Misaotra anao nitsidika ny Nature.com. Mampiasa dikan-tranonkala misy fanohanana CSS voafetra ianao. Ho an'ny traikefa tsara indrindra, manoro hevitra anao izahay hampiasa navigateur nohavaozina (na hanafoana ny Compatibility Mode ao amin'ny Internet Explorer). Ho fanampin'izany, mba hahazoana antoka fa mitohy ny fanohanana, dia asehonay ny tranonkala tsy misy styles sy JavaScript.
Mampiseho andian-tsary misy sary telo indray miaraka. Ampiasao ny bokotra "Previous" sy "Next" mba hifindrana amin'ny sary telo indray mandeha, na ampiasao ny bokotra "slider" eo amin'ny farany mba hifindrana amin'ny sary telo indray mandeha.
Ny sakana amin'ny ra sy ny ati-doha ary ny sakana amin'ny ra sy ny ati-doha dia manakana ny fanafody biotherapeutic tsy hahatratra ny tanjony ao amin'ny rafi-pitatitra foibe, ka manakana ny fitsaboana mahomby amin'ny aretin'ny neurolojia. Mba hahitana ireo mpitatitra atidoha vaovao in vivo, dia nampiditra tranomboky peptide phage T7 izahay ary nanangona ra sy tsiranoka cerebrospinal (CSF) tamin'ny fampiasana modely dobo lehibe misy voalavo. Ireo klôna phage manokana dia nanankarena be tao amin'ny CSF taorian'ny fihodinana efatra nifantenana. Ny fitsapana ireo peptide kandidà tsirairay dia naneho fa manankarena mihoatra ny 1000 heny ao amin'ny CSF. Ny bioactivity amin'ny fanaterana peptide-mediated mankany amin'ny atidoha dia nohamafisin'ny fihenan'ny 40% amin'ny haavon'ny amyloid-β ao amin'ny tsiranoka cerebrospinal amin'ny fampiasana inhibitor peptide BACE1 mifandray amin'ny peptide transit vaovao voafaritra. Ireo valiny ireo dia manondro fa ireo peptides fantatra amin'ny fomba fisafidianana phage in vivo dia mety ho fitaovana ilaina amin'ny fanaterana macromolecules amin'ny atidoha miaraka amin'ny vokatra fitsaboana.
Ny fikarohana momba ny fitsaboana mikendry ny rafi-pitatitra foibe (CNS) dia nifantoka betsaka tamin'ny famantarana ireo fanafody sy akora nohatsaraina izay mampiseho toetra mikendry ny CNS, miaraka amin'ny ezaka kely kokoa amin'ny fitadiavana ireo mekanisma izay mitarika ny fanaterana fanafody mavitrika mankany amin'ny atidoha. Manomboka miova izany ankehitriny satria ny fanaterana fanafody, indrindra fa ireo molekiola lehibe, dia ampahany manan-danja amin'ny fivoaran'ny fanafody neuroscience maoderina. Ny tontolo iainan'ny rafi-pitatitra foibe dia voaaro tsara amin'ny alàlan'ny rafitra sakana amin'ny lalan-dra ao amin'ny atidoha, izay ahitana ny sakana amin'ny ra-atidoha (BBB) ​​sy ny sakana amin'ny ra-atidoha (BCBB)1, ka mahatonga azy ho sarotra ny fanaterana fanafody any amin'ny atidoha1,2. Tombanana fa saika ny fanafody molekiola lehibe rehetra sy ny fanafody molekiola kely mihoatra ny 98% dia esorina amin'ny atidoha3. Izany no antony maha-zava-dehibe ny famantarana ireo rafitra fitaterana vaovao ao amin'ny atidoha izay manome fanaterana fanafody fitsaboana mahomby sy manokana any amin'ny CNS 4,5. Na izany aza, ny BBB sy ny BCSFB koa dia manolotra fahafahana tsara ho an'ny fanaterana fanafody satria miditra sy miditra amin'ny rafitra rehetra ao amin'ny atidoha amin'ny alàlan'ny lalan-dra mivelatra. Noho izany, ny ezaka ankehitriny hampiasana fomba tsy manafika amin'ny fanaterana any amin'ny atidoha dia mifototra betsaka amin'ny mekanisma fitaterana entin'ny mpandray (PMT) amin'ny fampiasana ny mpandray BBB6 endogenous. Na dia eo aza ny fandrosoana lehibe vao haingana amin'ny fampiasana ny lalan'ny mpandray transferrin7,8, dia ilaina ny fampivoarana bebe kokoa ny rafitra fanaterana vaovao miaraka amin'ny toetra nohatsaraina. Mba hanaovana izany, ny tanjonay dia ny hamantatra ireo peptide afaka mandrindra ny fitaterana CSF, satria amin'ny ankapobeny dia azo ampiasaina hanaterana macromolecules any amin'ny CNS na hanokafana lalan'ny mpandray vaovao izy ireo. Indrindra indrindra, ny mpandray sy mpitatitra manokana ao amin'ny rafitra cerebrovascular (BBB sy BSCFB) dia mety ho lasibatra mety ho an'ny fanaterana mavitrika sy manokana ny fanafody biotherapeutic. Ny tsiranoka cerebrospinal (CSF) dia vokatra miafina ao amin'ny plexus choroid (CS) ary mifandray mivantana amin'ny tsiranoka interstitial ao amin'ny atidoha amin'ny alàlan'ny habaka subarachnoid sy ny habaka ventricular4. Vao haingana no naseho fa ny tsiranoka cerebrospinal subarachnoid dia miparitaka be loatra ao amin'ny interstitium ao amin'ny atidoha9. Manantena izahay fa afaka miditra amin'ny habaka parenchymal amin'ny alàlan'ity lalan-drà subarachnoid ity na mivantana amin'ny alàlan'ny BBB. Mba hahatratrarana izany, dia nampihatra paikady matanjaka amin'ny fisafidianana phage in vivo izahay izay mamantatra tsara ireo peptides entin'ny iray amin'ireo lalana roa miavaka ireo.
Ankehitriny dia mamaritra fomba fanaraha-maso mitohy amin'ny alalan'ny fampisehoana phage in vivo miaraka amin'ny fakana santionany CSF miaraka amin'ny fandaharana avo lenta (HTS) izahay mba hanaraha-maso ny fihodinana fifantenana voalohany miaraka amin'ny fahasamihafan'ny tranomboky avo indrindra. Natao tamin'ny voalavo mahatsiaro tena miaraka amin'ny cannula cisterna lehibe (CM) napetraka maharitra ny fanaraha-maso mba hisorohana ny fahalotoan'ny ra. Zava-dehibe ny fisafidianana ity fomba fiasa ity, na ny peptide mikendry ny atidoha na ny peptide manana hetsika fitaterana manerana ny sakana cerebrovascular. Nampiasa phage T7 izahay noho ny habeny kely (~60 nm)10 ary nanolo-kevitra fa mety amin'ny fitaterana vesicles izay mamela ny fiampitana transcellular ny sakana endothelial sy/na epithelial-medulla. Taorian'ny fihodinana efatra nanaovana panning, dia navahana ny mponina phage izay mampiseho fanamafisana CSF in vivo matanjaka sy ny fifandraisana amin'ny lalan-drà bitika ao amin'ny atidoha. Zava-dehibe ny fanamafisana ny zavatra hitanay tamin'ny fampisehoana fa ny peptide kandidà tsara indrindra tiana sy novokarina tamin'ny fomba simika dia afaka mitondra entana proteinina ao amin'ny tsiranoka cerebrospinal. Voalohany, ny fiantraikan'ny pharmacodynamic an'ny CNS dia napetraka tamin'ny alàlan'ny fampifangaroana peptide transit mitarika miaraka amin'ny inhibitor an'ny peptide BACE1. Ankoatra ny fampisehoana fa ny paikady fitiliana miasa in vivo dia afaka mamantatra ireo peptide vaovao momba ny fitaterana ao amin'ny atidoha ho toy ny mpitondra proteinina mahomby, dia antenainay fa ho zava-dehibe ihany koa ny fomba fifantenana miasa mitovy amin'izany amin'ny famantarana ireo lalan-kizorana vaovao momba ny fitaterana ao amin'ny atidoha.
Mifototra amin'ny singa mpamorona takelaka (PFU), taorian'ny dingana famonosana phage, dia noforonina sy novokarina ny tranomboky misy peptide phage T7 linear 12-mer kisendrasendra misy fahasamihafana eo amin'ny 109 eo ho eo (jereo ny Fitaovana sy Fomba). Zava-dehibe ny manamarika fa nodinihinay tsara ity tranomboky ity talohan'ny fanaovana panning in vivo. Ny fanamafisana PCR ny santionan'ny tranomboky phage amin'ny fampiasana primer novaina dia namorona amplicons izay azo ampiharina mivantana amin'ny HTS (Sary Fanampiny 1a). Noho ny a) hadisoana amin'ny filaharan'ny HTS11, b) fiantraikany amin'ny kalitaon'ny primer (NNK)1-12, ary c) ny fisian'ny phage wild-type (wt) (skeleton inserts) ao amin'ny tranomboky standby, dia nampiharina ny fomba fanivanana filaharana mba hanesorana ny fampahalalana momba ny filaharana voamarina ihany (Sary Fanampiny 1b). Ireo dingana fanivanana ireo dia mihatra amin'ny tranomboky filaharan'ny HTS rehetra. Ho an'ny tranomboky mahazatra, dia nahazo famakiana miisa 233,868 izahay, izay 39% no nandalo ny fepetra sivana ary nampiasaina ho an'ny famakafakana sy fisafidianana tranomboky ho an'ny fihodinana manaraka (Sary Fanampiny 1c–e). Ny famakiana dia betsaka amin'ny mpivady fototra 3 ny halavany miaraka amin'ny tendrony amin'ny niokleotida 36 (Sary Fanampiny 1c), izay manamafy ny endriky ny tranomboky (NNK) 1-12. Tsara homarihina fa eo amin'ny 11% eo ho eo amin'ireo mpikambana ao amin'ny tranomboky no nahitana PAGISRELVDKL misy karazana wild-type (wt) 12-dimensionaly, ary saika ny antsasaky ny filaharana (49%) no nahitana fampidirana na famafana. Ny HTS an'ny tranomboky dia nanamafy ny fahasamihafan'ny peptides ao amin'ny tranomboky: mihoatra ny 81% amin'ny filaharan'ny peptide no hita indray mandeha monja ary 1.5% ihany no nitranga tamin'ny ≥4 kopia (Sary Fanampiny 2a). Ny fatran'ny asidra amine (aa) amin'ny toerana 12 rehetra ao amin'ny repertoire dia mifandray tsara amin'ny fatra andrasana amin'ny isan'ny codons novokarin'ny repertoire NKK simba (Sary Fanampiny 2b). Ny fatran'ny residu aa voamarika izay voakodia amin'ireo fampidirana ireo dia mifandray tsara amin'ny fatra kajy (r = 0.893) (Sary Fanampiny 2c). Ny fanomanana ny tranomboky phage ho an'ny tsindrona dia ahitana ny dingana fanamafisana sy fanesorana ny endotoxine. Efa naseho teo aloha fa mety hampihena ny fahasamihafan'ny tranomboky phage izany12,13. Noho izany, dia nandinika ny tranomboky phage nohamafisina takelaka izay efa nesorina ny endotoxine izahay ary nampitaha izany tamin'ny tranomboky tany am-boalohany mba hanombanana ny fatran'ny AA. Hita fa misy fifandraisana matanjaka (r = 0.995) eo amin'ny dobo tany am-boalohany sy ny dobo nohamafisina sy nodiovina (Sary Fanampiny 2d), izay manondro fa ny fifaninanana eo amin'ny clones nohamafisina amin'ny takelaka mampiasa phage T7 dia tsy miteraka fitongilanana lehibe. Ity fampitahana ity dia mifototra amin'ny fatran'ny motif tripeptide ao amin'ny tranomboky tsirairay, satria ny fahasamihafan'ny tranomboky (~109) dia tsy azo tratrarina tanteraka na dia amin'ny HTS aza. Ny famakafakana ny fatran'ny aa amin'ny toerana tsirairay dia naneho fitongilanana kely miankina amin'ny toerana amin'ny toerana telo farany amin'ny repertoire nampidirina (Sary Fanampiny 2e). Ho famaranana, dia nanatsoaka hevitra izahay fa azo ekena ny kalitao sy ny fahasamihafan'ny tranomboky ary fiovana kely amin'ny fahasamihafana ihany no hita noho ny fanamafisana sy ny fanomanana ny tranomboky phage teo anelanelan'ny fihodinana maromaro amin'ny fisafidianana.
Azo atao amin'ny alalan'ny fandidiana fametrahana cannula ao amin'ny CM-n'ny voalavo mahatsiaro tena ny fakana santionany amin'ny ranon-tsavoka mba hanamorana ny famantarana ny phage T7 nampidirina tamin'ny lalan-drà (iv) tamin'ny alalan'ny BBB sy/na BCSFB (Sary 1a-b). Nampiasa sandry roa mahaleo tena izahay (sandry A sy B) tamin'ny fihodinana telo voalohany tamin'ny fisafidianana in vivo (Sary 1c). Nampitombo tsikelikely ny hamafin'ny fisafidianana izahay tamin'ny fampihenana ny habetsaky ny phage rehetra nampidirina tamin'ny fihodinana telo voalohany tamin'ny fisafidianana. Ho an'ny fihodinana fahefatra amin'ny fisafidianana, dia nampiarahinay ny santionany avy amin'ny sampana A sy B ary nanao fisafidianana telo fanampiny mahaleo tena. Mba handinihana ny toetran'ny poti-phage T7 in vivo amin'ity modely ity, dia nampidirina tao amin'ny voalavo tamin'ny alalan'ny lalan-dra rambony ny phage wild-type (PAGISRELVDKL master insert). Ny famerenana ny phage avy amin'ny ranon-tsavoka sy ny ra amin'ny fotoana samihafa dia naneho fa ny phage icosahedral T7 kely dia manana dingana fanadiovana haingana avy amin'ny fizarana ra (Sary Fanampiny 3). Mifototra amin'ny titera nomena sy ny habetsahan'ny ran'ny voalavo, dia nokajianay fa eo amin'ny 1% eo ho eo ny lanjan'ny phage avy amin'ny fatra nomena no hita tao amin'ny ra 10 minitra taorian'ny tsindrona tamin'ny lalan-dra. Taorian'io fihenana haingana voalohany io, dia norefesina ny fanadiovana voalohany miadana kokoa miaraka amin'ny antsasaky ny androm-piainana 27.7 minitra. Zava-dehibe ny mahafantatra fa vitsy dia vitsy ny phage nalaina avy tao amin'ny fizarana CSF, izay manondro fa ambany ny fiavian'ny fifindran'ny phage karazana voajanahary ao amin'ny fizarana CSF (Sary Fanampiny 3). Amin'ny ankapobeny, eo amin'ny 1 x 10-3% eo ho eo ny titera amin'ny phage T7 ao amin'ny ra ary 4 x 10-8% amin'ny phage nampidirina voalohany no hita tao amin'ny tsiranoka cerebrospinal nandritra ny fe-potoana fakana santionany manontolo (0-250 min). Tsara homarihina fa ny antsasaky ny androm-piainan'ny phage karazana voajanahary (25.7 min) ao amin'ny tsiranoka cerebrospinal dia mitovy amin'ny hita tao amin'ny ra. Ireo angon-drakitra ireo dia mampiseho fa tsy simba ny sakana mampisaraka ny fizarana CSF amin'ny ra ao amin'ny voalavo nasiana CM cannulated, izay ahafahana misafidy in vivo ny tranomboky phage mba hamantarana ireo klôna izay mora entina avy ao amin'ny ra mankany amin'ny fizarana CSF.
(a) Fametrahana fomba iray handraisana indray ny tsiranoka cerebrospinal (CSF) avy amin'ny dobo lehibe iray. (b) Kisary mampiseho ny toerana misy ny sakana ao amin'ny rafi-pitatitra foibe (CNS) sy ny paikady fifantenana ampiasaina hamantarana ireo peptide izay miampita ny sakana ra-atidoha (BBB) ​​sy ny sakana ra-atidoha. (c) Tabilao fampisehoana phage in vivo. Isaky ny fihodinana fifantenana, dia nampidirina tamin'ny lalan-drà ny phages (marika famantarana biby ao anatin'ny zana-tsipìka). Sampana roa mahaleo tena (A, B) no tazonina misaraka mandra-pahatongan'ny fihodinana faha-4 amin'ny fifantenana. Ho an'ny fihodinana fifantenana faha-3 sy faha-4, dia nojerena tanana ny klone phage tsirairay nalaina avy amin'ny CSF. (d) Kinetika an'ny phage nalaina avy amin'ny ra (faribolana mena) sy tsiranoka cerebrospinal (telozoro maitso) nandritra ny fihodinana voalohany amin'ny fifantenana tamin'ny voalavo roa nokapohina taorian'ny fampidirana ny tranomboky peptide T7 tamin'ny lalan-drà (2 x 1012 phages/biby). Ny efamira manga dia manondro ny salan'isa fifantohana voalohany amin'ny phage ao amin'ny ra, kajy avy amin'ny habetsahan'ny phage atsindrona, miaraka amin'ny fiheverana ny habetsaky ny ra manontolo. Ny efamira mainty dia manondro ny teboka fihaonan'ny tsipika y nalaina avy amin'ny fifantohana phage ao amin'ny ra. (e,f) Asehoy ny matetika sy ny fizarana ny motif tripeptide mifanindry rehetra hita ao amin'ny peptide. Aseho ny isan'ny motif hita amin'ny famakiana 1000. Ny motif manankarena (p < 0.001) dia voamarika amin'ny teboka mena. (e) Tetika fifandraisana mampitaha ny matetika mifandraika amin'ny motif tripeptide ao amin'ny tranomboky atsindrona amin'ny phage avy amin'ny ra avy amin'ny biby #1.1 sy #1.2. (f) Tetika fifandraisana mampitaha ny matetika mifandraika amin'ny motif tripeptide phage biby #1.1 sy #1.2 voatokana ao amin'ny ra sy ny tsiranoka cerebrospinal. (g, h) Fanehoana ID filaharana ny phage manankarena ra (g) mifanohitra amin'ny tranomboky atsindrona ary phage manankarena CSF (h) mifanohitra amin'ny ra aorian'ny fihodinana fifantenana in vivo amin'ny biby roa tonta. Ny haben'ny kaody litera iray dia manondro ny impiry isehoan'io asidra amine io amin'io toerana io. Maitso = polar, volomparasy = tsy miandany, manga = fototra, mena = asidra ary mainty = asidra amine hydrophobic. Ny Sary 1a, b dia novolavolaina sy novokarin'i Eduard Urich.
Nampiditra tranomboky peptide phage tao anaty voalavo fitaovana CM roa (clades A sy B) izahay ary phage navahana avy amin'ny tsiranoka cerebrospinal sy ny ra (Sary 1d). Ny fanadiovana haingana voalohany ny tranomboky dia tsy dia niharihary loatra raha oharina amin'ny phage wild-type. Ny antsasaky ny androm-piainan'ny tranomboky tsindrona tamin'ireo biby roa ireo dia 24.8 minitra tao anaty ra, mitovy amin'ny phage wild-type, ary 38.5 minitra tao amin'ny CSF. Ny santionan'ny phage ra sy ny tsiranoka cerebrospinal avy amin'ny biby tsirairay dia nosedraina HTS ary ny peptide rehetra fantatra dia nohadihadiana mba hahitana ny fisian'ny motif tripeptide fohy. Ny motif tripeptide dia nofidiana satria manome fototra kely indrindra ho an'ny fananganana rafitra sy ny fifandraisan'ny peptide-proteinina14,15. Nahita fifandraisana tsara izahay teo amin'ny fizarana motif teo amin'ny tranomboky phage tsindrona sy ny clones nalaina avy amin'ny ran'ireo biby roa ireo (Sary 1e). Ny angon-drakitra dia manondro fa ny firafitry ny tranomboky dia manankarena kely fotsiny ao amin'ny fizarana ra. Ny fatran'ny asidra amine sy ny filaharan'ny consensus dia nohadihadiana bebe kokoa tamin'ny toerana tsirairay tamin'ny fampiasana ny fampifanarahana ny rindrambaiko Weblogo16. Mahaliana fa nahita fitomboan'ny glycine residues ao amin'ny ra izahay (Sary 1g). Rehefa nampitahaina tamin'ny clones nofantenana avy amin'ny CSF ny ra, dia hita fa nisy fifantenana matanjaka sy tsy fifantenana motifs sasany (Sary 1f), ary nisy asidra amine sasany hita tamin'ny toerana voafaritra mialoha tao amin'ny mpikambana 12 (Sary 1h). Tsara homarihina fa samy hafa be ny tsiranoka cerebrospinal ao amin'ny biby tsirairay, raha toa kosa ka hita tamin'ny biby roa ny fitomboan'ny glycine ao amin'ny ra (Sary Fanampiny 4a–j). Taorian'ny sivana henjana ny angon-drakitra momba ny filaharana ao amin'ny tsiranoka cerebrospinal an'ny biby #1.1 sy #1.2, dia nahazo peptides 12-mer tokana miisa 964 sy 420 (Sary Fanampiny 1d–e). Nohamafisina ireo clones phage mitokana ary nosedraina tamin'ny fihodinana faharoa amin'ny fifantenana in vivo. Ny phage nalaina avy amin'ny fihodinana faharoa amin'ny fifantenana dia nosedraina tamin'ny HTS tao amin'ny biby tsirairay ary ny peptides rehetra fantatra dia nampiasaina ho fidirana amin'ny programa famantarana motif mba handinihana ny fisian'ny motifs tripeptide (Sary 2a, b, ef). Raha ampitahaina amin'ny tsingerina voalohany amin'ny phage nalaina avy amin'ny CSF, dia nahita fifantenana sy fanesorana motif maro tao amin'ny CSF tao amin'ny sampana A sy B izahay (Sary 2). Nampiharina ny algorithm famantarana tambajotra mba hamaritana raha maneho lamina samihafa amin'ny filaharana mitovy izy ireo. Hita fa mitovy ny fitoviana eo amin'ny filaharana 12-dimensy nalain'ny CSF tao amin'ny clade A hafa (Sary 2c, d) sy clade B (Sary 2g, h). Ny fanadihadiana mitambatra tao amin'ny sampana tsirairay dia naneho mombamomba ny fifantenana samihafa ho an'ny peptides 12-mer (Sary Fanampiny 5c, d) ary fitomboan'ny tahan'ny CSF/titer ra rehefa mandeha ny fotoana ho an'ny clones mitambatra taorian'ny fihodinana faharoa amin'ny fifantenana raha oharina amin'ny fihodinana voalohany amin'ny fifantenana (Sary Fanampiny 5e).
Fanatsarana ny motif sy peptides ao amin'ny tsiranoka cerebrospinal amin'ny alàlan'ny fihodinana roa mifanesy amin'ny fisafidianana fampisehoana phage miasa in vivo.
Ireo phage rehetra ao amin'ny tsiranoka cerebrospinal nalaina avy amin'ny fihodinana voalohany amin'ny biby tsirairay (biby #1.1 sy #1.2) dia natambatra, nohamafisina, nojerena ny HT ary naverina nampidirina miaraka (phage 2 x 1010/biby) voalavo SM 2 nofonosina cannulated (#1.1 → #). 2.1 sy 2.2, 1.2 → 2.3 sy 2.4). (a,b,e,f) Tetika fifandraisana mampitaha ny fatran'ny motif tripeptide amin'ny phage rehetra avy amin'ny CSF amin'ny fihodinana fifantenana voalohany sy faharoa. Fatran'ny fatran'ny motif sy ny fizarana azy ireo izay maneho ny tripeptide rehetra mety hifanindry hita ao amin'ny peptides amin'ny lafiny roa. Aseho eto ny isan'ny motif hita tamin'ny famakiana 1000. Ireo motif izay voafantina na nesorina tamin'ny fomba manan-danja (p < 0.001) tao amin'ny iray amin'ireo tranomboky ampitahaina dia asongadina amin'ny teboka mena. (c, d, g, h) Fanehoana ny logo-n'ny filaharan'ny asidra amine 12 manankarena CSF lava mifototra amin'ny fihodinana 2 sy 1 amin'ny fifantenana in vivo. Ny haben'ny kaody litera iray dia manondro ny faharetan'ny fisian'io asidra amine io amin'io toerana io. Mba hanehoana ny logo, ampitahaina ny fatran'ny filaharan'ny CSF nalaina avy amin'ny biby tsirairay eo anelanelan'ny fihodinana fifantenana roa ary aseho ireo filaharana manankarena amin'ny fihodinana faharoa: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 sy (h) #1.2–#2.4. Aseho amin'ny loko ny asidra amine manankarena indrindra amin'ny toerana iray ao amin'ny (c, d) biby laharana 2.1 sy laharana 2.2 na (g, h) amin'ny biby laharana 2.3 sy laharana 2.4. Maitso = polar, volomparasy = tsy miandany, manga = fototra, mena = asidra ary mainty = asidra amine hydrophobic.
Taorian'ny fihodinana fahatelo amin'ny fifantenana, dia nahita filaharan'ny peptide miavaka miisa 124 (#3.1 sy #3.2) avy amin'ny klôna phage naverina tamin'ny CSF miisa 332 nalaina avy amin'ny biby roa izahay (Sary Fanampiny 6a). Ny filaharan'ny LGSVS (18.7%) no nanana ny ampahany betsaka indrindra, arahin'ny fampidirana karazana voajanahary PAGISRELVDKL (8.2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2.2%), ary SARGSWREIVSLS (2.2%). Tamin'ny fihodinana fahefatra farany, dia nanangona sampana roa nofantenana tsy miankina avy amin'ny biby telo misaraka izahay (Sary 1c). Tamin'ireo klôna phage voalamina miisa 925 azo avy amin'ny CSF, tamin'ny fihodinana fahefatra dia nahita filaharan'ny peptide miavaka miisa 64 izahay (Sary Fanampiny 6b), izay nihena ho 0.8% ny ampahany betsaka amin'ny phage karazana voajanahary. Ny klôna CSF mahazatra indrindra tamin'ny fihodinana fahefatra dia LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3.6%) ary RLSSVDSDLSGC (3, 2%). %)). Ny elanelan'ny halavan'ny peptide voafantina dia vokatry ny fampidirana/famafana nukleotida na ny kôdôna fijanonana aloha loatra ao amin'ny primers library rehefa mampiasa kôdôna simba ho an'ny famolavolana library NNK. Ny kôdôna fijanonana aloha loatra dia mamorona peptide fohy kokoa ary voafantina satria misy ny motif aa tsara. Ny peptide lava kokoa dia mety ho vokatry ny fampidirana/famafana ao amin'ny primers amin'ny librarys synthetic. Izany dia mametraka ny kôdôna fijanonana namboarina ivelan'ny frame ary mamaky izany mandra-pisehoan'ny kôdôna fijanonana vaovao any aoriana. Amin'ny ankapobeny, dia nokajianay ny anton-javatra fanatsarana ho an'ny fihodinana fifantenana efatra rehetra amin'ny alàlan'ny fampitahana ny angon-drakitra fidirana amin'ny angon-drakitra vokatra santionany. Ho an'ny fihodinana voalohany amin'ny fitiliana, dia nampiasa titer phage wild-type ho toy ny referansa fototra tsy voafaritra manokana izahay. Mahaliana fa tena matanjaka ny fisafidianana phage ratsy tamin'ny tsingerin'ny CSF voalohany, fa tsy tao amin'ny ra (Sary 3a), izay mety ho vokatry ny mety ho fiparitahan'ny ankamaroan'ny mpikambana ao amin'ny tranomboky peptide ao amin'ny fizarana CSF na ny phage mifandraika dia mirona ho voatahiry na esorina amin'ny lalan-dra mahomby kokoa noho ny bacteriophages. Na izany aza, tamin'ny fihodinana faharoa amin'ny panning, dia hita fa tena tsara ny fisafidianana phage ao amin'ny CSF tamin'ny clades roa, izay manondro fa ny fihodinana teo aloha dia nanankarena tamin'ny phages mampiseho peptides izay mampiroborobo ny fidiran'ny CSF (Sary 3a). Averina indray, tsy nisy fanatsarana be dia be tamin'ny ra. Tamin'ny fihodinana fahatelo sy fahefatra ihany koa, dia nanankarena be dia be tamin'ny CSF ny clones phage. Raha ampitahaina ny fatran'ny filaharan'ny peptide tokana tsirairay eo anelanelan'ny fihodinana roa farany amin'ny fisafidianana, dia hitanay fa tena nanankarena kokoa ny filaharana tamin'ny fihodinana fahefatra amin'ny fisafidianana (Sary 3b). Motif tripeptide miisa 931 no nalaina avy amin'ny filaharan'ny peptide tokana 64 rehetra tamin'ny fampiasana ny fironana peptide roa. Ireo motif nanankarena indrindra tamin'ny fihodinana fahefatra dia nodinihina akaiky kokoa ny mombamomba ny fanatsarana azy ireo tamin'ny fihodinana rehetra raha oharina amin'ny tranomboky nampidirina (tapany: fanatsarana 10%) (Sary Fanampiny 6c). Ny lamina ankapobeny amin'ny fifantenana dia naneho fa ny ankamaroan'ny motif nodinihina dia nanankarena tamin'ny fihodinana teo aloha rehetra tamin'ny sampana fifantenana roa. Na izany aza, ny motif sasany (ohatra SGL, VSG, LGS GSV) dia avy amin'ny clade A hafa indrindra, raha ny hafa kosa (ohatra FGW, RTN, WGF, NTR) dia nanankarena tamin'ny clade B hafa.
Fanamarinana ny fitaterana CSF an'ireo peptide asehon'ny phage manankarena CSF sy ireo peptide mpitarika biotinylated mifamatotra amin'ny entana streptavidin.
(a) Tahan'ny fanatsarana nokajiana tamin'ny fihodinana efatra (R1-R4) mifototra amin'ny titera phage (PFU) nampidirina (fidirana = I) sy ny titera phage CSF voafaritra (fivoahana = O). Ny singa fanatsarana nandritra ny fihodinana telo farany (R2-R4) dia nokajiana tamin'ny fampitahana tamin'ny fihodinana teo aloha sy ny fihodinana voalohany (R1) miaraka amin'ny angon-drakitra momba ny lanja. Ny bara misokatra dia ranon-tserebrospinal, ny bara misy alokaloka dia plasma. (***p<0.001, mifototra amin'ny fitsapana t an'ny Student). (b) Lisitry ny peptide phage be dia be indrindra, voalahatra araka ny anjarany amin'ny phage rehetra nangonina tao amin'ny CSF taorian'ny fihodinana faha-4 amin'ny fifantenana. Ny klôna phage enina mahazatra indrindra dia asongadina amin'ny loko, laharana ary ny singa fanatsarana azy ireo eo anelanelan'ny fihodinana faha-3 sy faha-4 amin'ny fifantenana (takelaka). (c,d) Ny klôna phage enina be dia be indrindra, ny tranomboky peptide phage foana sy ny phage ray aman-dreny avy amin'ny fihodinana faha-4 dia nodinihina tsirairay tao anaty modely santionany CSF. Nangonina tamin'ny fotoana voatondro ny santionan'ny CSF sy ny ra. (c) Mitovy habe amin'ny klôna phage kandidà 6 (2 x 1010 phages/biby), phages foana (#1779) (2 x 1010 phages/biby) ary tranomboky peptide phage tahiry (2 x 1012 phages/biby). Tsindrona farafahakeliny 3 CM no ampidirina amin'ny biby voatsindrona misaraka amin'ny alàlan'ny lalan-dra rambony. Aseho eto ny pharmacokinetics CSF an'ny klôna phage sy ny tranomboky peptide phage tsirairay voatsindrona rehefa mandeha ny fotoana. (d) mampiseho ny tahan'ny CSF/ra antonony ho an'ny phages/mL rehetra voaray nandritra ny fotoana fakana santionany. (e) Peptide mpitarika sentetika efatra sy fanaraha-maso iray no nampifandraisina tamin'ny biotin tamin'ny streptavidin tamin'ny alàlan'ny N-terminus (fampisehoana tetramer) arahin'ny tsindrona (lalan-drambony iv, streptavidin 10 mg/kg). Voalavo telo farafahakeliny no nampidirina fantsona (N = 3). ). Nangonina tamin'ny fotoana voatondro ny santionan'ny CSF ary norefesina tamin'ny alalan'ny CSF anti-streptavidin ELISA (nd = tsy hita) ny fifantohana streptavidin. (*p<0.05, **p<0.01, ***p<0.001, mifototra amin'ny fitsapana ANOVA). (f) Fampitahana ny filaharan'ny asidra amine amin'ny klôna peptide phage manankarena indrindra #2002 (volomparasy) amin'ny klôna peptide phage voafantina hafa avy amin'ny fihodinana faha-4 amin'ny fifantenana. Voasokajy loko ny sombin-asidôna mitovy sy mitovy amin'izany.
Tamin'ireo phage rehetra nohatsaraina tamin'ny fihodinana fahefatra (Sary 3b), dia klôna kandidà enina no nofantenana ho an'ny fanadihadiana tsirairay fanampiny ao amin'ny modely santionan'ny CSF. Nampidirina tao anaty biby CM telo nofonosina cannulated ny habetsahana mitovy amin'ny tranomboky peptide phage, phage foana (tsy misy insert) ary prophage kandidà enina, ary voafaritra tao amin'ny fanadihadiana CSF (Sary 3c) sy ra (Sary Fanampiny 7) ny pharmacokinetics. Ny klôna phage rehetra nosedraina dia nifantoka tamin'ny fizarana CSF amin'ny ambaratonga 10-1000 heny noho ny an'ny phage fanaraha-maso foana (#1779). Ohatra, ny klôna #2020 sy #2077 dia nanana titers CSF avo 1000 heny noho ny phage fanaraha-maso. Samy hafa ny mombamomba ny pharmacokinetic an'ny peptide voafantina tsirairay, saingy samy manana fahaiza-manao CSF ​​homing avo lenta izy rehetra. Nahita fihenana tsy tapaka nandritra ny fotoana ela izahay ho an'ny klôna #1903 sy #2011, raha toa kosa ho an'ny klôna #2077, #2002 ary #2009, ny fitomboana nandritra ny 10 minitra voalohany dia mety manondro fitaterana mavitrika saingy mila hamarinina. Niorina tamin'ny ambaratonga avo ny klôna #2020, #2002, ary #2077, raha nihena tsikelikely kosa ny fifantohan'ny CSF an'ny klôna #2009 taorian'ny fitomboana voalohany. Avy eo dia nampitahainay ny fatran'ny kandida CSF tsirairay amin'ny fifantohany amin'ny rany (Sary 3d). Ny fifandraisan'ny titer antonony amin'ny kandida CSF tsirairay amin'ny titer amin'ny rany amin'ny fotoana rehetra fakana santionany dia naneho fa telo amin'ireo kandida enina no manankarena CSF amin'ny ra. Mahaliana fa ny klôna #2077 dia naneho fahamarinan-toerana ambony kokoa amin'ny ra (Sary Fanampiny 7). Mba hanamafisana fa ireo peptides dia afaka mitondra entana hafa ankoatra ny poti-phage ao amin'ny fizarana CSF, dia nanamboatra peptide mpitarika efatra novokarina tamin'ny biotin izahay teo amin'ny N-terminus izay ifandraisan'ny peptides amin'ny poti-phage. Ireo peptide biotinylated (laharana 2002, 2009, 2020 ary 2077) dia nampiarahina tamin'ny streptavidin (SA) mba hahazoana endrika multimeric izay manahaka ny jeometrian'ny phage. Io endrika io koa dia namela anay handrefesana ny fihanaky ny SA ao amin'ny ra sy ny tsiranoka cerebrospinal ho toy ny peptide proteinina mpitondra entana. Zava-dehibe ny mahafantatra fa matetika ny angon-drakitra phage dia azo averina rehefa nomena peptides sentetika amin'ity endrika SA-conjugated ity (Sary 3e). Ireo peptide voahodina dia nanana fihanaky voalohany kely kokoa ary haingana kokoa ny fanadiovana CSF miaraka amin'ny ambaratonga tsy hita maso ao anatin'ny 48 ora. Mba hahazoana fahatakarana ny lalan'ny fanaterana ireo peptide phage clones ao amin'ny habaka CSF, dia nodinihinay ny toerana misy ny peptide phage tsirairay amin'ny alàlan'ny immunohistochemistry (IHC) mba hamantarana mivantana ny poti-phage 1 ora aorian'ny tsindrona intravenous in vivo. Tsara homarihina fa ny klôna #2002, #2077, ary #2009 dia azo hita tamin'ny alalan'ny fandokoana mahery vaika tao amin'ny kapilary ao amin'ny atidoha, raha toa kosa ka tsy hita ny phage fanaraha-maso (#1779) sy ny klôna #2020 (Sary Fanampiny 8). Izany dia manondro fa ireo peptide ireo dia mandray anjara amin'ny fiantraikany eo amin'ny atidoha amin'ny alàlan'ny fiampitana ny BBB. Ilaina ny fanadihadiana amin'ny antsipiriany bebe kokoa mba hitsapana ity petra-kevitra ity, satria mety ho tafiditra ao anatin'izany koa ny lalan'ny BSCFB. Rehefa mampitaha ny filaharan'ny asidra amine amin'ny klôna manankarena indrindra (#2002) amin'ny peptide voafantina hafa, dia voamarika fa ny sasany amin'izy ireo dia manana fanitarana asidra amine mitovy, izay mety manondro fomba fitaterana mitovy (Sary 3f).
Noho ny mombamomba ny plasma miavaka sy ny fitomboan'ny CSF betsaka rehefa mandeha ny fotoana, dia nojerena bebe kokoa nandritra ny 48 ora lava kokoa ny clone fampisehoana phage #2077 ary afaka namerina ny fitomboan'ny CSF haingana hita mifandraika amin'ny haavon'ny SA maharitra (Sary 4a). Mikasika ireo clone phage hafa voafaritra, ny #2077 dia nolokoina mafy ho an'ny kapilary ao amin'ny atidoha ary naneho fiaraha-miasa manan-danja amin'ny lectin marika kapilary rehefa jerena amin'ny famaha avo kokoa ary mety ho loko sasany ao amin'ny habaka parenchymal (Sary 4b). Mba handinihana raha azo atao ny mahazo vokatra ara-panafody vokatry ny peptide ao amin'ny CNS, dia nanao fanandramana izahay izay nampifangaroana ny dikan-teny biotinylated an'ny i) ny peptide transit #2077 sy ii) ny peptide inhibitor BACE1 tamin'ny SA tamin'ny tahan'ny roa samy hafa. Ho an'ny fitambarana iray dia nampiasa ny inhibitor peptide BACE1 ihany izahay ary ho an'ny iray hafa dia nampiasa tahan'ny 1:3 amin'ny inhibitor peptide BACE1 amin'ny peptide #2077 izahay. Samy nampidirina tamin'ny lalan-drà ireo santionany roa ireo ary norefesina tsikelikely ny haavon'ny beta-amyloid peptide 40 (Abeta40) ao amin'ny ra sy ny tsiranoka cerebrospinal. Norefesina tao amin'ny CSF ny Abeta40 satria maneho ny fanakanana ny BACE1 ao amin'ny parenchyma ao amin'ny atidoha. Araka ny nantenaina, ireo complexes roa ireo dia nampihena be ny haavon'ny Abeta40 ao amin'ny ra (Sary 4c, d). Na izany aza, ireo santionany misy fifangaroan'ny peptide laharana 2077 sy ny inhibitor an'ny peptide BACE1 mifamatotra amin'ny SA ihany no nahatonga ny fihenan'ny Abeta40 be dia be tao amin'ny tsiranoka cerebrospinal (Sary 4c). Ny angon-drakitra dia mampiseho fa ny peptide laharana 2077 dia afaka mitondra ny proteinina SA 60 kDa ao amin'ny CNS ary miteraka vokatra ara-panafody miaraka amin'ny inhibitor SA-conjugated an'ny peptide BACE1.
(a) Tsindrona klonaly (2 × 10 phages/biby) an'ny phage T7 mampiseho ny mombamomba ny pharmacokinetic maharitra an'ny peptide CSF #2077 (RLSSVDSDLSGC) sy ny phage fanaraha-maso tsy notsindrona (#1779) amin'ny voalavo telo farafahakeliny misy fantsona CM. (b) Sary mikroskopika confocal an'ny lalan-dra kely cortical solontena ao amin'ny voalavo notsindrona phage (2 × 10 10 phages/biby) mampiseho ny fandokoana mifanohitra amin'ny peptide #2077 sy ny lalan-dra (lectin). Ireo klôna phage ireo dia nomena voalavo 3 ary navela hivezivezy mandritra ny adiny 1 talohan'ny fampidiran-dra. Nozaraina ny ati-doha ary nolokoina tamin'ny antibody polyclonal misy marika FITC manohitra ny capsid phage T7. Folo minitra talohan'ny fampidiran-dra sy ny fametrahana azy manaraka, dia nomena lalan-dra ny lectin misy marika DyLight594. Sary fluorescent mampiseho fandokoana lectin (mena) amin'ny ilany luminal amin'ny lalan-dra madinika sy phages (maitso) ao amin'ny lumen'ny kapilara sy ny sela ao amin'ny atidoha perivascular. Ny bara mizana dia mifanandrify amin'ny 10 µm. (c, d) Ny peptide manakana ny BACE1 biotinylated irery na miaraka amin'ny peptide transit biotinylated #2077 dia nampiarahina tamin'ny streptavidin narahin'ny tsindrona intravenous tamin'ny voalavo CM telo farafahakeliny cannulated (10 mg streptavidin/kg). Ny fihenan'ny Aβ40 vokatry ny inhibitoran'ny peptide BACE1 dia norefesina tamin'ny alàlan'ny Aβ1-40 ELISA tao amin'ny ra (mena) sy ny tsiranoka cerebrospinal (volomboasary) tamin'ny fotoana voatondro. Ho an'ny fahazavana tsara kokoa, dia misy tsipika teboka eo amin'ny grafika amin'ny mizana 100%. (c) Fihenan'ny isan-jaton'ny Aβ40 ao amin'ny ra (telozoro mena) sy ny tsiranoka cerebrospinal (telozoro volomboasary) amin'ny voalavo notsaboina tamin'ny streptavidin mifamatotra amin'ny peptide transit #2077 sy ny peptide manakana ny BACE1 amin'ny tahan'ny 3:1. (d) Fihenan'ny isan-jaton'ny Aβ40 (faribolana mena) sy ny tsiranoka cerebrospinal (faribolana volomboasary) amin'ny voalavo notsaboina tamin'ny streptavidin mifamatotra amin'ny peptide manakana ny BACE1 ihany. Ny fifantohana Aβ ao amin'ny fanaraha-maso dia 420 pg/ml (fivilian-dalana mahazatra = 101 pg/ml).
Nampiharina tamim-pahombiazana tamin'ny sehatra maro samihafa amin'ny fikarohana biomedika ny fampisehoana phage17. Ity fomba ity dia nampiasaina tamin'ny fandalinana ny fahasamihafan'ny lalan-dra in vivo18,19 ary koa ny fandalinana mikendry ny lalan-dra ao amin'ny atidoha20,21,22,23,24,25,26. Ato amin'ity fandalinana ity, dia nanitatra ny fampiharana ity fomba fifantenana ity izahay tsy tamin'ny famantarana mivantana ny peptides mikendry ny lalan-dra ao amin'ny atidoha ihany, fa tamin'ny fahitana ireo kandidà manana toetra fitaterana mavitrika mba hiampitana ny sakana amin'ny ra-atidoha. Ankehitriny dia mamaritra ny fivoaran'ny fomba fifantenana in vivo amin'ny voalavo CM intubated izahay ary mampiseho ny fahafahany mamantatra ny peptides manana toetra homing CSF. Amin'ny fampiasana ny phage T7 izay mampiseho tranomboky misy peptides kisendrasendra 12-mer, dia afaka naneho izahay fa ny phage T7 dia kely ampy (eo amin'ny 60 nm eo ho eo ny savaivony)10 mba hifanaraka amin'ny sakana amin'ny ra-atidoha, ka hiampitana mivantana ny sakana amin'ny ra-atidoha na ny plexus choroid. Hitanay fa ny fanangonana CSF avy amin'ny voalavo CM nokapohina dia fomba fanaraha-maso tsara in vivo, ary ny phage nalaina dia tsy vitan'ny hoe mifamatotra amin'ny lalan-dra fotsiny fa miasa ho toy ny mpitatitra miampita ny sakana amin'ny ra-atidoha ihany koa. Ankoatra izany, tamin'ny fanangonana ra sy ny fampiharana HTS tamin'ny CSF sy ny phages avy amin'ny ra, dia nanamafy izahay fa ny safidinay ny CSF dia tsy voataonan'ny fanatsarana ny ra na ny fahafahana mivelatra eo anelanelan'ny fihodinana fifantenana. Na izany aza, ny fizarana ra dia anisan'ny fomba fifantenana, satria ny phages afaka mahatratra ny fizarana CSF dia tsy maintsy velona sy miparitaka ao amin'ny lalan-dra elaela mba hanatsarana ny tenany ao amin'ny atidoha. Mba hahazoana fampahalalana azo antoka momba ny filaharan'ny sela avy amin'ny angon-drakitra HTS manta, dia nampihatra sivana mifanaraka amin'ny lesoka fandaharana manokana amin'ny sehatra izahay ao amin'ny workflow fanadihadiana. Amin'ny fampidirana ireo masontsivana kinetika ao amin'ny fomba fisavana, dia nanamafy ny pharmacokinetics haingana amin'ny phages T7 karazana wild-type (t½ ~ 28 min) ao amin'ny ra24, 27, 28 izahay ary namaritra ihany koa ny antsasaky ny androm-piainany ao amin'ny tsiranoka cerebrospinal (t½ ~ 26 min) isan-minitra). Na dia mitovy aza ny mombamomba ny pharmacokinetic ao amin'ny ra sy ny CSF, dia 0.001% monja amin'ny fifantohan'ny phage ao amin'ny ra no hita tao amin'ny CSF, izay manondro ny fivezivezen'ny phage T7 karazana voajanahary miampita ny sakana amin'ny ra sy ny ati-doha. Ity asa ity dia manasongadina ny maha-zava-dehibe ny fihodinana voalohany amin'ny fifantenana rehefa mampiasa paikady panning in vivo, indrindra ho an'ny rafitra phage izay voafafa haingana amin'ny fivezivezena, satria vitsy ny clone afaka mahatratra ny fizarana CNS. Noho izany, tamin'ny fihodinana voalohany, dia nihena be ny fahasamihafan'ny tranomboky, satria vitsy ihany ny clone voaangona tamin'ny farany tamin'ity modely CSF tena henjana ity. Ity paikady panning in vivo ity dia nahitana dingana fifantenana maromaro toy ny fanangonana mavitrika ao amin'ny fizarana CSF, ny fahaveloman'ny clone ao amin'ny fizarana ra, ary ny fanesorana haingana ny clone phage T7 amin'ny ra ao anatin'ny 10 minitra voalohany (Sary 1d sy Sary fanampiny 4M). ). Noho izany, taorian'ny fihodinana voalohany, dia hita tao amin'ny CSF ny clone phage samihafa, na dia nampiasaina ho an'ny biby tsirairay aza ny dobo voalohany mitovy. Izany dia manambara fa ny dingana fifantenana henjana maromaro ho an'ny tranomboky loharano misy mpikambana maro ao amin'ny tranomboky dia miteraka fihenan'ny fahasamihafana betsaka. Noho izany, ny trangan-javatra kisendrasendra dia ho lasa ampahany manan-danja amin'ny dingana fifantenana voalohany, izay misy fiantraikany lehibe amin'ny vokatra. Azo inoana fa maro amin'ireo klôna tao amin'ny tranomboky tany am-boalohany no nanana fironana hampitombo ny CSF mitovy. Na izany aza, na dia ao anatin'ny toe-javatra fanandramana mitovy aza, dia mety tsy hitovy ny vokatra fifantenana noho ny isan'ny klôna tsirairay ao amin'ny dobo voalohany.
Samy hafa amin'ny ao amin'ny ra ireo lamina manankarena ao amin'ny CSF. Mahaliana fa voamarikay ny fiovana voalohany mankany amin'ny peptide manankarena glycine ao amin'ny ran'ny biby tsirairay. (Sary 1g, Sary fanampiny 4e, 4f). Mety ho marin-toerana kokoa ny peptide glycine misy phage ary tsy dia azo inoana loatra fa hesorina amin'ny fivezivezena. Na izany aza, ireo peptide manankarena glycine ireo dia tsy hita tao amin'ny santionan'ny tsiranoka cerebrospinal, izay manondro fa ireo tranomboky voafantina dia nandalo dingana fifantenana roa samihafa: ny iray ao amin'ny ra ary ny iray hafa navela hiangona ao amin'ny tsiranoka cerebrospinal. Ireo klôna manankarena CSF vokatry ny fihodinana fahefatra amin'ny fifantenana dia efa nosedraina betsaka. Saika ny klôna nosedraina tsirairay dia voamarina fa manankarena CSF raha oharina amin'ny phage fanaraha-maso banga. Ny peptide iray namely (#2077) dia nodinihina tamin'ny antsipiriany bebe kokoa. Nampiseho antsasaky ny androm-piainan'ny plasma lava kokoa raha oharina amin'ny kapoka hafa (Sary 3d sy Sary fanampiny 7), ary mahaliana fa ity peptide ity dia misy sisa tavela amin'ny cysteine ​​​​ao amin'ny C-terminus. Vao haingana no naseho fa ny fanampiana cysteine ​​​​amin'ny peptides dia afaka manatsara ny toetrany pharmacokinetic amin'ny alàlan'ny fifamatorana amin'ny albumin 29. Tsy fantatra amin'izao fotoana izao ho an'ny peptide #2077 izany ary mitaky fandalinana bebe kokoa. Ny peptides sasany dia naneho fiankinan-doha amin'ny valence amin'ny fanatsarana ny CSF (tsy aseho ny angon-drakitra), izay mety mifandray amin'ny jeometrika ambonin'ny capsid T7 aseho. Ny rafitra T7 nampiasainay dia naneho dika mitovy 5-15 amin'ny peptide tsirairay isaky ny singa phage. Ny IHC dia natao tamin'ny klôna phage mitarika kandidà izay nampidirina tamin'ny lalan-dra tao amin'ny cortex cerebral an'ny voalavo (Sary Fanampiny 8). Ny angon-drakitra dia naneho fa farafahakeliny klôna telo (No. 2002, No. 2009 ary No. 2077) no nifandray tamin'ny BBB. Mbola ho voafaritra raha miteraka fanangonan'ny CSF na ny fivezivezen'ireo klôna ireo mivantana any amin'ny BCSFB ity fifandraisan'ny BBB ity. Zava-dehibe ny mampiseho fa ireo peptides voafantina dia mitazona ny fahafahany mitondra CSF rehefa voafintina sy mifamatotra amin'ny enta-mavesatry ny proteinina. Ny fifamatoran'ny peptide biotinylated N-terminal amin'ny SA dia mamerina ny valiny azo tamin'ny clones phage tsirairay avy ao amin'ny ra sy ny tsiranoka cerebrospinal (Sary 3e). Farany, asehonay fa ny peptide lead #2077 dia afaka mampiroborobo ny fiasan'ny atidoha amin'ny inhibitor peptide biotinylated an'ny BACE1 mifamatotra amin'ny SA, ka miteraka fiantraikany pharmacodynamic miharihary ao amin'ny CNS amin'ny alàlan'ny fampihenana be dia be ny haavon'ny Abeta40 ao amin'ny CSF (Sary 4). Tsy afaka namantatra homologues tao amin'ny tahiry izahay tamin'ny fanaovana fikarohana homology sequence peptide amin'ny hits rehetra. Zava-dehibe ny manamarika fa ny haben'ny tranomboky T7 dia eo amin'ny 109 eo ho eo, raha ny haben'ny tranomboky teorika ho an'ny 12-mers kosa dia 4 x 1015. Noho izany, ampahany kely amin'ny habaka diversity an'ny tranomboky peptide 12-mer ihany no nofidinay, izay mety hidika fa ny peptides nohatsaraina kokoa dia azo fantarina amin'ny alàlan'ny fanombanana ny habaka sequence mifanila amin'ireo hits voafaritra ireo. Araka ny vinavina, ny iray amin'ireo antony tsy nahitantsika homologue voajanahary amin'ireo peptide ireo dia mety ho ny tsy fifantenana azy ireo mandritra ny evolisiona mba hisorohana ny fidiran'ny motif peptide sasany tsy voafehy ao amin'ny atidoha.
Raha fintinina, ny valin'ny fikarohanay dia manome fototra ho an'ny asa ho avy mba hamantarana sy hanavahana ny rafitra fitaterana ny sakana amin'ny lalan-dra ao amin'ny atidoha amin'ny antsipiriany bebe kokoa. Ny fametrahana fototra amin'ity fomba ity dia mifototra amin'ny paikady fifantenana miasa izay tsy vitan'ny hoe mamantatra ny klôna manana toetra mifamatotra amin'ny lalan-dra ao amin'ny atidoha, fa misy ihany koa ny dingana manan-danja izay ahafahan'ny klôna mahomby manana hetsika anatiny hiampitana ny sakana biolojika ao amin'ny vatana mankany amin'ny fizarana CNS. dia ny fanazavana ny mekanisma fitaterana ireo peptide ireo sy ny safidiny amin'ny fifamatorana amin'ny lalan-dra madinika manokana ao amin'ny faritry ny atidoha. Izany dia mety hitarika amin'ny fahitana lalana vaovao ho an'ny fitaterana ny BBB sy ny mpandray. Manantena izahay fa ireo peptide voafaritra dia afaka mifamatotra mivantana amin'ny mpandray lalan-dra ao amin'ny atidoha na amin'ny ligand mivezivezy izay entina amin'ny alàlan'ny BBB na BCSFB. Ireo vector peptide misy hetsika fitaterana CSF hita ato amin'ity asa ity dia hodinihina bebe kokoa. Amin'izao fotoana izao dia mikaroka ny maha-manokana ny atidohan'ireo peptide ireo izahay noho ny fahafahany miampita ny BBB sy/na BCSFB. Ireo peptide vaovao ireo dia ho fitaovana tena sarobidy amin'ny mety ho fahitana mpandray na lalan-kely vaovao ary ho an'ny fampivoarana sehatra vaovao tena mahomby amin'ny fanaterana macromolecules, toy ny biolojika, mankany amin'ny atidoha.
Sokafy ny cisterna lehibe (CM) amin'ny alàlan'ny fanovana ny fomba voalaza teo aloha. Ireo voalavo Wistar (200-350 g) nodorana dia napetraka teo amin'ny fitaovana stereotaxic ary nodidiana ny hodi-doha teo amin'ny hodi-doha efa noharatana sy nomanina tamin'ny fomba aseptika mba hampisehoana ny karandoha. Manaova lavaka roa eo amin'ny faritry ny fehikibo ambony ary apetaho ao anaty lavaka ireo visy fametahana. Nisy lavaka fanampiny nolavahana teo amin'ny crest occipital lateral ho an'ny fitarihana stereotaxic ny cannula vy tsy misy harafesina ao amin'ny CM. Apetaho simenitra nify manodidina ny cannula ary fafao amin'ny visy. Rehefa avy nohamainina tamin'ny photo-curing sy ny hamafin'ny simenitra, dia nohidiana tamin'ny zaitra supramid 4/0 ny ratra amin'ny hoditra. Ny fametrahana tsara ny cannula dia voamarina amin'ny alàlan'ny fivoahan'ny tsiranoka cerebrospinal (CSF). Esory amin'ny fitaovana stereotaxic ny voalavo, mahazo fikarakarana sy fitantanana fanaintainana aorian'ny fandidiana, ary avelao izy ho sitrana mandritra ny herinandro farafahakeliny mandra-pahitana famantarana ny ra ao amin'ny tsiranoka cerebrospinal. Ny voalavo Wistar (Crl:WI/Han) dia nalaina avy any Charles River (Frantsa). Notehirizina tao anatin'ny fepetra manokana tsy misy mikraoba ny voalavo rehetra. Neken'ny Biraon'ny Veterinera ao amin'ny Tanànan'i Basel, Soisa, ny fanandramana rehetra natao tamin'ny biby, ary natao mifanaraka amin'ny Fahazoan-dàlana Biby No. 2474 (Fanombanana ny Fitaterana Active ao amin'ny Atidoha amin'ny Fandrefesana ny Haavon'ny Kandida Fitsaboana ao amin'ny Ranon-tsiranoka Cerebrospinal sy ny Atidohan'ny Voalavo).
Tazomy moramora ny fahatsiarovan-tenan'ny voalavo miaraka amin'ny cannula CM eny an-tanana. Esory amin'ny cannula ny Datura ary angony 10 µl ny ranon-javatra cerebrospinal mikoriana ho azy. Koa satria simba ny fahafahan'ny cannula miditra, dia santionan'ny ranon-javatra cerebrospinal mazava tsy misy porofon'ny fahalotoan'ny ra na ny fiovan'ny loko ihany no nampidirina tamin'ity fandalinana ity. Niaraka tamin'izay, ra eo amin'ny 10–20 μl eo ho eo no nalaina avy amin'ny fandidiana kely teo amin'ny tendron'ny rambony tao anaty fantsona misy heparin (Sigma-Aldrich). Nangonina tamin'ny fotoana samihafa ny CSF sy ny ra taorian'ny tsindrona T7 phage tamin'ny lalan-dra. Ranon-javatra eo amin'ny 5–10 μl eo ho eo no nariana talohan'ny nangonina ny santionan'ny CSF tsirairay, izay mifanaraka amin'ny habetsahan'ny maty ao amin'ny catheter.
Noforonina tamin'ny alalan'ny vecteur T7Select 10-3b ireo tranomboky araka ny voalaza ao amin'ny boky torolalana momba ny rafitra T7Select (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Raha fintinina, dia novokarina tamin'ny endrika manaraka ny fampidirana ADN 12-mer kisendrasendra:
Nampiasaina ny kôdôna NNK mba hisorohana ny kôdôna roa sosona sy ny fihoaram-pefy ateraky ny asidra amine ao amin'ny insert. Ny N dia tahan'ny equimolar afangaro tanana amin'ny nucleotide tsirairay, ary ny K dia tahan'ny equimolar afangaro tanana amin'ny nucleotide adenine sy cytosine. Ny faritra tokana dia novaina ho ADN roa sosona tamin'ny alàlan'ny incubation fanampiny miaraka amin'ny dNTP (Novagen) sy ny anzima Klenow (New England Biolabs) ao amin'ny buffer Klenow (New England Biolabs) mandritra ny 3 ora amin'ny 37°C. Taorian'ny fihetsika, ny ADN roa sosona dia naverina tamin'ny alàlan'ny precipitation EtOH. Ny ADN vokatr'izany dia nolevonina tamin'ny anzima restriction EcoRI sy HindIII (samy avy amin'ny Roche). Ny insert voakapa sy nodiovina (QIAquick, Qiagen) (T4 ligase, New England Biolabs) dia avy eo nafatotra tao anaty frame tao anaty vector T7 efa voakapa mialoha taorian'ny asidra amine 348 an'ny gène capsid 10B. Ny fihetsika ligation dia nokolokoloina tamin'ny 16°C nandritra ny 18 ora talohan'ny fonosana in vitro. Natao araka ny toromarika nomena niaraka tamin'ny kitapo fakàna T7Select 10-3b (Novagen) ny famonosana phage in vitro ary nohamafisina indray mandeha ny vahaolana famonosana mba ho lysis tamin'ny fampiasana Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Nosantrifizina ireo lysate, notitra ary nangatsiaka tamin'ny -80° C ho vahaolana glycerol.
Fanamafisana PCR mivantana amin'ireo faritra miovaova phage nohamafisina tao anaty ron-kena na takelaka mampiasa primer fusion 454/Roche-amplicon manokana. Ny primer fusion mandroso dia misy filaharana manodidina ny faritra miovaova (NNK) 12 (manokana ho an'ny modely), GS FLX Titanium Adapter A, ary filaharana lakile tranomboky misy fototra efatra (TCAG) (Sary Fanampiny 1a):
Ny reverse fusion primer koa dia misy biotin miraikitra amin'ny capture beads sy ny GS FLX Titanium Adapter B ilaina amin'ny clonal amplification mandritra ny emulsion PCR:
Avy eo dia nampiharina tamin'ny pyrosequencing 454/Roche ireo amplicons araka ny protocole 454 GS-FLX Titanium. Ho an'ny fandaharana Sanger amin'ny tanana (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer), dia nohamafisina tamin'ny alalan'ny PCR ny ADN phage T7 ary nojerena tamin'ireto mpivady primer manaraka ireto:
Nohamafisina tamin'ny alalan'ny PCR ireo takelaka tsirairay nampidirina tamin'ny alalan'ny Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (araka ny toromariky ny mpanamboatra). Manaova fanombohana mafana (10 minitra amin'ny 95 °C) ary tsingerina fanamafisana 35 (50 segondra amin'ny 95 °C, 1 minitra amin'ny 50 °C, ary 1 minitra amin'ny 72 °C).
Nohamafisina tao amin'ny Escherichia coli BL5615 tao anaty ron-kena TB (Sigma Aldrich) na tao anaty lovia 500 cm2 (Thermo Scientific) nandritra ny 4 ora tamin'ny 37°C ny phage avy amin'ny tranomboky, phage karazana voajanahary, phage voavonjy avy amin'ny CSF sy ny ra, na ny klôna tsirairay. Nesorina tamin'ny takelaka ny phage tamin'ny fanasana ny takelaka tamin'ny buffer Tris-EDTA (Fluka Analytical) na tamin'ny fanangonana ny takelaka tamin'ny tendron'ny pipette sterile. Natokana avy amin'ny supernatant kolontsaina na buffer fitrandrahana tamin'ny alàlan'ny polyethylene glycol (PEG 8000) precipitation (Promega) ny phage ary naverina natsipy tao anaty buffer Tris-EDTA.
Nesorina in-2-3 ny phage nohamafisina tamin'ny alalan'ny fampiasana vakana fanesorana endotoxin (Miltenyi Biotec) talohan'ny tsindrona intravenous (500 μl/biby). Tamin'ny fihodinana voalohany, nampidirina ny phage 2 × 1012; tamin'ny faharoa, phage 2 × 1010; tamin'ny fihodinana fahatelo sy fahefatra, phage 2 × 109 isaky ny biby. Ny votoatin'ny phage ao amin'ny CSF sy ny santionan-dra nangonina tamin'ny fotoana voatondro dia voafaritra tamin'ny fanisana takelaka araka ny torolalan'ny mpanamboatra (boky torolalana momba ny rafitra T7Select). Ny fisafidianana phage dia natao tamin'ny alalan'ny tsindrona intravenous ny tranomboky voadio ao amin'ny lalan-dra rambony na tamin'ny tsindrona indray ny phage nalaina avy amin'ny CSF tamin'ny fihodinana fifantenana teo aloha, ary ny fijinjana manaraka dia natao tamin'ny 10 minitra, 30 minitra, 60 minitra, 90 minitra, 120 minitra, 180 minitra, ary 240 minitra tsirairay avy ny santionan'ny CSF sy ny ra. Nisy fihodinana efatra nanaovana "in vivo panning" izay nitehirizana sy nanadihadiana misaraka ireo sampana roa voafantina nandritra ireo fihodinana telo voalohany tamin'ny fifantenana. Ireo "phage inserts" rehetra nalaina avy amin'ny CSF avy amin'ireo fihodinana roa voalohany tamin'ny fifantenana dia nojerena tamin'ny tanana, raha toa kosa ireo "clones" rehetra nalaina avy amin'ny CSF avy amin'ireo fihodinana roa farany tamin'ny fifantenana dia nojerena tamin'ny tanana. Ireo "phages" ra rehetra avy amin'ny fihodinana voalohany tamin'ny fifantenana dia nojerena tamin'ny tanana ihany koa. Ho an'ny tsindrona "clones" phages, ireo "phages" voafantina dia nohamafisina tao amin'ny E. coli (BL5615) tamin'ny takelaka 500 cm2 tamin'ny 37°C nandritra ny 4 ora. Ireo "clones" voafantina tsirairay sy nojerena tamin'ny tanana dia nambolena tao amin'ny "media TB". Taorian'ny fanesorana ny "phages", ny fanadiovana ary ny fanesorana ny endotoxine (araka ny voalaza etsy ambony), dia nampidirina tao anaty lalan-drà tao amin'ny lalan-dra rambony iray ny "phages" 2×1010/biby tao anaty 300 μl.
Fanodinana mialoha sy fanivanana kalitao ny angon-drakitra momba ny filaharana. Ny angon-drakitra manta 454/Roche dia novaina avy amin'ny endrika sarintany renirano mahazatra binary (sff) ho amin'ny endrika azo vakian'ny olombelona Pearson (fasta) amin'ny alàlan'ny rindrambaiko mpivarotra. Ny fanodinana fanampiny ny filaharan'ny nukleotida dia natao tamin'ny alàlan'ny programa sy script C manokana (fonosana rindrambaiko tsy navoaka) araka ny voalaza etsy ambany. Ny famakafakana ny angon-drakitra voalohany dia misy fomba fanivanana dingana maro hentitra. Mba hanivanana ireo famakiana izay tsy misy filaharan'ny ADN 12mer manan-kery, dia nalamina araka ny filaharany ny famakiana mba hahazoana marika fanombohana (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), marika fijanonana (TAAGCTTGCGGCCGCACTCGAGTA) ary fametahana ambadika (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGAC) amin'ny alàlan'ny fitsapana Needleman-Wunsch manerantany. fampifanarahana mamela hatramin'ny tsy fitoviana 2 isaky ny fampifanarahana31. Noho izany, ny famakiana tsy misy marika fanombohana sy fijanonana ary ny famakiana misy fametahana ambadika, izany hoe, fampifanarahana izay mihoatra ny isan'ny tsy fitoviana azo atao, dia nesorina tao amin'ny tranomboky. Raha ny amin'ireo famakiana sisa, ny filaharan'ny ADN N-mer izay mivelatra avy amin'ny marika fanombohana ary mifarana alohan'ny marika fijanonana dia nesorina tamin'ny filaharan'ny famakiana tany am-boalohany ary nokarakaraina bebe kokoa (antsoina hoe "insers"). Aorian'ny fandikana ny insert, ny ampahany aorian'ny codon fijanonana voalohany amin'ny faran'ny 5′ amin'ny primer dia esorina amin'ny insert. Ho fanampin'izany, ny nucleotides izay mitarika ho amin'ny codons tsy feno amin'ny faran'ny 3′ amin'ny primer dia nesorina ihany koa. Mba hanesorana ireo insert izay misy filaharana ambadika fotsiny, dia nesorina ihany koa ireo insert nadika manomboka amin'ny lamina asidra amine "PAG". Ny peptides izay manana halavana aorian'ny fandikana latsaky ny 3 asidra amine dia nesorina tao amin'ny tranomboky. Farany, esory ny redundancy ao amin'ny dobo insert ary farito ny fatran'ny insert tokana tsirairay. Ny valin'ity fanadihadiana ity dia nahitana lisitry ny filaharan'ny nucleotide (insers) sy ny fatran'ny (vakiana) azy ireo (Sary Fanampiny 1c sy 2).
Fampidirana ADN vondrona N-mer araka ny fitoviana amin'ny filaharana: Mba hanafoanana ny lesoka amin'ny filaharana manokana 454/Roche (toy ny olana amin'ny fanitarana homopolymer filaharana) ary hanesorana ireo famerimberenana tsy dia manan-danja loatra, ny fampidirana filaharana ADN N-mer (fampidirana) efa voasivana teo aloha dia alamina araka ny fitoviana. fampidirana (hatramin'ny fototra tsy mifanaraka 2 azo atao) amin'ny fampiasana algorithm miverimberina voafaritra toy izao manaraka izao: ny fampidirana dia alamina aloha araka ny fatran'izy ireo (avo indrindra ka hatramin'ny ambany indrindra), ary raha mitovy izy ireo, dia alamina araka ny filaharany faharoa araka ny halavany (lava indrindra ka hatramin'ny fohy indrindra)). Noho izany, ny fampidirana matetika sy lava indrindra dia mamaritra ny "vondrona" voalohany. Ny fatran'ny vondrona dia apetraka amin'ny fatran'ny fototra. Avy eo, ny fampidirana tsirairay sisa tavela ao amin'ny lisitra voalamina dia noezahina ampiana amin'ny vondrona amin'ny alàlan'ny fampifanarahana Needleman-Wunsch mifanandrify. Raha tsy mihoatra ny tokonam-baravarana 2 ny isan'ny tsy fitoviana, fampidirana, na famafana amin'ny fampifanarahana, dia ampiana amin'ny vondrona ny fampidirana, ary ny fatran'ny vondrona amin'ny ankapobeny dia ampitomboina araka ny impiry nampiana ny fampidirana. Ny fampidirana ampiana amin'ny vondrona dia asiana marika hoe efa nampiasaina ary tsy azo atao ny fanodinana fanampiny. Raha tsy azo ampiana amin'ny vondrona efa misy ny filaharan'ny fampidirana, dia ampiasaina hamoronana vondrona vaovao miaraka amin'ny fatran'ny fampidirana mety ny filaharan'ny fampidirana ary asiana marika hoe efa nampiasaina. Mifarana ny famerenana rehefa nampiasaina hamoronana vondrona vaovao ny filaharan'ny fampidirana tsirairay na azo ampidirina ao anatin'ny vondrona efa misy. Rehefa dinihina tokoa, ny fampidirana voangona misy nukleotida dia adika ho filaharan'ny peptide (tranomboky peptide). Ny vokatry ny fanadihadiana dia andiana fampidirana sy ny fatran'ny fampidirana mifanaraka amin'izany izay mahaforona ny isan'ny famakiana mifanesy (Sary Fanampiny 2).
Famoronana Motif: Mifototra amin'ny lisitry ny peptide miavaka, dia noforonina ny tranomboky misy ny lamina asidra amine rehetra (aa) araka ny aseho etsy ambany. Ny lamina tsirairay azo atao amin'ny halavany 3 dia nalaina avy amin'ny peptide ary ny lamina mivadika aminy dia nampiana miaraka amin'ny tranomboky motif iraisana misy ny lamina rehetra (tripeptides). Nojerena ny tranomboky misy motif miverimberina be ary nesorina ny famerimberenana. Avy eo, ho an'ny tripeptide tsirairay ao amin'ny tranomboky motif, dia nojerenay ny fisiany ao amin'ny tranomboky amin'ny alàlan'ny fitaovana kajy. Amin'ity tranga ity, ny fatran'ny peptide misy ny motif tripeptide hita dia ampiana ary omena ny motif ao amin'ny tranomboky motif ("isan'ny motif"). Ny vokatry ny famoronana motif dia array roa refy misy ny fisehoan'ny tripeptides (motifs) rehetra sy ny sandany tsirairay avy, izay ny isan'ny famakiana filaharana izay miteraka motif mifanaraka amin'izany rehefa voasivana, voaangona ary nadika ny famakiana. Metrika araka ny voalaza amin'ny antsipiriany etsy ambony.
Fanaraha-maso ny isan'ny motif sy ny scatterplot mifandraika amin'izany: Ny isan'ny motif ho an'ny santionany tsirairay dia nohavaozina tamin'ny fampiasana
izay ny ni no isan'ny famakiana misy lohahevitra i. Noho izany, ny vi dia maneho ny isan-jaton'ny fahamaroan'ny famakiana (na peptides) misy motif i ao amin'ny santionany. Ny sandan'ny P ho an'ny isan'ny motif tsy voarindra dia nokajiana tamin'ny fampiasana ny fitsapana marina an'i Fisher. Momba ny correlograms amin'ny isan'ny motif, ny fifandraisan'i Spearman dia nokajiana tamin'ny fampiasana ny isan'ny motif voarindra miaraka amin'ny R.
Mba hijerena ny votoatin'ny asidra amine amin'ny toerana tsirairay ao amin'ny tranomboky peptide, dia noforonina ny logograma web 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com). Voalohany, ny votoatin'ny asidra amine amin'ny toerana tsirairay amin'ny peptide 12-mer dia tehirizina ao anaty matrice 20×12. Avy eo, andiana peptide 1000 misy votoatin'ny asidra amine mitovy amin'ny toerana tsirairay dia foronina amin'ny endrika fasta-sequence ary omena ho toy ny fidirana amin'ny web-logo 3, izay mamorona sary maneho ny votoatin'ny asidra amine amin'ny toerana tsirairay. ho an'ny tranomboky peptide iray. Mba hijerena ny angon-drakitra maro refy, dia noforonina ny sarintany hafanana tamin'ny fampiasana fitaovana novolavolaina anatiny tao amin'ny R (biosHeatmap, fonosana R mbola tsy navoaka). Ny dendrograma aseho ao amin'ny sarintany hafanana dia nokajiana tamin'ny fampiasana ny fomba fivondronan'i Ward miaraka amin'ny metrika elanelana Euclidean. Ho an'ny fanadihadiana statistika momba ny angon-drakitra momba ny fanombanana motif, ny sandan'ny P ho an'ny fanombanana tsy ara-dalàna dia nokajiana tamin'ny fampiasana ny fitsapana marina an'i Fisher. Ny sandan'ny P ho an'ny angon-drakitra hafa dia nokajiana tao amin'ny R tamin'ny fampiasana ny fitsapana t an'ny Mpianatra na ANOVA.
Ireo klôna phage sy phage voafantina tsy misy insert dia nampidirina tamin'ny lalan-drà tamin'ny alalan'ny lalan-dra rambony (phage 2 × 1010/biby tao anaty PBS 300 μl). Folo minitra talohan'ny fampidiran-dra sy ny fametrahana azy, ireo biby ireo ihany dia nampidirina tamin'ny lalan-drà tamin'ny lectin misy marika DyLight594 100 μl (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minitra taorian'ny fampidirana phage, dia nampidirina tao am-po tamin'ny PBS 50 ml ny voalavo narahin'ny PFA/PBS 4% 50 ml. Napetraka tao anaty PFA/PBS 4% nandritra ny alina koa ny santionan'ny atidoha ary nalona tao anaty sucrose 30% nandritra ny alina tamin'ny 4°C. Nangatsiaka tampoka tao anaty fangaro OCT ireo santionany. Natao tamin'ny mari-pana ao an-trano ny fanadihadiana immunohistochemical ny santionany mangatsiaka tamin'ny cryosections 30 µm voasakana tamin'ny BSA 1% ary notehirizina tamin'ny antibody polyclonal misy marika FITC manohitra ny phage T7 (Novus NB 600-376A) tamin'ny 4 °C. Avela hilona mandritra ny alina. Farany, nosasana intelo tamin'ny PBS ireo fizarana ary nojerena tamin'ny mikroskopia laser confocal (Leica TCS SP5).
Ny peptide rehetra manana fahadiovana farafahakeliny 98% dia novokarin'ny GenScript USA, novokarina tamin'ny biotinylation ary no-lyophilize. Ny Biotin dia mifamatotra amin'ny alàlan'ny triple glycine spacer fanampiny eo amin'ny N-terminus. Jereo ny peptide rehetra amin'ny alàlan'ny spectrometry mass.
Nafangaro tamin'ny peptide biotinylated equimolar mihoatra ny 5 heny, peptide manakana ny BACE1 biotinylated, na fitambarana (tahan'ny 3:1) amin'ny peptide manakana ny BACE1 biotinylated sy peptide manakana ny BACE1 ao anaty DMSO 5–10%/napetraka tao amin'ny PBS ny Streptavidin (Sigma S0677). Adiny 1 amin'ny mari-pana ao an-trano talohan'ny tsindrona. Natsindrona tamin'ny lalan-dra tamin'ny fatra 10 mg/kg tao amin'ny iray amin'ireo lalan-dra rambon'ny voalavo manana lavaka ao amin'ny atidoha ny peptide mifamatotra amin'ny Streptavidin.
Notombanana tamin'ny alalan'ny ELISA ny fifantohan'ny complexes streptavidin-peptide. Norakofana antibody anti-streptavidin 1.5 μg/ml totozy (Thermo, MA1-20011) nandritra ny alina tamin'ny 4°C ny takelaka microtiter Nunc Maxisorp (Sigma). Rehefa avy nosakanana (buffer blocking: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0.05% NP40, 0.25% gelatin, 1% BSA) tamin'ny mari-pana ao an-trano nandritra ny 2 ora, dia sasao amin'ny Tween-20/PBS (wash buffer) 0.05% mandritra ny 3 segondra ny takelaka, ary nampiana tao anaty lavadrano voatsatso tamin'ny buffer blocking (plasma 1:10,000, CSF 1:115) ny santionan'ny CSF sy plasma. Avy eo dia notehirizina nandritra ny alina tamin'ny 4°C niaraka tamin'ny antibody detection (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Rehefa avy nosasana intelo, dia hita tamin'ny alalan'ny fampidirana tao anaty vahaolana substrate TMB (Roche) nandritra ny 20 minitra ny streptavidin. Rehefa avy najanona ny fivoaran'ny loko tamin'ny 1M H2SO4, dia refeso amin'ny 450 nm ny absorbance.
Notombanana tamin'ny alalan'ny Aβ(1-40) ELISA ny fiasan'ny complexe streptavidin-peptide-BACE1 inhibitor araka ny protocole-n'ny mpanamboatra (Wako, 294-64701). Raha fintinina, dia natsonika tao anaty diluent mahazatra (1:23) ireo santionan'ny CSF ary notehirizina nandritra ny alina tamin'ny 4°C tao anaty takelaka 96-lavaka voarakotra antibody BNT77. Taorian'ny dingana fanasana dimy, dia nampiana antibody BA27 mifamatotra amin'ny HRP ary notehirizina nandritra ny 2 ora tamin'ny 4°C, narahin'ny dingana fanasana dimy. Hita tamin'ny alalan'ny incubation tao anaty vahaolana TMB nandritra ny 30 minitra tamin'ny mari-pana ao an-trano ny Aβ(1–40). Rehefa najanona tamin'ny alalan'ny stop solution ny fivoaran'ny loko, dia refeso ny absorbance amin'ny 450 nm. Natao extraction phase solid ny santionan'ny plasma talohan'ny Aβ(1–40) ELISA. Nampiana tamin'ny 0.2% DEA (Sigma) tao anaty takelaka 96-lavaka ny plasma ary notehirizina tamin'ny mari-pana ao an-trano nandritra ny 30 minitra. Rehefa avy nosasana tamin'ny rano sy methanol 100% ireo takelaka SPE (Oasis, 186000679), dia nampiana santionan'ny plasma ireo takelaka SPE ary nesorina ny rano rehetra. Nosasana ireo santionany (voalohany tamin'ny methanol 5% avy eo methanol 30%) ary nodiovina tamin'ny methanol 2% NH4OH/90%. Rehefa avy nohamainina tamin'ny 55°C nandritra ny 99 minitra tamin'ny herinaratra N2 tsy miova ny eluate, dia nahena tao anaty ranoka mpanalefaka mahazatra ireo santionany ary norefesina araka ny voalaza etsy ambony ny Aβ(1–40).
Ahoana no fomba hanonona ity lahatsoratra ity: Urich, E. et al. Fanaterana entana mankany amin'ny atidoha amin'ny fampiasana peptides transit hita in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB ary Moos T. Fanaterana fanafody makromolekiola ao amin'ny atidoha amin'ny alàlan'ny fitsaboana voatokana. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., ary Martinez-Martinez, P. Fanaterana fanafody peptide sy proteinina miampita ny sakana amin'ny ra sy ny ati-doha. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Ny sakana amin'ny ra sy ny ati-doha: sakana iray amin'ny fivoaran'ny fanafody ao amin'ny atidoha. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, ary Byrd, A. Vinavina ho an'ny fanatsaran'ny fanaterana fanafody sy ny fikendrena azy any amin'ny atidoha amin'ny alàlan'ny lalan'ny choroid plexus-CSF. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Fanavaozana ny fanafody biolojika amin'ny alalan'ny soavaly Trojan molekiola ho an'ny fanaterana ny atidoha. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, Fitaterana peptide entin'ny mpandray WM miampita ny sakana amin'ny ra sy ny ati-doha. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Mampitombo ny fidiran'ny antibody fitsaboana ao amin'ny atidoha sy ny fahombiazany amin'ny fampiasana ny molekiola molekiola monovalent. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Ny fitaterana ny mpandray transferrin (TfR) dia mamaritra ny fidiran'ny ati-doha amin'ny karazana hery fiarovana amin'ny antibody TfR. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).