Tak, fordi du besøger Nature.com. Du bruger en browserversion med begrænset CSS-understøttelse. For at få den bedste oplevelse anbefaler vi, at du bruger en opdateret browser (eller deaktiverer kompatibilitetstilstand i Internet Explorer). For at sikre løbende support viser vi desuden webstedet uden typografier og JavaScript.
Viser en karrusel med tre slides på én gang. Brug knapperne Forrige og Næste til at navigere gennem tre slides ad gangen, eller brug skyderknapperne i slutningen til at navigere gennem tre slides ad gangen.
Blod-hjerne-barrieren og blod-hjerne-barrieren forhindrer bioterapeutiske midler i at nå deres mål i centralnervesystemet, hvilket hindrer effektiv behandling af neurologiske sygdomme. For at opdage nye hjernetransportører in vivo introducerede vi et T7-fagpeptidbibliotek og serielt indsamlede blod og cerebrospinalvæske (CSF) ved hjælp af en kanyleret "conscious large pool"-model af rotter. Specifikke fagkloner blev stærkt beriget med CSF efter fire selektionsrunder. Test af individuelle kandidatpeptider afslørede mere end 1000 gange berigelse i CSF. Bioaktiviteten af ​​den peptidmedierede levering til hjernen blev bekræftet af en 40% reduktion i niveauet af amyloid-β i cerebrospinalvæsken ved hjælp af en BACE1-peptidhæmmer bundet til det identificerede nye transitpeptid. Disse resultater tyder på, at de peptider, der er identificeret ved in vivo-fagselektionsmetoder, kan være nyttige vehikler til systemisk levering af makromolekyler til hjernen med en terapeutisk effekt.
Forskning i målrettet terapi med centralnervesystemet (CNS) har i høj grad fokuseret på at identificere optimerede lægemidler og stoffer, der udviser CNS-målrettede egenskaber, med mindre indsats for at opdage de mekanismer, der driver aktiv lægemiddelafgivelse til hjernen. Dette begynder at ændre sig nu, da lægemiddelafgivelse, især store molekyler, er en integreret del af moderne neurovidenskabelig lægemiddeludvikling. Miljøet i centralnervesystemet er godt beskyttet af det cerebrovaskulære barrieresystem, der består af blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​og blod-hjerne-barrieren (BCBB)1, hvilket gør det udfordrende at levere lægemidler til hjernen1,2. Det anslås, at næsten alle lægemidler med store molekyler og mere end 98 % af lægemidler med små molekyler elimineres fra hjernen3. Derfor er det meget vigtigt at identificere nye hjernetransportsystemer, der giver effektiv og specifik levering af terapeutiske lægemidler til CNS4,5. Imidlertid præsenterer BBB og BCSFB også en fremragende mulighed for lægemiddelafgivelse, da de trænger ind i og kommer ind i alle strukturer i hjernen gennem dens omfattende vaskulatur. De nuværende bestræbelser på at anvende ikke-invasive metoder til levering til hjernen er således i høj grad baseret på mekanismen for receptormedieret transport (PMT) ved hjælp af den endogene BBB6-receptor. Trods nylige vigtige fremskridt ved hjælp af transferrinreceptorvejen7,8 er yderligere udvikling af nye leveringssystemer med forbedrede egenskaber nødvendig. Med dette for øje var vores mål at identificere peptider, der er i stand til at mediere CSF-transport, da de i princippet kunne bruges til at levere makromolekyler til CNS eller til at åbne nye receptorveje. Især specifikke receptorer og transportører i det cerebrovaskulære system (BBB og BSCFB) kan tjene som potentielle mål for aktiv og specifik levering af bioterapeutiske lægemidler. Cerebrospinalvæske (CSF) er et sekretorisk produkt fra choroid plexus (CS) og er i direkte kontakt med hjernens interstitielle væske gennem subarachnoidalrummet og ventrikulærrummet4. For nylig er det blevet vist, at subarachnoidal cerebrospinalvæske diffunderer overdrevent ind i hjernens interstitium9. Vi håber at kunne få adgang til det parenkymale rum ved hjælp af denne subarachnoide indstrømningskanal eller direkte gennem BBB. For at opnå dette implementerede vi en robust in vivo fagselektionsstrategi, der ideelt set identificerer peptider, der transporteres via en af ​​disse to forskellige veje.
Vi beskriver nu en sekventiel in vivo phage display screeningsmetode med CSF-prøveudtagning koblet med high throughput-sekventering (HTS) for at overvåge indledende selektionsrunder med den højeste biblioteksdiversitet. Screening blev udført på vågne rotter med en permanent implanteret stor cisterna (CM) kanyle for at undgå blodkontaminering. Det er vigtigt at bemærke, at denne tilgang selekterer både hjerne-målrettede peptider og peptider med transportaktivitet på tværs af den cerebrovaskulære barriere. Vi brugte T7-fager på grund af deres lille størrelse (~60 nm)10 og foreslog, at de er egnede til transport af vesikler, der tillader transcellulær krydsning af endotel- og/eller epitel-medulla-barrieren. Efter fire runder med panning blev fagpopulationer isoleret, hvilket viste stærk in vivo CSF-berigelse og cerebral mikrokar-association. Det er vigtigt at bemærke, at vi var i stand til at bekræfte vores resultater ved at demonstrere, at de foretrukne og kemisk syntetiserede bedste kandidatpeptider er i stand til at transportere proteinfragt ind i cerebrospinalvæsken. Først blev de farmakodynamiske virkninger af CNS fastslået ved at kombinere et ledende transitpeptid med en hæmmer af BACE1-peptidet. Ud over at demonstrere, at in vivo funktionelle screeningsstrategier kan identificere nye hjernetransportpeptider som effektive proteinfragtbærere, forventer vi, at lignende funktionelle selektionsmetoder også vil blive vigtige i forbindelse med identifikation af nye hjernetransportveje.
Baseret på plakdannende enheder (PFU) blev der efter fagpakningstrinnet designet og oprettet et bibliotek af tilfældige 12-mer lineære T7-fagpeptider med en diversitet på cirka 109 (se Materialer og Metoder). Det er vigtigt at bemærke, at vi omhyggeligt analyserede dette bibliotek før in vivo-panning. PCR-amplifikation af fagbiblioteksprøver ved hjælp af modificerede primere genererede amplikoner, der var direkte anvendelige til HTS (Supplerende figur 1a). På grund af a) HTS11-sekventeringsfejl, b) indvirkning på primernes kvalitet (NNK)1-12, og c) tilstedeværelsen af ​​vildtype (wt) fag (skeletindsatser) i standby-biblioteket blev der implementeret en sekvensfiltreringsprocedure for kun at udtrække verificeret sekvensinformation (Supplerende figur 1b). Disse filtertrin gælder for alle HTS-sekventeringsbiblioteker. For standardbiblioteket blev der opnået i alt 233.868 aflæsninger, hvoraf 39% bestod filterkriterierne og blev brugt til biblioteksanalyse og udvælgelse til efterfølgende runder (Supplerende figur 1c-e). Aflæsningerne var overvejende multipla af 3 basepar i længden med en top ved 36 nukleotider (supplerende figur 1c), hvilket bekræfter biblioteksdesignet (NNK) 1-12. Bemærkelsesværdigt indeholdt cirka 11% af biblioteksmedlemmerne et 12-dimensionelt vildtype (wt) backbone PAGISRELVDKL-indsæt, og næsten halvdelen af ​​sekvenserne (49%) indeholdt insertioner eller deletioner. HTS'en af ​​biblioteksbiblioteket bekræftede den høje diversitet af peptider i biblioteket: mere end 81% af peptidsekvenserne blev kun fundet én gang, og kun 1,5% forekom i ≥4 kopier (supplerende figur 2a). Hyppighederne af aminosyrer (aa) på alle 12 positioner i repertoiret korrelerede godt med de forventede frekvenser for antallet af kodoner genereret af det degenererede NKK-repertoire (supplerende figur 2b). Den observerede frekvens af aa-rester kodet af disse inserter korrelerede godt med den beregnede frekvens (r = 0,893) (supplerende figur 2c). Forberedelsen af ​​fagbiblioteker til injektion omfatter trinene amplifikation og fjernelse af endotoksin. Dette har tidligere vist sig potentielt at reducere diversiteten af ​​fagbiblioteker12,13. Derfor sekventerede vi et pladeamplificeret fagbibliotek, der havde gennemgået endotoksinfjernelse, og sammenlignede det med det originale bibliotek for at estimere hyppigheden af ​​AA. En stærk korrelation (r = 0,995) blev observeret mellem den originale pool og den amplificerede og oprensede pool (supplerende figur 2d), hvilket indikerer, at konkurrence mellem kloner amplificeret på plader ved hjælp af T7-fag ikke forårsagede større bias. Denne sammenligning er baseret på hyppigheden af ​​tripeptidmotiver i hvert bibliotek, da diversiteten af ​​biblioteker (~109) ikke kan indfanges fuldt ud, selv med HTS. Frekvensanalyse af aa i hver position afslørede en lille positionsafhængig bias i de sidste tre positioner i det indtastede repertoire (supplerende figur 2e). Afslutningsvis konkluderede vi, at bibliotekets kvalitet og diversitet var acceptabel, og kun mindre ændringer i diversitet blev observeret på grund af amplifikation og forberedelse af fagbiblioteker mellem flere selektionsrunder.
Seriel cerebrospinalvæskeprøvetagning kan udføres ved kirurgisk at implantere en kanyle i cerebrospinalvæsken (CM) hos vågne rotter for at lette identifikationen af ​​T7-fag injiceret intravenøst ​​(iv) via BBB og/eller BCSFB (fig. 1a-b). Vi anvendte to uafhængige selektionsarme (arme A og B) i de første tre runder af in vivo-selektion (fig. 1c). Vi øgede gradvist stringensen af ​​selektionen ved at reducere den samlede mængde fag introduceret i de første tre selektionsrunder. I den fjerde panoreringsrunde kombinerede vi prøver fra gren A og B og udførte tre yderligere uafhængige selektioner. For at studere in vivo-egenskaberne af T7-fagpartikler i denne model blev vildtype-fag (PAGISRELVDKL master insert) injiceret i rotter via halevenen. Genvinding af fager fra cerebrospinalvæske og blod på forskellige tidspunkter viste, at relativt små T7 ikosaedriske fager havde en hurtig initial clearancefase fra blodkompartmentet (supplerende fig. 3). Baseret på de administrerede titere og rotternes blodvolumen beregnede vi, at kun ca. 1 vægt% fag fra den administrerede dosis blev detekteret i blodet 10 minutter efter intravenøs injektion. Efter dette indledende hurtige fald blev der målt en langsommere primær clearance med en halveringstid på 27,7 minutter. Det er vigtigt at bemærke, at kun meget få fager blev udtaget fra CSF-rummet, hvilket indikerer en lav baggrund for migration af vildtypefager ind i CSF-rummet (Supplerende Fig. 3). I gennemsnit blev kun ca. 1 x 10-3% titere af T7-fag i blodet og 4 x 10-8% af initialt infunderede fager detekteret i cerebrospinalvæsken over hele prøveudtagningsperioden (0-250 min). Det er værd at bemærke, at halveringstiden (25,7 min) for vildtypefag i cerebrospinalvæske var den samme som den, der blev observeret i blod. Disse data viser, at barrieren, der adskiller CSF-rummet fra blodet, er intakt i CM-kanulerede rotter, hvilket muliggør in vivo-selektion af fagbiblioteker for at identificere kloner, der let transporteres fra blodet ind i CSF-rummet.
(a) Opsætning af en metode til genudtagning af cerebrospinalvæske (CSF) fra en stor pulje. (b) Diagram, der viser den cellulære placering af centralnervesystemets (CNS) barriere og den selektionsstrategi, der anvendes til at identificere peptider, der krydser blod-hjerne-barrieren (BBB) ​​og blod-hjerne-barrieren. (c) In vivo phage display screening flowdiagram. I hver selektionsrunde blev fager (dyreidentifikatorer inden for pilene) injiceret intravenøst. To uafhængige alternative grene (A, B) holdes separat indtil 4. selektionsrunde. I selektionsrunde 3 og 4 blev hver fagklon ekstraheret fra CSF manuelt sekventeret. (d) Kinetik af fag isoleret fra blod (røde cirkler) og cerebrospinalvæske (grønne trekanter) under den første selektionsrunde i to kanulerede rotter efter intravenøs injektion af T7-peptidbiblioteket (2 x 1012 fager/dyr). Blå firkanter angiver den gennemsnitlige initiale koncentration af fag i blodet, beregnet ud fra mængden af ​​injiceret fag, under hensyntagen til det samlede blodvolumen. De sorte firkanter angiver skæringspunktet for y-linjen ekstrapoleret fra blodfagkoncentrationer. (e,f) Præsenterer den relative frekvens og fordeling af alle mulige overlappende tripeptidmotiver fundet i peptidet. Antallet af motiver fundet i 1000 aflæsninger er vist. Signifikant (p < 0,001) er berigede motiver markeret med røde prikker. (e) Korrelationsspredningsdiagram, der sammenligner den relative frekvens af tripeptidmotivet i det injicerede bibliotek med blodafledt fag fra dyr #1.1 og #1.2. (f) Korrelationsspredningsdiagram, der sammenligner de relative frekvenser af dyrefag-tripeptidmotiver #1.1 og #1.2 isoleret i blod og cerebrospinalvæske. (g, h) Sekvens-ID-repræsentation af fag beriget med blod (g) versus injicerede biblioteker og fag beriget med CSF (h) versus blod efter en runde in vivo-selektion i begge dyr. Størrelsen af ​​den et-bogstavskode angiver, hvor ofte den pågældende aminosyre forekommer på den position. Grøn = polær, lilla = neutral, blå = basisk, rød = sur og sort = hydrofobe aminosyrer. Figur 1a, b blev designet og produceret af Eduard Urich.
Vi injicerede et fagpeptidbibliotek i to CM-instrumentrotter (klader A og B) og isolerede fagen fra cerebrospinalvæske og blod (figur 1d). Den indledende hurtige clearance af biblioteket var mindre udtalt sammenlignet med vildtypefagen. Den gennemsnitlige halveringstid for det injicerede bibliotek i begge dyr var 24,8 minutter i blod, svarende til vildtypefagen, og 38,5 minutter i CSF. Blod- og cerebrospinalvæskefagprøver fra hvert dyr blev underkastet HTS, og alle identificerede peptider blev analyseret for tilstedeværelsen af ​​et kort tripeptidmotiv. Tripeptidmotiver blev valgt, fordi de giver et minimalt grundlag for strukturdannelse og peptid-protein-interaktioner14,15. Vi fandt en god korrelation i fordelingen af ​​motiver mellem det injicerede fagbibliotek og kloner ekstraheret fra blodet fra begge dyr (figur 1e). Dataene indikerer, at bibliotekets sammensætning kun er marginalt beriget i blodområdet. Aminosyrefrekvenser og konsensussekvenser blev yderligere analyseret på hver position ved hjælp af en tilpasning af Weblogo16-softwaren. Interessant nok fandt vi en stærk berigelse af blodglycinrester (fig. 1g). Da blod blev sammenlignet med kloner udvalgt fra CSF, observeredes stærk selektion og en vis fraselektion af motiver (fig. 1f), og visse aminosyrer var fortrinsvis til stede på forudbestemte positioner i 12-medlemmet (fig. 1h). Bemærkelsesværdigt adskilte individuelle dyr sig signifikant i cerebrospinalvæsken, hvorimod blodglycinberigelse blev observeret hos begge dyr (supplerende fig. 4a-j). Efter stringent filtrering af sekvensdata i cerebrospinalvæsken fra dyr #1.1 og #1.2 blev i alt 964 og 420 unikke 12-mer peptider opnået (supplerende fig. 1d-e). De isolerede fagkloner blev amplificeret og underkastet en anden runde in vivo-selektion. Fag ekstraheret fra anden selektion blev underkastet HTS i hvert dyr, og alle identificerede peptider blev brugt som input til et motivgenkendelsesprogram for at analysere forekomsten af ​​tripeptidmotiver (fig. 2a, b, ef). Sammenlignet med den første cyklus af fagen udvundet fra CSF observerede vi yderligere selektion og fraselektion af mange motiver i CSF i grene A og B (fig. 2). En netværksidentifikationsalgoritme blev anvendt til at bestemme, om de repræsenterede forskellige mønstre af konsistent sekvens. En klar lighed blev observeret mellem de 12-dimensionelle sekvenser udvundet af CSF i alternativ klade A (fig. 2c, d) og klade B (fig. 2g, h). Den samlede analyse i hver gren afslørede forskellige selektionsprofiler for 12-mer peptider (supplerende fig. 5c, d) og en stigning i CSF/blodtiterforholdet over tid for samlede kloner efter den anden selektionsrunde sammenlignet med den første selektionsrunde (supplerende fig. 5e).
Berigelse af motiver og peptider i cerebrospinalvæske ved to på hinanden følgende runder af in vivo funktionel fagdisplayselektion.
Alle cerebrospinalvæskefager udvundet fra den første runde af hvert dyr (dyr #1.1 og #1.2) blev samlet, amplificeret, HT-sekventeret og geninjiceret sammen (2 x 1010 fager/dyr) 2 SM-kanulerede rotter (#1.1 → #). 2.1 og 2.2, 1.2 → 2.3 og 2.4). (a, b, e, f) Korrelationsspredningsdiagrammer, der sammenligner den relative hyppighed af tripeptidmotiver for alle CSF-afledte fager i den første og anden selektionsrunde. Relativ hyppighed og fordeling af motiver, der repræsenterer alle mulige overlappende tripeptider fundet i peptider i begge orienteringer. Antallet af motiver fundet i 1000 aflæsninger er vist. Motiver, der blev signifikant (p < 0,001) selekteret eller ekskluderet i et af de sammenlignede biblioteker, er fremhævet med røde prikker. (c, d, g, h) Sekvenslogo-repræsentation af alle CSF-rige sekvenser på 12 aminosyrer baseret på runde 2 og 1 af in vivo-selektion. Størrelsen af ​​den et-bogstavs kode angiver, hvor ofte den pågældende aminosyre forekommer på den position. For at repræsentere logoet sammenlignes hyppigheden af ​​CSF-sekvenser ekstraheret fra individuelle dyr mellem to selektionsrunder, og de berigede sekvenser i anden runde vises: (c) #1.1–#2.1 (d) #1.1–#2.2 (g) #1.2–#2.3 og (h) #1.2–#2.4. De mest berigede aminosyrer på en given position i (c, d) dyr nr. 2.1 og nr. 2.2 eller (g, h) i dyr nr. 2.3 og nr. 2.4 er vist i farve. Grøn = polær, lilla = neutral, blå = basisk, rød = sur og sort = hydrofobe aminosyrer.
Efter den tredje selektionsrunde identificerede vi 124 unikke peptidsekvenser (#3.1 og #3.2) fra 332 CSF-rekonstituerede fagkloner isoleret fra to dyr (supplerende figur 6a). Sekvensen LGSVS (18,7%) havde den højeste relative andel, efterfulgt af vildtype-inserterne PAGISRELVDKL (8,2%), MRWFFSHASQGR (3%), DVAKVS (3%), TWLFSLG (2,2%) og SARGSWREIVSLS (2,2%). I den sidste fjerde runde samlede vi to uafhængigt udvalgte grene fra tre separate dyr (figur 1c). Af de 925 sekventerede fagkloner udvundet fra CSF fandt vi i den fjerde runde 64 unikke peptidsekvenser (supplerende figur 6b), hvoraf den relative andel af vildtype-fager faldt til 0,8%. De mest almindelige CSF-kloner i fjerde runde var LYVLHSRGLWGFKLAAALE (18%), LGSVS (17%), GFVRFRLSNTR (14%), KVAWRVFSLFWK (7%), SVHGV (5%), GRPQKINGARVC (3,6%) og RLSSVDSDLSGC (3,2%). %). Længdeintervallet for de udvalgte peptider skyldes nukleotid-insertioner/deletioner eller for tidlige stopkodoner i biblioteksprimerne, når degenererede kodoner anvendes til NNK-biblioteksdesign. For tidlige stopkodoner genererer kortere peptider og selekteres, fordi de indeholder det gunstige aa-motiv. Længere peptider kan være et resultat af insertioner/deletioner i primerne i de syntetiske biblioteker. Dette placerer det designede stopkodon uden for rammen og læser det, indtil et nyt stopkodon vises nedstrøms. Generelt beregnede vi berigelsesfaktorer for alle fire selektionsrunder ved at sammenligne inputdataene med prøveoutputdataene. Til den første screeningsrunde brugte vi vildtype-fagtitere som en ikke-specifik baggrundsreference. Interessant nok var negativ fagselektion meget stærk i den første CSF-cyklus, men ikke i blodet (fig. 3a), hvilket kan skyldes den lave sandsynlighed for passiv diffusion af de fleste medlemmer af peptidbiblioteket ind i CSF-rummet, eller relative fager har en tendens til at blive mere effektivt tilbageholdt eller fjernet fra blodbanen end bakteriofager. I den anden runde af panning blev der imidlertid observeret en stærk selektion af fager i CSF i begge klader, hvilket tyder på, at den foregående runde var beriget med fager, der udviste peptider, der fremmer CSF-optagelse (fig. 3a). Igen uden signifikant blodberigelse. Også i den tredje og fjerde runde var fagklonerne signifikant beriget med CSF. Ved at sammenligne den relative frekvens af hver unikke peptidsekvens mellem de sidste to selektionrunder fandt vi, at sekvenserne var endnu mere berigede i den fjerde selektionrunde (fig. 3b). I alt 931 tripeptidmotiver blev ekstraheret fra alle 64 unikke peptidsekvenser ved hjælp af begge peptidorienteringer. De mest berigede motiver i fjerde runde blev nærmere undersøgt for deres berigelsesprofiler på tværs af alle runder sammenlignet med det injicerede bibliotek (grænseværdi: 10 % berigelse) (Supplerende figur 6c). Generelle selektionsmønstre viste, at de fleste af de undersøgte motiver var beriget i alle tidligere runder af begge selektionsgrene. Nogle motiver (f.eks. SGL, VSG, LGS GSV) var dog overvejende fra alternativ klade A, mens andre (f.eks. FGW, RTN, WGF, NTR) var beriget i alternativ klade B.
Validering af CSF-transport af CSF-berigede fag-displayede peptider og biotinylerede leaderpeptider konjugeret til streptavidin-nyttelaster.
(a) Berigelsesforhold beregnet i alle fire runder (R1-R4) baseret på injicerede (input = I) fag (PFU) titere og bestemte CSF fagtitere (output = O). Berigelsesfaktorer for de sidste tre runder (R2-R4) blev beregnet ved sammenligning med den foregående runde og den første runde (R1) med vægtdata. Åbne søjler er cerebrospinalvæske, skyggelagte søjler er plasma. (***p < 0,001, baseret på Student's t-test). (b) Liste over de mest udbredte fagpeptider, rangeret efter deres relative andel i forhold til alle fager indsamlet i CSF efter runde 4 af udvælgelsen. De seks mest almindelige fagkloner er fremhævet med farve, nummereret og deres berigelsesfaktorer mellem runde 3 og 4 af udvælgelsen (indsæt). (c, d) De seks mest berigede fagkloner, tomme fag- og forældrefagpeptidbiblioteker fra runde 4 blev analyseret individuelt i en CSF-prøvetagningsmodel. CSF- og blodprøver blev indsamlet på de angivne tidspunkter. (c) Lige store mængder af 6 kandidat-fagkloner (2 x 1010 fager/dyr), tomme fager (#1779) (2 x 1010 fager/dyr) og stamfagpeptidbiblioteker (2 x 1012 fager/dyr). Mindst 3 cm3 injiceres til det kanulerede dyr separat via halevenen. CSF-farmakokinetikken for hver injiceret fagklon og fagpeptidbibliotek over tid er vist. (d) viser det gennemsnitlige CSF/blod-forhold for alle udvundne fager/ml over prøveudtagningstiden. (e) Fire syntetiske leaderpeptider og én scrambled kontrol blev bundet med biotin til streptavidin via deres N-terminal (tetramer-display) efterfulgt af injektion (halevene iv, 10 mg streptavidin/kg). Mindst tre intuberede rotter (N = 3). CSF-prøver blev indsamlet på de angivne tidspunkter, og streptavidin-koncentrationerne blev målt ved CSF-anti-streptavidin-ELISA (nd = ikke detekteret). (*p<0,05, **p<0,01, ***p<0,001, baseret på ANOVA-test). (f) Sammenligning af aminosyresekvensen for den mest berigede fagpeptidklon #2002 (lilla) med andre udvalgte fagpeptidkloner fra 4. selektionsrunde. Identiske og lignende aminosyrefragmenter er farvekodede.
Af alle berigede fager i fjerde runde (fig. 3b) blev seks kandidatkloner udvalgt til yderligere individuel analyse i CSF-prøvetagningsmodellen. Lige store mængder af seks kandidatfag-, tomme fag- (uden indsættelse) og profagpeptidbiblioteker blev injiceret i tre kanulerede CM-dyr, og farmakokinetikken blev bestemt i CSF- (fig. 3c) og blod- (supplerende fig. 7) assays. Alle testede fagkloner målrettede CSF-kompartmentet på et niveau, der var 10-1000 gange højere end den tomme kontrolfag (#1779). For eksempel havde klonerne #2020 og #2077 omkring 1000 gange højere CSF-titre end kontrolfager. Den farmakokinetiske profil for hvert udvalgt peptid er forskellig, men de har alle en høj CSF-målsøgningsevne. Vi observerede et konstant fald over tid for klonerne #1903 og #2011, mens en stigning i løbet af de første 10 minutter for klonerne #2077, #2002 og #2009 kan indikere aktiv transport, men dette skal verificeres. Klonerne #2020, #2002 og #2077 stabiliserede sig på høje niveauer, mens CSF-koncentrationen af ​​klon #2009 langsomt faldt efter den indledende stigning. Vi sammenlignede derefter den relative frekvens af hver CSF-kandidat med dens blodkoncentration (fig. 3d). Korrelationen mellem den gennemsnitlige titer af hver CSF-kandidat og dens blodtiter på alle prøvetagningstidspunkter viste, at tre af de seks kandidater var signifikant beriget med blod-CSF. Interessant nok viste klon #2077 højere blodstabilitet (supplerende figur 7). For at bekræfte, at peptiderne i sig selv er i stand til aktivt at transportere anden last end fagpartikler ind i CSF-rummet, syntetiserede vi fire lederpeptider derivatiseret med biotin ved N-terminalen, hvor peptiderne binder sig til fagpartiklen. Biotinylerede peptider (nr. 2002, 2009, 2020 og 2077) blev konjugeret med streptavidin (SA) for at opnå multimere former, der til en vis grad efterlignede faggeometri. Dette format tillod os også at måle SA-eksponering i blod og cerebrospinalvæske som lasttransporterende proteinpeptider. Det er vigtigt at bemærke, at fagdata ofte kunne reproduceres, når syntetiske peptider blev administreret i dette SA-konjugerede format (fig. 3e). De blandede peptider havde mindre initial eksponering og hurtigere CSF-clearance med ikke-detekterbare niveauer inden for 48 timer. For at få indsigt i leveringsvejene for disse peptidfagkloner ind i CSF-rummet analyserede vi lokaliseringen af ​​individuelle fagpeptidhits ved hjælp af immunhistokemi (IHC) for direkte at detektere fagpartikler 1 time efter intravenøs injektion in vivo. Det er værd at bemærke, at klonerne #2002, #2077 og #2009 kunne detekteres ved stærk farvning i hjernekapillærer, mens kontrolfag (#1779) og klon #2020 ikke blev detekteret (Supplerende Figur 8). Dette tyder på, at disse peptider bidrager til effekten på hjernen netop ved at krydse BBB. Yderligere detaljeret analyse er nødvendig for at teste denne hypotese, da BSCFB-ruten også kan være involveret. Ved sammenligning af aminosyresekvensen for den mest berigede klon (#2002) med andre udvalgte peptider blev det bemærket, at nogle af dem har lignende aminosyreudvidelser, hvilket kan indikere en lignende transportmekanisme (Fig. 3f).
På grund af sin unikke plasmaprofil og signifikante stigning i CSF over tid blev fagdisplayklon #2077 yderligere undersøgt over en længere periode på 48 timer og var i stand til at reproducere den hurtige stigning i CSF observeret i forbindelse med vedvarende SA-niveauer (fig. 4a). Med hensyn til andre identificerede fagkloner farvede #2077 kraftigt for hjernekapillærer og viste signifikant kolokalisering med kapillærmarkørlektin set ved højere opløsning og muligvis en vis farvning i det parenkymale rum (figur 4b). For at undersøge, om peptidmedierede farmakologiske effekter kunne opnås i CNS, udførte vi et eksperiment, hvor biotinylerede versioner af i) #2077 transitpeptidet og ii) BACE1-hæmmerpeptidet blev blandet med SA i to forskellige forhold. Til den ene kombination anvendte vi kun BACE1-peptidhæmmeren, og til den anden anvendte vi et 1:3-forhold mellem BACE1-peptidhæmmer og #2077-peptid. Begge prøver blev administreret intravenøst, og niveauet af beta-amyloidpeptid 40 (Abeta40) i blod og cerebrospinalvæske blev målt over tid. Abeta40 blev målt i CSF, da det afspejler BACE1-hæmning i hjerneparenkym. Som forventet reducerede begge komplekser signifikant blodniveauerne af Abeta40 (fig. 4c, d). Imidlertid forårsagede kun prøver indeholdende en blanding af peptid nr. 2077 og en hæmmer af BACE1-peptidet konjugeret til SA et signifikant fald i Abeta40 i cerebrospinalvæsken (fig. 4c). Dataene viser, at peptid nr. 2077 er i stand til at transportere 60 kDa SA-proteinet ind i CNS og også inducerer farmakologiske effekter med SA-konjugerede hæmmere af BACE1-peptidet.
(a) Klonal injektion (2 × 10 fager/dyr) af T7-fag, der viser langsigtede farmakokinetiske profiler af CSF-peptid #2077 (RLSSVDSDLSGC) og uinjiceret kontrolfag (#1779) i mindst tre CM-intuberede rotter. (b) Konfokalt mikroskopisk billede af repræsentative kortikale mikrokar i faginjicerede rotter (2 × 10 10 fager/dyr), der viser modfarvning af peptid #2077 og kar (lectin). Disse fagkloner blev administreret til 3 rotter og fik lov til at cirkulere i 1 time før perfusion. Hjerner blev sektioneret og farvet med polyklonale FITC-mærkede antistoffer mod T7-fagkapsidet. Ti minutter før perfusion og efterfølgende fiksering blev DyLight594-mærket lectin administreret intravenøst. Fluorescerende billeder, der viser lectinfarvning (rød) af den luminale side af mikrokar og fager (grøn) i lumen af ​​kapillærer og perivaskulært hjernevæv. Skalalinjen svarer til 10 µm. (c, d) Biotinyleret BACE1-hæmmende peptid alene eller i kombination med biotinyleret transitpeptid #2077 blev koblet til streptavidin efterfulgt af intravenøs injektion af mindst tre kanulerede CM-rotter (10 mg streptavidin/kg). BACE1-peptidhæmmermedieret reduktion i Aβ40 blev målt ved Aβ1-40 ELISA i blod (rødt) og cerebrospinalvæske (orange) på de angivne tidspunkter. For bedre klarhed er der tegnet en stiplet linje på grafen i en skala fra 100%. (c) Procentvis reduktion i Aβ40 i blod (røde trekanter) og cerebrospinalvæske (orange trekanter) hos rotter behandlet med streptavidin konjugeret til transitpeptid #2077 og BACE1-hæmmende peptid i et 3:1-forhold. (d) Procentvis reduktion i blodets Aβ40 (røde cirkler) og cerebrospinalvæske (orange cirkler) hos rotter behandlet med streptavidin koblet til et BACE1-hæmmende peptid alene. Aβ-koncentrationen i kontrollen var 420 pg/ml (standardafvigelse = 101 pg/ml).
Fagdisplay er blevet anvendt med succes inden for adskillige områder af biomedicinsk forskning17. Denne metode er blevet brugt til in vivo vaskulær diversitetsstudier18,19 såvel som studier rettet mod hjernekar20,21,22,23,24,25,26. I dette studie udvidede vi anvendelsen af ​​denne selektionsmetode ikke kun til direkte identifikation af peptider rettet mod hjernekar, men også til opdagelsen af ​​kandidater med aktive transportegenskaber til at krydse blod-hjerne-barrieren. Vi beskriver nu udviklingen af ​​en in vivo selektionsprocedure i CM-intuberede rotter og demonstrerer dens potentiale til at identificere peptider med CSF-homing-egenskaber. Ved at bruge T7-fagen, der viser et bibliotek af 12-mer tilfældige peptider, var vi i stand til at demonstrere, at T7-fagen er lille nok (ca. 60 nm i diameter)10 til at blive tilpasset blod-hjerne-barrieren og derved direkte krydse blod-hjerne-barrieren eller choroid plexus. Vi observerede, at CSF-høst fra kanulerede CM-rotter var en velkontrolleret in vivo funktionel screeningsmetode, og at den ekstraherede fag ikke kun bandt sig til vaskulaturen, men også fungerede som en transportør på tværs af blod-hjerne-barrieren. Ved samtidig at indsamle blod og anvende HTS på CSF og blodafledte fager bekræftede vi desuden, at vores valg af CSF ikke var påvirket af blodberigelse eller egnethed til ekspansion mellem selektionsrunder. Blodkompartmentet er dog en del af selektionsproceduren, da fager, der er i stand til at nå CSF-kompartmentet, skal overleve og cirkulere i blodbanen længe nok til at berige sig selv i hjernen. For at udtrække pålidelig sekvensinformation fra rå HTS-data implementerede vi filtre tilpasset platformspecifikke sekventeringsfejl i analysearbejdsgangen. Ved at inkorporere kinetiske parametre i screeningsmetoden bekræftede vi den hurtige farmakokinetik af vildtype T7-fager (t½ ~ 28 min) i blod24, 27, 28 og bestemte også deres halveringstid i cerebrospinalvæske (t½ ~ 26 min) pr. minut. Trods lignende farmakokinetiske profiler i blod og cerebrospinalvæske (CSF) kunne kun 0,001 % af blodkoncentrationen af ​​fag detekteres i CSF, hvilket indikerer lav baggrundsmobilitet af vildtype T7-fag over blod-hjerne-barrieren. Dette arbejde fremhæver vigtigheden af ​​den første selektionsrunde, når man bruger in vivo panoreringsstrategier, især for fagsystemer, der hurtigt fjernes fra kredsløbet, da få kloner er i stand til at nå CNS-kompartmentet. I den første runde var reduktionen i biblioteksdiversitet således meget stor, da kun et begrænset antal kloner til sidst blev indsamlet i denne meget strenge CSF-model. Denne in vivo panoreringsstrategi omfattede flere selektionstrin, såsom aktiv akkumulering i CSF-kompartmentet, klonoverlevelse i blodkompartmentet og hurtig fjernelse af T7-fagkloner fra blodet inden for de første 10 minutter (fig. 1d og supplerende fig. 4M). Efter den første runde blev der således identificeret forskellige fagkloner i CSF, selvom den samme initiale pulje blev brugt til individuelle dyr. Dette tyder på, at flere strenge udvælgelsestrin for kildebiblioteker med et stort antal biblioteksmedlemmer resulterer i en betydelig reduktion i diversitet. Derfor vil tilfældige begivenheder blive en integreret del af den indledende udvælgelsesproces og i høj grad påvirke resultatet. Det er sandsynligt, at mange af klonerne i det oprindelige bibliotek havde en meget lignende CSF-berigelsestilbøjelighed. Men selv under de samme eksperimentelle forhold kan udvælgelsesresultaterne variere på grund af det lille antal af hver enkelt klon i den indledende pulje.
Motiverne beriget i CSF adskiller sig fra dem i blodet. Interessant nok bemærkede vi det første skift mod glycinrige peptider i blodet hos individuelle dyr. (Fig. 1g, supplerende fig. 4e, 4f). Fag indeholdende glycinpeptider kan være mere stabile og mindre tilbøjelige til at blive taget ud af kredsløbet. Disse glycinrige peptider blev dog ikke detekteret i cerebrospinalvæskeprøverne, hvilket tyder på, at de kuraterede biblioteker gennemgik to forskellige selektionstrin: et i blodet og et andet, der fik lov til at akkumulere i cerebrospinalvæsken. CSF-berigede kloner, der er resultatet af den fjerde selektionsrunde, er blevet grundigt testet. Næsten alle de individuelt testede kloner blev bekræftet at være beriget i CSF sammenlignet med blank kontrolfag. Et peptidhit (#2077) blev undersøgt mere detaljeret. Det viste en længere plasmahalveringstid sammenlignet med andre hits (figur 3d og supplerende figur 7), og interessant nok indeholdt dette peptid en cysteinrest ved C-terminalen. Det er for nylig blevet vist, at tilsætning af cystein til peptider kan forbedre deres farmakokinetiske egenskaber ved at binde til albumin 29. Dette er i øjeblikket ukendt for peptid #2077 og kræver yderligere undersøgelse. Nogle peptider viste en valensafhængighed i CSF-berigelse (data ikke vist), hvilket kan være relateret til den viste overfladegeometri af T7-kapsidet. Det T7-system, vi anvendte, viste 5-15 kopier af hvert peptid pr. fagpartikel. IHC blev udført på kandidat-lead-fagkloner injiceret intravenøst ​​i hjernebarken hos rotter (Supplerende Fig. 8). Dataene viste, at mindst tre kloner (nr. 2002, nr. 2009 og nr. 2077) interagerede med BBB. Det skal stadig afgøres, om denne BBB-interaktion resulterer i akkumulering af CSF eller bevægelse af disse kloner direkte til BCSFB. Vigtigt er det, at vi viser, at de udvalgte peptider bevarer deres CSF-transportkapacitet, når de syntetiseres og bindes til proteinlasten. Binding af N-terminale biotinylerede peptider til SA gentager i bund og grund de resultater, der blev opnået med deres respektive fagkloner i blod og cerebrospinalvæske (fig. 3e). Endelig viser vi, at leadpeptid #2077 er i stand til at fremme hjerneaktiviteten af ​​en biotinyleret peptidhæmmer af BACE1 konjugeret til SA, hvilket forårsager udtalte farmakodynamiske effekter i CNS ved signifikant at reducere Abeta40-niveauer i CSF (fig. 4). Vi var ikke i stand til at identificere nogen homologer i databasen ved at udføre en peptidsekvenshomologisøgning af alle hits. Det er vigtigt at bemærke, at størrelsen af ​​T7-biblioteket er cirka 109, mens den teoretiske biblioteksstørrelse for 12-merer er 4 x 1015. Derfor valgte vi kun en lille brøkdel af diversitetsrummet i 12-mer-peptidbiblioteket, hvilket kan betyde, at mere optimerede peptider kan identificeres ved at evaluere det tilstødende sekvensrum for disse identificerede hits. Hypotetisk set kan en af ​​grundene til, at vi ikke har fundet nogen naturlige homologer af disse peptider, være deselektion under evolutionen for at forhindre den ukontrollerede indtrængen af ​​visse peptidmotiver i hjernen.
Samlet set giver vores resultater et grundlag for fremtidigt arbejde med at identificere og karakterisere transportsystemerne i den cerebrovaskulære barriere in vivo mere detaljeret. Den grundlæggende opsætning af denne metode er baseret på en funktionel selektionsstrategi, der ikke kun identificerer kloner med cerebrale vaskulære bindingsegenskaber, men også inkluderer et kritisk trin, hvor succesfulde kloner har iboende aktivitet til at krydse biologiske barrierer in vivo ind i CNS-kompartmentet. Målet er at belyse transportmekanismen for disse peptider og deres præference for binding til den mikrovaskulatur, der er specifik for hjerneområdet. Dette kan føre til opdagelsen af ​​nye transportveje for BBB og receptorer. Vi forventer, at de identificerede peptider kan binde direkte til cerebrovaskulære receptorer eller til cirkulerende ligander, der transporteres gennem BBB eller BCSFB. De peptidvektorer med CSF-transportaktivitet, der opdages i dette arbejde, vil blive undersøgt yderligere. Vi undersøger i øjeblikket hjernespecificiteten af ​​disse peptider for deres evne til at krydse BBB og/eller BCSFB. Disse nye peptider vil være yderst værdifulde værktøjer til potentiel opdagelse af nye receptorer eller signalveje og til udvikling af nye, højeffektive platforme til levering af makromolekyler, såsom biologiske lægemidler, til hjernen.
Kanulér den store cisterna (CM) ved hjælp af en modifikation af den tidligere beskrevne metode. Bedøvede Wistar-rotter (200-350 g) blev monteret på et stereotaksisk apparat, og et median snit blev lavet over den barberede og aseptisk forberedte hovedbund for at blotlægge kraniet. Bor to huller i området omkring den øvre ramme, og fastgør fastgørelsesskruerne i hullerne. Et yderligere hul blev boret i den laterale occipitale kam til stereotaktisk føring af en rustfri stålkanyle ind i CM. Påfør dentalcement omkring kanylen, og fastgør den med skruer. Efter fotohærdning og cementhærdning blev hudsåret lukket med 4/0 supramidsutur. Korrekt placering af kanylen bekræftes ved spontan lækage af cerebrospinalvæske (CSF). Fjern rotten fra det stereotaksiske apparat, modtag passende postoperativ pleje og smertebehandling, og lad den komme sig i mindst en uge, indtil der observeres tegn på blod i cerebrospinalvæsken. Wistar-rotter (Crl:WI/Han) blev indhentet fra Charles River (Frankrig). Alle rotter blev holdt under specifikke patogenfri forhold. Alle dyreforsøg blev godkendt af veterinærkontoret i byen Basel, Schweiz, og blev udført i overensstemmelse med dyrelicens nr. 2474 (Vurdering af aktiv hjernetransport ved måling af niveauer af terapeutiske kandidater i cerebrospinalvæsken og hjernen hos rotter).
Hold forsigtigt rotten bevidst med CM-kanylen i hånden. Fjern Datura fra kanylen og opsaml 10 µl spontant strømmende cerebrospinalvæske. Da kanylens åbenhed i sidste ende blev kompromitteret, blev kun klare cerebrospinalvæskeprøver uden tegn på blodkontaminering eller misfarvning inkluderet i dette studie. Parallelt blev ca. 10-20 μl blod taget fra et lille snit i spidsen af ​​halen og ind i rør med heparin (Sigma-Aldrich). CSF og blod blev opsamlet på forskellige tidspunkter efter intravenøs injektion af T7-fag. Ca. 5-10 μl væske blev kasseret, før hver CSF-prøve blev opsamlet, hvilket svarer til kateterets dødvolumen.
Biblioteker blev genereret ved hjælp af T7Select 10-3b-vektoren som beskrevet i T7Select-systemmanualen (Novagen, Rosenberg et al., InNovations 6, 1-6, 1996). Kort fortalt blev et tilfældigt 12-mer DNA-indsæt syntetiseret i følgende format:
NNK-kodonet blev brugt til at undgå dobbelte stopkodoner og aminosyreoverekspression i insertet. N er et manuelt blandet ækvimolært forhold mellem hvert nukleotid, og K er et manuelt blandet ækvimolært forhold mellem adenin- og cytosin-nukleotider. Enkeltstrengede regioner blev omdannet til dobbeltstrenget DNA ved yderligere inkubation med dNTP (Novagen) og Klenow-enzym (New England Biolabs) i Klenow-buffer (New England Biolabs) i 3 timer ved 37°C. Efter reaktionen blev dobbeltstrenget DNA udvundet ved EtOH-udfældning. Det resulterende DNA blev fordøjet med restriktionsenzymerne EcoRI og HindIII (begge fra Roche). Det spaltede og oprensede (QIAquick, Qiagen) insert (T4-ligase, New England Biolabs) blev derefter ligeret in-frame i en præ-spaltet T7-vektor efter aminosyre 348 i 10B-kapsidgenet. Ligeringsreaktioner blev inkuberet ved 16°C i 18 timer før in vitro-pakning. Fagpakning in vitro blev udført i henhold til instruktionerne leveret med T7Select 10-3b kloningskittet (Novagen), og pakningsopløsningen blev amplificeret én gang til lysis ved hjælp af Escherichia coli (BLT5615, Novagen). Lysaterne blev centrifugeret, titreret og frosset ved -80°C som en stamopløsning af glycerol.
Direkte PCR-amplifikation af fagvariable regioner amplificeret i bouillon eller plade ved hjælp af proprietære 454/Roche-amplicon-fusionsprimere. Forward fusionsprimeren indeholder sekvenser, der flankerer den variable region (NNK) 12 (skabelonspecifik), GS FLX Titanium Adapter A og en fire-base biblioteksnøglesekvens (TCAG) (Supplerende figur 1a):
Reverse fusionsprimeren indeholder også biotin bundet til capture-perler og GS FLX Titanium Adapter B, der kræves til klonal amplifikation under emulsions-PCR:
Amplikonerne blev derefter underkastet 454/Roche-pyrosekventering i henhold til 454 GS-FLX Titanium-protokollen. Til manuel Sanger-sekventering (Applied Biosystems Hitachi 3730 xl DNA Analyzer) blev T7-fag-DNA amplificeret ved PCR og sekventeret med følgende primerpar:
Indsatser fra individuelle plaques blev underkastet PCR-amplifikation ved hjælp af Roche Fast Start DNA Polymerase Kit (i henhold til producentens instruktioner). Udfør en varmstart (10 min. ved 95 °C) og 35 boost-cyklusser (50 s. ved 95 °C, 1 min. ved 50 °C og 1 min. ved 72 °C).
Fag fra biblioteker, vildtype-fag, fag reddet fra CSF og blod eller individuelle kloner blev amplificeret i Escherichia coli BL5615 i TB-bouillon (Sigma Aldrich) eller i 500 cm2 skåle (Thermo Scientific) i 4 timer ved 37°C. Fagerne blev ekstraheret fra pladerne ved at skylle pladerne med Tris-EDTA-buffer (Fluka Analytical) eller ved at opsamle plakkerne med sterile pipettespidser. Fagerne blev isoleret fra kultursupernatant eller ekstraktionsbuffer med én omgang polyethylenglycol (PEG 8000)-udfældning (Promega) og resuspenderet i Tris-EDTA-buffer.
Den amplificerede fag blev underkastet 2-3 runder med endotoksinfjernelse ved hjælp af endotoksinfjernelsesperler (Miltenyi Biotec) før intravenøs (IV) injektion (500 μl/dyr). I første runde blev 2×1012 fager introduceret; i den anden 2×1010 fager; i tredje og fjerde selektionsrunde 2×109 fager pr. dyr. Fagindholdet i CSF- og blodprøver indsamlet på de angivne tidspunkter blev bestemt ved plaktælling i henhold til producentens instruktioner (T7Select-systemmanual). Fagudvælgelse blev udført ved intravenøs injektion af oprensede biblioteker i halevenen eller ved geninjektion af fag ekstraheret fra CSF fra den foregående selektionsrunde, og efterfølgende høst blev udført efter henholdsvis 10 min, 30 min, 60 min, 90 min, 120 min, 180 min og 240 min i CSF- og blodprøver. I alt fire runder in vivo-panning blev udført, hvor de to udvalgte grene blev separat opbevaret og analyseret i løbet af de første tre selektionsrunder. Alle fagindsatser ekstraheret fra CSF fra de første to selektionsrunder blev underkastet 454/Roche-pyrosekventering, mens alle kloner ekstraheret fra CSF fra de sidste to selektionsrunder blev manuelt sekventeret. Alle blodfager fra den første selektionsrunde blev også underkastet 454/Roche-pyrosekventering. Til injektion af fagkloner blev udvalgte fager amplificeret i E. coli (BL5615) på 500 cm2 plader ved 37°C i 4 timer. Individuelt udvalgte og manuelt sekventerede kloner blev formeret i TB-medium. Efter fagekstraktion, oprensning og fjernelse af endotoksin (som beskrevet ovenfor) blev 2×1010 fager/dyr i 300 μl injiceret intravenøst ​​i en halevene.
Forbehandling og kvalitativ filtrering af sekvensdata. Rå 454/Roche-data blev konverteret fra et binært standard stream map-format (sff) til et Pearson human readable format (fasta) ved hjælp af leverandørsoftware. Yderligere behandling af nukleotidsekvensen blev udført ved hjælp af proprietære C-programmer og scripts (ikke-udgivet softwarepakke) som beskrevet nedenfor. Analysen af ​​primære data inkluderer strenge flertrinsfiltreringsprocedurer. For at filtrere aflæsninger fra, der ikke indeholdt en gyldig 12mer-insert-DNA-sekvens, blev aflæsningerne sekventielt justeret til startmærke (GTGATGTCGGGGATCCGAATTCT), stopmærke (TAAGCTTGGGCCGCACTCGAGTA) og baggrundsinsert (CCCTGCAGGGATATCCCGGGAGCTCGTCGAC) ved hjælp af den globale Needleman-Wunsch-test. Alignment, der tillader op til 2 inkonsistenser pr. alignment31. Derfor blev aflæsninger uden start- og stopmærker og aflæsninger, der indeholder baggrundsinserter, dvs. alignementer, der overstiger det tilladte antal uoverensstemmelser, fjernet fra biblioteket. For de resterende aflæsninger blev N-mer-DNA-sekvensen, der strakte sig fra startmærket og sluttede før stopmærket, udskåret fra den oprindelige aflæsningssekvens og yderligere bearbejdet (i det følgende benævnt "insert"). Efter translation af insertet fjernes delen efter det første stopcodon ved 5'-enden af ​​primeren fra insertet. Derudover blev nukleotider, der fører til ufuldstændige kodoner ved 3'-enden af ​​primeren, også fjernet. For at udelukke inserter, der kun indeholdt baggrundssekvenser, blev translaterede inserter, der starter med aminosyremønsteret "PAG", også fjernet. Peptider med en posttranslationel længde på mindre end 3 aminosyrer blev fjernet fra biblioteket. Endelig fjernes redundans i insertpuljen, og hyppigheden af ​​hvert unikke insert bestemmes. Resultaterne af denne analyse omfattede en liste over nukleotidsekvenser (inserter) og deres (aflæsnings)frekvenser (supplerende figur 1c og 2).
Gruppér N-mer DNA-indsætninger efter sekvenslighed: For at eliminere 454/Roche-specifikke sekventeringsfejl (såsom problemer med sekventering af homopolymerudvidelser) og fjerne mindre vigtige redundanser, sorteres tidligere filtrerede N-mer DNA-sekvensindsætninger (indsætninger) efter lighed. Indsætninger (op til 2 ikke-matchende baser tilladt) ved hjælp af en iterativ algoritme defineret som følger: indsætninger sorteres først efter deres frekvens (højeste til laveste), og hvis de er ens, efter deres sekundære sortering efter længde (længste til korteste). Således definerer de hyppigste og længste indsætninger den første "gruppe". Gruppefrekvensen sættes til nøglefrekvensen. Derefter blev det forsøgt at tilføje hver indsætning, der var tilbage på den sorterede liste, til gruppen ved parvis Needleman-Wunsch-justering. Hvis antallet af uoverensstemmelser, indsætninger eller deletioner i en justering ikke overstiger en tærskel på 2, tilføjes en indsætning til gruppen, og den samlede gruppefrekvens øges med, hvor ofte indsætningen blev tilføjet. Indsætninger, der tilføjes til en gruppe, markeres som brugte og udelukkes fra yderligere behandling. Hvis insertsekvensen ikke kan tilføjes til en allerede eksisterende gruppe, bruges insertsekvensen til at oprette en ny gruppe med den passende insertfrekvens og markeres som brugt. Iterationen slutter, når hver insertsekvens enten er blevet brugt til at danne en ny gruppe eller kan inkluderes i en allerede eksisterende gruppe. Grupperede inserts bestående af nukleotider bliver trods alt til sidst oversat til peptidsekvenser (peptidbiblioteker). Resultatet af denne analyse er et sæt af insertioner og deres tilsvarende frekvenser, der udgør antallet af fortløbende læsninger (Supplerende Fig. 2).
Motivgenerering: Baseret på en liste over unikke peptider blev der oprettet et bibliotek indeholdende alle mulige aminosyremønstre (aa) som vist nedenfor. Hvert muligt mønster med længde 3 blev ekstraheret fra peptidet, og dets inverse mønster blev tilføjet sammen med et fælles motivbibliotek indeholdende alle mønstre (tripeptider). Biblioteker med meget repetitive motiver blev sekventeret, og redundans blev fjernet. Derefter kontrollerede vi for hvert tripeptid i motivbiblioteket dets tilstedeværelse i biblioteket ved hjælp af beregningsværktøjer. I dette tilfælde tilføjes hyppigheden af ​​peptidet, der indeholder det fundne motivtripeptid, og det tildeles motivet i motivbiblioteket ("antal motiver"). Resultatet af motivgenerering er et todimensionelt array, der indeholder alle forekomster af tripeptider (motiver) og deres respektive værdier, som er antallet af sekventeringslæsninger, der resulterer i det tilsvarende motiv, når læsningerne filtreres, grupperes og oversættes. Metrikker som beskrevet detaljeret ovenfor.
Normalisering af antallet af motiver og tilsvarende scatterplots: Antallet af motiver for hver prøve blev normaliseret ved hjælp af
hvor ni er antallet af læsninger, der indeholder emne i. Vi repræsenterer således den procentvise frekvens af læsninger (eller peptider), der indeholder motiv i, i stikprøven. P-værdier for det ikke-normaliserede antal motiver blev beregnet ved hjælp af Fishers eksakte test. Med hensyn til korrelogrammer af antallet af motiver blev Spearmans korrelationer beregnet ved hjælp af det normaliserede antal motiver med R.
For at visualisere indholdet af aminosyrer på hver position i peptidbiblioteket blev weblogogrammer 32, 33 (http://weblogo.threeplusone.com) oprettet. Først gemmes indholdet af aminosyrer på hver position af 12-mer-peptidet i en 20×12 matrix. Derefter genereres et sæt af 1000 peptider indeholdende det samme relative aminosyreindhold på hver position i fasta-sekvensformat og leveres som input til weblogo 3, som genererer en grafisk repræsentation af det relative aminosyreindhold på hver position for et givet peptidbibliotek. For at visualisere flerdimensionelle datasæt blev der oprettet varmekort ved hjælp af et internt udviklet værktøj i R (biosHeatmap, en endnu ikke udgivet R-pakke). De dendrogrammer, der præsenteres i varmekortene, blev beregnet ved hjælp af Wards hierarkiske klyngemetode med den euklidiske afstandsmetrik. Til statistisk analyse af motivscoringsdata blev P-værdier for unormaliseret scoring beregnet ved hjælp af Fishers eksakte test. P-værdier for andre datasæt blev beregnet i R ved hjælp af Student's t-test eller ANOVA.
Udvalgte fagkloner og fager uden indsætninger blev injiceret intravenøst ​​via halevenen (2×1010 fager/dyr i 300 μl PBS). Ti minutter før perfusion og efterfølgende fiksering blev de samme dyr intravenøst ​​injiceret med 100 μl DyLight594-mærket lectin (Vector Laboratories Inc., DL-1177). 60 minutter efter faginjektion blev rotterne perfunderet gennem hjertet med 50 ml PBS efterfulgt af 50 ml 4% PFA/PBS. Hjerneprøver blev yderligere fikseret natten over i 4% PFA/PBS og gennemblødt i 30% sukrose natten over ved 4°C. Prøverne lynfryses i OCT-blandingen. Immunhistokemisk analyse af frosne prøver blev udført ved stuetemperatur på 30 µm kryosektioner blokeret med 1% BSA og inkuberet med polyklonale FITC-mærkede antistoffer mod T7-fag (Novus NB 600-376A) ved 4°C. Inkuber natten over. Endelig blev snittene vasket 3 gange med PBS og undersøgt med et konfokalt lasermikroskop (Leica TCS SP5).
Alle peptider med en minimumsrenhed på 98% blev syntetiseret af GenScript USA, biotinyleret og frysetørret. Biotin er bundet via en yderligere tripel glycin-spacer ved N-terminalen. Kontroller alle peptider ved hjælp af massespektrometri.
Streptavidin (Sigma S0677) blev blandet med et 5 gange ækvimolært overskud af biotinyleret peptid, biotinyleret BACE1-hæmmende peptid eller en kombination (forhold 3:1) af biotinyleret BACE1-hæmmende peptid og BACE1-hæmmende peptid i 5-10% DMSO/inkuberet i PBS. 1 time ved stuetemperatur før injektion. Streptavidin-konjugerede peptider blev injiceret intravenøst ​​i en dosis på 10 mg/kg i en af ​​halevenerne hos rotter med et cerebralt hulrum.
Koncentrationen af ​​streptavidin-peptidkomplekser blev vurderet ved ELISA. Nunc Maxisorp mikrotiterplader (Sigma) blev coatet natten over ved 4°C med 1,5 μg/ml muse-anti-streptavidin-antistof (Thermo, MA1-20011). Efter blokering (blokerende buffer: 140 nM NaCL, 5 mM EDTA, 0,05% NP40, 0,25% gelatine, 1% BSA) ved stuetemperatur i 2 timer, vaskes pladen med 0,05% Tween-20/PBS (vaskebuffer) i 3 sekunder. CSF- og plasmaprøver blev tilsat til brønde fortyndet med blokerende buffer (plasma 1:10.000, CSF 1:115). Pladen blev derefter inkuberet natten over ved 4°C med detektionsantistof (1 μg/ml, anti-streptavidin-HRP, Novus NB120-7239). Efter tre vasketrin blev streptavidin detekteret ved inkubation i TMB-substratopløsning (Roche) i op til 20 minutter. Efter at farveudviklingen var stoppet med 1 M H2SO4, måles absorbansen ved 450 nm.
Funktionen af ​​streptavidin-peptid-BACE1-hæmmerkomplekset blev vurderet ved Aβ(1-40) ELISA i henhold til producentens protokol (Wako, 294-64701). Kort fortalt blev CSF-prøver fortyndet i standardfortyndingsmiddel (1:23) og inkuberet natten over ved 4°C i 96-brønds plader coatet med BNT77-indfangningsantistof. Efter fem vasketrin blev HRP-konjugeret BA27-antistof tilsat og inkuberet i 2 timer ved 4°C, efterfulgt af fem vasketrin. Aβ(1-40) blev detekteret ved inkubation i TMB-opløsning i 30 minutter ved stuetemperatur. Efter at farveudviklingen er blevet stoppet med stopopløsning, måles absorbansen ved 450 nm. Plasmaprøver blev underkastet fastfaseekstraktion før Aβ(1-40) ELISA. Plasma blev tilsat 0,2% DEA (Sigma) i 96-brønds plader og inkuberet ved stuetemperatur i 30 minutter. Efter successiv vask af SPE-pladerne (Oasis, 186000679) med vand og 100% methanol blev plasmaprøver tilsat SPE-pladerne, og al væske blev fjernet. Prøverne blev vasket (først med 5% methanol, derefter 30% methanol) og elueret med 2% NH4OH/90% methanol. Efter tørring af eluatet ved 55°C i 99 minutter ved konstant N2-strøm blev prøverne reduceret i standardfortyndingsmidler, og Aβ(1-40) blev målt som beskrevet ovenfor.
Sådan citerer du denne artikel: Urich, E. et al. Fragtlevering til hjernen ved hjælp af transitpeptider identificeret in vivo. the science. 5, 14104; doi:10.1038/srep14104 (2015).
Likhota J., Skjorringe T., Thomsen LB og Moos T. Tilførsel af makromolekylære lægemidler til hjernen ved hjælp af målrettet terapi. Journal of Neurochemistry 113, 1–13, 10.1111/j.1471-4159.2009.06544.x (2010).
Brasnjevic, I., Steinbusch, HW, Schmitz, C., og Martinez-Martinez, P. Levering af peptid- og proteinlægemidler over blod-hjerne-barrieren. Prog Neurobiol 87, 212–251, 10.1016/j.pneurobio.2008.12.002 (2009).
Pardridge, WM Blod-hjerne-barrieren: en flaskehals i udviklingen af ​​​​hjernelægemidler. NeuroRx 2, 3–14, 10.1602/neurorx.2.1.3 (2005).
Johanson, KE, Duncan, JA, Stopa, EG, og Byrd, A. Udsigter til forbedret lægemiddelafgivelse og målretning til hjernen via choroid plexus-CSF-signalvejen. Pharmaceutical Research 22, 1011–1037, 10.1007/s11095-005-6039-0 (2005).
Pardridge, WM Modernisering af biofarmaceutiske produkter med molekylære trojanske heste til hjernelevering. Bioconjug Chem 19, 1327–1338, 10.1021/bc800148t (2008).
Pardridge, WM-receptormedieret peptidtransport over blod-hjerne-barrieren. Endocr Rev. 7, 314–330 (1986).
Niewoehner, J. et al. Øget hjernepenetration og effektivitet af terapeutiske antistoffer ved hjælp af monovalente molekylære shuttler. Neuron 81, 49–60, 10.1016/j.neuron.2013.10.061 (2014).
Bien-Lee, N. et al. Transferrinreceptor (TfR)-transport bestemmer hjernens optagelse af affinitetsvarianter af TfR-antistoffer. J Exp Med 211, 233–244, 10.1084/jem.20131660 (2014).