( Materials and Methods ကိုကြည့်ပါ)။vivo panning မလုပ်မီ ဤစာကြည့်တိုက်ကို ဂရုတစိုက် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့ကြောင်း သတိပြုရန် အရေးကြီးပါသည်။PCR သည် HTS (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 1a) နှင့် တိုက်ရိုက်သက်ဆိုင်သော မွမ်းမံထားသော primers များကို အသုံးပြု၍ PCR ချဲ့ထွင်ခြင်းက) HTS11 ဆင့်ကဲအမှားအယွင်းများကြောင့်၊ b) primers (NNK)1-12 ၏ အရည်အသွေးအပေါ် သက်ရောက်မှုရှိပြီး ဂ) အသင့်အနေအထားဖြင့် စာကြည့်တိုက်တွင် wild-type (wt) phage (skeleton inserts) ပါဝင်ခြင်းအတွက် စီစဥ်စစ်ထုတ်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်ကို စီစစ်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်တစ်ခု (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 1b)။ဤစစ်ထုတ်မှုအဆင့်များသည် HTS စီစစ်ခြင်းစာကြည့်တိုက်များအားလုံးနှင့် သက်ဆိုင်ပါသည်။စံပြစာကြည့်တိုက်အတွက် စုစုပေါင်းဖတ်ရှုမှု 233,868 ကိုရရှိခဲ့ပြီး ၎င်းတို့ထဲမှ 39% သည် စစ်ထုတ်မှုစံနှုန်းများကို အောင်မြင်ပြီး နောက်ဆက်တွဲအကျော့များအတွက် စာကြည့်တိုက်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုနှင့် ရွေးချယ်မှုအတွက် အသုံးပြုခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 1c–e)။ဖတ်ရှုမှုများသည် 36 nucleotides (နောက်ဆက်တွဲပုံ. 1c) တွင် အထွတ်အထိပ်ရှိ အလျား 3 အခြေခံအတွဲ 3 ခု၏ အဆများဖြစ်ပြီး စာကြည့်တိုက်ဒီဇိုင်း (NNK) 1-12 ကို အတည်ပြုသည်။မှတ်သားဖွယ်၊ ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် စာကြည့်တိုက်အဖွဲ့ဝင်များ၏ 11% တွင် 12-dimensional wild-type (wt) backbone PAGISRELVDKL ပါ၀င်ပြီး sequences တစ်ဝက်နီးပါး (49%) တွင် ထည့်သွင်းခြင်း သို့မဟုတ် ဖျက်ခြင်းများပါရှိသည်။စာကြည့်တိုက်စာကြည့်တိုက်၏ HTS သည် စာကြည့်တိုက်ရှိ peptides ၏ ကွဲပြားမှုမြင့်မားမှုကို အတည်ပြုခဲ့သည်- peptide sequences ၏ 81% ကျော်ကို တစ်ကြိမ်သာတွေ့ရှိပြီး ≥4 မိတ္တူတွင် 1.5% သာဖြစ်ပေါ်သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 2a)။အမိုင်နိုအက်ဆစ်များ (aa) ၏ ကြိမ်နှုန်းများသည် ပျက်ယွင်းနေသော NKK ဇာတ်ဝင်ခန်းမှ ထုတ်ပေးသော codons အရေအတွက်အတွက် မျှော်လင့်ထားသည့် ကြိမ်နှုန်းများနှင့် ကောင်းမွန်စွာ ဆက်စပ်နေသည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 2b)။ဤထည့်သွင်းမှုများဖြင့် ကုဒ်လုပ်ထားသော aa အကြွင်းအကျန်များ၏ ကြိမ်နှုန်းသည် တွက်ချက်ထားသော ကြိမ်နှုန်း (r = 0.893) (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 2c) နှင့် ကောင်းစွာဆက်စပ်နေသည်။ဆေးထိုးရန်အတွက် phage စာကြည့်တိုက်များ ပြင်ဆင်မှုတွင် ချဲ့ထွင်ခြင်းနှင့် endotoxin ဖယ်ရှားခြင်း အဆင့်များ ပါဝင်သည်။၎င်းသည် phage libraries12,13 ၏ကွဲပြားမှုကိုလျှော့ချနိုင်ချေကိုယခင်ကပြသထားသည်။ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် endotoxin ဖယ်ရှားခြင်းခံရသော ပန်းကန်ပြား-ချဲ့ထားသည့် phage စာကြည့်တိုက်ကို ဆက်တိုက်လုပ်ဆောင်ပြီး AA ၏အကြိမ်ရေကို ခန့်မှန်းရန် မူလစာကြည့်တိုက်နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါသည်။မူလရေကန်နှင့် ချဲ့ထွင်ထားသော သန့်စင်သောရေကန်ကြားတွင် ခိုင်မာသောဆက်စပ်ဆက်နွယ်မှု (r = 0.995) ကို တွေ့ရှိရပြီး T7 phage ကို အသုံးပြုထားသော ပန်းကန်ပြားများပေါ်တွင် ချဲ့ထားသော clones များအကြား ပြိုင်ဆိုင်မှုသည် ကြီးကြီးမားမား ဘက်လိုက်မှုမဖြစ်စေကြောင်း ညွှန်ပြပါသည်။စာကြည့်တိုက်များ၏ ကွဲပြားမှု (~109) ကို HTS ဖြင့်ပင် အပြည့်အဝ ဖမ်းယူမရနိုင်သောကြောင့် ဤနှိုင်းယှဉ်မှုသည် စာကြည့်တိုက်တစ်ခုစီရှိ tripeptide motifs ၏ အကြိမ်ရေအပေါ် အခြေခံထားသည်။ရာထူးတစ်ခုစီရှိ aa ၏ ကြိမ်နှုန်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် ထည့်သွင်းထားသော repertoire ၏နောက်ဆုံးသုံးရာထူး (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 2e) တွင် သေးငယ်သောအနေအထား-မှီခိုဘက်လိုက်မှုကို ဖော်ပြသည်။နိဂုံးချုပ်အားဖြင့်၊ ရွေးချယ်မှုအကြိမ်များစွာကြားရှိ phage စာကြည့်တိုက်များ၏ ချဲ့ထွင်မှုနှင့် ပြင်ဆင်မှုများကြောင့် စာကြည့်တိုက်များ၏ အရည်အသွေးနှင့် ကွဲပြားမှုကို လက်ခံနိုင်ဖွယ်ရှိကြောင်းနှင့် ကွဲပြားမှုများတွင် အနည်းငယ်သောပြောင်းလဲမှုများကိုသာ တွေ့ရှိခဲ့ကြောင်း ကောက်ချက်ချခဲ့သည်။
BBB နှင့်/သို့မဟုတ် BCSFB (ပုံ. 1a-b) မှတဆင့် သွေးကြောထဲထိုးသွင်းသည့် T7 phage ကို ဖော်ထုတ်ရာတွင် လွယ်ကူစေရန်အတွက် အမှတ်စဉ် cerebrospinal fluid sampling ကို သတိမေ့သောကြွက်များ၏ CM ထဲသို့ cannula တစ်ခု ခွဲစိတ်ထည့်သွင်းခြင်းဖြင့် လုပ်ဆောင်နိုင်ပါသည်။vivo ရွေးချယ်မှု ပထမသုံးကြိမ်တွင် လွတ်လပ်သောရွေးချယ်ရေးလက်နက် (လက်နက် A နှင့် B) နှစ်ခုကို ကျွန်ုပ်တို့အသုံးပြုခဲ့သည် (ပုံ 1c)။ရွေးချယ်မှု ပထမသုံးကြိမ်တွင် မိတ်ဆက်ခဲ့သည့် စုစုပေါင်း phage ပမာဏကို လျှော့ချခြင်းဖြင့် ရွေးချယ်မှု၏ တင်းမာမှုကို တဖြည်းဖြည်း တိုးမြှင့်ခဲ့သည်။စတုတ္ထအချီတွင် ကျွန်ုပ်တို့သည် အကိုင်းအခက် A နှင့် B တို့မှ နမူနာများကို ပေါင်းစပ်ပြီး နောက်ထပ် သီးခြားရွေးချယ်မှု သုံးခုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။ဤမော်ဒယ်ရှိ T7 phage အမှုန်များ၏ vivo ဂုဏ်သတ္တိများကို လေ့လာရန်၊ wild-type phage (PAGISRELVDKL master insert) ကို အမြီးသွေးပြန်ကြောမှတစ်ဆင့် ကြွက်များထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။မတူညီသောအချိန်အချက်များတွင် ဦးနှောက်အရည်နှင့်သွေးမှ phages ကိုပြန်လည်ရယူခြင်းသည် အတော်လေးသေးငယ်သော T7 icosahedral phages သည် သွေးအတွင်းခန်းမှ လျင်မြန်သော ကနဦးရှင်းလင်းရေးအဆင့်ဖြစ်သည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 3) ကိုပြသခဲ့သည်။အုပ်ချုပ်သည့် titers နှင့် ကြွက်များ၏ သွေးပမာဏကို အခြေခံ၍ ခန့်မှန်းခြေ 1% wt သာ တွက်ချက်ပါသည်။အကြောထိုးသွင်းပြီး 10 မိနစ်အကြာတွင် စီမံထားသော ပမာဏမှ ဖာ့ခ်ျကို သွေးထဲတွင် တွေ့ရှိခဲ့သည်။ဤကနဦး လျင်မြန်စွာ ကျဆင်းပြီးနောက်၊ နှေးကွေးသော မူလရှင်းလင်းမှုကို ၂၇.၇ မိနစ်ဖြင့် တိုင်းတာခဲ့သည်။အရေးကြီးသည်မှာ၊ CSF compartment မှ phage အနည်းငယ်ကိုသာ ထုတ်ယူပြီး CSF compartment သို့ wild-type phage ရွှေ့ပြောင်းခြင်းအတွက် နောက်ခံနိမ့်ကြောင်း ညွှန်ပြသည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 3)။ပျမ်းမျှအားဖြင့်၊ သွေးထဲတွင် T7 phage ၏ 1 x 10-3% titers ခန့်သာရှိပြီး ကနဦးထည့်သွင်းထားသော phages များ၏ 4 x 10-8% သည် နမူနာကာလတစ်ခုလုံး (0-250 မိနစ်) တစ်လျှောက်လုံးတွင် cerebrospinal fluid ကိုရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။သတိပြုမိသည်မှာ၊ ဦးနှောက်အမြှေးပါးအရည်ရှိ ရိုင်းအမျိုးအစား ဖာ့ဂ်၏ သက်တမ်းတစ်ဝက် (၂၅.၇ မိနစ်) သည် သွေးတွင်တွေ့ရှိသည့်အရာနှင့် ဆင်တူသည်။ဤအချက်အလက်များသည် သွေးမှ CSF အကန့်ကို CM-cannulated ကြွက်များတွင် ခွဲထုတ်ထားသည့် အတားအဆီးသည် နဂိုအတိုင်းဖြစ်ပြီး၊ vivo မှ phage စာကြည့်တိုက်များ၏ ရွေးချယ်မှုတွင် သွေးမှ CSF ခန်းထဲသို့ အလွယ်တကူ ပို့ဆောင်နိုင်သည့် clones များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်စေပါသည်။
(က) ကြီးမားသောရေကန်မှ ဦးနှောက်အရည် (CSF) ကို ပြန်လည်နမူနာယူရန် နည်းလမ်းကို သတ်မှတ်ခြင်း။(ခ) ဗဟိုအာရုံကြောစနစ် (CNS) အတားအဆီး (CNS) အတားအဆီး၏ ဆယ်လူလာတည်နေရာပြသသည့် ပုံကြမ်းနှင့် သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီး (BBB) ​​နှင့် သွေးဦးနှောက်အတားအဆီးကိုဖြတ်ကျော်သည့် peptides များကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် အသုံးပြုသည့် ရွေးချယ်မှုဗျူဟာ။(ဂ) vivo phage display တွင် screening flowchart။ရွေးချယ်မှုတစ်ခုစီတွင်၊ phages (မြှားများအတွင်း၌ တိရစ္ဆာန်ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်း) ကို သွေးကြောသွင်းပြီး ထိုးသွင်းခဲ့သည်။အမှီအခိုကင်းသော အခြားရွေးချယ်ရေးဌာနခွဲနှစ်ခု (A၊ B) သည် ရွေးချယ်မှု ၄ ကြိမ်မြောက်အထိ သီးခြားထားရှိမည်ဖြစ်သည်။ရွေးချယ်မှုအကျော့ 3 နှင့် 4 အတွက် CSF မှ ထုတ်နုတ်ထားသော phage clone တစ်ခုစီကို ကိုယ်တိုင် စီတန်းထားပါသည်။(ဃ) T7 peptide စာကြည့်တိုက်၏ အကြောထိုးသွင်းပြီးနောက် ပထမအကျော့တွင် ကြွက်နှစ်ကောင်အတွက် ရွေးချယ်မှုအတွင်း သွေး (အနီရောင်စက်ဝိုင်း) နှင့် ဦးနှောက်အမြှေးပါးအရည် (အစိမ်းရောင်တြိဂံများ) တို့မှ ခွဲထုတ်ထားသော ဖာ့ဂ်ျ၏ ရုပ်ပုံသဏ္ဍာန် (2 x 1012 ဖာ့ဂ်ျ/တိရစ္ဆာန်)။အပြာရောင်စတုရန်းပုံများသည် စုစုပေါင်းသွေးပမာဏကိုထည့်သွင်းစဉ်းစားပြီး ထိုးသွင်းထားသော phage ပမာဏမှ တွက်ချက်ထားသော သွေးအတွင်းရှိ phage ၏ ပျမ်းမျှ ကနဦးအာရုံစူးစိုက်မှုကို ဖော်ပြသည်။အနက်ရောင်စတုရန်းများသည် သွေးတွင်း ပမာဏမှ ခွဲထုတ်ထားသော y မျဉ်း၏ လမ်းဆုံအမှတ်ကို ညွှန်ပြသည်။(င၊ စ) peptide တွင်တွေ့ရှိရသော ထပ်နေသော tripeptide motifs အားလုံးကို နှိုင်းရကြိမ်နှုန်းနှင့် ဖြန့်ဖြူးမှုကို တင်ပြပါ။ဖတ်ရှုမှု 1000 တွင်တွေ့ရှိရသော motif အရေအတွက်ကို ပြသထားသည်။သိသာထင်ရှားစွာ (p < 0.001) ကြွယ်ဝသောပုံစံများကို အနီရောင်အစက်များဖြင့် မှတ်သားထားသည်။(င) ထိုးသွင်းထားသောစာကြည့်တိုက်၏ tripeptide motif ၏ နှိုင်းရကြိမ်နှုန်းကို တိရိစ္ဆာန်များမှ သွေးမှရရှိသော phage နှင့် နှိုင်းယှဉ်ထားသော ကွဲလွဲမှုဆက်စပ်မှု။(စ) တိရိစ္ဆာန် phage tripeptide motifs #1.1 နှင့် #1.2 သွေးနှင့် cerebrospinal အရည်များတွင် သီးခြားခွဲထားသော တိရစ္ဆာန်များ၏ ကြိမ်နှုန်းများကို နှိုင်းယှဉ်ထားသော ကွဲလွဲမှုဆက်စပ်မှု(ဆ၊ ဇ) တိရိစ္ဆာန်နှစ်မျိုးလုံးတွင် vivo ရွေးချယ်မှုအပြီးတွင် (ဆ) နှင့် CSF (h) တွင် ကြွယ်ဝသော page နှင့် သွေးတွင်ကြွယ်ဝသော phage တို့၏ ဆက်တိုက် ID ကို ကိုယ်စားပြုခြင်း။စာလုံးတစ်လုံးပါသော ကုဒ်၏ အရွယ်အစားသည် ထိုအနေအထားတွင် အမိုင်နိုအက်ဆစ် မည်မျှ မကြာခဏ ဖြစ်ပေါ်သည်ကို ညွှန်ပြသည်။အစိမ်းရောင် = ဝင်ရိုးစွန်း၊ ခရမ်းရောင် = ကြားနေ၊ အပြာ = အခြေခံ၊ အနီရောင် = အက်ဆစ်နှင့် အနက်ရောင် = hydrophobic amino acids။ပုံ 1a၊ b ကို Eduard Urich မှ ဒီဇိုင်းဆွဲထုတ်လုပ်ထားပါသည်။
ကျွန်ုပ်တို့သည် phage peptide စာကြည့်တိုက်ကို CM တူရိယာ ကြွက်နှစ်ကောင် (အကန့် A နှင့် B) ထဲသို့ ထိုးသွင်းပြီး ဦးနှောက်အရည်နှင့် သွေးမှ ခွဲထုတ်ထားသော phage (ပုံ 1d)။စာကြည့်တိုက်၏ ကနဦး လျင်မြန်စွာ ရှင်းလင်းမှုသည် တောရိုင်းအမျိုးအစား ဖာ့ဂ်ျနှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက အသံထွက်နည်းပါသည်။တိရိစ္ဆာန်နှစ်ကောင်စလုံးတွင် ထိုးသွင်းထားသော စာကြည့်တိုက်၏ ပျမ်းမျှသက်တမ်းတစ်ဝက်သည် သွေးထဲတွင် ၂၄.၈ မိနစ်ဖြစ်ပြီး တောရိုင်းအမျိုးအစား phage နှင့် CSF တွင် ၃၈.၅ မိနစ်ဖြစ်သည်။တိရိစ္ဆာန်တစ်ခုစီမှ သွေးနှင့် ဦးနှောက်အမြှေးအရည် phage နမူနာများကို HTS တွင် ထားရှိခဲ့ပြီး တိုတောင်းသော tripeptide motif ရှိနေခြင်းအတွက် ခွဲခြားထားသော peptides အားလုံးကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။Tripeptide motifs များသည် ဖွဲ့စည်းတည်ဆောက်ပုံဖွဲ့စည်းပုံနှင့် peptide-protein အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုအတွက် အနည်းငယ်မျှသောအခြေခံကို ပံ့ပိုးပေးသောကြောင့် ရွေးချယ်ခဲ့ခြင်းဖြစ်သည်။ထိုးသွင်းထားသော phage စာကြည့်တိုက်နှင့် တိရိစ္ဆာန်နှစ်ကောင်စလုံး၏ သွေးမှထုတ်ယူထားသော ကိုယ်လုံးများကြား motifs များ ဖြန့်ဝေရာတွင် ကောင်းမွန်သောဆက်စပ်မှုကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 1e)။စာကြည့်တိုက်၏ဖွဲ့စည်းပုံသည် သွေးခန်းအတွင်း အနည်းငယ်သာ ကြွယ်ဝကြောင်း အချက်အလက်များက ဖော်ပြသည်။Weblogo16 ဆော့ဖ်ဝဲလ်ကို လိုက်လျောညီထွေဖြစ်အောင် အသုံးပြု၍ အနေအထားတစ်ခုစီတွင် အမိုင်နိုအက်ဆစ်ကြိမ်နှုန်းနှင့် သဘောတူညီမှု အတွဲများကို ထပ်မံခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ သွေး glycine အကြွင်းအကျန်များ (ပုံ ၁ ဂရမ်) တွင် အားကောင်းသော ကြွယ်ဝမှုကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။CSF မှရွေးချယ်ထားသော clones များနှင့် သွေးကို နှိုင်းယှဉ်ကြည့်သောအခါ၊ အားကောင်းသော ရွေးချယ်မှုနှင့် motifs အချို့ကို ဖယ်ထုတ်ခြင်းကို တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ. 1f)၊ အချို့သော အမိုင်နိုအက်ဆစ်များသည် အဖွဲ့ဝင် 12 ဦးရှိ ကြိုတင်သတ်မှတ်ထားသော အနေအထားများတွင် ဦးစားပေးရှိနေသည် (ပုံ။ 1h)။ထင်ရှားသည်မှာ၊ တိရစ္ဆာန်တစ်ကောင်ချင်းစီတွင် ဦးနှောက်အမြှေးအရည်တွင် သိသိသာသာကွဲပြားသည်၊ တိရစ္ဆာန်နှစ်မျိုးလုံးတွင် သွေး glycine ကြွယ်ဝမှုကိုတွေ့ရှိရသည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 4a–j)။တိရိစ္ဆာန်များ #1.1 နှင့် #1.2 ၏ ဦးနှောက်အရည်များတွင် ဆက်တိုက်ဒေတာကို တင်းကြပ်စွာ စစ်ထုတ်ပြီးနောက်၊ စုစုပေါင်း 964 နှင့် 420 တစ်မူထူးခြားသော 12-mer peptides ကို ရရှိခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 1d–e)။သီးခြား phage clones များကို ချဲ့ထွင်ပြီး vivo ရွေးချယ်မှုတွင် ဒုတိယအကျော့ကို ချထားပါသည်။ဒုတိယအကျော့ရွေးချယ်မှုမှထုတ်နုတ်ထားသော Phage အား တိရစ္ဆာန်တစ်ခုစီတွင် HTS တွင်ထည့်သွင်းထားပြီး tripeptide motifs ပေါ်ပေါက်မှုကိုခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် motif အသိအမှတ်ပြုမှုပရိုဂရမ်တစ်ခုတွင် ခွဲခြားသတ်မှတ်ထားသော peptides အားလုံးကို ထည့်သွင်းအသုံးပြုခဲ့သည် (ပုံ။ 2a၊ b၊ ef)။CSF မှပြန်လည်ရယူသော phage ၏ပထမစက်ဝန်းနှင့်နှိုင်းယှဉ်ပါက၊ အကိုင်းအခက် A နှင့် B ရှိ CSF ရှိ motifs အများအပြား၏နောက်ထပ်ရွေးချယ်ခြင်းနှင့်ရွေးချယ်ခြင်းများကိုကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည် (ပုံ 2)။၎င်းတို့သည် တသမတ်တည်း အစီအစဥ်၏ မတူညီသော ပုံစံများကို ကိုယ်စားပြုခြင်းရှိမရှိ ဆုံးဖြတ်ရန် ကွန်ရက် ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်း အယ်လဂိုရီသမ်ကို အသုံးပြုထားသည်။အစားထိုး clade A (ပုံ. 2c၊ d) နှင့် clade B (ပုံ. 2g, h) တွင် CSF မှ ပြန်လည်ရယူသည့် 12-dimensional sequences အကြား ရှင်းရှင်းလင်းလင်းတူညီမှုကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။ဌာနခွဲတစ်ခုစီရှိ စုပေါင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုသည် 12-mer peptides အတွက် မတူညီသောရွေးချယ်မှုပရိုဖိုင်များ (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 5c၊d) နှင့် ဒုတိယအကျော့ရွေးချယ်မှုအပြီး ဒုတိယအကျော့ရွေးချယ်မှုအပြီးတွင် ပေါင်းစုထားသော clones အတွက် အချိန်ကြာလာသည်နှင့်အမျှ CSF/ blood titer အချိုး တိုးလာပါသည်။)
vivo functional phage display ရွေးချယ်မှုတွင် နှစ်ပတ်ဆက်တိုက် ဦးနှောက်အရည်ရှိ motifs နှင့် peptides များ ကြွယ်ဝစေသည်။
တိရိစ္ဆာန်တစ်ခုစီ၏ ပထမအကြိမ် (#1.1 နှင့် #1.2) မှ ပြန်လည်ရရှိသော ဦးနှောက်အရည် phages အားလုံးကို ပေါင်းစည်းကာ၊ ချဲ့ထား၊ HT-sequenced နှင့် ပြန်လည်ထိုးသွင်းခြင်း (2 x 1010 phages/animal) 2 SM cannulated ကြွက်များ (#1.1 → #)။2.1 နှင့် 2.2၊ 1.2 → 2.3 နှင့် 2.4)။(a,b,e,f) ပထမအကြိမ်နှင့် ဒုတိယရွေးချယ်မှုအလှည့်များတွင် CSF မှရရှိသော phages များအားလုံး၏ tripeptide motifs ၏ နှိုင်းရကြိမ်နှုန်းကို နှိုင်းယှဉ်ထားသော ဆက်စပ်ကွက်လပ်များ။နှိုင်းရကြိမ်နှုန်းနှင့် လမ်းကြောင်းနှစ်ခုလုံးရှိ peptides တွင်တွေ့ရနိုင်သော ထပ်နေသော tripeptides အားလုံးကို ကိုယ်စားပြုသည့် motifs များ။ဖတ်ရှုမှု 1000 တွင်တွေ့ရှိရသော motif အရေအတွက်ကို ပြသထားသည်။(p < 0.001) နှိုင်းယှဥ်ထားသောစာကြည့်တိုက်များထဲမှ တစ်ခုတွင် သိသိသာသာ (p < 0.001) ရွေးချယ်ထားသော သို့မဟုတ် ဖယ်ထုတ်ထားသည့် ပန်းချီကားများကို အနီရောင်အစက်များဖြင့် မီးမောင်းထိုးပြထားသည်။(c၊ d၊ g၊ h) vivo ရွေးချယ်မှု၏ အကြိမ် 2 နှင့် 1 တို့ကို အခြေခံ၍ CSF ကြွယ်ဝသော အမိုင်နိုအက်ဆစ် ရှည်လျားသော အတွဲများ အားလုံး၏ တစ်ဆက်တည်းလိုဂိုကို ကိုယ်စားပြုခြင်း။စာလုံးတစ်လုံးပါသော ကုဒ်၏ အရွယ်အစားသည် ထိုအနေအထားတွင် အမိုင်နိုအက်ဆစ် မည်မျှ မကြာခဏ ဖြစ်ပေါ်သည်ကို ညွှန်ပြသည်။လိုဂိုကို ကိုယ်စားပြုရန်၊ ရွေးချယ်မှု နှစ်ခုကြားရှိ တိရစ္ဆာန်တစ်ဦးစီမှ ထုတ်ယူထားသော CSF အကြိမ်ရေ၏ အကြိမ်ရေကို နှိုင်းယှဉ်ပြီး ဒုတိယအချီတွင် ကြွယ်ဝသော အတွဲများကို ပြသထားသည်- (ဂ) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 နှင့် (h) #1.2–#2.4။(ဂ၊ ဃ) တိရိစ္ဆာန်များတွင် သတ်မှတ်ထားသော အနေအထားတွင် အကြွယ်ဝဆုံး အမိုင်နိုအက်ဆစ်များ မရှိပါ။2.1 နှင့် မဟုတ်ပါ။တိရစ္ဆာန်များတွင် 2.2 သို့မဟုတ် (g၊ ဇ)2.3 နှင့် မဟုတ်ပါ။2.4 ကို အရောင်နဲ့ ပြထားပါတယ်။အစိမ်းရောင် = ဝင်ရိုးစွန်း၊ ခရမ်းရောင် = ကြားနေ၊ အပြာ = အခြေခံ၊ အနီရောင် = အက်ဆစ်နှင့် အနက်ရောင် = hydrophobic amino acids။
တတိယအကြိမ်မြောက် ရွေးချယ်ပြီးနောက်၊ တိရစ္ဆာန်နှစ်ကောင်မှ သီးခြားခွဲထုတ်ထားသော CSF မှ ပြန်လည်ဖွဲ့စည်းထားသော ဖာ့ဂ်ကိုယ်ပွား 332 မှ ထူးခြားသော peptide 124 ခု (#3.1 နှင့် #3.2) ကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခဲ့သည်။အမျိုးအစား LGSVS (18.7%) တွင် ဆက်စပ်အချိုးအစား အများဆုံးရှိပြီး ၎င်းနောက်တွင် အရိုင်းအမျိုးအစား PAGISRELVDKL (8.2%)၊ MRWFFSHASQGR (3%)၊ DVAKVS (3%)၊ TWLFSLG (2.2%)၊ နှင့် SARGSWREIVSLS (2.2%) တို့ ပါဝင်သည်။နောက်ဆုံးစတုတ္ထအချီတွင်၊ သီးခြားတိရစ္ဆာန်သုံးကောင်မှ သီးခြားရွေးချယ်ထားသော အကိုင်းအခက်နှစ်ခုကို ပေါင်းစည်းလိုက်သည် (ပုံ။ 1c)။CSF မှ ပြန်လည်ရယူထားသော 925 စီဆက်ထားသော phage clones များထဲမှ စတုတ္ထအချီတွင် ထူးခြားသော peptide အမျိုးအစား 64 ခု (နောက်ဆက်တွဲပုံ 6b) ကိုတွေ့ရှိခဲ့ပြီး ၎င်းတို့အနက် wild-type phage ၏ အချိုးအစားသည် 0.8% သို့ ကျဆင်းသွားသည်။စတုတ္ထအကြိမ်တွင် အဖြစ်အများဆုံး CSF ကိုယ်လုံးရုပ်ပုံများသည် LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%)၊ LGSVS (17%)၊ GFVRFRLSNTR (14%)၊ KVAWRVFSLFWK (7%)၊ SVHGV (5%)၊ GRPQKINGARVC (3.6%) နှင့် RLSSVDSDLSGC (3,6%)%))။ရွေးချယ်ထားသော peptides ၏ အရှည်အကွာအဝေးသည် NNK စာကြည့်တိုက်ဒီဇိုင်းအတွက် degenerate codons ကိုအသုံးပြုသောအခါတွင် nucleotide ထည့်သွင်းခြင်း/ဖျက်ခြင်း သို့မဟုတ် စာကြည့်တိုက် primers များတွင် အချိန်မတန်မီ ရပ်သွားခြင်းကြောင့်ဖြစ်သည်။အချိန်မတန်မီ ရပ်တန့်ထားသော codons များသည် ပိုတိုသော peptides များကို ထုတ်ပေးပြီး ၎င်းတို့တွင် နှစ်သက်ဖွယ် aa motif ပါဝင်သောကြောင့် ရွေးချယ်ထားသည်။ပိုရှည်သော peptides များသည် synthetic libraries များ၏ primer များတွင် ထည့်သွင်းခြင်း/ဖျက်ခြင်းများမှ ဖြစ်ပေါ်လာနိုင်ပါသည်။၎င်းသည် ဒီဇိုင်းထုတ်ထားသော stop codon ကို frame အပြင်ဘက်တွင် နေရာချထားပြီး stop codon အသစ်တစ်ခု ရေအောက်ပိုင်းတွင် ပေါ်လာသည်အထိ ၎င်းကို ဖတ်သည်။ယေဘူယျအားဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ရွေးချယ်မှု လေးခုလုံးအတွက် ဖြည့်သွင်းမှုဒေတာကို နမူနာအထွက်ဒေတာနှင့် နှိုင်းယှဉ်ခြင်းဖြင့် ကျွန်ုပ်တို့တွက်ချက်ပါသည်။ပထမအကျော့ စိစစ်မှုအတွက်၊ အတိအကျမဟုတ်သော နောက်ခံကိုးကားချက်အဖြစ် ရိုင်း-အမျိုးအစား phage titers ကို အသုံးပြုခဲ့သည်။စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ အနုတ်လက္ခဏာ phage ရွေးချယ်မှုသည် ပထမ CSF လည်ပတ်မှုတွင် အလွန်အားကောင်းသော်လည်း (ပုံ 3a) သည် သွေးထဲတွင်မဟုတ်ပါ (ပုံ 3a) သည် peptide စာကြည့်တိုက်၏အဖွဲ့ဝင်အများစု၏ passive diffusion ဖြစ်နိုင်ခြေနည်းသောကြောင့် CSF compartment သို့ CSF compartment သို့ bacteriophages ထက်ပို၍ ထိရောက်စွာထိန်းသိမ်းထားနိုင်သည် သို့မဟုတ် ဖယ်ထုတ်ခြင်းထက် သွေးကြောမှဖယ်ရှားခြင်းဖြစ်နိုင်သည် ။သို့ရာတွင်၊ ဒုတိယအချီတွင်၊ CSF ရှိ phages များကို ကွက်လပ်နှစ်ခုလုံးတွင် ပြင်းထန်သောရွေးချယ်မှုကို တွေ့ရှိခဲ့ပြီး ယခင်အကျော့တွင် CSF စုပ်ယူမှုကို မြှင့်တင်ပေးသည့် peptides ပြသသည့် phages များတွင် ကြွယ်ဝသည်ဟု အကြံပြုထားသည်။တဖန် သိသိသာသာ သွေးကြွယ်ဝခြင်း မရှိဘဲ။တတိယအကြိမ်နှင့် စတုတ္ထအကြိမ်များတွင်လည်း၊ phage clones များသည် CSF တွင် သိသိသာသာကြွယ်ဝလာပါသည်။နောက်ဆုံးအကြိမ်ရွေးချယ်မှုနှစ်ခုကြားရှိ ထူးခြားသော peptide sequence တစ်ခုစီ၏ နှိုင်းရကြိမ်နှုန်းကို နှိုင်းယှဉ်ကြည့်ပါက၊ အတွဲများသည် စတုတ္ထအကြိမ်ရွေးချယ်မှုတွင် ပို၍ပင်ကြွယ်ဝလာသည် (ပုံ။ 3b)။စုစုပေါင်း 931 tripeptide motifs များကို peptide orientation နှစ်ခုစလုံးကို အသုံးပြု၍ ထူးခြားသော peptide အစီအစဉ် 64 ခုမှ ထုတ်ယူခဲ့သည်။စတုတ္ထအချီတွင် အကြွယ်ဝဆုံးသော motifs များကို ထိုးသွင်းထားသည့် စာကြည့်တိုက်နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပတ်လုံးရှိ ၎င်းတို့၏ ကြွယ်ဝမှု ပရိုဖိုင်များ အတွက် ပိုမို အနီးကပ် ဆန်းစစ်ထားသည် (ဖြတ်တောက်ခြင်း- 10% ကြွယ်ဝမှု) (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 6c)။အထွေထွေရွေးချယ်မှုပုံစံများက လေ့လာထားသော စေ့ဆော်မှုအများစုသည် ရွေးချယ်မှုနယ်ပယ်နှစ်ခုစလုံး၏ ယခင်နှစ်ကျော့စလုံးတွင် ကြွယ်ဝလာကြောင်း ပြသခဲ့သည်။သို့သော်၊ အချို့သော motifs (ဥပမာ SGL၊ VSG၊ LGS GSV) သည် အစားထိုး clade A မှ အများစုဖြစ်ပြီး အခြားပုံစံများ (ဥပမာ FGW၊ RTN၊ WGF၊ NTR) သည် အစားထိုး clade B တွင် ကြွယ်ဝပါသည်။
CSF သယ်ယူပို့ဆောင်ရေး CSF ကြွယ်ဝသော phage-displayed peptides နှင့် streptavidin payloads များနှင့်ပေါင်းစပ်ထားသော biotinylated ခေါင်းဆောင် peptides များ၏ validation ။
(က) ထိုးသွင်းထားသော (input = I) phage (PFU) titers နှင့် သတ်မှတ်ထားသော CSF phage titers (output = O) ကို အခြေခံ၍ လေးပတ်လုံး (R1-R4) တွင် တွက်ချက်ထားသော ကြွယ်ဝမှုအချိုး။နောက်ဆုံးသုံးကျော့ (R2-R4) အတွက် ကြွယ်ဝမှုအချက်များအား ယခင်အချီနှင့် ပထမအချီ (R1) တို့ကို အလေးချိန်ဒေတာဖြင့် နှိုင်းယှဉ်တွက်ချက်ထားပါသည်။အဖွင့်အကန့်များသည် ဦးနှောက်အမြှေးပါးအရည်များဖြစ်ပြီး အရိပ်ရသောဘားများသည် ပလာစမာဖြစ်သည်။(***p<0.001၊ ကျောင်းသား၏ t-test ကိုအခြေခံ၍)။(ခ) ရွေးချယ်မှု၏ 4 ပတ်ပြီးနောက် CSF တွင် စုဆောင်းထားသော ဖာ့ဂ်အားလုံးအတွက် ၎င်းတို့၏ အချိုးအစားအရ အပေါများဆုံး phage peptides များစာရင်း။အသုံးအများဆုံး phage clone ခြောက်ခုကို အရောင်၊ နံပါတ်တပ်ထားပြီး ရွေးချယ်မှု၏ အကြိမ် 3 နှင့် 4 ကြားတွင် ၎င်းတို့၏ ကြွယ်ဝမှုအချက်များ (insets) ဖြင့် မီးမောင်းထိုးပြထားသည်။(ဂ၊ ဃ) အဆင့် 4 မှ အကြွယ်ဝဆုံး phage clones ခြောက်ခု၊ အချည်းနှီးသော phage နှင့် parent phage peptide စာကြည့်တိုက်များကို CSF နမူနာပုံစံဖြင့် တစ်ဦးချင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။CSF နှင့် သွေးနမူနာများကို သတ်မှတ်ထားသည့် အချိန်အမှတ်များတွင် ကောက်ယူခဲ့သည်။(ဂ) ကိုယ်စားလှယ်လောင်း ဖာ့ဂ်ျကိုယ်ပွား 6 ခု (2 x 1010 ဖာ့ဂ်ျ/တိရစ္ဆာန်များ)၊ အချည်းနှီးသော ဖာ့ဂ်ျ (#1779) (2 x 1010 ဖာ့ဂ်ျ/တိရိစ္ဆာန်များ) နှင့် စတော့ခ်ဖာ့ဂ်ျပပ်ဆိုဒ်စာကြည့်တိုက်များ (2 x 1012 ဖာ့ဂ်ျ/တိရိစ္ဆာန်များ) အနည်းဆုံး 3 CM ကို အမြီးပိုင်းဖြတ်ထားသော တိရစ္ဆာန်များသို့ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာပြီး ကုသပေးသည်။ထိုးသွင်းထားသော phage clone နှင့် phage peptide စာကြည့်တိုက်တစ်ခုစီ၏ CSF ဆေးဝါးလုပ်ငန်းကို အချိန်နှင့်အမျှ ပြသထားသည်။(ဃ) နမူနာယူသည့်အချိန်အတွင်း ပြန်လည်ရယူထားသော phages/mL အားလုံးအတွက် ပျမ်းမျှ CSF/သွေးအချိုးကို ပြသည်။(င) ဓာတုခေါင်းဆောင် ပက်ပိုက်လေးခုနှင့် မွှေနှောက်ထိန်းချုပ်မှုတစ်ခုအား ၎င်းတို့၏ N-terminus (tetramer display) မှတဆင့် ဘိုင်အိုတင်နှင့် ချိတ်ဆက်ထားပြီး ဆေးထိုးပြီးနောက် (အမြီးပိုင်းသွေးပြန်ကြော iv၊ 10 mg streptavidin/kg)။အနည်းဆုံး ပိုက်တပ်ကြွက်သုံးကောင် (N=3)။)CSF နမူနာများကို ညွှန်ပြသည့် အချိန်မှတ်များတွင် စုဆောင်းပြီး streptavidin ပြင်းအားကို CSF anti-streptavidin ELISA ဖြင့် တိုင်းတာသည် (nd = မတွေ့ရှိပါ)။(*p<0.05၊ **p<0.01၊ ***p<0.001၊ ANOVA စမ်းသပ်မှုအပေါ် အခြေခံသည်)။(စ) ရွေးချယ်မှု၏ 4 ကြိမ်မြောက်ရွေးချယ်မှုမှ အခြားရွေးချယ်ထားသော phage peptide clone #2002 (ခရမ်းရောင်) ၏ အကြွယ်ဝဆုံး phage peptide clone ၏ အမိုင်နိုအက်ဆစ် sequence ကို နှိုင်းယှဉ်ခြင်း။တူညီပြီး အလားတူ အမိုင်နိုအက်ဆစ်အပိုင်းအစများကို အရောင်ဖြင့် ဖော်ပြထားပါသည်။
စတုတ္ထအကြိမ် (ပုံ. 3b) တွင် ကြွယ်ဝသော ဖြည့်စွက်စာများအားလုံးကို CSF နမူနာပုံစံတွင် နောက်ထပ်တစ်ဦးချင်းခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက် ကိုယ်စားလှယ်လောင်းကိုယ်ပွားခြောက်ခုကို ရွေးချယ်ခဲ့သည်။ကိုယ်စားလှယ်လောင်း phage ခြောက်ခု၊ အချည်းနှီးသော phage (မထည့်ရ) နှင့် prophage peptide စာကြည့်တိုက်များကို သန့်စင်ထားသော CM တိရစ္ဆာန်သုံးကောင်ထဲသို့ ထိုးသွင်းခဲ့ပြီး ဆေးဝါးဖော်စပ်ခြင်းကို CSF (ပုံ 3c) နှင့် သွေး (နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 7) တွင် ဆန်းစစ်မှုပြုလုပ်ခဲ့သည်။စမ်းသပ်ထားသော phage clones များအားလုံးသည် CSF အကန့်အား အချည်းနှီးသော ထိန်းချုပ်မှု phage (#1779) ထက် အဆ 10 မှ 1000 အဆပိုမိုမြင့်မားစွာ ပစ်မှတ်ထားခဲ့သည်။ဥပမာအားဖြင့်၊ #2020 နှင့် #2077 တို့သည် control phage ထက် CSF titers အဆ 1000 ခန့်ပိုမိုမြင့်မားသည်။ရွေးချယ်ထားသော peptide တစ်ခုစီ၏ pharmacokinetic profile သည် မတူညီသော်လည်း ၎င်းတို့အားလုံးတွင် မြင့်မားသော CSF homing စွမ်းရည်ရှိသည်။#1903 နှင့် #2011 တို့၏ clones များအတွက် အချိန်ကြာလာသည်နှင့်အမျှ အဆက်မပြတ်ကျဆင်းလာသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့ပြီး #2077၊ #2002 နှင့် #2009 တို့၏ကိုယ်ပွားများအတွက် ပထမ 10 မိနစ်အတွင်း တိုးလာခြင်းသည် တက်ကြွသောသယ်ယူပို့ဆောင်ရေးကိုညွှန်ပြနိုင်သော်လည်း အတည်ပြုရန်လိုအပ်ပါသည်။Clones #2020၊ #2002 နှင့် #2077 တို့သည် မြင့်မားသောအဆင့်တွင် တည်ငြိမ်ခဲ့ပြီး CSF ၏ #2009 ၏ CSF အာရုံစူးစိုက်မှုသည် ကနဦးတိုးမြှင့်ပြီးနောက် တဖြည်းဖြည်း လျော့နည်းသွားပါသည်။ထို့နောက် ကျွန်ုပ်တို့သည် CSF ကိုယ်စားလှယ်တစ်ဦးစီ၏ နှိုင်းရကြိမ်နှုန်းကို ၎င်း၏သွေးအာရုံစူးစိုက်မှု (ပုံ။ 3d) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါသည်။နမူနာအချိန်တိုင်းတွင် CSF ကိုယ်စားလှယ်လောင်းတစ်ဦးစီ၏ ပျမ်းမျှ titer ၏ ဆက်စပ်မှုသည် ကိုယ်စားလှယ်လောင်း ခြောက်ဦးမှ သုံးဦးသည် CSF သွေးတွင် သိသာထင်ရှားစွာ ကြွယ်ဝကြောင်း ပြသခဲ့သည်။စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ၊ မွေးထုတ်ခြင်း #2077 သည် ပိုမိုမြင့်မားသောသွေးတည်ငြိမ်မှုကိုပြသခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲပုံ 7)။peptides များသည် CSF compartment သို့ phage အမှုန်များမှလွဲ၍ အခြားကုန်တင်ပစ္စည်းများကို တက်ကြွစွာ သယ်ဆောင်နိုင်စွမ်းရှိကြောင်း အတည်ပြုရန်၊ peptides နှင့် phage အမှုန်သို့ တွယ်ကပ်သည့် N-terminus တွင် ခေါင်းဆောင် peptides လေးခုကို ပေါင်းစပ်ထုတ်လုပ်ထားပါသည်။Biotinylated peptides (နံပါတ် 2002၊ 2009၊ 2020 နှင့် 2077) ကို streptavidin (SA) နှင့် ပေါင်းစပ်ထားသော phage ဂျီသြမေတြီကို အနည်းငယ်တုပသော ဘက်စုံပုံစံများရရှိရန်။ဤဖော်မတ်သည် ကျွန်ုပ်တို့အား ကုန်တင်ပရိုတင်း peptides များအဖြစ် သွေးနှင့် ဦးနှောက်အမြှေးအရည်များတွင် SA ထိတွေ့မှုကို တိုင်းတာနိုင်စေပါသည်။အရေးကြီးသည်မှာ၊ ဤ SA-ပေါင်းစပ်ဖော်မတ် (ပုံ 3e) ဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသော ပေါင်းစပ်ထားသော ပေါင်းစပ်မှုဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသော ဓာတု peptides များကို စီမံသောအခါတွင် phage ဒေတာကို မကြာခဏ ပြန်ထုတ်ပေးနိုင်သည်။မွှေထားသော peptides များသည် ကနဦးထိတွေ့မှုနည်းပြီး ၄၈ နာရီအတွင်း သိရှိနိုင်ခြင်းမရှိသောအဆင့်များဖြင့် CSF ရှင်းလင်းမှုကို ပိုမိုမြန်ဆန်စေသည်။CSF အာကာသထဲသို့ ဤ peptide phage clones များ၏ ပေးပို့လမ်းကြောင်းများကို ထိုးထွင်းသိမြင်နိုင်ရန် ကျွန်ုပ်တို့သည် vivo တွင် အကြောထိုးသွင်းပြီး 1 နာရီအကြာတွင် phage အမှုန်များကို တိုက်ရိုက်ထောက်လှမ်းရန် immunohistochemistry (IHC) ကို အသုံးပြု၍ တစ်ဦးချင်းစီ phage peptide hits များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာထားပါသည်။မှတ်သားစရာမှာ၊ ထိန်းချုပ်မှု phage (#1779) နှင့် #2020 တို့ကို ထိန်းချုပ်နိုင်ခြင်း မရှိသော်လည်း ဦးနှောက်သွေးကြောမျှင်များအတွင်း ပြင်းထန်သော စွန်းထင်းမှုမှ တွေ့ရှိရသည်မှာ # 2002၊ #2077 နှင့် #2009 ကို တွေ့ရှိနိုင်သည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 8)။ဤ peptides များသည် BBB ကိုဖြတ်ကျော်ခြင်းဖြင့် ဦးနှောက်အပေါ် တိကျစွာအကျိုးသက်ရောက်မှုကို အထောက်အကူပြုကြောင်း ညွှန်ပြသည်။BSCFB လမ်းကြောင်းလည်း ပါဝင်နိုင်သောကြောင့် ဤယူဆချက်ကို စမ်းသပ်ရန် နောက်ထပ်အသေးစိတ်ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန် လိုအပ်ပါသည်။အကြွယ်ဝဆုံးသော clone (#2002) ၏ အမိုင်နိုအက်ဆစ်စီးရီးကို အခြားရွေးချယ်ထားသော peptides များနှင့် နှိုင်းယှဉ်သောအခါ၊ ၎င်းတို့ထဲမှ အချို့သည် အလားတူ အမိုင်နိုအက်ဆစ်ဆက်များရှိကြောင်း၊ အလားတူ သယ်ယူပို့ဆောင်ရေး ယန္တရား (ပုံ 3f) ကို ညွှန်ပြနိုင်သည်ကို သတိပြုမိပါသည်။
၎င်း၏ထူးခြားသောပလာစမာပရိုဖိုင်းနှင့် CSF တွင် အချိန်ကြာလာသည်နှင့်အမျှ သိသာထင်ရှားစွာ တိုးလာခြင်းကြောင့်၊ phage display clone #2077 ကို ပိုမိုရှည်လျားသော 48 နာရီကြာကာလတွင် ထပ်မံရှာဖွေခဲ့ပြီး စဉ်ဆက်မပြတ် SA အဆင့်များနှင့် ဆက်နွယ်နေသော CSF ၏ လျင်မြန်စွာတိုးလာမှုကို မျိုးပွားနိုင်သည် (ပုံ။ 4a)။အခြားသတ်မှတ်ထားသော phage clones များနှင့် ပတ်သက်၍၊ #2077 သည် ဦးနှောက်သွေးကြောမျှင်များ အတွက် ပြင်းထန်စွာ စွန်းထင်းခဲ့ပြီး ပိုမိုကြည်လင်ပြတ်သားသော သွေးကြောမျှင်အမှတ်အသား lectin ဖြင့် သိသိသာသာ colocalization ကိုပြသပြီး parenchymal space တွင် စွန်းထင်းမှုအချို့ဖြစ်နိုင်သည် (ပုံ 4b)။CNS တွင် peptide-mediated ဆေးဝါးဗေဒဆိုင်ရာသက်ရောက်မှုများရရှိနိုင်ခြင်းရှိမရှိစုံစမ်းစစ်ဆေးရန်အတွက်ကျွန်ုပ်တို့သည် biotinylated ဗားရှင်းဖြစ်သော i) #2077 transit peptide နှင့် ii) BACE1 inhibitor peptide ကို မတူညီသောအချိုးအစားနှစ်ခုဖြင့် SA နှင့် ရောစပ်ထားပါသည်။ပေါင်းစပ်မှုတစ်ခုအတွက် ကျွန်ုပ်တို့သည် BACE1 peptide inhibitor ကိုသာအသုံးပြုခဲ့ပြီး အခြားတစ်ခုအတွက် BACE1 peptide inhibitor ၏ 1:3 အချိုးကို #2077 peptide ကိုအသုံးပြုခဲ့သည်။နမူနာနှစ်ခုလုံးကို သွေးကြောသွင်းပြီး ဘီတာ-အေမီလွိုက် ပက်ပရိုက် 40 (Abeta40) ၏ သွေးနှင့် ဦးနှောက်အရည်အဆင့်များကို အချိန်နှင့်အမျှ တိုင်းတာခဲ့သည်။Abeta40 ကို ဦးနှောက် parenchyma တွင် BACE1 တားဆီးမှုကို ထင်ဟပ်နေသောကြောင့် CSF တွင် တိုင်းတာသည်။မျှော်လင့်ထားသည့်အတိုင်း၊ ရှုပ်ထွေးမှုနှစ်ခုစလုံးသည် Abeta40 ၏သွေးပမာဏကို သိသိသာသာလျော့ကျစေသည် (ပုံ။ 4c၊ ဃ)။သို့သော်၊ peptide ၏အရောအနှောပါရှိသောနမူနာများသာဖြစ်သည်။2077 နှင့် SA နှင့်ပေါင်းစပ်ထားသော BACE1 peptide ၏ inhibitor သည် cerebrospinal fluid (ပုံ 4c) တွင် Abeta40 တွင် သိသာထင်ရှားစွာကျဆင်းသွားစေသည်။အချက်အလက်က peptide no.2077 သည် 60 kDa SA ပရိုတင်းကို CNS အတွင်းသို့ ပို့ဆောင်နိုင်ပြီး BACE1 peptide ၏ SA-conjugated inhibitors ဖြင့် ဆေးဝါးဗေဒဆိုင်ရာသက်ရောက်မှုများကို ဖြစ်ပေါ်စေသည်။
(က) အနည်းဆုံး CM-intubated ကြွက်သုံးကောင်တွင် CSF peptide #2077 (RLSSVDSDLSGC) နှင့် CM-intubed control phage (#1779) ၏ ရေရှည်ဆေးဝါးဖော်စပ်သည့် ပရိုဖိုင်များကို ပြသသည့် T7 phage ၏ Clonal ထိုးဆေး (2 × 10 phages/တိရစ္ဆာန်)။(ခ) peptide #2077 နှင့် ရေယာဉ်များ (လက်တင်) ကို တန်ပြန်ခြင်းပြသသော ဖာ့ဂ်ျထိုးကြွက်များ (2 × 10 10 ဖာ့ဂ်ျ/တိရိစ္ဆာန်) တွင် ကိုယ်စားပြု ကော်တီဝင် မိုက်ခရိုစကုပ်၏ ဖော်မြူလာ အဏုကြည့်ရုပ်ပုံ။ဤ phage clone များကို ကြွက် ၃ ကောင်တွင် စီမံထားပြီး ဆေးမလိမ်းမီ ၁ နာရီကြာ ဖြန့်ကျက်ခွင့်ပြုထားသည်။ဦးနှောက်များကို T7 phage capsid ဆန့်ကျင်ဘက် polyclonal FITC-တံဆိပ်တပ်ထားသော ပဋိပစ္စည်းများဖြင့် အပိုင်းပိုင်းခွဲထားသည်။ဖော်စပ်ခြင်းနှင့် နောက်ဆက်တွဲ ပြုပြင်ခြင်းမပြုမီ ဆယ်မိနစ်အလိုတွင်၊ DyLight594-တံဆိပ်တပ်ထားသော လက်တင်ကို သွေးကြောသွင်း၍ စီမံပေးခဲ့သည်။သွေးကြောမျှင်များနှင့် perivascular ဦးနှောက်တစ်ရှူးများ၏ lumen အတွင်းရှိ microvessels နှင့် phages (အစိမ်းရောင်) ၏ luminal side မှ lectin စွန်းထင်းခြင်း (အနီရောင်) ကိုပြသသော fluorescent ပုံများ။စကေးဘားသည် 10 µm နှင့် ကိုက်ညီသည်။(ဂ၊ ဃ) Biotinylated BACE1 inhibitory peptide တစ်ခုတည်း သို့မဟုတ် biotinylated transit peptide #2077 နှင့် ပေါင်းစပ်ခြင်းကို streptavidin နှင့် ပေါင်းစပ်ပြီးနောက် အနည်းဆုံး cannulated CM ကြွက်သုံးကောင်ကို အကြောထိုးသွင်းခြင်းဖြင့် (10 mg streptavidin/kg)။Aβ40 ရှိ BACE1 peptide inhibitor-mediated လျှော့ချခြင်းကို သွေး (အနီရောင်) နှင့် cerebrospinal fluid (လိမ္မော်ရောင်) ဖြင့် တိုင်းတာသည်။ပိုမိုရှင်းလင်းစေရန်အတွက်၊ ဂရပ်ပေါ်တွင် အစက်ချမျဉ်းကြောင်းကို 100% စကေးဖြင့် ဆွဲပါသည်။(ဂ) သွေးထဲတွင် Aβ40 တွင် ရာခိုင်နှုန်း လျှော့ချခြင်း (တြိဂံအနီ) နှင့် ဦးနှောက်အရည်များ (လိမ္မော်ရောင် တြိဂံများ) ကို transit peptide #2077 နှင့် BACE1 inhibitory peptide သို့ 3:1 အချိုးဖြင့် ကုသထားသော ကြွက်များတွင် လိမ္မော်ရောင်တြိဂံများ (လိမ္မော်ရောင်တြိဂံ)။(ဃ) သွေး Aβ40 (အနီရောင်စက်ဝိုင်း) နှင့် streptavidin နှင့်ကုသထားသော ကြွက်များ၏ ဦးနှောက်အရည် (လိမ္မော်ရောင်အဝိုင်း) သည် BACE1 inhibitory peptide နှင့်သာတွဲဖက်ထားသည်။ထိန်းချုပ်မှုတွင် Aβ အာရုံစူးစိုက်မှုသည် 420 pg/ml (စံသွေဖည် = 101 pg/ml) ဖြစ်သည်။
Phage display ကို biomedical research17 ၏ နယ်ပယ်များစွာတွင် အောင်မြင်စွာ အသုံးချခဲ့သည်။ဤနည်းလမ်းကို vivo vascular diversity studies18,19 နှင့် cerebral vessels 20,21,22,23,24,25,26 တို့ကို ပစ်မှတ်ထားသော လေ့လာမှုများတွင် အသုံးပြုထားသည်။ဤလေ့လာမှုတွင်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ဦးနှောက်သွေးကြောများကို ပစ်မှတ်ထားသော peptides များကို တိုက်ရိုက်ခွဲခြားသတ်မှတ်ခြင်းသာမက သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးကိုဖြတ်ကျော်ရန် တက်ကြွသောသယ်ယူပို့ဆောင်ရေးဂုဏ်သတ္တိရှိသည့် ကိုယ်စားလှယ်လောင်းများကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းကိုလည်း ဤရွေးချယ်ရေးနည်းလမ်းကို တိုးချဲ့လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ယခု ကျွန်ုပ်တို့သည် CM intubated ကြွက်များတွင် in vivo ရွေးချယ်ရေးလုပ်ထုံးလုပ်နည်း၏ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကို ဖော်ပြပြီး CSF homing ဂုဏ်သတ္တိများဖြင့် peptides ကိုခွဲခြားသတ်မှတ်ရန် ၎င်း၏အလားအလာကို ပြသထားသည်။12-mer ကျပန်း peptides များ၏စာကြည့်တိုက်ကိုပြသသည့် T7 phage ကိုအသုံးပြု၍ T7 phage သည် သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးသို့လိုက်လျောညီထွေဖြစ်စေရန် 10 လုံလောက်သောသေးငယ်သည် (အချင်း 60 nm) သေးငယ်ကြောင်းပြသနိုင်ခဲ့ပြီး သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီး သို့မဟုတ် choroid plexus ကိုတိုက်ရိုက်ဖြတ်ကျော်နိုင်ခဲ့သည်။Cannulated CM ကြွက်များမှ CSF ရိတ်သိမ်းခြင်းသည် vivo functional screening method တွင် ကောင်းမွန်စွာထိန်းချုပ်ထားပြီး၊ ထုတ်ယူထားသော phage သည် vasculature နှင့်ချိတ်ဆက်ရုံသာမက သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးကိုဖြတ်ကာ ပို့ဆောင်ပေးသူအဖြစ်လည်း လုပ်ဆောင်ကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့တွေ့ရှိခဲ့သည်။ထို့အပြင်၊ တစ်ပြိုင်နက်တည်း၊ သွေးစုဆောင်းခြင်းနှင့် CSF ​​သို့ HTS နှင့် သွေးမှရရှိသော phages များကိုအသုံးပြုခြင်းဖြင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့၏ရွေးချယ်မှုသည် CSF ၏ရွေးချယ်မှုကြားတွင် တိုးချဲ့ရန်အတွက် သွေးဖြည့်တင်းခြင်း သို့မဟုတ် ကြံ့ခိုင်မှုအပေါ် လွှမ်းမိုးမှုမရှိကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့အတည်ပြုပါသည်။သို့ရာတွင်၊ သွေးအကန့်သည် CSF အကန့်သို့ရောက်ရှိနိုင်သည့် အိတ်များသည် ဦးနှောက်အတွင်း ကြွယ်ဝစေရန် လုံလောက်သောကြာရှည်စွာ ရှင်သန်ပြီး သွေးကြောထဲတွင် လည်ပတ်နေရမည်ဖြစ်သောကြောင့် ရွေးချယ်ရေးလုပ်ထုံးလုပ်နည်း၏ တစ်စိတ်တစ်ပိုင်းဖြစ်သည်။အကြမ်းထည် HTS ဒေတာမှ ယုံကြည်စိတ်ချရသော အစီအစဥ်အချက်အလက်များကို ထုတ်ယူရန်အတွက်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုလုပ်ငန်းအသွားအလာတွင် ပလပ်ဖောင်းအလိုက် စီတန်းခြင်းအမှားများကို လိုက်လျောညီထွေဖြစ်စေမည့် စစ်ထုတ်မှုများကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။စစ်ဆေးမှုနည်းလမ်းတွင် kinetic parameters များကို ထည့်သွင်းခြင်းဖြင့်၊ သွေး 24၊ 27၊ 28 တွင် တောရိုင်းအမျိုးအစား T7 phages (t½ ~ 28 min) ၏ လျင်မြန်သော ဆေးဝါးဖော်စပ်နည်းကို အတည်ပြုခဲ့ပြီး ၎င်းတို့၏ ဦးနှောက်အရည်အတွက် တစ်ဝက်သက်တမ်း (t½ ~ 26 min) per minute ကိုလည်း ဆုံးဖြတ်ခဲ့သည်။သွေးနှင့် CSF တွင် အလားတူ ဆေးဝါးဖော်စပ်သည့် ပရိုဖိုင်များ ရှိသော်လည်း၊ သွေး-ဦးနှောက် အတားအဆီးကိုဖြတ်၍ သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးကိုဖြတ်၍ သွေးအာရုံကြောအတားအဆီး၏ 0.001% ကိုသာ CSF တွင် ရှာဖွေတွေ့ရှိနိုင်သည်။ဤအလုပ်သည် vivo panning strategies များတွင်အသုံးပြုသည့်အခါ၊ အထူးသဖြင့် လည်ပတ်မှုမှလျင်မြန်စွာရှင်းလင်းထားသော phage စနစ်များအတွက်၊ ကလိုနီအနည်းငယ်သည် CNS အကန့်သို့ရောက်ရှိနိုင်သောကြောင့် ဤလုပ်ငန်းသည် ပထမအကျော့ရွေးချယ်မှု၏အရေးကြီးမှုကို မီးမောင်းထိုးပြပါသည်။ထို့ကြောင့် ပထမအကျော့တွင်၊ ဤအလွန်တင်းကျပ်သော CSF မော်ဒယ်တွင် နောက်ဆုံးတွင် အကန့်အသတ်ရှိသော ကိုယ်လုံးများကိုသာ စုဆောင်းထားသောကြောင့် စာကြည့်တိုက်ကွဲပြားမှု လျော့နည်းသွားခြင်းမှာ အလွန်ကြီးမားပါသည်။vivo panning မဟာဗျူဟာတွင် ၎င်းတွင် CSF အကွက်အတွင်း တက်ကြွစွာစုပုံခြင်း၊ သွေးခန်းအတွင်း ကလိုးရှင်သန်ခြင်းနှင့် ပထမ 10 မိနစ်အတွင်း သွေးထဲမှ T7 phage clones ကို လျင်မြန်စွာ ဖယ်ရှားခြင်းကဲ့သို့သော ရွေးချယ်မှုအဆင့်များပါ၀င်သည် (ပုံ 1d ​​နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ။ 4M)။)ထို့ကြောင့် ပထမအကျော့အပြီးတွင် တူညီသောကနဦးရေကူးကန်ကို တိရစ္ဆာန်တစ်ဦးချင်းစီအတွက် အသုံးပြုခဲ့သော်လည်း CSF တွင် မတူညီသော phage clone များကို တွေ့ရှိခဲ့သည်။စာကြည့်တိုက်အသင်းဝင်အများအပြားပါရှိသော အရင်းအမြစ်စာကြည့်တိုက်များအတွက် တင်းကျပ်သောရွေးချယ်မှုအဆင့်များစွာသည် ကွဲပြားမှုကို သိသာထင်ရှားစွာ လျော့နည်းသွားစေသည်ဟု အကြံပြုပါသည်။ထို့ကြောင့်၊ ကျပန်းဖြစ်ရပ်များသည် ကနဦးရွေးချယ်မှုလုပ်ငန်းစဉ်၏ အဓိကအစိတ်အပိုင်းတစ်ခုဖြစ်လာမည်ဖြစ်ပြီး ရလဒ်ကို များစွာလွှမ်းမိုးနိုင်မည်ဖြစ်သည်။မူရင်းစာကြည့်တိုက်ရှိ clone အများအပြားတွင် အလွန်ဆင်တူသော CSF ကြွယ်ဝမှုဆိုင်ရာ ဉာဉ်ရှိနိုင်ဖွယ်ရှိသည်။သို့သော်၊ တူညီသောစမ်းသပ်မှုအခြေအနေအောက်တွင်ပင်၊ ကနဦးရေကူးကန်ရှိ သီးခြားကိုယ်လုံးတစ်ခုစီ၏ အရေအတွက် အနည်းငယ်ကြောင့် ရွေးချယ်မှုရလဒ်များ ကွဲပြားနိုင်သည်။
CSF တွင်ကြွယ်ဝသော motifs များသည် သွေးထဲတွင်ရှိသော အရာများနှင့် ကွဲပြားသည်။စိတ်ဝင်စားစရာမှာ၊ တိရိစ္ဆာန်တစ်ဦးချင်းစီ၏သွေးတွင် glycine ကြွယ်ဝသော peptides များဆီသို့ ဦးစွာပြောင်းသွားသည်ကို ကျွန်ုပ်တို့သတိပြုမိခဲ့သည်။(ပုံ။ 1g၊ နောက်ဆက်တွဲပုံများ။ 4e၊ 4f)။glycine peptides ပါရှိသော phage သည် ပိုမိုတည်ငြိမ်နိုင်ပြီး သွေးလည်ပတ်မှုမှ ထုတ်ယူရန် အလားအလာနည်းပါသည်။သို့သော်၊ ဤ glycine ကြွယ်ဝသော peptides များကို cerebrospinal fluid နမူနာများတွင် ရှာမတွေ့ခဲ့ဘဲ၊ ခွဲထုတ်ထားသော စာကြည့်တိုက်များသည် မတူညီသော ရွေးချယ်မှုအဆင့်နှစ်ခုကို ဖြတ်သန်းသွားသည်- တစ်ခုမှာ သွေးထဲတွင် တစ်ခုနှင့် နောက်တစ်ခုသည် cerebrospinal fluid တွင် စုပုံလာသည်ဟု အကြံပြုပါသည်။စတုတ္ထအကြိမ်ရွေးချယ်မှုမှ ထွက်ပေါ်လာသော CSF ကြွယ်ဝသောကိုယ်ပွားများကို အကျယ်တဝင့်စမ်းသပ်ပြီးဖြစ်သည်။တစ်ဦးချင်းစမ်းသပ်ထားသော clone အားလုံးနီးပါးသည် blank control phage နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက CSF တွင် ကြွယ်ဝသည်ဟု အတည်ပြုထားသည်။peptide hit တစ်ခု (#2077) ကို ပိုမိုအသေးစိတ်စစ်ဆေးခဲ့သည်။၎င်းသည် အခြား hits များ (ပုံ 3d နှင့် နောက်ဆက်တွဲပုံ 7) နှင့် နှိုင်းယှဉ်ပါက ပိုရှည်သော ပလာစမာတစ်ဝက်သက်တမ်းကို ပြသခဲ့ပြီး စိတ်ဝင်စားစရာကောင်းသည်မှာ ဤ peptide သည် C-terminus တွင် cysteine ​​​​အကြွင်းအကျန်များပါရှိသည်။မကြာသေးမီက ၎င်းကို cysteine ​​​​peptides တွင်ပေါင်းထည့်ခြင်းသည် albumin 29 နှင့် ချိတ်ဆက်ခြင်းဖြင့် ၎င်းတို့၏ pharmacokinetic ဂုဏ်သတ္တိများကို မြှင့်တင်ပေးနိုင်ကြောင်းပြသခဲ့သည်။၎င်းသည် peptide #2077 အတွက် လောလောဆယ် မသိရသေးဘဲ ဆက်လက်လေ့လာရန် လိုအပ်ပါသည်။အချို့သော peptides များသည် CSF ကြွယ်ဝမှုတွင် valence-dependency ကိုပြသခဲ့သည် (ဒေတာမပြပါ) T7 capsid ၏မျက်နှာပြင်ဂျီသြမေတြီနှင့်ဆက်စပ်နေနိုင်သည်။ကျွန်ုပ်တို့အသုံးပြုသော T7 စနစ်သည် phage အမှုန်တစ်ခုလျှင် peptide တစ်ခုစီ၏ 5-15 ကော်ပီကို ပြသခဲ့သည်။IHC သည် ကြွက်များ၏ ဦးနှောက် cortex သို့ သွေးကြောသွင်းထားသော ကိုယ်စားလှယ်လောင်း ခဲ phage clones တွင် လုပ်ဆောင်ခဲ့သည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 8)။အနည်းဆုံး လူသုံးကောင် (အမှတ် 2002၊ နံပါတ် 2009 နှင့် နံပါတ် 2077) တို့သည် BBB နှင့် အပြန်အလှန် သက်ရောက်မှုရှိကြောင်း ဒေတာများက ပြသခဲ့သည်။ဤ BBB အပြန်အလှန်တုံ့ပြန်မှုသည် CSF ၏စုဆောင်းမှုကိုဖြစ်စေသည် သို့မဟုတ် BCSFB သို့ တိုက်ရိုက်ရွေ့လျားမှုဖြစ်စေရန် ဆုံးဖြတ်ရန်ကျန်နေသေးသည်။အရေးကြီးသည်မှာ၊ ရွေးချယ်ထားသော peptides များသည် ပရိုတိန်းကုန်တင်နှင့် ပေါင်းစပ်လိုက်သောအခါတွင် ၎င်းတို့၏ CSF သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးစွမ်းရည်ကို ထိန်းသိမ်းထားကြောင်း ကျွန်ုပ်တို့ပြသပါသည်။N-terminal biotinylated peptides များကို SA နှင့် ပေါင်းစည်းခြင်းသည် အဓိကအားဖြင့် သွေးနှင့် ဦးနှောက်အမြှေးအရည်များတွင် ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာ phage clones များဖြင့် ရရှိသောရလဒ်များကို ထပ်တလဲလဲဖြစ်စေသည် (ပုံ။ 3e)။နောက်ဆုံးတွင်၊ ခဲ peptide #2077 သည် SA သို့ပေါင်းစပ်ထားသော BACE1 ၏ biotinylated peptide inhibitor ၏ ဦးနှောက်လုပ်ဆောင်ချက်ကို မြှင့်တင်နိုင်ပြီး CNS တွင် အသံထွက်သည့် ဆေးဝါးဒိုင်းနမစ်အကျိုးသက်ရောက်မှုများကို CSF တွင် Abeta40 အဆင့်ကို သိသိသာသာလျှော့ချခြင်းဖြင့် CNS (ပုံ 4) ကို မြှင့်တင်နိုင်သည်ကို ကျွန်ုပ်တို့ပြသပါသည်။hits အားလုံး၏ peptide sequence homology ရှာဖွေမှုပြုလုပ်ခြင်းဖြင့် database အတွင်းရှိ မည်သည့် homologues များကိုမဆို ခွဲခြား၍မရပါ။T7 စာကြည့်တိုက်၏ အရွယ်အစားသည် ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် 109 ဖြစ်ပြီး 12-mers အတွက် သီအိုရီအရ စာကြည့်တိုက်အရွယ်အစားမှာ 4 x 1015 ဖြစ်သည်။ ထို့ကြောင့်၊ ကျွန်ုပ်တို့သည် 12-mer peptide စာကြည့်တိုက်၏ မတူကွဲပြားသည့်နေရာ၏ အနည်းငယ်မျှသာကို ရွေးချယ်ထားကာ၊ ဆိုလိုသည်မှာ ပိုမိုကောင်းမွန်သော peptides များကို အကဲဖြတ်ခြင်းဖြင့် ၎င်းတို့ကို ခွဲခြားသတ်မှတ်နိုင်သည်။ဟန်ချက်ညီစွာဖြင့်၊ ဤ peptides များ၏ သဘာဝတူတူများကို ကျွန်ုပ်တို့မတွေ့ရသည့် အကြောင်းရင်းတစ်ခုမှာ ဦးနှောက်ထဲသို့ အချို့သော peptide motifs များ ထိန်းချုပ်မရသော ဝင်ရောက်မှုကို တားဆီးရန် ဆင့်ကဲဖြစ်စဉ်အတွင်း ရွေးချယ်မှုမှ ပယ်ဖျက်ခြင်း ဖြစ်နိုင်သည်။
ကျွန်ုပ်တို့၏ရလဒ်များသည် vivo ရှိ cerebrovascular barrier ၏သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးစနစ်များကိုပိုမိုအသေးစိတ်ဖော်ပြရန်နှင့်ခွဲခြားသတ်မှတ်ရန်အနာဂတ်အလုပ်အတွက်အခြေခံတစ်ခုဖြစ်သည်။ဤနည်းလမ်း၏ အခြေခံဖွဲ့စည်းမှုမှာ ဦးနှောက်သွေးကြောဆိုင်ရာ ပေါင်းစပ်မှုဆိုင်ရာ ဂုဏ်သတ္တိများပါရှိသည့် ကိုယ်ပွားများကို ခွဲခြားသတ်မှတ်ပေးသည့် လုပ်ဆောင်ချက်ဆိုင်ရာ ရွေးချယ်မှုဗျူဟာအပေါ် အခြေခံထားပြီး အောင်မြင်သော clones များသည် vivo ရှိ ဇီဝအတားအဆီးများကို CNS ခန်းထဲသို့ ဖြတ်ကျော်ရန် အရေးကြီးသောအဆင့်တစ်ခုလည်း ပါဝင်သည်။ဤ peptides များ၏သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးယန္တရားကိုရှင်းလင်းရန်နှင့်၎င်းတို့၏ဦးစားပေးဦးနှောက်ဒေသအတွက် microvasculature နှင့်ချိတ်ဆက်မှုအတွက်၎င်းတို့၏လိုလားချက်ကိုရှင်းလင်းရန်ဖြစ်သည်။၎င်းသည် BBB နှင့် receptors များပို့ဆောင်ခြင်းအတွက် လမ်းကြောင်းအသစ်များကို ရှာဖွေတွေ့ရှိရန် ဦးတည်စေနိုင်သည်။ဖော်ထုတ်ထားသော peptides များသည် cerebrovascular receptors များနှင့် BBB သို့မဟုတ် BCSFB မှတဆင့် သယ်ဆောင်သော ပျံ့နှံ့နေသော ligands များနှင့် တိုက်ရိုက်ချိတ်ဆက်နိုင်သည်ဟု ကျွန်ုပ်တို့ မျှော်လင့်ပါသည်။ဤလုပ်ငန်းတွင်တွေ့ရှိခဲ့သော CSF သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးလုပ်ဆောင်မှုပါရှိသော peptide vector များကို ထပ်မံစုံစမ်းစစ်ဆေးပါမည်။ကျွန်ုပ်တို့သည် BBB နှင့်/သို့မဟုတ် BCSFB ကိုဖြတ်ကျော်နိုင်စွမ်းအတွက် ဤ peptides များ၏ ဦးနှောက်ဆိုင်ရာ တိကျမှုကို လောလောဆယ် စုံစမ်းစစ်ဆေးနေပါသည်။အဆိုပါ peptides အသစ်များသည် receptors အသစ်များ သို့မဟုတ် လမ်းကြောင်းများကို ရှာဖွေတွေ့ရှိခြင်းနှင့် ဇီဝဗေဒဆိုင်ရာ macromolecules များဖြစ်သည့် ဦးနှောက်ဆီသို့ macromolecules များပေးပို့ခြင်းအတွက် အလွန်ထိရောက်သော ပလပ်ဖောင်းအသစ်များ ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုအတွက် အလွန်အဖိုးတန်သောကိရိယာများဖြစ်လိမ့်မည်။
ယခင်ဖော်ပြထားသည့်နည်းလမ်းကို ပြုပြင်မွမ်းမံခြင်းဖြင့် ကြီးမားသော cisterna (CM) ကို ရေတွက်ပါ။မေ့ဆေးပေးထားသော Wistar ကြွက်များ (200-350 ဂရမ်) ကို စတီရီယိုအဆိပ်ဖြေကိရိယာတစ်ခုပေါ်တွင် တပ်ဆင်ထားပြီး ဦးခေါင်းခွံကို ခွဲထုတ်ရန် စနစ်တကျပြင်ဆင်ထားသော ဦးရေပြားပေါ်တွင် အလယ်အလတ်ခွဲစိတ်မှုကို ပြုလုပ်ခဲ့သည်။အပေါ်ခါးပန်းဧရိယာတွင် အပေါက်နှစ်ပေါက်ကို တူးပြီး အပေါက်များတွင် ပြုပြင်ထားသောဝက်အူများကို ချိတ်ပါ။Stainless Steel Cannula ၏ stereotactic လမ်းညွှန်ချက်အတွက် CM အတွင်းသို့ တစ်ဖက် occipital crest တွင် နောက်ထပ်အပေါက်တစ်ခုကို တူးဖော်ခဲ့ပါသည်။cannula ပတ်ပတ်လည်တွင် သွားဘက်ဆိုင်ရာဘိလပ်မြေကို လိမ်းပြီး ဝက်အူများဖြင့် လုံခြုံအောင်ထားပါ။ဓာတ်ပုံ-ကုထုံးနှင့် ဘိလပ်မြေ မာကျောပြီးနောက်၊ အရေပြားအနာကို 4/0 supramid ပါးစပ်ဖြင့် ပိတ်ထားသည်။Cannula ၏ မှန်ကန်သောနေရာချထားမှုကို ဦးနှောက်အမြှေးပါးအရည် (CSF) မှ အလိုအလျောက် ယိုစိမ့်မှုဖြင့် အတည်ပြုသည်။ကြွက်ကို stereotaxic ယန္တရားမှ ဖယ်ရှားပါ၊ သင့်လျော်သော ခွဲစိတ်ကုသမှု ခံယူပြီးနောက် နာကျင်မှု စီမံခန့်ခွဲမှုကို ခံယူကာ ဦးနှောက်အရည်တွင် သွေးပါသည့် လက္ခဏာများ မတွေ့မချင်း အနည်းဆုံး တစ်ပတ်ကြာအောင် ပြန်လည်ကောင်းမွန်လာစေရန် ခွင့်ပြုပါ။Wistar ကြွက်များ (Crl:WI/Han) ကို Charles River (ပြင်သစ်) မှရရှိခဲ့သည်။ကြွက်များအားလုံးသည် ရောဂါပိုးမွှားကင်းစင်သော အခြေအနေအောက်တွင် ထားရှိခဲ့သည်။တိရိစ္ဆာန်စမ်းသပ်မှုအားလုံးကို ဆွစ်ဇာလန်နိုင်ငံ၊ Basel မြို့ရှိ ကုသရေးရုံးမှ အတည်ပြုထားပြီး တိရစ္ဆာန်လိုင်စင်အမှတ် 2474 (Cerebrospinal Fluid and Brain of rat of Therapeutic Candidates in the Therapeutic Candidates of Therapeutic Candidates Levels of Therapeutic Candidates in the Cerebrospinal Fluid and Brain of Rats of Therapeutic Candidates) အဆင့်ကို တိုင်းတာခြင်းဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။
CM cannula လက်ထဲတွင် ကြွက်ကို ညင်သာစွာ သတိထားပါ။Cannula မှ Datura ကိုဖယ်ရှားပြီး သူ့အလိုလိုစီးဆင်းနေသော ဦးနှောက်အရည်၏ 10 µl ကို စုဆောင်းပါ။cannula ၏ patency ကို အဆုံးစွန်ထိ လျှော့ချနိုင်ခဲ့သောကြောင့်၊ ဤလေ့လာမှုတွင် သွေးညစ်ညမ်းခြင်း သို့မဟုတ် အရောင်ပြောင်းခြင်း အထောက်အထားမရှိသော ကြည်လင်သော ဦးနှောက်အရည် နမူနာများသာ ပါဝင်ခဲ့ပါသည်။တဆက်တည်းတွင်၊ ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် သွေး ၁၀-၂၀ မီလီလီတာအား အမြီးဖျားရှိ သေးငယ်သော ခွဲစိတ်မှုမှ heparin (Sigma-Aldrich) ပါသော ပြွန်များအဖြစ်သို့ ယူဆောင်သွားပါသည်။T7 phage ကို အကြောထိုးသွင်းပြီးနောက် CSF နှင့် သွေးများကို အချိန်အမျိုးမျိုးတွင် စုဆောင်းခဲ့သည်။CSF နမူနာတစ်ခုစီကို မကောက်ယူမီတွင် ခန့်မှန်းခြေအားဖြင့် အရည်၏ 5-10 μl ကို စွန့်ပစ်ခဲ့ပြီး၊ ၎င်းသည် catheter ၏ သေဆုံးနေသော ထုထည်နှင့် ကိုက်ညီပါသည်။
T7Select စနစ်လက်စွဲတွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း T7Select 10-3b vector ကိုအသုံးပြု၍ စာကြည့်တိုက်များကို ထုတ်ပေးခဲ့သည် (Novagen, Rosenberg et al., Innovations 6, 1-6, 1996)။အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ ကျပန်း 12-mer DNA ထည့်သွင်းမှုကို အောက်ပါပုံစံဖြင့် ပေါင်းစပ်ထားသည်-
NNK codon ကို ထည့်သွင်းမှုတွင် double stop codons နှင့် amino acid overexpression ကိုရှောင်ရှားရန် အသုံးပြုခဲ့သည်။N သည် nucleotide တစ်ခုစီ၏ ကိုယ်တိုင်ရောစပ်ထားသော ညီမျှသောအချိုးဖြစ်ပြီး K သည် adenine နှင့် cytosine nucleotides တို့၏ ကိုယ်တိုင်ရောစပ်ထားသော ညီမျှသောအချိုးဖြစ်သည်။Klenow ကြားခံ (New England Biolabs) တွင် 37°C တွင် dNTP (Novagen) နှင့် Klenow အင်ဇိုင်း (New England Biolabs) တို့ဖြင့် ထပ်ဆင့်ပေါက်ပွားခြင်းဖြင့် သောင်တင်ထားသော DNA နှစ်ခုအဖြစ် ပြောင်းလဲသွားပါသည်။တုံ့ပြန်မှုပြီးနောက်၊ EtOH မိုးရွာသွန်းမှုကြောင့် နှစ်ထပ်သောင်တင်ထားသော DNA ကို ပြန်လည်တွေ့ရှိခဲ့သည်။ရလဒ် DNA ကို ကန့်သတ်အင်ဇိုင်း EcoRI နှင့် HindIII (Roche မှ နှစ်မျိုးလုံး) ဖြင့် ချေဖျက်ခဲ့သည်။ခုတ်ထစ်ပြီး သန့်စင်ထားသော (QIAquick၊ Qiagen) ထည့်သွင်းခြင်း (T4 ligase၊ New England Biolabs) သည် 10B capsid gene ၏ အမိုင်နိုအက်ဆစ် 348 ပြီးနောက် မခွာမီ T7 ကွက်လပ်တစ်ခုအဖြစ် အတွင်းဘောင်ကို ချိတ်ဆက်ထားသည်။ဗီရိုထုပ်ပိုးမှုမပြုလုပ်မီ 18 နာရီကြာတွင် Ligation တုံ့ပြန်မှုကို 16 ဒီဂရီစင်တီဂရိတ်တွင် ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။T7Select 10-3b cloning kit (Novagen) ပါရှိသော ညွှန်ကြားချက်များနှင့်အညီ Phage ထုပ်ပိုးခြင်းကို Escherichia coli (BLT5615, Novagen) ဖြင့် ထုပ်ပိုးမှုဖြေရှင်းချက်အား တစ်ကြိမ် ချဲ့ခဲ့သည်။lysates များကို glycerol ၏စတော့ရှယ်ယာဖြေရှင်းချက်အဖြစ် -80°C တွင် ဗဟိုပြု၍ ကြိတ်ချေပြီး အေးခဲထားသည်။
သီးသန့် 454/Roche-amplicon fusion primers ကို အသုံးပြု၍ ဟင်းရည် သို့မဟုတ် ပန်းကန်တွင် ချဲ့ထားသော phage ပြောင်းလဲနိုင်သော ဒေသများကို တိုက်ရိုက် PCR ချဲ့ခြင်း။ရှေ့သို့ ပေါင်းစည်းထားသော primer တွင် ပြောင်းလဲနိုင်သော ဒေသ (NNK) 12 (ပုံစံ-သီးသန့်)၊ GS FLX တိုက်တန်းနီယမ် အဒပ်တာ A နှင့် လေးခုအခြေခံ စာကြည့်တိုက်သော့အတွဲ (TCAG) (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ 1a) တို့ကို ဘေးတိုက်ထားသော အတွဲများ ပါရှိသည်။
reverse fusion primer တွင် ပုတီးစေ့များဖမ်းယူရန် biotin နှင့် GS FLX Titanium Adapter B တို့ပါ၀င်ပြီး emulsion PCR အတွင်း clonal amplification အတွက် လိုအပ်သည်-
ထို့နောက် 454 GS-FLX တိုက်တေနီယမ်ပရိုတိုကောအရ 454/Roche pyrosequencing တွင် amplicons များကို အသုံးချခဲ့သည်။Manual Sanger sequencing (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) အတွက် T7 phage DNA ကို PCR မှ ချဲ့ထွင်ပြီး အောက်ပါ primer အတွဲများဖြင့် စီထားသည်။
Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (ထုတ်လုပ်သူ၏ညွှန်ကြားချက်အရ) ကိုအသုံးပြု၍ ကမ္ပည်းတစ်ခုချင်းစီမှထည့်သွင်းမှုများကို PCR ချဲ့ထွင်မှုပြုလုပ်ခဲ့သည်။စတင်ပူနွေးလာမှု (95°C တွင် 10 မိနစ်) နှင့် 35 boost cycles (95°C တွင် 50 စက္ကန့်၊ 50°C တွင် 1 မိနစ်၊ နှင့် 72°C တွင် 1 မိနစ်)။
စာကြည့်တိုက်များမှ phage၊ တောရိုင်းအမျိုးအစား phage၊ CSF နှင့် သွေးမှ ကယ်တင်ထားသော phage သို့မဟုတ် တစ်ဦးချင်းကိုယ်ပွားများကို တီဘီဟင်းရည် (Sigma Aldrich) တွင် သို့မဟုတ် 37°C တွင် 4 နာရီကြာ 4 နာရီကြာ အပူချိန် 37°C တွင် ချဲ့ထွင်ထားသည်။ပန်းကန်ပြားများကို Tris-EDTA ကြားခံ (Fluka Analytical) ဖြင့် ဆေးကြောခြင်း သို့မဟုတ် ပိုးမွှားပိုက်ချေးအကြံပြုချက်များဖြင့် ကမ္ဗည်းပြားများကို စုဆောင်းခြင်းဖြင့် ဖာ့ဂ်ျကို ပန်းကန်ပြားများမှ ထုတ်ယူသည်။Phage ကို polyethylene glycol (PEG 8000) မိုးရွာသွန်းမှု (Promega) တစ်ကြိမ်ဖြင့် ယဉ်ကျေးမှု supernatant သို့မဟုတ် ထုတ်ယူမှုကြားခံမှ ခွဲထုတ်ပြီး Tris-EDTA ကြားခံတွင် ပြန်လည်ရပ်ဆိုင်းခဲ့သည်။
ချဲ့ထွင်ထားသော phage အား သွေးကြောသွင်း (IV) ထိုးခြင်း (500 μl/တိရစ္ဆာန်) မတိုင်မီ endotoxin ဖယ်ရှားရေးပုတီးစေ့ (Miltenyi Biotec) ကို အသုံးပြု၍ endotoxin ဖယ်ရှားခြင်းအား 2-3 ကြိမ် ပြုလုပ်ရပါမည်။ပထမအကျော့တွင် 2×1012 phages ကို မိတ်ဆက်ခဲ့သည်။ဒုတိယတွင်၊ 2×1010 phages;တတိယနှင့် စတုတ္ထရွေးချယ်မှုအကျော့တွင် တိရစ္ဆာန်တစ်ကောင်လျှင် 2×109 phages။CSF တွင် Phage ပါဝင်မှုနှင့် ညွှန်ပြသည့်အချိန်အမှတ်များတွင် စုဆောင်းထားသော သွေးနမူနာများကို ထုတ်လုပ်သူ၏ ညွှန်ကြားချက်များအတိုင်း (T7Select စနစ်လက်စွဲ) အရ plaque ရေတွက်ခြင်းဖြင့် ဆုံးဖြတ်ပါသည်။Phage ရွေးချယ်ခြင်းကို အမြီးသွေးပြန်ကြောထဲသို့ သန့်စင်ထားသော စာကြည့်တိုက်များ၏ အကြောထိုးဆေးဖြင့် သို့မဟုတ် ယခင်ရွေးချယ်မှုအဝန်းမှ CSF မှထုတ်နုတ်ထားသော phage ကို ပြန်လည်ထိုးသွင်းခြင်းဖြင့် လုပ်ဆောင်ခဲ့ပြီး နောက်ပိုင်းတွင် ရိတ်သိမ်းမှုများကို 10 မိနစ်၊ 30 မိနစ်၊ 60 မိနစ်၊ 90 မိနစ်၊ 120 မိနစ်၊ 180 မိနစ်၊ နှင့် CSF နှင့် သက်ဆိုင်သော သွေးနမူနာ 240 မိနစ်vivo panning တွင် စုစုပေါင်း လေးကြိမ် ပြုလုပ်ခဲ့ပြီး ရွေးချယ်ထားသော အကိုင်းအခက် နှစ်ခုအား သီးခြား သိမ်းဆည်းကာ ပထမအကြိမ် ရွေးချယ်မှု သုံးကြိမ်အတွင်း ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာခဲ့သည်။ပထမအကြိမ်ရွေးချယ်မှုနှစ်ကျော့မှ CSF မှထုတ်နုတ်ထားသော phage ထည့်သွင်းမှုများအားလုံးကို 454/Roche pyrosequencing တွင် ထားရှိခဲ့ပြီး နောက်ဆုံးအကြိမ်ရွေးချယ်မှုနှစ်ကျော့မှ CSF မှထုတ်ယူသော clone အားလုံးကို ကိုယ်တိုင် စီတန်းထားပါသည်။ပထမအကြိမ်ရွေးချယ်မှုမှ သွေးပေါင်အားလုံးကိုလည်း 454/Roche pyrosequencing တွင် ထားရှိခဲ့သည်။phage clones ထိုးခြင်းအတွက်၊ ရွေးချယ်ထားသော phage များကို 37°C တွင် 500 cm2 ပြားများပေါ်တွင် 500 cm2 တွင် 4 နာရီကြာ ချဲ့ထားသည်။တစ်ဦးချင်းရွေးချယ်ပြီး ကိုယ်တိုင်ကိုယ်ကျ စီထားသော ကိုယ်ပွားများကို တီဘီအလတ်စားတွင် ဖြန့်ကြက်ထားသည်။phage ထုတ်ယူပြီးနောက်၊ သန့်စင်ခြင်းနှင့် endotoxin ၏ဖယ်ရှားခြင်း (အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း) 300 μlရှိ 2 × 1010 phages / တိရိစ္ဆာန် / အမြီးသွေးပြန်ကြောတစ်ခုထဲသို့အကြောထိုးသွင်းခဲ့သည်။
အစီအစဥ်ဒေတာကို ကြိုတင်လုပ်ဆောင်ခြင်းနှင့် အရည်အသွေးစစ်ထုတ်ခြင်း။Raw 454/Roche ဒေတာကို ရောင်းချသူဆော့ဖ်ဝဲကို အသုံးပြု၍ ဒွိစံစမ်းချောင်းဖော်မတ် (sff) မှ Pearson လူသားဖတ်နိုင်သောဖော်မတ် (fasta) သို့ ပြောင်းလဲခဲ့သည်။အောက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း သီးသန့် C ပရိုဂရမ်များနှင့် script များ (မထုတ်ဝေရသေးသောဆော့ဖ်ဝဲလ်ပက်ကေ့ဂျ်) ကို အသုံးပြု၍ nucleotide အစီအစဉ်၏ နောက်ထပ်လုပ်ဆောင်မှုကို လုပ်ဆောင်ခဲ့ပါသည်။ပင်မဒေတာခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုတွင် တင်းကျပ်သော အဆင့်ပေါင်းစုံ စစ်ထုတ်ခြင်းလုပ်ငန်းစဉ်များ ပါဝင်သည်။တရားဝင် 12mer ထည့်သွင်းထားသော DNA အတွဲမပါဝင်သော ဖတ်ရှုမှုများကို စစ်ထုတ်ရန်၊ ဖတ်ရှုမှုများကို အညွှန်း (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT)၊ ရပ်ထားသော အညွှန်း (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) နှင့် နောက်ခံထည့်သွင်းခြင်း (CCCTGCAGGATATCCCGGGAGAGCTCGTCGAC) ကို အသုံးပြု၍ ကမ္ဘာလုံးဆိုင်ရာ Nee ကို အသုံးပြုထားသည်။alignment သည် alignment တစ်ခုလျှင် ကွဲလွဲမှု 2 ခုအထိ ခွင့်ပြုသော ချိန်ညှိမှု ၃၁။ထို့ကြောင့်၊ နောက်ခံထည့်သွင်းမှုများပါ ၀ င်သောတဂ်များနှင့်ဖတ်ခြင်းကိုစတင်ခြင်းနှင့်ရပ်တန့်ခြင်းမရှိဘဲဖတ်သည်ဆိုလိုသည်မှာခွင့်ပြုထားသောမတူညီသောအရေအတွက်ထက်ကျော်လွန်သောချိန်ညှိမှုများကိုစာကြည့်တိုက်မှဖယ်ရှားခဲ့သည်။ကျန်စာဖတ်မှုများအတွက်၊ မူလအမှတ်အသားမှ ချဲ့ထွင်ထားသော N-mer DNA အစီအစဥ်သည် ရပ်တန့်အမှတ်အသားကို မူရင်းဖတ်ရှုသည့်အစီအစဥ်မှ ဖယ်ထုတ်ပြီး ဆက်လက်လုပ်ဆောင်ခြင်းမပြုမီ (ယခုနောက်ပိုင်းတွင် “ထည့်သွင်းရန်” ဟုရည်ညွှန်းသည်)။ထည့်သွင်းမှုကို ဘာသာပြန်ပြီးနောက်၊ primer ၏ 5′ အဆုံးရှိ ပထမ stop codon ပြီးနောက် အပိုင်းကို ထည့်သွင်းမှုမှ ဖယ်ရှားသည်။ထို့အပြင် primer ၏ 3′ အဆုံးတွင် မပြည့်စုံသော codons များဆီသို့ ဦးတည်စေသော nucleotides များကိုလည်း ဖယ်ရှားခဲ့သည်။နောက်ခံအစီအစဥ်များသာပါရှိသော ထည့်သွင်းမှုများကို ဖယ်ထုတ်ရန်၊ အမိုင်နိုအက်ဆစ်ပုံစံ “PAG” နှင့်အစရှိသည့် ဘာသာပြန်ထည့်သွင်းမှုများကိုလည်း ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ဘာသာပြန်ပြီးနောက် အမိုင်နိုအက်ဆစ် 3 ထက်နည်းသော peptide များကို စာကြည့်တိုက်မှ ဖယ်ရှားခဲ့သည်။နောက်ဆုံးတွင်၊ ထည့်သွင်းရေကူးကန်တွင် ထပ်နေသောဖြစ်မှုကို ဖယ်ရှားပြီး သီးသန့်ထည့်သွင်းမှုတစ်ခုစီ၏ ကြိမ်နှုန်းကို ဆုံးဖြတ်ပါ။ဤခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၏ရလဒ်များတွင် nucleotide ဆင့်ကဲများ (ထည့်သွင်းမှုများ) နှင့် ၎င်းတို့၏ (ဖတ်ရန်) ကြိမ်နှုန်းများ (နောက်ဆက်တွဲပုံများ 1c နှင့် 2) စာရင်းများပါ၀င်သည်။
အုပ်စု N-mer DNA ထည့်သွင်းမှုများကို မျဥ်းဆင်တူခြင်းဖြင့် ဖယ်ရှားရန်- 454/Roche-specific sequencing errors (homopolymer extensions များကို စီစစ်ခြင်းဆိုင်ရာ ပြဿနာများကဲ့သို့) နှင့် အရေးမကြီးသော ထပ်နေမှုများကို ဖယ်ရှားရန်၊ ယခင်က စစ်ထုတ်ထားသော N-mer DNA အတွဲလိုက်ထည့်သွင်းမှုများ (ထည့်သွင်းမှုများ) ကို ဆင်တူယိုးမှားဖြင့် စီထားသည်။အောက်ဖော်ပြပါအတိုင်း သတ်မှတ်ထားသော ထပ်ကာထပ်ကာ အယ်လဂိုရီသမ်ကို အသုံးပြု၍ ထည့်သွင်းမှုများ (ကိုက်ညီမှုမရှိသော အခြေ 2 ခုအထိ ခွင့်ပြုထားသည်)- ထည့်သွင်းမှုများကို ၎င်းတို့၏ ကြိမ်နှုန်း (အမြင့်ဆုံးမှ အနိမ့်ဆုံး) ဖြင့် ပထမအကြိမ်စီခွဲပြီး ၎င်းတို့သည် တူညီပါက၊ ၎င်းတို့၏ ဒုတိယအမျိုးအစားအလိုက် အလျား (အရှည်ဆုံးမှ အတိုဆုံး))။ထို့ကြောင့်၊ မကြာခဏနှင့် အကြာဆုံးထည့်သွင်းမှုများသည် ပထမ “အုပ်စု” ကို သတ်မှတ်သည်။အုပ်စုကြိမ်နှုန်းကို သော့ကြိမ်နှုန်းအဖြစ် သတ်မှတ်ထားသည်။ထို့နောက်၊ စီထားသောစာရင်းတွင်ကျန်ရှိသောထည့်သွင်းမှုတစ်ခုစီကို pairwise Needleman-Wunsch alignment ဖြင့်အုပ်စုသို့ထည့်ရန်ကြိုးစားခဲ့သည်။ချိန်ညှိမှုတစ်ခုတွင် မကိုက်ညီခြင်း၊ ထည့်သွင်းခြင်း သို့မဟုတ် ဖျက်ခြင်းအရေအတွက်သည် 2 ၏ အတိုင်းအတာတစ်ခုထက် မကျော်လွန်ပါက၊ ထည့်သွင်းမှုတစ်ခုသည် အုပ်စုသို့ ပေါင်းထည့်မည်ဖြစ်ပြီး၊ ထည့်သွင်းမှုအကြိမ်အရေအတွက်ကို မည်မျှကြာကြာထည့်သွင်းထားသည်ဖြင့် အုပ်စုတစ်ခုလုံးကို တိုးစေသည်။အဖွဲ့တစ်ခုသို့ ထည့်လိုက်သော ထည့်သွင်းမှုများကို အသုံးပြုသည်ဟု အမှတ်အသားပြုထားပြီး နောက်ထပ်လုပ်ဆောင်ခြင်းမှ ဖယ်ထုတ်ထားသည်။ထည့်သွင်းသည့် အတွဲကို ယခင်ရှိပြီးသားအဖွဲ့တစ်ခုသို့ မထည့်နိုင်ပါက၊ သင့်လျော်သော ထည့်သွင်းကြိမ်နှုန်းဖြင့် အုပ်စုအသစ်တစ်ခုကို ဖန်တီးရန်အတွက် ထည့်သွင်းသည့် အတွဲကို အသုံးပြုပြီး အသုံးပြုသည်ဟု မှတ်သားထားသည်။ထည့်သွင်းမှုအစီအစဥ်တစ်ခုစီကို အဖွဲ့အသစ်ဖွဲ့ရန် သို့မဟုတ် ရှိပြီးသားအဖွဲ့တွင် ထည့်သွင်းနိုင်သည့်အခါ ထပ်ခါထပ်ခါပြုလုပ်ခြင်း ပြီးဆုံးသည်။နောက်ဆုံးတွင်၊ nucleotides များပါ၀င်သော အုပ်စုလိုက်ထည့်သွင်းမှုများကို peptide sequences (peptide libraries) အဖြစ်သို့ ဘာသာပြန်ပါသည်။ဤခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှု၏ရလဒ်သည် ဆက်တိုက်ဖတ်သည့်အကြိမ်အရေအတွက်ကို ထည့်သွင်းထားသည့် ထည့်သွင်းမှုအစုအဝေးတစ်ခုနှင့် ၎င်းတို့၏သက်ဆိုင်ရာ ကြိမ်နှုန်းများဖြစ်သည် (နောက်ဆက်တွဲ ပုံ။ 2)။
Motif Generation- ထူးခြားသော peptides စာရင်းကို အခြေခံ၍ အောက်တွင်ပြထားသည့်အတိုင်း ဖြစ်နိုင်သော အမိုင်နိုအက်ဆစ်ပုံစံများ (aa) အားလုံးပါဝင်သော စာကြည့်တိုက်တစ်ခုကို ဖန်တီးထားပါသည်။ဖြစ်နိုင်ချေရှိသော အရှည်ပုံစံ 3 တစ်ခုစီကို peptide မှ ထုတ်နုတ်ပြီး ပုံစံများ (tripeptides) အားလုံးပါဝင်သော ဘုံပုံစံ စာကြည့်တိုက်တစ်ခုနှင့်အတူ ၎င်း၏ ပြောင်းပြန်ပုံစံကို ပေါင်းထည့်ထားသည်။ထပ်တလဲလဲဖြစ်စေသော ပန်းချီကားချပ်များကို စီတန်းပြီး ထပ်နေသောအထပ်များကို ဖယ်ရှားခဲ့သည်။ထို့နောက် motif စာကြည့်တိုက်ရှိ tripeptide တစ်ခုစီအတွက်၊ တွက်ချက်မှုဆိုင်ရာကိရိယာများကို အသုံးပြု၍ စာကြည့်တိုက်တွင် ၎င်း၏တည်ရှိမှုကို စစ်ဆေးခဲ့သည်။ဤကိစ္စတွင်၊ တွေ့ရှိထားသော motif tripeptide ပါရှိသော peptide ၏ကြိမ်နှုန်းကို ပေါင်းထည့်ပြီး motif စာကြည့်တိုက်ရှိ motif ("motifs အရေအတွက်") သို့ သတ်မှတ်ပေးပါသည်။motif မျိုးဆက်၏ ရလဒ်မှာ tripeptides (motifs) နှင့် ၎င်းတို့၏ သက်ဆိုင်ရာတန်ဖိုးများ ပါဝင်သော နှစ်ဖက်မြင် အခင်းအကျင်းတစ်ခုဖြစ်ပြီး ၎င်းသည် ဖတ်ရှုမှုများကို စီစစ်ကာ၊ အုပ်စုဖွဲ့ကာ ဘာသာပြန်သည့်အခါ သက်ဆိုင်သော motif ကို ဖြစ်ပေါ်စေသည့် စီစစ်ဖတ်ခြင်းအရေအတွက်ဖြစ်သည်။အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း မက်ထရစ်များ။
motifs အရေအတွက်နှင့် သက်ဆိုင်ရာ scatterplots များကို ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ခြင်း- နမူနာတစ်ခုစီအတွက် motifs အရေအတွက်ကို ပုံမှန်အသုံးပြုပြီး ပုံမှန်ဖြစ်အောင် ပြုလုပ်ထားပါသည်။
ni သည် အကြောင်းအရာ i ပါ၀င်သော ဖတ်ရှုမှု အရေအတွက်ဖြစ်သည်။ထို့ကြောင့် vi သည် နမူနာတွင် motif i ပါရှိသော reads (သို့မဟုတ် peptides) ရာခိုင်နှုန်းကို ကိုယ်စားပြုသည်။Fisher ၏တိကျသောစမ်းသပ်မှုကို အသုံးပြု၍ ပုံမှန်မဟုတ်သော motif အရေအတွက်အတွက် P-တန်ဖိုးများကို တွက်ချက်ခဲ့သည်။စေ့ဆော်မှုအရေအတွက်၏ correlograms နှင့် ပတ်သက်၍၊ Spearman ၏ဆက်စပ်မှုများကို R ဖြင့် ပုံမှန် motives အရေအတွက်ကို အသုံးပြု၍ တွက်ချက်ခဲ့သည်။
peptide စာကြည့်တိုက်ရှိ နေရာတစ်ခုစီရှိ အမိုင်နိုအက်ဆစ်များ၏ ပါဝင်မှုကို မြင်သာစေရန်၊ ဝဘ်လိုဂိုဂရမ် 32၊ 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ကို ဖန်တီးခဲ့သည်။ပထမဦးစွာ၊ 12-mer peptide ၏အနေအထားတစ်ခုစီတွင်အမိုင်နိုအက်ဆစ်များ၏ပါဝင်မှုကို 20 × 12 matrix တွင်သိမ်းဆည်းထားသည်။ထို့နောက်၊ နေရာတစ်ခုစီတွင် တူညီသော ဆွေမျိုးအမိုင်နိုအက်ဆစ်ပါဝင်မှုပါရှိသော 1000 peptides အစုတစ်စုကို fasta-sequence ဖော်မတ်ဖြင့် ထုတ်ပေးပြီး ဝဘ်-လိုဂို 3 သို့ ထည့်သွင်းမှုအဖြစ် ပံ့ပိုးပေးကာ နေရာတစ်ခုစီရှိ ဆွေမျိုးအမိုင်နိုအက်ဆစ်ပါဝင်မှုကို ဂရပ်ဖစ်ကိုယ်စားပြုမှုကို ထုတ်ပေးသည်။ပေးထားသော peptide စာကြည့်တိုက်အတွက်။ဘက်ပေါင်းစုံမှ ဒေတာအတွဲများကို မြင်သာစေရန်၊ R (biosHeatmap၊ မထုတ်ရသေးသော R package) တွင် အတွင်းပိုင်းတီထွင်ထားသည့် တူးလ်တစ်ခုကို အသုံးပြု၍ အပူမြေပုံများကို ဖန်တီးထားသည်။အပူမြေပုံများတွင် ဖော်ပြထားသော dendrography များကို Ward ၏ အထက်အောက် အစုလိုက်အပြုံလိုက်နည်းလမ်းဖြင့် Euclidean အကွာအဝေးမက်ထရစ်ဖြင့် တွက်ချက်ထားပါသည်။motif အမှတ်ပေးဒေတာ၏ ကိန်းဂဏန်းအချက်အလက်များကို ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာရန်အတွက်၊ ပုံမှန်မဟုတ်သော အမှတ်ပေးမှုအတွက် P တန်ဖိုးများကို Fisher ၏ တိကျသောစမ်းသပ်မှုဖြင့် တွက်ချက်ခဲ့သည်။ကျောင်းသား၏ t-test သို့မဟုတ် ANOVA ကို အသုံးပြု၍ အခြားဒေတာအတွဲများအတွက် P-တန်ဖိုးများကို R တွင် တွက်ချက်ခဲ့သည်။
ထည့်သွင်းခြင်းမရှိဘဲ ရွေးချယ်ထားသော phage clones နှင့် phages များကို အမြီးသွေးပြန်ကြောမှတစ်ဆင့် သွေးကြောသွင်းခြင်း (300 μl PBS တွင် 2×1010 phages/တိရိစ္ဆာန်/တိရိစ္ဆာန်များ 300 μl PBS)။ပေါင်းထည့်ခြင်းနှင့် နောက်ဆက်တွဲပြုပြင်ခြင်းမပြုမီ ဆယ်မိနစ်အလိုတွင် တူညီသောတိရစ္ဆာန်များကို DyLight594-တံဆိပ်တပ်ထားသော lectin 100 μl (Vector Laboratories Inc., DL-1177) ဖြင့် သွေးကြောသွင်းခဲ့သည်။phage ထိုးပြီးနောက် မိနစ် 60 အကြာတွင် 50 ml PBS နှင့် 50 ml 4% PFA/PBS ဖြင့် ကြွက်များကို နှလုံးအတွင်းသို့ ပျံ့နှံ့သွားသည်။ဦးနှောက်နမူနာများကို 4% PFA/PBS တွင် တစ်ညလုံး ပြုပြင်ပြီး 30% sucrose တွင် တစ်ညလုံး 4°C တွင် စိမ်ထားသည်။နမူနာများကို OCT အရောအနှောတွင် ဖလက်ရှ်အေးခဲထားသည်။1% BSA ဖြင့် ပိတ်ဆို့ထားသော 30 µm cryosections တွင် အေးခဲနမူနာများ၏ ကိုယ်ခံစွမ်းအား ဓာတုဗေဒဆိုင်ရာ ခွဲခြမ်းစိတ်ဖြာမှုကို အပူချိန် 4°C တွင် 4°C တွင် ဖောက်ထွင်းထားသည့် polyclonal FITC-တံဆိပ်တပ်ထားသော ပဋိပစ္စည်းဖြင့် ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။ညတွင်းချင်း သားဖောက်ပါ။နောက်ဆုံးတွင်၊ အပိုင်းများကို PBS ဖြင့် ၃ ကြိမ်ဆေးကြောပြီး confocal laser microscope (Leica TCS SP5) ဖြင့် စစ်ဆေးခဲ့သည်။
အနိမ့်ဆုံး 98% ရှိသော သန့်စင်မှုရှိသော peptides အားလုံးကို GenScript USA မှ ပေါင်းစပ်၍ ဇီဝရုပ်ထုနှင့် lyophilized ပြုလုပ်ထားသည်။Biotin ကို N-terminus ရှိ နောက်ထပ် triple glycine spacer မှတဆင့် ချည်နှောင်ထားသည်။အစုလိုက်အပြုံလိုက် spectrometry သုံးပြီး peptides အားလုံးကို စစ်ဆေးပါ။
Streptavidin (Sigma S0677) ကို biotinylated peptide၊ biotinylated BACE1 inhibitory peptide သို့မဟုတ် biotinylated BACE1 inhibitory peptide (3:1 ratio) နှင့် BACE1 inhibitory peptide ၏ 5-10% Peptide နှင့် BACE1 inhibitory peptide တို့ကို ပေါင်းစပ်ထားသည်။ဆေးမထိုးခင် အခန်းအပူချိန်မှာ 1 နာရီထားပါ။Streptavidin-conjugated peptides ကို ဦးနှောက်အခေါင်းပေါက်ရှိသော ကြွက်များ၏ အမြီးသွေးပြန်ကြောများထဲမှ တစ်ခုသို့ 10 mg/kg ပမာဏဖြင့် အကြောထဲ ထိုးသွင်းခဲ့သည်။
streptavidin-peptide complexes များ၏အာရုံစူးစိုက်မှုကို ELISA မှအကဲဖြတ်ခဲ့သည်။Nunc Maxisorp မိုက်ခရိုတီတာပြားများ (Sigma) ကို 1.5 μg/ml mouse ဆန့်ကျင်ဘက်စထရက်ဗီဒင် ပဋိပစ္စည်း (Thermo, MA1-20011) ဖြင့် 4°C တွင် တစ်ညလုံး ဖုံးအုပ်ထားသည်။ပိတ်ဆို့ပြီးနောက် (ပိတ်ဆို့ခြင်းကြားခံ- 140 nM NaCL၊ 5 mM EDTA၊ 0.05% NP40၊ 0.25% gelatin၊ 1% BSA) အခန်းအပူချိန်တွင် 2 နာရီကြာအောင်၊ ပန်းကန်ပြားကို 0.05% Tween-20/PBS (ဆေးကြောသည့်ကြားခံ) ကို 3 Seconds plalute နှင့် Csf တွင်ထည့်၍ plate ကောင်းကောင်းထဲသို့ထည့်သည်၊ sma 1:10,000၊ CSF 1:115)။ထို့နောက် ပန်းကန်ပြားကို 4°C တွင် ထောက်လှမ်းနိုင်သော ပဋိပစ္စည်း (1 μg/ml၊ anti-streptavidin-HRP၊ Novus NB120-7239) ဖြင့် တစ်ညလုံး ပေါက်ဖွားခဲ့သည်။ရေချိုးခြင်း အဆင့်သုံးဆင့်ပြီးနောက်၊ streptavidin ကို TMB ဆပ်ပြာရည် (Roche) တွင် မိနစ် 20 အထိ ပေါက်ဖွားခြင်းဖြင့် တွေ့ရှိခဲ့သည်။1M H2SO4 ဖြင့် အရောင်ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကို ရပ်ပြီးနောက်၊ စုပ်ယူမှုကို 450 nm တွင် တိုင်းတာပါ။
ထုတ်လုပ်သူ၏ပရိုတိုကော (Wako, 294-64701) အရ Aβ(1-40) ELISA မှ streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor complex ၏လုပ်ဆောင်ချက်ကို အကဲဖြတ်ခဲ့သည်။အတိုချုပ်အားဖြင့်၊ CSF နမူနာများကို စံအညစ်အကြေး (1:23) ဖြင့် ရောစပ်ပြီး BNT77 ဖမ်းယူနိုင်သော ပဋိပစ္စည်းဖြင့် ဖုံးအုပ်ထားသော ရေတွင်း 96 ခုတွင် 4°C တွင် ညတွင်းချင်း ပေါက်ဖွားစေပါသည်။ရေချိုးခြင်းငါးဆင့်ပြီးနောက်၊ HRP-ပေါင်းစပ်ထားသော BA27 ပဋိပစ္စည်းကို ထည့်ပြီး 4°C တွင် 2 နာရီကြာ ပေါက်ဖွားပြီး ရေဆေးခြင်းအဆင့်ငါးဆင့်ဖြင့် ပြီးနောက်။Aβ(1–40) ကို အခန်းအပူချိန်တွင် မိနစ် 30 ကြာ TMB ဖြေရှင်းချက်တွင် ပေါက်ဖွားခြင်းဖြင့် တွေ့ရှိခဲ့သည်။ရပ်တန့်ဖြေရှင်းချက်ဖြင့် အရောင်ဖွံ့ဖြိုးတိုးတက်မှုကို ရပ်တန့်ပြီးနောက် စုပ်ယူမှုကို 450 nm တွင် တိုင်းတာပါ။ပလာစမာနမူနာများကို Aβ(1-40) ELISA မတိုင်မီ အစိုင်အခဲအဆင့် ထုတ်ယူမှုကို ခံခဲ့ရသည်။ပလာစမာကို 0.2% DEA (Sigma) တွင်း 96-တွင်းပြားများတွင် ပေါင်းထည့်ကာ အခန်းအပူချိန်တွင် မိနစ် 30 ကြာ ပျိုးထားသည်။SPE ပြားများ (Oasis၊ 186000679) ကို ရေနှင့် 100% methanol ဖြင့် ဆက်တိုက်ဆေးကြောပြီးနောက်၊ ပလာစမာနမူနာများကို SPE ပြားများထဲသို့ ထည့်သွင်းပြီး အရည်အားလုံးကို ဖယ်ရှားခဲ့သည်။နမူနာများကို ဆေးကြောခြင်း (ပထမ 5% မီသနော နှင့် 30% မီသနော) နှင့် 2% NH4OH / 90% မီသနောဖြင့် ဖယ်ထုတ်ခဲ့သည်။အဆက်မပြတ် N2 လက်ရှိတွင် 55°C တွင် 99 မိနစ်ကြာ အခြောက်ခံပြီးနောက်၊ နမူနာများကို စံဒြပ်စင်များတွင် လျှော့ချပြီး အထက်တွင်ဖော်ပြထားသည့်အတိုင်း Aβ(1-40) ကို တိုင်းတာခဲ့သည်။
ဤဆောင်းပါးကို ကိုးကားနည်း- Urich, E. et al.vivo တွင်သတ်မှတ်ထားသော transit peptides ကို အသုံးပြု၍ ဦးနှောက်သို့ ကုန်စည်ပို့ဆောင်ခြင်း။သိပ္ပံပညာ။5, 14104;doi:10.1038/srep14104 (2015)။
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB နှင့် Moos T. ပစ်မှတ်ထားသောကုထုံးကိုအသုံးပြု၍ ဦးနှောက်သို့ macromolecular ဆေးဝါးများ ပေးပို့ခြင်း။အာရုံကြောဓာတုဗေဒဂျာနယ် 113၊ 1–13၊ 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)။
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., နှင့် Martinez-Martinez, P. သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးကိုဖြတ်၍ peptide နှင့် ပရိုတင်းဆေးဝါးများ ပေးပို့ခြင်း။Prog Neurobiol 87၊ 212–251၊ 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)။
Pardridge, WM သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီး- ဦးနှောက်ဆေးဖွံ့ဖြိုးမှုအတွက် ပိတ်ဆို့မှုတစ်ခု။NeuroRx 2၊ 3–14၊ 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)။
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, နှင့် Byrd, A. choroid plexus-CSF လမ်းကြောင်းမှတစ်ဆင့် ဦးနှောက်သို့ ပိုမိုကောင်းမွန်သော ဆေးဝါးများပေးပို့ခြင်းနှင့် ပစ်မှတ်ထားခြင်းအတွက် အလားအလာများ။ဆေးဝါးသုတေသန 22၊ 1011–1037၊ 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)။
Pardridge၊ WM သည် ဦးနှောက်ပေးပို့မှုအတွက် မော်လီကျူးထရိုဂျန်မြင်းများဖြင့် ဇီဝဆေးဝါးများကို ခေတ်မီအောင်ပြုလုပ်ခြင်း။Bioconjug Chem 19၊ 1327–1338၊ 10.1021/bc800148t (2008)။
Pardridge၊ WM receptor-mediated peptide သည် သွေး-ဦးနှောက်အတားအဆီးကိုဖြတ်၍ ပို့ဆောင်သည်။Endocr Rev. 7၊ 314–330 (1986)။
Niewoehner, J. et al.monovalent မော်လီကျူး လွန်းပျံယာဉ်များကို အသုံးပြု၍ ကုသမှုဆိုင်ရာ ပဋိပစ္စည်းများ၏ ထိရောက်မှု နှင့် ဦးနှောက်အတွင်း ထိုးဖောက်ဝင်ရောက်မှုကို တိုးမြှင့်ပါ။နျူရွန် 81၊ 49–60၊ 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)။
Bien-Lee, N. et al.Transferrin receptor (TfR) သယ်ယူပို့ဆောင်ရေးသည် TfR ပဋိပစ္စည်းများ၏ ရင်းနှီးမှုမျိုးကွဲများကို ဦးနှောက်မှ စုပ်ယူမှုကို ဆုံးဖြတ်ပေးသည်။J Exp Med 211၊ 233–244၊ 10.1084/jem.20131660 (2014)။