ขอบคุณที่เข้าชม Nature.com คุณกำลังใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันที่มีการรองรับ CSS จำกัด เพื่อประสบการณ์การใช้งานที่ดีที่สุด เราขอแนะนำให้คุณใช้เบราว์เซอร์เวอร์ชันล่าสุด (หรือปิดโหมดความเข้ากันได้ใน Internet Explorer) นอกจากนี้ เพื่อให้มั่นใจได้ว่าเว็บไซต์จะได้รับการสนับสนุนอย่างต่อเนื่อง เราจึงแสดงเว็บไซต์โดยไม่มีสไตล์และ JavaScript
แสดงภาพสไลด์สามภาพพร้อมกัน ใช้ปุ่ม "ก่อนหน้า" และ "ถัดไป" เพื่อเลื่อนดูสไลด์ทีละสามภาพ หรือใช้ปุ่มเลื่อนที่ด้านท้ายเพื่อเลื่อนดูสไลด์ทีละสามภาพ
อุปสรรคเลือด-สมองและกำแพงเลือด-สมองขัดขวางไม่ให้สารชีวบำบัดเข้าถึงเป้าหมายในระบบประสาทส่วนกลาง ซึ่งส่งผลให้การรักษาโรคทางระบบประสาทไม่ประสบผลสำเร็จ เพื่อค้นหาตัวขนส่งสารเข้าสู่สมองชนิดใหม่ในร่างกาย เราได้ใช้ไลบรารีเปปไทด์ของฟาจ T7 และเก็บตัวอย่างเลือดและน้ำไขสันหลัง (CSF) อย่างต่อเนื่องโดยใช้หนูทดลองแบบมีท่อใส่สายสวนขนาดใหญ่ โคลนฟาจจำเพาะถูกทำให้เข้มข้นขึ้นในน้ำไขสันหลังหลังจากการคัดเลือกสี่รอบ การทดสอบเปปไทด์ที่คัดเลือกแต่ละตัวเผยให้เห็นว่ามีการเพิ่มขึ้นมากกว่า 1000 เท่าในน้ำไขสันหลัง ฤทธิ์ทางชีวภาพของการนำส่งสารไปยังสมองโดยใช้เปปไทด์ได้รับการยืนยันโดยการลดระดับของอะไมลอยด์-เบตาในน้ำไขสันหลังลง 40% โดยใช้สารยับยั้งเปปไทด์ BACE1 ที่เชื่อมโยงกับเปปไทด์นำส่งชนิดใหม่ที่ระบุได้ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่าเปปไทด์ที่ระบุได้โดยวิธีการคัดเลือกฟาจในร่างกายอาจเป็นพาหะที่มีประโยชน์สำหรับการนำส่งโมเลกุลขนาดใหญ่ไปยังสมองอย่างเป็นระบบโดยมีผลในการรักษา
การวิจัยเกี่ยวกับการบำบัดที่มุ่งเป้าไปที่ระบบประสาทส่วนกลาง (CNS) ส่วนใหญ่เน้นไปที่การระบุยาและสารที่มีคุณสมบัติในการกำหนดเป้าหมาย CNS อย่างเหมาะสม โดยมีความพยายามน้อยลงในการค้นหากลไกที่ขับเคลื่อนการส่งยาอย่างมีประสิทธิภาพไปยังสมอง อย่างไรก็ตาม สถานการณ์กำลังเริ่มเปลี่ยนแปลงไป เนื่องจากระบบการส่งยา โดยเฉพาะยาโมเลกุลขนาดใหญ่ เป็นส่วนสำคัญของการพัฒนายาทางประสาทวิทยาศาสตร์สมัยใหม่ สภาพแวดล้อมของระบบประสาทส่วนกลางได้รับการปกป้องอย่างดีโดยระบบกั้นหลอดเลือดสมอง ซึ่งประกอบด้วยอุปสรรคเลือด-สมอง (BBB) ​​และอุปสรรคเลือด-สมอง (BCBB)1 ทำให้การส่งยาไปยังสมองเป็นเรื่องท้าทาย1,2 มีการประมาณการว่ายาโมเลกุลขนาดใหญ่เกือบทั้งหมดและยาโมเลกุลขนาดเล็กมากกว่า 98% ถูกกำจัดออกจากสมอง3 ด้วยเหตุนี้ การระบุระบบการขนส่งในสมองใหม่ ๆ ที่ให้การส่งยาบำบัดไปยัง CNS อย่างมีประสิทธิภาพและเฉพาะเจาะจงจึงมีความสำคัญอย่างยิ่ง4,5 อย่างไรก็ตาม BBB และ BCBB ยังเป็นโอกาสที่ดีเยี่ยมสำหรับการส่งยา เนื่องจากสามารถแทรกซึมและเข้าสู่โครงสร้างทั้งหมดของสมองผ่านทางหลอดเลือดที่กว้างขวาง ดังนั้น ความพยายามในปัจจุบันในการใช้วิธีการส่งยาเข้าสู่สมองแบบไม่รุกรานส่วนใหญ่จึงอาศัยกลไกการขนส่งผ่านตัวรับ (PMT) โดยใช้ตัวรับ BBB6 ภายในร่างกาย แม้ว่าจะมีความก้าวหน้าสำคัญเมื่อเร็ว ๆ นี้โดยใช้เส้นทางตัวรับทรานสเฟอร์ริน7,8 แต่ก็ยังจำเป็นต้องมีการพัฒนาเพิ่มเติมของระบบการส่งยาใหม่ที่มีคุณสมบัติที่ดีขึ้น เพื่อจุดประสงค์นี้ เป้าหมายของเราคือการระบุเปปไทด์ที่สามารถเป็นตัวกลางในการขนส่ง CSF เนื่องจากในทางทฤษฎีแล้วสามารถนำมาใช้ในการส่งโมเลกุลขนาดใหญ่ไปยังระบบประสาทส่วนกลางหรือเพื่อเปิดเส้นทางตัวรับใหม่ได้ โดยเฉพาะอย่างยิ่ง ตัวรับและตัวขนส่งเฉพาะของระบบหลอดเลือดสมอง (BBB และ BSCFB) สามารถทำหน้าที่เป็นเป้าหมายที่มีศักยภาพสำหรับการส่งยาชีวบำบัดอย่างมีประสิทธิภาพและเฉพาะเจาะจง น้ำไขสันหลัง (CSF) เป็นผลิตภัณฑ์ที่หลั่งออกมาจากเยื่อหุ้มสมองชั้นใน (CS) และสัมผัสโดยตรงกับของเหลวระหว่างเซลล์ของสมองผ่านช่องใต้เยื่อหุ้มสมองและช่องโพรงสมอง4 เมื่อไม่นานมานี้ มีการแสดงให้เห็นว่าของเหลวในช่องใต้เยื่อหุ้มสมองและไขสันหลังแพร่กระจายมากเกินไปในเนื้อเยื่อระหว่างเซลล์ของสมอง9 เราหวังที่จะเข้าถึงช่องว่างของเนื้อเยื่อสมองโดยใช้ทางเดินการไหลเข้าของของเหลวในช่องใต้เยื่อหุ้มสมองและไขสันหลัง หรือโดยตรงผ่านทางอุปสรรคเลือด-สมอง เพื่อให้บรรลุเป้าหมายนี้ เราได้นำกลยุทธ์การคัดเลือกฟาจในร่างกายที่มีประสิทธิภาพมาใช้ ซึ่งระบุเปปไทด์ที่ถูกขนส่งโดยทางเดินที่แตกต่างกันสองทางนี้อย่างเหมาะสม
เราจะอธิบายวิธีการคัดกรองแบบลำดับขั้นโดยใช้ฟาจดิสเพลย์ในร่างกายร่วมกับการเก็บตัวอย่างน้ำไขสันหลัง (CSF) และการลำดับดีเอ็นเอความเร็วสูง (HTS) เพื่อตรวจสอบรอบการคัดเลือกเบื้องต้นที่มีความหลากหลายของไลบรารีสูงสุด การคัดกรองดำเนินการในหนูทดลองที่รู้สึกตัวโดยมีการฝังท่อขนาดใหญ่ในช่องน้ำไขสันหลัง (CM) อย่างถาวรเพื่อหลีกเลี่ยงการปนเปื้อนของเลือด ที่สำคัญ วิธีการนี้คัดเลือกทั้งเปปไทด์ที่มุ่งเป้าไปยังสมองและเปปไทด์ที่มีกิจกรรมการขนส่งผ่านอุปสรรคหลอดเลือดสมอง เราใช้ฟาจ T7 เนื่องจากมีขนาดเล็ก (~60 นาโนเมตร)10 และแนะนำว่าเหมาะสมสำหรับการขนส่งเวสิเคิลที่ช่วยให้เกิดการข้ามเซลล์ของเยื่อบุผนังหลอดเลือดและ/หรือเยื่อบุผิว-ไขกระดูก หลังจากผ่านการคัดเลือกสี่รอบ ประชากรฟาจที่แยกได้แสดงให้เห็นถึงการเพิ่มจำนวนในน้ำไขสันหลังในร่างกายอย่างแข็งแกร่งและการเชื่อมโยงกับหลอดเลือดขนาดเล็กในสมอง ที่สำคัญ เราสามารถยืนยันผลการค้นพบของเราได้โดยการแสดงให้เห็นว่าเปปไทด์ที่เหมาะสมที่สุดซึ่งสังเคราะห์ทางเคมีนั้นสามารถขนส่งโปรตีนเข้าสู่ของเหลวในไขสันหลังได้ ขั้นแรก เราได้ศึกษาผลทางเภสัชพลศาสตร์ของระบบประสาทส่วนกลางโดยการรวมเปปไทด์นำส่งหลักเข้ากับสารยับยั้งเปปไทด์ BACE1 นอกจากจะแสดงให้เห็นว่ากลยุทธ์การคัดกรองการทำงานในร่างกายสามารถระบุเปปไทด์ขนส่งสมองใหม่ๆ ที่เป็นพาหะขนส่งโปรตีนที่มีประสิทธิภาพแล้ว เราคาดว่าวิธีการคัดเลือกการทำงานที่คล้ายกันนี้จะมีความสำคัญในการระบุเส้นทางการขนส่งสมองใหม่ๆ ด้วยเช่นกัน
จากการวัดจำนวนหน่วยก่อตัวของคราบจุลินทรีย์ (PFU) หลังขั้นตอนการบรรจุฟาจ ได้มีการออกแบบและสร้างไลบรารีของเปปไทด์ฟาจ T7 เชิงเส้น 12-mer แบบสุ่มที่มีความหลากหลายประมาณ 10⁹ (ดูหัวข้อ วัสดุและวิธีการ) สิ่งสำคัญคือต้องสังเกตว่าเราได้วิเคราะห์ไลบรารีนี้อย่างละเอียดก่อนการคัดเลือกในร่างกาย (in vivo panning) การขยายสัญญาณ PCR ของตัวอย่างไลบรารีฟาจโดยใช้ไพรเมอร์ที่ดัดแปลงแล้วได้สร้างแอมพลิคอนที่สามารถนำไปใช้กับ HTS ได้โดยตรง (ภาพประกอบเพิ่มเติม 1a) เนื่องจาก ก) ข้อผิดพลาดในการจัดลำดับ HTS11 ข) ผลกระทบต่อคุณภาพของไพรเมอร์ (NNK)1-12 และ ค) การมีอยู่ของฟาจชนิดป่า (wt) (ส่วนแทรกโครงกระดูก) ในไลบรารีสำรอง จึงได้มีการใช้ขั้นตอนการกรองลำดับเพื่อดึงเฉพาะข้อมูลลำดับที่ได้รับการตรวจสอบแล้วเท่านั้น (ภาพประกอบเพิ่มเติม 1b) ขั้นตอนการกรองเหล่านี้ใช้กับไลบรารีการจัดลำดับ HTS ทั้งหมด สำหรับไลบรารีมาตรฐาน ได้รับข้อมูลการอ่านทั้งหมด 233,868 ครั้ง โดย 39% ผ่านเกณฑ์การกรองและถูกนำไปใช้ในการวิเคราะห์และคัดเลือกไลบรารีสำหรับรอบต่อไป (ภาพประกอบเพิ่มเติม 1c–e) การอ่านส่วนใหญ่มีความยาวเป็นทวีคูณของ 3 คู่เบส โดยมีจุดสูงสุดที่ 36 นิวคลีโอไทด์ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 1c) ซึ่งยืนยันการออกแบบไลบรารี (NNK) 1-12 ที่น่าสังเกตคือ ประมาณ 11% ของสมาชิกในไลบรารีมีชิ้นส่วนแทรก PAGISRELVDKL แบบ 12 มิติชนิดดั้งเดิม (wt) และเกือบครึ่งหนึ่งของลำดับ (49%) มีการแทรกหรือการลบ การวิเคราะห์ HTS ของไลบรารีได้ยืนยันความหลากหลายสูงของเปปไทด์ในไลบรารี: มากกว่า 81% ของลำดับเปปไทด์พบเพียงครั้งเดียว และมีเพียง 1.5% เท่านั้นที่พบในจำนวน ≥4 สำเนา (ภาพประกอบเพิ่มเติม 2a) ความถี่ของกรดอะมิโน (aa) ในตำแหน่งทั้ง 12 ตำแหน่งในเรเพอร์ทัวร์มีความสัมพันธ์ที่ดีกับความถี่ที่คาดหวังสำหรับจำนวนโคดอนที่สร้างขึ้นโดยเรเพอร์ทัวร์ NKK ที่เสื่อมสภาพ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 2b) ความถี่ที่สังเกตได้ของกรดอะมิโนที่เข้ารหัสโดยอินเสิร์ตเหล่านี้มีความสัมพันธ์ที่ดีกับความถี่ที่คำนวณได้ (r = 0.893) (ภาพประกอบเพิ่มเติม 2c) การเตรียมไลบรารีของฟาจสำหรับการฉีดประกอบด้วยขั้นตอนการขยายและการกำจัดเอนโดท็อกซิน ซึ่งก่อนหน้านี้ได้แสดงให้เห็นแล้วว่าอาจลดความหลากหลายของไลบรารีของฟาจได้12,13 ดังนั้น เราจึงทำการลำดับไลบรารีของฟาจที่ขยายบนเพลทซึ่งผ่านการกำจัดเอนโดท็อกซินแล้ว และเปรียบเทียบกับไลบรารีดั้งเดิมเพื่อประมาณความถี่ของ AA พบความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่ง (r = 0.995) ระหว่างกลุ่มตัวอย่างดั้งเดิมกับกลุ่มตัวอย่างที่ขยายและทำให้บริสุทธิ์แล้ว (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 2d) ซึ่งบ่งชี้ว่าการแข่งขันระหว่างโคลนที่ขยายบนเพลทโดยใช้ฟาจ T7 ไม่ได้ทำให้เกิดความลำเอียงที่สำคัญ การเปรียบเทียบนี้อิงตามความถี่ของโมทีฟไตรเปปไทด์ในแต่ละไลบรารี เนื่องจากความหลากหลายของไลบรารี (~109) ไม่สามารถจับได้อย่างครบถ้วนแม้จะใช้ HTS ก็ตาม การวิเคราะห์ความถี่ของกรดอะมิโนในแต่ละตำแหน่งเผยให้เห็นความลำเอียงเล็กน้อยที่ขึ้นอยู่กับตำแหน่งในสามตำแหน่งสุดท้ายของเรเพอร์ทัวร์ที่ป้อนเข้าไป (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 2e) โดยสรุป เราสรุปได้ว่าคุณภาพและความหลากหลายของไลบรารีอยู่ในระดับที่ยอมรับได้ และพบการเปลี่ยนแปลงเพียงเล็กน้อยในความหลากหลายเนื่องจากการขยายและการเตรียมไลบรารีฟาจระหว่างรอบการคัดเลือกหลายรอบ
การเก็บตัวอย่างน้ำไขสันหลังแบบต่อเนื่องสามารถทำได้โดยการผ่าตัดฝังท่อขนาดเล็กเข้าไปในน้ำไขสันหลังของหนูทดลองที่ยังมีสติ เพื่อช่วยในการระบุฟาจ T7 ที่ฉีดเข้าทางหลอดเลือดดำ (iv) ผ่านทางอุปสรรคเลือดสมอง (BBB) ​​และ/หรืออุปสรรคเลือด-น้ำไขสันหลัง (BCSFB) (รูปที่ 1a-b) เราใช้แขนการคัดเลือกอิสระสองแขน (แขน A และ B) ในสามรอบแรกของการคัดเลือกในร่างกาย (รูปที่ 1c) เราค่อยๆ เพิ่มความเข้มงวดของการคัดเลือกโดยการลดปริมาณฟาจทั้งหมดที่นำเข้าในสามรอบแรกของการคัดเลือก สำหรับรอบที่สี่ของการคัดเลือก เราได้รวมตัวอย่างจากแขน A และ B และทำการคัดเลือกอิสระเพิ่มเติมอีกสามครั้ง เพื่อศึกษาคุณสมบัติในร่างกายของอนุภาคฟาจ T7 ในแบบจำลองนี้ ฟาจชนิดป่า (PAGISRELVDKL master insert) ถูกฉีดเข้าไปในหนูทดลองทางเส้นเลือดหาง การตรวจพบฟาจจากน้ำไขสันหลังและเลือดในช่วงเวลาต่างๆ แสดงให้เห็นว่าฟาจ T7 รูปทรงไอโคซาเฮดรัลขนาดค่อนข้างเล็กมีการกำจัดออกจากกระแสเลือดอย่างรวดเร็วในช่วงแรก (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 3) จากปริมาณยาที่ให้และปริมาณเลือดของหนู เราคำนวณได้ว่าตรวจพบฟาจเพียงประมาณ 1% ของน้ำหนักจากปริมาณยาที่ให้ในเลือด 10 นาทีหลังจากการฉีดเข้าเส้นเลือดดำ หลังจากช่วงการลดลงอย่างรวดเร็วในช่วงแรกนี้แล้ว พบว่ามีการกำจัดในระยะแรกที่ช้าลง โดยมีครึ่งชีวิต 27.7 นาที ที่สำคัญคือ ตรวจพบฟาจเพียงเล็กน้อยจากน้ำไขสันหลัง ซึ่งบ่งชี้ว่ามีพื้นฐานต่ำสำหรับการเคลื่อนย้ายของฟาจชนิดดั้งเดิมเข้าไปในน้ำไขสันหลัง (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 3) โดยเฉลี่ยแล้ว ตรวจพบฟาจ T7 เพียงประมาณ 1 x 10⁻³% ในเลือด และ 4 x 10⁻⁸% ของฟาจที่ฉีดเข้าไปในตอนแรกในน้ำไขสันหลังตลอดช่วงเวลาการเก็บตัวอย่างทั้งหมด (0-250 นาที) ที่น่าสังเกตคือ ครึ่งชีวิต (25.7 นาที) ของฟาจชนิดปกติในน้ำไขสันหลังนั้นคล้ายคลึงกับที่พบในเลือด ข้อมูลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าเยื่อกั้นที่แยกส่วนของน้ำไขสันหลังออกจากเลือดนั้นยังคงสมบูรณ์ในหนูที่ใส่ท่อ CM ทำให้สามารถคัดเลือกไลบรารีของฟาจในร่างกายเพื่อระบุโคลนที่สามารถเคลื่อนย้ายจากเลือดไปยังส่วนของน้ำไขสันหลังได้อย่างง่ายดาย
(a) การจัดตั้งวิธีการเก็บตัวอย่างน้ำไขสันหลัง (CSF) ซ้ำจากกลุ่มตัวอย่างขนาดใหญ่ (b) แผนภาพแสดงตำแหน่งของเซลล์ของอุปสรรคระบบประสาทส่วนกลาง (CNS) และกลยุทธ์การคัดเลือกที่ใช้ในการระบุเปปไทด์ที่สามารถผ่านอุปสรรคเลือด-สมอง (BBB) ​​และอุปสรรคเลือด-สมอง (c) แผนผังการคัดกรองแบบแสดงผลฟาจในร่างกาย ในแต่ละรอบของการคัดเลือก ฟาจ (ตัวระบุสัตว์ภายในลูกศร) จะถูกฉีดเข้าทางหลอดเลือดดำ สาขาทางเลือกอิสระสองสาขา (A, B) จะถูกเก็บแยกกันจนถึงรอบการคัดเลือกที่ 4 สำหรับรอบการคัดเลือกที่ 3 และ 4 โคลนฟาจแต่ละตัวที่สกัดจาก CSF จะถูกจัดลำดับด้วยตนเอง (d) จลนศาสตร์ของฟาจที่แยกได้จากเลือด (วงกลมสีแดง) และน้ำไขสันหลัง (สามเหลี่ยมสีเขียว) ในระหว่างรอบการคัดเลือกครั้งแรกในหนูทดลองสองตัวที่ใส่ท่อหลังจากการฉีดไลบรารีเปปไทด์ T7 เข้าทางหลอดเลือดดำ (2 x 10¹² ฟาจ/ตัว) ช่องสี่เหลี่ยมสีน้ำเงินแสดงถึงความเข้มข้นเริ่มต้นเฉลี่ยของฟาจในเลือด ซึ่งคำนวณจากปริมาณฟาจที่ฉีดเข้าไป โดยคำนึงถึงปริมาตรเลือดทั้งหมด ช่องสี่เหลี่ยมสีดำแสดงจุดตัดของเส้น y ที่ลากจากความเข้มข้นของฟาจในเลือด (e,f) แสดงความถี่สัมพัทธ์และการกระจายของโมทีฟไตรเปปไทด์ที่ทับซ้อนกันทั้งหมดที่พบในเปปไทด์ จำนวนโมทีฟที่พบในการอ่าน 1000 ครั้งจะแสดงไว้ โมทีฟที่มีความเข้มข้นสูงขึ้นอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.001) จะถูกทำเครื่องหมายด้วยจุดสีแดง (e) แผนภาพกระจายความสัมพันธ์เปรียบเทียบความถี่สัมพัทธ์ของโมทีฟไตรเปปไทด์ของไลบรารีที่ฉีดเข้าไปกับฟาจที่ได้จากเลือดของสัตว์ #1.1 และ #1.2 (f) แผนภาพกระจายความสัมพันธ์เปรียบเทียบความถี่สัมพัทธ์ของโมทีฟไตรเปปไทด์ของฟาจสัตว์ #1.1 และ #1.2 ที่แยกได้จากเลือดและน้ำไขสันหลัง (g, h) ภาพแสดงลำดับรหัสของฟาจที่เพิ่มจำนวนในเลือด (g) เทียบกับไลบรารีที่ฉีดเข้าไป และฟาจที่เพิ่มจำนวนในน้ำไขสันหลัง (h) เทียบกับเลือด หลังจากการคัดเลือกในร่างกายของสัตว์ทั้งสองชนิด ขนาดของรหัสตัวอักษรหนึ่งตัวบ่งบอกถึงความถี่ที่กรดอะมิโนนั้นปรากฏในตำแหน่งนั้น สีเขียว = มีขั้ว สีม่วง = เป็นกลาง สีน้ำเงิน = เป็นเบส สีแดง = เป็นกรด และสีดำ = ไม่ชอบน้ำ รูปที่ 1a, b ออกแบบและจัดทำโดย Eduard Urich
เราฉีดไลบรารีเปปไทด์ของฟาจเข้าไปในหนูทดลอง CM สองตัว (สายพันธุ์ A และ B) และแยกฟาจออกจากน้ำไขสันหลังและเลือด (รูปที่ 1d) การกำจัดไลบรารีอย่างรวดเร็วในช่วงแรกนั้นไม่เด่นชัดเท่ากับฟาจสายพันธุ์ปกติ ครึ่งชีวิตเฉลี่ยของไลบรารีที่ฉีดเข้าไปในสัตว์ทั้งสองตัวคือ 24.8 นาทีในเลือด ซึ่งคล้ายกับฟาจสายพันธุ์ปกติ และ 38.5 นาทีในน้ำไขสันหลัง ตัวอย่างฟาจจากเลือดและน้ำไขสันหลังของสัตว์แต่ละตัวถูกนำไปทำการคัดกรองแบบความเร็วสูง (HTS) และเปปไทด์ที่ระบุได้ทั้งหมดถูกวิเคราะห์หาการมีอยู่ของโมทีฟไตรเปปไทด์สั้นๆ โมทีฟไตรเปปไทด์ถูกเลือกเพราะเป็นพื้นฐานขั้นต่ำสำหรับการสร้างโครงสร้างและการโต้ตอบระหว่างเปปไทด์กับโปรตีน14,15 เราพบความสัมพันธ์ที่ดีในการกระจายของโมทีฟระหว่างไลบรารีฟาจที่ฉีดเข้าไปและโคลนที่สกัดจากเลือดของสัตว์ทั้งสองตัว (รูปที่ 1e) ข้อมูลบ่งชี้ว่าองค์ประกอบของไลบรารีมีการเพิ่มขึ้นเพียงเล็กน้อยในส่วนของเลือด ความถี่ของกรดอะมิโนและลำดับคอนเซนซัสได้รับการวิเคราะห์เพิ่มเติมในแต่ละตำแหน่งโดยใช้ซอฟต์แวร์ Weblogo16 ที่ปรับปรุงแล้ว ที่น่าสนใจคือ เราพบว่ามีการเพิ่มขึ้นอย่างมากของกรดอะมิโนไกลซีนในเลือด (รูปที่ 1g) เมื่อเปรียบเทียบเลือดกับโคลนที่เลือกจากน้ำไขสันหลัง พบว่ามีการคัดเลือกอย่างเข้มข้นและการลดการคัดเลือกของโมทีฟบางส่วน (รูปที่ 1f) และกรดอะมิโนบางชนิดปรากฏอยู่เป็นพิเศษในตำแหน่งที่กำหนดไว้ล่วงหน้าในเปปไทด์ 12 สมาชิก (รูปที่ 1h) ที่น่าสังเกตคือ สัตว์แต่ละตัวมีความแตกต่างกันอย่างมีนัยสำคัญในน้ำไขสันหลัง ในขณะที่พบการเพิ่มขึ้นของไกลซีนในเลือดในสัตว์ทั้งสองตัว (รูปเพิ่มเติมที่ 4a–j) หลังจากการกรองข้อมูลลำดับอย่างเข้มงวดในน้ำไขสันหลังของสัตว์หมายเลข 1.1 และ 1.2 แล้ว ได้รับเปปไทด์ 12 เมอร์ที่ไม่ซ้ำกันทั้งหมด 964 และ 420 ตัว (รูปเพิ่มเติมที่ 1d–e) โคลนฟาจที่แยกได้ถูกขยายจำนวนและนำไปผ่านกระบวนการคัดเลือกในร่างกายรอบที่สอง ฟาจที่สกัดได้จากรอบการคัดเลือกครั้งที่สองถูกนำไปทำ HTS ในสัตว์แต่ละตัว และเปปไทด์ที่ระบุได้ทั้งหมดถูกใช้เป็นข้อมูลป้อนเข้าสำหรับโปรแกรมการจดจำลวดลายเพื่อวิเคราะห์การเกิดขึ้นของลวดลายไตรเปปไทด์ (รูปที่ 2a, b, ef) เมื่อเปรียบเทียบกับรอบแรกของฟาจที่ได้จาก CSF เราสังเกตเห็นการคัดเลือกและการยกเลิกการคัดเลือกเพิ่มเติมของลวดลายจำนวนมากใน CSF ในสาขา A และ B (รูปที่ 2) อัลกอริทึมการระบุเครือข่ายถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบว่าพวกมันแสดงถึงรูปแบบที่แตกต่างกันของลำดับที่สอดคล้องกันหรือไม่ พบความคล้ายคลึงกันอย่างชัดเจนระหว่างลำดับ 12 มิติที่ได้จาก CSF ในกลุ่มทางเลือก A (รูปที่ 2c, d) และกลุ่ม B (รูปที่ 2g, h) การวิเคราะห์แบบรวมในแต่ละสาขาเผยให้เห็นรูปแบบการคัดเลือกที่แตกต่างกันสำหรับเปปไทด์ 12-เมอร์ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 5c,d) และอัตราส่วนไทเตอร์ CSF/เลือดที่เพิ่มขึ้นเมื่อเวลาผ่านไปสำหรับโคลนแบบรวมหลังจากการคัดเลือกรอบที่สองเมื่อเทียบกับการคัดเลือกรอบแรก (ภาพประกอบเพิ่มเติม 5e)
การเพิ่มความเข้มข้นของลวดลายและเปปไทด์ในน้ำไขสันหลังโดยการคัดเลือกด้วยการแสดงผลฟาจเชิงฟังก์ชันในร่างกายสองรอบต่อเนื่องกัน
ฟาจในน้ำไขสันหลังทั้งหมดที่ได้จากรอบแรกของสัตว์แต่ละตัว (สัตว์หมายเลข 1.1 และ 1.2) ถูกนำมารวมกัน ขยายจำนวน ทำการเรียงลำดับ HT และฉีดกลับเข้าไปพร้อมกัน (2 x 10¹⁰ ฟาจ/สัตว์) ในหนูที่ใส่ท่อ SM จำนวน 2 ตัว (หมายเลข 1.1 → หมายเลข 2.1 และ 2.2, 1.2 → หมายเลข 2.3 และ 2.4) (a,b,e,f) แผนภาพกระจายความสัมพันธ์เปรียบเทียบความถี่สัมพัทธ์ของโมทีฟไตรเปปไทด์ของฟาจที่ได้จากน้ำไขสันหลังทั้งหมดในรอบการคัดเลือกครั้งแรกและครั้งที่สอง ความถี่สัมพัทธ์และการกระจายของโมทีฟที่แสดงถึงไตรเปปไทด์ที่ทับซ้อนกันที่เป็นไปได้ทั้งหมดที่พบในเปปไทด์ในทั้งสองทิศทาง จำนวนโมทีฟที่พบในการอ่าน 1000 ครั้งแสดงไว้ โมทีฟที่ถูกเลือกหรือถูกยกเว้นอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.001) ในไลบรารีที่เปรียบเทียบกันจะถูกเน้นด้วยจุดสีแดง (c, d, g, h) โลโก้ลำดับแสดงลำดับกรดอะมิโน 12 ตัวที่อุดมด้วย CSF ทั้งหมด โดยอิงจากรอบที่ 2 และ 1 ของการคัดเลือกในร่างกาย ขนาดของรหัสตัวอักษรเดียวบ่งบอกถึงความถี่ที่กรดอะมิโนนั้นปรากฏในตำแหน่งนั้น ในการแสดงโลโก้ จะมีการเปรียบเทียบความถี่ของลำดับ CSF ที่สกัดจากสัตว์แต่ละตัวระหว่างสองรอบการคัดเลือก และแสดงลำดับที่อุดมด้วยในรอบที่สอง: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 และ (h) #1.2–#2.4 กรดอะมิโนที่อุดมด้วยมากที่สุดในตำแหน่งที่กำหนดใน (c, d) สัตว์หมายเลข 2.1 และ 2.2 หรือ (g, h) ในสัตว์หมายเลข 2.3 และ 2.4 จะแสดงด้วยสี สีเขียว = กรดอะมิโนมีขั้ว สีม่วง = กรดอะมิโนเป็นกลาง สีน้ำเงิน = กรดอะมิโนเบส สีแดง = กรดอะมิโนกรด และสีดำ = กรดอะมิโนที่ไม่ชอบน้ำ
หลังจากการคัดเลือกในรอบที่สาม เราได้ระบุลำดับเปปไทด์ที่ไม่ซ้ำกัน 124 ลำดับ (#3.1 และ #3.2) จากโคลนฟาจที่สร้างขึ้นใหม่จากน้ำไขสันหลังจำนวน 332 โคลนที่แยกได้จากสัตว์สองตัว (ภาพประกอบเพิ่มเติม 6a) ลำดับ LGSVS (18.7%) มีสัดส่วนสัมพัทธ์สูงสุด ตามด้วยส่วนแทรกแบบดั้งเดิม PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%) และ SARGSWREIVSLS (2.2%) ในรอบที่สี่ซึ่งเป็นรอบสุดท้าย เราได้รวมสาขาที่คัดเลือกอย่างอิสระสองสาขาจากสัตว์สามตัวที่แตกต่างกัน (รูปที่ 1c) จากโคลนฟาจที่ได้รับการจัดลำดับ 925 โคลนที่กู้คืนจากน้ำไขสันหลัง ในรอบที่สี่ เราพบลำดับเปปไทด์ที่ไม่ซ้ำกัน 64 ลำดับ (ภาพประกอบเพิ่มเติม 6b) ซึ่งสัดส่วนสัมพัทธ์ของฟาจแบบดั้งเดิมลดลงเหลือ 0.8% โคลน CSF ที่พบมากที่สุดในรอบที่สี่ ได้แก่ LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) และ RLSSVDSDLSGC (3.2%) ช่วงความยาวของเปปไทด์ที่เลือกนั้นเกิดจากการแทรก/ลบของนิวคลีโอไทด์หรือรหัสหยุดก่อนกำหนดในไพรเมอร์ของไลบรารีเมื่อใช้รหัสแบบดีเจเนอเรตในการออกแบบไลบรารี NNK รหัสหยุดก่อนกำหนดจะสร้างเปปไทด์ที่สั้นกว่าและถูกเลือกเนื่องจากมีลำดับกรดอะมิโนที่เหมาะสม เปปไทด์ที่ยาวกว่าอาจเกิดจากการแทรก/ลบในไพรเมอร์ของไลบรารีสังเคราะห์ ซึ่งจะทำให้รหัสหยุดที่ออกแบบไว้อยู่นอกเฟรมและอ่านจนกว่าจะมีรหัสหยุดใหม่ปรากฏขึ้นที่ปลายน้ำ โดยทั่วไป เราคำนวณปัจจัยการเพิ่มความเข้มข้นสำหรับการคัดเลือกทั้งสี่รอบโดยการเปรียบเทียบข้อมูลขาเข้ากับข้อมูลขาออกของตัวอย่าง สำหรับรอบแรกของการคัดกรอง เราใช้ไทเตอร์ของฟาจชนิดป่าเป็นตัวอ้างอิงพื้นหลังที่ไม่จำเพาะเจาะจง ที่น่าสนใจคือ การคัดเลือกฟาจเชิงลบมีความเข้มข้นมากในรอบ CSF รอบแรก แต่ไม่พบในเลือด (รูปที่ 3a) ซึ่งอาจเป็นเพราะความน่าจะเป็นต่ำของการแพร่แบบพาสซีฟของสมาชิกส่วนใหญ่ในไลบรารีเปปไทด์เข้าไปในช่อง CSF หรือฟาจที่เกี่ยวข้องมีแนวโน้มที่จะถูกกักเก็บหรือกำจัดออกจากกระแสเลือดได้อย่างมีประสิทธิภาพมากกว่าแบคทีริโอฟาจ อย่างไรก็ตาม ในรอบที่สองของการคัดเลือกแบบแพนนิ่ง พบการคัดเลือกฟาจอย่างเข้มข้นใน CSF ในทั้งสองกลุ่ม ซึ่งบ่งชี้ว่ารอบก่อนหน้านี้มีการเพิ่มความเข้มข้นของฟาจที่แสดงเปปไทด์ที่ส่งเสริมการดูดซึม CSF (รูปที่ 3a) อีกครั้ง โดยไม่มีการเพิ่มความเข้มข้นในเลือดอย่างมีนัยสำคัญ นอกจากนี้ ในรอบที่สามและสี่ โคลนฟาจยังได้รับการเพิ่มความเข้มข้นอย่างมีนัยสำคัญใน CSF เมื่อเปรียบเทียบความถี่สัมพัทธ์ของลำดับเปปไทด์ที่ไม่ซ้ำกันแต่ละลำดับระหว่างรอบการคัดเลือกสองรอบสุดท้าย เราพบว่าลำดับเหล่านั้นมีความเข้มข้นมากขึ้นในรอบการคัดเลือกรอบที่สี่ (รูปที่ 3b) มีการสกัดโมทีฟไตรเปปไทด์ทั้งหมด 931 โมทีฟจากลำดับเปปไทด์ที่ไม่ซ้ำกันทั้งหมด 64 ลำดับโดยใช้การวางแนวเปปไทด์ทั้งสองแบบ โมทีฟที่มีความเข้มข้นมากที่สุดในรอบที่สี่ได้รับการตรวจสอบอย่างละเอียดมากขึ้นสำหรับโปรไฟล์ความเข้มข้นในทุกรอบเมื่อเทียบกับไลบรารีที่ฉีดเข้าไป (จุดตัด: ความเข้มข้น 10%) (รูปประกอบเพิ่มเติม 6c) รูปแบบทั่วไปของการคัดเลือกแสดงให้เห็นว่าโมทีฟที่ศึกษาเกือบทั้งหมดมีความเข้มข้นในทุกรอบก่อนหน้าของทั้งสองสาขาการคัดเลือก อย่างไรก็ตาม โมทีฟบางส่วน (เช่น SGL, VSG, LGS GSV) ส่วนใหญ่มาจากกลุ่มทางเลือก A ในขณะที่โมทีฟอื่นๆ (เช่น FGW, RTN, WGF, NTR) มีความเข้มข้นในกลุ่มทางเลือก B
การตรวจสอบความถูกต้องของการขนส่ง CSF ของเปปไทด์ที่แสดงบนฟาจซึ่งเสริมด้วย CSF และเปปไทด์นำที่ติดไบโอตินซึ่งเชื่อมต่อกับสารบรรทุกสเตรปตาไวดีน
(a) อัตราส่วนการเพิ่มความเข้มข้นที่คำนวณในทั้งสี่รอบ (R1-R4) โดยอิงจากความเข้มข้นของฟาจ (PFU) ที่ฉีดเข้าไป (อินพุต = I) และความเข้มข้นของฟาจในน้ำไขสันหลังที่กำหนด (เอาต์พุต = O) ปัจจัยการเพิ่มความเข้มข้นสำหรับสามรอบสุดท้าย (R2-R4) คำนวณโดยการเปรียบเทียบกับรอบก่อนหน้าและรอบแรก (R1) โดยใช้ข้อมูลน้ำหนัก แท่งสีขาวแสดงถึงน้ำไขสันหลัง แท่งสีเทาแสดงถึงพลาสมา (***p<0.001 อ้างอิงจากการทดสอบ t ของนักเรียน) (b) รายชื่อของเปปไทด์ฟาจที่พบมากที่สุด เรียงลำดับตามสัดส่วนสัมพัทธ์ต่อฟาจทั้งหมดที่เก็บรวบรวมในน้ำไขสันหลังหลังจากการคัดเลือกในรอบที่ 4 โคลนฟาจที่พบมากที่สุดหกตัวถูกเน้นด้วยสี หมายเลขกำกับ และปัจจัยการเพิ่มความเข้มข้นระหว่างรอบที่ 3 และ 4 ของการคัดเลือก (ภาพแทรก) (c,d) โคลนฟาจที่เข้มข้นที่สุด 6 โคลน ฟาจเปล่า และไลบรารีเปปไทด์ฟาจต้นแบบจากรอบที่ 4 ได้รับการวิเคราะห์ทีละตัวในแบบจำลองการเก็บตัวอย่างน้ำไขสันหลัง ตัวอย่างน้ำไขสันหลังและเลือดถูกเก็บรวบรวม ณ จุดเวลาที่ระบุ (c) โคลนฟาจที่คัดเลือก 6 โคลน (2 x 10¹⁰ ฟาจ/ตัว) ฟาจเปล่า (#1779) (2 x 10¹⁰ ฟาจ/ตัว) และไลบรารีเปปไทด์ฟาจสต็อก (2 x 10¹² ฟาจ/ตัว) ในปริมาณเท่ากันจะถูกฉีดเข้าไปในสัตว์ที่ใส่ท่อผ่านทางเส้นเลือดหางแยกกัน เภสัชจลนศาสตร์ของน้ำไขสันหลังของโคลนฟาจและไลบรารีเปปไทด์ฟาจแต่ละชนิดที่ฉีดเข้าไปเมื่อเวลาผ่านไปแสดงไว้ในภาพ (d) แสดงอัตราส่วนเฉลี่ยของน้ำไขสันหลังต่อเลือดสำหรับฟาจ/มล. ที่กู้คืนได้ทั้งหมดตลอดช่วงเวลาการเก็บตัวอย่าง (e) เปปไทด์นำสังเคราะห์ 4 ตัวและเปปไทด์ควบคุมแบบสุ่ม 1 ตัวถูกเชื่อมต่อกับสเตรปตาไวดีนด้วยไบโอตินผ่านทางปลาย N-terminus (การแสดงผลแบบเทตราเมอร์) จากนั้นฉีดเข้าเส้นเลือดดำที่หาง (iv, สเตรปตาไวดีน 10 มก./กก.) ในหนูทดลองที่ใส่ท่อช่วยหายใจอย่างน้อย 3 ตัว (N = 3) เก็บตัวอย่างน้ำไขสันหลัง (CSF) ในช่วงเวลาที่กำหนด และวัดความเข้มข้นของสเตรปตาไวดีนโดยใช้ ELISA ต่อต้านสเตรปตาไวดีนในน้ำไขสันหลัง (nd = ตรวจไม่พบ) (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001 โดยอิงจากการทดสอบ ANOVA) (f) การเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนของโคลนเปปไทด์ฟาจที่เข้มข้นที่สุด #2002 (สีม่วง) กับโคลนเปปไทด์ฟาจอื่นๆ ที่เลือกจากรอบการคัดเลือกครั้งที่ 4 ชิ้นส่วนกรดอะมิโนที่เหมือนกันและคล้ายกันจะถูกระบายสี
จากฟาจที่ผ่านการเพิ่มจำนวนทั้งหมดในรอบที่สี่ (รูปที่ 3b) ได้คัดเลือกโคลนฟาจที่เหมาะสมจำนวน 6 โคลนเพื่อทำการวิเคราะห์เพิ่มเติมในแบบจำลองการเก็บตัวอย่างน้ำไขสันหลัง โดยฉีดฟาจที่เหมาะสมทั้ง 6 โคลน ฟาจเปล่า (ไม่มีสารแทรก) และไลบรารีเปปไทด์ของโปรฟาจในปริมาณเท่ากันเข้าไปในสัตว์ทดลอง CM ที่มีท่อใส่สายสวนจำนวน 3 ตัว และทำการตรวจสอบเภสัชจลนศาสตร์ในน้ำไขสันหลัง (รูปที่ 3c) และเลือด (รูปเพิ่มเติมที่ 7) โคลนฟาจทั้งหมดที่ทดสอบมุ่งเป้าไปยังช่องน้ำไขสันหลังในระดับที่สูงกว่าฟาจควบคุมเปล่า (#1779) ถึง 10-1000 เท่า ตัวอย่างเช่น โคลน #2020 และ #2077 มีความเข้มข้นในน้ำไขสันหลังสูงกว่าฟาจควบคุมประมาณ 1000 เท่า โปรไฟล์เภสัชจลนศาสตร์ของเปปไทด์ที่เลือกแต่ละตัวนั้นแตกต่างกัน แต่ทั้งหมดมีความสามารถในการมุ่งเป้าไปยังน้ำไขสันหลังสูง เราสังเกตเห็นการลดลงอย่างต่อเนื่องเมื่อเวลาผ่านไปสำหรับโคลน #1903 และ #2011 ในขณะที่สำหรับโคลน #2077, #2002 และ #2009 การเพิ่มขึ้นในช่วง 10 นาทีแรกอาจบ่งชี้ถึงการขนส่งแบบแอคทีฟ แต่จำเป็นต้องได้รับการตรวจสอบ โคลน #2020, #2002 และ #2077 มีเสถียรภาพในระดับสูง ในขณะที่ความเข้มข้นของ CSF ของโคลน #2009 ลดลงอย่างช้าๆ หลังจากที่เพิ่มขึ้นในช่วงแรก จากนั้นเราได้เปรียบเทียบความถี่สัมพัทธ์ของตัวเลือก CSF แต่ละตัวกับความเข้มข้นในเลือด (รูปที่ 3d) ความสัมพันธ์ของค่าเฉลี่ยของไทเตอร์ของตัวเลือก CSF แต่ละตัวกับไทเตอร์ในเลือด ณ เวลาการเก็บตัวอย่างทั้งหมดแสดงให้เห็นว่าตัวเลือกสามในหกตัวมีความเข้มข้นใน CSF ในเลือดสูงกว่าอย่างมีนัยสำคัญ ที่น่าสนใจคือ โคลน #2077 แสดงให้เห็นถึงความเสถียรในเลือดที่สูงกว่า (รูปภาพเสริม 7) เพื่อยืนยันว่าเปปไทด์เหล่านั้นสามารถขนส่งสารอื่นนอกเหนือจากอนุภาคฟาจเข้าไปในช่องน้ำไขสันหลังได้อย่างมีประสิทธิภาพ เราจึงสังเคราะห์เปปไทด์นำสี่ตัวที่ดัดแปลงด้วยไบโอตินที่ปลาย N-terminus ซึ่งเป็นตำแหน่งที่เปปไทด์ยึดติดกับอนุภาคฟาจ เปปไทด์ที่ติดไบโอติน (หมายเลข 2002, 2009, 2020 และ 2077) ถูกเชื่อมต่อกับสเตรปตาไวดีน (SA) เพื่อให้ได้รูปแบบมัลติเมอร์ที่เลียนแบบรูปทรงเรขาคณิตของฟาจได้บ้าง รูปแบบนี้ยังช่วยให้เราสามารถวัดการแสดงออกของ SA ในเลือดและน้ำไขสันหลังในฐานะเปปไทด์โปรตีนที่ขนส่งสารได้ ที่สำคัญ ข้อมูลของฟาจมักจะสามารถทำซ้ำได้เมื่อให้เปปไทด์สังเคราะห์ในรูปแบบที่เชื่อมต่อกับ SA นี้ (รูปที่ 3e) เปปไทด์ที่สุ่มลำดับมีปริมาณการแสดงออกเริ่มต้นน้อยกว่าและมีการกำจัดออกจากน้ำไขสันหลังได้เร็วกว่า โดยตรวจไม่พบระดับภายใน 48 ชั่วโมง เพื่อทำความเข้าใจเส้นทางการนำส่งของโคลนเปปไทด์ฟาจเหล่านี้เข้าสู่ช่องน้ำไขสันหลัง เราได้วิเคราะห์ตำแหน่งของเปปไทด์ฟาจแต่ละตัวโดยใช้วิธีอิมมูโนฮิสโตเคมี (IHC) เพื่อตรวจจับอนุภาคฟาจโดยตรง 1 ชั่วโมงหลังจากการฉีดเข้าเส้นเลือดในร่างกาย ที่น่าสังเกตคือ โคลน #2002, #2077 และ #2009 สามารถตรวจพบได้ด้วยการย้อมสีที่เข้มข้นในเส้นเลือดฝอยในสมอง ในขณะที่ฟาจควบคุม (#1779) และโคลน #2020 ไม่สามารถตรวจพบได้ (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 8) สิ่งนี้ชี้ให้เห็นว่าเปปไทด์เหล่านี้มีส่วนช่วยให้เกิดผลกระทบต่อสมองโดยการผ่านเข้าสู่สมอง (BBB) ​​จำเป็นต้องมีการวิเคราะห์โดยละเอียดเพิ่มเติมเพื่อทดสอบสมมติฐานนี้ เนื่องจากเส้นทาง BSCFB อาจมีส่วนเกี่ยวข้องด้วย เมื่อเปรียบเทียบลำดับกรดอะมิโนของโคลนที่พบมากที่สุด (#2002) กับเปปไทด์อื่นๆ ที่เลือกไว้ พบว่าบางส่วนมีส่วนขยายของกรดอะมิโนที่คล้ายกัน ซึ่งอาจบ่งชี้ถึงกลไกการขนส่งที่คล้ายกัน (รูปที่ 3f)
เนื่องจากลักษณะเฉพาะของโปรไฟล์พลาสมาและการเพิ่มขึ้นอย่างมีนัยสำคัญของน้ำไขสันหลังเมื่อเวลาผ่านไป โคลนฟาจดิสเพลย์ #2077 จึงได้รับการศึกษาเพิ่มเติมในช่วงเวลาที่ยาวนานขึ้น 48 ชั่วโมง และสามารถจำลองการเพิ่มขึ้นอย่างรวดเร็วของน้ำไขสันหลังที่สังเกตได้ซึ่งเกี่ยวข้องกับระดับ SA ที่คงที่ (รูปที่ 4a) สำหรับโคลนฟาจอื่นๆ ที่ระบุได้ #2077 ย้อมติดสีเส้นเลือดฝอยในสมองอย่างเข้มข้นและแสดงการร่วมตำแหน่งอย่างมีนัยสำคัญกับเลคตินที่เป็นตัวบ่งชี้เส้นเลือดฝอยเมื่อดูที่ความละเอียดสูงขึ้น และอาจมีการย้อมสีในช่องว่างของเนื้อเยื่อสมอง (รูปที่ 4b) เพื่อตรวจสอบว่าสามารถได้รับผลทางเภสัชวิทยาที่เกิดจากเปปไทด์ในระบบประสาทส่วนกลางหรือไม่ เราได้ทำการทดลองโดยผสม i) เปปไทด์นำส่ง #2077 ที่ติดไบโอติน และ ii) เปปไทด์ยับยั้ง BACE1 กับ SA ในอัตราส่วนสองแบบที่แตกต่างกัน สำหรับการผสมแบบหนึ่ง เราใช้เฉพาะเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 เท่านั้น และสำหรับการผสมอีกแบบหนึ่ง เราใช้อัตราส่วน 1:3 ของเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ต่อเปปไทด์ #2077 ตัวอย่างทั้งสองถูกฉีดเข้าทางหลอดเลือดดำ และวัดระดับของเบต้า-อะไมลอยด์เปปไทด์ 40 (Abeta40) ในเลือดและน้ำไขสันหลังเมื่อเวลาผ่านไป การวัด Abeta40 ในน้ำไขสันหลังนั้นสะท้อนถึงการยับยั้ง BACE1 ในเนื้อเยื่อสมอง ตามที่คาดไว้ สารประกอบทั้งสองชนิดลดระดับ Abeta40 ในเลือดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4c, d) อย่างไรก็ตาม เฉพาะตัวอย่างที่มีส่วนผสมของเปปไทด์หมายเลข 2077 และสารยับยั้งเปปไทด์ BACE1 ที่เชื่อมต่อกับ SA เท่านั้นที่ทำให้ Abeta40 ในน้ำไขสันหลังลดลงอย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4c) ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าเปปไทด์หมายเลข 2077 สามารถขนส่งโปรตีน SA ขนาด 60 kDa เข้าสู่ระบบประสาทส่วนกลาง และยังเหนี่ยวนำให้เกิดผลทางเภสัชวิทยาด้วยสารยับยั้งเปปไทด์ BACE1 ที่เชื่อมต่อกับ SA ด้วย
(a) การฉีดโคลน (2 × 10 ฟาจ/ตัว) ของฟาจ T7 แสดงให้เห็นถึงลักษณะทางเภสัชจลนศาสตร์ระยะยาวของเปปไทด์ #2077 ในน้ำไขสันหลัง (RLSSVDSDLSGC) และฟาจควบคุมที่ไม่ได้รับการฉีด (#1779) ในหนูทดลองที่ใส่ท่อ CM อย่างน้อยสามตัว (b) ภาพจากกล้องจุลทรรศน์คอนโฟคอลของหลอดเลือดฝอยในเปลือกสมองของหนูทดลองที่ได้รับการฉีดฟาจ (2 × 10 10 ฟาจ/ตัว) แสดงการย้อมสีของเปปไทด์ #2077 และหลอดเลือด (เลคติน) โคลนฟาจเหล่านี้ถูกฉีดให้กับหนูทดลอง 3 ตัว และปล่อยให้ไหลเวียนเป็นเวลา 1 ชั่วโมงก่อนการให้สารละลายไหลผ่าน สมองถูกตัดเป็นชิ้นและย้อมด้วยแอนติบอดีแบบโพลีโคลนัลที่ติดฉลาก FITC ต่อต้านแคปซิดของฟาจ T7 สิบนาทีก่อนการให้สารละลายไหลผ่านและการตรึงในภายหลัง เลคตินที่ติดฉลาก DyLight594 ถูกฉีดเข้าทางหลอดเลือดดำ ภาพเรืองแสงแสดงการย้อมสีเลคติน (สีแดง) ของด้านในของหลอดเลือดฝอยและฟาจ (สีเขียว) ในช่องว่างของเส้นเลือดฝอยและเนื้อเยื่อสมองรอบหลอดเลือด แถบมาตราส่วนแสดงถึง 10 µm (c, d) เปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ที่ติดไบโอตินเพียงอย่างเดียวหรือร่วมกับเปปไทด์นำส่ง #2077 ที่ติดไบโอติน ถูกเชื่อมต่อกับสเตรปตาไวดีน จากนั้นฉีดเข้าทางหลอดเลือดดำในหนู CM อย่างน้อยสามตัวที่ใส่ท่อ (สเตรปตาไวดีน 10 มก./กก.) การลดลงของ Aβ40 ที่เกิดจากการยับยั้งเปปไทด์ BACE1 ถูกวัดโดย Aβ1-40 ELISA ในเลือด (สีแดง) และน้ำไขสันหลัง (สีส้ม) ณ จุดเวลาที่ระบุ เพื่อความชัดเจนยิ่งขึ้น เส้นประถูกวาดบนกราฟที่มาตราส่วน 100% (c) เปอร์เซ็นต์การลดลงของ Aβ40 ในเลือด (สามเหลี่ยมสีแดง) และน้ำไขสันหลัง (สามเหลี่ยมสีส้ม) ในหนูที่ได้รับการรักษาด้วยสเตรปตาไวดีนที่เชื่อมต่อกับทรานสิตเปปไทด์ #2077 และเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ในอัตราส่วน 3:1 (d) เปอร์เซ็นต์การลดลงของ Aβ40 ในเลือด (วงกลมสีแดง) และน้ำไขสันหลัง (วงกลมสีส้ม) ของหนูที่ได้รับการรักษาด้วยสเตรปตาไวดีนที่เชื่อมต่อกับเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 เพียงอย่างเดียว ความเข้มข้นของ Aβ ในกลุ่มควบคุมคือ 420 pg/ml (ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน = 101 pg/ml)
การแสดงผลด้วยฟาจ (Phage display) ประสบความสำเร็จในการนำไปประยุกต์ใช้ในงานวิจัยทางการแพทย์หลายด้าน¹⁷ วิธีนี้ถูกนำมาใช้ในการศึกษาความหลากหลายของหลอดเลือดในร่างกาย^18,19 รวมถึงการศึกษาที่มุ่งเป้าไปที่หลอดเลือดในสมอง^{20,21,22,23,24,25,26} ในการศึกษานี้ เราได้ขยายการประยุกต์ใช้วิธีการคัดเลือกนี้ ไม่เพียงแต่สำหรับการระบุเปปไทด์ที่มุ่งเป้าไปที่หลอดเลือดในสมองโดยตรงเท่านั้น แต่ยังรวมถึงการค้นพบเปปไทด์ที่มีคุณสมบัติในการขนส่งแบบแอคทีฟเพื่อข้ามผ่านอุปสรรคเลือด-สมองด้วย เราจะอธิบายถึงการพัฒนาขั้นตอนการคัดเลือกในร่างกายในหนูทดลองที่ใส่ท่อ CM และแสดงให้เห็นถึงศักยภาพในการระบุเปปไทด์ที่มีคุณสมบัติในการมุ่งเป้าไปยัง CSF โดยใช้ฟาจ T7 ที่แสดงไลบรารีของเปปไทด์แบบสุ่ม 12-mer เราสามารถแสดงให้เห็นว่าฟาจ T7 มีขนาดเล็กพอ (เส้นผ่านศูนย์กลางประมาณ 60 นาโนเมตร)¹⁰ ที่จะปรับตัวให้เข้ากับอุปสรรคเลือด-สมองได้ จึงสามารถข้ามผ่านอุปสรรคเลือด-สมองหรือคอรอยด์เพล็กซัสได้โดยตรง เราพบว่าการเก็บน้ำไขสันหลัง (CSF) จากหนู CM ที่ใส่ท่อเข้าไปในสมอง เป็นวิธีการคัดกรองการทำงานในร่างกายที่ควบคุมได้ดี และพบว่าฟาจที่สกัดได้ไม่เพียงแต่จับกับหลอดเลือดเท่านั้น แต่ยังทำหน้าที่เป็นตัวขนส่งผ่านกำแพงเลือด-สมองอีกด้วย ยิ่งไปกว่านั้น การเก็บเลือดพร้อมกันและใช้ HTS กับฟาจในน้ำไขสันหลังและเลือด ทำให้เรายืนยันได้ว่าการเลือกใช้น้ำไขสันหลังของเราไม่ได้รับอิทธิพลจากการเพิ่มจำนวนของฟาจในเลือดหรือความเหมาะสมสำหรับการขยายตัวระหว่างรอบการคัดเลือก อย่างไรก็ตาม ส่วนของเลือดเป็นส่วนหนึ่งของกระบวนการคัดเลือก เนื่องจากฟาจที่สามารถเข้าถึงน้ำไขสันหลังได้จะต้องมีชีวิตรอดและไหลเวียนอยู่ในกระแสเลือดนานพอที่จะเพิ่มจำนวนในสมองได้ เพื่อให้ได้ข้อมูลลำดับที่เชื่อถือได้จากข้อมูล HTS ดิบ เราจึงใช้ตัวกรองที่ปรับให้เข้ากับข้อผิดพลาดในการจัดลำดับเฉพาะแพลตฟอร์มในขั้นตอนการวิเคราะห์ โดยการรวมพารามิเตอร์จลนศาสตร์เข้ากับวิธีการคัดกรอง เราได้ยืนยันเภสัชจลนศาสตร์ที่รวดเร็วของฟาจ T7 ชนิดป่า (t½ ~ 28 นาที) ในเลือด24, 27, 28 และยังกำหนดครึ่งชีวิตของฟาจในน้ำไขสันหลัง (t½ ~ 26 นาทีต่อนาที) แม้ว่าจะมีโปรไฟล์เภสัชจลนศาสตร์ที่คล้ายคลึงกันในเลือดและน้ำไขสันหลัง แต่ตรวจพบความเข้มข้นของฟาจในเลือดเพียง 0.001% ในน้ำไขสันหลัง ซึ่งบ่งชี้ถึงการเคลื่อนที่ของฟาจ T7 ชนิดป่าในระดับต่ำข้ามกำแพงเลือดสมอง งานวิจัยนี้เน้นย้ำถึงความสำคัญของการคัดเลือกในรอบแรกเมื่อใช้กลยุทธ์การแพนนิ่งในร่างกาย โดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับระบบฟาจที่ถูกกำจัดออกจากระบบไหลเวียนโลหิตอย่างรวดเร็ว เนื่องจากมีโคลนเพียงไม่กี่ตัวเท่านั้นที่สามารถเข้าถึงส่วนของระบบประสาทส่วนกลางได้ ดังนั้น ในรอบแรก การลดลงของความหลากหลายของไลบรารีจึงมีมาก เนื่องจากมีเพียงโคลนจำนวนจำกัดเท่านั้นที่ถูกรวบรวมไว้ในที่สุดในแบบจำลองน้ำไขสันหลังที่เข้มงวดมากนี้ กลยุทธ์การคัดเลือกแบบ in vivo นี้ประกอบด้วยขั้นตอนการคัดเลือกหลายขั้นตอน เช่น การสะสมอย่างมีประสิทธิภาพในช่อง CSF การอยู่รอดของโคลนในช่องเลือด และการกำจัดโคลน T7 phage ออกจากเลือดอย่างรวดเร็วภายใน 10 นาทีแรก (รูปที่ 1d และรูปประกอบเพิ่มเติมที่ 4M) ดังนั้น หลังจากรอบแรก โคลน phage ที่แตกต่างกันถูกระบุใน CSF แม้ว่าจะใช้กลุ่มเริ่มต้นเดียวกันสำหรับสัตว์แต่ละตัวก็ตาม นี่แสดงให้เห็นว่าขั้นตอนการคัดเลือกที่เข้มงวดหลายขั้นตอนสำหรับไลบรารีต้นทางที่มีสมาชิกไลบรารีจำนวนมากส่งผลให้ความหลากหลายลดลงอย่างมาก ดังนั้น เหตุการณ์สุ่มจะกลายเป็นส่วนสำคัญของกระบวนการคัดเลือกเริ่มต้น ซึ่งส่งผลต่อผลลัพธ์อย่างมาก เป็นไปได้ว่าโคลนจำนวนมากในไลบรารีดั้งเดิมมีแนวโน้มการเพิ่มจำนวนใน CSF ที่คล้ายคลึงกันมาก อย่างไรก็ตาม แม้ภายใต้เงื่อนไขการทดลองเดียวกัน ผลการคัดเลือกอาจแตกต่างกันเนื่องจากจำนวนโคลนแต่ละชนิดในกลุ่มเริ่มต้นมีจำนวนน้อย
ลวดลายที่พบมากในน้ำไขสันหลังแตกต่างจากลวดลายที่พบในเลือด ที่น่าสนใจคือ เราสังเกตเห็นการเปลี่ยนแปลงครั้งแรกไปสู่เปปไทด์ที่อุดมไปด้วยไกลซีนในเลือดของสัตว์แต่ละตัว (รูปที่ 1g, รูปประกอบเพิ่มเติม 4e, 4f) ฟาจที่มีเปปไทด์ไกลซีนอาจมีความเสถียรมากกว่าและมีโอกาสน้อยที่จะถูกกำจัดออกจากระบบไหลเวียนโลหิต อย่างไรก็ตาม ไม่พบเปปไทด์ที่อุดมไปด้วยไกลซีนเหล่านี้ในตัวอย่างน้ำไขสันหลัง ซึ่งบ่งชี้ว่าไลบรารีที่คัดสรรมานั้นผ่านขั้นตอนการคัดเลือกสองขั้นตอนที่แตกต่างกัน คือ ขั้นตอนหนึ่งในเลือดและอีกขั้นตอนหนึ่งที่ปล่อยให้สะสมในน้ำไขสันหลัง โคลนที่พบมากในน้ำไขสันหลังซึ่งได้จากการคัดเลือกรอบที่สี่ได้รับการทดสอบอย่างละเอียด โคลนที่ทดสอบแต่ละตัวเกือบทั้งหมดได้รับการยืนยันว่ามีปริมาณมากในน้ำไขสันหลังเมื่อเทียบกับฟาจควบคุมว่างเปล่า เปปไทด์ที่ได้ผลหนึ่งตัว (#2077) ได้รับการตรวจสอบอย่างละเอียดมากขึ้น พบว่าเปปไทด์นี้มีครึ่งชีวิตในพลาสมาที่ยาวนานกว่าเมื่อเทียบกับเปปไทด์อื่นๆ (รูปที่ 3d และรูปประกอบเพิ่มเติมที่ 7) และที่น่าสนใจคือ เปปไทด์นี้มีกรดอะมิโนซิสทีนอยู่ที่ปลาย C-terminus เมื่อเร็วๆ นี้มีการแสดงให้เห็นว่าการเพิ่มซิสทีนลงในเปปไทด์สามารถปรับปรุงคุณสมบัติทางเภสัชจลนศาสตร์ได้โดยการจับกับอัลบูมิน 29 ซึ่งในปัจจุบันยังไม่ทราบแน่ชัดสำหรับเปปไทด์หมายเลข 2077 และจำเป็นต้องมีการศึกษาเพิ่มเติม เปปไทด์บางชนิดแสดงให้เห็นถึงการพึ่งพาค่าวาเลนซ์ในการเพิ่มความเข้มข้นใน CSF (ข้อมูลไม่ได้แสดงไว้) ซึ่งอาจเกี่ยวข้องกับรูปทรงเรขาคณิตของพื้นผิวแคปซิด T7 ที่แสดงออกมา ระบบ T7 ที่เราใช้แสดงให้เห็นว่ามีเปปไทด์แต่ละชนิด 5-15 สำเนาต่ออนุภาคฟาจ ได้ทำการทดสอบ IHC กับโคลนฟาจตัวนำที่ฉีดเข้าทางหลอดเลือดดำในเปลือกสมองของหนู (รูปประกอบเพิ่มเติมที่ 8) ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าโคลนอย่างน้อยสามตัว (หมายเลข 2002, หมายเลข 2009 และหมายเลข 2077) มีปฏิสัมพันธ์กับ BBB ยังคงต้องพิจารณาต่อไปว่าปฏิสัมพันธ์กับ BBB นี้ส่งผลให้เกิดการสะสมของ CSF หรือการเคลื่อนที่ของโคลนเหล่านี้ไปยัง BCSFB โดยตรงหรือไม่ ที่สำคัญ เราแสดงให้เห็นว่าเปปไทด์ที่เลือกไว้ยังคงความสามารถในการขนส่ง CSF เมื่อถูกสังเคราะห์และจับกับโปรตีนเป้าหมาย การจับกันของเปปไทด์ที่ติดไบโอตินที่ปลาย N กับ SA นั้นให้ผลลัพธ์ที่คล้ายคลึงกับที่ได้จากโคลนฟาจในเลือดและน้ำไขสันหลัง (รูปที่ 3e) สุดท้าย เราแสดงให้เห็นว่าเปปไทด์นำร่องหมายเลข 2077 สามารถส่งเสริมการทำงานของสารยับยั้ง BACE1 ที่ติดไบโอตินซึ่งเชื่อมต่อกับ SA ในสมอง ทำให้เกิดผลทางเภสัชพลศาสตร์ที่เด่นชัดในระบบประสาทส่วนกลางโดยการลดระดับ Abeta40 ใน CSF อย่างมีนัยสำคัญ (รูปที่ 4) เราไม่สามารถระบุโฮโมล็อกใดๆ ในฐานข้อมูลได้โดยการค้นหาความคล้ายคลึงของลำดับเปปไทด์จากผลลัพธ์ทั้งหมด สิ่งสำคัญที่ควรทราบคือ ขนาดของไลบรารี T7 มีประมาณ 109 ในขณะที่ขนาดไลบรารีตามทฤษฎีสำหรับ 12-เมอร์ คือ 4 x 1015 ดังนั้น เราจึงเลือกเพียงส่วนเล็กๆ ของพื้นที่ความหลากหลายของไลบรารีเปปไทด์ 12-เมอร์ ซึ่งอาจหมายความว่าสามารถระบุเปปไทด์ที่เหมาะสมยิ่งขึ้นได้โดยการประเมินพื้นที่ลำดับที่อยู่ติดกันของผลลัพธ์ที่ระบุเหล่านี้ ในทางทฤษฎี หนึ่งในเหตุผลที่เราไม่พบโฮโมล็อกตามธรรมชาติของเปปไทด์เหล่านี้ อาจเป็นเพราะการคัดเลือกที่ไม่เหมาะสมในระหว่างวิวัฒนาการเพื่อป้องกันการเข้าสู่สมองอย่างไม่สามารถควบคุมได้ของโมทีฟเปปไทด์บางอย่าง
โดยรวมแล้ว ผลลัพธ์ของเราเป็นพื้นฐานสำหรับการทำงานในอนาคตเพื่อระบุและจำแนกระบบการขนส่งของสิ่งกีดขวางหลอดเลือดสมองในร่างกายอย่างละเอียดมากขึ้น โครงสร้างพื้นฐานของวิธีการนี้ขึ้นอยู่กับกลยุทธ์การคัดเลือกเชิงฟังก์ชัน ซึ่งไม่เพียงแต่ระบุโคลนที่มีคุณสมบัติการจับกับหลอดเลือดสมองเท่านั้น แต่ยังรวมถึงขั้นตอนสำคัญที่โคลนที่ประสบความสำเร็จมีกิจกรรมโดยธรรมชาติในการข้ามสิ่งกีดขวางทางชีวภาพในร่างกายเข้าสู่ส่วนของระบบประสาทส่วนกลาง คือการอธิบายกลไกการขนส่งของเปปไทด์เหล่านี้และความชอบในการจับกับหลอดเลือดฝอยเฉพาะในบริเวณสมอง ซึ่งอาจนำไปสู่การค้นพบเส้นทางใหม่สำหรับการขนส่งของ BBB และตัวรับ เราคาดว่าเปปไทด์ที่ระบุสามารถจับกับตัวรับหลอดเลือดสมองโดยตรงหรือกับลิแกนด์ที่ไหลเวียนซึ่งขนส่งผ่าน BBB หรือ BCSFB เวกเตอร์เปปไทด์ที่มีกิจกรรมการขนส่ง CSF ที่ค้นพบในงานนี้จะได้รับการตรวจสอบเพิ่มเติม ขณะนี้เรากำลังตรวจสอบความจำเพาะของสมองของเปปไทด์เหล่านี้สำหรับความสามารถในการข้าม BBB และ/หรือ BCSFB เปปไทด์ใหม่เหล่านี้จะเป็นเครื่องมือที่มีคุณค่าอย่างยิ่งสำหรับการค้นพบตัวรับหรือวิถีการทำงานใหม่ๆ และสำหรับการพัฒนาแพลตฟอร์มใหม่ที่มีประสิทธิภาพสูงสำหรับการนำส่งโมเลกุลขนาดใหญ่ เช่น สารชีวภาพ ไปยังสมอง
ทำการสอดท่อเข้าไปในโพรงน้ำไขสันหลังขนาดใหญ่ (CM) โดยดัดแปลงวิธีการที่เคยอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ใช้หนูวิสตาร์ (200-350 กรัม) ที่ได้รับการวางยาสลบแล้ว ตรึงไว้บนเครื่องมือผ่าตัดสมองแบบสเตอริโอแท็กซ์ และทำการผ่าตัดตรงกลางเหนือหนังศีรษะที่โกนและเตรียมอย่างปลอดเชื้อเพื่อเปิดเผยกะโหลก เจาะรูสองรูในบริเวณส่วนบนของกะโหลกและยึดสกรูยึดในรู เจาะรูเพิ่มเติมอีกหนึ่งรูที่สันกระดูกท้ายทอยด้านข้างเพื่อใช้เป็นแนวทางในการวางท่อสแตนเลสเข้าไปใน CM ทาซีเมนต์ทางทันตกรรมรอบท่อและยึดด้วยสกรู หลังจากฉายแสงและซีเมนต์แข็งตัวแล้ว จึงเย็บปิดแผลด้วยไหมเย็บ 4/0 supramid ยืนยันตำแหน่งที่ถูกต้องของท่อโดยการสังเกตการรั่วไหลของน้ำไขสันหลัง (CSF) นำหนูออกจากเครื่องมือผ่าตัดสมองแบบสเตอริโอแท็กซิก ให้การดูแลหลังผ่าตัดและการจัดการความเจ็บปวดที่เหมาะสม และปล่อยให้พักฟื้นอย่างน้อยหนึ่งสัปดาห์จนกว่าจะพบสัญญาณของเลือดในน้ำไขสันหลัง หนูวิสตาร์ (Crl:WI/Han) ได้รับจาก Charles River (ฝรั่งเศส) หนูทุกตัวถูกเลี้ยงไว้ในสภาพแวดล้อมปลอดเชื้อโรคเฉพาะ การทดลองกับสัตว์ทั้งหมดได้รับการอนุมัติจากสำนักงานสัตวแพทย์ของเมืองบาเซิล ประเทศสวิตเซอร์แลนด์ และดำเนินการตามใบอนุญาตสัตว์หมายเลข 2474 (การประเมินการขนส่งสารในสมองโดยการวัดระดับสารที่อาจใช้ในการรักษาในน้ำไขสันหลังและสมองของหนู)
ค่อยๆประคองหนูให้มีสติโดยถือท่อ CM ไว้ในมือ นำ Datura ออกจากท่อและเก็บน้ำไขสันหลังที่ไหลออกมาเอง 10 ไมโครลิตร เนื่องจากในที่สุดท่อก็ไม่สามารถเปิดได้ จึงได้คัดเลือกเฉพาะตัวอย่างน้ำไขสันหลังที่ใส ไม่มีร่องรอยการปนเปื้อนของเลือดหรือการเปลี่ยนสีมาใช้ในการศึกษาครั้งนี้ ในขณะเดียวกัน ก็ได้ทำการเก็บเลือดประมาณ 10-20 ไมโครลิตรจากแผลเล็กๆ ที่ปลายหางใส่หลอดที่มีเฮปาริน (Sigma-Aldrich) เก็บน้ำไขสันหลังและเลือดในช่วงเวลาต่างๆ หลังจากการฉีด T7 phage เข้าทางหลอดเลือดดำ ทิ้งของเหลวประมาณ 5-10 ไมโครลิตรก่อนเก็บตัวอย่างน้ำไขสันหลังแต่ละครั้ง ซึ่งตรงกับปริมาตรของเหลวที่เหลืออยู่ในท่อ
มีการสร้างไลบรารีโดยใช้เวกเตอร์ T7Select 10-3b ตามที่อธิบายไว้ในคู่มือระบบ T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996) โดยสรุปคือ มีการสังเคราะห์ชิ้นส่วน DNA แบบสุ่มขนาด 12 เมอร์ในรูปแบบดังต่อไปนี้:
ใช้โคดอน NNK เพื่อหลีกเลี่ยงโคดอนหยุดคู่และการแสดงออกของกรดอะมิโนมากเกินไปในส่วนแทรก N คืออัตราส่วนโมลเท่ากันที่ผสมด้วยมือของนิวคลีโอไทด์แต่ละชนิด และ K คืออัตราส่วนโมลเท่ากันที่ผสมด้วยมือของนิวคลีโอไทด์อะดีนีนและไซโตซีน บริเวณสายเดี่ยวถูกแปลงเป็นดีเอ็นเอสายคู่โดยการบ่มเพิ่มเติมกับ dNTP (Novagen) และเอนไซม์ Klenow (New England Biolabs) ในบัฟเฟอร์ Klenow (New England Biolabs) เป็นเวลา 3 ชั่วโมงที่ 37°C หลังจากปฏิกิริยา ดีเอ็นเอสายคู่ถูกแยกออกมาโดยการตกตะกอนด้วยเอทานอล ดีเอ็นเอที่ได้ถูกย่อยด้วยเอนไซม์ตัดจำเพาะ EcoRI และ HindIII (ทั้งสองจาก Roche) จากนั้น นำชิ้นส่วนที่ถูกตัดและทำให้บริสุทธิ์ (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) มาเชื่อมต่อเข้ากับเวกเตอร์ T7 ที่ถูกตัดไว้ก่อนแล้ว โดยเชื่อมต่อที่กรดอะมิโนลำดับที่ 348 ของยีนแคปซิด 10B ปฏิกิริยาการเชื่อมต่อถูกบ่มที่อุณหภูมิ 16°C เป็นเวลา 18 ชั่วโมงก่อนการบรรจุในหลอดทดลอง การบรรจุฟาจในหลอดทดลองดำเนินการตามคำแนะนำที่ให้มาพร้อมกับชุดโคลนนิ่ง T7Select 10-3b (Novagen) และสารละลายที่ใช้ในการบรรจุถูกขยายจำนวนหนึ่งครั้งจนเกิดการแตกตัวโดยใช้ Escherichia coli (BLT5615, Novagen) สารละลายที่ได้ถูกนำไปปั่นเหวี่ยง ไตเตรท และแช่แข็งที่อุณหภูมิ -80°C เพื่อใช้เป็นสารละลายสต็อกในกลีเซอรอล
การขยายดีเอ็นเอโดยตรงด้วยวิธี PCR ของบริเวณตัวแปรของฟาจที่ขยายในน้ำซุปหรือจานเพาะเชื้อโดยใช้ไพรเมอร์ฟิวชั่นแอมพลิคอน 454/Roche ที่เป็นกรรมสิทธิ์ ไพรเมอร์ฟิวชั่นตัวหน้าประกอบด้วยลำดับที่ขนาบข้างบริเวณตัวแปร (NNK) 12 (จำเพาะต่อแม่แบบ), GS FLX Titanium Adapter A และลำดับคีย์ไลบรารีสี่เบส (TCAG) (ภาพประกอบเพิ่มเติม 1a):
ไพรเมอร์ฟิวชั่นย้อนกลับยังประกอบด้วยไบโอตินที่ติดอยู่กับลูกปัดจับยึด และอะแดปเตอร์ไทเทเนียม GS FLX B ที่จำเป็นสำหรับการขยายโคลนระหว่างการทำ PCR แบบอิมัลชัน:
จากนั้น นำแอมพลิคอนไปทำการลำดับเบสด้วยวิธีไพโรซีเควนซิง 454/Roche ตามโปรโตคอล 454 GS-FLX Titanium สำหรับการลำดับเบสแบบแซงเกอร์ด้วยมือ (เครื่องวิเคราะห์ดีเอ็นเอ Applied Biosystems Hitachi 3730 xl) ดีเอ็นเอของฟาจ T7 ถูกขยายด้วยวิธี PCR และลำดับเบสโดยใช้คู่ไพรเมอร์ดังต่อไปนี้:
นำชิ้นส่วนจากแต่ละแผ่นเพลทไปทำการเพิ่มปริมาณด้วยวิธี PCR โดยใช้ชุดอุปกรณ์ Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (ตามคำแนะนำของผู้ผลิต) ทำการเริ่มต้นด้วยความร้อน (10 นาทีที่ 95 °C) และเพิ่มรอบการทำงาน 35 รอบ (50 วินาทีที่ 95 °C, 1 นาทีที่ 50 °C และ 1 นาทีที่ 72 °C)
ทำการเพิ่มจำนวนฟาจจากไลบรารี ฟาจชนิดดั้งเดิม ฟาจที่กู้คืนจากน้ำไขสันหลังและเลือด หรือโคลนแต่ละตัวในแบคทีเรีย Escherichia coli BL5615 ในน้ำซุป TB (Sigma Aldrich) หรือในจานเพาะเลี้ยงขนาด 500 ตารางเซนติเมตร (Thermo Scientific) เป็นเวลา 4 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37°C จากนั้นสกัดฟาจออกจากจานเพาะเลี้ยงโดยการล้างจานด้วยบัฟเฟอร์ Tris-EDTA (Fluka Analytical) หรือโดยการเก็บพลากด้วยปลายปิเปตที่ผ่านการฆ่าเชื้อแล้ว แยกฟาจออกจากสารละลายส่วนบนของวัฒนธรรมหรือบัฟเฟอร์สกัดด้วยการตกตะกอนโพลีเอทิลีนไกลคอล (PEG 8000) หนึ่งรอบ (Promega) และละลายใหม่ในบัฟเฟอร์ Tris-EDTA
ฟาจที่เพิ่มจำนวนแล้วจะถูกกำจัดเอนโดท็อกซิน 2-3 รอบโดยใช้ลูกปัดกำจัดเอนโดท็อกซิน (Miltenyi Biotec) ก่อนฉีดเข้าทางหลอดเลือดดำ (IV) (500 ไมโครลิตร/ตัว) ในรอบแรก จะฉีดฟาจ 2×10¹² ตัว ในรอบที่สอง 2×10¹⁰ ตัว และในรอบที่สามและสี่ 2×10⁹ ตัวต่อสัตว์หนึ่งตัว ปริมาณฟาจในน้ำไขสันหลังและตัวอย่างเลือดที่เก็บในเวลาที่กำหนดจะถูกกำหนดโดยการนับพลากตามคำแนะนำของผู้ผลิต (คู่มือระบบ T7Select) การคัดเลือกฟาจทำได้โดยการฉีดไลบรารีที่บริสุทธิ์แล้วเข้าทางหลอดเลือดดำที่หาง หรือโดยการฉีดฟาจที่สกัดจากน้ำไขสันหลังจากรอบการคัดเลือกก่อนหน้าซ้ำ และทำการเก็บเกี่ยวตัวอย่างน้ำไขสันหลังและเลือดในเวลา 10 นาที 30 นาที 60 นาที 90 นาที 120 นาที 180 นาที และ 240 นาที ตามลำดับ มีการดำเนินการคัดเลือกแบบ in vivo ทั้งหมดสี่รอบ โดยในแต่ละรอบการคัดเลือกสามรอบแรก กิ่งก้านที่เลือกไว้สองกิ่งจะถูกเก็บและวิเคราะห์แยกกัน ชิ้นส่วนของฟาจที่สกัดจากน้ำไขสันหลังในสองรอบแรกของการคัดเลือกจะถูกนำไปวิเคราะห์ด้วยวิธี 454/Roche pyrosequencing ในขณะที่โคลนทั้งหมดที่สกัดจากน้ำไขสันหลังในสองรอบสุดท้ายของการคัดเลือกจะถูกวิเคราะห์ด้วยวิธี manual sequencer ฟาจในเลือดทั้งหมดจากรอบแรกของการคัดเลือกก็ถูกนำไปวิเคราะห์ด้วยวิธี 454/Roche pyrosequencing เช่นกัน สำหรับการฉีดโคลนฟาจ ฟาจที่เลือกไว้จะถูกขยายจำนวนใน E. coli (BL5615) บนจานขนาด 500 cm² ที่อุณหภูมิ 37°C เป็นเวลา 4 ชั่วโมง โคลนที่เลือกและวิเคราะห์ด้วยวิธี manual sequencer แต่ละตัวจะถูกเพาะเลี้ยงในอาหารเลี้ยงเชื้อ TB หลังจากสกัดฟาจ การทำให้บริสุทธิ์ และการกำจัดเอนโดท็อกซิน (ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น) แล้ว จะฉีดฟาจจำนวน 2×10¹⁰ ตัวต่อสัตว์หนึ่งตัว ในปริมาณ 300 ไมโครลิตร เข้าทางหลอดเลือดดำที่หางข้างใดข้างหนึ่ง
การประมวลผลเบื้องต้นและการกรองเชิงคุณภาพของข้อมูลลำดับ ข้อมูลดิบ 454/Roche ถูกแปลงจากรูปแบบแผนที่สตรีมมาตรฐานไบนารี (sff) เป็นรูปแบบที่มนุษย์อ่านได้ของ Pearson (fasta) โดยใช้ซอฟต์แวร์ของผู้ผลิต การประมวลผลลำดับนิวคลีโอไทด์เพิ่มเติมดำเนินการโดยใช้โปรแกรมและสคริปต์ C ที่เป็นกรรมสิทธิ์ (แพ็คเกจซอฟต์แวร์ที่ยังไม่เผยแพร่) ดังที่อธิบายไว้ด้านล่าง การวิเคราะห์ข้อมูลหลักประกอบด้วยขั้นตอนการกรองหลายขั้นตอนที่เข้มงวด เพื่อกรองอ่านที่ไม่ประกอบด้วยลำดับ DNA แทรก 12mer ที่ถูกต้อง อ่านจะถูกจัดเรียงตามลำดับกับฉลากเริ่มต้น (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT) ฉลากหยุด (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) และแทรกพื้นหลัง (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) โดยใช้การทดสอบ Needleman-Wunsch ทั่วโลก การจัดเรียงที่อนุญาตให้มีความไม่สอดคล้องกันได้สูงสุด 2 รายการต่อการจัดเรียง31 ดังนั้น ข้อมูลการอ่านที่ไม่มีแท็กเริ่มต้นและแท็กสิ้นสุด และข้อมูลการอ่านที่มีส่วนแทรกพื้นหลัง กล่าวคือ การจัดเรียงที่เกินจำนวนความคลาดเคลื่อนที่อนุญาต จะถูกลบออกจากไลบรารี สำหรับข้อมูลการอ่านที่เหลือ ลำดับดีเอ็นเอ N-mer ที่ขยายจากเครื่องหมายเริ่มต้นและสิ้นสุดก่อนเครื่องหมายหยุด จะถูกตัดออกจากลำดับการอ่านดั้งเดิมและประมวลผลเพิ่มเติม (ต่อไปนี้เรียกว่า “ส่วนแทรก”) หลังจากแปลส่วนแทรกแล้ว ส่วนที่อยู่หลังรหัสหยุดแรกที่ปลาย 5′ ของไพรเมอร์จะถูกลบออกจากส่วนแทรก นอกจากนี้ นิวคลีโอไทด์ที่นำไปสู่รหัสที่ไม่สมบูรณ์ที่ปลาย 3′ ของไพรเมอร์ก็ถูกลบออกด้วย เพื่อไม่ให้มีส่วนแทรกที่มีเฉพาะลำดับพื้นหลัง ส่วนแทรกที่แปลแล้วซึ่งเริ่มต้นด้วยรูปแบบกรดอะมิโน “PAG” ก็ถูกลบออกเช่นกัน เปปไทด์ที่มีความยาวหลังการแปลน้อยกว่า 3 กรดอะมิโนจะถูกลบออกจากไลบรารี สุดท้าย ลบความซ้ำซ้อนในกลุ่มส่วนแทรกและกำหนดความถี่ของส่วนแทรกที่ไม่ซ้ำกันแต่ละรายการ ผลลัพธ์ของการวิเคราะห์นี้ประกอบด้วยรายการลำดับนิวคลีโอไทด์ (ส่วนแทรก) และความถี่ (การอ่าน) ของลำดับเหล่านั้น (ภาพประกอบเพิ่มเติม 1c และ 2)
จัดกลุ่มชิ้นส่วน DNA N-mer ตามความคล้ายคลึงของลำดับ: เพื่อกำจัดข้อผิดพลาดในการจัดลำดับเฉพาะของ 454/Roche (เช่น ปัญหาในการจัดลำดับส่วนขยายโฮโมพอลิเมอร์) และลบส่วนที่ซ้ำซ้อนที่ไม่สำคัญ ชิ้นส่วน DNA N-mer ที่ผ่านการกรองแล้ว (ชิ้นส่วนแทรก) จะถูกจัดเรียงตามความคล้ายคลึง (อนุญาตให้มีเบสที่ไม่ตรงกันได้สูงสุด 2 เบส) โดยใช้อัลกอริทึมแบบวนซ้ำที่กำหนดไว้ดังนี้: ชิ้นส่วนแทรกจะถูกจัดเรียงก่อนตามความถี่ (สูงสุดไปต่ำสุด) และหากเหมือนกัน จะจัดเรียงใหม่ตามความยาว (ยาวที่สุดไปสั้นที่สุด) ดังนั้น ชิ้นส่วนแทรกที่พบบ่อยที่สุดและยาวที่สุดจะกำหนด "กลุ่ม" แรก ความถี่ของกลุ่มจะถูกตั้งค่าเป็นความถี่หลัก จากนั้น ชิ้นส่วนแทรกแต่ละชิ้นที่เหลืออยู่ในรายการที่จัดเรียงแล้วจะถูกพยายามเพิ่มเข้าไปในกลุ่มโดยการจัดเรียงแบบ Needleman-Wunsch แบบจับคู่ หากจำนวนความไม่ตรงกัน การแทรก หรือการลบในการจัดเรียงไม่เกินเกณฑ์ 2 ชิ้นส่วนแทรกจะถูกเพิ่มเข้าไปในกลุ่ม และความถี่โดยรวมของกลุ่มจะเพิ่มขึ้นตามจำนวนครั้งที่ชิ้นส่วนแทรกถูกเพิ่มเข้าไป ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เพิ่มเข้าไปในกลุ่มจะถูกทำเครื่องหมายว่าใช้งานแล้วและถูกยกเว้นจากการประมวลผลเพิ่มเติม หากลำดับนิวคลีโอไทด์ไม่สามารถเพิ่มเข้าไปในกลุ่มที่มีอยู่แล้วได้ ลำดับนิวคลีโอไทด์นั้นจะถูกนำไปใช้สร้างกลุ่มใหม่ที่มีความถี่ของลำดับนิวคลีโอไทด์ที่เหมาะสมและทำเครื่องหมายว่าใช้งานแล้ว กระบวนการจะสิ้นสุดลงเมื่อลำดับนิวคลีโอไทด์แต่ละตัวถูกนำไปใช้สร้างกลุ่มใหม่หรือสามารถรวมอยู่ในกลุ่มที่มีอยู่แล้วได้ ในที่สุด ลำดับนิวคลีโอไทด์ที่จัดกลุ่มไว้จะถูกแปลเป็นลำดับเปปไทด์ (ไลบรารีเปปไทด์) ผลลัพธ์ของการวิเคราะห์นี้คือชุดของลำดับนิวคลีโอไทด์และความถี่ที่สอดคล้องกัน ซึ่งประกอบกันเป็นจำนวนของลำดับการอ่านที่ต่อเนื่องกัน (ภาพประกอบเพิ่มเติมที่ 2)
การสร้างโมทีฟ: จากรายการของเปปไทด์ที่ไม่ซ้ำกัน ได้มีการสร้างไลบรารีที่มีรูปแบบกรดอะมิโน (aa) ที่เป็นไปได้ทั้งหมด ดังแสดงด้านล่าง แต่ละรูปแบบที่เป็นไปได้ที่มีความยาว 3 จะถูกดึงออกมาจากเปปไทด์ และเพิ่มรูปแบบผกผันของมันเข้าไป พร้อมกับไลบรารีโมทีฟทั่วไปที่มีรูปแบบทั้งหมด (ไตรเปปไทด์) ไลบรารีของโมทีฟที่มีการทำซ้ำสูงจะถูกจัดลำดับและลบส่วนที่ซ้ำซ้อนออก จากนั้น สำหรับแต่ละไตรเปปไทด์ในไลบรารีโมทีฟ เราจะตรวจสอบการมีอยู่ของมันในไลบรารีโดยใช้เครื่องมือคำนวณ ในกรณีนี้ ความถี่ของเปปไทด์ที่มีไตรเปปไทด์โมทีฟที่พบจะถูกเพิ่มและกำหนดให้กับโมทีฟในไลบรารีโมทีฟ (“จำนวนโมทีฟ”) ผลลัพธ์ของการสร้างโมทีฟคืออาร์เรย์สองมิติที่มีการเกิดขึ้นทั้งหมดของไตรเปปไทด์ (โมทีฟ) และค่าที่เกี่ยวข้อง ซึ่งก็คือจำนวนการอ่านลำดับที่ส่งผลให้เกิดโมทีฟที่สอดคล้องกัน เมื่อการอ่านถูกกรอง จัดกลุ่ม และแปล เมตริกต่างๆ อธิบายไว้โดยละเอียดข้างต้น
การปรับค่าจำนวนลวดลายและแผนภาพกระจายที่เกี่ยวข้องให้เป็นมาตรฐาน: จำนวนลวดลายสำหรับแต่ละตัวอย่างได้รับการปรับค่าให้เป็นมาตรฐานโดยใช้
โดยที่ ni คือจำนวนอ่านที่มีหัวข้อ i ดังนั้น vi จึงแสดงถึงความถี่ร้อยละของอ่าน (หรือเปปไทด์) ที่มีโมทีฟ i ในตัวอย่าง ค่า p สำหรับจำนวนโมทีฟที่ไม่ได้รับการปรับค่ามาตรฐานคำนวณโดยใช้การทดสอบความแม่นยำของฟิชเชอร์ ส่วนสหสัมพันธ์ของจำนวนโมทีฟนั้น คำนวณค่าสหสัมพันธ์ของสเปียร์แมนโดยใช้จำนวนโมทีฟที่ได้รับการปรับค่ามาตรฐานด้วยโปรแกรม R
เพื่อแสดงภาพเนื้อหาของกรดอะมิโนในแต่ละตำแหน่งของไลบรารีเปปไทด์ จึงได้สร้างเว็บล็อกโกแกรม 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) ขึ้นมา ขั้นแรก เนื้อหาของกรดอะมิโนในแต่ละตำแหน่งของเปปไทด์ 12-mer จะถูกเก็บไว้ในเมทริกซ์ 20×12 จากนั้น ชุดเปปไทด์ 1000 ตัวที่มีเนื้อหากรดอะมิโนสัมพัทธ์เท่ากันในแต่ละตำแหน่งจะถูกสร้างขึ้นในรูปแบบลำดับ fasta และป้อนเป็นอินพุตให้กับเว็บล็อกโกแกรม 3 ซึ่งจะสร้างภาพกราฟิกแสดงเนื้อหากรดอะมิโนสัมพัทธ์ในแต่ละตำแหน่งสำหรับไลบรารีเปปไทด์ที่กำหนด เพื่อแสดงภาพชุดข้อมูลหลายมิติ จึงได้สร้างฮีทแมปโดยใช้เครื่องมือที่พัฒนาขึ้นภายในใน R (biosHeatmap ซึ่งเป็นแพ็กเกจ R ที่ยังไม่เปิดตัว) เดนโดแกรมที่แสดงในฮีทแมปคำนวณโดยใช้วิธีการจัดกลุ่มแบบลำดับชั้นของ Ward โดยใช้เมตริกซ์ระยะทางแบบยูคลิด สำหรับการวิเคราะห์ทางสถิติของข้อมูลการให้คะแนนลวดลาย ค่า P สำหรับการให้คะแนนที่ไม่ได้รับการปรับค่ามาตรฐานจะคำนวณโดยใช้การทดสอบ Fisher's exact test ส่วนค่า P สำหรับชุดข้อมูลอื่นๆ จะคำนวณใน R โดยใช้การทดสอบ Student's t-test หรือ ANOVA
โคลนฟาจที่คัดเลือกและฟาจที่ไม่มีสารแทรกถูกฉีดเข้าทางหลอดเลือดดำที่หาง (2×10¹⁰ ฟาจ/ตัว ใน PBS 300 ไมโครลิตร) สิบนาทีก่อนการฉีดสารละลายและการตรึงเนื้อเยื่อ สัตว์ทดลองกลุ่มเดียวกันนี้ได้รับการฉีดเลคตินที่ติดฉลาก DyLight594 (Vector Laboratories Inc., DL-1177) ปริมาณ 100 ไมโครลิตร เข้าทางหลอดเลือดดำ 60 นาทีหลังจากการฉีดฟาจ หนูทดลองได้รับการฉีดสารละลาย PBS 50 มิลลิลิตร ตามด้วยสารละลาย PFA 4% ใน PBS 50 มิลลิลิตร ตัวอย่างสมองได้รับการตรึงเพิ่มเติมในสารละลาย PFA 4% ใน PBS ค้างคืน และแช่ในสารละลายซูโครส 30% ค้างคืนที่อุณหภูมิ 4°C ตัวอย่างถูกแช่แข็งอย่างรวดเร็วในสารละลาย OCT การวิเคราะห์ทางอิมมูโนฮิสโตเคมีของตัวอย่างแช่แข็งดำเนินการที่อุณหภูมิห้องบนชิ้นเนื้อแช่แข็งขนาด 30 µm ที่ปิดกั้นด้วย BSA 1% และบ่มด้วยแอนติบอดีโพลีโคลนอลที่ติดฉลาก FITC ต่อต้าน T7 phage (Novus NB 600-376A) ที่ 4 °C บ่มข้ามคืน สุดท้าย ล้างชิ้นเนื้อ 3 ครั้งด้วย PBS และตรวจสอบด้วยกล้องจุลทรรศน์เลเซอร์คอนโฟคอล (Leica TCS SP5)
เปปไทด์ทั้งหมดที่มีความบริสุทธิ์อย่างน้อย 98% ถูกสังเคราะห์โดย GenScript USA และผ่านกระบวนการไบโอติไนเลชันและทำให้แห้งด้วยวิธีแช่แข็ง ไบโอตินถูกเชื่อมต่อผ่านตัวเชื่อมไกลซีนสามตัวเพิ่มเติมที่ปลาย N-terminus ตรวจสอบเปปไทด์ทั้งหมดโดยใช้แมสสเปกโทรเมตรี
สเตรปตาไวดีน (Sigma S0677) ถูกผสมกับเปปไทด์ที่ติดไบโอตินในปริมาณที่มากกว่า 5 เท่า หรือเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ที่ติดไบโอติน หรือส่วนผสม (อัตราส่วน 3:1) ของเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ที่ติดไบโอตินและเปปไทด์ยับยั้ง BACE1 ใน DMSO 5–10% / บ่มใน PBS เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้องก่อนฉีด เปปไทด์ที่จับกับสเตรปตาไวดีนถูกฉีดเข้าทางหลอดเลือดดำในปริมาณ 10 มก./กก. เข้าที่เส้นเลือดหางของหนูที่มีโพรงสมอง
ความเข้มข้นของสารเชิงซ้อนสเตรปตาไวดีน-เปปไทด์ถูกประเมินโดยวิธี ELISA แผ่นไมโครไทเตอร์ Nunc Maxisorp (Sigma) ถูกเคลือบด้วยแอนติบอดีต่อต้านสเตรปตาไวดีนจากหนู (Thermo, MA1-20011) ความเข้มข้น 1.5 μg/ml ค้างคืนที่อุณหภูมิ 4°C หลังจากทำการบล็อก (บัฟเฟอร์บล็อก: 140 nM NaCl, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% เจลาติน, 1% BSA) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมง ล้างแผ่นด้วย 0.05% Tween-20/PBS (บัฟเฟอร์ล้าง) เป็นเวลา 3 วินาที จากนั้นเติมตัวอย่าง CSF และพลาสมาลงในหลุมที่เจือจางด้วยบัฟเฟอร์บล็อก (พลาสมา 1:10,000, CSF 1:115) จากนั้น นำเพลทไปบ่มค้างคืนที่อุณหภูมิ 4°C ร่วมกับแอนติบอดีตรวจจับ (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239) หลังจากการล้างสามครั้ง ตรวจจับสเตรปตาไวดีนโดยการบ่มในสารละลายซับสเตรต TMB (Roche) นานสูงสุด 20 นาที หลังจากหยุดการพัฒนาสีด้วย 1M H2SO4 แล้ว วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 nm
การทำงานของสารเชิงซ้อนสเตรปตาไวดีน-เปปไทด์-สารยับยั้ง BACE1 ถูกประเมินโดยวิธี Aβ(1-40) ELISA ตามโปรโตคอลของผู้ผลิต (Wako, 294-64701) โดยสรุป ตัวอย่างน้ำไขสันหลังถูกเจือจางในสารละลายมาตรฐาน (1:23) และบ่มค้างคืนที่ 4°C ในจาน 96 หลุมที่เคลือบด้วยแอนติบอดีจับ BNT77 หลังจากล้าง 5 ครั้ง เติมแอนติบอดี BA27 ที่เชื่อมต่อกับ HRP และบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมงที่ 4°C ตามด้วยการล้าง 5 ครั้ง ตรวจจับ Aβ(1–40) โดยการบ่มในสารละลาย TMB เป็นเวลา 30 นาทีที่อุณหภูมิห้อง หลังจากหยุดการพัฒนาสีด้วยสารละลายหยุดแล้ว ให้วัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 450 nm ตัวอย่างพลาสมาถูกนำไปสกัดด้วยเฟสของแข็งก่อนทำการทดสอบ Aβ(1–40) ELISA พลาสมาถูกเติมลงใน DEA 0.2% (Sigma) ในจาน 96 หลุมและบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 30 นาที หลังจากล้างแผ่น SPE (Oasis, 186000679) ด้วยน้ำและเมทานอล 100% ตามลำดับแล้ว จึงเติมตัวอย่างพลาสมาลงในแผ่น SPE และกำจัดของเหลวทั้งหมดออก จากนั้นล้างตัวอย่าง (ครั้งแรกด้วยเมทานอล 5% แล้วตามด้วยเมทานอล 30%) และชะล้างด้วยสารละลาย 2% NH4OH/90% เมทานอล หลังจากอบแห้งสารละลายที่อุณหภูมิ 55°C เป็นเวลา 99 นาที โดยใช้กระแส N2 คงที่แล้ว จึงรีดิวซ์ตัวอย่างในสารเจือจางมาตรฐาน และวัด Aβ(1–40) ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น
วิธีการอ้างอิงบทความนี้: Urich, E. และคณะ การนำส่งสารไปยังสมองโดยใช้เปปไทด์นำส่งที่ระบุได้ในร่างกาย The Science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015)
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB และ Moos T. การนำส่งยาโมเลกุลขนาดใหญ่ไปยังสมองโดยใช้การบำบัดแบบกำหนดเป้าหมาย วารสารประสาทเคมี 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010)
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C. และ Martinez-Martinez, P. การนำส่งยาเปปไทด์และโปรตีนผ่านแนวกั้นเลือด-สมอง Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009)
Pardridge, WM อุปสรรคเลือด-สมอง: อุปสรรคสำคัญในการพัฒนายาสำหรับสมอง NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005)
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG และ Byrd, A. โอกาสในการปรับปรุงการนำส่งยาและการกำหนดเป้าหมายไปยังสมองผ่านทางเส้นทางคอรอยด์เพล็กซัส-CSF การวิจัยทางเภสัชกรรม 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005)
Pardridge, WM การปรับปรุงยาชีวเภสัชภัณฑ์ด้วยโมเลกุลโทรจันสำหรับการส่งยาเข้าสู่สมอง Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008)
Pardridge, การขนส่งเปปไทด์ผ่านตัวรับ WM ข้ามกำแพงเลือดสมอง Endocr Rev. 7, 314–330 (1986)
Niewoehner, J. และคณะ เพิ่มการแทรกซึมเข้าสู่สมองและประสิทธิภาพของแอนติบอดีบำบัดโดยใช้โมเลกุลนำส่งแบบโมโนวาเลนต์ Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014)
Bien-Lee, N. และคณะ การขนส่งตัวรับทรานสเฟอร์ริน (TfR) กำหนดการดูดซึมของแอนติบอดี TfR ชนิดต่างๆ เข้าสู่สมอง J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014)